專利名稱：神經(jīng)調(diào)節(jié)素及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)素(neurotonin)及其應(yīng)用。更具體地說，本發(fā)明涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)素、編碼該神經(jīng)調(diào)節(jié)素的cDNA、相關(guān)核酸分子、對該神經(jīng)調(diào)節(jié)素等的單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
運動神經(jīng)的神經(jīng)肌肉接頭中神經(jīng)興奮傳導(dǎo)的缺失導(dǎo)致外周神經(jīng)損傷，且常引起肌病。由于這種原因，已知有各種的疾病情形，例如，感覺遲鈍、運動失常、自主神經(jīng)損傷等。疾病的原因也是各種各樣，在許多病例中詳細病因不為人所知。艾薩克綜合癥被認為是一種引起神經(jīng)末端的VGKC(電壓門控鉀通道)異常和神經(jīng)末端乙酰膽堿的連續(xù)性釋放的神經(jīng)病和肌病，也被認為是連續(xù)性肌纖維活動的綜合癥。存在一些臨床觀察的癥狀，例如，在肌肉收縮如肢體肌強直后引起的松弛困難、疼痛性肌肉痙攣(dolorousmuscular convulsion)和有限手指外展(limited finger abduction)、步行困難、多汗等。雖然這些癥狀的機理還不清楚，但觀察到胸腺瘤并發(fā)癥的出現(xiàn)和血液包含免疫復(fù)合物的病例。因此，也可以假設(shè)出現(xiàn)了自身免疫性疾病。
在現(xiàn)實情況中，還沒有一種特異性的和有效的治療包括艾薩克綜合癥的外周神經(jīng)損傷的方法，當(dāng)前的治療局限于對癥治療，例如，有一種治療方法使用血漿交換、給予維生素B12等。因為現(xiàn)實的老齡社會即將到來，急需一種有效地進行除外周神經(jīng)損傷外，作為糖尿病的并發(fā)癥的外周多神經(jīng)癥(peripheral multiple neurosis)、肌肉的全疼痛性麻痹(whole painfullnumbness)等的治療。
本發(fā)明的發(fā)明人掌握了以下事實，即從艾薩克綜合癥患者分離得到的一種cDNA編碼一種特定的特異性蛋白質(zhì)且該蛋白質(zhì)在患者的血液中增加。作為深入研究的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人鑒定了該cDNA和該蛋白質(zhì)并確定它們是與該疾病狀態(tài)有關(guān)的因素，還確定了它們的序列結(jié)構(gòu)并因此完成了涉及應(yīng)用該核酸分子和蛋白質(zhì)進行診斷和治療的本發(fā)明。按照本發(fā)明的DNA分子和蛋白質(zhì)提供了各種有助于涉及到外周神經(jīng)損傷的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的物質(zhì)和方法。
發(fā)明目的在神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其cDNA編碼的結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的目的是提供一種核酸分子、一種對神經(jīng)調(diào)節(jié)素的單克隆抗體、臨床檢測化學(xué)制劑、一種治療方法、一種新型的載體及通過應(yīng)用它們得到的一種結(jié)合了抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體的血液過濾材料、一種培養(yǎng)介質(zhì)、轉(zhuǎn)基因動物、用于篩選的動物等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種具有下述特性的外周神經(jīng)細胞蛋白質(zhì)(下面稱為“神經(jīng)調(diào)節(jié)素”)，其中該蛋白質(zhì)a)在艾薩克綜合癥患者或其它具有外周神經(jīng)損傷的患者的外周神經(jīng)細胞中找到；b)與在患者血液中找到的一種抗體反應(yīng)；
c)兔免疫引起類似于艾薩克綜合癥癥狀群的癥狀；及d)按SDS-PAGE法測定，其分子量約為66kDa。
按照本發(fā)明的DNA為編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素的cDNA。
此外，按照本發(fā)明的DNA為編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素的DNA或包括如

圖1或2所示的所有核苷酸序列的DNA。
本發(fā)明還包含編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素的核酸分子，包括至少一個與如圖1或2所示的整個或部分核苷酸序列基本一致的核苷酸序列，或包括與任何該序列基本同源或與任何該序列雜交的序列。
按照本發(fā)明的DNA還包括編碼鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素的DNA或包含如圖3或4所示的全部核苷酸序列的DNA。另外，編碼鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素的鼠cDNA也屬于本發(fā)明的范圍。
此外，本發(fā)明還包含編碼鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素的核酸分子，包括至少一個與如圖3或4所示的整個或部分核苷酸序列基本一致的核苷酸序列，或包括與任何該序列基本同源或與任何該序列雜交的編碼鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素的序列。
本發(fā)明還進一步包括該cDNA或任何該核酸分子的反義RNA或反義DNA，或者識別并裂解所說的cDNA、所說的核酸分子或從其一部分轉(zhuǎn)錄獲得的RNA的核酶。
按照本發(fā)明的表達載體、克隆載體或粘粒包含該cDNA或任何所說的核酸分子。
按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體保持該載體或粘粒。
按照本發(fā)明的原核細胞、真核細胞或變異細胞包含任何以上所述的核酸分子。
按照本發(fā)明的神經(jīng)調(diào)節(jié)素具有如圖5或6所示的氨基酸序列。
按照本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有與患者血液中找到的抗體結(jié)合的活性和下面的a)或b)項的特征。
a)多肽，例如具有如圖5或6所示的氨基酸序列的多肽、具有在如圖5或6所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加和/或插入至少一個氨基酸的氨基酸序列的多肽、包括構(gòu)成神經(jīng)調(diào)節(jié)素的抗原性部分的氨基酸序列的合成多肽、其功能等效變異體、或進一步包括前述氨基酸序列的融合多肽；和b)與具有任何如圖1-4所示的核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼的蛋白質(zhì)。
另外，按照本發(fā)明的蛋白質(zhì)能與存在于外周神經(jīng)細胞中的“14-3-3”蛋白結(jié)合并具有下面的a)或b)項的特征a)多肽，例如具有如圖5或6所示的氨基酸序列的多肽、具有在如圖5或6所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加和/或插入至少一個氨基酸的氨基酸序列的多肽、包括構(gòu)成神經(jīng)調(diào)節(jié)素的抗原性部分的氨基酸序列的合成多肽、其功能等效變異體、或進一步包括前述氨基酸序列的融合多肽；和b)與具有任何如圖1-4所示的核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明進一步包括蛋白質(zhì)的免疫活性域或具有該域的片段。
按照本發(fā)明的多肽還包括具有如圖7或8所示的氨基酸序列的多肽、具有在如圖7或8所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加和/或插入至少一個氨基酸的氨基酸序列的多肽、包括構(gòu)成神經(jīng)調(diào)節(jié)素的抗原性部分的氨基酸序列的合成多肽、其功能等效變異體或進一步包括前述氨基酸序列的融合多肽。
按照本發(fā)明的包含任何前述的用于免疫分析的蛋白質(zhì)的試劑用來檢驗識別該蛋白的抗體。
另外，所說的用于免疫分析的試劑被用來評價艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷的診斷或治療效果。
按照本發(fā)明的包含與任何前述的用于免疫分析的蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體的試劑用于分析該蛋白。
另外，該用于免疫分析的試劑被用來評價艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷的診斷或治療效果。
而且在該用于免疫分析的試劑中，任何被分析的蛋白質(zhì)存在于外周神經(jīng)細胞中。
本發(fā)明提供一種分析存在于受檢者體液中并與任何該蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體的神經(jīng)調(diào)節(jié)素的檢測方法。
按照本發(fā)明的篩選與任何該蛋白質(zhì)結(jié)合的配體的方法，包括以下步驟a)使配體的候選化合物與上述的蛋白質(zhì)接觸；及b)選擇具有與該蛋白質(zhì)的結(jié)合活性的候選化合物。
本發(fā)明提供一種根據(jù)抗配體與通過該篩選方法使用該蛋白質(zhì)作為抗配體獲得的配體的親和力測定任何該蛋白的檢驗方法。
按照本發(fā)明的篩選可抑制任何該蛋白質(zhì)與配體結(jié)合的化合物的方法，包括下述步驟a)在候選化合物存在的情況下使該蛋白質(zhì)與配體接觸；及b)選擇具有抑制該蛋白質(zhì)與該配體結(jié)合的活性的候選化合物。
按照本發(fā)明的化合物還包括可通過該篩選方法獲得的化合物。
按照本發(fā)明的神經(jīng)調(diào)節(jié)素抑制劑包含可通過該篩選方法獲得的化合物。
按照本發(fā)明的治療外周神經(jīng)損傷的藥物包含可通過該篩選方法獲得的化合物。
按照本發(fā)明的抗體為能夠與任何該蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。
該抗體包括單克隆抗體。按照本發(fā)明的另一單克隆抗體為抗引起外周神經(jīng)損傷的抗體的單克隆抗體。
按照本發(fā)明的方法包括通過設(shè)定該蛋白質(zhì)或編碼該蛋白的基因的表達作為標記檢測或分離表達前述蛋白質(zhì)的細胞的方法。該方法包括這種情況，即其中該細胞為外周神經(jīng)細胞。
按照本發(fā)明的檢測或分離表達任何該蛋白質(zhì)的細胞的試劑，包含上述的抗體。
按照本發(fā)明的試劑包括含有具有可與該DNA或其部分、或其轉(zhuǎn)錄RNA的雜交的核苷酸序列，并檢測該DNA或該RNA的試劑。
按照本發(fā)明的非人類轉(zhuǎn)基因脊椎動物是其中該DNA的表達經(jīng)過改變或誘導(dǎo)了此種改變的非人類轉(zhuǎn)基因脊椎動物。
該動物是例如外周神經(jīng)損傷模型動物。
按照本發(fā)明的非人類基因敲除脊椎動物是其中該內(nèi)源DNA的表達受到抑制的非人類脊椎動物。
該非人類基因敲除脊椎動物還包括其中另一基因被敲除的非人類脊椎動物。
按照本發(fā)明的細胞包括任何從前述的非人類脊椎動物獲得的細胞。
按照本發(fā)明的篩選方法還包括篩選提高或降低如圖1-4所示的DNA的內(nèi)源啟動子的活性的化合物的方法，包括下述步驟a)在所測試的化合物存在的情況下檢測如圖1-4所示的與DNA的內(nèi)源啟動子下游結(jié)合的基因的表達；及b)選擇增加或降低該表達的化合物。
另外，按照本發(fā)明的篩選方法包括篩選提高或降低如圖1-4所示的DNA的內(nèi)源啟動子的活性的化合物的方法，包括下述步驟a)將所測試的化合物應(yīng)用于非人類脊椎動物或從該動物獲得的細胞；及b)選擇增加或降低敲入的基因的表達的化合物。
按照本發(fā)明用神經(jīng)調(diào)節(jié)素免疫的動物是用于研究艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷和篩選具有改善艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷的作用的物質(zhì)的用神經(jīng)調(diào)節(jié)素免疫的動物。
按照本發(fā)明，兔用神經(jīng)調(diào)節(jié)素免疫以用于篩選改善受抑制的VGKC功能、神經(jīng)末端的信號傳導(dǎo)異?；蛱弁葱约∪獐d攣的蛋白質(zhì)或非蛋白類物質(zhì)。
本發(fā)明提供用于通過應(yīng)用神經(jīng)調(diào)節(jié)素、其相關(guān)蛋白或其它的引起外周神經(jīng)損傷的抗體作為標記檢測與單克隆抗體的特異性結(jié)合的診斷標志，并進而測定從受試者取得的樣本中的神經(jīng)調(diào)節(jié)素、其相關(guān)蛋白或引起外周神經(jīng)損傷的抗體的水平以診斷艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷。
本發(fā)明提供為診斷艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷提供數(shù)據(jù)的檢驗方法，其中測定從受試者取得的樣本中的神經(jīng)調(diào)節(jié)素或引起外周神經(jīng)損傷的抗體的水平。
本發(fā)明提供用于消除由于神經(jīng)調(diào)節(jié)素或引起外周神經(jīng)損傷的抗體的存在造成的麻木以進行治療的血液過濾材料，其中通過血液透析使血液中的神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體或引起外周神經(jīng)損傷的抗體與固定在該過濾材料上的單克隆抗體結(jié)合，因而減少身體內(nèi)的神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體或引起外周神經(jīng)損傷的抗體。
本發(fā)明提供用于在人體或其它動物中刺激對艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷的免疫反應(yīng)的疫苗組合物，該組合物用于刺激對與可接受的藥用載體一起包含在組合物中的至少一種上述的多肽的免疫反應(yīng)，或者刺激對被插入到包含在該組合物中的病毒細胞(virus cell)或宿主細胞中的核酸分子編碼的多肽的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明提供包含如權(quán)利要求31或32所述的單克隆抗體的細胞培養(yǎng)介質(zhì)，用于通過從具有外周神經(jīng)損傷的患者分離的外周神經(jīng)和肌肉系統(tǒng)細胞的孵育去除引起外周神經(jīng)損傷的抗體在體外繁殖成為外周神經(jīng)的細胞，因而導(dǎo)致病因抗體與該單克隆抗體特異性結(jié)合。
附圖簡要說明圖1為人神經(jīng)調(diào)節(jié)素編碼cDNA(短)的核苷酸序列。
圖2為人神經(jīng)調(diào)節(jié)素編碼cDNA(長)的核苷酸序列。
圖3為鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素編碼cDNA(短)的核苷酸序列。
圖4為鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素編碼cDNA(長)的核苷酸序列。
圖5為人神經(jīng)調(diào)節(jié)素(短)的氨基酸序列。
圖6為人神經(jīng)調(diào)節(jié)素(長)的氨基酸序列。
圖7為鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素(短)的氨基酸序列。
圖8為鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素(長)的氨基酸序列。
圖9為通過蛋白質(zhì)印跡法檢測神經(jīng)調(diào)節(jié)素和估算其分子量的照片，也顯示了大鼠(PC-12)和NB-1神經(jīng)細胞(左側(cè))的結(jié)果。66KDa相應(yīng)于神經(jīng)調(diào)節(jié)素(長)，而44KDa相應(yīng)于神經(jīng)調(diào)節(jié)素(短)。
圖10為通過用人神經(jīng)調(diào)節(jié)素免疫兔誘發(fā)外周神經(jīng)損傷的照片。A表示保持自然睡姿的正常兔，B表示經(jīng)過免疫誘發(fā)的外周神經(jīng)損傷的兔，其有一后肢麻痹并表現(xiàn)出步行困難。
圖11為通過以神經(jīng)調(diào)節(jié)素免疫引起兔肌肉組織異常的照片。A表示正常兔的肌肉組織，而B表示具有外周神經(jīng)損傷的兔的肌肉組織。所示的為放大100倍的HE染色獲得的結(jié)果。
圖12為使用人神經(jīng)調(diào)節(jié)素檢測人血清中升高的抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體的結(jié)果的照片。辣根過氧化物酶偶聯(lián)-抗人免疫球蛋白M(anti-human IgM-HRP)被用作二級抗體。A表示具有外周神經(jīng)損傷的患者M的血清，B表示具有外周神經(jīng)損傷的患者A的血清，而C表示正常人的血清。
本發(fā)明的詳細說明本發(fā)明提供了一種具有下述特性的外周神經(jīng)細胞蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)a)在艾薩克綜合癥患者或其它具有外周神經(jīng)損傷的患者的外周神經(jīng)細胞中找到；b)與在患者血液中找到的一種抗體反應(yīng)；c)兔免疫引起類似于艾薩克綜合癥癥狀群的癥狀；及d)按SDS-PAGE法測定，其分子量約為66kDa。
本發(fā)明將按照編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素的cDNA、相關(guān)核酸分子、神經(jīng)調(diào)節(jié)素、神經(jīng)調(diào)節(jié)素的生理功能、關(guān)聯(lián)蛋白、藥用材料及在動物體的應(yīng)用的順序進行詳細說明。
在本說明書中，“外周神經(jīng)損傷”表示除艾薩克綜合癥外的外周神經(jīng)的異常。在本文中，如果必要該術(shù)語在廣義上包括艾薩克綜合癥。
“VGKC”是電壓門控鉀通道的縮寫，其意指電壓依賴性鉀通道。
在“神經(jīng)調(diào)節(jié)素和其關(guān)聯(lián)蛋白”和“神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其關(guān)聯(lián)蛋白”中，“其關(guān)聯(lián)蛋白”也包括抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素的抗體。
編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素的cDNA
編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素的cDNA可通過使用艾薩克綜合癥患者的血清應(yīng)用免疫篩選方法于相當(dāng)于人類基因組的cDNA庫而制備，更具體地說，該從如NB-1細胞的神經(jīng)細胞獲得的cDNA庫通過用常規(guī)方法分離mRNAs和用已知的技術(shù)將該mRNAs整合入λ載體等，并在該mRNA混合物上進行反轉(zhuǎn)錄而創(chuàng)建。該包含抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體的血清被應(yīng)用于該cDNA庫以確定包含表達神經(jīng)調(diào)節(jié)素的cDNA的克隆。
在本發(fā)明的發(fā)明人使用艾薩克綜合癥患者的血清以獲得編碼如上所述的新型蛋白質(zhì)的cDNA而完成該免疫篩選的過程中，發(fā)現(xiàn)了具有不同鏈長度的兩種類型的cDNA。長的編碼該蛋白質(zhì)的cDNA將被稱作“長cDNA”而首先得到的短的編碼386個氨基酸的蛋白質(zhì)的cDNA將被稱作“短cDNA”。
圖1和圖2顯示了編碼該神經(jīng)調(diào)節(jié)素的cDNA的“短cDNA”和“長cDNA”的核苷酸序列。
按照本發(fā)明的DNA編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素或包括如圖1或2所示的整個核苷酸序列。該DNA包括剪接之前的攜帶遺傳信息的基因組結(jié)構(gòu)基因的DNA和含有起始密碼子和終止密碼子的DNA。
另外，編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素的核酸分子，包括至少一個與如圖1或2所示的整個或部分核苷酸序列基本一致的核苷酸序列，或包括與任何該序列基本同源或能與任何該序列雜交的序列，也屬于本發(fā)明的核酸。按照本發(fā)明的核酸分子可以是單鏈或雙鏈DNA、cDNA或RNA。
該“基本同源序列”包括具有大約50％或以上，如60％或以上的序列同一性的序列、功能等效的等位基因變異序列、及通過替換、增加和/或缺失至少一個核苷酸修飾的相關(guān)序列，相似地，“功能等效”意指相似于顯示神經(jīng)調(diào)節(jié)素相同功能的多肽。
能與圖1和圖2所示的序列雜交的核酸分子，或上述定義的基本同源序列或功能等效序列也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在此所用的“雜交”被定義為在非嚴緊(non-stringent)條件(6×SSC，1％SDS，10％Dextran，100g/ml鮭精DNA，室溫)下被結(jié)合及在低嚴緊條件(2×SSC，室溫，優(yōu)選2×SSC，30℃)或高嚴緊條件，例如，2×SSC，65℃下被洗脫的序列。SSC為標準檸檬酸緩沖液(Standard Saline Citrate)的縮寫，意指0.15M NaCl和0.015M檸檬酸鈉，pH7.2。
通過應(yīng)用已知的遺傳工程技術(shù)方法，也可能創(chuàng)建包括至少一個編碼抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體的多肽的核苷酸序列和從如圖1或2所示的神經(jīng)調(diào)節(jié)素編碼序列整合了編碼至少一個抗原決定簇的域的核酸分子。這樣的核酸分子也包括在本發(fā)明中。
為檢測編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素的結(jié)構(gòu)基因及從其中獲得的DNA、從其中獲得的cDNA或包含至少一個與整個或部分如圖1或2所示的核苷酸序列基本一致的核苷酸序列的DNA，根據(jù)應(yīng)用DNA鏈或RNA鏈雜交的原理，優(yōu)選使用與任何上述序列基本同源或功能等效的序列、或能與任何該序列和從該DNA轉(zhuǎn)錄的RNA雜交的序列、含有這些核酸分子的試劑。此外，這些核酸分子也可被用作尋找PCR引物或同源序列部分的雜交探針。
一般，該探針可用放射性同位素標記，更優(yōu)選為非放射性同位素如熒光染料或化學(xué)發(fā)光通過5’端標記方法、切口平移方法、隨機引物方法等標記。用于檢測該DNA或其轉(zhuǎn)錄RNA的試劑優(yōu)選被用作原位雜交、DNA印跡雜交、RNA印跡雜交、噬菌斑雜交、群體雜交等的探針。
這樣的探針也優(yōu)選通過核酸水平上的雜交用來從基因組庫或cDNA庫中尋找目標克隆。
神經(jīng)調(diào)節(jié)素按照本發(fā)明的神經(jīng)調(diào)節(jié)素為具有如圖5或6所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或由cDNA、與該cDNA或能與任何上述的核苷酸序列雜交的DNA一致的基因編碼的蛋白質(zhì)。該神經(jīng)調(diào)節(jié)素具有這樣的活性，即與在上述患者的血液中找到的抗體結(jié)合，更進一步，可與外周神經(jīng)細胞中的“14-3-3”蛋白偶聯(lián)。
該神經(jīng)調(diào)節(jié)素可通過對艾薩克綜合癥患者或其它具有外周神經(jīng)損傷的患者的血清進行免疫篩選獲得，或者，如果已獲得該cDNA，該神經(jīng)調(diào)節(jié)素也可采用已知的重組DNA技術(shù)通過轉(zhuǎn)錄和翻譯該cDNA而制備。
另外，按照本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括具有這樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)的多肽，即具有如圖5或6所示的氨基酸序列的多肽、具有在如圖5或6所示的氨基酸序列中缺失、替換或添加和/或插入至少一個氨基酸的氨基酸序列的多肽、包含構(gòu)成神經(jīng)調(diào)節(jié)素的抗原性部分的氨基酸序列的合成多肽、其功能等效變異的多肽和進一步包括它們的氨基酸序列的融合多肽，這些多肽也被包括在本發(fā)明中。此外，按照本發(fā)明的蛋白質(zhì)除生物來源的蛋白質(zhì)外，可通過部分或全部的人工合成或通過對從生物來源獲得的蛋白質(zhì)的修飾獲得。按照本發(fā)明生物來源的蛋白質(zhì)還包括根據(jù)重組DNA技術(shù)制得的蛋白質(zhì)。
在此使用的“多肽”同時包括具有全長度序列的蛋白質(zhì)和具有與該蛋白質(zhì)相比較短序列的多肽。因此，神經(jīng)調(diào)節(jié)素的免疫活性域或具有該域的片段也包括在本發(fā)明中?！懊庖呋钚浴币庵冈撚虬鄬τ谥赶蛟摰鞍踪|(zhì)的抗體的抗原決定部位并具有抗原性。因此，包含這樣的域的片段保持了抗原性。相似地，包含構(gòu)成神經(jīng)調(diào)節(jié)素的抗原性部分的氨基酸序列的合成多肽也被包括在按照本發(fā)明的蛋白質(zhì)中。
上面所用的關(guān)于多肽的氨基酸序列的術(shù)語“功能等效”是指氨基酸序列經(jīng)過缺失、替換、增加和/或插入至少一個氨基酸的修飾，或通過由例如磷酸化或脫磷酸作用、葡糖基化、脫葡糖基作用等化學(xué)修飾氨基酸殘基的側(cè)基另外獲得氨基酸序列，且不管氨基酸序列的改變而保持與神經(jīng)調(diào)節(jié)素的作用或活性基本相同的情況。這樣的功能等效變異體在某些情況下作為自然生物變異產(chǎn)生或者也可通過采用已知的技術(shù)制造。例如，功能等效的重組多肽可采用已知的技術(shù)如在特定位點的誘變、非特定位點的誘變、酶切和/或氨基酸的連接等產(chǎn)生。
該蛋白質(zhì)，即神經(jīng)調(diào)節(jié)素和其關(guān)聯(lián)蛋白可被用于分析識別和結(jié)合到該蛋白質(zhì)上的抗體。為達到這一目的，用于免疫分析的試劑包括任何上述的蛋白質(zhì)，且可通過抗原-抗體的反應(yīng)和測定與該反應(yīng)有關(guān)的任何實體檢測樣本中的抗體。對于檢測實體，適當(dāng)?shù)厥褂靡阎臋z測手段如除各種包括熒光或化學(xué)發(fā)光的光譜法外的免疫-抗體方法、采用放射性的方法等是可能的。
因為這樣的用于免疫分析的試劑用來檢測和分析特定的作為疾病標志的抗體與神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其關(guān)聯(lián)蛋白的復(fù)合，它也可被用于診斷。更具體地說，使用該試劑診斷艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷，或者通過測定從受試者獲得的樣本中特定的抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體或造成外周神經(jīng)損傷的抗體的水平評價治療效果也是可能的。
在另一實施方式中，為檢測產(chǎn)生抗體的融合細胞，即在下面描述單克隆抗體的生產(chǎn)中有效地從大量的融合細胞中檢測產(chǎn)生特定目標抗體的融合細胞，可能使用該試劑。例如，蛋白質(zhì)如作為抗原的神經(jīng)調(diào)節(jié)素被固定到固相載體上而因此與其結(jié)合的融合細胞上清液中的抗體被檢測到。
能夠與神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其關(guān)聯(lián)蛋白結(jié)合的物質(zhì)或具有可與其結(jié)合的配基的化合物可用作控制神經(jīng)調(diào)節(jié)素的功能的物質(zhì)，包括抗體和可被用于分析的物質(zhì)。此外，也可能使用對抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體的產(chǎn)生有抑制作用的化合物、可能影響抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體的活性的化合物或能阻止抗體與神經(jīng)調(diào)節(jié)素的偶聯(lián)的化合物。這些化合物可能在艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷中顯示某些藥理學(xué)作用。
優(yōu)選，選擇這樣的物質(zhì)的篩選方法包括下述步驟a)使配體的候選化合物與神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其關(guān)聯(lián)蛋白接觸的步驟；及b)選擇具有與該蛋白質(zhì)的結(jié)合活性的候選化合物的步驟。
為分析該蛋白質(zhì)，它可通過其與能用該蛋白質(zhì)作為抗配體的篩選方法獲得的配體的特異性結(jié)合進行測定。
另外，優(yōu)選篩選抑制所說的蛋白質(zhì)與其配體的結(jié)合的化合物的方法應(yīng)包含下述步驟a)在候選化合物存在的情況下使神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其關(guān)聯(lián)蛋白與該配體接觸的步驟；及b)選擇具有抑制該蛋白質(zhì)與其配體的結(jié)合活性的候選化合物的步驟。
該配體或可通過該篩選方法獲得的化合物可作為神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其關(guān)聯(lián)蛋白的抑制劑。因此，通過使用神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其關(guān)聯(lián)蛋白的結(jié)合，由篩選獲得的化合物可被用作治療外周神經(jīng)損傷，包括艾薩克綜合癥的藥物。
cDNA編碼鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素通過雜交克隆從鼠cDNA庫分離編碼鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素的cDNA是可能的。為達到這一目的，也可能使用全長度序列的神經(jīng)調(diào)節(jié)素cDNA作為探針，因而篩選包含陽性克隆的空斑。
圖3和圖4顯示被分離和測序的編碼鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素的cDNA的核苷酸序列。
按照本發(fā)明的DNA包括編碼鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素的DNA或包含全部如圖3或4所示的核苷酸序列的DNA。另外，本發(fā)明還包括編碼鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素、含有至少一個與全部或部分如圖3或4所示的核苷酸序列基本相同的核苷酸序列、與任何該序列基本同源或包含能與任何該序列雜交的序列的核酸分子。按照本發(fā)明的核酸可能為單鏈或雙鏈DNA、cDNA或RNA。
“基本同源”序列包括具有大約50％或以上，如60％或以上的序列同一性的序列、功能等效的等位基因變異序列、及通過替換、增加和/或缺失至少一個核苷酸修飾的其相關(guān)序列，“功能等效”意指具有編碼顯示與神經(jīng)調(diào)節(jié)素相同功能的多肽的序列。
能與圖1和圖2所示的序列雜交的核酸分子，或上述定義的基本同源序列或功能等效序列也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在此所用的“雜交”定義如上。
相似地，通過應(yīng)用已知的遺傳工程技術(shù)方法，也可能創(chuàng)建包括至少一個編碼抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體的多肽的核苷酸序列和從如圖3或4所示的神經(jīng)調(diào)節(jié)素編碼序列整合了編碼至少一個抗原決定簇的域的核酸分子。
上述的編碼人神經(jīng)調(diào)節(jié)素DNA或核酸分子的性質(zhì)、應(yīng)用等精確地應(yīng)用于編碼鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素和其關(guān)聯(lián)蛋白的核酸。
鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素按照本發(fā)明的鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素為具有如圖7或8所示的氨基酸序列的多肽。除鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素之外，本發(fā)明的多肽進一步包括具有以下形式的多肽，即具有在如圖7或8所示的氨基酸序列中缺失、替換或添加和/或插入至少一個氨基酸的氨基酸序列的多肽、包含構(gòu)成神經(jīng)調(diào)節(jié)素的抗原性部分的氨基酸序列的合成多肽、它們的功能等效變異體或進一步包含它們的氨基酸序列的融合多肽。在此使用的“多肽”和“功能等效”定義如上。
上述的編碼人神經(jīng)調(diào)節(jié)素的性質(zhì)、應(yīng)用等精確地應(yīng)用于鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素和其關(guān)聯(lián)蛋白。
神經(jīng)調(diào)節(jié)素和神經(jīng)調(diào)節(jié)素基因的生理功能人類基因組包含具有關(guān)于本發(fā)明人通過應(yīng)用存在于艾薩克綜合癥患者的血清中的相關(guān)抗體的免疫篩選方法新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白的氨基酸序列的信息的結(jié)構(gòu)基因，其定位、表達生理和控制功能的詳細情況還不清楚。至于是否艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷由神經(jīng)調(diào)節(jié)素的過度表達導(dǎo)致或由異位表達衍生引起的問題還需要進一步的闡明，還需要分析神經(jīng)調(diào)節(jié)素及其抗體與外周神經(jīng)損傷之間的關(guān)系。
人神經(jīng)調(diào)節(jié)素還是一種能在人類以外的動物免疫誘發(fā)艾薩克綜合癥癥狀的蛋白質(zhì)，可能使用任何產(chǎn)生免疫反應(yīng)的動物，如靈長類、綿羊、兔、大鼠、小鼠等。
例如，在兔的情況中，帶GST的融合蛋白通過使用含511個氨基酸殘基的全長神經(jīng)調(diào)節(jié)素制得，然后以該融合蛋白作為抗原對兔進行免疫。在接種后約六個月，觀察到與艾薩克綜合癥癥狀類似的外周神經(jīng)損傷的誘發(fā)，例如，后肢麻痹。在以神經(jīng)調(diào)節(jié)素免疫的兔的肌肉中，肌細胞的大小出現(xiàn)與正常肌肉組織不同的不均勻，且觀察到神經(jīng)變性。
在艾薩克綜合癥患者中，神經(jīng)調(diào)節(jié)素基因的表達被加強了以至于對編碼的神經(jīng)調(diào)節(jié)素的抗體的血液水平因而上升。該基因表達的原因、神經(jīng)調(diào)節(jié)素的生理功能及與艾薩克綜合癥的疾病狀態(tài)的關(guān)系還不清楚。由于抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體的產(chǎn)生也增加，在自身免疫性疾病后果的基礎(chǔ)上也很可能引起外周神經(jīng)損傷。綜合這些觀察或?qū)嶒灥慕Y(jié)果，該新發(fā)現(xiàn)和鑒定的神經(jīng)調(diào)節(jié)素是一種與艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷緊密聯(lián)系的蛋白質(zhì)，這一點已得到確認。
鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素的cDNA與相應(yīng)的人cDNA的核苷酸序列具有85％或以上的同源性。在得自鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素cDNA的氨基酸序列水平中，未發(fā)現(xiàn)其它的在同源性上的因素且其功能也還不清楚。鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素基因也以與人神經(jīng)調(diào)節(jié)素基因相同的方式發(fā)揮作用?？梢栽O(shè)想，如果用人神經(jīng)調(diào)節(jié)素免疫鼠，類似于艾薩克綜合癥的外周神經(jīng)損傷，如出現(xiàn)麻痹的后肢，被誘發(fā)。
參照基因的表達，增加或降低該DNA的內(nèi)源啟動子的活性的化合物可通過包括下述步驟的方法篩選a)在所測試的化合物存在的情況下檢測與DNA的內(nèi)源啟動子下游區(qū)域結(jié)合的基因的表達；及b)選擇增加或降低該表達的化合物。
人神經(jīng)調(diào)節(jié)素cDNA的核苷酸序列被轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的氨基酸序列以進行模體研究，結(jié)果，很清楚，主模體缺乏但在C端側(cè)出現(xiàn)脂類修飾的位點?；谕ㄟ^使用神經(jīng)調(diào)節(jié)素的C端側(cè)的部分進行免疫兔后肢出現(xiàn)麻痹和更多的存在于出現(xiàn)麻痹的患者的血清中的對神經(jīng)調(diào)節(jié)素的抗體被發(fā)現(xiàn)是對神經(jīng)調(diào)節(jié)素的C端區(qū)域的抗體的事實，該神經(jīng)調(diào)節(jié)素是一膜蛋白且至少其C端部分在膜中起作用。
從本發(fā)明人的研究中，已經(jīng)證明神經(jīng)調(diào)節(jié)素的C端部分被結(jié)合到“14-3-3蛋白”上。該“14-3-3蛋白”出現(xiàn)在細胞中，且可識別具有磷酸化的絲氨酸殘基的蛋白質(zhì)，而且其作為信號傳導(dǎo)的各種調(diào)質(zhì)的作用已得到確認。因此，能與代替神經(jīng)調(diào)節(jié)素的或與神經(jīng)調(diào)節(jié)素競爭的“14-3-3蛋白”結(jié)合或相互反應(yīng)的蛋白質(zhì)或非蛋白物質(zhì)可在“14-3-3蛋白”上產(chǎn)生類似于對神經(jīng)調(diào)節(jié)素的效應(yīng)。很可能這樣的蛋白質(zhì)或非蛋白物質(zhì)可在艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷中顯示某些藥理學(xué)作用。
據(jù)報道，在某些有艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷的患者的血清中檢測到VGKC的抗體。VGKC的功能性異常被認為與這些疾病情況有關(guān)，另外，從本發(fā)明人的研究中可以清楚地看出，各種抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素的抗體也出現(xiàn)于這些患者的血清中，特別是，大量的患者具有抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素的C端區(qū)域的抗體。相似地，這些抗體也被確認涉及到與神經(jīng)調(diào)節(jié)素的生理功能相關(guān)的癥狀?；谶@種理由，可與這些抗體結(jié)合的抗體、能對該抗體的產(chǎn)生發(fā)揮抑制作用的化合物、可影響該抗體作用的化合物、能阻止該抗體與神經(jīng)調(diào)節(jié)素結(jié)合的化合物等可能在艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷中顯示某些藥理學(xué)作用。
相關(guān)核酸分子按照本發(fā)明通過重組DNA技術(shù)獲得的整合神經(jīng)調(diào)節(jié)素基因的反義RNA和反義DNA、mRNA、cDNA或其相關(guān)核酸分子，還有核酶、粘粒等也被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如果需要，該重組DNA和核酸分子也能被用在各種能在基因診斷方法的建立、基因治療和藥物開發(fā)中應(yīng)用的基因克隆操作中。
·反義RNA和反義DNA因為通過攜帶神經(jīng)調(diào)節(jié)素的翻譯信息的mRNA鏈與其反義互補鏈、或?qū)υ揷DNA或上述核酸分子的反義RNA或反義DNA雜交產(chǎn)生的雙鏈RNA或DNA具有通過與其互補mRNA雜交抑制翻譯的能力，因而抑制了相應(yīng)基因的表達，所以它可被應(yīng)用于反義藥物治療和敲除小鼠的建立。
在反義藥物療法中，反義RNA和反義DNA被用于在基因水平上說明疾病始發(fā)的機理、治療方法的進展等。另外，為控制神經(jīng)調(diào)節(jié)素基因的表達也可能使用該RNA和DNA。更特別地為了抑制目標基因的表達，反義RNA可被注射到細胞中，或者向其中引入用以建立反義RNA的DNA。
·核酶本發(fā)明還包括，在其酶活性已闡明的核酶中，預(yù)定用于特異性切割神經(jīng)調(diào)節(jié)素的RNA、從上述cDNA或核酸分子轉(zhuǎn)錄的相關(guān)RNA、或從其一部分轉(zhuǎn)錄并通過化學(xué)合成制得的相關(guān)RNA、或具有該酶活性位點和RNA切割活性的核苷酸序列的寡DNA的可選擇的核苷酸序列的核酶。
·粘粒因為整合神經(jīng)調(diào)節(jié)素基因的環(huán)狀DNA、其DNA片段或其相關(guān)核酸，再加上必要的成分，如從質(zhì)粒獲得的復(fù)制起點、λ噬菌體的cos部位，能夠以與質(zhì)粒相同的方式復(fù)制，所以可被用作載體。這樣的人工核酸粒子能在其中整合相對較大的DNA片段，因此，為克隆的目的，將該人工核酸粒子有效地引入細菌如大腸桿菌中是可能的。另外，該人工核酸粒子也適用于基因庫的制備。
·表達載體和克隆載體包含轉(zhuǎn)化核酸的微生物細胞如原核細胞或真核細胞可被用于大量所需要的蛋白質(zhì)的表達。
按照本發(fā)明編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素的核苷酸序列被克隆以便通過適當(dāng)?shù)貞?yīng)用一組已知的技術(shù)和表達系統(tǒng)，例如，原核細胞如大腸桿菌或枯草桿菌中的表達系統(tǒng)、真核細胞如酵母或轉(zhuǎn)化哺乳類細胞中的表達系統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因哺乳動物中的表達系統(tǒng)等，進行其表達。
優(yōu)選可使用制備與神經(jīng)調(diào)節(jié)素相關(guān)的合成多肽的方法，包括在該多肽被表達的條件下培養(yǎng)整合了核酸分子的真核細胞或原核細胞，并收集這樣產(chǎn)生的多肽的步驟。
如上所述，本發(fā)明的范圍包括了包含按照本發(fā)明的核酸分子或核苷酸序列的克隆載體和表達載體。這樣的其中閱讀碼框和按照本發(fā)明的核酸分子被恰當(dāng)?shù)剡B接的表達載體整合了適當(dāng)?shù)目刂菩蛄?，例如，翻譯控制元素如起始密碼子和終止密碼子和轉(zhuǎn)錄控制元素如啟動子操縱區(qū)、核糖體結(jié)合部位和終止序列。
按照本發(fā)明的載體的例子包括在重組DNA技術(shù)領(lǐng)域中為人所熟知或已在該技術(shù)的文獻中被描述的質(zhì)粒、噬菌體、病毒(包括真核病毒)等，這些載體能被用在各種眾所周知的表達系統(tǒng)中。優(yōu)選的病毒載體包括桿狀病毒、腺病毒、牛痘病毒等。
為通過使用各種眾所周知的技術(shù)包括按照本發(fā)明的核酸分子或核苷酸序列的表達，載體或粘?？杀徊迦氲皆思毎蛘婧思毎校蛘撸瑸榻⑥D(zhuǎn)基因動物，可以制備把該載體或粘粒保持在生殖細胞系或體細胞中的轉(zhuǎn)化株。
另外，本發(fā)明還包括具有按照本發(fā)明的核酸分子或多核苷酸分子并被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的真核或原核宿主細胞或轉(zhuǎn)基因微生物。為生產(chǎn)這些轉(zhuǎn)化體等，可以使用已知的轉(zhuǎn)化技術(shù)或轉(zhuǎn)染技術(shù)。
如果神經(jīng)調(diào)節(jié)素需要進行翻譯后的修飾如形成二硫鍵、糖基化或程度不同的脂質(zhì)附著，哺乳動物宿主細胞可很好地復(fù)制抗原和抗原決定部位的原始形態(tài)。因此更優(yōu)選為哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。更具體地說，真核表達系統(tǒng)可進行翻譯后的修飾，而大腸桿菌很難復(fù)制抗原的原始形態(tài)且可能產(chǎn)生不溶的蛋白質(zhì)?？蓛?yōu)選用于該目的的動物細胞的例子包括人或動物的成纖維細胞或骨髓瘤細胞系，例如Hela-人細胞系、BHK-新生倉鼠腎細胞、VERO-猴腎細胞系、FR3T3-Fisher大鼠成纖維細胞、NIH3T3-小鼠成纖維細胞系、C127I-小鼠乳腺癌細胞系、CV-1-非洲青猴腎成纖維細胞、3T6-小鼠胚胎成纖維細胞、L細胞-小鼠細胞系、CHO-中國倉鼠卵巢細胞系、NSONSI-SP2和其它小鼠骨髓瘤細胞系、YB2/0和Y3小鼠骨髓瘤細胞系、大鼠骨髓瘤細胞系等。
各種適用于不同種類的哺乳動物細胞系的載體已為人所知且一般包括操縱性地連接到編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其片段的核苷酸序列上的啟動子和/或增強子。這種適當(dāng)?shù)膯幼拥睦影⊿V40起始或后期啟動子，例如，PSVL載體、巨細胞病毒(CMV)啟動子、小鼠金屬硫蛋白(metallothionine)I型啟動子、小鼠胸腺瘤病毒LTR(長末端重復(fù))等。該載體攜帶適宜的標志，例如其基因，如二氫葉酸還原酶或谷氨酰氨合成酶的基因。
宿主細胞的轉(zhuǎn)染可通過使用標準的現(xiàn)有技術(shù)進行，例如為達到這一目的，已建立了磷酸鈣法、用DEAE-右旋糖苷或聚凝胺取代磷酸鈣的方法、原生質(zhì)體融合法、紅細胞影融合法、脂質(zhì)體融合法或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、直接顯微注射法和對哺乳動物細胞系使用基因炮(gene cannon)或電穿孔的轉(zhuǎn)染法。一般而言，線性DNA比環(huán)狀DNA更容易引入。
關(guān)聯(lián)蛋白涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)素的合成多肽可被用于抗體產(chǎn)生、疫苗生產(chǎn)等，這將在下面按神經(jīng)調(diào)節(jié)素的相同方式描述。合成多肽可通過在包含與表達控制序列操縱性連接并包括上述的核苷酸序列的重組DNA的宿主細胞或包含攜帶該重組DNA分子的媒介或載體的宿主細胞中的表達而生產(chǎn)，或者，該多肽也可通過向宿主細胞直接注射本發(fā)明的裸DNA分子而表達。
這樣表達的合成多肽可以是包含顯示全部或部分神經(jīng)調(diào)節(jié)素的免疫原性的片段的融合多肽或進一步由與其融合的重組分子的DNA編碼的額外融合多肽。例如，按照本發(fā)明需要制備這樣的合成神經(jīng)調(diào)節(jié)素，其與蛋白質(zhì)如谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶或HB核心(乙型肝炎核心)抗原，或包含另一多肽的融合蛋白質(zhì)偶聯(lián)。大多數(shù)這樣的融合蛋白質(zhì)是通過其中兩個編碼序列被結(jié)合到一個已調(diào)諧的閱讀碼框的重組基因的表達而形成的，或者，該多肽也可通過體外的化學(xué)方法結(jié)合而成。如此融合或雜交衍生物也被包括在本發(fā)明中且該合成多肽可通過使用化學(xué)方法如現(xiàn)有的Merrifield固相合成法生產(chǎn)。
·抗體蛋白質(zhì)對神經(jīng)調(diào)節(jié)素和其關(guān)聯(lián)蛋白的抗體在艾薩克綜合癥患者或具有其它外周神經(jīng)損傷的患者體內(nèi)產(chǎn)生，因此，各種對神經(jīng)調(diào)節(jié)素的抗體也被發(fā)現(xiàn)存在于這些患者的血清中。特別是，在本發(fā)明的發(fā)明人的研究中，在許多患者中觀察到指向C末端側(cè)部分的抗體，這些抗體也很可能涉及與神經(jīng)調(diào)節(jié)素的生理功能有緊密聯(lián)系的癥狀。因此，能被結(jié)合到這些抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體上的抗體可能在艾薩克綜合癥或外周神經(jīng)損傷中具有某些藥理學(xué)功能。
該抗體可通過用作為抗原的蛋白質(zhì)接種動物并免疫該動物而制備。用于這一目的的動物的例子包括廣泛使用的兔、綿羊、小鼠、大鼠等。但是，所有產(chǎn)生的抗體是從非人動物獲得的多克隆抗體，因此對于人來說是外來物質(zhì)。
在這些抗體中，特別有用和優(yōu)選的是單克隆抗體，是能與單個抗原決定部位特異性結(jié)合的相同抗體。更具體地說，本發(fā)明的范圍包括神經(jīng)調(diào)節(jié)素的單克隆抗體、VGKC抗體的單克隆抗體、對引起外周神經(jīng)損傷的抗體或其它關(guān)聯(lián)蛋白的單克隆抗體等。
在制備這些單克隆抗體的過程中，也可以使用現(xiàn)有的制備和克隆從用作為抗原的神經(jīng)調(diào)節(jié)素免疫的動物脾獲得的淋巴細胞與具有HAT敏感性的骨髓瘤細胞的雜交瘤的細胞融合技術(shù)或使用已知的重組DNA技術(shù)，以進行大規(guī)模生產(chǎn)。
為獲得人化的單克隆抗體，嵌合或人化的抗體通過包括人抗體cDNA與取自從小鼠、大鼠等獲得的動物細胞的抗體cDNA的融合在內(nèi)的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)，也可以采用通過使用人派生細胞和腫瘤細胞克隆、小鼠腫瘤細胞和人細胞的融合及使用轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)人抗體的方法。
該抗體一般應(yīng)用的例子包括測試藥物、診斷藥物、治療藥物、研究用試劑、檢驗用試劑、用于免疫篩選等的涉及到神經(jīng)調(diào)節(jié)素、其關(guān)聯(lián)蛋白和“14-3-3蛋白質(zhì)”的抗體。這些抗體具體應(yīng)用的例子包括用于測定神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其關(guān)聯(lián)蛋白的免疫檢驗的試劑，它包括與神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其關(guān)聯(lián)蛋白反應(yīng)的抗體或特別根據(jù)該事實，即該抗體與神經(jīng)調(diào)節(jié)素等結(jié)合是可檢測的?！翱蓹z測”意指已知的檢測手段如免疫抗體法或使用放射性的方法以及各種光譜方法可適當(dāng)?shù)夭捎?，特定的?yīng)用方式的例子包括放射免疫測定(RIA)法、酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)等。在RIA中，以125I或131I等標記的抗體被固定到固相載體上且測定其放射性。另外，在ELISA中，抗體按同樣的方式被固定到載體上且附加堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶等的二級抗體被添加以進行酶反應(yīng)，而最終測定著色或熒光。
另外，作為應(yīng)用該抗體的這種具體實施的另一實例，可設(shè)計診斷艾薩克綜合癥或外周神經(jīng)損傷和為評價治療效果提供數(shù)據(jù)的測試方法。這種測試方法特征在于測定從受試者取得的樣本中神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其關(guān)聯(lián)蛋白、或者神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體或引起外周神經(jīng)損傷的抗體的水平。
另外，通過使用神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其關(guān)聯(lián)蛋白、或者引起外周神經(jīng)損傷的抗體作為標志檢測與上述抗體的特異性結(jié)合，因此在從受試者獲得的樣本中神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其關(guān)聯(lián)蛋白的水平、或者引起外周神經(jīng)損傷的抗體的水平被測定。所獲得的結(jié)果被用于診斷艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷，或者評價治療效果。參考這些分析試劑，被分析的神經(jīng)調(diào)節(jié)素、其關(guān)聯(lián)蛋白等最初出現(xiàn)在神經(jīng)細胞中。但是，通過分析出現(xiàn)在受試者體液中的抗體，也可能檢測神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其關(guān)聯(lián)蛋白。
通過設(shè)定編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其關(guān)聯(lián)蛋白的基因的表達作為線索，可能檢測或分離產(chǎn)生所說的蛋白質(zhì)的細胞。通過使用抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其關(guān)聯(lián)蛋白的抗體，優(yōu)選其單克隆型抗體作為例如應(yīng)用流式細胞儀方法的檢測手段，可能分離或檢測表達這些蛋白質(zhì)的細胞。作為檢測或分離用的試劑，該抗體，更優(yōu)選為單克隆抗體包括通過附加例如熒光物質(zhì)作為標記獲得的抗體。更明確地說，檢測是通過觀察結(jié)合到細胞上的抗體的熒光激發(fā)進行的，而分離是使用具有自動分類功能的細胞分選儀進行的。
通過采用這種方法，可以在細胞群體中特異性地檢測或分離表達神經(jīng)調(diào)節(jié)素的外周神經(jīng)細胞。例如通過采用這種方法，可能從將在下面說明的非人類轉(zhuǎn)基因脊椎動物或非人類基因敲除脊椎動物獲得的細胞中檢測和分離外周神經(jīng)細胞，這些細胞為檢查神經(jīng)調(diào)節(jié)素基因的表達和控制提供了有用的材料。
本發(fā)明還包括含有按照本發(fā)明的核酸分子或核苷酸序列并被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的真核或原核細胞，或轉(zhuǎn)基因微生物。另外，本發(fā)明還包括產(chǎn)生單克隆抗體的B細胞與腫瘤細胞的融合細胞。該抗體和流式細胞儀被結(jié)合使用，且也可以被用來分離目標的轉(zhuǎn)化體、融合細胞等。
醫(yī)用材料的應(yīng)用按照本發(fā)明的神經(jīng)調(diào)節(jié)素和其關(guān)聯(lián)蛋白可被用于分析、臨床測試、診斷和治療，而且可被用在各種醫(yī)用材料上，例如血液過濾材料、細胞培養(yǎng)介質(zhì)、藥物傳遞系統(tǒng)的載體、疫苗等。盡管應(yīng)用的具體方式將作為實施例加以說明，但本發(fā)明并不局限于它們。
如果血液中的抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體或引起外周神經(jīng)損傷的抗體被結(jié)合到上述固定在過濾材料上的單克隆抗體上，且經(jīng)過血液的透析過濾，過濾后的血液再輸回到患者體內(nèi)，降低體內(nèi)神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體或引起外周神經(jīng)損傷的抗體的量是可能的。這種全血透析的血液交換過濾提供了一種緩解由神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其抗體、或引起外周神經(jīng)損傷的抗體引發(fā)的麻痹的治療方法。為此目的本發(fā)明還提供了結(jié)合該抗體的血液過濾材料的應(yīng)用。
作為另一種實施方式，還可能設(shè)想應(yīng)用包含特異性地與神經(jīng)調(diào)節(jié)素反應(yīng)的單克隆抗體的細胞培養(yǎng)介質(zhì)接種從具有外周神經(jīng)損傷的患者分離的外周神經(jīng)和肌肉系統(tǒng)細胞以使其與涉及外周神經(jīng)損傷原因的抗體結(jié)合，因而去除該抗體，以在體外繁殖作為外周神經(jīng)的細胞。
人化抗體沒有對人的抗原性，因此可以設(shè)想，通過直接結(jié)合到與外周神經(jīng)損傷包括艾薩克綜合癥的原因有關(guān)的神經(jīng)調(diào)節(jié)素或其它蛋白質(zhì)、生物成分等上從而使其失去作用，應(yīng)用這種人化抗體作為治療的手段，或者應(yīng)用這種人化抗體作為DDS(藥物傳遞系統(tǒng))載體以高效地將具有藥物效能的有效生物活性物質(zhì)或化合物輸送到目標部位。考慮到反應(yīng)的均一性，人單克隆抗體可能是特別適宜使用的。
按照本發(fā)明的疫苗組合物在人體或其它非人類物質(zhì)中激發(fā)對艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷的免疫反應(yīng)。該疫苗可以包含任何屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)的多肽，加上可接受的藥用載體以因此激發(fā)對該多肽的免疫反應(yīng)，或包含具有任何上述插入其中的核酸分子的病毒細胞或宿主細胞以因此激發(fā)對由插入的核酸分子編碼的多肽的免疫反應(yīng)。
該疫苗組合物可按照在疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)。這樣的疫苗配方一般可能包括至少一種按照本發(fā)明的多肽，加上至少一種適宜的添加劑，例如氫氧化鋁、皂角苷、Quil A或其精制形式、胞壁酰二肽、礦物油、novasom等，如果恰好是存在至少一種可接受的藥用載體或稀釋劑的情況。優(yōu)選的載體的例子包括液體介質(zhì)如適宜用作向患者引入肽或多肽的媒介的生理鹽水溶液。可包含添加劑成分如防腐劑。
作為另一種疫苗配方，它還可包含按照本發(fā)明的核酸分子被插入其中的病毒、或宿主細胞、或微生物如牛痘病毒、腺病毒或沙門氏菌族。這是為了激發(fā)對由插入的核酸分子編碼的多肽的免疫反應(yīng)。
因此，本發(fā)明的另一方面是在人或其它動物中激發(fā)對艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷的免疫反應(yīng)的疫苗組合物的生產(chǎn)過程中使用本發(fā)明的核酸分子或多肽的方法。
為給予這種疫苗，可隨意應(yīng)用傳統(tǒng)的給藥途徑，例如口服或非口服給藥(例如，按任意間隔進行肌肉注射，即每7天至28天進行兩次注射)。
動物為研究神經(jīng)調(diào)節(jié)素基因及神經(jīng)調(diào)節(jié)素的功能和表達控制并在其基礎(chǔ)上建立診斷和治療包括艾薩克綜合癥的外周神經(jīng)損傷的方法以發(fā)展其治療法，疾病模型動物是有用的。更具體地說，按照本發(fā)明的外周神經(jīng)損傷動物模型是能在編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素的DNA或與如圖1或2所示的核苷酸序列或如圖3或4所示的核苷酸序列同源或雜交的DNA的表達中發(fā)生改變，或能誘導(dǎo)該改變的非人類轉(zhuǎn)基因脊椎動物。
較有價值的非人類轉(zhuǎn)基因動物的例子包括非人類脊椎動物，即固有的神經(jīng)調(diào)節(jié)素基因DNA或其相關(guān)DNA的表達受到抑制的非人類基因敲除脊椎動物和有其它基因被敲除的非人類脊椎動物。所說的其它基因不包括編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素的基因，而可能是編碼外周神經(jīng)細胞的其它蛋白質(zhì)，如“14-3-3”蛋白質(zhì)等的基因。該非人類脊椎動物的種類不受限制。為上面提到的目的，這些動物也可被用作外周神經(jīng)損傷的模型動物。
作為特別優(yōu)選的非人類脊椎動物，可較容易地生產(chǎn)有基因被敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠。除被用于闡明被敲除的基因的功能外，這種小鼠可被廣泛地用于闡明外周神經(jīng)損傷的機理、建立診斷和治療方法、開發(fā)藥物、疫苗測試等。這種轉(zhuǎn)基因小鼠可通過已知的在小鼠受精卵中形成被敲除的基因的反轉(zhuǎn)錄DNA的方法或通過已知的引入反義RNA的反義方法建立。在這些情況下，這種生產(chǎn)可通過使用從小鼠基因組獲得的神經(jīng)調(diào)節(jié)素基因的目標載體進行，另外，也可以使用胚胎干細胞，即ES細胞。
以神經(jīng)調(diào)節(jié)素免疫的動物可被用于篩選對艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷有改善效能的藥物。這樣的動物沒有特別限制，而可以是任何誘發(fā)免疫反應(yīng)的種類。為此目的，如兔、綿羊、小鼠和大鼠的動物可被廣泛地使用。
例如，在如上所述的以人神經(jīng)調(diào)節(jié)素免疫的兔中，抗人神經(jīng)調(diào)節(jié)素的抗體在六周前后產(chǎn)生并出現(xiàn)類似于艾薩克綜合癥的癥狀。該有類似于艾薩克綜合癥的癥狀的兔可被用于檢驗抗體，如單克隆抗體的功能或疫苗和藥物的效能，或篩選阻滯與神經(jīng)調(diào)節(jié)素結(jié)合的因子的藥物、與蛋白質(zhì)結(jié)合以調(diào)節(jié)其功能的藥物、改善對VGKC功能的抑制、神經(jīng)末端的信號傳導(dǎo)異?；蛱弁葱约∪獐d攣的蛋白或非蛋白物質(zhì)，等。
增加或降低與神經(jīng)調(diào)節(jié)素基因的表達有關(guān)的DNA內(nèi)源啟動子的活性的藥物可通過不同于在“關(guān)聯(lián)蛋白”一欄中描述的方法的方法進行篩選，該方法包括以下步驟a)將該被測試的藥物應(yīng)用于非人類脊椎動物或從該非人類脊椎動物獲得的細胞，及b)選擇增加或降低被敲入的基因的表達的化合物。
本發(fā)明的優(yōu)點按照本發(fā)明，被認為是艾薩克綜合癥的關(guān)鍵物質(zhì)的神經(jīng)調(diào)節(jié)素已被鑒定且其結(jié)構(gòu)已被確定，因此，可能生產(chǎn)或制備其單克隆抗體、能夠調(diào)節(jié)該物質(zhì)功能的藥物、可應(yīng)用于篩選該藥物的動物等。通過應(yīng)用神經(jīng)調(diào)節(jié)素、其相關(guān)物質(zhì)和該動物建立外周神經(jīng)損傷包括艾薩克綜合癥的測試方法及診斷和治療方法是可能的。
按照本發(fā)明，神經(jīng)調(diào)節(jié)素基因的存在已通過其cDNA的分離和鑒定得到證明。通過利用神經(jīng)調(diào)節(jié)素的抗體或引起外周神經(jīng)損傷的抗體、單克隆抗體和轉(zhuǎn)基因小鼠，因此提供了研究神經(jīng)調(diào)節(jié)素的功能和表達的機理、調(diào)節(jié)功能等的有力手段，此外，可進行外周神經(jīng)功能性異常的機理、實體等的說明。
實施例下面將根據(jù)實施例對本發(fā)明進行進一步的說明，但本發(fā)明的范圍不局限于這些說明。
實施例1·被艾薩克綜合癥患者的血清識別的抗原(神經(jīng)調(diào)節(jié)素)的基因克隆通過使用表達人類基因組相應(yīng)基因的艾薩克綜合癥患者的血清抗體的免疫篩選得到編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素的cDNA。通過酸性胍/苯酚氯仿(acidguanidine/phenol chloroform)法將全部RNAs從人成神經(jīng)細胞瘤(NB-1)株提取出來，而且，mRNAs通過使用寡聚脫氧胸腺嘧啶珠(oligo(dT)bead)的親合色譜法(Anal.Biochem.，162159，1987)分離。通過使用λZAP載體(STRATSGENE Co.，Ltd.)，按照普通方法形成cDNA庫。通過使用picoBlue免疫篩選試劑盒(STRATSGENE Co.，Ltd.)，可進行使用患者血清的免疫篩選。由此獲得的陽性克隆(噬菌體)通過輔助噬菌體被轉(zhuǎn)換進質(zhì)粒pBluescriptII SK(+)。該插入到pBluescript II SK(+)的DNA的核苷酸序列應(yīng)用ABIPRISM377 DNA測序系統(tǒng)(Perkin Elmer Co.，Ltd.)根據(jù)使用M13PrimerM4和M13PrimerRV(Takara)的染料終止(dye terminator)法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，745463，1997)確定。從編碼以艾薩克綜合癥患者的血清識別的抗原(神經(jīng)調(diào)節(jié)素)的cDNA的3’端確定核苷酸序列以闡明包含Poly(A)+鏈的核苷酸序列(圖1)，該核苷酸序列進行與GenBank的同源分析，結(jié)果，未報告相似序列，并發(fā)現(xiàn)該核苷酸序列為新的基因。該cDNA(稱作“短cDNA”)是由全長1347個核苷酸構(gòu)成并編碼包含386個氨基酸的新型蛋白質(zhì)。
雖然進行了取得由該cDNA編碼的蛋白質(zhì)的嘗試，但未發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸起始密碼子。由于這一原因，該核苷酸序列應(yīng)用5’-RACE(cDNA末端快速擴增)法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，858998，1988)通過cDNA庫進行PCR。因此，獲得了相應(yīng)于全長包含551個氨基酸的蛋白質(zhì)，即神經(jīng)調(diào)節(jié)素的cDNA(稱作“長cDNA”)。
圖1和2分別顯示了“短cDNA”和“長cDNA”核苷酸序列。
實施例2·在大腸桿菌中重組蛋白質(zhì)的表達編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素的一部分的短cDNA被從按照實施例1的免疫篩選方法獲得的cDNA克隆中提取出來，該在一端具有EcoRI/XhoI識別序列的短cDNA被插入谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白表達載體pGEX-5X-3以進行亞克隆。整合了短cDNA的pGEX-5X-3在42℃45秒鐘通過熱激(hot shock)方法被導(dǎo)入BL21大腸桿菌株以獲得BL21/短cDNA-GST基因/pGEX-5X-3。該BL21在含有0.1mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并加入0.1mM的異丙基硫-β-D-半乳糖苷(IPTG)，此外，該培養(yǎng)在37℃進行2小時以誘導(dǎo)前述融合蛋白的表達。通過離心法收集的BL21用PBS(磷酸鹽緩沖液)清洗，然后再用1mg/mL的溶菌酶消化，并用0.1％的TritonX-100溶解。含有溶解的GST融合蛋白的BL21導(dǎo)出蛋白懸浮液被加載到谷光甘肽瓊脂糖4B(GS4B)柱上，再通過50mM的還原型谷光甘肽/PBS用PBS洗脫以純化目標GST-短神經(jīng)調(diào)節(jié)素融合蛋白。而且，通過SDS-電泳(SDS-PAGE)檢測分子量、同質(zhì)性、亞單元結(jié)構(gòu)等。
·在大腸桿菌中通過編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素的全長cDNA重組體的蛋白質(zhì)的表達神經(jīng)調(diào)節(jié)素cDNA通過向在實施例1中獲得的在其一端具有EcoRI/XhoI識別序列的全長cDNA的3’端添加兩分子的流感血凝素(HA)-標記獲得，插入谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白表達載體pGEX-5X-1以作為表達載體并進行亞克隆。該整合了cDNA的pGEX-5X-1在42℃45秒鐘通過熱激方法被導(dǎo)入BL21大腸桿菌株以獲得BL21/長cDNA-GST基因/pGEX-5X-1。該BL21在含有0.1mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并加入0.1mM的異丙基硫-β-D-半乳糖苷(IPTG)，此外，該培養(yǎng)在30℃進行3小時以誘導(dǎo)分別向N和C端附加GST和HA的融合蛋白(GST-神經(jīng)調(diào)節(jié)素-HAHA)的表達。通過離心法收集的BL21用PBS清洗，然后再用1mg/mL的溶菌酶消化，并用0.1％的Triton X-100溶解。含有溶解的GST融合蛋白的BL21導(dǎo)出蛋白懸浮液被加載到谷光甘肽瓊脂糖4B(GS4B)柱上，再通過50mM的還原型谷光甘肽/Tris-HCl(pH8.0)用PBS洗脫以純化目標GST-神經(jīng)調(diào)節(jié)素-HAHA融合蛋白。
為證實該表達，以50mM的還原型谷光甘肽洗脫的組分按1/200和1/2000的比例稀釋于PBS中，然后用含0.25％SDS、0.05％巰基乙醇和0.1％甘油的25mM Tris-HCl(pH6.8)處理，其后進行8％的SDS-PAGE。在SDS-PAGE后，融合蛋白(GST-神經(jīng)調(diào)節(jié)素-HAHA)通過電印跡法被轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，該尼龍膜在室溫下用含5％脫脂乳的PBS封閉60分鐘，然后在室溫下與按1/400的比例稀釋于含0.5％脫脂乳的PBS中的抗-HA單克隆抗體(Boehringer Mannheim Co.，Ltd.)進行60分鐘的免疫反應(yīng)。在反應(yīng)完成后，用0.1％Tween 20/PBS進行清洗并在室溫下通過使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)-抗鼠-免疫球蛋白G(抗鼠IgG-HRP)作為二級抗體進行60分鐘的另一個免疫反應(yīng)，然后用0.1％Tween 20/PBS清洗以通過顯示HRP活性檢測目標抗原。ECL(Amersham Co.，Ltd.)被用于HRP活性的檢測(Clin.Chem.，251531，1979)。結(jié)果如圖9所示。神經(jīng)調(diào)節(jié)素的分子量根據(jù)GST-神經(jīng)調(diào)節(jié)素-HAHA融合蛋白的分子量大小被估算為大約66KDa。
·通過全長cDNA重組的蛋白質(zhì)的體外表達神經(jīng)調(diào)節(jié)素cDNA(圖2)在其末端被限制性內(nèi)切酶EcoRI修飾，然后被插入pBluescript IIKS載體。其后，通過利用pBluescript(1μg)和TNT偶聯(lián)翻譯系統(tǒng)(Promega Co.，Ltd.)，神經(jīng)調(diào)節(jié)素通過體外翻譯方法表達為(35S)標記的體外實體，該(35S)標記的蛋白質(zhì)被加載到10％SDS-PAGE上并通過圖像分析儀(BAS2000，F(xiàn)ujix)檢測放射性。可以看到，根據(jù)SDS-PAGE通過神經(jīng)調(diào)節(jié)素cDNA體外翻譯得到的神經(jīng)調(diào)節(jié)素的分子量大約為66KDa。
實施例3
·通過RNA印跡法證實神經(jīng)調(diào)節(jié)素基因的表達通過傳統(tǒng)方法從NB-1細胞、A549細胞株、Jurkat細胞株和HeLa細胞株分離得到mRNAs，1μg的mRNAs用1％瓊脂糖凝膠電泳分離并通過接觸印跡法轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。該尼龍膜在80℃處理2小時，然后在42℃Denhardt’s溶液中進行2小時的預(yù)雜交。接著，用32P放射標記的神經(jīng)調(diào)節(jié)素cDNA作為探針在42℃與mRNA雜交12小時，如此獲得的尼龍膜在反應(yīng)完成后以300mM的NaCl和30mM的檸檬酸鈉清洗，然后再在50℃用15mM的NaCl和1.5mM的檸檬酸鈉清洗。目標mRNA通過感光X光片檢測。從所獲得的放射自顯影看出，在神經(jīng)細胞的NB-1細胞中神經(jīng)調(diào)節(jié)素基因被強烈表達。
·神經(jīng)調(diào)節(jié)素對兔的免疫(圖10和11)通過使用全長包含511個氨基酸的神經(jīng)調(diào)節(jié)素，其與GST的融合蛋白被產(chǎn)生出來，然后依照普遍的方法與添加劑一起被用作免疫三只兔子的抗原。六周后，可觀察到在所有3只兔子誘發(fā)出具有類似于艾薩克綜合癥的癥狀，如后肢麻痹、肌肉強直、由此導(dǎo)致的步行困難等的外周神經(jīng)損傷(圖10)。從以神經(jīng)調(diào)節(jié)素免疫的兔子獲得的肌肉經(jīng)HE染色并進行顯微鏡觀察，結(jié)果與正常肌肉組織相比，肌細胞的大小是不均勻的，并觀察到神經(jīng)細胞的變性(圖11)。
另外，人神經(jīng)調(diào)節(jié)素被分為3段，即C端區(qū)段、N端區(qū)段以及它們的中間段。它們分別對5只兔子進行免疫，結(jié)果，上述癥狀在以神經(jīng)調(diào)節(jié)素的C端段免疫的兔子身上誘發(fā)出來，在以其它段免疫的情況下，在兔子身上未獲得這種結(jié)果。
從以神經(jīng)調(diào)節(jié)素免疫的兔子獲得的血清在下面的試驗中被用作抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗血清。
·通過蛋白質(zhì)印跡法證實在各種細胞中神經(jīng)調(diào)節(jié)素基因的表達通過使用GST-短神經(jīng)調(diào)節(jié)素融合蛋白(陽性對照)及在實施例1中制備的NB-1神經(jīng)細胞和HEK(人胚胎腎)-293T，用蛋白質(zhì)印跡法證實神經(jīng)調(diào)節(jié)素基因的表達狀態(tài)。
首先，用1％NP-40溶解的細胞溶解液從用作樣本的各種細胞制備，各細胞溶解液以含有0.25％SDS、0.05％巰基乙醇和0.1％甘油的25mM的Tris-HCl(pH6.8)處理，并通過8％SDS-PAGE分離。在SDS-PAGE后，從各種細胞獲得的蛋白質(zhì)通過電印跡法被轉(zhuǎn)移到硝化纖維(NC)膜上。在NC膜上，抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素的抗血清按1/1000的比例用添加了2.0mg/mL的GST-短神經(jīng)調(diào)節(jié)素融合蛋白和5％脫脂乳的TBS(Tris緩沖鹽水)稀釋，并在室溫下進行60分鐘的免疫反應(yīng)。另外，同時進行使同樣的抗體溶液與作為陰性對照的單獨的NC膜反應(yīng)的試驗或?qū)⒖贵w溶液的GST-短神經(jīng)調(diào)節(jié)素融合蛋白換成單獨的GST的試驗。反應(yīng)完成后獲得的NC膜用0.1％Tween20/TBS清洗，再在室溫下進行60分鐘的與作為二級抗體的HRP標記抗兔IgG抗體的免疫反應(yīng)，并用0.1％Tween 20/TBS清洗以檢測HRP活性因而檢測目標抗原。使用ECL(Amersham Co.，Ltd.)檢測HRP活性(Clin.Chem.，251531，1979)。結(jié)果，在NB-1細胞中觀察到神經(jīng)調(diào)節(jié)素的產(chǎn)生。
實施例4·在患者血清中檢測抗人神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體(圖12)
通過使用如上所述制備的GST-短神經(jīng)調(diào)節(jié)素融合蛋白作為抗原，應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測存在于人血清中的抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體。
首先，GST-短神經(jīng)調(diào)節(jié)素融合蛋白(100ng/道)通過SDS-PAGE電泳被轉(zhuǎn)移到NC膜。從5個艾薩克綜合癥患者、30個具有自訴有作為糖尿病等的并發(fā)癥的手足疼痛性麻痹的不同于艾薩克綜合癥的其它外周神經(jīng)損傷患者、和8個健康正常人獲得的血清用作一級抗體。為檢驗血清中抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體的存在，用TBS按1/1000稀釋的血清樣本涂覆到NC膜上以在室溫下進行60分鐘的免疫反應(yīng)，該NC膜周0.1％Tween 20/TBS清洗，再在室溫下用HRP標記的抗人IgG抗體作為二級抗體進行60分鐘的免疫反應(yīng)。該NC膜用0.1％Tween 20/TBS清洗以檢測HRP活性，因而人IgG與目標抗原的反應(yīng)被檢測到。HRP活性按上述方法測定。
結(jié)果，從5個艾薩克綜合癥患者中的4個患者和30個具有不同于艾薩克綜合癥的外周神經(jīng)損傷的患者中的7個患者檢測到抗神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體，而未從8個健康正常人檢測到該抗體。圖11顯示了部分結(jié)果。
再看檢測到抗體的患者的血清，從4個陽性艾薩克綜合癥患者檢測到指向神經(jīng)調(diào)節(jié)素的C末端部分的抗體，且從7個具有不同于艾薩克綜合癥的外周神經(jīng)損傷的患者得到同樣的檢測結(jié)果，此外，從另外的兩個人檢測到指向神經(jīng)調(diào)節(jié)素的N末端部分的抗體。
實施例5·通過鼠基因組的雜交克隆檢測神經(jīng)調(diào)節(jié)素編碼cDNA由小鼠肝臟獲得的鼠基因組庫(Clontech Co.，Ltd.)被用作基因庫，而人神經(jīng)調(diào)節(jié)素cDNA的全長序列被用作探針，該探針通過使用Bca BEST標記試劑盒(Takara Co.，Ltd.)以放射性同位素(32P)進行標記。每板的噬菌體DNAs被轉(zhuǎn)移到兩個GeneScreen Plus片(Du Pont Co.，Ltd.)上，并在反應(yīng)溶液(1M NaCl、1％SDS(十二烷基磺酸鈉)、10％Dextran、100g/ml鮭精DNA)中與標記探針進行雜交過夜。在雜交完成后，濾膜在室溫下用2×SSC(標準檸檬酸鹽緩沖液的縮寫，意指0.15M NaCl和0.015 M檸檬酸鈉，pH7.2)清洗2次，在65℃用2×SSC/1％SDS清洗2次，及在室溫下用0.1×SSC清洗2次，然后通過放射自顯影法檢測陽性空斑。在同樣的條件下，進行第二和第三次篩選操作以采用圖像分析儀(Fujix Co.，Ltd.)檢測和分離陽性空斑。
在分析中使用的噬菌體DNA應(yīng)用WizardTMLambda Preps DNA純化系統(tǒng)(Promega Co.，Ltd.)進行純化，結(jié)果，獲得9個陽性克隆。
·DNA印跡分析為檢驗通過雜交克隆獲得的9個陽性克隆含有包括等同于甲硫氨酸起始密碼子的ATG的區(qū)域，進行了以下的分析。
1ng如此純化的基因組噬菌體DNA用限制性內(nèi)切酶SacI消化并通過0.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠經(jīng)過溴化乙錠染色并確認被消化的基因組DNA，然后凝膠中的DNA通過印跡石(blotting stone)法被轉(zhuǎn)移到濾膜上在堿性緩沖液(0.4M NaOH、0.6M NaCl)中放置過夜。該用50mM NaOH和1MTris-HCl(pH8.0)中和的濾膜經(jīng)空氣干燥，再浸入預(yù)雜交溶液(1％SDS、1MNaCl、10％Dextran)，然后在65℃進行預(yù)雜交30分鐘。
接著，通過使用Bca BEST標記試劑盒(Takara Co.，Ltd.)以放射性同位素(32P)標記特異性識別包含等同于神經(jīng)調(diào)節(jié)素cDNA的甲硫氨酸起始密碼子的ATG及其側(cè)翼序列的區(qū)域的探針，該探針和100g/ml的鮭精DNA被加到前述的預(yù)雜交溶液中以在65℃進行雜交過夜，在雜交反應(yīng)結(jié)束后，濾膜在室溫下用2×SSC清洗2次，在65℃用2×SSC/1％SDS清洗2次，及在室溫下用0.1×SSC清洗2次，然后該濾膜感光成像底片以通過圖像分析儀(Fujix Co.，Ltd.)檢測和分離陽性空斑。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在9個克隆中3個出現(xiàn)了包含相應(yīng)于甲硫氨酸起始密碼子的ATG的5’區(qū)域，更具體地說，從1個克隆中檢測到大約2kb的帶，而從2個克隆中檢測到大約7kb的帶。這3個克隆被發(fā)現(xiàn)是包含5’上游區(qū)域的基因組DNAs。
實施例6·小鼠cDNA的分離按下面的方法通過小鼠基因組的雜交克隆獲得編碼小鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素的cDNA是可能的。
從小鼠胚胎獲得的小鼠胚胎Lambda cDNA庫(STRATAGENE Co.，Ltd.)被用作基因庫，而人神經(jīng)調(diào)節(jié)素cDNA的全長序列被用作探針，該探針通過使用Bca BEST標記試劑盒(Takara Co.，Ltd.)以放射性同位素(32P)進行標記。每板的噬菌體DNAs被轉(zhuǎn)移到兩個GeneScreen Plus片(Du Pont Co.，Ltd.)上，并在65℃于反應(yīng)溶液(1M NaCl、1％SDS、10％Dextran、100g/ml鮭精DNA)中與標記探針反應(yīng)8小時。濾膜在室溫下用2×SSC清洗2次，在65℃用2×SSC/1％SDS清洗2次，及在室溫下周0.1×SSC清洗2次，然后通過放射自顯影法檢測陽性空斑。在同樣的條件下，進行第二和第三次篩選操作以采用圖像分析儀(Fujix Co.，Ltd.)檢測和分離陽性空斑。
在上述分析中使用的噬菌體DNA應(yīng)用WizardTMLambda Preps DNA純化系統(tǒng)(Promega Co.，Ltd.)進行純化，結(jié)果，獲得1個陽性克隆。
如此純化的基因組噬菌體DNA用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI內(nèi)切，然后插入片段被切割出來。在克隆載體pBluescriptII的EcoRI和XhoI部位，該插入片段被進一步進行亞克隆。結(jié)果，可獲得編碼小鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素的cDNA。在分析該cDNA的核苷酸序列時，通過ABIPRISM377 DNA測序系統(tǒng)(Perkin Elmer Co.，Ltd.)確定其序列。
如此分析獲得的核苷酸序列被轉(zhuǎn)換成氨基酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所說的序列包含甲硫氨酸起始密碼子，且與人神經(jīng)調(diào)節(jié)素的核苷酸序列具有85％或更高的同源性。
序列表序列表(1)一般信息申請人LOCOMOGENE，INC.發(fā)明名稱神經(jīng)調(diào)節(jié)素(NEUROTONIN)及其應(yīng)用在先申請日本，2001-34217優(yōu)先權(quán)日2001-02-09序列數(shù)目4(2)序列信息序列編號1長度1347類型cDNA來源人名稱神經(jīng)調(diào)節(jié)素短cDNA1tgacagaagg gagaagaaag aaatgaagcg agttttcagt attccaagca taagagccag 60caagatacat tccctcaagt gtccagaatt tccaattaca gacgacaaag tagcactgat 120tcgaattcag aattgtcaaa tgaagaatta aggcaatgtc ttaatgaaac tttagaggag 180gtagaa atg tta aaa act gaa ctt gag gca tct caa aga caa ctc aga ggt aaa 234Met Leu Lys Thr Glu Leu Glu Ala Ser Gln Arg Gln Leu Arg Gly Lys1 5 10 15gag gaa gca ttg aaa att ctt caa agc atg gca ata ctg ggc aaa gcc 282Glu Glu Ala Leu Lys Ile Leu Gln Ser Met Ala Ile Leu Gly Lys Ala20 25 30aca agt cat acg cag gca gtg ctt caa aaa act atg gaa caa aac aga 330Thr Ser His Thr Gln Ala Val Leu Gln Lys Thr Met Glu Gln Asn Arg35 40 45tcc ttg gag aag gaa ata aat gcc ttg cag tgg gaa ata gaa ttt gat 378Ser Leu Glu Lys Glu Ile Asn Ala Leu Gln Trp Glu Ile Glu Phe Asp50 55 60cat aat aga ttt aaa aat ata gag gaa tct tgg atc caa aaa tat gac 426His Asn Arg Phe Lys Asn Ile Glu Glu Ser Trp Ile Gln Lys Tyr Asp65 70 75 80agg cta aac tgt gaa aat gca gtc ctc aaa gag aat ttg aaa gtg aaa 474Arg Leu Asn Cys Glu Asn Ala Val Leu Lys Glu Asn Leu Lys Val Lys85 90 95aca gaa gaa att aaa atg ctg aag tct gac aat gca gtt ttg aat caa522Thr Glu Glu Ile Lys Met Leu Lys Ser Asp Asn Ala Val Leu Asn GLn100 105 110cgg tat ttg gag gcc ctc gcc atg ctt gat atc aaa cag cag aag atg570Arg Tyr Leu Glu Ala Leu Ala Met Leu Asp Ile Lys Gln Gln Lys Met115 120 125gct cag gaa aac atg tgc tgt gat aaa agt ggc ttt gca gag gct tca618Ala Gln Glu Asn Met Cys Cys Asp Lys Ser Gly Phe Ala Glu Ala Ser130 135 140ggt ctt gag ctt gcg gtc ctc gga gcc tgc ctt tgt cat ggg ccc gga666Gly Leu Glu Leu Ala Val Leu Gly Ala Cys Leu Cys His Gly Pro Gly145 150 155 160ggg aac ccc tgt tct tgt gcc aga atg gca gca tcc act cgg aaa ctg714Gly Asn Pro Cys Ser Cys Ala Arg Met Ala Ala Ser Thr Arg Lys Leu165 170 175ctt ctt cag ctc aaa caa gag ttg gaa att ttg cag aag agt aaa gaa762Leu Leu Gln Leu Lys Gln Glu Leu Glu Ile Leu Gln Lys Ser Lys Glu180 185 190gaa gct tac gtg atg gca gat gct ttc aga att gca ttt gag caa caa810Glu Ala Tyr Val Met Ala Asp Ala Phe ArgIle Ala Phe Glu Gln Gln195 200 205tta atg aga aaa aat gac cag gca cta caa ttg aca caa atg gat aaa858Leu Met Arg Lys Asn Asp Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gln Met Asp Lys210 215 220atg cat aaa aaa gca aca aaa tgg atg aat tgg aag cac ctt aaa gag906Met His Lys Lys Ala Thr Lys Trp Met Asn Trp Lys His Leu Lys Glu225 230 235 240gat gga ttt cca tca cca agg agt aag aag acc ttc ggg cag aga ctg954Asp Gly Phe Pro Ser Pro Arg Ser Lys Lys Thr Phe Gly Gln Arg Leu245 250 255ttg ggt atg ctc cct tca gaa aac agt tct aag agg atg gaa gac cag1002Leu Gly Met Leu Pro Ser Glu Asn Ser Ser Lys Arg Met Glu Asp Gln260 265 270gac agt cct caa gag gtc ctt aag atg ctc ata gat ttg ctt aat gat1050Asp Ser Pro Gln Glu Val Leu Lys Met Leu Ile Asp Leu Leu Asn Asp275 280 285aaa gaa gaa gct ttg gct cat caa aga aaa gtt agc tac atg ctt gct1098Lys Glu Glu Ala Leu Ala His Gln Arg Lys Val Ser Tyr Met Leu Ala290 295 300cgg gca ttg gaa gac aaa gac act gct tca aac gag aat aaa gaa aaa1146Arg Ala Leu Glu Asp Lys Asp Thr Ala Ser Asn Glu Asn Lys Glu Lys305 310 315 320aat cct ata aaa gag aat ttc cct ttc aac aac ccc tgg cgt aag act1194Asn Pro Ile Lys Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asn Pro Trp Arg Lys Thr
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340 345 350act tta ttt tac aag taa1326Thr Leu Phe Tyr Lys355序列編號4長度1559類型cDNA來源小鼠名稱神經(jīng)調(diào)節(jié)素長cDNA4tgagggagga ggctgagtgt ccagcagctc cctgggaccg acatttggct a 51atg agc aaa gtg ccg agg tca tcg agc gag gca gag gac atc tgg gaa99Met Ser Lys Val Pro Arg Ser Ser Ser Glu Ala Glu Asp Ile Trp Glu1 5 10 15aca gag gat gac atg acc gaa ggt gac cta ggc tat ggc ctc gga aga147Thr Glu Asp Asp Met Thr Glu Gly Asp Leu Gly Tyr Gly Leu Gly Arg20 25 30aaa ccc ggt ggt att tat gaa gtt ccg tgt tcg att aca tct aag aaa195Lys Pro Gly Gly Ile Tyr Glu Val Pro Cys Ser Ile Thr Ser Lys Lys35 40 45agg tca gat gga aag aac tca agc cct cct ccg ttt cca aga aag gga243Arg Ser Asp Gly Lys Asn Ser Ser Pro Pro Pro Phe Pro Arg Lys Gly50 55 60gaa gaa aga agc gaa acc agt ttc cag tat tcc agg agg aag ggc ttt291Glu Glu Arg Ser Glu Thr Ser Phe Gln Tyr Ser Arg Arg Lys Gly Phe65 70 75 80caa gat aca agc gct gag gga tac cga gca tcc aga ctg agc agc aca339Gln Asp Thr Ser Ala Glu Gly Tyr Arg Ala Ser Arg Leu Ser Ser Thr85 90 95gat tct aac tca gaa ttg tcg gat gag cag tta agg cga cgt ctt cat387Asp Ser Asn Ser Glu Leu Ser Asp Glu Gln Leu Arg Arg Arg Leu His100 105 110gaa gcc tta gag gac gta gag att tta aaa acg gaa ctt gaa gcg tct435Glu Ala Leu Glu Asp Val Glu Ile Leu Lys Thr Glu Leu Glu Ala Ser115 120 125caa aga caa ctt gaa ggt aaa gag gaa gca ttg aaa atc ctc caa agc483Gln Arg Gln Leu Glu Gly Lys Glu Glu Ala Leu Lys Ile Leu Gln Ser130 135 140atg gca atg ctt ggc aaa gcc aca agc cac aca cag aca atg ctt caa531Met Ala Met Leu Gly Lys Ala Thr Ser His Thr Gln Thr Met Leu Gln145 150 155 160aaa act ata gaa caa aag aga tct ctg gag aag gaa ata aat gcc ttg579Lys Thr Ile Glu Gln Lys Arg Ser Leu Glu Lys Glu Ile Asn Ala Leu165 170 175cag tgg gaa atg gaa ttt gat cag gat aga ttt aaa aat ata gaa gaa627Gln Trp Glu Met Glu Phe Asp Gln Asp Arg Phe Lys Asn Ile Glu Glu180 185 190tct tgg atc cag aaa tgt gac agg cta aac tgt gac aat gca gtc ctc675Ser Trp Ile Gln Lys Cys Asp Arg Leu Asn Cys Asp Asn Ala Val Leu195 200 205aga gag aat ctg aag ttg aga aca gag gaa ata aag atg cta aag tct723Arg Glu Asn Leu Lys Leu Arg Thr Glu Glu Ile Lys Met Leu Lys Ser210 215 220aag aat gct gtt ttg aat cag cgg tac ttg gag gcc ctc gcc atg ctt771Lys Asn Ala Val Leu Asn Gln Arg Tyr Leu Glu Ala Leu Ala Met Leu225 230 235 240gat atc aag gag cag aag atg ggt cag gag gag agt ggc ttt aca gat819Asp Ile Lys Glu Gln Lys Met Gly Gln Glu Glu Ser Gly Phe Thr Asp245 250 255gta tca ggt ctc gag ctt gca gtc ctt gga gcc tgc ctg tgt cat ggt867Val Ser Gly Leu Glu Leu Ala Val Leu Gly Ala Cys Leu Cys His Gly260 265 270cct gga ggg agc ccc tgt tct tgt gcc aaa atg gca gca tcc act cgg915Pro Gly Gly Ser Pro Cys Ser Cys Ala Lys Met Ala Ala Ser Thr Arg275 280 285aaa ctg gtt ctt cag ctc aga cat gag ttg gaa act ctg cag aag agt963Lys Leu Val Leu Gln Leu Arg His Glu Leu Glu Thr Leu Gln Lys Ser290 295 300aag gaa gag gcg cac ata acg gca gat gca ttc agg att gct ttt gag1011Lys Glu Glu Ala His Ile Thr Ala Asp Ala Phe Arg Ile Ala Phe Glu305 310 315 320caa cag tta atg agg aaa aat gag cag gca ctg aga ctg gct gga ggg1059Gln Gln Leu Met Arg Lys Asn Glu Gln Ala Leu Arg Leu Ala Gly Gly325 330 335gac ctg tgt aaa aaa gcg gca acc gtg gat caa cag aca aca ccc agg1107Asp Leu Cys Lys Lys Ala Ala Thr Val Asp Gln Gln Thr Thr Pro Arg340 345 350cag acg atg gat atc cgg cta caa agg aga aag aag acc tta ggg caa1155Gln Thr Met Asp Ile Arg Leu Gln Arg Arg Lys Lys Thr Leu Gly Gln355 360 365aga tta ctg ggg ata ctc cct tcg gaa aac agc tcc aag ggc gct gaa1203Arg Leu Leu Gly Ile Leu Pro Ser Glu Asn Ser Ser Lys Gly Ala Glu370 375 380gac caa gac aat atg caa gag gtc ttt aag atg ctg gta gat ttg ttg1251Asp Gln Asp Asn Met Gln Glu Val Phe Lys Met Leu Val Asp Leu Leu385 390 395 400aat gac aaa gaa gaa gcc ctt gca cat cag aga aag gtt agt tac atg1299Asn Asp Lys Glu Glu Ala Leu Ala His Gln Arg Lys Val Ser Tyr Met405 410 415ctc gct cgg gcg ctg gaa gac aaa gac acg gcc tca gaa agg aat aaa1347Leu Ala Arg Ala Leu Glu Asp Lys Asp Thr Ala Ser Glu Arg Asn Lys420 425 430gaa aaa atc ccc atg agc cag acc ttc cca ttc aaa acg gcc tgg cac1395Glu Lys Ile Pro Met Ser Gln Thr Phe Pro Phe Lys Thr Ala Trp His435 440 445gac gct tca gag ctc tgt ggt ctg cgt gat cca gta cag tca aac cat1443Asp Ala Ser Glu Leu Cys Gly Leu Arg Asp Pro Val Gln Ser Asn His450 455 460gtt tct gaa ccc atg gct tgc atc tgt tca ata cag cat cct cca aaa1491Val Ser Glu Pro Met Ala Cys Ile Cys Ser Ile Gln His Pro Pro Lys465 470 475 480gtt tca gac tgc cca aga act ctt aaa aga tcc tgt tct ttg cca tca1539Val Ser Asp Cys Pro Arg Thr Leu Lys Arg Ser Cys Ser Leu Pro Ser485 490 495act tta ttt tac aag taa ac 1559Thr Leu Phe Tyr Lys500
權(quán)利要求
1.具有下述特性的外周神經(jīng)細胞蛋白質(zhì)，下面稱為“神經(jīng)調(diào)節(jié)素(neurotoxin)”，其中該蛋白質(zhì)a)在艾薩克綜合癥患者或其它具有外周神經(jīng)損傷的患者的外周神經(jīng)細胞中找到；b)與在患者血液中找到的一種抗體反應(yīng)；c)兔免疫引起類似于艾薩克綜合癥癥狀群的癥狀；及d)按SDS-PAGE法測定，其分子量約為66kDa。
2.編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素的cDNA。
3.編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素或包括如圖1或2所示的所有核苷酸序列的DNA。
4.編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)素的核酸分子，包括至少一個與如圖1或2所示的整個或部分核苷酸序列基本一致的核苷酸序列，或包括與任何該序列基本同源或與任何該序列雜交的序列。
5.編碼鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素的鼠cDNA。
6.編碼鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素或包括如圖3或4所示的全部核苷酸序列的DNA。
7.編碼鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素的核酸分子，包括至少一個與如圖3或4所示的整個或部分核苷酸序列基本一致的核苷酸序列，或包括與任何該序列基本同源或與任何該序列雜交的編碼鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)素的序列。
8.如權(quán)利要求2或5所述的cDNA或如權(quán)利要求3、4、6或7所述的核酸分子的反義RNA或反義DNA。
9.識別并裂解如權(quán)利要求2或5所述的cDNA、如權(quán)利要求3、4、6或7所述的核酸分子或從其一部分轉(zhuǎn)錄獲得的RNA的核酶。
10.包含如權(quán)利要求2-8中任一項所述的核酸分子的表達載體、克隆載體或粘粒。
11.保持如權(quán)利要求10所述的載體或粘粒的轉(zhuǎn)化體。
12.包含如權(quán)利要求2-8中任一項所述的核酸分子的原核細胞、真核細胞或變異細胞。
13.具有如圖5或6所示的氨基酸序列的神經(jīng)調(diào)節(jié)素。
14.在下面的a)或b)項中定義的具有與患者血液中找到的抗體結(jié)合的活性的蛋白質(zhì)a)多肽，例如具有如圖5或6所示的氨基酸序列的多肽、具有在如圖5或6所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加和/或插入至少一個氨基酸的氨基酸序列的多肽、包括構(gòu)成神經(jīng)調(diào)節(jié)素的抗原性部分的氨基酸序列的合成多肽、其功能等效變異體、或進一步包括前述氨基酸序列的融合多肽；和b)與具有如權(quán)利要求2-4中任一項所述的核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼的蛋白質(zhì)。
15.在下面的a)或b)項中定義的能與存在于外周神經(jīng)細胞中的“14-3-3”蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)a)多肽，例如具有如圖5或6所示的氨基酸序列的多肽、具有在如圖5或6所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加和/或插入至少一個氨基酸的氨基酸序列的多肽、包括構(gòu)成神經(jīng)調(diào)節(jié)素的抗原性部分的氨基酸序列的合成多肽、其功能等效變異體、或進一步包括前述氨基酸序列的融合多肽；和b)與具有如權(quán)利要求2-4中任一項所述的核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼的蛋白質(zhì)。
16.如權(quán)利要求13-15中任一項所述的蛋白質(zhì)的免疫活性有效域或具有該域的片段。
17.多肽，例如具有如圖7或8所示的氨基酸序列的多肽、具有在如圖7或8所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加和/或插入至少一個氨基酸的氨基酸序列的多肽、包括構(gòu)成神經(jīng)調(diào)節(jié)素的抗原性部分的氨基酸序列的合成多肽、其功能等效變異體、或進一步包括前述氨基酸序列的融合多肽。
18.包含如權(quán)利要求13-17中任一項所述的蛋白質(zhì)，用于檢驗識別該蛋白的抗體的免疫分析的試劑。
19.用于如權(quán)利要求18所述的免疫分析，評價艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷的診斷或治療效果的試劑。
20.包含與如權(quán)利要求13-17中任一項所述的蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體，用于檢驗該蛋白的免疫分析的試劑。
21.用于如權(quán)利要求20所述的免疫分析，評價艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷的診斷或治療效果的試劑。
22.如權(quán)利要求21所述的免疫分析試劑，其中被分析的如權(quán)利要求13-17中任一項所述的蛋白質(zhì)存在于外周神經(jīng)細胞中。
23.神經(jīng)調(diào)節(jié)素的檢測方法，通過分析存在于受檢者體液中并與如權(quán)利要求13-17中任一項所述的蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體。
24.篩選與如權(quán)利要求13-17中任一項所述的蛋白質(zhì)結(jié)合的配體的方法，包括以下步驟a)使配體的候選化合物與如權(quán)利要求13-17中任一項所述的蛋白質(zhì)接觸；及b)選擇具有與蛋白質(zhì)的結(jié)合活性的候選化合物。
25.根據(jù)抗配體與通過按權(quán)利要求24所述的方法使用如權(quán)利要求13-17中任一項所述的蛋白質(zhì)作為抗配體獲得的配體的親和力檢驗該蛋白的方法。
26.可抑制如權(quán)利要求13-17中任一項所述的蛋白質(zhì)與配體的結(jié)合的化合物的篩選方法，包括下述步驟a)在候選化合物存在的情況下使如權(quán)利要求13-17中任一項所述的蛋白質(zhì)與配體接觸；及b)選擇具有抑制該蛋白質(zhì)與該配體結(jié)合的活性的候選化合物。
27.可通過權(quán)利要求26中所述的篩選方法獲得的化合物。
28.包含可通過權(quán)利要求26中所述的篩選方法獲得的化合物的神經(jīng)調(diào)節(jié)素抑制劑。
29.治療外周神經(jīng)損傷的藥物，包含可通過權(quán)利要求26中所述的篩選方法獲得的化合物。
30.與權(quán)利要求13-17中任一項所述的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。
31.如權(quán)利要求30所述的抗體，其中該抗體為單克隆抗體。
32.抗引起外周神經(jīng)損傷的抗體的單克隆抗體。
33.通過設(shè)定如權(quán)利要求13-17中任一項所述的蛋白質(zhì)或編碼該蛋白的基因的表達作為標記檢測或分離表達該蛋白質(zhì)的細胞的方法。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中該細胞為外周神經(jīng)細胞。
35.檢測或分離表達如權(quán)利要求13-17中任一項所述的蛋白質(zhì)的細胞的試劑，包含如權(quán)利要求30-32中任一項所述的抗體。
36.檢測如權(quán)利要求2-7所述的DNA或其轉(zhuǎn)錄RNA的試劑，包含具有可與該DNA或其部分、或該RNA雜交的核苷酸序列的核酸分子。
37.非人類轉(zhuǎn)基因脊椎動物，其中如權(quán)利要求3或6所述的DNA的表達經(jīng)過改變或誘導(dǎo)了此種改變。
38.如權(quán)利要求37所述的動物，為外周神經(jīng)損傷模型動物。
39.如權(quán)利要求37所述的非人類基因敲除脊椎動物，其中如權(quán)利要求3或6所述的內(nèi)源DNA的表達受到抑制。
40.如權(quán)利要求37所述的非人類脊椎動物，其中另一基因被敲除。
41.從如權(quán)利要求37-40中任一項所述的非人類脊椎動物獲得的細胞。
42.提高或降低如權(quán)利要求3或6所述的DNA的內(nèi)源啟動子的活性的化合物的篩選方法，包括下述步驟a)在所測試的化合物存在的情況下檢測與權(quán)利要求3或6所述的DNA的內(nèi)源啟動子下游結(jié)合的基因的表達；及b)選擇增加或降低該表達的化合物。
43.提高或降低如權(quán)利要求3或6所述的DNA的內(nèi)源啟動子的活性的化合物的篩選方法，包括下述步驟a)將所測試的化合物應(yīng)用于如權(quán)利要求37-40所述的非人類脊椎動物或從該脊椎動物獲得的細胞；及b)選擇增加或降低敲入的基因的表達的化合物。
44.用神經(jīng)調(diào)節(jié)素免疫以用于研究艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷和篩選具有改善艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷的作用的物質(zhì)的動物。
45.用神經(jīng)調(diào)節(jié)素免疫以用于篩選改善受抑制的VGKC功能、神經(jīng)末端的信號傳導(dǎo)異?；蛱弁葱约∪獐d攣的蛋白質(zhì)或非蛋白類物質(zhì)的兔。
46.用于通過應(yīng)用神經(jīng)調(diào)節(jié)素、其相關(guān)蛋白或其它的引起外周神經(jīng)損傷的抗體作為標記檢測與單克隆抗體的特異性結(jié)合的診斷標志，并進而測定從受試者取得的樣本中的神經(jīng)調(diào)節(jié)素、其相關(guān)蛋白或引起外周神經(jīng)損傷的抗體的水平以診斷艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷。
47.為診斷艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷提供數(shù)據(jù)的檢驗方法，其中測定從受試者取得的樣本中的神經(jīng)調(diào)節(jié)素或引起外周神經(jīng)損傷的抗體的水平。
48.用于消除由于神經(jīng)調(diào)節(jié)素或引起外周神經(jīng)損傷的抗體的存在造成的麻木以進行治療的血液過濾材料，其中通過血液透析使血液中的神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體或引起外周神經(jīng)損傷的抗體與固定在該過濾材料上的單克隆抗體結(jié)合，因而減少身體內(nèi)的神經(jīng)調(diào)節(jié)素抗體或引起外周神經(jīng)損傷的抗體。
49.用于在人體或其它動物中刺激對艾薩克綜合癥或其它外周神經(jīng)損傷的免疫反應(yīng)的疫苗組合物，包含至少一種如權(quán)利要求13-17中任一項所述的多肽，加上可接受的藥用載體和對多肽的免疫反應(yīng)的刺激，或者包含具有插入到細胞中的如權(quán)利要求2-8中任一項所述的核酸分子的病毒細胞(virus cell)或宿主細胞和對由插入的核酸分子編碼的多肽的免疫反應(yīng)的刺激。
50.包含如權(quán)利要求31或32所述的單克隆抗體的細胞培養(yǎng)介質(zhì)，用于通過從具有外周神經(jīng)損傷的患者分離的外周神經(jīng)和肌肉系統(tǒng)細胞的孵育中去除引起外周神經(jīng)損傷的抗體在體外繁殖成為外周神經(jīng)的細胞，因而導(dǎo)致病因抗體與該單克隆抗體特異性結(jié)合。
全文摘要
為詳細說明引起艾薩克綜合癥的物質(zhì)并建立有效的診斷和治療方法，對從艾薩克綜合癥者獲得的血清應(yīng)用一種免疫篩選方法。從神經(jīng)細胞得到的cDNA庫中分離得到一特定的cDNA，其核苷酸序列已闡明并通過對其的克隆獲得一新的蛋白質(zhì)，即神經(jīng)調(diào)節(jié)素(neurotonin)。該氨基酸序列已經(jīng)確定的新型蛋白質(zhì)被認為是艾薩克綜合癥的關(guān)鍵物質(zhì)，并可應(yīng)用于外周神經(jīng)損傷的研究和臨床治療中。
文檔編號A61M1/34GK1491281SQ02804802
公開日2004年4月21日 申請日期2002年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月9日
發(fā)明者中島利博 申請人:洛克莫基因株式會社