專(zhuān)利名稱(chēng)：日本血吸蟲(chóng)核酸疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及人畜共患寄生蟲(chóng)病核酸疫苗，特別是針對(duì)血吸蟲(chóng)病的核酸疫苗。
背景技術(shù)：
血吸蟲(chóng)病是危害人類(lèi)健康，影響國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展的人畜共患寄生蟲(chóng)病，據(jù)1990年WHO資料，血吸蟲(chóng)病分布于76個(gè)國(guó)家和地區(qū)，估計(jì)5-6億人口受威脅，患病人數(shù)達(dá)2億多，我國(guó)仍有150萬(wàn)病人，耕牛感染也相當(dāng)嚴(yán)重，是發(fā)展中國(guó)家包括中國(guó)的一個(gè)主要公共衛(wèi)生問(wèn)題。長(zhǎng)期以來(lái)，人們將對(duì)血吸蟲(chóng)病的有效防治寄希望于有效疫苗的研制開(kāi)發(fā)，現(xiàn)有血吸蟲(chóng)疫苗主要有減毒活疫苗和基因工程蛋白疫苗。血吸蟲(chóng)尾蚴減毒活疫苗需要特定設(shè)備攜帶不方便，數(shù)量來(lái)源有限，存在血吸蟲(chóng)尾蚴的毒力回復(fù)，即存在安全性問(wèn)題；基因工程蛋白疫苗的制備繁瑣，制備流程長(zhǎng)，費(fèi)時(shí)，費(fèi)力，人力物力花費(fèi)較大，推廣應(yīng)用受到限制。研制出安全、經(jīng)濟(jì)、有效、制備簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定不需冷藏系統(tǒng)，利于存儲(chǔ)運(yùn)輸和使用方便，一次免疫能產(chǎn)生較為持久的免疫保護(hù)效果的血吸蟲(chóng)疫苗，是人們的長(zhǎng)久愿望。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種血吸蟲(chóng)核酸疫苗，即血吸蟲(chóng)DNA疫苗，包括單價(jià)血吸蟲(chóng)核酸疫苗和多價(jià)血吸蟲(chóng)核酸疫苗，使其具有安全、經(jīng)濟(jì)、有效、制備簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定不需冷藏系統(tǒng)，利于存儲(chǔ)運(yùn)輸和使用方便，一次免疫能產(chǎn)生較為持久的免疫保護(hù)效果等優(yōu)點(diǎn)，克服現(xiàn)有血吸蟲(chóng)疫苗的不足，從而有效控制人畜感染，減少傳播來(lái)源和對(duì)人的威脅，根本改善血吸蟲(chóng)流行病學(xué)狀況。
本發(fā)明提供的血吸蟲(chóng)核酸疫苗，由真核表達(dá)載體pCD或pBK和血吸蟲(chóng)抗原基因組成，其血吸蟲(chóng)抗原基因?yàn)槿毡狙x(chóng)抗原基因Sj-23、Sj-26或Sj-32[Richer D et al.JImmunol，1993；151(1)256-265]。日本血吸蟲(chóng)抗原基因Sj-23、Sj-26和Sj-32的堿基序列[SmithDB，Davem KM，Board PG，et al.Mr 26000 antigen of Schistosoma japonicum recognized byresistant WEHI 129/J mice is a parasite glutathione S-transferase.Proc Natl Acad Sci USA1986；838703-8707]；[Merckelbach A，Hasse S，Dell R，et al.cDNA sequences of Schistosomajaponicum coding for two cathepsin B-like protein and Sj32.Trop Med Parasitol 1994；45193-198]；[Davem KM et al.Mol Biochem Parasitol，1991；48(1)]，分別列于序列表之序列1、序列2和序列3。上述基因的克隆方案均可采用反轉(zhuǎn)錄PCR的方法進(jìn)行，即根據(jù)各基因兩端序列設(shè)計(jì)PCR引物，然后以組織來(lái)源的RNA為摸板，行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增相應(yīng)基因的cDNA，再將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序即可。


圖1 單價(jià)日本血吸蟲(chóng)核酸疫苗制備流程圖；圖2 多價(jià)日本血吸蟲(chóng)核酸疫苗(pBK-Sj26-Sj23)的制備流程圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 單價(jià)DNA疫苗(pCD-Sj26、pCD-Sj32、pCD-Sj23和pBK-Sj26)的制備1.根據(jù)Sj23、Sj26和Sj32的堿基序列設(shè)計(jì)引物，三對(duì)引物的堿基序列分別列于序列表之序列4至9，由上海生工生物公司合成。
Sj23之5′端引物見(jiàn)序列4；Sj23之3′端引物見(jiàn)序列5。
Sj26之5′端引物見(jiàn)序列6；Sj26之3′端引物見(jiàn)序列7。
Sj32之5′端引物見(jiàn)序列8；Sj32之3′端引物見(jiàn)序列9。
2.提取血吸蟲(chóng)總RNA，分別以上述三對(duì)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，即RT-PCR，方法如下稱(chēng)取100mg成蟲(chóng)，加1mlTRI20L試劑(GIBCO)勻漿，置室溫5min。加0.2ml氯仿，劇烈振搖15s后，置室溫2min。在4′1300r/min離心15min，取上清加0.5ml異丙醇，靜置10min沉淀RNA。13000r/min離心10min，RNA沉淀用75％乙醇洗滌一次，空氣干燥后溶于100μlDEPC處理水中。紫外分光光度計(jì)測(cè)260nm及280nm的OD值，確定RNA純度及其含量。1％瓊脂糖變性凝膠電泳分離，并分析其完整性。
cDNA第一鏈合成1～5μg總RNA加0.5μg寡聚核苷酸(dT)12～18及12μl DEPC處理水，于70℃ 10min后置冰浴至少1min。加2μl 10×PCR緩沖液，2μl 25mM MgCl2，1μl 10mM dNTP混合物及2μl 0.1MDDT。置42℃ 5min后，加200u Superscript RT逆轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO)，混勻，繼續(xù)置42℃反應(yīng)50min。置70℃ 15min終止反應(yīng)。最后加2u RNase H，置37℃ 20min，反應(yīng)結(jié)束后置-20℃?zhèn)溆谩?br> PCR反應(yīng)條件為10μl 10×PCR緩沖液，1μl 25mM MgCl2，2μl 10mM dNTP混合物，50mM的兩種引物各1μl，2～5u Taq DNA聚合酶，加水至100μl體積。94℃變性2min后，按94℃變性、55℃退火、70℃延伸各1min進(jìn)行30次循環(huán)。取5μl PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
3.將所得PCR產(chǎn)物Sj26、Sj32和Sj23堿基進(jìn)行酶切后分別連接入真核表達(dá)載體pCD得到Sj26、Sj32和Sj23的DNA疫苗電泳回收雙酶切后的PCR產(chǎn)物。同樣雙酶切pCD及pBK載體DNA，回收大片段。在T4DNA連接酶作用下，將回收的兩種DNA片段連接重組成pCD-Sj26、pCD-Sj32、pCD-Sj23和pBK-Sj26。
PCD購(gòu)自Invitrogen公司，為5.4kb，來(lái)源于PRC/CMV，具有高效表達(dá)。
PBK購(gòu)自Stratagen公司，為4.5kb。
連接反應(yīng)條件10×DNA連接緩沖液 2μlpCD DNA0.1μg目的基因DNA0.1-0.3μgT4DNA連接酶(5-10u/？？) 2μl加水至 20μl混勻后，置14℃反應(yīng)24小時(shí)。
用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，涂板培養(yǎng)，挑取單克隆擴(kuò)增后，小規(guī)模制備上述重組質(zhì)粒進(jìn)行篩選。
感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)接種環(huán)從貯存的大腸桿菌菌種取一環(huán)菌液，在不含抗菌素的LB瓊脂平板上劃線，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜(2)平板上挑取一單菌落，接入2ml不含抗菌素的LB培養(yǎng)基(3)取100μl上述菌液轉(zhuǎn)入含30ml LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，震蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)(4)轉(zhuǎn)入50ml離心管中，置冰上10min，4℃5000rpm離心10min(5)棄上清，將細(xì)菌懸浮于25ml 100mM Cacl2中，冰浴20min，同上離心(6)棄上清，細(xì)菌重新懸浮于1ml 100mM Cacl2中，冰浴30min后用于轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化(1)連接產(chǎn)物5μl與200μl感受態(tài)細(xì)菌混合，冰浴30-60min(2)42℃水浴90-120sec，冰浴2min(3)加800μlLB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)1h(4)每管取100-2005μl菌液，分別加入LB瓊脂板
(5)干燥后，倒置于37℃培養(yǎng)過(guò)夜4.經(jīng)酶切圖譜分析法、PCR擴(kuò)增和核苷酸序列測(cè)定轉(zhuǎn)化子證明成功構(gòu)建了血吸蟲(chóng)DNA疫苗，體內(nèi)、體外的表達(dá)鑒定證實(shí)疫苗具有生物學(xué)功能(1)酶切分析鑒定小量提取質(zhì)粒，將重組DNA質(zhì)粒，用限制性酶消化(Sj26用BamHI和KpnI、Sj32用BamHI和HindIII、Sj23用BamHI和XbaI；限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自華美公司)酶切反應(yīng)條件如下DNA(10μg) xμl酶1(10u/μl)2μl酶1(10u/μl)2μlBuffer E2μl加水至 20μl混勻，離心后置37℃反應(yīng)4～6小時(shí)或過(guò)夜，然后電泳鑒定，結(jié)果可見(jiàn)紫外燈下有一條與目的基因片段大小一致的DNA片段。
(2)PCR擴(kuò)增分析鑒定小量提取質(zhì)粒，將重組DNA質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增用高保真試劑盒購(gòu)自華美公司)，反應(yīng)成分及條件如下10×PCR緩沖液 10μl25mM MgCl26μl10mM dNTP混合物 2μl引物1(50pmol/μl) 1μl引物2(50pmol/μl) 1μl質(zhì)粒DNA 1μlTaqDNA聚合酶(2-5u/μl)1μlH2O 78μl混勻后加2滴礦物油。按94℃變性、55℃退火、72℃延伸各1min在PCR儀上(PERKIN ELMER公司DNA Thermal Cycler 480)進(jìn)行30次循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外燈下可見(jiàn)一條與目的基因大小一致的DNA片段。
(3)核苷酸序列測(cè)定用WizardTMMinipreps DNA純化系統(tǒng)(Promega)制備pSj26，用Version 2.0 DNA測(cè)序酶測(cè)序試劑盒(USB)，分別從插入的eDNA片段兩端進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果與菲律賓株日本血吸蟲(chóng)eDNA核苷酸序列進(jìn)行比較，其核苷酸序列與菲律賓株日本血吸蟲(chóng)cDNA核苷酸序列一致。
(4)表達(dá)鑒定a.體內(nèi)表達(dá)鑒定定位免疫小鼠5周齡雄性昆明小鼠，清去大腿外側(cè)毛，苦味酸定點(diǎn)標(biāo)記，于第一、第十天定點(diǎn)注射100μg/只的質(zhì)粒DNA，注射前一天同一位置用0.5％鹽酸布比卡因50μl預(yù)處理，注射用質(zhì)粒DNA需用生理鹽水調(diào)至濃度1μg/μl。
熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)抗原表達(dá)免疫小鼠于第14天拉頸處死，取定點(diǎn)處肌肉，冰凍切片6～7μm，丙酮固定5min，PBS洗滌3次，加1∶10小鼠陽(yáng)性血清37℃，孵育1h后4℃過(guò)夜，PBS洗后，加入1∶10羊抗鼠熒光抗體，37℃1h后，PBS洗滌，蒸餾水浸泡2分鐘，冷風(fēng)吹干后，熒光顯微鏡下觀察。
b.體外表達(dá)鑒定制備貼壁細(xì)胞NIH3T3成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基(GIB-CO)，37℃，5％CO2，每3d傳代1次。轉(zhuǎn)導(dǎo)前1d，按常規(guī)方法將細(xì)胞傳代，用0.25％胰蛋白酶松散貼壁細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞，1.0～3×105個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)至35mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24h。
制備DOTAP/DNA混合物在滅菌試管中，用20mmol/L Hepes緩沖液(pH7.4)分別稀釋25μl pCD-Sj26和pBK-Sj26至0.5μg/μl(終體積為25μl)。另一試管用Hepes緩沖液與15μl DOTAP(寶靈曼公司)混合，終體積為50μl。將上述兩種溶液混勻，室溫下孵育10～15min。
轉(zhuǎn)導(dǎo)將上述DOTAP/DNA混合物與1ml培養(yǎng)液混勻，加入培養(yǎng)皿，培養(yǎng)3～6h。用新鮮培養(yǎng)液進(jìn)一步培養(yǎng)48h。胰酶消化后，轉(zhuǎn)移至另一放置了蓋玻片的平皿，待細(xì)胞貼壁伸展。取出蓋玻片，2％多聚甲醛固定10min，吹干，備用。
將1∶100rSj26免疫鼠血清加至細(xì)胞片上，37℃濕盒孵育1h，0.2mol/L PBS(pH7.4)洗3次，吹干；再加1∶12羊抗鼠IgG熒光標(biāo)記抗體(武漢生物制研究所產(chǎn)品)，37℃濕盒孵育45min，PBS洗3次，每次5min干燥后加甘油封片，鏡檢。
2.進(jìn)行保護(hù)實(shí)驗(yàn)，經(jīng)動(dòng)物肌肉，皮膚等途徑分別接種三種疫苗，觀察它們誘導(dǎo)動(dòng)物抗血吸蟲(chóng)攻擊感染的能力，并研究疫苗抗感染的免疫機(jī)制觀察指標(biāo)減蟲(chóng)率免疫方案5wk齡雄性BALB/c小鼠(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所)，經(jīng)股四頭肌注射0.5％鹽酸布比卡因，50μl/只。1d后在相同部位注射重組DNA pCD-Sj26/Sj32/Sj23和pBK-Sj26，并設(shè)空載體pBK-CMV對(duì)照，100μg/只，0、3、5wk免疫3次。每組共設(shè)10只小鼠。
小鼠免疫后攻擊感染末次免疫后4wk，每鼠按常規(guī)方法，經(jīng)腹部皮膚人工感染40條日本血吸蟲(chóng)尾蚴。
減蟲(chóng)率和肝組織減卵率計(jì)算 攻擊感染后6wk，自小鼠眼眶取血收集血清后，肝門(mén)靜脈灌注收集成蟲(chóng)并計(jì)數(shù)。按下述公式計(jì)算減蟲(chóng)率 減卵率稱(chēng)取鼠肝總重量后，按常規(guī)方法，用5％KOH消化1g肝組織，計(jì)算每g肝組織蟲(chóng)卵數(shù)(EPG)，然后按下述公式計(jì)算肝組織減卵率及每對(duì)成蟲(chóng)減卵率，成蟲(chóng)對(duì)數(shù)即為雌雄合抱成蟲(chóng)數(shù)。
中和抗體測(cè)定免疫鼠血清中和抗體測(cè)定1∶100 1％可溶性成蟲(chóng)抗原(AWA)，1∶2000可溶性蟲(chóng)卵抗原(SEA)包被PVC板，置4℃過(guò)夜；加免疫鼠血清1∶50稀釋?zhuān)?7℃ 1h；加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 1∶500稀釋?zhuān)?7℃ 1h；加底物鄰苯二胺(OPD)和過(guò)氧化氫顯色30min；2mol/L硫酸終止顯色，∑960nm ELISA讀數(shù)儀(Sigma)測(cè)定OD值。
免疫血清介導(dǎo)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)免疫組和對(duì)照組小鼠每4周采血1次，持續(xù)至28周，分離血清，凍存?zhèn)溆?。采用ELISA方法測(cè)定特異性抗體IgG。按常規(guī)方法從免疫小鼠腹腔收集巨噬細(xì)胞，制備血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)，體外進(jìn)行抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)試驗(yàn)。
小鼠脾臟T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子檢測(cè)以pCD-Sj32 100μg或200μg直接注射BALB/C小鼠肌肉。B組、C組為試驗(yàn)組。A組為對(duì)照組，注射等體積PBS或空載體。6周后剖殺小鼠，分離脾臟制備脾細(xì)胞，應(yīng)用FACSort流式細(xì)胞儀(BD公司)測(cè)定CD4+/CD8+細(xì)胞。同時(shí)，用血吸蟲(chóng)抗原31/32kD(30.8/31.7ku)和非特異的絲裂原(ConA或PHA)刺激脾細(xì)胞，誘生IL-2、TNF和INF-γ細(xì)胞因子，然后采用依賴(lài)細(xì)胞株方法測(cè)定上述細(xì)胞因子的活性和含量。
實(shí)施例2 多價(jià)DNA疫苗(pBK-Sj26-Sj23)的制備為了提高日本血吸蟲(chóng)DNA疫苗誘導(dǎo)機(jī)體抗血吸蟲(chóng)感染的保護(hù)力，本發(fā)明提供了混合DNA疫苗(Cocktail疫苗，即雞尾酒疫苗)和多價(jià)DNA疫苗，即使用特異多肽的堿基接頭連接兩個(gè)候選疫苗分子。
1.多肽的堿基接頭序列根據(jù)日本血吸蟲(chóng)26KDa(Sj26)，23KDa(Sj32)序列及真核表達(dá)載體pBK多克隆位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)2對(duì)引物，在Sj26的3’端，即在Sj26的引物2中設(shè)計(jì)一個(gè)與Sj23 5’端相同的酶切位點(diǎn)XbaI及活動(dòng)度較好的多肽接頭G-G-S的堿基序列，引物序列如下Sj26引物15’-TAAGGATCCCATGTCCCCCTATACTAGG-3’ (序列10)引物25’-AGCTCTAGATCCTCCTTTTGGAGGATGGTCGCC-3’(序列11)Sj23引物15’-CGTCTAGAATGGCGACTTTGGGTACT-3’(序列12)引物25’-CGGGTACCTTAAACATTCTGATAATC-3’(序列13)引物均由上海生工生物公司合成。
2.制備過(guò)程在已構(gòu)建的日本血吸蟲(chóng)26kDa(Sj26)和23kDa(Sj32)真核表達(dá)載體pCD-Sj26，pCD-Sj23的基礎(chǔ)上，根據(jù)Sj26kDa，Sj23kDa序列分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物，且在引物中引入一個(gè)多肽接頭的核苷酸序列G-G-S，PCR擴(kuò)增出26kDa，32kDa基因，將載體pBK與目的基因雙酶切，酶切回收后將Sj23連接入載體pBK中，然后再將Sj26連接入pBK-Sj23中，構(gòu)建成多價(jià)DNA疫苗pBK-Sj26-Sj23，(見(jiàn)附圖2)。
同樣進(jìn)行保護(hù)實(shí)驗(yàn)，經(jīng)動(dòng)物肌肉分別接種三種疫苗，觀察多抗原分子DNA疫苗誘導(dǎo)動(dòng)物抗血吸蟲(chóng)攻擊感染能力，觀察指標(biāo)及方法同前述單價(jià)血吸蟲(chóng)DNA疫苗。多價(jià)血吸蟲(chóng)DNA疫苗可以激活機(jī)體更多的特異性淋巴細(xì)胞抵抗血吸蟲(chóng)的侵襲。
實(shí)施例3 本發(fā)明效果評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明血吸蟲(chóng)DNA疫苗能誘導(dǎo)較好的保護(hù)力，由于血吸蟲(chóng)在體內(nèi)不繁殖，消滅一個(gè)，減少一個(gè)，因而，血吸蟲(chóng)病疫苗不同于其他傳染病疫苗，WHO指出疫苗誘導(dǎo)宿主抗血吸蟲(chóng)的保護(hù)力能達(dá)到50％，即可認(rèn)為誘導(dǎo)的保護(hù)程度較高。本實(shí)驗(yàn)的觀察指標(biāo)有1.減蟲(chóng)率
組別 攻擊尾蚴數(shù) 攻擊感染后 減蟲(chóng)率(％) p值檢獲成蟲(chóng)數(shù)空白對(duì)照組 40 30.60±5.32 -- --DNA疫苗pCD-Sj26組 40 19.22±4.12 37.19 ＜0.01DNA疫苗pCD-Sj32組 40 18.80±5.45 38.56 ＜0.01DNA疫苗pCD-Sj23組 40 20.50±7.96 33.01 ＜0.01DNA疫苗pBK-Sj26組 40 17.00±3.89 44.44 ＜0.012.減卵率組別 攻擊感染后 減卵率(％) p值每g肝組織蟲(chóng)卵數(shù)空白對(duì)照組20110.00±6421.29-- --DNA疫苗pCD-Sj26組 5268.75±2759.65 73.80 ＜0.01DNA疫苗pCD-Sj32組 8905.24±6727.72 55.71 ＜0.01DNA疫苗pCD-Sj23組 10137.50±6314.4849.59 ＜0.01DNA疫苗pBK-Sj26組 10610.66±3107.9547.20 ＜0.013.中和抗體測(cè)定組別 平均OD值免疫前 免疫后空白對(duì)照組 0.1018±0.0050.222±0.037DNA疫苗pCD-Sj26組 0.0948±0.0380.531±0.174DNA疫苗pCD-Sj32組 0.105±0.021 0.447±0.061DNA疫苗pCD-Sj23組 0.1018±0.0270.0429±0.081DNA疫苗pBK-Sj26組 0.1015±0.0110.509±0.1224.免疫血清介導(dǎo)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
100μg pCD-Sj32一次免疫后4周血清IgG抗體滴度即可達(dá)1∶320，8周以后持續(xù)穩(wěn)定在1∶640以上并持續(xù)到免疫后24周，其中最高滴度可達(dá)1∶1280。證實(shí)pCD-Sj32質(zhì)粒免疫小鼠后血清可介導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生很強(qiáng)體外殺傷血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)作用，而正常小鼠血清組未見(jiàn)明顯的童蟲(chóng)表皮損傷。
5.小鼠脾臟T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子檢測(cè)從下表可見(jiàn)，B、C兩免疫組CD8+百分率明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，而CD4+無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果表明，免疫組脾細(xì)胞誘生的IL-2生物學(xué)活性，TNF細(xì)胞毒效應(yīng)和IFN-γ水平，在ConA和31/32kD蛋白刺激下較對(duì)照組明顯增高，免疫組IL-2分別為321.7和150.6U/ml；TNF分別為72.7％和36.8％；INF-γ分別為1435.6和371.3pg/ml。對(duì)照組IL-2分別為117.3和87.4U/ml；TNF分別為24.7％和13.6％；INF-γ分別為666.1和50.0pg/ml。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較有顯著性差異(P＜0.01)。pCD-Sj32 100μg組與200μg注射組無(wú)顯著性差異。
各組小鼠脾臟T細(xì)胞亞群CD4+、CD8+測(cè)定結(jié)果T細(xì)胞亞群(％)(x±s) CD4+/CD8+組別 小鼠數(shù)CD4+CD8+比值A(chǔ)7 32.12±9.85 22.57±7.561.42B8 36.38±11.5241.77±19.12*0.87C8 35.64±9.24 38.41±12.23*0.93與A組(對(duì)照組)比較*P＜0.01本發(fā)明核酸疫苗的減蟲(chóng)率為35.4～44.4％，肝臟減卵率為39.6～69.0％，按照WHO制定的血吸蟲(chóng)疫苗評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明結(jié)果較好。使用本發(fā)明血吸蟲(chóng)DNA疫苗針劑，進(jìn)行肌肉免疫或皮下免疫小鼠，先后6批共計(jì)400多只小鼠觀察，證實(shí)疫苗能有效誘導(dǎo)抗血吸蟲(chóng)的免疫保護(hù)力。本發(fā)明血吸蟲(chóng)DNA疫苗對(duì)環(huán)境無(wú)污染和不良影響；對(duì)動(dòng)物反復(fù)多次的實(shí)驗(yàn)觀察未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。
序列表.txt<110>華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院<120>日本血吸蟲(chóng)核酸疫苗<130>1<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1158<212>DNA<213>血吸蟲(chóng)<400>1tggtaatggt agcgaccggc gctcagctgg aattccctcg gagtctattt attcttgaaa 60aatggcgact ttgggtactg ggatgaggtg tctgaagagt tgtgtgttca tattgaacat120tatctgtctg ttatgttccc ttgtattaat aggcgctggt gcatatgtag aagttaaatt180cagccagtat gaggctaatt tacataaagt ctggcaggcg gctcccatcg caattattgt240ggttggagtg gtaattctca tagtaagctt cttgggctgt tgtggagcta taaaggaaaa300cgtctgcatg ctttacatgt atgcattttt ccttattgtc cttctgattg ctgagttggt360cgccgccatt gttgcggtgg tgtacaagga taaaatcgat gacgaaatta atacactaat420gactggtgct ctggaaaatc caaacgagga aataacggca accatggata agatacaaac480atcattccat tgttgtggag tcaaaggtcc agacgattat aaagggaatg tgccagcatc540atgtaaagaa gggcaagaag tttatgttca gggttgtcta tctgtcttta gtgcattctt600aaaacgcaac ttaataattg ttgcctgtgt ggcattcggt gtatgcttct tccaactgct660aagcatcgtt atagcttgtt gtttgggtca acgaatacac gattatcaga atgtttaaat720tcaaagagtg tagtgtgtgt ggactactca tttctgtttc cttgtttttc ctttttggtt780tttattcaat gatggctttt tattgcctag ataattgtgc cttggttact attatttatg840tattcgattt catcgatgat actctgttgg ataccataat ctcatcgttt cacaatttac900cattattaca aaataaaccg cattgattta cttgatatat attctcacaa atgtgatgaa960tcatcctcat taatcttgtg gtgtatatct cattaataac tttgaatgtt cacaattgcc 1020gtttacatat aattttaagc ctttgatacg ccttttatct aacactatgc ttattttgca 1080gctacaacat cgttagacac gtgtataaat caatgttgtt cggaattccg ccgatactga 1140cgggctccag gagtcgtc 1158
序列表.txt<210>2<211>739<212>DNA<213>血吸蟲(chóng)<400>2tttaggtaac ttggtcatgt cccctatact aggttattgg aaaattaagg gccttgtgca 60acccactcga cttcttttgg aatatcttga agaaaaatat gaagagcatt tgtatgagcg 120cgatgaaggt gataaatggc gaaacaaaaa gtttgaattg ggtttggagt ttcccaatct 180tccttattat attgatggtg atgttaaatt aacacagtct atggccatca tacgttatat 240agctgacaag cacaacatgt tgggtggttg tccaaaagag cgtgcagaga tttcaatgct 300tgaaggagcg gttttggata ttagatacgg tgtttcgaga attgcatata gtaaagactt 360tgaaactctc aaagttgatt ttcttagcaa gctacctgaa atgctgaaaa tgttcgaaga 420tcgtttatgt cataaaacat atttaaatgg tgatcatgta acccatcctg acttcatgtt 480gtatgacgct cttgatgttg ttttatacat ggacccaatg tgcctggatg cgttcccaaa 540attagtttgt tttaaaaaac gtattgaagc tatcccacaa attgataagt acttgaaatc 600cagcaagtat atagcatggc ctttgcaggg ctggcaagcc acgtttggtg gtggcgacca 660tcctccaaaa taaattaaga atgattgttt tagtaaacat tatttatcac ttacaattaa 720actaaatata aatgtcgac 739<210>3<211>1447<212>DNA<213>血吸蟲(chóng)<400>3accagttaca aaatgtagat agaaacaaac atttaaaatt ttgaaataaa ttaataaaga 60gaaataatgt tttattcaat attttttatt catattttac gtattgtact agtagactgt 120aatgaatatt ctgaagaaaa tgttgatgat agacataaat gggctgtttt agttgctgga 180tcaaatggat ttgagaatta tagacatcaa gctgatgtct gtcatgcata tcatgtatta 240ctttcaaagg gtgtaaaacc agaacatatt atcacattta tgtacgatga tattgctcat 300aataaagaaa atccatttcc tgggaaaatt ttcaatgact atagacataa agattattat 360aaaggagtgg ttatcgatta taagggtaaa aaagttaatc caaagacctt tctacaagta 420ctgaaaggtg ataaaagggc tggagggaaa gttctgaaaa gtggtaaaaa tgacgatgta 480tttatatatt tcactgatca tggagctcct ggtatacttg cgttccctga tgacgattta 540catgccaaac catttataaa cactcttaaa tatctacgac aacatcgacg ttattcgaaa 600ttagtcatct acgttgaagc atgtgaatca ggttcaatgt ttgcaggact actaccaact 660gacatcaata tttatgcaac tactgcagca agaccagatg aatctagtta tgcaacattt 720tgtgatgatc cacgaataag tagttgtctc gctgatttat actcgtatga ttggattgtt 780
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序列表.txt<210>13<211>26<212>DNA<213>人工<400>13cgggtacctt aaacattctg ataatc 2權(quán)利要求
1.一種日本血吸蟲(chóng)核酸疫苗，其特征在于由真核表達(dá)載體pCD或pBK和日本血吸蟲(chóng)抗原基因組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(chóng)核酸疫苗，其特征在于所述的日本血吸蟲(chóng)抗原基因?yàn)槿毡狙x(chóng)抗原基因Sj-23。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(chóng)核酸疫苗，其特征在于所述的日本血吸蟲(chóng)抗原基因?yàn)槿毡狙x(chóng)抗原基因Sj-26。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(chóng)核酸疫苗，其特征在于所述的日本血吸蟲(chóng)抗原基因?yàn)檠x(chóng)抗原基因Sj-32。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(chóng)核酸疫苗，其特征在于所述的日本血吸蟲(chóng)抗原基因?yàn)槿毡狙x(chóng)抗原基因Sj-26和日本血吸蟲(chóng)抗原基因Sj-23。
全文摘要
一種血吸蟲(chóng)核酸疫苗，由真核表達(dá)載體pCD或pBK和血吸蟲(chóng)抗原基因組成，血吸蟲(chóng)抗原基因包括日本血吸蟲(chóng)抗原基因Sj－23、Sj－26和Sj－32，構(gòu)成單價(jià)核酸疫苗pCD－Sj26、pCD－Sj32、pCD－Sj23和pBK－Sj26，以及多價(jià)核酸疫苗pBK－Sj26－Sj23，其減蟲(chóng)率為35.4～44.4％，肝臟減卵率為39.6～69.0％，能有效誘導(dǎo)抗血吸蟲(chóng)的免疫保護(hù)力，一次免疫能產(chǎn)生較為持久的免疫保護(hù)效果，對(duì)環(huán)境無(wú)污染和不良影響，無(wú)不良反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61P33/12GK1511588SQ0215419
公開(kāi)日2004年7月14日 申請(qǐng)日期2002年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月31日
發(fā)明者石佑恩, 李柳哲 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院