專利名稱：微生物感染防御劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物感染防御劑。更具體地說，本發(fā)明涉及可作為對防御大腸桿菌O-157等病原性大腸桿菌或幽門螺桿菌等微生物感染有效的藥物、指定保健用食品、健康食品等使用的微生物感染防御劑。
背景技術：
通常病原性細菌對人的感染是通過識別并結合靶細胞、即存在于機體上皮表層的復合糖類的糖鏈結構(受體)而建立的。對于這樣的病原性細菌對機體的感染，通常的治療方法例如是使用抗生素。抗生素是通過殺死增殖的病原性細菌來治病的，因此是在病原性細菌感染過程的最后階段起作用。作為對發(fā)病后機體的治療方法，抗生素治療感染癥是非常有效的，但抗生素的各種副作用以及引發(fā)的變態(tài)反應癥狀等問題也很多。
另外，在治療多種細菌感染癥時，要使用多種多樣的抗菌藥，但因頻繁使用這些抗菌藥而出現(xiàn)耐藥菌、尤其是MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)等，在臨床上產生了深刻的問題，并與其他的條件感染菌共同作為院內感染菌產生了嚴重的問題。
從多種抗菌藥中適當選擇的抗菌藥可用于治療包括條件感染的細菌感染癥。但是使用抗菌藥會有休克癥狀、腎功能受損、肝功能受損、白細胞減少、神經紊亂、細菌重復感染等多種副作用。
如上所述，仍然需求開發(fā)對微生物感染的防御作用強，且副作用少的微生物感染防御劑。
根據以前的研究，報告了縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚L-乳酸混合物可用作抗惡性腫瘤藥(特開平9-227388號公報以及特開平10-130153號公報)。但對于縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物是否可發(fā)揮微生物感染防御作用的評價卻未有報告。
發(fā)明的公開本發(fā)明要解決的課題是提供可用于防御例如大腸桿菌O-157等病原性大腸桿菌、幽門螺桿菌等微生物感染的新型微生物感染防御劑。本發(fā)明的另一個要解決的課題是提供利用上述微生物感染防御劑的用于防御微生物感染的食品。
本發(fā)明人為了進行以解決上述課題為目的的研究，將縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物給予無菌小鼠，對防御大腸桿菌O-157感染的效果，具體地說，對感染O-157小鼠的存活率以及抑制上述小鼠中O-157增殖的效果進行了研究。結果發(fā)現(xiàn)上述聚乳酸混合物可改善感染O-157小鼠的存活率，還顯示了對O-157增殖的抑制。
本發(fā)明人還通過使沙鼠感染幽門螺桿菌(H.pylori)，飼養(yǎng)1個月，然后測定沙鼠胃和十二指腸中的活菌數，來研究縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物防御幽門螺桿菌感染的效果。結果發(fā)現(xiàn)上述聚乳酸混合物顯示了防御幽門螺桿菌感染的效果。
本發(fā)明基于這些發(fā)現(xiàn)而完成。
即，根據本發(fā)明，提供包含縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物的微生物感染防御劑。
本發(fā)明的微生物感染防御劑優(yōu)選是細菌感染防御劑，更優(yōu)選作為病原性大腸桿菌感染防御劑(例如病原性大腸桿菌O-157感染防御劑等)或幽門螺桿菌感染防御劑使用。本發(fā)明的微生物感染防御劑例如可作為微生物感染癥的治療藥或預防藥使用。
優(yōu)選聚乳酸中的重復單元乳酸實質上由L-乳酸構成。
優(yōu)選縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物是如下制備的部分將乳酸在惰性氣氛下進行脫水縮合，將得到的反應液可溶于乙醇和甲醇的部分進行反相柱層析，用pH為2～3的25～50％重量的乙腈水溶液洗脫后，用pH為2～3的90％重量以上的乙腈水溶液洗脫的部分。
優(yōu)選在氮氣氣氛下，通過逐級減壓和升溫進行脫水縮合。
優(yōu)選反相柱層析通過ODS柱層析進行。
根據本發(fā)明的另一方面，提供含有上述本發(fā)明的微生物感染防御劑的、用于防御微生物感染的食品。
根據本發(fā)明的又一個方面，提供縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物在微生物感染防御劑或用于防御微生物感染的食品生產中的應用。
根據本發(fā)明的又一個方面，提供用于防御微生物感染的方法，該方法包括將有效量的縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物給予人等哺乳動物。
圖面簡述

圖1顯示制備例1得到的聚乳酸化合物的質譜。
圖2為顯示CPL影響感染O-157小鼠存活率的效果的圖。
圖3為顯示CPL影響感染O-157小鼠糞便中活菌數的效果的圖。
圖4為顯示CPL給予組和對照組的胃(前胃、后胃)以及十二指腸中幽門螺桿菌活菌數的測定結果的圖。白色條柱表示對照組(n＝5)，黑色條柱表示CPL組(n＝6)。
圖5顯示制備例2得到的產物的正離子模式FABMS譜的全圖。范圍m/z 10.0000～1305.5900圖6顯示制備例2得到的產物的負離子模式FABMS譜的全圖。范圍m/z 10.0000～2000.0000圖7顯示制備例2得到的產物的負離子模式FABMS譜的放大圖。范圍m/z 10.0000～501.9260圖8顯示制備例2得到的產物的負離子模式FABMS譜的放大圖。范圍m/z 490.2980～1003.7700圖9顯示制備例2得到的產物的負離子模式FABMS譜的放大圖。范圍m/z 999.9500～1504.3400圖10顯示制備例2得到的產物的負離子模式FABMS譜的放大圖。范圍m/z 1484.5300～2000.0000圖11顯示制備例2得到的產物的NMR譜的全圖。
圖12顯示CPL影響感染O-157小鼠存活率的效果的圖。
圖13為顯示CPL影響感染O-157小鼠糞便中活菌數的效果的圖。
實施發(fā)明的最佳方式下面，對本發(fā)明的實施方案和實施方法進行詳細說明。
本發(fā)明的微生物感染防御劑含有縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物作為有效成分，例如可作為大腸桿菌O-157等病原性大腸桿菌或幽門螺桿菌感染的防御劑使用。本發(fā)明的微生物感染防御劑可以作為各種微生物感染的治療藥和預防藥使用。
本說明書中所說的微生物具有最廣義的含義、包括細菌和真菌等全部的微生物。
微生物具體可例舉有大腸桿菌(包括O-157等)、腸球菌、葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等)、綠膿桿菌、腸炎菌(腸炎沙門氏菌)、肺炎桿菌、枯草芽孢桿菌、念珠菌、幽門螺旋桿菌等，它們有些除了使腸內腐敗或產生致癌物質和其他有害毒素之外，也是引發(fā)各種自發(fā)性感染癥的原因。
本發(fā)明的微生物感染防御劑具有防御上述病原性細菌等微生物感染的功能，因此，可以用于預防感染病原性細菌引起的疾病，或治療疾病的用途。這樣的疾病可以例舉由大腸桿菌等食物中毒病原菌類引起的腹瀉和食物中毒、變異鏈球菌等引起的齲齒、幽門螺桿菌引起的胃潰瘍和胃癌等。
即，本發(fā)明的微生物感染防御劑可以抑制作為條件感染病因的大腸桿菌(Escherichia coli)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)等；假單胞菌屬(Pseudomonos)菌；病原性大腸桿菌及其親緣菌的沙門氏菌(Salmonella)等的細菌感染，可以抑制作為條件感染病因的細菌和腸道感染病原菌的增殖，從而可以預防腸道內感染和條件感染。
其中的大腸桿菌是構成健康人體的腸內菌叢的1個菌種，獲得了產生部分特殊致病因子的能力的大腸桿菌會引起人體的腸道感染癥。在全國各地，自腸出血性大腸桿菌(EHEC)O-157H7感染癥集體發(fā)病多發(fā)的1996年以來，集體發(fā)病的件數正在減少，但散發(fā)病例依然持續(xù)。EHEC產生vero毒素作為主要致病因子，該vero毒素對來源于非洲綠猴腎細胞的vero細胞顯示強的細胞毒性，感染時，有約5％的病例并發(fā)溶血性尿毒癥綜合征，以及偶爾并發(fā)腦病，多后果嚴重。本發(fā)明的微生物感染防御劑可以特別用于預防和治療病原性大腸桿菌O-157引發(fā)的感染癥。
另外，已知幽門螺桿菌引發(fā)胃炎，同時還作為胃·十二指腸潰瘍的復發(fā)和延緩治愈因子發(fā)揮作用，另外也有人指出了該菌與胃癌的相關性。本發(fā)明的微生物感染防御劑可以用于防御幽門螺桿菌的感染。
本發(fā)明的微生物感染防御劑對于防御病原性細菌感染有效，因此如果預先在感染之前攝取，則具有細菌難以感染，即使感染也容易治愈的預防性作用。從而，本發(fā)明的微生物感染防御劑也優(yōu)選作為健康食品和藥物日常攝取。
在本發(fā)明的微生物感染防御劑和用于防御微生物感染的食品中，使用縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物作為有效成分。
本說明書中所說的“聚乳酸混合物”是指縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸以任意的比例存在的混合物。即，“混合物”的用語是指具有縮合度為3～20其中的任意一個的聚乳酸混合物，同時也作為包含環(huán)狀和鏈狀聚乳酸的混合物的概念應用。如本說明書中以下所述的，這樣的“聚乳酸混合物”可以通過將乳酸進行脫水縮合，以適當的方法提純而得到。本說明書中為了方便，使用了“聚乳酸混合物”的用語，但其中也包含由具有一定縮合度的環(huán)狀聚乳酸或具有一定縮合度的鏈狀聚乳酸這樣單一成分構成的聚乳酸。
縮合度是指聚乳酸中的重復單元即乳酸單元的數量。例如推測環(huán)狀聚乳酸有下述的結構式，式中的n即表示縮合度(即n＝3～20)。
本說明書中，如果稱為“乳酸”，則該乳酸中包含L-乳酸、D-乳酸或它們的任意比例的混合物的全部。本發(fā)明中，優(yōu)選乳酸實質上由L-乳酸構成。這里所說的“實質上”是指聚乳酸混合物中的L-乳酸單元的比例[即，(L-乳酸單元數/L-乳酸單元數+D-乳酸單元數)×100]例如為70％以上，優(yōu)選80％以上，更優(yōu)選85％以上，進一步優(yōu)選90％以上，特別優(yōu)選95％以上。聚乳酸混合物中L-乳酸單元的比例與作為原料使用的乳酸中存在的L-乳酸和D-乳酸的比例相關。
縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物的制備方法并沒有特別限定，例如可通過特開平9-227388號公報、特開平10-130153號公報、或者特愿平11-39894號說明書(這些專利說明書中記載的內容的通過引用全部包括在本文中，作為本說明書的發(fā)明的公開內容。)等記載的制備方法來獲得。
更具體地說，例如縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物可根據下述方法A獲得。
方法A首先，使乳酸(優(yōu)選實質上由L-乳酸構成的乳酸)在惰性氣氛下進行脫水縮合。惰性氣氛可以例舉氮氣、氬氣等，優(yōu)選使用氮氣。
脫水縮合反應在常壓～約1mmHg減壓下，在110～210℃，優(yōu)選130～190℃的溫度下進行，特別優(yōu)選通過逐級減壓和逐級升溫來進行。反應時間可以適當設定，例如可以進行1～20小時的反應。采用逐級減壓和逐級升溫時，將反應時間分為2部分以上的反應時間，對每部分分別設定壓力和溫度進行反應。采用逐級減壓時，例如可以按照常壓→150mm Hg→3mm Hg減壓，采用逐級升溫時，例如可以按照145℃→155℃→185℃升溫。實際上也可以將其組合，例如按照145℃常壓下3小時、145℃150mm Hg下3小時、155℃3mm Hg下3小時，然后185℃3mm Hg下1.5小時進行反應。
接著，向脫水縮合反應得到的反應混合物中加入乙醇和甲醇，過濾，干燥濾液，得到可溶于乙醇和甲醇的部分。即，本說明書中所述的“可溶于乙醇和甲醇的部分”是指可溶于乙醇和甲醇的混合液的部分。得到可溶于乙醇和甲醇的部分時，是將脫水縮合反應的反應混合物與乙醇和甲醇混合，但此時的乙醇和甲醇的比例可以適當設定，例如乙醇∶甲醇＝1∶9。向反應混合物中添加乙醇和甲醇的順序、方法等并沒有特別限定，可以適當選擇，例如可以先向脫水縮合反應的反應混合物中添加乙醇，然后添加甲醇。
將上述得到的可溶于乙醇和甲醇的部分進行反相柱層析，特別是使用十八烷基硅烷(ODS)柱的層析，首先除去用pH為2～3的25～50％重量的乙腈水溶液洗脫的部分，然后收集用pH為2～3的90％重量以上的乙腈水溶液、優(yōu)選99％重量以上的乙腈水溶液洗脫得到的部分，這樣可得到縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物。
如上所述得到的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物可用氫氧化鈉等堿中和，減壓干燥，然后通過常規(guī)方法制成如下所述的所需形式的制劑。
作為制備本發(fā)明中使用的縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物的另一個方法，可以例舉特愿平11-265715號說明書中記載的方法(方法B)或特愿平11-265732號說明書中記載的方法(方法C)(這些專利說明書中記載的內容通過引用全部包括在本文中，作為本說明書的發(fā)明的公開內容。)。下面對方法B和方法C進行具體說明。
方法B該方法是通過使丙交酯在以RYLi(式中，R表示脂族基或芳族基，Y表示氧原子或硫原子)表示的鋰化合物存在下聚合，制備環(huán)狀乳酸低聚物的方法。進行聚合反應時，鋰化合物(RYLi)的使用比例為1摩爾丙交酯使用1～0.1摩爾，優(yōu)選0.2～0.3摩爾的比例。反應溫度為-100～0℃，優(yōu)選-78～-50℃。優(yōu)選反應以-78～-50℃的溫度開始，慢慢升溫至室溫。優(yōu)選反應在反應溶劑存在下進行。反應溶劑除四氫呋喃等環(huán)醚之外，可以使用二乙醚、二甲氧基乙烷等。反應氣氛采用氮氣、氬氣等惰性氣體氣氛。反應壓力并無特別限制，優(yōu)選常壓。
如上所述得到的乳酸低聚物的組成(即環(huán)狀乳酸低聚物和鏈狀乳酸低聚物的混合比例)隨著作為反應助劑使用的鋰化合物而變動。使用碳原子數為1～3烷基醇的鋰化合物(ROLi)(式中，R為碳原子數1～3的烷基)作為鋰化合物時，可得到環(huán)狀乳酸低聚物和鏈狀乳酸低聚物的混合物(環(huán)狀乳酸低聚物的比例80～85％重量)。而使用叔丁醇等碳原子數為4以上的烷基醇的鋰化合物和苯硫酚化合物作為鋰化合物時，可以實質上選擇性地得到環(huán)狀乳酸低聚物。
方法C該方法的特征是包含(i)第1加熱步驟，在350～400mm Hg的壓力條件下，將乳酸加熱到120～140℃范圍的溫度，使之進行脫水縮合反應，同時，并不餾出丙交酯，只餾出并除去副產物水；(ii)第2加熱步驟，該第1加熱步驟結束后，將反應產物加熱到150～160℃的溫度，將該反應壓力以0.5～1mm Hg/分鐘的減壓速度降到15～20mm Hg，在減壓的同時一邊避免餾出丙交酯，一邊只餾出并除去副產物水，該反應壓力降到15～20mm Hg后，在同壓力條件和150～160℃反應溫度下，再繼續(xù)反應，使之生成以鏈狀乳酸低聚物為主要成分的脫水縮合物。
(iii)第3加熱步驟，該第2加熱步驟結束后，在0.1～3mm Hg的壓力條件下以150～160℃加熱，使該鏈狀乳酸低聚物環(huán)化，生成環(huán)狀低聚物。
該方法首先在第1加熱步驟中在減壓下加熱乳酸，使之進行脫水縮合反應。此時的反應時間為3～12小時，優(yōu)選5～6小時。為了使該第1加熱步驟下進行的反應順利進行，要餾去乳酸脫水縮合而生成的副產物水，但此時并不餾去2分子乳酸的脫水縮合物丙交酯。因此，要使反應壓力減壓，優(yōu)選300～500mm Hg，更優(yōu)選保持350～400mmHg，在該壓力條件下，可以加熱到100～140℃，優(yōu)選130～140℃的范圍。通過該第1加熱步驟的反應，主要生成以乳酸的3～23分子脫水縮合物為主要成分的反應產物。
上述第1加熱步驟結束后，在第2加熱步驟中，為了得到平均聚合度更高的低聚物，要加熱到比上述第1加熱步驟中的反應溫度高的溫度，優(yōu)選145～180℃，更優(yōu)選150～160℃，同時使反應壓力降到10～50mm Hg，優(yōu)選15～20mm Hg的壓力，再繼續(xù)進行脫水縮合反應。
該反應也與上述第1加熱步驟的反應情形相同，為使反應順利進行，要在餾去副產物水而不餾去丙交酯的條件下進行。為了避免餾去丙交酯，且提高反應效率，通常需要將反應壓力降至上述范圍的壓力時的速度(減壓速度)保持在0.25～5mm Hg/分鐘，優(yōu)選0.5～1mm Hg/分鐘的范圍。如果是比上述范圍低的減壓速度，則減壓到規(guī)定壓力所需的時間就延長，因而不優(yōu)選，另一方面，如果使比上述范圍高的減壓速度，則丙交酯會與副產物水一同餾去，因而不優(yōu)選。
反應壓力下降到規(guī)定壓力后，在該反應壓力下再繼續(xù)反應。此時的加熱時間為3～12小時，優(yōu)選5～6小時。
通過上述第2加熱步驟的反應，可得到平均聚合度為3～30，優(yōu)選3～23的乳酸低聚物，此時低聚物中的環(huán)狀低聚物的比例通常為70～80％重量左右。
上述第2加熱步驟結束后，在第3加熱步驟中，將反應壓力保持在0.25～5mm Hg，優(yōu)選0.5～1mm Hg，以145～180℃，優(yōu)選150～160℃的溫度再繼續(xù)反應。反應時間為3～12小時，優(yōu)選5～6小時。此時也要餾去副產物水。此時也優(yōu)選避免丙交酯的餾去，但由于反應產物中幾乎不含丙交酯，因此無需特別降低減壓速度。
通過上述第3加熱步驟的反應，可生成平均聚合度為3～30，優(yōu)選3～23，且環(huán)狀低聚物的比例為90％重量以上，優(yōu)選99％重量以上的乳酸低聚物。
上述方法A、B和C只是表示本發(fā)明所采用的聚乳酸混合物的制備方法的部分具體實例，在本發(fā)明中，也可使用以其他方法制備的聚乳酸混合物。
在上述必需成分之外，可以根據需要，在無損本發(fā)明效果的范圍內，任意選擇、同時使用藥物類、準藥物類等制劑中使用的成分和添加劑來制造本發(fā)明的微生物感染防御劑。本發(fā)明的微生物感染防御劑除可單獨作為藥物類使用之外，也可以混合到藥物類、準藥物類等中使用。
本發(fā)明的微生物感染防御劑的形式并無特別限定，可以從經口給藥或非經口給藥用的劑型中選擇最符合目的的適當的形式。
適合經口給藥的劑型可以例舉片劑、膠囊劑、散劑、口服液、顆粒劑、細粒劑、糖漿劑、溶液劑、乳劑、混懸劑、咀嚼劑等，適合非經口給藥的劑型可以例舉注射劑(皮下注射、肌內注射或靜脈注射)、外用劑、輸液、吸入劑、噴霧劑等，但并不限于這些。
適合經口給藥的液體制劑例如溶液劑、乳劑或糖漿劑等可以用水、蔗糖、山梨醇、果糖等糖類，聚乙二醇、丙二醇等甘醇類，芝麻油、橄欖油、豆油等油類，對羥基苯甲酸酯類等防腐劑，草莓香料、薄荷等香料類等來制造。另外膠囊劑、片劑、散劑或顆粒劑等固體制劑的制造可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等賦形劑，淀粉、褐藻酸鈉等崩解劑，硬脂酸鎂、滑石粉等潤滑劑，聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等粘合劑，脂肪酸酯等表面活性劑，甘油等增塑劑等。
適合非經口給藥的注射用或輸液用的制劑優(yōu)選將作為有效成分的上述物質以溶解或懸浮狀態(tài)包含在與受藥者的血液等滲的無菌水性介質中。例如，如果是注射劑，則可用由鹽溶液、葡萄糖溶液、或鹽水與葡萄糖溶液的混合物構成的水性介質等配制溶液。用于腸內給藥的制劑可以用例如可可脂、氫化脂或氫化羧酸等載體來配制，作為栓劑提供。另外，在噴霧劑的制備中，可以將作為有效成分的上述物質分散為微粒，可以使用不刺激受藥者的口腔和氣道粘膜，且容易吸收有效成分的載體。作為載體，可具體例舉乳糖或甘油等?？筛鶕行С煞治镔|和使用的載體的性質，配制成氣霧劑或干粉等形式的制劑。在這些非經口給藥用的制劑中可以添加選自甘醇類、油類、香料類、防腐劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、粘合劑、表面活性劑、增塑劑等的1種或多種的飲食品。
本發(fā)明的微生物感染防御劑的給藥量和給藥次數可根據包括給藥目的、給藥形式、攝取者年齡、體重或性別等條件的各種因素而適當設定，通常有效成分的給藥量為每天1～10,000mg/kg，優(yōu)選10～2000mg/kg，更優(yōu)選10～200mg/kg。優(yōu)選將上述給藥量的制劑分為每天1～4次左右給藥。
本發(fā)明的微生物感染防御劑的給藥時間并沒有特別限定，在微生物感染前或后均可。
本發(fā)明還涉及包含縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物、用于防御微生物感染的食品。即，本發(fā)明中使用的縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物不僅以上述單獨劑型使用，還可以混合到食品中使用。
本發(fā)明的用于防御微生物感染的食品只要混合后不使聚乳酸混合物分解即可，對混合形式并沒有特別限定。
本發(fā)明的用于防御微生物感染的食品制品可具體例舉清涼飲料、口服液、健康食品、指定保健用食品、功能食品、活性功能食品、營養(yǎng)輔助食品、增補劑、飼料、飼料添加劑等通常稱為健康食品或輔助食品(包括飲料)的制品。
食品的具體例子有香口膠、巧克力、糖果、糖片、果凍、曲奇餅、餅干、酸乳酪等糖果點心類；雪糕、果汁冰棍等的冰點類；茶軟飲料(包括果汁、咖啡、可可等)、營養(yǎng)口服液、美容口服液等飲料；面包、火腿、湯、果醬、意大利粉、冷凍食品類等任何的食品?；蛘撸部梢詫⒈景l(fā)明中使用的聚乳酸混合物添加于調味料或食品添加劑中使用。通過攝取本發(fā)明的用于防御微生物感染的食品，能夠發(fā)揮防御微生物感染的效果，可以提供未顯示實質的有害副作用的、安全的食品。
本發(fā)明的用于防御微生物感染的食品可以通過將聚乳酸混合物直接混合、分散到食品所使用的通常的原料中，通過公知的方法加工成所需的形式而獲得。
本發(fā)明的用于防御微生物感染的食品包含所有形式的食品，其種類并無特別限定，可以將本發(fā)明的微生物感染防御劑混合到如上所述的各種食物或各種營養(yǎng)組合物，例如各種經口或經腸營養(yǎng)劑、飲料等中，作為食品提供。這樣的食品的組成中除了縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物之外，還可以包含蛋白質、脂質、糖類、維生素和/或礦物質類等。食品的形式并無特別限定，只要是容易攝取的形式即可，可以是固體、粉末、液體、膠狀、漿狀等任何形式。
食品中的聚乳酸混合物的含量并無特別限定，通常為約0.1～20％重量，更優(yōu)選約0.1～10％重量。
食品中含有的聚乳酸混合物的量優(yōu)選含有可發(fā)揮作為本發(fā)明目的的防御微生物感染作用的量，優(yōu)選在攝取的食品中含有約0.1g至10g，更優(yōu)選含有約0.5g至3g。
作為本申請所要求的優(yōu)先權的基礎即日本專利申請?zhí)卦?001-4823號的說明書中所記載的全部內容引用到本說明書中，作為本說明書的發(fā)明公開的一部分。
通過以下實施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的任何一點均不受實施例限制。
實施例制備例1聚乳酸混合物(以下稱為CPL)的制備將500ml L-乳酸(混有D-乳酸)加入置于加熱套中的分離式燒瓶中。通入300ml/分鐘的氮氣并進行攪拌，一邊將餾出的水通過保溫的下行連接管導入具回流冷凝器的燒瓶，一邊以145℃加熱3小時。再減壓至150mm Hg，在同一溫度下加熱3小時，然后減壓至3mm Hg，在155℃溫度下加熱3小時，最后在3mm Hg減壓下185℃加熱1.5小時，得到反應產物聚乳酸。
將得到的聚乳酸保持在100℃，先后加入100ml乙醇和400ml甲醇，然后冷卻。將該液加入500ml甲醇中，充分攪拌、靜置，然后過濾、提純。將該濾液減壓干燥，溶解于乙腈，配制為200ml(原液)。
將該原液通過預先已平衡的反相ODS柱(TSK gel ODS-80TM)，用含0.01M鹽酸的30％、50％和100％乙腈(pH 2.0)逐級洗脫，得到100％乙腈洗脫的部分即聚乳酸(縮合度3～20)。得到的物質的質譜顯示在圖1中。從圖1中有規(guī)律的碎片離子峰可知得到的聚乳酸混合物為環(huán)狀縮合物為主體，混有少量直鏈縮合物的狀態(tài)。
試驗例1(材料和方法)實驗動物使用5～12周齡的無菌BALB/c系小鼠(CLEA JAPANINC)。對于CPL組，預先將混入了1％CPL(由制備例1制備的)的標準固體餌料(CE-2)進行高壓蒸汽滅菌(121℃、10分鐘)，與滅菌自來水同時供其自由攝取。另外，對于對照組，將放射線滅菌(鈷60)的標準固體餌料(CE-2)與滅菌自來水同時供其自由攝取。試驗用的所有小鼠均在乙烯隔離籠內飼養(yǎng)管理。
自開始給予CPL后的第3天，用胃管經口給予EHEC(8.5×106cfu/只)，觀察存活以及每天測定糞便中的菌數。
菌數測定如下進行取糞便，稱量糞便重量，加入10倍量的磷酸緩沖液(PBS)進行勻漿，逐級稀釋，將0.1ml逐級稀釋液涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基(Defco，USA)上，計數菌落數。
(結果及討論)(1)CPL對感染EHEC小鼠存活的效果圖2顯示了CPL給予組和對照組的存活觀察(存活率)結果。從給予EHEC之前3天開始給予混入了CPL的標準固體餌料的無菌小鼠中，從給予EHEC后的第6天死亡，第11天的存活率為50％。與自第3天死亡，第11天的存活率為30％的CPL未攝取組的感染小鼠相比，可見CPL攝取組對于EHEC的抗性高。
(2)糞便中的活菌數圖3顯示了測定CPL給予組和對照組的糞便中活菌數的結果。在存活觀察期間，持續(xù)檢出了糞便中排出的EHEC。EHEC定居于無菌小鼠腸道內，并且，與CPL非攝取組相比，可知在測定期間內CPL攝取組的1g濕糞便的活菌數略少。
由上述結果可以證實，感染小鼠的死亡是由于EHEC感染引起的，攝取混入了CPL的標準固體餌料的小鼠對于EHEC感染顯示了抗性。
試驗例2(材料和方法)實驗動物使用9～12周齡的沙鼠(SEYAKKU)。對于CPL組，將混入了0.2％的CPL的標準固體餌料(CE-2)與滅菌自來水同時供其自由攝取，另外對于對照組，將放射線滅菌(鈷60)的標準固體餌料(CE-2)與滅菌自來水同時供其自由攝取。用胃管連續(xù)3天經口給予幽門螺桿菌(1.5～3.0×106cfu/只)，然后給予混入餌料中的CPL，第30天處死，取胃和十二指腸，測定活菌數?；罹鷶档臏y定如下進行稱量胃(分割為前胃和后胃)和十二指腸的重量，加入10倍量的磷酸緩沖液(PBS)進行勻漿，逐級稀釋，將0.1ml逐級稀釋液涂布于螺桿菌瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥)上，計數菌落數。
(結果及討論)感染幽門螺桿菌沙鼠的胃和十二指腸中的活菌數圖4顯示了CPL給予組和對照組的胃(前胃和后胃)以及十二指腸中的幽門螺桿菌活菌數的測定結果。CPL給予組的前胃(102cfu)、后胃(102cfu)以及十二指腸(102cfu)中的活菌數與對照組的前胃(103cfu)、后胃(104cfu)以及十二指腸(104cfu)中的活菌數相比顯示減少的傾向。
上述結果顯示機體內CPL本身或其代謝產物抑制了幽門螺桿菌的增殖，給予CPL可以防御幽門螺桿菌的感染。
制備例2乳酸低聚物混合物(以下也稱為X03)的制備制備例2的反應圖如下所示。
在氮氣氣氛、0℃下，向含0.101g(1mmol)二異丙胺的5mlTHF溶液中加入0.63mL(1mmol)正丁基鋰(1.6M己烷溶液)，攪拌10分鐘，生成二異丙基氨基化鋰(LDA)，然后加入含0.577g(4mmol)L-(-)-丙交酯的4mL THF溶液，攪拌15分鐘使其反應。向該反應混合物中加入20mL飽和氯化銨水溶液，處理反應，再加入10mL水。用THF(50mL)萃取5次，用無水硫酸鈉干燥有機層。濾除無水硫酸鈉，然后減壓濃縮有機溶劑，得到0.53g粗產物。向得到的粗產物中加入6mL乙醚，在超聲波清洗儀中浸漬10分鐘，過濾，得到0.39g熔點為125～129℃的白色固體產物。
圖5-圖11顯示得到的產物的物理性質數據。由圖5-圖11所示的FABMS和NMR數據可知固體產物中存在從3聚體到21聚體的環(huán)狀乳酸低聚物和從3聚體到27聚體的鏈狀乳酸低聚物。
試驗例3(材料和方法)實驗動物使用5～6周齡的無菌BALB/c系小鼠(CLEA JAPANINC)。對于CPL組，預先將混入了0.1％的X03(由制備例2制備的)的標準固體餌料(CE-2+X03)進行高壓蒸汽滅菌(121℃、10分鐘)，與滅菌自來水同時供其自由攝取。另外，對于對照組，將放射線滅菌(鈷60)的標準固體餌料(CE-2)與滅菌自來水同時供其自由攝取。試驗用的所有的小鼠均在乙烯隔離籠中飼養(yǎng)管理。
自開始給予CPL后的第7天，用胃管經口給予EHEC(5.0×106cfu/只)，觀察存活以及每天測定糞便中的菌數。
菌數測定如下進行取糞便，稱量糞便重量，加入10倍量的磷酸緩沖液(PBS)進行勻漿，將0.1ml該勻漿涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基(Defco，USA)上，計數菌落數。
(結果及討論)(1)CPL對存活率的效果圖12顯示CPL給予組和對照組的存活觀察(存活率)結果。15天觀察期間的感染EHEC小鼠的存活率為對照組為20％(2/10)、CPL給予組為88.9％(2/18)。
(2)糞便中的活菌數圖13顯示測定CPL給予組和對照組的糞便中活菌數的結果。對照組和CPL給予組的糞便中的活菌數均為1g濕糞便中含有109-10cfu。
工業(yè)應用性本發(fā)明的微生物感染防御劑可用于治療和預防微生物(例如O-157等病原性大腸桿菌和幽門螺桿菌等)感染癥。
另外，本發(fā)明中作為有效成分使用的聚乳酸混合物是來源于機體成分的乳酸低縮合物，因此生物體適合性高，副作用少。
權利要求
1.一種微生物感染防御劑，所述微生物感染防御劑含有縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物。
2.權利要求1的微生物感染防御劑，所述微生物感染防御劑是細菌感染防御劑。
3.權利要求1或2的微生物感染防御劑，所述微生物感染防御劑是病原性大腸桿菌感染防御劑。
4.權利要求1或2的微生物感染防御劑，所述微生物感染防御劑是病原性大腸桿菌O-157感染防御劑或幽門螺桿菌感染防御劑。
5.權利要求1～4的任一項所述的微生物感染防御劑，所述微生物感染防御劑作為微生物感染癥的治療藥或預防藥使用。
6.權利要求1～5的任一項所述的微生物感染防御劑，其中所述聚乳酸中的重復單元乳酸實質上由L-乳酸構成。
7.權利要求1～6的任一項所述的微生物感染防御劑，其中所述縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物是如下制備的部分將乳酸在惰性氣氛下進行脫水縮合，將得到的反應液可溶于乙醇和甲醇的部分進行反相柱層析，用pH為2～3的25～50％重量的乙腈水溶液洗脫后，用pH為2～3的90％重量以上的乙腈水溶液洗脫的部分。
8.權利要求7的微生物感染防御劑，其中所述脫水縮合在氮氣氣氛下，通過逐級減壓和升溫進行。
9.權利要求7或8的微生物感染防御劑，其中所述反相柱層析通過ODS柱層析進行。
10.一種用于防御微生物感染的食品，所述食品包含權利要求1～9的任一項所述的微生物感染防御劑。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供可用于防御例如O－157等病原性大腸桿菌和幽門螺桿菌感染的新型微生物感染防御劑。根據本發(fā)明，可提供包含縮合度為3～20的環(huán)狀和/或鏈狀聚乳酸混合物的微生物感染防御劑。
文檔編號A61P1/00GK1496267SQ0280619
公開日2004年5月12日 申請日期2002年1月10日 優(yōu)先權日2001年1月12日
發(fā)明者村上正裕, 田爪正氣, 氣 申請人:天藤制藥株式會社