專利名稱：一種識(shí)別腫瘤細(xì)胞的多肽ot10、編碼ot10的多核苷酸及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的多核苷酸及其編碼的多肽。具體而言，本發(fā)明涉及一種能特異性識(shí)別卵巢癌的抗原識(shí)別受體(gamma delta TCR)互補(bǔ)決定區(qū)域(CDR)3多肽(即“OT10”)的氨基酸序列、其活性片斷、類似物或衍生物，以及所述的多肽及編碼該多肽的核苷酸序列在制備用于診斷或治療腫瘤的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤，發(fā)病率在婦科生殖系統(tǒng)腫瘤中居第二位，但卻是致死率最高的婦科腫瘤。卵巢癌的臨床治療主要采用手術(shù)切除或用順鉑聯(lián)合化療，但腫瘤惡性程度高的病人仍會(huì)復(fù)發(fā)，5年存活率僅為25％左右，因此，臨床上客觀要求有更好的手段輔助治療，而免疫治療在此方面的應(yīng)用前景則受到人們的青睞。近年來，許多學(xué)者分別進(jìn)行了細(xì)胞因子治療、TIL及CTL過繼治療、抗體療法、腫瘤疫苗治療等多種免疫治療方法的嘗試，并且也取得了一定的成果，但尚不令人滿意。例如，細(xì)胞因子治療目前是以局部治療或與其它生物手段聯(lián)合使用為主，盡管IL-2和IFN-α等細(xì)胞因子能起到良好的協(xié)同作用，但需要有效應(yīng)細(xì)胞存在；過繼治療有一定的應(yīng)用前景，但CTL識(shí)別抗原受主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子的限制，而腫瘤細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)MHC分子，使CTL的功能受限；至于腫瘤疫苗則有賴于腫瘤特異性或相關(guān)性抗原的發(fā)現(xiàn)；此外，還要克服荷瘤機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)和充分活化腫瘤特異性T細(xì)胞等問題。除上述影響腫瘤免疫治療的因素外，αβTIL在TCR-CD3復(fù)合體的表達(dá)或/和組裝上有缺陷以及腫瘤抗原似乎缺乏普遍性等因素，也在一定程度上制約著腫瘤免疫治療的效果。
與此同時(shí)，γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤的免疫治療方面存在優(yōu)勢(shì)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞獨(dú)特的抗腫瘤免疫機(jī)制可以彌補(bǔ)上述不足。例如，①γδT細(xì)胞主要以MHC非限制性方式識(shí)別抗原，可克服αβT細(xì)胞抗腫瘤免疫的MHC限制性的局限；②γδTIL細(xì)胞表達(dá)Fc受體，在TCR-CD3復(fù)合體的表達(dá)或/和組裝上有缺陷時(shí)，仍可傳遞信號(hào)，這是αβT細(xì)胞所不具備的；③γδT細(xì)胞在抗腫瘤免疫中可發(fā)揮產(chǎn)生細(xì)胞因子和細(xì)胞毒兩方面作用，兼具NK、CTL和Th細(xì)胞的功能特點(diǎn)。有人推測(cè)Vγ9/Vδ2T細(xì)胞做為抗腫瘤的天然效應(yīng)細(xì)胞與NK細(xì)胞的作用相似，而其對(duì)某些腫瘤的特異性識(shí)別則是由那些腫瘤攜帶的能被某些γδTCR特異性識(shí)別的配體所介導(dǎo)的[1]，因此，γδT細(xì)胞可以被看作是從天然免疫和特異性免疫兩方面發(fā)揮著抗腫瘤效應(yīng)機(jī)制。因此，若篩選到γδT細(xì)胞所識(shí)別的卵巢癌抗原及其表位(epitope)，則可用于激活γδT細(xì)胞、進(jìn)而進(jìn)行卵巢癌的γδT細(xì)胞特異性過繼治療，其應(yīng)用前景應(yīng)是較理想的。同時(shí)，篩選到的抗原肽可做為腫瘤疫苗，進(jìn)行卵巢癌主動(dòng)免疫治療的嘗試。因此，發(fā)現(xiàn)和尋找可做為卵巢癌腫瘤免疫治療有效靶點(diǎn)的特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原，尤其是表位，是攻破腫瘤免疫治療難關(guān)的急待解決的問題之一。顯然，從卵巢癌腫瘤組織浸潤(rùn)的γδT細(xì)胞(Tumor infiltrating γδT lymphocyte，γδTIL)中尋找與卵巢癌抗原特異性反應(yīng)的γδT細(xì)胞是合乎邏輯的。由于γδT細(xì)胞識(shí)別抗原的方式不受MHC限制，與抗體識(shí)別抗原的方式相似，能夠直接識(shí)別抗原，并且T細(xì)胞受體(TCR)與抗原之間特異性反應(yīng)部位是抗原表位，而與抗原表位特異性結(jié)合的是TCR的互補(bǔ)決定區(qū)3(Complementary determining regions3，CDR3)。因而從γδTCR CDR3序列的分析入手，尋找能與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，是解決上述問題的關(guān)鍵所在。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供分離的新的多肽——卵巢上皮癌(OEC)識(shí)別特異性γδTCR CDR3多肽OT10以及其類似物和衍生物。
本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，選自
c)包含SEQ ID NO.1的多核苷酸；d)SEQ ID NO.1的多核苷酸的反義核苷酸序列；c)一種在嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1序列或其片斷雜交的多核苷酸序列；d)一種具有與SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少70％同源并且編碼相同功能多肽的多核苷酸序列。
優(yōu)選地，所述的多核苷酸為與SEQ ID NO.1的多核苷酸具有至少95％同源并且編碼相同功能多肽的多核苷酸序列。
本發(fā)明涉及一種重組載體，它含有所述的多核苷酸。
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它含有所述的重組載體。
優(yōu)選地，所述的重組載體是所述的多核苷酸與細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒和腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等載體組成的重組載體。
優(yōu)選地，所述的重組載體是由所述的多核苷酸與編碼其它多肽或蛋白核苷酸序列構(gòu)建而成的基因重組載體。
優(yōu)選地，所述的重組載體是一種表達(dá)載體。
本發(fā)明涉及一種所述的多核苷酸編碼的具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、其活性片段、類似物或衍生物。
本發(fā)明涉及一種與所述的多肽、其活性片斷、類似物或衍生物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明涉及所述的多核苷酸在制備用于診斷或治療與γδTCRCDR3多肽相關(guān)腫瘤疾病的藥物中的用途。
優(yōu)選地，所述的腫瘤為卵巢癌。
本發(fā)明涉及具有由所述的多核苷酸編碼的如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、其活性片段、類似物或衍生物在制備用于診斷或治療與γδTCR CDR3多肽相關(guān)腫瘤的藥物中的用途。
本發(fā)明涉及一種模擬或調(diào)節(jié)所述的多肽表達(dá)的化合物，其中所述的化合物可以模擬或促進(jìn)γδTCR CDR3多肽的活性。
本發(fā)明涉及一種藥物組合物，它含有治療有效量的所述的多核苷酸或其編碼的所述的多肽或其活性片斷、類似物或衍生物和藥學(xué)上可以接受的載體。
本發(fā)明涉及一種腫瘤疫苗，其特征在于它含有所述的多核苷酸編碼的多肽所識(shí)別的免疫有效量腫瘤抗原表位、完整腫瘤抗原或編碼上述腫瘤抗原及其表位的多核苷酸以及包含該序列的基因重組載體和藥學(xué)上可以接受的佐劑。
為了表述方便，以下將本發(fā)明多肽稱作“OT10”。
本發(fā)明提供了一種新的多肽——一種特異性識(shí)別卵巢癌的γδTCR CDR3多肽OT10，以及編碼此多肽的氨基酸序列，本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的制備及應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種新的多肽——一種特異性識(shí)別卵巢癌的γδTCR CDR3多肽OT10，其基本上是由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或是用重組技術(shù)從原核或真核宿主，如細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化或非糖基化的。還可以包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括特異性識(shí)別卵巢癌的γδTCR CDR3OT10多肽的片段、衍生物和類似物。如本發(fā)明所用，術(shù)語(yǔ)“片段”“衍生物”和“類似物”是指基本上保持與本發(fā)明的特異性識(shí)別卵巢癌的γδTCRCDR3OT10多肽相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明多肽的片段、衍生物和類似物可以是(1)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被保守或非保守的氨基酸殘基取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的。(2)或者是其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基上的某個(gè)基團(tuán)被其它基團(tuán)所取代。(3)或者是屬于成熟多肽與其它化合物融合；或者是通過其中附加的氨基酸序列融合成熟多肽，如前導(dǎo)序列、分泌序列，或者用于純化此多肽的序列。通過對(duì)本文的闡述，這樣的片段、衍生物和類似物被認(rèn)為是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，基本由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸組成。本發(fā)明的多核苷酸序列包括SEQ IDNo.1的核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸是通過提取卵巢上皮癌中組織浸潤(rùn)的γδT細(xì)胞的總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增而得到的。它包含的多核苷酸序列的全長(zhǎng)為69個(gè)堿基，編碼了23個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、重組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈或是雙鏈。也可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)可以與SEQ ID No.1所示的序列相同或是簡(jiǎn)并的變異體。如本發(fā)明所用，“簡(jiǎn)并的變異體”是指具有SEQ ID No.2序列的多肽，但與SEQ ID No.1所示的序列有差別的多核苷酸序列。
編碼SEQIDNO2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”是指包括編碼此多肽的多核苷酸和包括附加和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述描述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述描述的序列雜交的多核苷酸(兩個(gè)序列之間具有至少50％，優(yōu)選具有70％的相同性)。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加用變性劑，如50％(V/V)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQIDNO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述序列雜交的核酸片段。如本發(fā)明所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含10個(gè)核苷酸，較好是至少15-20個(gè)核苷酸，最好是40個(gè)核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)，如PCR，以確定和/或分離編碼OT10的多核苷酸。
本發(fā)明的編碼特異性識(shí)別卵巢癌的γδTCR CDR3OT10多肽的多核苷酸序列可通過多種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離多核苷酸。這些技術(shù)包括但不限于1)用探針與基因組或cDNA文庫(kù)雜交以檢出同源的多核苷酸序列；2)表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特型的克隆的多核苷酸片段。3)經(jīng)化學(xué)合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。4)從基因組DNA分離上述雙鏈DNA序列。
上述提到的方法中，經(jīng)常選用的方法是DNA序列的直接化學(xué)合成，更經(jīng)常使用的方法是cDNA序列的分離。其標(biāo)準(zhǔn)方法是從表達(dá)該基因的供體細(xì)胞分離mRNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)粒或噬菌體cDNA文庫(kù)，從而應(yīng)用常規(guī)方法從上述文庫(kù)中篩選本發(fā)明的基因，這些方法包括但不限于(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)測(cè)定人OT10轉(zhuǎn)錄本的水平；(3)通過免疫學(xué)技術(shù)或測(cè)定生物活性的方法，來檢測(cè)基因表達(dá)的蛋白/多肽產(chǎn)物。上述方法即可單用，也可多種方法聯(lián)合使用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發(fā)明的多核苷酸的任何一部分同源，其長(zhǎng)度至少是10個(gè)核苷酸，最好是15-20個(gè)核苷酸；其所用探針通常是在本發(fā)明的基因序列信息的基礎(chǔ)上化學(xué)合成的DNA序列。
在方法(3)中，可用免疫學(xué)常規(guī)技術(shù)，包括但不限于免疫印跡(Western Blot)，放射免疫沉淀法或ELISA等，利用合成或表達(dá)的本發(fā)明的多肽對(duì)其結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明中，編碼特異性識(shí)別卵巢癌的γδTCR CDR3OT10多肽的多核苷酸序列可插入到載體中，以合成含有本發(fā)明所述多核苷酸的重組載體。術(shù)語(yǔ)“載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒和腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和其它基因轉(zhuǎn)運(yùn)工具。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)基于T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源與桿狀病毒的載體?？傊灰茉谒拗黧w內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定任何質(zhì)粒和載體都可以用于構(gòu)建重組表達(dá)載體。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通過含有復(fù)制起始點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯調(diào)控元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含編碼特異性識(shí)別卵巢癌的γδTCR CDR3OT10多肽的DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體的PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子等。在載體中插入增強(qiáng)子序列將會(huì)使其在高等真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是在DNA表達(dá)的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用與啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)有多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性等。
本發(fā)明中，編碼特異性識(shí)別卵巢癌的γδTCR CDR3OT10多肽的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以構(gòu)成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”指原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；細(xì)菌細(xì)胞如鼠傷寒沙門氏菌；真核細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2或Sf9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的編碼特異性識(shí)別卵巢癌的γδTCR CDR3OT10多肽，以及與該多肽融合表達(dá)的特異蛋白。一般來說有以下步驟用本發(fā)明的編碼特異性識(shí)別卵巢癌的γδTCR CDR3OT10多肽的多核苷酸(或變異體)、或包含有該核苷酸序列基因重組蛋白核苷酸，或用含有該核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。(放在一起)本發(fā)明提供了多肽，及其片段、衍生物、類似物或它們的細(xì)胞作為抗原以生產(chǎn)抗體的辦法。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還提供了針對(duì)編碼特異性識(shí)別卵巢癌的γδTCR CDR3OT10多肽抗原決定簇的抗體。從而用于測(cè)定與OT10結(jié)合蛋白親合力的大小及特異性。
本發(fā)明還可以用于設(shè)計(jì)針對(duì)體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如編碼特異性識(shí)別卵巢癌的γδTCR CDR3OT10多肽可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價(jià)結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如(SPDP)，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合與抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅OT10特異性識(shí)別的細(xì)胞。
本發(fā)明還可用于設(shè)計(jì)合成特異性靶向如卵巢癌等腫瘤的基因工程重組蛋白，該融合蛋白包括但不限于細(xì)胞因子、免疫毒素、免疫抑制劑和調(diào)節(jié)劑等，其具體方法是通過構(gòu)建基因重組表達(dá)載體，如pET-JV127，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，按照常規(guī)方法進(jìn)行表達(dá)、篩選和純化。
本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明多肽以基因重組的方式表達(dá)融合蛋白，該蛋白包括但不限于細(xì)胞因子、免疫毒素、免疫調(diào)節(jié)劑等的形式；或以嵌合受體或抗體的形式，利用所述多肽/多核苷酸序列進(jìn)行對(duì)卵巢癌等γδTCR CDR3多肽OT10相關(guān)的腫瘤疾病的免疫治療或診斷方法。
本發(fā)明可以將OT10多肽與毒素如白喉毒素進(jìn)行基因重組，以構(gòu)建、表達(dá)、純化該重組蛋白，使OT10識(shí)別與γδTCR CDR3多肽相關(guān)的腫瘤以使與OT10相連的毒素表達(dá)達(dá)到抑制相關(guān)腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織的生長(zhǎng)的目的。其方法可以是例如，將人工合成OT10編碼核苷酸與白喉毒素(DT)A鏈基因加入連接子后整合入pET30a和pET42a載體，然后轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)表達(dá)菌株中，通過IPTG誘導(dǎo)，可以得到融合蛋白。將融合蛋白通過HisTrap純化柱加以純化，然后，用凝血酶X a因子分別將OT10與白喉毒素(DT)A鏈融合肽片段切割下來，并加以純化，凍干后，-20℃保存。
總之，本發(fā)明通過篩選γδT細(xì)胞所識(shí)別的卵巢癌抗原及其表位(epitope)，提供了一種能特異性識(shí)別卵巢癌的抗原識(shí)別受體(gammadelta TCR)互補(bǔ)決定區(qū)域(CDR)3的多肽OT10的核苷酸序列與氨基酸序列，該多肽可用于激活γδT細(xì)胞、進(jìn)而進(jìn)行卵巢癌的γδT細(xì)胞特異性過繼治療，在特異抑制腫瘤的生長(zhǎng)的相關(guān)治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)，篩選到的抗原肽可做為腫瘤疫苗，進(jìn)行卵巢癌主動(dòng)免疫治療的嘗試。


圖1 不同pH值的固定反應(yīng)緩沖液對(duì)OT10的靜電吸附的影響。曲線1為OT10反應(yīng)曲線，固定反應(yīng)緩沖液的pH值依次為pH6.00、pH5.50、pH5.75和pH6.22；圖2 不同濃度對(duì)OT10的靜電吸附的影響。曲線1為OT10反應(yīng)曲線，OT10溶液的濃度依次為0.05，0.10，和0.01μg/μl；圖3 利用EDC/NHS將CDR3肽固定在CM-Dextran表面。曲線1為OT10固定反應(yīng)曲線，用“開始”和“結(jié)束”標(biāo)注了固定反應(yīng)的起始和結(jié)束。
圖4 利用IasysPlus生物傳感器監(jiān)測(cè)OEC細(xì)胞、對(duì)照細(xì)胞及其蛋白與CDR3短肽間的反應(yīng)。曲線1為OT10與細(xì)胞或蛋白質(zhì)反應(yīng)的生物傳感器檢測(cè)曲線，它們分別由4種或5種不同濃度的同一種細(xì)胞或蛋白的相對(duì)應(yīng)的4種或5種反應(yīng)結(jié)果組成，用“開始”和“結(jié)束”分別標(biāo)注了一種濃度的細(xì)胞或蛋白與OT10反應(yīng)的開始及結(jié)束。圖4A-J依次為SKOV3細(xì)胞，SKOV3細(xì)胞蛋白提取物，OEC1、OEC3、OEC4和OEC10組織蛋白提取物，PBMC，Hep-2細(xì)胞，803細(xì)胞和正常Balb/C小鼠卵巢組織蛋白提取物與CDR3短肽的反應(yīng)結(jié)果。其中不同濃度的803細(xì)胞的加入按濃度由高到低順序進(jìn)行，余者均為由低到高順序加樣。
圖5 去除生物素化的OT10短肽中游離生物素及脫鹽的層析圖。
圖6 ELISA方法檢測(cè)OT10短肽與一些細(xì)胞蛋白的反應(yīng)。
圖7 Dot-ELSIA檢測(cè)OT10短肽與一些細(xì)胞蛋白的反應(yīng)。
圖8 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)OT10短肽與卵巢癌組織的反應(yīng)，其中結(jié)果表明，OT10能識(shí)別卵巢癌腫瘤組織中的上皮細(xì)胞，但不與間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)(圖8A，8B，8C)，并且不加生物素標(biāo)記的OT10對(duì)照組未發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)(圖8G)；它們與因子宮切除而獲得的正常卵巢組織的上皮對(duì)照細(xì)胞不發(fā)反應(yīng)(圖8D，8E，8F)。上述結(jié)果表明OT10肽能特異性地識(shí)別卵巢癌上皮細(xì)胞抗原。
圖9 OT10所識(shí)別的噬菌體的篩選效率。篩選效率用產(chǎn)率表示，產(chǎn)率等于洗脫回收的噬菌體的滴度(單位為pfu)與用于篩選的噬菌體滴度的比值。SA-PMPs表示用SA-PMPs進(jìn)行第一輪篩選時(shí)CDR3肽反應(yīng)性噬菌體的產(chǎn)率，而一、二、三分別代表使用Reacti-Bind Neutravidin包被聚苯乙烯反應(yīng)板進(jìn)行第一輪、第二輪和第三輪篩選時(shí)CDR3肽反應(yīng)性噬菌體的產(chǎn)率。
圖10 利用Iasys生物傳感器監(jiān)測(cè)第三輪篩選的噬菌體與CDR3多肽的反應(yīng)。曲線1為OT10與噬菌體反應(yīng)的生物傳感器檢測(cè)曲線，它們分別由1種或5種不同濃度的同一種噬菌體洗脫液相對(duì)應(yīng)的1種或5種反應(yīng)結(jié)果組成，用“起始”和“結(jié)束”分別標(biāo)注了一種濃度的噬菌體的加入及結(jié)束。A為第三次篩選的噬菌體與CDR3短肽的反應(yīng)結(jié)果；B為第一次篩選時(shí)非結(jié)合噬菌體與CDR3短肽的反應(yīng)結(jié)果，做為對(duì)照。
圖11 利用IAsysPlus生物傳感器監(jiān)測(cè)用CDR3肽釣取的噬菌體與CDR3肽的反應(yīng)。曲線1為OT10與噬菌體反應(yīng)的生物傳感器檢測(cè)曲線，它們由3種、4種或5種不同濃度的同一種噬菌體洗脫液相對(duì)應(yīng)的3、4、5種反應(yīng)結(jié)果組成，用“起始”和“結(jié)束”分別標(biāo)注了一種濃度的噬菌體的加入及結(jié)束。A，B為P3-1和P3-7噬菌體與OT10的反應(yīng)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的其他方面由于本發(fā)明技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
實(shí)施例實(shí)施例1、編碼OT10多肽基因的克隆與序列分析取人卵巢上皮癌的新鮮組織(臨床資料見表1)，提取總RNA；使用特異性引物(Vδ15′-CAGCCTTACAGCTAGAAGATTCAGC-3′，Vδ25′-GCACCATCAGAGAGAGATGAAGGG-3′，Vδ35′-TCACTTGGTGATCTCTCCAGTAAGG-3′，Cδ5′-AAACGGATGGTTTGGTATGAGGC-3′。(其中Vδ1，Vδ2，Vδ3為5′端特異性引物，分別與3′端共用引物Cδ配對(duì)使用，可分別擴(kuò)增出δ1、δ2及δ3亞型CDR3基因片段)對(duì)γδT細(xì)胞受體δ1、δ2及δ3鏈CDR3基因片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下在50μl反應(yīng)體系中含有100mM Tris-HCl(PH9.0)，100mM KCL，100mM(NH4)2SO4，20mMMgSO4，1％TritonX-100，2.5mM dNTP10pM引物，1U的TaqDNA聚合酶(上海生物工程公司產(chǎn)品)。按下列條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃預(yù)變性5分鐘，然后94℃變性40秒，63.5℃退火50秒，72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物用玻璃奶DNA回收試劑盒(博大公司產(chǎn)品)進(jìn)行純化，然后應(yīng)用連接反應(yīng)試劑盒(包含T4連接酶及其相應(yīng)的緩沖液，Promega生產(chǎn)，美國(guó))將RT-PCR擴(kuò)增片段重組到pGEM-T easy載體(Promega生產(chǎn)，美國(guó))上，轉(zhuǎn)化DH5α菌株(轉(zhuǎn)化條件如下將5μl連接產(chǎn)物和90μl感受態(tài)細(xì)菌共同冰浴30分鐘，然后42℃熱激活90秒，立即冰浴5分鐘，加入200μl不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于37℃，180轉(zhuǎn)/分鐘搖菌1小時(shí)，最后將其涂布于含有氨芐青霉素的LB平板中37℃培養(yǎng)過夜。)，挑選陽(yáng)性克隆增殖并提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)EcoR I酶切及PCR鑒定為CDR3基因陽(yáng)性重組質(zhì)粒后，進(jìn)行序列測(cè)定。根據(jù)基因測(cè)序結(jié)果推導(dǎo)出相應(yīng)的γδTIL TCRδ鏈CDR3短肽的氨基酸序列。如表2所示。由于所設(shè)計(jì)的引物是針對(duì)TCRδ鏈CDR3區(qū)兩端的保守的側(cè)翼序列的，而CDR3區(qū)本身在序列上又存在著高度的多態(tài)性，因此氨基酸序列的分析結(jié)果顯示，所有已測(cè)序的CDR3片段不存在共同的保守序列。我們經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)共克隆得到了14條TCRδ鏈CDR3區(qū)序列；依據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的技術(shù)要求，我們選擇適宜的片段長(zhǎng)度及等電點(diǎn)等合成OT10多肽。經(jīng)HPLC分析其純度為90％以上。
表1.卵巢癌組織標(biāo)本臨床病理資料編號(hào)年齡 病案號(hào) 病理診斷OEC150 C693107 雙側(cè)高分化漿液性乳頭狀癌OEC259 C685632 雙側(cè)高分化粘液腺癌，不排除轉(zhuǎn)移性O(shè)EC370 C693829 雙側(cè)中-低分化移行細(xì)胞癌OEC455 C694101 雙側(cè)中-低分化子宮內(nèi)膜樣癌，部分為透明細(xì)胞癌OEC553 C692651 右側(cè)低分化漿液性乳頭狀癌OEC647 C694852 雙側(cè)低分化癌(可能為鱗癌或癌肉瘤，不除外轉(zhuǎn)移性)OEC755 C700353 雙側(cè)低分化漿液性乳頭狀癌，部分呈移行細(xì)胞癌分化OEC848 C696652 左卵巢透明細(xì)胞癌OEC948 C690257 雙側(cè)中分化漿液性乳頭狀癌OEC10 49 C696543 右側(cè)低分化漿液性乳頭狀癌實(shí)施例2、OT10多肽與卵巢上皮癌結(jié)合特異性的驗(yàn)證(1)OT10的固定按照IAsys生物傳感器(Affinity Sensor，F(xiàn)ranklin，法國(guó))的使用說明書，首先對(duì)固定反應(yīng)緩沖液(5mM馬來西酸)的pH值(6.00，5.50，5.75，6.22；)及OT10短肽的濃度(0.05，0.10，和0.01μg/μl)進(jìn)行了優(yōu)化篩選。通過EDC/NHS活化CM-Dextran兩孔反應(yīng)池(Affinity Sensor，F(xiàn)ranklin，法國(guó))后，在最佳的反應(yīng)緩沖液及CDR3多肽濃度條件下，將OT10固定在反應(yīng)池的CMD表面上。經(jīng)優(yōu)化篩選，OT10固定反應(yīng)緩沖液(5mM馬來西酸)的最佳pH值均為6.00(圖1)，最適濃度分別為0.10μg/μl和0.50μg/μl(圖2)。采用上述最佳pH值的固定反應(yīng)緩沖液及最適肽濃度，經(jīng)EDC/NHS作用，分別將OT10固定至CM-Dextran兩孔反應(yīng)池的CMD表面上；按200arcseconds相對(duì)應(yīng)每平方毫米CMD表面結(jié)合1ng蛋白計(jì)算，固定在CMD表面上的OT10分別約為10ng/mm2(圖3)。
(2)利用BIA技術(shù)檢測(cè)OT10與完整細(xì)胞的反應(yīng)性將培養(yǎng)的卵巢癌腫瘤細(xì)胞SKOV3、OVCA3、胃癌細(xì)胞803及喉表皮樣癌細(xì)胞hep-2，經(jīng)胰蛋白酶消化后，用反應(yīng)緩沖液PBS/T(10mMPBS，0.05％Tween-20，pH7.4)分別稀釋成2×104、5×104、1.5×105、2×105或1×106cell/ml，待檢。同時(shí)取人外周血，通過常規(guī)方法制備外周血單核細(xì)胞(PBMC)，用于正常細(xì)胞對(duì)照。用50μlPBS/T洗curvette3次后，開始收集數(shù)據(jù)，約5-10分鐘，此時(shí)段為基線(baseline)；待基線平穩(wěn)后，移去反應(yīng)池內(nèi)的PBS/T，迅速加入45μlPBST及5μl細(xì)胞懸液，反應(yīng)5-10分鐘，此時(shí)段為結(jié)合曲線(bindingcurve)；待結(jié)合曲線幾乎水平后，用PBS/T洗3次，在第3次加入PBS/T后，作用約1分鐘，此時(shí)段為洗脫曲線(dissociation curve)；待洗脫曲線趨于水平后，用1M甲酸洗3次，此時(shí)為再生曲線(regenerationcurve)。上述步驟為一個(gè)反應(yīng)過程，重復(fù)上述過程可檢測(cè)不同濃度或不同細(xì)胞與OT10之間的反應(yīng)。當(dāng)冼脫效果不好時(shí)，可以重復(fù)洗脫。
(3)利用BIA技術(shù)檢測(cè)OT10與提取的腫瘤細(xì)胞粗蛋白的反應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白提取試劑(M-PER Mammalian ProteinExtraction Reagent，Pierce公司生產(chǎn)，美國(guó))提取腫瘤細(xì)胞粗蛋白。取卵巢癌腫瘤細(xì)胞SKOV3和OVCA3接種到培養(yǎng)瓶中，待其長(zhǎng)滿單層后，加入1ml該試劑，并按其說明書提取相應(yīng)細(xì)胞蛋白。取正常Balb/C雌鼠卵巢組織，提取其組織蛋白，做為對(duì)照。按材料與方法3所介紹的步驟，檢測(cè)上述粗蛋白與OT10的反應(yīng)。結(jié)果示卵巢癌腫瘤細(xì)胞SKOV3及其蛋白提取物以及人卵巢癌組織OEC1、OEC3、OEC4及OEC10的蛋白提取物，均能與OT10發(fā)生反應(yīng)，且隨著其濃度的升高，其反應(yīng)性也在增強(qiáng)(圖4A-F)；而人正常外周血單核細(xì)胞(PBMC)、喉表皮樣癌細(xì)胞hep-2、胃癌細(xì)胞803及正常Balb/C鼠卵巢蛋白提取物等與OT10均不發(fā)生反應(yīng)(圖4G-J)。其中803細(xì)胞注入的濃度由高到低，余者均為由低到高的順序，故803細(xì)胞的濃度反應(yīng)曲線與其它細(xì)胞或蛋白的反應(yīng)曲線不同。
(4)ELISA驗(yàn)證BIA技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果a.OT10的生物素化用EZ-Link TM Sulfo-NHS-LC-BiotinylationKit(PIERCE生產(chǎn)，美國(guó))將1.5mgOT10進(jìn)行生物素標(biāo)記，方法按該試劑盒使用說明書操作。生物素化的OT10用D-Salt Dextran Desaltingcolumn(PIERCE生產(chǎn)，美國(guó))脫鹽，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)洗脫過程，收集洗脫峰。(圖5)b.ELISA檢測(cè)取用于BIA技術(shù)檢測(cè)的卵巢癌腫瘤細(xì)胞SKOV3、OVCA3、胃癌細(xì)胞803、喉表皮樣癌細(xì)胞hep-2的粗提蛋白、正常人PBMC及正常Balb/C雌鼠卵巢組織粗提蛋白的相同樣品100μl，包被ELISA檢測(cè)板，設(shè)空白對(duì)照，4℃過夜。PBS/T洗液(0.02MpH7.4PBS，0.05％Tween-20)洗3遍；加入10,000×生物素化的OT10100μl，37℃1小時(shí)；PBS/T洗3遍；加入0.1μg/ml辣根過氧化物酶連接的鏈親合素(Horseradishperoxidase conjugated streptavidin，PIERCE生產(chǎn)，美國(guó))100μl，37℃1小時(shí)；PBS/T洗3遍；加入底物(0.5μg/ml鄰苯二胺，0.04％H2O2，0.05M檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，pH5.5)，37℃作用10分鐘；加2MH2SO4終止反應(yīng)，酶聯(lián)自動(dòng)讀數(shù)儀測(cè)OD490值。利用生物素-親和素標(biāo)記系統(tǒng)建立了用于檢測(cè)CDR3與其所識(shí)別的抗原間反應(yīng)的ELISA方法。用該方法檢測(cè)了OT10與卵巢癌腫瘤細(xì)胞SKOV3、胃癌細(xì)胞803、喉表皮樣癌細(xì)胞hep-2的粗提蛋白、正常人PBMC及正常Balb/C雌鼠卵巢組織以及人卵巢癌組織OEC1、OEC3、OEC4、OEC10粗提蛋白之間的反應(yīng)，每個(gè)樣品檢測(cè)3次求平均值。其中OT10與SKOV3及人卵巢癌組織OEC1、OEC3、OEC4、OEC10的粗提蛋白反應(yīng)均為陽(yáng)性，余者皆為陰性，見圖6。這與BIA技術(shù)檢測(cè)結(jié)果相一致。
(5)Dot-ELISA檢測(cè)及其結(jié)果利用生物素-親和素標(biāo)記系統(tǒng)建立了用于檢測(cè)CDR3與其所識(shí)別的抗原間反應(yīng)的Dot-ELISA方法。用該方法檢測(cè)了OT10與卵巢癌腫瘤細(xì)胞SKOV3、胃癌細(xì)胞803、喉表皮樣癌細(xì)胞hep-2的粗提蛋白、正常人PBMC及正常Balb/C雌鼠卵巢組織以及人卵巢癌組織OEC3、OEC4、OEC10粗提蛋白之間的反應(yīng)。點(diǎn)樣順序相同的膜分別用DAB和化學(xué)發(fā)光底物染色，二者的結(jié)果是一致的，見圖7，其中OT10與SKOV3、人卵巢癌組織OEC3、OEC4、OEC10粗提蛋白反應(yīng)均為陽(yáng)性，余者皆為陰性，這與BIA技術(shù)檢測(cè)結(jié)果相一致。盡管2種方法染色結(jié)果是一致的，但化學(xué)發(fā)光底物染色方法的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DAB方法，本實(shí)驗(yàn)中，其底片爆光時(shí)間僅為5秒。
(6)免疫組化用常規(guī)方法制備卵巢上皮癌及正常卵巢組織(臨床資料見表1)切片；常規(guī)脫蠟至無水乙醇；用3％H2O2處理10min以清除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；水化，PBS沖洗5min×3次；將切片置微波爐中微波輻射，93℃10min；用0.05~0.1％胰蛋白酶消化15min；PBS沖洗5min×3次；10％正常兔血清(PBS稀釋)，室溫孵育10min；PBS沖洗5min×3次；向玻片上滴加10,000×生物素化的OT10反應(yīng)液，使其恰好覆蓋細(xì)胞，室溫孵育1h；PBS沖洗5min×3次；滴加0.1μg/ml鏈親合素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，37℃，孵育30min；PBS沖洗，5min×3；滴加DAB顯色液，適時(shí)自來水沖洗終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察，明膠封片，照相。另設(shè)不加生物素化的OT10做為對(duì)照。
對(duì)卵巢癌腫瘤組織及因子宮切除而獲得的正常卵巢組織的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，OT10能識(shí)別卵巢癌腫瘤組織中的上皮細(xì)胞，但不與間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)(圖8A，8B，8C)，并且不加生物素標(biāo)記的OT10的對(duì)照組未發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)(圖8G)；它們與因子宮切除而獲得的正常卵巢組織的上皮對(duì)照細(xì)胞不發(fā)反應(yīng)(圖8D，8E，8F)。上述結(jié)果表明OT10肽能特異性地識(shí)別卵巢癌上皮細(xì)胞抗原。
實(shí)施例3OT10多肽與白喉毒素的體外偶聯(lián)及細(xì)胞毒性試驗(yàn)(1)OT10多肽與白喉毒素衍生物的體外偶聯(lián)應(yīng)用短臂氨基-巰基交聯(lián)劑BMPS(PIERCE生產(chǎn)，美國(guó))對(duì)OT10多肽和低毒的白喉毒素衍生物進(jìn)行交聯(lián)，具體操作過程參見試劑說明進(jìn)行。
(2)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)SKOV3、Ho8910、OVOA及原代培養(yǎng)的卵巢上皮癌細(xì)胞分別用含有10％胎牛血清的Myco5A和1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。將上述細(xì)胞系以1×105/ml的濃度加入96孔培養(yǎng)板，每孔100μl；將白喉毒素偶聯(lián)OT10多肽調(diào)至終濃度為1×10-7～1×10-10/M，并設(shè)定相應(yīng)濃度的OT10多肽和白喉毒素的對(duì)照各3復(fù)孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)18小時(shí)后收獲上清，使用CytoTox96非放射性細(xì)胞毒性分析試劑盒(Promega生產(chǎn)，美國(guó))進(jìn)行分析，對(duì)比各組的殺傷百分比。
(3)荷瘤裸鼠體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)采用4周齡雌性Balb/c裸鼠，隨機(jī)分成3組白喉毒素偶聯(lián)OT10治療組、白喉毒素治療組和對(duì)照組，每組8只。取傳代生長(zhǎng)良好的人卵巢上皮癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞，以RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2次，重懸于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，調(diào)細(xì)胞濃度為5×106個(gè)細(xì)胞/ml，裸鼠皮下接種，100μl/只(荷瘤細(xì)胞數(shù)量為5×105個(gè)細(xì)胞/只)。接種腫瘤細(xì)胞3天后，以1×10-3mM100μl局部注射，對(duì)照組用同體積的RPMI-1640培養(yǎng)基注射；腫瘤長(zhǎng)出后(接種腫瘤細(xì)胞后，7天左右開始有腫瘤結(jié)節(jié)形成)，觀察腫瘤結(jié)節(jié)生長(zhǎng)情況，每2～3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤瘤體直徑并記錄。待出瘤裸鼠數(shù)及腫瘤個(gè)數(shù)不再增加時(shí)，確定30天為一觀察時(shí)段，每3天測(cè)量瘤體直徑，共測(cè)量10次，結(jié)果以各組腫瘤瘤體體積大小來評(píng)價(jià)。瘤體體積計(jì)算公式為瘤體體積(mm3)＝a×b2×0.4(其中a為瘤體長(zhǎng)徑，b為瘤體短徑，單位均以mm計(jì))。
實(shí)施例4應(yīng)用OT10多肽篩選噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)以獲得腫瘤相關(guān)模擬表位(1)噬菌體滴度測(cè)定挑取ER2738菌株原始菌種在LB-Tet平板上進(jìn)行劃線，于37℃培養(yǎng)過夜。挑取ER2738單菌落，接種于50或100ml燒瓶?jī)?nèi)的5-10mlLB液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床上振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(OD600的值約為0.5)。用LB液體培養(yǎng)基對(duì)噬菌體進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋。擴(kuò)增的噬菌體培養(yǎng)上清的稀釋倍數(shù)一般為108-1011；未擴(kuò)增的富集篩選的噬菌體洗脫液的稀釋倍數(shù)一般為101-104；當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期時(shí)，取200μl分裝到EP管中。取10μl各個(gè)稀釋倍數(shù)的噬菌體，分別加入到分裝了細(xì)菌的EP管中，做好標(biāo)記，輕輕搖動(dòng)或振蕩，使之混勻，室溫溫育1~5分鐘。將噬菌體與細(xì)菌的混合物加入至含有45℃頂層瓊脂的試管中，快速振蕩混勻，立即將管內(nèi)混合物傾入裝有預(yù)熱的LB/IPTG/Xgal平板中，輕輕旋動(dòng)平皿以確使頂層瓊脂及細(xì)菌分布均勻。蓋上平皿，于室溫放置5分鐘，使瓊脂凝固，翻轉(zhuǎn)后于37℃培養(yǎng)過夜。檢查平板，對(duì)藍(lán)色噬斑數(shù)大約為102的平板進(jìn)行噬斑計(jì)數(shù)。噬斑數(shù)乘以稀釋倍數(shù)等于10μl噬菌體原液的滴度。
(2)、噬菌體擴(kuò)增從最新劃線的LB-Tet平板上挑取ER2738單菌落，接種于250ml燒瓶?jī)?nèi)的20mlLB液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床上振蕩培養(yǎng)約2小時(shí)，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期(A600的值小于0.01)。將待擴(kuò)增的噬菌體洗脫液加入到上述燒瓶中，于37℃持續(xù)振搖培養(yǎng)4.5小時(shí)。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到離心管中，于4℃，12,000×g離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，于4℃，12,000×g再次離心10分鐘。取80％的上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，并加入1/6體積的PEG/NaCl。于4℃放置至少1小后于4℃，12,000×g離心15分鐘，棄上清，再次離心30秒，用微量進(jìn)樣器移去殘余液體。用1mlTBS懸浮沉淀物，并將其轉(zhuǎn)移至微量離心管中，于4℃，12,000×g離心5分鐘，使混雜的少量細(xì)菌沉淀。將上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，用1/6體積的PEG/NaCl再次沉淀噬菌體，冰浴15-60分鐘。于4℃，12,000×g離心10分鐘，去上清，離心30秒，用微量進(jìn)樣器移去殘余液體。用200μlTBS懸浮沉淀物。離心1分鐘，以沉淀不溶的物質(zhì)。將上清轉(zhuǎn)移到1個(gè)新的微量離心管中。這便是擴(kuò)增的噬菌體懸液。對(duì)其進(jìn)行滴度測(cè)定，于4℃保存，備用。
(3)Ph.D.-12噬菌體隨第一輪篩選
取100μl生物素化的OT10加入Reacti-Bind Neutravidin包被的聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中，放4℃冰箱，過夜。棄掉反應(yīng)孔中的反應(yīng)液，每孔加入200μl封閉液，4℃封閉至少1小時(shí)。棄掉封閉液，用TBST(TBS+0.1％Tween-20)快速洗6遍。取20μl噬菌體庫(kù)原液(約8×1010的噬菌體)，加入180μlTBST，混勻后，分別加入到結(jié)合了OT10的反應(yīng)孔中，100μl/孔，室溫反應(yīng)1小時(shí)。加入生物素至終濃度0.1mmol/L，室溫反應(yīng)5分鐘?；厥瘴唇Y(jié)合的噬菌體，進(jìn)行噬斑滴度測(cè)定并作為陰性對(duì)照。用TBST快速洗10遍，用含有1mg/mlBSA的0.2mol/L的Glycine-HCl(pH2.2)洗脫噬菌體，100μl/孔，時(shí)間不能超過10分鐘。最后加入1mol/LTris-HCl(pH9.1)對(duì)酸性洗脫液進(jìn)行中和，10μl/孔。取部分的洗脫液用于噬菌體滴度測(cè)定及SPR生物傳感器檢測(cè)，余者進(jìn)行擴(kuò)增，用于下一輪的篩選。
或者取生物素化的OT10100μl，與4×1010pfu的噬菌體庫(kù)原液混合，放4℃冰箱，過夜。輕彈且倒轉(zhuǎn)裝有TheStretavidinMagnesphere磁珠(SA-PMPs)的微量離心管(0.6ml/管)，使SA-PMPs(10mg/ml)分散均勻后，將其旋轉(zhuǎn)于磁性架上，使SA-PMPs被吸附于管臂側(cè)面，約30秒。然后，小心移出液體部分。用PBST洗3次，每次用磁性架捕獲SA-PMPs，并小心移出液體部分。用200μlPBST重懸SA-PMPs，加入OT10與噬菌體的反應(yīng)液，室溫作用30分鐘。通過磁性架吸附結(jié)合噬菌體的SA-PMPs。用PBST洗3次，每次用磁性架捕獲SA-PMPs，并小心移出液體部分。加入生物素至終濃度0.1mmol/L，室溫反應(yīng)5分鐘。用PBST洗10次，每次用磁性架捕獲SA-PMPs，并小心移出液體部分。用含有1mg/mlBSA的0.2mol/L的Glycine-HCl(pH2.2)洗脫噬菌體，400μl/管，時(shí)間不能超過10分鐘。加入1mol/LTris-HCl(pH9.1)對(duì)酸性洗脫液進(jìn)行中和，40μl/管。通過磁性架捕獲SA-PMPs，收集含有噬菌體的洗脫液。12000×g離心5分鐘，去掉SA-PMPs，收集上清。取部分上清用于噬菌體滴度測(cè)定，余者進(jìn)行擴(kuò)增，用于下一輪的篩選。
第二輪及第三輪篩選的方法與第一輪相同。只不過噬菌體是由其上一輪篩選洗脫噬菌體的增殖產(chǎn)物，為了提高篩選的嚴(yán)緊度，其加入量依次為4×109和4×108pfu，并且提高了TBST中的Tween-20的比例，由原來的0.1％變?yōu)?.5％。在第一輪篩選中，同時(shí)使用TheStretavidinMagnesphere磁珠和Reacti-Bind Neutravidin包被聚苯乙烯板進(jìn)行篩選，檢測(cè)洗脫液中噬菌體的滴度，并計(jì)算出其產(chǎn)率，二者的篩選結(jié)果相似(圖9)，故第二輪和第三輪只用Reacti-Bind Neutravidin包被聚苯乙烯板進(jìn)行親和篩選。如圖9所示，經(jīng)過3輪篩選，親和洗脫的噬菌體回收率顯著提高，說明OT10反應(yīng)性噬菌體出現(xiàn)了明顯的富集。
(4)SPR生物傳感器檢測(cè)親和篩選的噬菌體與OT10之間的反應(yīng)將OT10進(jìn)行親和篩選的每一輪所富集洗脫的噬菌體，用反應(yīng)緩沖液PBS/T(10mMPBS，0.05％Tween-20，pH7.4)分別稀釋成1×104、2×104、4×104、6×104或8×105pfu/ml，將回收的第一輪未結(jié)合的噬菌體分別稀釋為1×105pfu/ml，設(shè)為對(duì)照。并將篩選到的OT10特異性反應(yīng)噬菌體P3-1擴(kuò)增后的噬菌體分別稀釋成1×103、2×103、4×103、6×103或8×103pfu/ml。從而用SPR生物傳感器檢測(cè)親和篩選的噬菌體與OT10之間的反應(yīng)。SPR生物傳感器檢測(cè)了OT10與第三輪篩選的噬菌體之間的反應(yīng)，結(jié)果見圖10，OT10與其所對(duì)應(yīng)的第三輪篩選的噬菌體均能發(fā)生特異性反應(yīng)，而用于對(duì)照的第一輪篩選時(shí)未結(jié)合的噬菌體與OT10幾乎不發(fā)生反應(yīng)。所有檢測(cè)的用于測(cè)序的噬菌體與其所對(duì)應(yīng)的OT10的反應(yīng)結(jié)果均為陽(yáng)性反應(yīng)，見圖11。
(5)噬菌體的序列測(cè)定取第3輪篩選后的噬菌體懸液，適當(dāng)稀釋，按每個(gè)平板含有20個(gè)噬斑的量進(jìn)行噬斑培養(yǎng)。待形成噬斑后，隨機(jī)挑取獨(dú)立的噬斑擴(kuò)增純化后，制備成噬菌體懸液，進(jìn)行噬斑滴定。取200μl噬菌體溶液(約1011顆粒數(shù))用酚和氯仿各抽提一次。最后的上清轉(zhuǎn)至一新管，加入250μlTE和40μl3mol/LNaCl、1ml乙醇，4℃作用1小時(shí)以上。12000×g離心30分鐘，或獲得噬菌體單鏈DNA沉淀。用70％乙醇洗一次沉淀，棄盡殘雜液體至完全干燥，用7.5μlddH2O溶解，-20℃保存?zhèn)溆?。將純化的噬菌體單鏈DNA送華大生物公司測(cè)序。測(cè)序引物為-96gIII測(cè)序引物。序列分析結(jié)果表明，基因序列的同源性很小，但氨基酸序列的同源性較高，并且OT10反應(yīng)性的噬菌體分別存在完全相同或部分共同的序列。
(6)噬菌體肽序列的驗(yàn)證人工合成上述實(shí)驗(yàn)所得肽序列，與BSA偶聯(lián)后免疫小鼠制備單克隆抗體，然后經(jīng)生物素化后與FITC偶聯(lián)，利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)其與卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、H08910、OVCA，以及原代培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞系是否有特異性結(jié)合；并在此基礎(chǔ)上提取上述細(xì)胞系的膜蛋白，經(jīng)免疫印跡(Western Blot)進(jìn)一步驗(yàn)證與單抗結(jié)合的蛋白成分，最后經(jīng)質(zhì)譜分析確定該組分。
序列表<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>一種識(shí)別腫瘤細(xì)胞的多核苷酸、其編碼的多肽及用途<130><160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>78<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(69)<223>
<400>1tgt aca aca gga atg atc ttg tgc ctc cca ccc agg ctg ctg gga cta48Cys Thr Thr Gly Met Ile Leu Cys Leu Pro Pro Arg Leu Leu Gly Leu1 5 10 15atg atg cag aag ctc atc ttt ggaaaagga 78Met Met Gln Lys Leu Ile Phe20<210>2<211>23<212>PRT<213>人<400>2Cys Thr Thr Gly Met Ile Leu Cys Leu Pro Pro Arg Leu Leu Gly Leu1 5 10 15Met Met Gln Lys Leu Ile Phe20
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，選自a)包含SEQ ID NO.1的多核苷酸；b)SEQ ID NO.1的多核苷酸的反義核苷酸序列；c)一種在嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1序列或其片斷雜交的多核苷酸序列；d)一種具有與SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少70％同源并且編碼相同功能多肽的多核苷酸序列。
2.一種具有與SEQ ID NO.1的多核苷酸具有至少95％同源并且編碼相同功能多肽的多核苷酸序列。
3.一種重組載體，它含有權(quán)利要求1所述的多核苷酸。
4.一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它含有權(quán)利要求3所述的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，它是由權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸與細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒和腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等載體所組成的重組載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，它是由權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸與編碼其它多肽或蛋白核苷酸序列構(gòu)建而成的基因重組載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，它是一種表達(dá)載體。
8.一種如權(quán)利要求1所述的多核苷酸編碼的具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、其活性片段、類似物或衍生物。
9.一種與權(quán)利要求8所述的多肽、其活性片斷、類似物或衍生物結(jié)合的抗體。
10.權(quán)利要求1所述的多核苷酸在制備用于診斷或治療與γδTCRCDR3多肽相關(guān)腫瘤疾病的藥物中的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中所述的腫瘤為卵巢癌。
12.具有由權(quán)利要求1所述的多核苷酸編碼的如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、其活性片段、類似物或衍生物在制備用于診斷或治療與γδTCR CDR3多肽相關(guān)腫瘤的藥物中的用途。
13.一種模擬或調(diào)節(jié)權(quán)利要求8所述的多肽表達(dá)的化合物，其中所述的化合物可以模擬或促進(jìn)γδTCR CDR3多肽的活性。
14.一種藥物組合物，它含有治療有效量的如權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸或其編碼的如權(quán)利要求8所述的多肽或其活性片斷、類似物或衍生物和藥學(xué)上可以接受的載體。
15.一種腫瘤疫苗，其特征在于它含有權(quán)利要求1所述的多核苷酸編碼的多肽所識(shí)別的免疫有效量腫瘤抗原表位、完整腫瘤抗原或編碼上述腫瘤抗原及其表位的多核苷酸以及包含該序列的基因重組載體和藥學(xué)上可以接受的佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的多核苷酸及其編碼的多肽。具體而言，本發(fā)明涉及一種能特異性識(shí)別卵巢癌的抗原識(shí)別受體(gamma delta TCR)互補(bǔ)決定區(qū)域(CDR)3多肽(即“OT10”)的氨基酸序列、其活性片斷、類似物或衍生物，以及所述的多肽及編碼該多肽的核苷酸序列在制備用于診斷或治療腫瘤的藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1504475SQ0215392
公開日2004年6月16日 申請(qǐng)日期2002年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月5日
發(fā)明者何維, 何洪彬, 徐涌, 牛海濤, 姚一洲, 張惠媛, 崔蓮仙, 何 維 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所