專利名稱：一組新型抗腫瘤基因治療藥物短干擾核糖核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組siRNA(短干擾核糖核酸)藥物的設(shè)計、合成及其在腫瘤基因治療中的應(yīng)用。
目前腫瘤基因治療的基本策略是通過反義核酸或3’-5’A反義嵌合體引起靶mRNA部分特異或非特異降解，從而達到抑制靶基因表達的作用。前者導(dǎo)入細胞后在很短的時間內(nèi)活性下降，且療效難以判斷，后者的穩(wěn)定性和特異性也有待于進一步證實和提高。而新近發(fā)展起來的RNA干擾技術(shù)可以高度特異地降解靶mRNA。最近研究表明，質(zhì)粒載體介導(dǎo)的RNA干擾作用在人類腫瘤細胞中可維持兩個月，siRNA還可通過RdRP介導(dǎo)的級聯(lián)放大作用更為快速地降解靶mRNA。
本發(fā)明的目的在于以RNAi為基礎(chǔ)，利用人體基因庫搜索技術(shù)、生物計算機信息技術(shù)設(shè)計針對腫瘤相關(guān)基因的siRNA藥物，闡明siRNA藥物對不同人類腫瘤細胞的細胞毒作用及其機制，為腫瘤的基因治療提供更為有效的手段。
以下列舉一些實施例作為對本發(fā)明的進一步說明，但不限制本發(fā)明。實施例1siRNA的序列設(shè)計從siRNA的長度和懸掛突出序列的長度等幾方面對siRNA的沉默效率進行分析表明，最有效的siRNA雙鏈是由21個核苷酸的正義鏈和反義鏈組成，每條鏈的3’端都懸掛突出兩個核苷酸，中間19個核苷酸互補配對(PNAS 2001；9814428-14433.)。懸掛突出的兩個脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸同樣有效，但前者合成更便宜，而且可耐受更多的核酸酶，因此本發(fā)明選擇懸掛突出為dTdT的siRNA序列。
從特定基因完整cDNA序列起始密碼子下游的50-100個核苷酸中選擇靶區(qū)域更為有效(Genes and Development 2001；15188-200.)。由于5’或3’的非翻譯區(qū)及起始密碼子附近調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點較多，所以一般不選擇這些部位。非翻譯區(qū)的結(jié)合蛋白和翻譯起始復(fù)合物可能會對siRNP(short interferingRibonucleoprotein)和RISC(RNA-induced silencing complex)核酸內(nèi)切酶復(fù)合物的結(jié)合有影響。所用的序列一般是前兩個為AA后兩個為TT且G/C含量約為50％的21核苷酸序列。如果cDNA中不含有這樣的序列，也可采用僅前兩個核苷酸為AA的21核苷酸序列。這種情況下，在合成siRNA時需將其正義鏈3’端后兩個核苷酸變?yōu)門T。正義鏈和反義鏈3’端的懸掛突出序列TT是對稱的。siRNA正義鏈懸掛突出部分的修飾不會影響其對靶mRNA的識別，而反義鏈該部分的修飾則可引導(dǎo)其對靶mRNA的識別。同時3’懸掛突出部分用dTdT的方式也可提醒合成者采用正確的合成方向。
如果靶mRNA上沒有前兩個為AA的21核苷酸序列，則可采用僅第二個核苷酸為A的21核苷酸序列。
若所選擇的siRNA雙鏈無沉默作用，其原因可能是序列上的錯誤、基因多態(tài)性以及所用細胞系是否是真正從設(shè)計種系得來的[。siRNA識別特異性研究表明，siRNA雙鏈配對區(qū)上一個單一的點突變即可解除siRNA對mRNA的降解。
根據(jù)上述原則，本發(fā)明從GenBank中獲得了六種基因序列，它們在GenBank中的登記號以及對應(yīng)的siRNA序列相對于起始密碼子的位置分別如下bcl-2(Acc.No.M13995) 562-580mdm-2(Acc.No.NM_002392)22-40H-ras(Acc.No.AF493916) 310-328Cdk-2(Acc.No.AF512553) 4080-4098VEGF(Acc.No.AY047581) 315-333PKCα(Acc.No.NM_002737)259-277六種siRNA的靶mRNA序列及siRNA寡核苷酸序列如下siRNA-MDM2siACE-RNAi-OptionC-DuplexmRNA Target(AA-N19)5’-AAC AGC ACC AUC AGUAGG UAC-3’(SEQ ID No1)Oligo Sequence5’-C AGC ACC AUC AGU AGG UACdTdT-3’(SEQ ID No2)3’-DTdTG UCG UGG UAG UCA UCC AUG-5’(SEQ ID No3)siRNA-HRassiACE-RNAi-OptionC-DuplexmRNA Target(AA-N19)5’-AAG CAC GUC AUC CGA GUC CUU-3’(SEQ ID No4)Oligo Sequence5’-G CAC GUC AUC CGA GUC CUU dTdT-3’(SEQ ID No5)3’-dTdTC GUG CAG UAG GCU CAG GAA-5’(SEQ ID No6)siRNA-Bcl2siACE-RNAi-OptionC-DuplexmRNA Target(AA-N19)5’-AAC UCC GUU AUC CUG GAU CCA-3’(SEQ ID No7)Oligo Sequence5’-C UCC GUU AUC CUG GAU CCA dTdT-3’(SEQ ID No8)3’-dTdTG AGG CAA UAG GAC CUA GGU-5’(SEQ ID No 9)siRNA-CDK2siACE-RNAi-OptionC-DuplexmRNA Target(AA-N19)5’-AAC CGAAAG AUC CGG AAG AGC-3’(SEQ ID No10)Oligo Sequence5’-C CGA AAG AUC CGG AAG AGC dTdT-3’(SEQ ID No11)3’-dTdTG GCU UUC UAG GCC UUC UCG-5’(SEQ ID No12)siRNA-PKCαsiACE-RNAi-OptionC-DuplexmRNA Target(AA-N19)5’-AAG UCC CUU AUC CGC ACC CGG-3’(SEQ ID No13)Oligo Sequence5’-GUC CCU UAU CCG CAC CCG GdTdT-3’(SEQ ID No14)3’-dTdTCAG GGA AUA GGC GUG GGC C-5’(SEQ ID No15)siRNA-VEGFsiACE-RNAi-OptionC-DuplexmRNA Target(AA-N19)5’-AAA GGU UUG AUC CGC AUA AUC-3’(SEQ ID No16)Oligo Sequence5’-A GGU UUG AUC CGC AUA AUCdTdT-3’(SEQ ID No17)3’-dTdTU CCG AAC UAG GCG UAG UAG-5’(SEQ ID No18)21個核苷酸的RNA適宜將核苷的氨基磷酸化保護后用化學(xué)法合成，也可用傳統(tǒng)的DNA/RNA合成儀合成。本發(fā)明所使用的siRNA是由Dharmacon公司合成，siRNA雙鏈純度＞97％。用水溶解RNA雙鏈后，可直接用于轉(zhuǎn)染。這種方式可保證雙鏈復(fù)合體以適當(dāng)形式存在并易于轉(zhuǎn)染。
另外結(jié)果表明，MDM-2、CDK-2、HRas、Bcl-2四種siRNA等比例混合用脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染效果不如四種siRNA分別用脂質(zhì)體包裹后再等比例混合進行轉(zhuǎn)染，其原因可能是四種siRNA混合后相互作用形成復(fù)合體，影響siRNA的識別。實施例3用MTT法檢測siRNA對腫瘤細胞的細胞毒作用按上述實施例2方法轉(zhuǎn)染的細胞在37度，含5％CO2空氣及100％濕度的溫箱中孵育45小時左右。MTT用PBS緩沖液配成2mg/ml溶液，每孔加50μl，37度溫育4小時，使MTT還原為Formazan。吸出上清液，加入150μl DMSO(二甲基亞砜)使Formazan溶解。用酶標儀(Model3550，Bio-Rad)在560nm處測定每個孔的光密度OD560。將各測試孔的OD值減去本底OD值(完全培養(yǎng)基加MTT，無細胞)或空白藥物孔OD值(完全培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞)，各重復(fù)孔的OD值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C％表示，T為加藥細胞的OD值，C為對照細胞的OD值。細胞存活率％＝(加藥細胞OD/對照細胞OD)×100，求出T/C＝50％時的藥物濃度即IC50。siRNA對MCF-7、BEL-7402、KB、HT29等細胞的劑量反應(yīng)曲線和IC50如表1和圖1至圖4所示。
表1.siRNA對不同細胞的IC50 實施例4用Western Blotting檢測siRNA抑制靶基因表達情況用2ml含10％胎牛血清的DMEM(Gibco公司產(chǎn)品)培養(yǎng)液在35mm細胞培養(yǎng)皿中于5％二氧化碳100％濕度培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)MCF-7細胞，覆蓋率達到80％-90％時，按照LipofectAMINETM2000脂質(zhì)體操作方案轉(zhuǎn)染500nM siRNA于細胞中，37-42小時后，將細胞用預(yù)冷的1×PBS(本實施例中各種試劑和常規(guī)操作方法按照“分子克隆實驗指南”第二版中相關(guān)說明部分配制)涮洗兩遍，加入120μl新鮮配制的細胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH7.5；1％NP-40；150mM NaCl；1mg/ml aprotinin；1mg/ml leupeptin；1mM Na3VO4；1mM NaF)，立即用細胞刮刀刮下細胞使其與裂解液充分混合，冰浴30分鐘至1小時。4度、13,000rpm離心15分鐘收集上清于新的EP管中，用標準Bradford法測定蛋白含量。取各樣品等量總蛋白(20-50μg)分別加入等體積的2倍上樣緩沖液，沸水煮沸變性5分鐘后于7.5％-12％的SDS-PAGE凝膠電泳分離各蛋白，按照“分子克隆實驗指南”第二版中相關(guān)部分說明轉(zhuǎn)移印跡蛋白到PVDF膜上。轉(zhuǎn)完的膜浸于含5％(w/v)脫脂奶粉TBS溶液中后室溫振搖封閉過夜，TBS(10mM Tris HCl，pH7.5，150mM NaCl)室溫潤洗5次，每次5分鐘，裝入雜交袋，用含1％BSA的TBS溶液稀釋第一抗體，室溫孵育3小時，TBS室溫潤洗5次，每次5分鐘。裝入新的雜交袋內(nèi)，用二抗(兔抗HRP-辣根過氧化物酶)溫育3小時，TBS室溫潤洗5次，每次5分鐘。膜上滴加化學(xué)發(fā)光增強劑(Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品)，按照試劑說明進行操作，通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)ChemiImager5500(AlphaInnotech.)捕獲圖像。四種siRNA均能抑制MCF-7細胞中相應(yīng)蛋白的表達(圖5-圖8)。其中siRNA-MDM2在降低Mdm2蛋白表達量同時，也解除了Mdm2蛋白對p53蛋白的抑制，使p53蛋白的表達量升高(圖9)。在轉(zhuǎn)染siRNA-Bcl2、siRNA-MDM2的同時檢測PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)蛋白表達量，以保證各組樣品總蛋白上樣量的一致(圖10、圖11)。各種抗體的稀釋比例如下，小鼠單克隆Mdm2抗體(sc-5304)1/150稀釋，小鼠單克隆HRas抗體(sc-29)1/200稀釋，兔多克隆p53抗體(sc-6243)1/200稀釋，兔多克隆CDK2(sc-163)抗體1/200稀釋，小鼠單克隆Bcl-2抗體(Oncogene Product，OP60)1/200稀釋，小鼠單克隆PCNA抗體(Oncogene Product，NA-03)1/200稀釋，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠抗體(ZB-2305)和辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體(ZB-2301)1/3000稀釋。實施例5HE染色法觀察細胞染色質(zhì)濃縮和死亡情況細胞接種于含有蓋玻片的培養(yǎng)瓶中，放入CO2孵箱培養(yǎng)18-20小時，使細胞覆蓋80％-90％瓶底面積，轉(zhuǎn)染300nM siRNA-MDM2處理約20小時，取出長有細胞的蓋玻片，用PBS洗3次。將蓋玻片浸入95％酒精固定15分鐘。PBS洗2次，每次數(shù)分鐘。浸入蘇木精染液，染色5-10分鐘，自來水浸洗。浸入稀鹽酸酒精溶液進行分色，數(shù)秒鐘即可，自來水浸洗。浸入淡氨水中，使細胞核藍化3-5分鐘，自來水浸洗。浸入伊紅染液，染色5-10分鐘后，自來水浸洗。經(jīng)70％、80％、90％酒精各1次、95％酒精2次和100％酒精3次逐級脫水，每次1分鐘。通過二甲苯3次，每次1分鐘。在載玻片上滴加中性樹膠，將有細胞一面的蓋玻片向下封固于載玻片上。用Leica顯微成像系統(tǒng)(Leica Q500IW)拍攝細胞染色質(zhì)濃縮圖像(圖12)。
發(fā)明效果本發(fā)明提出一種全新的腫瘤基因治療藥物—siRNA的設(shè)計與體外藥效學(xué)研究方案，合成了針對六種基因序列的siRNA，用MTT法檢測了其對三種人類腫瘤細胞的細胞毒作用，用Western Blotting檢測四種siRNA降低其靶蛋白表達水平可達80％以上，HE染色觀察到siRNA-MDM2、siRNA-Bcl2可以引起MCF-7細胞的明顯死亡和染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象。因此，siRNA藥物對腫瘤的基因治療有著廣泛的發(fā)展前景。


圖1.六種siRNA對MCF-7細胞的劑量-反應(yīng)曲線，其中Bcl2siRNA-Bcl2CDK2siRNA-CDK2HRassiRNA-HRasPKCαsiRNA-PKCαMDM2siRNA-MDM2VEGFsiRNA-VEGFMix1siRNA-Mix1，四種siRNA先混合后再用脂質(zhì)體包裹圖2.四種siRNA混合后對MCF-7細胞的劑量-反應(yīng)曲線，其中Mix1siRNA-Mix1，四種siRNA先混合后再用脂質(zhì)體包裹Mix2siRNA-Mix2，四種siRNA先分別用脂質(zhì)體包裹后再混合圖3.五種siRNA對MCF-7細胞的IC50值，其中1siRNA-Bcl22siRNA-CDK23siRNA-HRas4siRNA-PKCα5siRNA-MDM26siRNA-Mix1，四種siRNA先混合后再用脂質(zhì)體包裹7siRNA-Mix2四種siRNA先分別用脂質(zhì)體包裹后再混合圖4.siRNA對BEL-7402細胞的劑量-反應(yīng)曲線，其中MDM2siRNA-MDM2Bcl2siRNA-Bcl2圖5.Western Blotting檢測siRNA-HRas引起MCF-7細胞靶蛋白表達水平降低，其中C以水作為siRNA-HRas的空白對照1siRNA-HRas圖6.Western Blotting檢測siRNA-CDK2引起MCF-7細胞靶蛋白表達水平降低，其中C以水作為siRNA-CDK2的空白對照1siRNA-CDK2圖7.Western Blotting檢測siRNA-Bcl2引起MCF-7細胞靶蛋白表達水平降低，其中C以水作為siRNA-Bcl2的空白對照1siRNA-Bcl2圖8.Western Blotting檢測siRNA-MDM2引起MCF-7細胞靶蛋白表達水平降低，其中C以水作為siRNA-MDM2的空白對照1siRNA-MDM2圖9.Western Blotting檢測siRNA-MDM2引起MCF-7細胞P53蛋白表達水平升高，其中C以水作為siRNA-MDM2的空白對照1siRNA-MDM2圖10.Western Blotting檢測siRNA-Bcl2轉(zhuǎn)染后MCF-7細胞PCNA蛋白表達水平，以此確證各組樣品總蛋白上樣量相等，其中C以水作為siRNA-Bcl2的空白對照1siRNA-Bcl2圖11.Western Blotting檢測siRNA-MDM2轉(zhuǎn)染后MCF-7細胞PCNA蛋白表達水平，以此確證各組樣品總蛋白上樣量相等，其中C以水作為siRNA-MDM2的空白對照1siRNA-MDM2圖12.siRNA-MDM2引起MCF-7細胞死亡和染質(zhì)濃縮，其中A以水作為siRNA-MDM2的空白對照BsiRNA-MDM權(quán)利要求
1.一組抗腫瘤基因治療藥物siRNAs，包括siRNA-MDM2、siRNA-HRas、siRNA-Bcl2、siRNA-CDK2、siRNA-PKCα、siRNA-VEGF，其特征是所說的siRNAs序列均具有21-nt的雙鏈RNA復(fù)合體，每條鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛狀態(tài)，正義鏈與反義鏈有19個堿基互補配對。
2.如權(quán)利要求1所述的siRNAs，其特征是siRNA-MDM2的靶mRNA序列為5’-AAC AGC ACC AUC AGU AGG UAC-3’(SEQ ID No1)寡核苷酸序列為5’-C AGC ACC AUC AGU AGG UAC dTdT-3’(SEQ ID No2)3’-dTdTG UCG UGG UAG UCAUCC AUG-5’(SEQ ID No3)
3.如權(quán)利要求1所述的siRNAs，其特征是siRNA-HRas的靶mRNA序列為5’-AAG CAC GUC AUC CGA GUC CUU-3’(SEQ ID No4)寡核苷酸序列為5’-G CAC GUC AUC CGA GUC CUU dTdT-3’(SEQ ID No5)3’-dTdTC GUG CAG UAG GCU CAG GAA-5’(SEQ ID No6)
4.如權(quán)利要求1所述的siRNAs，其特征是siRNA-Bcl2的靶mRNA序列為5’-AAC UCC GUU AUC CUG GAU CCA-3’(SEQ ID No7)寡核苷酸序列為5’-C UCC GUU AUC CUG GAU CCA dTdT-3’(SEQ ID No8)3’-dTdTG AGG CAA UAG GAC CUA GGU-5’(SEQ ID No9)
5.如權(quán)利要求1所述的siRNAs，其特征是siRNA-CDK2的靶mRNA序列為5’-AAC CGA AAG AUC CGG AAG AGC-3’(SEQ ID No10)寡核苷酸序列為5’-C CGA AAG AUC CGG AAG AGC dTdT-3’(SEQ ID No11)3’-dTdTG GCU UUC UAG GCC UUC UCG-5’(SEQ ID No12)
6.如權(quán)利要求1所述的siRNAs，其特征是siRNA-PKCα的靶mRNA序列為5’-AAG UCC CUU AUC CGC ACC CGG-3’(SEQ ID No13)寡核苷酸序列為5’-GUC CCU UAU CCG CAC CCG GdTdT-3’(SEQ ID No14)3’-dTdT CAG GGA AUA GGC GUG GGC C-5’(SEQ ID No15)
7.如權(quán)利要求1所述的siRNAs，其特征是siRNA-VEGF的靶mRNA序列為5’-AAA GGU UUG AUC CGC AUA AUC-3’(SEQ ID No16)寡核苷酸序列為5’-A GGU UUG AUC CGC AUA AUC dTdT-3’(SEQ ID No17)3’-dTdTU CCG AAC UAG GCG UAG UAG-5’(SEQ ID No18)
8.一組siRNAs在制備腫瘤基因治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明利用生物計算機信息技術(shù)從GenBank中獲得一組與人類腫瘤相關(guān)的基因序列，并以RNA干擾技術(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計出一組可能誘發(fā)RNA干擾的siRNA，通過化學(xué)法合成一定量的siRNA，以此作為新型抗腫瘤藥物具有高效、特異的特點，經(jīng)MTT法檢測，對siRNA對MCF－7、BEL7402、KB、HT－29等腫瘤細胞有明顯的細胞毒作用，WesternBlotting檢測siRNA能降低特異蛋白的表達水平達80％－90％，形態(tài)學(xué)觀察表明siRNA能引起腫瘤細胞發(fā)生相應(yīng)的形態(tài)變化和染色質(zhì)濃縮，與以往藥物相比，siRNA是一種機制全新、高效快速的抗腫瘤藥物。
文檔編號A61K48/00GK1425466SQ0215903
公開日2003年6月25日 申請日期2002年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月27日
發(fā)明者邵榮光, 劉鐵剛, 殷勤偉, 張敏 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所