專利名稱：治療神經(jīng)損傷性疾病的植入神經(jīng)元制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種誘導間質干細胞分化為神經(jīng)元的方法，特別是一種用中藥作誘導劑制備用于治療神經(jīng)損傷性疾病的植入神經(jīng)元的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的治療脊髓損傷性疾病的植入神經(jīng)元制備方法，包括A、骨髓間質干細胞分離、培養(yǎng)、擴增取人或動物骨髓分離、培養(yǎng)，通過換液后傳代去除其他細胞，經(jīng)傳代后純化；B、用中藥誘導骨髓間質干細胞分化為神經(jīng)元取純化的間質干細胞用培養(yǎng)液預誘導，然后用含中藥有效成分的培養(yǎng)液再誘導；C、細胞洗滌后備用。
其中所述的中藥為丹參注射液或麝香多肽。
中藥(丹參注射液、麝香多肽)無明顯的毒副作用，采用其作為誘導劑誘導率高，安全性好，容易被病人接受。通過形態(tài)學和神經(jīng)元表面標記物檢測，丹參注射液誘導神經(jīng)元的陽性細胞率為62％左右，而麝香多肽陽性率達88-93％。利用上述中藥誘導分化的早期神經(jīng)元植入體內生長良好，能較好地重建受損神經(jīng)的功能；骨髓間質干細胞取材容易，能從患者本人獲得足夠的骨髓間質干細胞，經(jīng)擴增后，用于患者本人的治療，療效好，無免疫排斥等問題，臨床應用前景廣闊，社會效益巨大，而且能進行工業(yè)化生產(chǎn)以供應其他患者應用。
1、骨髓間質干細胞分離、培養(yǎng)、擴增及生物學特性識別。
分別取人或大鼠骨髓3-5毫升，于比重為1.078分離液分離。用含15％胎牛血清(FCS)的低糖培養(yǎng)基(L-DMEM)培養(yǎng)，間質干細胞很快貼壁生長，其他細胞不貼壁，通過換液化傳代去除其他細胞。經(jīng)2-3次傳代后，基本達到純化目的。第5代細胞表面標記物識別CD116，CD45，CD61，CD71，CD80，CD86，MHC-II表達均為陰性，而CD29和CD44陽性，證明是間質干細胞，而不是造血干細胞。
每份標本原代培養(yǎng)可獲得5-6×105細胞，傳5代細胞數(shù)為1×108，10代為2×1010，15代為3-4×1012。上述細胞量已基本滿足臨床應用所用細胞量。
2、丹參注射液和麝香多肽分別誘導骨髓間質干細胞分化為神經(jīng)元。
取5-10代間質干細胞用含10納克/毫升堿性纖維生長因子(bFGF)的L-DMEM(含15％FCS)預誘導24小時，然后，分別用丹參注射液5-10微升/毫升，或麝香多肽100-150微克/毫升加進無血清L-DMEM誘導5小時-7天。神經(jīng)元的確定通過形態(tài)學和神經(jīng)元表面標記物檢測，丹參注射液誘導神經(jīng)元的陽性細胞率為62％左右，而麝香多肽陽性率達88-93％。
3、丹參注射液和麝香多肽誘導分化神經(jīng)元的功能實驗。
a、將丹參或麝香多肽誘導的早期神經(jīng)元(誘導時間為2-5小時)，先用熒光染料(Hoe33342)標記，然后植入脊髓損傷處。治療組大鼠約在7-14天后后肢癱瘓即出現(xiàn)恢復，持續(xù)60-90天(相當于人類長期存活)，沒有異常副作用出現(xiàn)，經(jīng)熒光金逆行追蹤實驗，表明損傷神經(jīng)元軸索通路已經(jīng)建立，大體標本及病理切片證實植入細胞無瘤樣生長，生長良好，免疫組化證實已經(jīng)分化為神經(jīng)元。
b、將丹參或麝香多肽誘導分化的早期神經(jīng)元(誘導時間為2-5小時)，先用熒光染料標記，植入大鼠的紋狀體。治療組約在7-14天癥狀明顯改善(阿撲嗎啡誘導的轉圈動作明顯減少)，經(jīng)60-90天觀察，療效一直維持，病理切片證實植入細胞在宿主紋狀體生長良好，多巴胺含量(TH酶含量)明顯增加。
上述結果說明，用丹參或麝香多肽能高效誘導間質干細胞分化為神經(jīng)元，利用上述中藥誘導分化的早期神經(jīng)元植入體內生長良好，能較好地重建受損神經(jīng)的功能；骨髓間質干細胞取材容易，能從患者本人獲得足夠的骨髓間質干細胞，經(jīng)擴增后，用于患者本人的治療，療效好，無免疫排斥等問題，臨床應用前景廣闊，社會效益巨大，而且能進行工業(yè)化生產(chǎn)以供應其他患者應用。因為人骨髓間質干細胞傳15代時細胞量可達3-4×1012經(jīng)液氮保存隨時可取出供用。
另外，體外實驗表明，麝香多肽或丹參誘導骨髓間質干細胞從第二小時開始細胞形態(tài)已變?yōu)樯窠?jīng)元樣。兩天后已有90％左右細胞分化為神經(jīng)元，五天后(未改用維持液培養(yǎng))神經(jīng)元漂浮脫落，出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。
誘導2-5小時的神經(jīng)元處于早期，是活力最好的時期，植入體內后，動物實驗表明連續(xù)觀察2-3個月(相當于人類的長期存活)，早期神經(jīng)元植入使神經(jīng)細胞在體內存活良好，能更有效地重建受損功能。
大鼠脊髓損傷導致癱瘓的治療65只成年SD大鼠于胸腺9-10用刀片橫切約1毫米(用吸管吸出橫切組織)，然后分為三組。25只為細胞治療組，另四十只分別為空白對照組和明膠海綿對照組，細胞治療組用含有5×105已誘導分化的早期神經(jīng)元的可吸收明膠海綿植入損傷處；對照組不植入細胞。術后30天后定期行為學檢查(BBB分級)，于60天和90天分批處0死動物作病理切片和熒光金逆行追蹤檢查。結果表明，從錄像看出爬行小鼠雙后肢已有不同程度恢復。BBB分級從對照組的0-4級恢復至10級左右。病理切片證實植入細胞已分化為神經(jīng)元并存活90天以上。熒光金逆行追蹤檢查表明切片近端脊索，紅核及皮層運動區(qū)均陽性。說明切斷脊髓神經(jīng)軸索已得到重建。
大鼠帕金森病模型的治療用6微升6-OHDO(8毫克/微升)注入右側中腦黑質致密處一周后用apomorphine(0.5mg/kg)誘發(fā)旋轉，大于7次/分為帕金森模型建立成功，然后將已誘導的早期神經(jīng)元10微升含有5×105細胞注入紋狀體。實驗組25只，另一對照組(n＝15)僅注入培養(yǎng)液。術后3.7.14.21.28.56.90天觀察旋轉實驗，并于90天處死動物作病理切片及多巴胺檢測。對照組90天旋轉情況未見改善。細胞治療組于第七天開始旋轉次數(shù)明顯減少或消失。療效維持90天(相當于人類長期存活)病理切片表明植入細胞存活情況良好并能遷移至周圍其他部位。多巴胺檢測(western blot)治療組明顯陽性，而對照組呈陰性反應。
權利要求
1.治療脊髓損傷性疾病的植入神經(jīng)元制備方法，包括A、骨髓間質干細胞分離、培養(yǎng)、擴增取人或動物骨髓分離、培養(yǎng)，通過換液后傳代去除其他細胞，經(jīng)傳代后純化；B、用中藥誘導骨髓間質干細胞分化為神經(jīng)元取純化的間質干細胞用培養(yǎng)液預誘導，然后用含中藥有效成分的培養(yǎng)液再誘導；C、細胞洗滌后備用。
2.根據(jù)權利要求1所述植入神經(jīng)元的制備方法，其中所述的中藥為丹參注射液。
3.根據(jù)權利要求2所述植入神經(jīng)元的制備方法，其中用丹參注射液再誘導的時間為2小時-7天。
4.根據(jù)權利要求2所述植入神經(jīng)元的制備方法，其中丹參注射液的劑量為5-10微升/毫升。
5.根據(jù)權利要求3或4所述植入神經(jīng)元的制備方法，其中A、骨髓間質干細胞分離、培養(yǎng)、擴增取人或大鼠骨髓3-5毫升，于比重為1.077-1.078的分離液中分離，用含15％胎牛血清(FCS)的低糖培養(yǎng)基(L-DMEM)培養(yǎng)，間質干細胞貼壁生長，通過換液后傳代去除其他細胞，再經(jīng)2-3次傳代后，基本達到純化目的；B、用丹參注射液誘導骨髓間質干細胞分化為神經(jīng)元取5-10代間質干細胞，用含10納克/毫升堿性纖維生長因子(bFGF)的L-DMEM(含15％FCS)預誘導24小時，然后用含丹參注射液的無血清L-DMEM再誘導；C、細胞洗滌后備用。
6.根據(jù)權利要求1所述植入神經(jīng)元的制備方法，其中所述的中藥為麝香多肽。
7.根據(jù)權利要求6所述植入神經(jīng)元的制備方法，其中用麝香多肽再誘導的時間為2小時-7天。
8.根據(jù)權利要求6所述植入神經(jīng)元的制備方法，其中麝香多肽的劑量為100-150微克/毫升。
9.根據(jù)權利要求7或8所述植入神經(jīng)元的制備方法，其中A、骨髓間質干細胞分離、培養(yǎng)、擴增取人或大鼠骨髓3-5毫升，于比重為1.077-1.078的分離液中分離，用含15％胎牛血清(FCS)的低糖培養(yǎng)基(L-DMEM)培養(yǎng)，間質干細胞貼壁生長，通過換液后傳代去除其他細胞，再經(jīng)2-3次傳代后，基本達到純化目的；B、用麝香多肽誘導骨髓間質干細胞分化為神經(jīng)元取5-10代間質干細胞，用含10納克/毫升堿性纖維生長因子(bFGF)的L-DMEM(含15％FCS)預誘導24小時，然后用含麝香多肽的無血清L-DMEM再誘導；C、細胞洗滌后備用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種誘導間質干細胞分化為神經(jīng)元的方法，特別是一種用中藥作誘導劑制備用于治療神經(jīng)損傷性疾病的植入神經(jīng)元的方法。包括A、骨髓間質干細胞分離、培養(yǎng)、擴增取人或動物骨髓分離、培養(yǎng)，通過換液后傳代去除其他細胞，經(jīng)傳代后純化；B、用中藥誘導骨髓間質干細胞分化為神經(jīng)元取純化的間質干細胞用培養(yǎng)液預誘導，然后用含中藥有效成分的培養(yǎng)液再誘導；C、細胞洗滌后備用。中藥(丹參注射液、麝香多肽)無明顯的毒副作用，采用其作為誘導劑誘導率高，安全性好，容易被病人接受，所誘導分化的早期神經(jīng)元植入體內生長良好，能較好地重建受損神經(jīng)的功能；骨髓間質干細胞取材容易，能從患者本人獲得足夠的骨髓間質干細胞，經(jīng)擴增后，用于患者本人的治療，療效好，無免疫排斥等問題，臨床應用前景廣闊，社會效益巨大，而且能進行工業(yè)化生產(chǎn)以供應其他患者應用。
文檔編號A61K45/00GK1424396SQ0214962
公開日2003年6月18日 申請日期2002年12月13日 優(yōu)先權日2002年12月13日
發(fā)明者李樹濃, 鄧宇斌, 肖慶忠 申請人:中山大學