專(zhuān)利名稱(chēng)：一種含有表皮生長(zhǎng)因子的皮膚組織工程支架的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)療器械敷料類(lèi)，具體地說(shuō)它是采用組織工程方法以胎牛皮及牛跟腱的膠原為支架構(gòu)建皮膚組織工程支架的方法。
背景技術(shù)：
隨著組織工程科學(xué)的出現(xiàn)和發(fā)展，皮膚創(chuàng)傷修復(fù)敷料研究已從單純的創(chuàng)傷包覆敷料研究轉(zhuǎn)向活性人工皮膚研究，利用組織工程構(gòu)建的活性人工皮膚成為皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的最佳選擇。
皮膚組織工程支架的研究是組織工程研究的重點(diǎn)之一，已有近20年的歷史，人們對(duì)以PLGA、乙丙交酯為主的聚酯類(lèi)和以絲素、膠原為主的天然生物材料進(jìn)行深入研究表明，聚酯類(lèi)雖然生物性能良好，但降解后的產(chǎn)物會(huì)使周?chē)M織酸度升高，在使用上受到限制；以膠原為主的天然生物材料因具有良好的生物相容性和促進(jìn)組織修復(fù)再生、止血等特點(diǎn)日益引起重視。
膠原蛋白具有G-x-y的重復(fù)結(jié)構(gòu)域，種屬間差異較小，屬免疫原性較低的蛋白質(zhì)大分子，但不同種屬和同種屬間仍存在差異，這一差異導(dǎo)致膠原存在一定的免疫特性。
膠原溶液經(jīng)冷凍干燥形成的膠原海綿膜彈性差、易破碎、穩(wěn)定性差，因而需外加交聯(lián)劑或經(jīng)特殊處理進(jìn)行交聯(lián)。
已有的以膠原蛋白為原料制成膠原海綿膜作為創(chuàng)傷敷料的技術(shù)中，有的以戊二醛作為交聯(lián)劑，提高了膠原海綿膜的強(qiáng)度、韌性和穩(wěn)定性，但已有報(bào)道證實(shí)戊二醛具有明顯的細(xì)胞毒性，以含有戊二醛的海綿膜培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞向內(nèi)生長(zhǎng)很少，并且隨著膠原海綿膜在體內(nèi)的逐漸降解，戊二醛單體也會(huì)隨之釋放入體液中，對(duì)肌體產(chǎn)生毒害，因此戊二醛不是理想的交聯(lián)劑；有的用硫酸軟骨素作為交聯(lián)劑，提高了膠原海綿膜的強(qiáng)度和對(duì)酶的耐受性，但硫酸軟骨素與膠原分子只能弱鍵結(jié)合，其本身具有促進(jìn)疤痕形成、降低膠原凝血能力等缺點(diǎn)，同樣不是理想的交聯(lián)劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是為了克服已有技術(shù)的缺點(diǎn)不足之處，提供一種無(wú)抗原性、強(qiáng)度高、柔韌性和耐酶性好、對(duì)肌體無(wú)毒害、含有表皮生長(zhǎng)因子的皮膚組織工程支架的構(gòu)建方法。
采用以下工藝技術(shù)可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的(a)、以胎牛皮或牛跟腱為基料，按常規(guī)方法進(jìn)行脫毛、去筋膜及脂肪和污血、清洗、冷凍、切薄片，用丙酮脫水，再用石油醚脫脂，制成脫水脫脂的胎牛皮或牛跟腱為原料，用雙蒸水清洗原料后加入反應(yīng)器內(nèi)，加入原料重量1～5％的胃酶或無(wú)花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠蘿酶，與原料重量10倍的水配制的水溶液進(jìn)行一次酶處理，在20～40℃、pH＝2～8條件下、機(jī)械振動(dòng)8～12小時(shí)，降解組織纖維間的共價(jià)鍵，經(jīng)離心分離，棄上清液取沉淀用雙蒸餾水洗滌三次以上，加入原料重量的50～150倍的0.5M醋酸溶液，在0～20℃溫度下，振動(dòng)24～32小時(shí)，再加入氯化鈉，使溶液中氯化鈉濃度達(dá)到2M，沉淀完全后，經(jīng)離心分離，棄上清液取沉淀裝入透析袋進(jìn)行透析3～4次，收集透析后膠原溶液，加入反應(yīng)器內(nèi)，并加入上述原料重量1～3％的無(wú)花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠蘿酶，與原料重量10倍的配制的水溶液進(jìn)行二次酶處理，在30～40℃、pH＝2～8條件下、機(jī)械振動(dòng)4～8小時(shí)，去除抗原決定簇；再按常規(guī)方法酶滅活處理，經(jīng)離心分離，棄上清液用原料重量50～150倍的0.05～0.5M的醋酸水溶液溶解，得到酸溶性0.5～4mg/ml的無(wú)抗原性膠原溶液；(b)、再將(a)項(xiàng)的無(wú)抗原性膠原溶液倒入預(yù)冷模型中，在-10～-70℃溫度下冷凍4～24小時(shí)，再真空冷凍干燥24～48小時(shí)，得到孔徑均勻，厚度為0.1～0.5mm的膠原海綿膜，然后置入0.5～10％濃度的丙三醇水溶液中，丙三醇水溶液用量為膠原海綿膜重量50～150倍，吸附膨脹后取出膠原海綿膜，在105～130℃溫度下，真空干燥18～32小時(shí)，得到干膠原海綿膜；(c)、將肝素溶于0.005～1M的醋酸水溶液中，水溶液肝素含量為0.1～10mg/ml，然后用100目濾網(wǎng)過(guò)濾，得到肝素醋酸水溶液；(d)、將表皮生長(zhǎng)因子溶于三蒸水中，三蒸水中表皮生長(zhǎng)因子的含量為0.001～0.1μg/ml，得到表皮生長(zhǎng)因子水溶液；(e)、最后將(c)項(xiàng)的肝素醋酸水溶液和(d)項(xiàng)的表皮生長(zhǎng)因子水溶液按體積比1∶1～50的比例混合，機(jī)械振動(dòng)48小時(shí)后，將上述混合液再與5％的丙三醇水溶液按體積比0.1～5∶100混合后，浸潤(rùn)(b)項(xiàng)的干膠原海綿膜，潤(rùn)濕后，在-10～-70℃溫度下，冷凍4～10小時(shí)，再真空干燥，得到的構(gòu)建含有表皮生長(zhǎng)因子的皮膚組織工程支架。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)及效果1)、本發(fā)明制成的皮膚組織工程支架所用膠原海綿膜無(wú)抗原性。
膠原的抗原決定簇位于膠原分子的非螺旋的尾肽部分，本發(fā)明首先采用專(zhuān)一性強(qiáng)的胃酶或無(wú)花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠蘿酶對(duì)膠原的共價(jià)鍵進(jìn)行定向切除，然后用無(wú)花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠蘿酶對(duì)膠原的尾肽進(jìn)行切除，使膠原不再具有抗原性。
2)、采用增塑和熱交聯(lián)聯(lián)合處理工藝技術(shù)，制成的皮膚組織工程支架強(qiáng)度高、柔韌性和耐酶性好，對(duì)創(chuàng)傷肌體無(wú)毒害。
已有技術(shù)的交聯(lián)劑因會(huì)對(duì)肌體產(chǎn)生毒害等均存在一定缺陷，本發(fā)明采用以丙三醇增塑和熱交聯(lián)聯(lián)合處理的方法，制成的皮膚組織工程支架，具有強(qiáng)度高、柔韌性和耐酶性好、對(duì)肌體無(wú)毒害的特點(diǎn)。
3)、本發(fā)明在皮膚組織工程支架中加入表皮生長(zhǎng)因子，可有效誘導(dǎo)創(chuàng)傷部位自體細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。
外源性表皮生長(zhǎng)因子能夠誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，加速創(chuàng)傷修復(fù)，已經(jīng)應(yīng)用于臨床；將外源性表皮生長(zhǎng)因子引入皮膚組織工程支架中，可有效誘導(dǎo)創(chuàng)面組織細(xì)胞分化生長(zhǎng)。
4)、本發(fā)明采用表皮生長(zhǎng)因子緩釋技術(shù)，使表皮生長(zhǎng)因子可以持續(xù)釋放。
無(wú)論體外細(xì)胞培養(yǎng)，還是創(chuàng)傷部位自體細(xì)胞生長(zhǎng)，生長(zhǎng)因子都需要與細(xì)胞接觸超過(guò)一定時(shí)間才能有效發(fā)揮作用，而生長(zhǎng)因子在體內(nèi)的活性半衰期很短(幾小時(shí)或更短)，為解決此問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)引入肝素，促使表皮生長(zhǎng)因子與膠原形成一個(gè)緩釋系統(tǒng)，逐漸釋放出表皮生長(zhǎng)因子，在創(chuàng)傷愈合前保持表皮生長(zhǎng)因子持續(xù)作用于創(chuàng)面組織細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將胎牛皮按常規(guī)方法進(jìn)行脫毛、去筋膜、脂肪和血污、清洗、冷凍、切成厚0.5mm的薄片，用丙酮脫水三次，用石油醚脫脂三次，再抽真空除去石油醚，制成脫水脫脂的胎牛皮為原料，取10g原料，用雙蒸水洗滌加入反應(yīng)器內(nèi)，加入由0.1g胃酶和100g水配制的水溶液。進(jìn)行一次酶處理，在20℃、pH＝2條件下，機(jī)械振動(dòng)24小時(shí)，降解組織纖維間的共價(jià)鍵，經(jīng)離心分離，棄上清液，取沉淀，用雙蒸餾水洗滌三次，加入500g的0.5M醋酸水溶液，在0℃溫度下，機(jī)械振動(dòng)32小時(shí)后，再加入氯化鈉，使溶液中氯化鈉濃度達(dá)到2M，沉淀完全后，離心分離，棄上清，取沉淀裝入透析袋進(jìn)行透析三次，收集透析后膠原溶液加入反應(yīng)器內(nèi)，并加入0.3g菠蘿酶與100g水配制的水溶液進(jìn)行二次酶處理，在30℃、pH＝6條件下，機(jī)械振動(dòng)8小時(shí)，去除抗原決定簇，再按常規(guī)方法酶滅活處理，經(jīng)離心分離，棄上清，用0.05M的醋酸水溶液1000g溶解用失重法測(cè)得含有0.4g/ml無(wú)抗原性膠原溶液，并倒入直徑100mm的預(yù)冷模具中，在-10℃溫度下，冷凍24小時(shí)，再真空干燥24小時(shí)，得到孔徑均勻的厚度為0.1mm膠原海綿膜0.15g，然后置入0.5％濃度的7.5ml丙三醇溶液中吸附膨脹后取出在105℃溫度下，真空干燥32小時(shí)，得干膠原海綿膜，取肝素與0.005M醋酸水溶液中使肝素含量為0.1mg/ml，再將表皮生長(zhǎng)因子溶于三蒸水中，使表皮生長(zhǎng)因子含量為0.01μg/ml，取上述肝素醋酸水溶液100ml與表皮生長(zhǎng)因子溶液100ml混合機(jī)械振動(dòng)48小時(shí)后，取上述混合液0.1mL與5％濃度丙三醇水溶液100ml再次混合，并浸潤(rùn)干膠原海綿膜，潤(rùn)濕后在-70℃溫度下，冷凍4小時(shí)，再真空干燥，得到的構(gòu)建含有表皮生長(zhǎng)因子的皮膚組織工程支架。
實(shí)施例2將牛跟腱按實(shí)施例1的方法進(jìn)行脫水脫脂，抽真空除去石油醚，制成脫水脫脂的牛跟腱為原料，取原料10g用雙蒸水洗滌后加入反應(yīng)器內(nèi)，加入由0.3g胰凝乳蛋白酶與100g配制的水溶液進(jìn)行一次酶處理，在30℃、pH＝6條件下，機(jī)械振動(dòng)16小時(shí)，降解組織纖維間的共價(jià)鍵，經(jīng)離心分離，棄上清，取沉淀，用雙蒸餾水洗滌四次，加入1000g0.5M醋酸水溶液，在10℃溫度下，機(jī)械振動(dòng)28小時(shí)，再加入氯入鈉，使溶液中氯化鈉濃度達(dá)2M，沉淀完全后，離心分離，棄上清，取沉淀，裝入透析袋進(jìn)行透析四次，收集透析后的膠原加入反應(yīng)器內(nèi)，并加入0.2g木瓜酶與100g水配制的水溶液進(jìn)行二次酶處理，在35℃、pH＝7條件下，機(jī)械振動(dòng)6小時(shí)，去除抗原性決定簇，再按常規(guī)方法酶滅活處理，經(jīng)離心分離，棄上清，用0.1M的醋酸水溶液1000g溶解，用失重法，測(cè)得含有2mg/ml無(wú)抗原性膠原溶液，并倒入直徑100mm的預(yù)冷模具中，在-40℃溫度上冷凍10小時(shí)，再真空干燥36小時(shí)，得到孔徑均勻厚度為0.25mm膠原海綿膜0.3g并置入5％濃度的30mL丙三醇水溶液，吸附膨脹后取出，在120℃溫度下，真空干燥20小時(shí)，得到干膠原海綿膜，取肝素溶于0.1M的醋酸溶液中，使肝素含量為5mg/ml，在將表皮生長(zhǎng)因子溶于三蒸水中，使表皮生長(zhǎng)因子含量為0.01μg/ml，取上述肝素醋酸水溶液10ml和表皮生長(zhǎng)因子水溶液200mL混合機(jī)械振動(dòng)48小時(shí)后，取上述混合液1ml與5％濃度丙三醇水溶液100ml再次混合，并浸潤(rùn)干膠原海綿膜，浸潤(rùn)后在-40℃溫度下，冷凍6小時(shí)，再真空干燥，得到的構(gòu)建含有表皮生長(zhǎng)因子的皮膚組織工程支架。
實(shí)施例3用實(shí)施例2的脫水脫脂的牛跟腱為原料，取10g，用雙蒸水洗滌后加入反應(yīng)器內(nèi)，加入由0.5g菠蘿酶與100g水配制的水溶液進(jìn)行一次酶處理，在40℃、pH＝8條件下，機(jī)械振動(dòng)8小時(shí)，降解組織纖維間的共價(jià)鍵，經(jīng)離心分離，棄上清，取沉淀用雙蒸水洗滌四次，加入1500g的0.5M醋酸水溶液中，在20℃溫度下，機(jī)械振動(dòng)24小時(shí)后，再加入氯化鈉使溶液中氯化鈉濃度達(dá)2M，沉淀完全后，離心分離，棄上清，取沉淀裝入透析袋進(jìn)行透析五次，收集透析后的膠原溶液加入反應(yīng)器內(nèi)，并加入0.1g胰凝乳蛋白酶與100g水配制的水溶液進(jìn)行二次酶處理，在40℃、pH＝8條件下機(jī)械振動(dòng)4小時(shí)，除去抗原決定簇，再按常規(guī)方法酶滅活處理，離心分離，棄上清，取沉淀，用0.5M的醋酸水溶液1000g進(jìn)行溶解，用失重法測(cè)定得到含4mg/ml無(wú)抗原膠原溶液，并倒入直徑50mm的預(yù)冷模具中，在-70℃溫度下，冷凍4小時(shí)，再真空干燥48小時(shí)，得到孔徑均勻厚度為0.5mm的膠原海綿膜，0.5g，置入10％濃度的45ml丙三醇溶液吸附膨脹后取出，在130℃溫度下，真空干燥18小時(shí)，得到干膠原海綿膜，取肝素溶于1M的醋酸水溶液中，肝素含量為10mg/ml，再取表皮生長(zhǎng)因子溶于三蒸水中，表皮生長(zhǎng)因子含量為0.1μg/ml，取上述肝素醋酸水溶液5ml與表皮生長(zhǎng)因子水溶液150ml混合機(jī)械振動(dòng)48小時(shí)后，取混合液5ml與5％濃度的丙三醇水溶液100ml再次混合，并浸潤(rùn)干膠原海綿膜，潤(rùn)濕后在-10℃溫度下，冷凍10小時(shí)，再真空干燥，得到的構(gòu)建含有表皮生長(zhǎng)因子的皮膚組織工程支架。
權(quán)利要求
1.一種含有表皮生長(zhǎng)因子的皮膚組織工程支架的構(gòu)建方法，其特征在于它按下述步驟進(jìn)行(a)、以胎牛皮或牛跟腱為基料，按常規(guī)方法進(jìn)行脫毛、去筋膜及脂肪和污血、清洗、冷凍、切薄片，用丙酮脫水，再用石油醚脫脂，制成脫水脫脂的胎牛皮或牛跟腱為原料，用雙蒸水清洗原料后加入反應(yīng)器內(nèi)，加入原料重量1～5％的胃酶或無(wú)花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠蘿酶，與原料重量10倍的水配制的水溶液進(jìn)行一次酶處理，在20～40℃、pH＝2～8條件下、機(jī)械振動(dòng)8～12小時(shí)，降解組織纖維間的共價(jià)鍵，經(jīng)離心分離，棄上清液取沉淀用雙蒸餾水洗滌三次以上，加入原料重量的50～150倍的0.5M醋酸溶液，在0～20℃溫度下，振動(dòng)24～32小時(shí)，再加入氯化鈉，使溶液中氯化鈉濃度達(dá)到2M，沉淀完全后，經(jīng)離心分離，棄上清液取沉淀裝入透析袋進(jìn)行透析3～4次，收集透析后膠原溶液，加入反應(yīng)器內(nèi)，并加入上述原料重量1～3％的無(wú)花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠蘿酶，與原料重量10倍的配制的水溶液進(jìn)行二次酶處理，在30～40℃、pH＝2～8條件下、機(jī)械振動(dòng)4～8小時(shí)，去除抗原決定簇；再按常規(guī)方法酶滅活處理，經(jīng)離心分離，棄上清液用原料重量50～150倍的0.05～0.5M的醋酸水溶液溶解，得到酸溶性0.5～4mg/ml的無(wú)抗原性膠原溶液；(b)、再將(a)項(xiàng)的無(wú)抗原性膠原溶液倒入預(yù)冷模型中，在-10～-70℃溫度下冷凍4～24小時(shí)，再真空冷凍干燥24～48小時(shí)，得到孔徑均勻，厚度為0.1～0.5mm的膠原海綿膜，然后置入0.5～10％濃度的丙三醇水溶液中，丙三醇水溶液用量為膠原海綿膜重量50～150倍，吸附膨脹后取出膠原海綿膜，在105～130℃溫度下，真空干燥18～32小時(shí)，得到干膠原海綿膜；(c)、將肝素溶于0.005～1M的醋酸水溶液中，水溶液肝素含量為0.1～10mg/ml，然后用100目濾網(wǎng)過(guò)濾，得到肝素醋酸水溶液；(d)、將表皮生長(zhǎng)因子溶于三蒸水中，三蒸水中表皮生長(zhǎng)因子的含量為0.001～0.1μg/ml，得到表皮生長(zhǎng)因子水溶液；(e)、最后將(c)項(xiàng)的肝素醋酸水溶液和(d)項(xiàng)的表皮生長(zhǎng)因子水溶液按體積比1∶1～50的比例混合，機(jī)械振動(dòng)48小時(shí)后，將上述混合液再與5％的丙三醇水溶液按體積比0.1～5∶100混合后，浸潤(rùn)(b)項(xiàng)的干膠原海綿膜，潤(rùn)濕后，在-10～-70℃溫度下，冷凍4～10小時(shí)，再真空干燥，得到的構(gòu)建含有表皮生長(zhǎng)因子的皮膚組織工程支架。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有表皮生長(zhǎng)因子的皮膚組織工程支架的構(gòu)建方法，其特征是它以胎牛皮或牛跟腱為基料，經(jīng)過(guò)脫水、脫脂處理，進(jìn)行一次酶處理，降低組織纖維間的共價(jià)鍵，再經(jīng)透析，進(jìn)行二次處理，除去抗原決定簇，再用醋酸溶解得到無(wú)抗原性膠原溶液，再制成膠原海綿膜，用丙三醇浸泡吸附，經(jīng)干燥后將肝素醋酸水溶液與表皮生長(zhǎng)因子水溶液的混合物與丙三醇再次混合潤(rùn)濕膠原海綿膜，經(jīng)冷凍干燥構(gòu)建成皮膚組織工程支架。該支架具有無(wú)抗原性、強(qiáng)度高、柔韌性好、手術(shù)植入方便、對(duì)創(chuàng)傷面無(wú)毒害、并可有效誘導(dǎo)創(chuàng)傷面部位自體細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)創(chuàng)面愈合的優(yōu)點(diǎn)及效果。
文檔編號(hào)A61L27/00GK1511592SQ02159528
公開(kāi)日2004年7月14日 申請(qǐng)日期2002年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月30日
發(fā)明者楊穎颙, 于淑賢, 劉杰, 王德文, 楊穎 申請(qǐng)人:中國(guó)皮革和制鞋工業(yè)研究院, 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所