專利名稱：重組血小板源生長(zhǎng)因子水凝膠制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物的水凝膠制劑的制備方法，具體地，本發(fā)明涉及一種重組血小板源生長(zhǎng)因子(rhPDGF-BB)的水凝膠制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是全球性高發(fā)疾病之一。1998年的統(tǒng)計(jì)數(shù)字顯示，全球糖尿病患者約有1.43億人。美國(guó)目前大約有1600萬(wàn)人患有糖尿病，中國(guó)糖尿病人更是高達(dá)4000多萬(wàn)，并且還以每年1‰的速度遞增。據(jù)WHO專家估計(jì)，到2025年全球糖尿病患者將達(dá)3億，其中75％的糖尿病人在印度、中國(guó)等發(fā)展中國(guó)家。
糖尿病人的一個(gè)特殊問(wèn)題是足部及下肢發(fā)生潰瘍，簡(jiǎn)稱糖尿病足(干性壞疽)。周邊神經(jīng)病變、肢端缺血和感染是三個(gè)主要的致病因素。其發(fā)病率隨著患者年齡增加而增大，多發(fā)于40歲以上的患者中。糖尿病足很難治愈，目前臨床主要有維持、預(yù)防感染和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)三種治療方法，但都無(wú)法從根本上使組織再生，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。病人的潰瘍長(zhǎng)期不能愈合，甚至遲遲無(wú)皮膚生長(zhǎng)的現(xiàn)象，并發(fā)感染，最終的結(jié)果是截肢。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)每年由各種類型糖尿病導(dǎo)致截肢的有5.6萬(wàn)人，單是住院治療和截肢的總費(fèi)用平均每人就需要4萬(wàn)美元，為此美國(guó)每年支出的醫(yī)療費(fèi)用超過(guò)22億美元，給家庭和社會(huì)帶來(lái)極大負(fù)擔(dān)。而血小板源生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)創(chuàng)面組織再生，增加糖尿病足的治愈率，降低截肢的危險(xiǎn)。
血小板源生長(zhǎng)因子(Platelet-Derived Growth Factor，以下簡(jiǎn)稱PDGF)是一種通常儲(chǔ)存于血小板α顆粒中的堿性蛋白質(zhì)，由血小板、趨化到受損部位的巨噬細(xì)胞、受損血管附近的平滑肌細(xì)胞和受損部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞所分泌，具有促進(jìn)中胚層源細(xì)胞分裂；刺激白細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的趨化作用；參與創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中的炎癥的反應(yīng)，參與組織和細(xì)胞的分化與增殖過(guò)程；對(duì)正常和病理狀態(tài)下的創(chuàng)傷修復(fù)有促進(jìn)作用等。
PDGF是由A、B兩種單體構(gòu)成的二聚體結(jié)構(gòu)，其分子量為28-31KDa，可形成PDGF-AA，BB和AB三種異構(gòu)體，在人類血小板來(lái)源中約85％-90％為AB型(分子量為22.5KDa，其中A鏈為13.3KDa，B鏈為12.2KDa)，約10％-15％為BB型。老年人的血小板也可含有多量的PDGF-BB，高達(dá)30％，而新鮮的血小板也可含有高達(dá)27％PDGF-AA。PDGF亞型的濃度是直接與創(chuàng)口愈合過(guò)程相關(guān)的。本發(fā)明涉及的重組血小板源生長(zhǎng)因子為PDGF-BB型(以下簡(jiǎn)稱為rhPDGF-BB)。
大量研究表明，慢性傷口如糖尿病足部潰瘍、壓迫性潰瘍的微環(huán)境中缺乏活性生長(zhǎng)因子是造成它們難以愈合的主要原因。因此在這一領(lǐng)域中生長(zhǎng)因子的潛在治療作用開(kāi)始受到人們的廣泛關(guān)注。有關(guān)PDGF，EGF，TGF等生長(zhǎng)因子的治療作用迅速展開(kāi)。實(shí)驗(yàn)表明PDGF是創(chuàng)傷愈合過(guò)程中較早出現(xiàn)的生長(zhǎng)因子之一，在創(chuàng)面愈合的全過(guò)程中起重要作用，參與創(chuàng)口愈合的全過(guò)程。特別是針對(duì)慢性難愈性疾病如糖尿病潰瘍，慢性靜脈性潰瘍，褥瘡，放射性潰瘍等效果顯著。另外，血小板是進(jìn)入創(chuàng)口的第一個(gè)細(xì)胞成分，通過(guò)釋放生長(zhǎng)因子促進(jìn)平滑肌細(xì)胞膠原蛋白的合成來(lái)啟動(dòng)創(chuàng)口愈合過(guò)程。因此理論上說(shuō)，PDGF應(yīng)該對(duì)所有創(chuàng)面愈合均有促進(jìn)作用，包括燒傷、燙傷、手術(shù)創(chuàng)口、皮外傷等急性創(chuàng)傷及對(duì)慢性靜脈潰瘍、褥瘡、放射性潰瘍等均有促進(jìn)愈合作用。
在各種疤痕的治療方面，PDGF也顯示了良好的效果，現(xiàn)在已經(jīng)有一系列基于PDGF的用于治療痤瘡等留下的疤痕的修復(fù)用化妝品相繼問(wèn)世。
到目前為止，PDGF是國(guó)外唯一一個(gè)在三期臨床上證明有效并已作為藥物上市的生長(zhǎng)因子。1997年12月16日，美國(guó)食品及藥品管理局批準(zhǔn)Ortho-McNeil公司生產(chǎn)的REGRANEX藥物上市，Regranex的有效活性成分是Becaplermin(0.01％)，即人重組血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF-BB)。Becaplermin由重組DNA技術(shù)在酵母菌中表達(dá)生產(chǎn)，原料Becaplermin由美國(guó)Chiron公司生產(chǎn)(U.S.LicenseNo.1106，Emeryville，CA 94608)；Regranex由Ortho-McNeilPharmaceutical公司推向市場(chǎng)(U.S.License No.1196，San German，Puerto Rico 00683)，用來(lái)治療皮下深層、有充足血管供應(yīng)的糖尿病足部潰瘍。Regranex是一種羧甲基纖維素型軟膏，為無(wú)色或淡粉色，1g含100ug Becaplermin，有2g，7.5g和15g的包裝，限于外用。是目前唯一的一種PDGF劑型。
在向中國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)局申請(qǐng)的專利中有一個(gè)申請(qǐng)?zhí)枮?6198773.1的專利申請(qǐng)含生長(zhǎng)因子的凝膠制劑，其權(quán)利要求書(shū)的所要求保護(hù)的也是PDGF的凝膠制劑，其有效藥物成分為血小板生成生長(zhǎng)因子PDGF為PDGF-B的同二聚體，凝膠基質(zhì)為纖維素聚合物，及可藥用的帶電荷化學(xué)物質(zhì)，選自包括賴氨酸、精氨酸、組氨酸、魚(yú)精蛋白、丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、色氨酸、氨基胍、鋅和鎂的組合，其中組合物為粘度在室溫下約1000-500,000cps范圍內(nèi)的水性凝膠。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種新的重組血小板源生長(zhǎng)因子(rhPDGF-BB)的水凝膠制劑，它基本上含有1)、藥物成份重組血小板源生長(zhǎng)因子(rhPDGF-BB)；2)、水凝膠基質(zhì)；3)、一種穩(wěn)定劑；4)、一種等滲劑；5)、一種PH調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明的目的之二是提供一種制備新的重組血小板源生長(zhǎng)因子(rhPDGF-BB)的水凝膠制劑的方法。
本發(fā)明提供的重組血小板源生長(zhǎng)因子的水凝膠制劑，是根據(jù)rhPDGF-BB藥物自身的特點(diǎn)即主要是用于治療糖尿病患者潰瘍傷口的外用藥而制備的，其特點(diǎn)在于在潤(rùn)濕的環(huán)境下，有利于傷口的愈合，使傷口不會(huì)結(jié)痂；基質(zhì)本身具有彈性和柔軟性，同時(shí)外觀呈透明狀，有利于對(duì)傷口愈合情況的觀察，且與皮膚創(chuàng)面有較好的接觸性能；同時(shí)藥物需要通過(guò)凝膠層進(jìn)行釋藥，具有緩慢持續(xù)釋放藥物的作用，因此藥效作用維持的時(shí)間長(zhǎng)等等。
本發(fā)明的技術(shù)方案之一為是提供一種新的重組血小板源生長(zhǎng)因子(rhPDGF-BB)的水凝膠制劑，它基本上含有1)、藥物成份重組血小板源生長(zhǎng)因子(rhPDGF-BB)；2)、水凝膠基質(zhì)；3)、一種穩(wěn)定劑；4)、一種等滲劑；5)、一種PH調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明的技術(shù)方案之二為提供一種制備新的重組血小板源生長(zhǎng)因子(rhPDGF-BB)的水凝膠制劑的方法，包括如下步驟1)、取水凝膠基質(zhì)適量，加注射用水，充分浸泡，使之溶漲完全。然后滴加適量的PH調(diào)節(jié)劑，使膠液的PH值達(dá)到5.0-9.0之間；加入一定量的等滲劑，攪拌至溶解，放于適宜的容器中，高壓流通蒸汽滅菌30分鐘(121℃，115Pa)，室溫下充分冷卻，制備得A液；2)、取一定量的穩(wěn)定劑，加水溶解，置于2-8℃保存，制備得B液；3)、取rhPDGF-BB藥液為C液；4)、取B液，使之通過(guò)0.22μm濾膜，在不斷攪拌A液的條件下加入到A液中，溫度控制在2-8℃，繼續(xù)攪拌至均勻，加入C液，保持上述溫度條件，至均勻。
5)分裝。
具體地，因?yàn)楸景l(fā)明提供的制劑是用于傷口創(chuàng)面，因此為了保證用藥的安全性、低刺激性和良好的順應(yīng)性，本發(fā)明研制的rhPDGF-BB水凝膠制劑應(yīng)具有無(wú)菌、等滲、PH值與皮膚接近等特點(diǎn)。在上述原則的指導(dǎo)下，我們對(duì)基質(zhì)的種類、穩(wěn)定劑、防腐劑等賦形劑以及制備工藝進(jìn)行了篩選，以確定產(chǎn)品的處方和制備工藝。
本發(fā)明采用的水凝膠基質(zhì)為纖維素類聚合物材料，我們首選的是聚丙烯酸類的卡伯姆(Carbopol)?？ú肥且环N聚丙烯酸交聯(lián)樹(shù)脂，在很低的濃度下即可形成較高粘度的凝膠?？ú吩趪?guó)外已經(jīng)廣泛用于化妝品和藥品的研究生產(chǎn)中，并且被多國(guó)藥典收載，在制劑中可作為凝膠基質(zhì)、生物粘附材料等。常用的卡伯姆有Carbopol910NF、934NF、941NF、980NF、981NF、971NF、974NF，以上8個(gè)型號(hào)產(chǎn)品均取得中國(guó)大陸藥品注冊(cè)許可證，在市場(chǎng)均有出售。同時(shí)卡伯姆作為本實(shí)驗(yàn)用基質(zhì)具有外觀澄明、柔軟、吸附性強(qiáng)和生物粘附性質(zhì)，因此本發(fā)明選用卡伯姆作為水凝膠基質(zhì)。
可用于制備水凝膠的卡伯姆的型號(hào)較多，主要有兩類。其中Carbopol940的特點(diǎn)是分子鏈較短、粘度高，吸附能力適中，藥物釋放較慢。因此使用Carbopol940作為PDGF的基質(zhì)時(shí)，該凝膠劑具具有藥物釋放緩慢、藥效作用持久的特點(diǎn)。經(jīng)過(guò)我們的摸索，發(fā)現(xiàn)當(dāng)卡伯姆940的濃度為0.1％(W/W)-2％(W/W)，有較理想的活性結(jié)果，同時(shí)經(jīng)過(guò)粘度測(cè)定，粘度值適中。其中，優(yōu)選地，當(dāng)卡伯姆940的濃度為0.4％時(shí)具有最好的穩(wěn)定性和藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
而Carbopol981類分子鏈較長(zhǎng)、粘度較低，用它作為PDGF藥物的基質(zhì)時(shí)，該凝膠劑具有與皮膚吸附能力較強(qiáng)，藥物釋放較快的特點(diǎn)。經(jīng)過(guò)我們的摸索，發(fā)現(xiàn)當(dāng)卡伯姆981的濃度為0.1％(W/W)-2％(W/W)，有較理想的活性結(jié)果，同時(shí)經(jīng)過(guò)粘度測(cè)定，粘度值適中。其中，優(yōu)選地，當(dāng)卡伯姆981的濃度為1％時(shí)具有最好的穩(wěn)定性和藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
本發(fā)明涉及的是rhPDGF-BB的水凝膠制劑，因此要求的實(shí)驗(yàn)條件是無(wú)菌。同時(shí)由于rhPDGF-BB是細(xì)胞活性因子，所以整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)該保持在低溫狀態(tài)。
因此，本發(fā)明涉及的rhPDGF-BB水凝膠制劑的制備方法中，第一步是取水凝膠基質(zhì)卡伯姆適量，加適量注射用水，使之充分浸泡，溶漲完全。滴加適量的PH調(diào)節(jié)劑，使膠液的PH值在5.0-9.0之間，加入一定的量的等滲劑，攪拌至溶解，放于適宜的容器中，高壓流通蒸汽滅菌30分鐘(121℃，115Pa)，室溫下充分冷卻，制備得A液；我們所制備的PDGF水凝膠制劑為外用藥物，因此要求在制劑配方中有等滲劑。在藥劑中可以作為等滲劑的常用材料為0.9％的氯化鈉、5％的葡萄糖及3％的甘露醇。
其中本發(fā)明中所涉及的PH調(diào)節(jié)劑為10％的NaOH溶液。
本發(fā)明涉及的第二步驟為取一定量的穩(wěn)定劑，加水溶解，置于2-8℃保存，制備得B液；這是由于rhPDGF-BB本身為細(xì)胞活性因子，因此要求加入一定量的穩(wěn)定劑進(jìn)行活性保護(hù)。本發(fā)明是選擇了氨基酸作為穩(wěn)定劑。
本發(fā)明涉及的第三步驟為取rhPDGF-BB藥液為C液，其中該rhPDGF-BB藥液為通過(guò)基因工程技術(shù)，構(gòu)建重組人的PDGF-BB菌株，通過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵、純化過(guò)程，從而得到蛋白質(zhì)純度大于97％、蛋白含量為1mg/ml的rhPDGF-BB藥液樣品。本發(fā)明中，rhPDGF-BB的濃度為在1μg/g-1000μg/g范圍內(nèi)。
本發(fā)明涉及的第四個(gè)步驟為取上述B液，使之通過(guò)0.22μm濾膜，在攪拌下加入到A液中，溫度控制在2-8℃，繼續(xù)攪拌至均勻，加入C液，保持上述溫度條件，至均勻。即為制備好的rhPDGF-BB水凝膠制劑。
另外，由于rhPDGF-BB本身具有一定的疏水性，加入一定的離子有助于增加其在水中的溶解性能，同時(shí)可以更好地保持活性，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)在rhPDGF-BB的藥液中加入濃度為20mM的醋酸鈉，可以使藥物更好地發(fā)揮活性。
同時(shí)創(chuàng)面外用藥劑的特點(diǎn)決定了該制劑在一定時(shí)間內(nèi)應(yīng)該處于無(wú)菌狀態(tài)，因此可以處方中加入一定的防腐劑，在藥劑學(xué)中常用的防腐劑有水溶性的苯甲酸鈉和尼泊金類，優(yōu)選的為0.8％的尼泊金乙酯。另外加入金屬離子絡(luò)合劑可以起到穩(wěn)定的作用，優(yōu)選的為0.3％的EDTA-Na。
通過(guò)對(duì)本發(fā)明提供的重組血小板源生長(zhǎng)因子的水凝膠制劑進(jìn)行的動(dòng)物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，本發(fā)明提供的水凝膠制劑對(duì)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面具有明顯的促修復(fù)作用，其劑量效應(yīng)與國(guó)外同類制品的促創(chuàng)面愈合療效相似。
通過(guò)對(duì)本發(fā)明提供的重組血小板源生長(zhǎng)因子的水凝膠制劑進(jìn)行動(dòng)物(獼猴)藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)研究表明，獼猴皮膚缺損涂抹了rhPDGF-BB后，各猴血漿抗原濃度隨時(shí)間的變化，循環(huán)血中rhPDGF-BB抗原濃度均在動(dòng)物本底水平波動(dòng)，與本底水平相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)意義上的升高。各組相同時(shí)間點(diǎn)抗原濃度對(duì)比也無(wú)統(tǒng)計(jì)意義的差別。獼猴全層皮膚缺損局部用藥后的生物利用度表明，全層皮膚潰瘍創(chuàng)面局部敷用rhPDGF-BB水凝膠制劑后，各時(shí)間點(diǎn)血漿樣品抗原濃度均在本底水平波動(dòng)，各樣品抗原濃度水平與本底水平相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)意義差別。生物利用度計(jì)算值為-15.8％。本發(fā)明提供的水凝膠制劑局部應(yīng)用后全身吸收可以忽略不計(jì)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 rhPDGF-BB藥液的制備本發(fā)明涉及的rhPDGF-BB藥液，是通過(guò)用通用的基因工程技術(shù)，構(gòu)建重組人的PDGF-BB菌株，通過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵、純化過(guò)程，從而得到蛋白質(zhì)純度大于97％、蛋白質(zhì)含量為1mg/ml的rhPDGF-BB藥液樣品。
實(shí)施例2 rhPDGF-BB的水凝膠制劑的制備下述整個(gè)過(guò)程是在無(wú)菌條件下進(jìn)行操作的。
1)、空白基質(zhì)的制備取4.0克的Carbopol940，加水約900毫升，使之充分浸泡，溶漲完全。在機(jī)械攪拌的條件下，滴加10％NaOH溶液適量，使膠液的PH值在5.0-9.0之間，然后加入30克的甘露醇、0.3克的EDTA-Na、0.8克的尼泊金乙酯，攪拌直到溶解，放置到適宜的容器中，高壓流通蒸汽滅菌30分鐘(121℃，115Pa)，室溫下充分冷卻，置冰箱中冷藏保存，備用。
2)、賴氨酸溶液的配置取5.0克的賴氨酸，加入適量的注射用水，待溶解后，放置冰箱中冷藏(2-8℃)保存，備用。
3)、水凝膠的制備將第1)步的空白基質(zhì)置于冰水浴中，用機(jī)械攪拌的方法攪拌空白基質(zhì)，然后將配好的賴氨酸溶液通過(guò)0.22μm濾膜的濾器，加入到空白基質(zhì)中，繼續(xù)攪拌直到均勻；然后在不斷攪拌的條件下，加入100毫克的rhPDGF-BB藥液，加注射用水至1000毫升。
實(shí)施例3 rhPDGF-BB的水凝膠制劑的制備下述整個(gè)過(guò)程是在無(wú)菌條件下進(jìn)行操作的。
1)、空白基質(zhì)的制備取10克的Carbopol981，加水約900毫升，使之充分浸泡，溶漲完全。在機(jī)械攪拌的條件下，滴加10％NaOH溶液適量，使膠液的PH值在5.0-9.0之間，然后加入30克的甘露醇、0.3克的EDTA-Na、0.8克的尼泊金乙酯，攪拌直到溶解，放置到適宜的容器中，高壓流通蒸汽滅菌30分鐘(121℃，115Pa)，室溫下充分冷卻，置冰箱中冷藏保存，備用。
2)、賴氨酸溶液的配置取5.0克的賴氨酸，加入適量的注射用水，待溶解后，放置冰箱中冷藏(2-8℃)保存，備用。
3)、水凝膠的制備將第1)步的空白基質(zhì)置于冰水浴中，用機(jī)械攪拌的方法攪拌空白基質(zhì)，然后將配好的賴氨酸溶液通過(guò)0.22μm濾膜的濾器，加入到空白基質(zhì)中，繼續(xù)攪拌直到均勻；然后在不斷攪拌的條件下，加入100毫克的rhPDGF-BB藥液，加注射用水至1000毫升。
權(quán)利要求
1.一種重組血小板源生長(zhǎng)因子(rhPDGF-BB)的水凝膠制劑的制備方法，包括如下步驟1)、取水凝膠基質(zhì)適量，加注射用水，充分浸泡，使之溶漲完全。然后滴加適量的PH調(diào)節(jié)劑，使膠液的PH值達(dá)到5.0-9.0之間；加入一定的量的等滲劑，攪拌至溶解，放于適宜的容器中，高壓流通蒸汽滅菌30分鐘(121℃，115Pa)，室溫下充分冷卻，制備得A液；2)、取一定量的穩(wěn)定劑，加水溶解，置于2-8℃保存，制備得B液；3)、取rhPDGF-BB藥液為C液；4)、取B液，使之通過(guò)0.22μm濾膜，在不斷攪拌A液的條件下加入到A液中，溫度控制在2-8℃，繼續(xù)攪拌至均勻，加入C液，保持上述溫度條件，至均勻。5)分裝。
2.如權(quán)利要求1所述的rhPDGF-BB的水凝膠制劑的方法，其中rhPDGF-BB的濃度在1μg/g-1000μg/g范圍內(nèi)。
3.如權(quán)利要求1所述的制備rhPDGF-BB的水凝膠制劑的方法，其中所述的水凝膠基質(zhì)為卡伯姆。
4.如權(quán)利要求3所述的制備rhPDGF-BB的水凝膠制劑的方法，優(yōu)選的水凝膠基質(zhì)為卡伯姆940。
5.如權(quán)利要求3所述的制備rhPDGF-BB的水凝膠制劑的方法，優(yōu)選的水凝膠基質(zhì)為卡伯姆981。
6.如權(quán)利要求1所述的制備rhPDGF-BB的水凝膠制劑的方法，其中水凝膠基質(zhì)的濃度為0.1％(W/W)-2％(W/W)。
7.如權(quán)利要求1所述的制備rhPDGF-BB的水凝膠制劑的方法，其中穩(wěn)定劑為氨基酸。
8.如權(quán)利要求7所述的制備rhPDGF-BB的水凝膠制劑的方法，優(yōu)選的穩(wěn)定劑為賴氨酸。
9.如權(quán)利要求1所述的制備rhPDGF-BB的水凝膠制劑的方法，其中等滲劑為0.9％的氯化鈉或5％的葡萄糖或3％的苷露醇。
10.如權(quán)利要求1所述的制備rh PDGF-BB的水凝膠制劑的方法，其中還可以加入防腐劑，優(yōu)選的為水溶性的苯甲酸(鈉)及尼泊金類。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備一種藥物的水凝膠制劑的方法，具體地，本發(fā)明涉及制備重組血小板源生長(zhǎng)因子(rhPDGF－BB)的水凝膠制劑的方法。
文檔編號(hào)A61P3/00GK1506113SQ02153958
公開(kāi)日2004年6月23日 申請(qǐng)日期2002年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月9日
發(fā)明者卓冰, 卓 冰 申請(qǐng)人:北京金賽獅生物制藥技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司, 北京金賽獅生物制藥技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任