專利名稱：用于治療炎性疾病的煙堿性受體激動劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過使用或給予煙堿性受體激動劑治療炎性疾病，包括多種肺部疾病。
背景技術(shù)：
盡管我們每小時呼吸超過一立方米的空氣，但是我們的肺部防御機制通常能對付吸入空氣中存在的大量的顆粒，抗原，感染性病原體以及毒氣與煙霧。這些顆粒與免疫系統(tǒng)以及其他肺部防御機制相互作用的結(jié)果是產(chǎn)生了受控制的炎癥反應(yīng)，它通常是保護性的和有益的。通常，這個過程可以自我調(diào)節(jié)以保證氣道與發(fā)生氣體交換的肺泡上皮表面的完整性。然而在一些情況下卻不能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，組織損傷的可能性增加。取決于環(huán)境暴露的類型，遺傳易感性以及多種不甚明確的因素，異常大量的炎癥細胞會聚集在呼吸系統(tǒng)的不同部位，造成病態(tài)或疾病。
對吸入的或內(nèi)在的刺激的炎癥反應(yīng)的特征為血管通透性非特異性增加以及炎癥和趨化介質(zhì)包括組胺、類花生酸、前列腺素、細胞因子和趨化因子的釋放。這些介質(zhì)調(diào)節(jié)白細胞-內(nèi)皮細胞粘附分子的表達和接合，從而使血液中存在的炎癥細胞發(fā)生募集。
更特異的炎癥反應(yīng)包括對吸入抗原的識別以及啟動強化的特異性的免疫應(yīng)答。這個反應(yīng)參與哮喘、過敏性肺炎(HP)和可能結(jié)節(jié)病的發(fā)生。肺損傷后繼發(fā)的修復機制失調(diào)可促成哮喘、肺纖維化、慢性阻塞性肺病(COPD)以及慢性HP中的纖維化和功能喪失。
先前報道當前吸煙者中HP的發(fā)生率要明顯低于非吸煙者(1-4)。吸煙者中結(jié)節(jié)病的發(fā)生率也低于非吸煙者。吸煙對HP和其他炎性疾病發(fā)生的有益作用的潛在機制仍不清楚，但是這可能與煙堿的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。有戒煙后哮喘復發(fā)或惡化的臨床觀察。這方面的證據(jù)很難取到，并且煙堿在預防或治療哮喘中的任何保護性作用都可能被有上千種成分的煙草吸入的負面作用所掩蓋。
吸煙的保護性作用在其他疾病中也有報道，研究最多的是潰瘍性結(jié)腸炎，它是一種炎性腸病(7，8)。煙堿已經(jīng)被成功地用于該疾病的治療(9，10)。其他的研究已經(jīng)關(guān)注到煙堿在治療阿爾茲海默氏病和帕金森病中可能的治療價值(11，12)。
煙堿性受體是由5個多肽亞基構(gòu)成的五聚體，它作用為配體門控的離子通道。當配體結(jié)合于受體時，多肽發(fā)生構(gòu)象改變，打開中央通道以允許鈉離子從細胞外液進入細胞質(zhì)。已經(jīng)確定了四種類型的亞基α、β、γ和δ。受體可以由這四種類型亞基的任意組合構(gòu)成(13)。最近的研究表明肺泡巨噬細胞(AM)能表達α-7亞基(14)，而支氣管上皮細胞表達α-3，α-5和α-7亞基(15)，以及淋巴細胞表達α-2、α-5、α-7、β-2與β-4亞基(14)。成纖維細胞與氣道平滑肌細胞(17)也表達這些受體。因此，原住的肺部細胞(AM，樹突細胞，上皮細胞，成纖維細胞等)與那些在炎性疾病中募集的細胞(淋巴細胞，多形核細胞)都表達煙堿性受體。
淋巴細胞中煙堿性受體的激活影響細胞內(nèi)信號作用，導致細胞的不完全活化。事實上，煙堿處理上調(diào)了蛋白激酶的活性，這接著上調(diào)了磷脂酶A2(PLA2)的活性。PLA2負責將磷酸肌醇-2-磷酸(PIP2)切割為肌醇-3-磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)(18，19)。細胞內(nèi)IP3的持續(xù)存在會造成鈣儲備的脫敏，導致其耗盡(19)。這個發(fā)現(xiàn)可解釋這一事實，即用煙堿處理的淋巴細胞不釋放足夠多的鈣離子到細胞質(zhì)中以激活轉(zhuǎn)錄因子如NFκ-B(20)。
煙堿，香煙中的主要藥理學成分，是最為人熟知的煙堿性受體激動劑之一(21)。這種天然物質(zhì)有著明確的抗炎和免疫抑制特性(22)，以及可能有著抗纖維化特性(23)。令動物暴露于含高水平煙堿的香煙煙霧比低煙堿香煙免疫抑制更強(24)。另外，用煙堿處理大鼠抑制了對抗原的特異性抗體應(yīng)答并誘發(fā)了T細胞無反應(yīng)性(25)。盡管吸煙者的AM數(shù)目有所增多，但是這些AM顯示出對內(nèi)毒素起反應(yīng)分泌炎癥細胞因子的能力減弱((20，25，26))并且煙堿似乎是這種抑制的效應(yīng)成分(26)。一項研究還顯示吸煙者的外周血淋巴細胞表達更高水平的FAS配體(FASL)以及煙堿增加非吸煙者淋巴細胞上的FASL的表達，這提示煙堿可能影響細胞凋亡(27)。煙堿也顯示出在體外對人牙齦成纖維細胞的增殖以及產(chǎn)生細胞外基質(zhì)有抑制作用(23)。有意思的是，煙堿處理似乎上調(diào)煙堿性受體的表達(28)。
煙堿性激動劑可下調(diào)T細胞活化，實際上，煙堿顯示出影響T細胞表達共刺激分子CD28和CTLA4(29)。
B7/CD28/CTLA4共刺激途徑在T細胞活化和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用(30，31)。其中涉及兩個信號途徑。正信號包括B7(CD80/CD86)分子與T細胞CD28受體的結(jié)合，造成T細胞反應(yīng)(增殖、活化、細胞因子表達、和存活)的強化。負信號包括B7與活化的T細胞上的CTLA4的相互作用，造成T細胞反應(yīng)的下調(diào)(33，34)。CD28和CTLA4衍生的信號間的平衡可以改變T細胞活化的結(jié)果。
在HP中，先前已經(jīng)報導活動性HP患者(35)和鼠HP(36)中AM上的B7分子表達上調(diào)。還顯示阻斷小鼠的B7-CD28共刺激途徑抑制了肺部炎癥(36)。這些結(jié)果也證實吸煙者AM上B7分子的表達要低于非吸煙者，以及體外流感病毒感染能上調(diào)正常人AM中的B7表達卻不能上調(diào)吸煙者AM表達B7，是否這能歸結(jié)于香煙煙霧中存在的煙堿或其他物質(zhì)還不清楚(35)。哮喘(37，38)和結(jié)節(jié)病(39)中也報道有B7分子的上調(diào)。
地棘蛙素(epibatidine)是至今為止知道的最強的煙堿性激動劑(40)。它有著抗炎和止痛特性。事實上，它的止痛潛能是嗎啡的200倍(40)。也已知這個分子可在體外抑制淋巴細胞的增殖(41)。地棘蛙素與受體的結(jié)合是非特異性的(42)。然而，地棘蛙素主要在心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有嚴重的毒副作用，使得它不適合用作治療肺部疾病的抗炎藥物(40)。
二甲基苯基哌嗪鎓(DMPP)是一種非特異性的合成煙堿性激動劑(13)。它對受體的效力大約等同于煙堿，取決于刺激中涉及的細胞類型(43)。它相對于煙堿和其他煙堿性激動劑的優(yōu)點是它的化學構(gòu)型阻止它通過血腦屏障，因此不會引起成癮或其他中樞神經(jīng)效應(yīng)(13)。DMPP的抗炎特性未得到很好地描述。然而，已經(jīng)顯示長期體內(nèi)治療能減少白細胞數(shù)目，減少脾細胞生成細胞因子以及降低天然殺傷細胞的活性(44)。DMPP對氣道平滑肌細胞的作用也已經(jīng)被測試。當細胞與該激動劑接觸更長一段時間時，DMPP最初有著短暫的收縮作用，緊接著是舒張作用(45)。這種支氣管擴張作用本身不會使DMPP成為用于哮喘的潛在有效治療，因為目前在市場上可以得到更有效的支氣管擴張劑(B2激動劑)。然而，該煙堿性受體激動劑的所述特性是重要的，因為該藥物因其抗炎特性可以被安全地用于哮喘和COPD患者。另外，沒有證據(jù)表明DMPP對主要器官如心臟、腦、肝臟或肺有任何毒作用。
盡管在炎性疾病，包括肺部炎性疾病的治療上取得了進展，但是應(yīng)用目前可得到的藥物或藥劑進行的治療通常都會產(chǎn)生不希望的副作用。例如，COPD的炎癥顯然對皮質(zhì)類固醇耐藥，因而已經(jīng)意識到需要開發(fā)新的抗炎藥物用于治療這種疾病(46)。
同樣地，盡管皮質(zhì)類固醇和其他的免疫抑制藥物已經(jīng)被常規(guī)地用于治療肺纖維化，但是它們證實僅有微弱效力(47)。
因此，需要治療炎性疾病，包括肺部炎性疾病的新的和可靠的方法，其作用方式能減輕癥狀而不引起副作用。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，提供了一種治療炎性疾病的新方法。特別地，本發(fā)明描述了通過使用或給予煙堿性受體激動劑治療肺部炎性疾病的新方法。
將煙堿或其他煙堿性受體激動劑用于治療炎性肺病的想法是全新的。盡管煙堿和其他煙堿性受體激動劑有著令人印象深刻的抗炎和免疫抑制特性，但它們可用于治療過敏性和其他炎性肺部疾病的用途以前沒有公開過。煙堿本身是一種安全的物質(zhì)，它似乎不具有任何長期的副作用(48，49)。與吸煙相關(guān)的肺部、心臟和動脈疾病不是由煙堿引起的，而是吸入煙霧中存在的數(shù)千計其他化學物質(zhì)造成的。主要的問題是煙堿能通過血腦屏障而誘導成癮。這是先前對煙堿性激動劑治療肺部疾病缺乏興趣的主要原因。吸煙的危害是顯而易見的。盡管煙堿不引起吸煙的毒性作用(49)，但是關(guān)聯(lián)仍存在。
因此本發(fā)明提出將煙堿性受體激動劑如DMPP用于治療炎性肺病，如哮喘、COPD、間質(zhì)性肺纖維化(IPF)、結(jié)節(jié)病、HP、以及阻塞性細支氣管炎伴機化性肺炎(BOOP)。藥物可口服給予，或優(yōu)選與不同的優(yōu)選的載體氣霧化通過靶向遞送直接輸送到肺部以使任何全身作用降到最低限度。
煙堿性受體激動劑的抗炎和免疫抑制特性以及最小的副作用使得這些藥物非常適合于在治療大量不同的肺病中的醫(yī)學用途，這些肺病的特征是支氣管或間質(zhì)炎癥，包括如哮喘、COPD、IPF、結(jié)節(jié)病、HP和BOOP。
在閱讀下面非限制性的僅作為舉例而給出的優(yōu)選實施方案的描述并參照附圖后，本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點和特征將變得更明顯。
附圖簡要說明

圖1BAL細胞的總細胞計數(shù)和細胞分類計數(shù)。煙堿處理的小鼠中總細胞計數(shù)受到明顯的抑制，這主要歸結(jié)于淋巴細胞群減少。
圖2分離的肺單核的細胞中的IFN-γmRNA表達。觀察到IFN-γmRNA的顯著抑制。
圖324小時LPS刺激誘導TNF-αmRNA的表達。結(jié)果用表達％來表示，100％設(shè)定為單用LPS組。通過將TNF-α條帶的強度除以β-肌動蛋白的條帶強度以得到條帶的強度。用不同劑量(40-160μM煙堿與DMPP)處理受刺激的細胞引起TNF-αmRNA表達下降。在40μM煙堿濃度獲得了最大的效果(表達減少了98％)，而所有劑量的DMPP引起表達減少60-50％。
圖424小時SR刺激誘導TNF-αmRNA的表達。結(jié)果按圖5所述的表示。用不同劑量(80和160μM煙堿以及40到160μM DMPP)處理受刺激的細胞引起TNF-αmRNA表達下調(diào)。僅160μM劑量的煙堿對mRNA表達有作用，而40和80μM劑量的DMPP誘導了TNF-αmRNA表達減少高達60％。
圖524小時LPS刺激誘導IL-10mRNA的表達。結(jié)果按圖5所描述的表示。用不同劑量(40到160μM煙堿與DMPP)處理受刺激的細胞下調(diào)了IL-10mRNA的表達。最大的表達降低(降低87％)發(fā)生在40μM的煙堿濃度，所有三個劑量的DMPP造成了表達減少55-40％。
圖624小時SR刺激誘導IL-10mRNA的表達。用不同劑量(80和160μM煙堿以及40到80μM DMPP)處理受刺激的細胞引起IL-10mRNA表達下調(diào)。對于煙堿處理，最大的mRNA表達降低發(fā)生在160μM(表達降低60％)，對于DMPP處理為80μM(表達降低90％)。
圖724小時LPS刺激誘導RAW264.7細胞中IFN-γmRNA表達。結(jié)果按圖5所描述的表示。用不同劑量的DMPP處理受刺激的細胞造成IFN-γmRNA表達的減少。最大的表達下降(減少80％)發(fā)生在40μM DMPP。
圖8a)用LPS(38％)或SR抗原(35％)誘導CD80的表達。煙堿處理(40μM，48小時)將LPS刺激細胞中的表達減少到20％，SR刺激細胞中的表達降到26％。b)用LPS(38％)或SR抗原(35％)誘導CD80的表達。DMPP處理(40μM，48小時)將LPS刺激細胞中的表達減少到17％，SR刺激細胞中的表達降到20％。
圖9從對HP患者進行的BAL中分離到的T淋巴細胞中的IFN-γmRNA表達。DMPP處理減少了這些細胞中的IFN-γmRNA表達。
圖10來自對正?；颊哌M行的BAL的全部細胞中的CD86表達。用DMPP處理的細胞表達的CD86比未處理的細胞少50％。
圖11來自DMPP、煙堿和地棘蛙素處理小鼠的BAL細胞。24小時后煙堿和地棘蛙素處理對SR誘導的炎癥有著明顯的抑制作用。
圖12當我們增加動物數(shù)目后，發(fā)現(xiàn)DMPP對肺部炎癥的顯著抑制作用。
圖13來自DMP-處理小鼠的BAL液中的TNF水平。DMPP明顯降低BALF TNF水平。
圖14用增加劑量的DMPP進行腹腔內(nèi)處理對哮喘小鼠的BAL中總細胞聚集的影響。細胞數(shù)目在OVA攻擊的未處理的小鼠中高度增加。0.5和2.0mg/kg劑量的DMPP處理明顯地減少了細胞計數(shù)。
圖15劑量反應(yīng)的細胞分類計數(shù)。OVA攻擊的小鼠(OVA OVA)的BAL中有著比對照組(Sal Sal)更多的嗜酸性粒細胞和淋巴細胞。DMPP處理顯著地減少了所有組BAL中的嗜酸性粒細胞和淋巴細胞(n＝8；p＜0.05)。
圖16DMPP IP處理對哮喘小鼠BAL中的總細胞聚集的影響的第二劑量反應(yīng)。細胞數(shù)目在OVA攻擊的未處理小鼠中高度增加。0.1和0.5mg/kg劑量的DMPP處理明顯地減少了總細胞數(shù)。
圖17第二劑量反應(yīng)的分類計數(shù)。0.1和0.5mg/kg劑量的DMPP處理明顯地減少了嗜酸性粒細胞和淋巴細胞計數(shù)，0.5mg/kg是DMPP抗炎作用的最有效劑量。
圖18對照、哮喘和處理小鼠的BAL中的IL-5水平。OVA攻擊增加了BAL中的IL-5水平，而在0.5mg/kg處理組的小鼠中DMPP處理對IL-5水平有著顯著的抑制作用。
圖19正常、哮喘以及鼻內(nèi)給予0.5mg/kg DMPP處理的哮喘小鼠在醋甲膽堿攻擊后的肺阻力。與哮喘小鼠相比，DMPP似乎減少了肺阻力增大的百分比。
圖20計算肺阻力增大200％的激發(fā)攻擊劑量(PC200)。與哮喘小鼠相比，DMPP顯著地減少了處理小鼠的PC200(p＝0.04，n＝6)。
圖2124小時LPS刺激誘導IL-4mRNA表達。結(jié)果按圖5所描述的表示。用不同劑量(40到160μM煙堿與DMPP)處理細胞。煙堿處理引起IIL-4mRNA表達減少(在40μM組表達減少高達90％)。所有劑量的DMPP處理完全阻斷了LPS刺激細胞中的IL-4mRNA表達。
圖22DMPP對血嗜酸性粒細胞遷移的影響。DMPP誘導了對嗜酸性粒細胞遷移通過人工基底膜的劑量相關(guān)性抑制。
圖23美加明，一種煙堿性拮抗劑，對DMPP對血嗜酸性粒細胞遷移的抑制作用的影響。美加明逆轉(zhuǎn)了DMPP的作用，提示煙堿性受體的激活對于DMPP的抑制作用是必需的。
圖24其他煙堿性激動劑對血嗜酸性粒細胞遷移的影響。煙堿、地棘蛙素和胞嘧啶都減少了血嗜酸性粒細胞的遷移。
圖25DMPP對正常人肺成纖維細胞表達膠原1A mRNA的影響。DMPP以劑量依賴性方式抑制膠原1A mRNA表達。
圖26煙堿對人肺成纖維細胞表達膠原1A mRNA的影響。1和10μM的煙堿抑制膠原1A mRNA表達，而更高劑量沒有抑制作用。
圖27地棘蛙素，另一種煙堿性激動劑，對人肺成纖維細胞表達膠原1A mRNA的影響。地棘蛙素對膠原1A mRNA表達也有抑制作用。
優(yōu)選實施方案的描述先前已描述了在炎癥和肺部細胞上存在著煙堿性受體。但是，本發(fā)明的新穎性在于觀察到煙堿性受體激動劑表現(xiàn)出可用于炎性肺部疾病的治療，以及對煙堿性激動劑的抗炎和免疫抑制特性的相關(guān)發(fā)現(xiàn)，這些作用特異性地針對參與諸如哮喘、HP、結(jié)節(jié)病、BOOP、IPF和COPD這樣的炎性肺部疾病發(fā)病的機制。一個例子就是吸煙對B7共刺激分子表達的影響。
將兩種動物模型用于研究煙堿性拮抗劑在炎性肺部疾病中的作用HP模型和哮喘模型。采用這兩種模型，研究了煙堿性受體激動劑(選擇性及非選擇性)對肺生理和炎癥的作用。利用來自動物研究或患者的分離的炎癥細胞以及購得的細胞系進行體外研究以試圖了解煙堿性激動劑下調(diào)炎癥的機制。
最初，利用非特異性激動劑，也就是結(jié)合所有煙堿性受體亞基的激動劑(煙堿，二甲基苯基哌嗪鎓(DMPP)和地棘蛙素)進行實驗(13，42)。對一種β4亞基特異性激動劑野靛堿(42)也進行測試以檢驗是否特異性的刺激也能有抗炎作用。
對于本發(fā)明的目的而言，術(shù)語“動物”指的是人，靈長類動物，家畜(如馬，牛，豬，山羊，綿羊，貓，狗，豚鼠，小鼠等)以及其他的哺乳動物。通常，該術(shù)語用于表示有著高度發(fā)育的血管系統(tǒng)的生物。
對于本發(fā)明的目的而言，激動劑或藥劑是結(jié)合并調(diào)節(jié)煙堿性受體功能的分子或化合物。優(yōu)選的藥劑是受體特異性的并且不通過血腦屏障，如DMPP。盡管它們通常是有機化合物，優(yōu)選小的有機化合物，可以在無數(shù)的化學物質(zhì)類別中發(fā)現(xiàn)有用的藥劑。小的有機化合物有著大于150但小于約4,500的分子量，優(yōu)選的是小于約1500，更優(yōu)選的是小于約500。示例性的種類包括肽，糖，類固醇，雜環(huán)，多環(huán)，取代的芳香族化合物，以及諸如此類。
可對挑選的藥劑進行修飾以增加效力，穩(wěn)定性，藥物兼容性以及類似性能。對藥劑結(jié)構(gòu)的鑒定可以用于鑒定、產(chǎn)生或篩選另外的藥劑。例如，若鑒定出多肽藥劑，可以將它們按上面描述的多種方法進行修飾，如增強它們的蛋白水解穩(wěn)定性。其他穩(wěn)定方法可包括包封，如包封入脂質(zhì)體等。按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何便利方法制備目標結(jié)合藥劑。
為了治療用途，可以將影響煙堿性受體功能的藥劑以任何便利的方式給藥。小的有機物優(yōu)選口服給藥；其他組合物和藥劑優(yōu)選胃腸外給藥，便利地處于藥學或生理可接受的載體中，如磷酸緩沖鹽水，或類似物。典型的是將組合物加入到滯留的生理液如血液或滑膜液中。
例如，許多這些治療藥物適合于直接注射或輸注，局部、氣管內(nèi)/鼻內(nèi)給藥如通過氣霧劑，眼內(nèi)，或在植入物內(nèi)/上(如膠原，滲透泵，含有適當轉(zhuǎn)化細胞的移植物等，含有治療性多肽。通常，給藥量是經(jīng)驗性決定的，典型的是在約10-1000μg/kg的受體范圍內(nèi)。對于肽藥物，濃度通常是在給予劑量中約50-500μg/ml的范圍內(nèi)?？梢园ㄆ渌砑觿┤绶€(wěn)定劑，殺菌劑等。這些添加劑將以常規(guī)量存在。
煙堿性激動劑將不會取代目前用于治療炎性肺部疾病以及常與這些疾病相關(guān)的氣道阻塞的所有藥物。支氣管擴張劑對于即刻緩解支氣管痙攣仍是有用的。然而，支氣管擴張劑對潛在的病因或炎癥沒有作用。
皮質(zhì)類固醇是有效的抗炎藥物。它們的全身使用造成嚴重的副作用以致只要有可能就會排除它們的長期使用。吸入的吸收差的皮質(zhì)類固醇對于治療氣道炎癥是有效的。這些藥物在低劑量副作用極少或沒有副作用。然而，更高的劑量增加了口腔念珠菌病，聲帶麻痹，白內(nèi)障和骨質(zhì)疏松的危險。吸入的類固醇對肺間質(zhì)沒有作用，并且沒有抗纖維化的特性(57)。
更新的藥物，如抗白三烯藥物，對于一些哮喘是有用的(58)，但是對COPD和其他肺部疾病無效。這些藥物的抗炎特性局限于由白三烯引起的炎癥成分(59)。間質(zhì)性肺病如IPF、結(jié)節(jié)病、HP以及BOOP的治療基本上依賴于全身使用皮質(zhì)類固醇。這種治療在控制部分炎癥上是有效的，但是不幸的是會誘發(fā)嚴重的副作用以及不能逆轉(zhuǎn)潛在的纖維化改變。有時候?qū)⒚庖咭种苿┤绛h(huán)磷酰胺和硫唑嘌呤試用于嚴重的IPF，但是它們的治療價值未得到證實并且最多是非常局限的(60)。本質(zhì)上，肺纖維化通常是進展性的和不可治療的，大多數(shù)IPF患者死于這種疾病(61)。
煙堿性激動劑可用作為類固醇的備用或替代藥物。通過將它們靶向地運送到肺巨噬細胞，這些藥物可有助于控制氣道和間質(zhì)炎癥。除了具有更少的副作用外，煙堿性激動劑較皮質(zhì)類固醇的一個主要優(yōu)點是這些激動劑對于成纖維細胞有著直接的作用，因此能預防或逆轉(zhuǎn)氣道和肺的纖維化，而皮質(zhì)類固醇卻不能做到這些。間質(zhì)纖維化是IPF的標記，是HP和結(jié)節(jié)病的主要結(jié)局，而氣道纖維化是慢性哮喘中最常見的發(fā)現(xiàn)(57)。
其他物質(zhì)正處于積極研究，作為炎性肺病的潛在新療法。特異性地瞄準了很多細胞因子(如IL-5，IL-13，IL-16.....)(62)。相信因為炎癥中涉及途徑的復雜性，任何一種特異的細胞因子或其他炎癥介質(zhì)都不可能對治療這些肺病有顯著的影響。煙堿性受體激動劑，不象皮質(zhì)類固醇，有著針對廣泛炎癥反應(yīng)的優(yōu)點。這是它們用于治療炎性肺病的潛能所在。
實施例I-過敏樣炎癥煙堿性激動劑對小鼠中長期誘導的過敏性肺炎的影響。
實施例1體內(nèi)HP研究假定用煙堿刺激煙堿性受體通過抑制炎癥細胞因子以及抑制特異性抗原介導的細胞活化而下調(diào)對HP抗原的免疫應(yīng)簽。
選擇這個模型是因為，如前面提及的，吸煙者中的HP發(fā)生率要低于非吸煙者(50)，以及因為這個模型已經(jīng)被很好地描述。通過給予直逗號糖多孢菌(Saccharopolyspora rectivirgula)(SR)抗原誘導HP，該抗原是農(nóng)民肺的致病原，農(nóng)民肺是HP的一種形式。以范圍從0.5到2mg/kg劑量1天兩次經(jīng)腹膜內(nèi)(IP)給予煙堿同時處理小鼠。煙堿的給予顯著地減少了這些小鼠的支氣管肺泡灌洗液(BAL)中的總細胞數(shù)目。受煙堿處理影響最大的細胞群是淋巴細胞(圖1)。分離肺巨噬細胞和淋巴細胞，并用抗CD3+重組IL-2刺激。測定這些細胞的IFN-γmRNA產(chǎn)生，這是一種已知參與HP和其他肺部炎性疾病發(fā)生的細胞因子(52)。來自煙堿處理動物的細胞顯示出顯著低于來自未處理動物的細胞的IFN-γmRNA表達(圖2)。
實施例2體外研究顯示煙堿性激動劑對細胞因子表達的影響為了進一步闡明煙堿在體內(nèi)模型中抑制作用所涉及的機理，使用肺泡巨噬細胞細胞系。
利用RT-PCR檢測煙堿或DMPP處理AMJ2-C11細胞對TNF-α，IL-10mRNA表達的影響。這些細胞因子參與肺部炎性疾病如HP、哮喘和結(jié)節(jié)病的發(fā)生(52-55)。煙堿和DMPP處理表現(xiàn)出TNF-αmRNA表達的大幅下降(在LPS刺激和40μM煙堿處理組表達減少高達98％)，但不是以劑量依賴性方式(圖3)。在SR刺激的細胞中觀察到相似的結(jié)果(圖4)。由于培養(yǎng)基中大量的激動劑造成煙堿性受體脫敏可以解釋這種非劑量依賴性反應(yīng)。IL-10mRNA表達也受到煙堿和DMPP處理的削弱。最佳的下調(diào)發(fā)生在40μM煙堿劑量(LPS刺激的；mRNA表達減少88％；圖5)于80μMDMPP劑量(SR刺激的；mRNA表達減少87％，圖6)，再一次，這種作用是非劑量依賴性的。
用另一種巨噬細胞細胞系(RAW264.7，ATCC)通過RT-PCR檢測DMPP對IFN-γ表達的影響，因為AMJ2-C11細胞似乎不表達IFN-γmRNA(數(shù)據(jù)沒有顯示)。將細胞用50μg/ml的SR抗原進行刺激并與劑量從40到160μM的DMPP一起溫育。40μM劑量的DMPP處理減少了這些細胞中IFN-γ表達多至75％(圖7)。又一次，這種作用似乎不是劑量依賴性的。
實施例3煙堿性激動劑對共刺激分子表達的體外作用在體外測定煙堿和DMPP對B7(CD80)分子表達的影響。將AMJ2-C11細胞(小鼠肺泡巨噬細胞，來自ATCC)與40μM煙堿或DMPP一起培養(yǎng)并用LPS(0.1μg/ml)或SR(50μg/ml)刺激48小時。在處理細胞中CD80表達的百分比約為在LPS和SR刺激的未處理細胞中發(fā)現(xiàn)的表達的一半(圖8(a)和(b))。
實施例4對人BAL細胞的研究(AM和淋巴細胞)因為一個目的是用DMPP或相似的藥物治療患者，因此驗證了這種藥物對來自HP患者的淋巴細胞的影響。對HP患者進行BAL。將淋巴細胞與其他BAL細胞分離，并用PHA刺激以及與DMPP一起溫育。測定DMPP對細胞因子IFN-γmRNA產(chǎn)生的劑量效應(yīng)(通過RT-PCR)(圖9)。
對正常人進行支氣管肺泡灌洗，并分離肺泡巨噬細胞。SR刺激的以及煙堿或DMPP處理的細胞再次顯示出只有非處理細胞一半的CD86表達。(圖10)。
實施例5其他煙堿性激動劑對短期SR誘導的急性炎癥的作用的研究向小鼠鼻內(nèi)滴注農(nóng)民肺的致病原直逗號糖多孢菌(SR)抗原，誘導肺中顯著的炎癥反應(yīng)。中性粒細胞是最先募集在炎癥部位的炎癥細胞。用DMPP(0.5mg/kg)、煙堿(0.5mg/kg)和地棘蛙素(2μg/kg)處理小鼠對SR誘導的炎癥有著顯著的抑制作用(圖11)。將煙堿性激動劑以50μl體積每6小時鼻內(nèi)給予，并在SR滴注后24小時將小鼠處死。
對煙堿和地棘蛙素觀察到了顯著的抑制作用，但對DMPP卻沒有觀察到。然而，將用DMPP處理或不用DMPP處理的小鼠數(shù)目增加到15只后，我們確實觀察到了相對于未處理組的顯著抑制作用(圖12)。
DMPP處理小鼠的支氣管肺泡灌洗液中TNF(一種促炎癥細胞因子)水平較低(圖13)，這表明炎癥的下調(diào)可能是由較低的TNF濃度所致。
II-哮喘樣炎癥實施例6體內(nèi)哮喘模型在卵白蛋白致敏的小鼠上進行類似試驗。假設(shè)DMPP減弱針對吸入的過敏原和醋甲膽堿的炎癥反應(yīng)與過高反應(yīng)性。
將20μg乳化于含2mg氫氧化鋁的PBS中的OVA蛋白(雞蛋白蛋白，Sigma-Aldrich)腹腔內(nèi)注射以致敏Bal/c小鼠組。4周后，將1.5％/50μlOVA攻擊劑量經(jīng)鼻內(nèi)給予。每天進行一次攻擊連續(xù)3天，然后在末次接觸氣霧劑后24小時評估小鼠肺部的過敏性炎癥。在攻擊期間，用多種濃度的DMPP處理各組小鼠。進行支氣管肺泡灌洗(BAL)，并將該液體于400g離心以從液體中分離出細胞(圖14，15，16和17)。
將上清液用于測定肺IL-5水平。評價BAL細胞總數(shù)和分類細胞計數(shù)(圖18)。
用最合適的DMPP劑量重復本試驗以評估氣道反應(yīng)性。
AHR的測定利用計算機控制的通氣機(FlexiVENT)測定麻醉的氣管切開的通氣的小鼠對醋甲膽堿的氣道高反應(yīng)性(AHR)。
通過頸靜脈給予增加劑量的醋甲膽堿(0mg/kg-32.5mg/kg)(圖19，20)。
實施例7激動劑處理對IL-4 mRNA表達的影響激動劑處理對IL-4mRNA表達的影響也被測定(53)，已經(jīng)知道該細胞因子參與哮喘的發(fā)生。40μM的煙堿減少IL-4mRNA表達多達92％(圖9)。DMPP完全阻斷了IL-4 mRNA表達(圖21)。如先前所證實的，當用SR抗原刺激細胞時，無IL-4 mRNA表達(數(shù)據(jù)沒有顯示)。
實施例8各種激動劑對嗜酸性粒細胞遷移的作用為了進一步研究煙堿性激動劑哮喘中炎癥下調(diào)的作用，我們測定了各種激動劑對嗜酸性粒細胞遷移的作用。
嗜酸性粒細胞和其他炎癥細胞對肺部組織的浸潤是哮喘的重要特征和氣道炎癥及高反應(yīng)性的原因。炎癥細胞從循環(huán)到肺包括遷移通過血管內(nèi)皮，基底膜和胞外基質(zhì)成分。炎癥細胞通過產(chǎn)生蛋白酶而穿過基底膜。在這些初步的體外實驗中，我們研究了不同煙堿性激動劑對純化的血嗜酸性粒細胞遷移通過人造基底膜(Matrigel包被的趨化室)的影響。DMPP誘導了對嗜酸性粒細胞遷移的劑量相關(guān)性抑制(圖22)，然而這一作用被拮抗劑美家明(MEC)逆轉(zhuǎn)(圖23)。其他的煙堿性激動劑包括煙堿，地棘蛙素和胞嘧啶進一步確認了這種抑制作用(圖24)。結(jié)果用與無激動劑的對照條件相比的抑制百分比(激動劑處理的細胞)來表示。
這些結(jié)果說明煙堿性激動劑下調(diào)降解基底膜成分的蛋白酶的合成或活化，從而抑制嗜酸性粒細胞遷移到肺粘膜中。
實施例9煙堿性激動劑對膠原產(chǎn)生的影響哮喘的特征為氣道結(jié)構(gòu)改變，包括上皮下膠原沉積，這可能是該疾病慢性的原因。成纖維細胞的膠原合成與其降解之間的失衡可能參與這個過程(56)。在預實驗中，我們研究了煙堿性激動劑對原代正常成纖維細胞合成膠原A1的影響。通過RT-PCR評估膠原A1基因的表達。
結(jié)果表示為激動劑處理細胞與未處理細胞相比的基因表達百分比。
DMPP以劑量依賴性方式抑制膠原A1基因表達(圖25)。1和10μM煙堿有著輕微的抑制作用，而更高濃度卻沒有作用(圖26)，這可能是因為受體的脫敏。實現(xiàn)抑制可能需要更低的劑量，這將被測試。對地棘蛙素也觀察到了抑制作用(圖27)。
盡管本發(fā)明已如上通過優(yōu)選實施方案的方式進行了描述，但是可以在不偏離于所附的權(quán)利要求書中限定的本發(fā)明的精神和本質(zhì)的情況下加以修改。
參考文獻1.Cormier，Y.，J.Belanger，和P.Durand.1985.魁北克乳牛農(nóng)場農(nóng)夫中影響針對農(nóng)民肺抗原的血清沉淀素產(chǎn)生的因素“Factorsinfluencing the development of serum precipitins to farmer′s lungantigen in Quebec dairy farmers.”Thorax 40(2)138-42.
2.Cormier，Y.，L.Gagnon，F(xiàn).Berube-Genest，和M.Fournier.1988.試驗性外源性過敏性肺泡炎的序貫支氣管肺泡灌洗，吸煙的影響。“Sequential bronchoalveolar lavage in experimental extrinsicallergic alveolitis.The influence of cigarette smoking.”Am RevRespir Dis 137(5)1104-9.
3.Cormier，Y.，E.IsraeI-Assayag，G.Bedard，和C.Duchaine.泥煤苔加工廠工人中的過敏性肺炎“Hypersensitivity pneumonitis inpeat moss processing plant workers.”Am J Respir Cdt Care Med158(2)412-7.
4.Gariepy，L.，Y.Cormier，M.Laviolette，和A.Tardif.1989.無癥狀的乳牛場農(nóng)夫中支氣管肺泡灌洗細胞和血清沉淀素的預測價值.“redictive value of bronchoalveolar lavage cells and serumprecipitins in asymptomatic dairy tarmers.”Am Rev Respir Dis140(5)1386-9.
5.Lawrence，E.C.，T.B.Fox，R.B.Teague，K.Bloom，和R.K.Wilson.1986.吸煙與結(jié)節(jié)病患者中的支氣管肺泡T細胞群“Cigarettesmoking and bronchoalveolar T cell populations in sarcoidosis.”AnnN Y Acad Sci 465657-64.
6.Valeyre，D.，P.Soler，C.Clerici，J.Pre，J.P.Battesti，R.Georges，和A.J.Hance.1988.吸煙和肺結(jié)節(jié)病吸煙對該疾病的流行，臨床表現(xiàn)，肺泡炎以及演變的影響“Smoking and pulmonarysarcoidosiseffect of cigarette smoking on prevalence，clinicalmanifestations，alveolitis，and evolution of the disease.”Thorax43(7)516-24.
7.Rubin，D.T.，和S.B.Hanauer. 2000.吸煙和炎性腸病“Smoking and inflammatory bowel disease.”Eur J GastroenterolHepatol 12(8)855-62.
8.Thomas，G.A.，J.Rhodes，J.T.Green，和C.Richardson.2000.吸煙在炎性腸病中的作用對治療的提示“Role of smoking ininflammatory bowel diseaseimplications for therapy.”Postgrad MedJ 76(895)273-9.
9.Guslandi，M.1999.潰瘍性結(jié)腸炎的煙堿治療“Nicotinetreatment for ulcerative colitis.”Br J Clin Pharmacol 48(4)481-4.
10.Guslandi，M.1999.單療程煙堿治療在急性潰瘍性結(jié)腸炎中的長期效果在12個月隨診研究中緩解持續(xù)“Long-term effects of asingle course of nicotine treatment in acute ulcerative colitisremission maintenance in a 12-month follow-up study.”Int JColorectal Dis 14(4-5)261-2.
11.Rezvani，A.H.，和E.D.Levin.2001.煙堿的認知作用“Cognitive effects of nicotine.”Biol Psychiatry 49(3)258-67.
12.Kelton，M.C.，H.J.Kahn，C.L.Conrath，和P.A.Newhouse.2000.煙堿對帕金森病的作用 “The effects of nicotine onParkinson′s disease.”Brain Cogn43(1-3)274-82.
13.Bertram，K.G.1998.基礎(chǔ)和臨床藥理學“Basic and clinicalpharmacology.”Editions Appelton和Lange.Stanford，Connecticut.
14.Sekhon，H.S.，Y.Jia，R.Raab，A.Kuryatov，J.F.Pankow，J.A.Whitsett，J.Lindstrom，和E.R.Spindel.1999.出生前的煙堿在猴中增加了肺alpha7煙堿性受體表達以及改變了胎肺的發(fā)育“Prenatalnicotine increases pulmonary alpha7 nicotinic receptor expression andalters fetal lung development in monkeys.”J Clin Invest103(5)637-47.
15.Maus，A.D.，E.F.Pereira，P.I.Karachunski，R.M.Horton，D.Navaneetham，K.Macklin，W.S.Cortes，E.X.Albuquerque，和B.M.Conti-Fine.1998.人和嚙齒動物支氣管上皮細胞表達功能性的煙堿乙酰膽堿性受體“Human and rodent bronchial epithelial cellsexpress functional nicotinic acetylcholine receptors.”Mol Pharmacol54(5)779-88.
16.Shriver，S.P.，H.A.Bourdeau，C.T.Gubish，D.L.Tirpak，A.L.Davis，J.D.Luketich，和J.M.Siegfried.2000.胃泌素釋放肽受體的性別特異性表達與吸煙史和肺癌危險性的關(guān)系“Sex-specificexpression of gastrin-releasing peptide receptorrelationship tosmoking history and risk of lung cancer.”J Natl Cancer lnst92(1)24-33.
17.Ferguson，D.G.，M.A.Haxhiu，A.J.To，B.Erokwu，和I.A.Dreshaj.2000.孤束核的氣道相關(guān)神經(jīng)元中表達煙堿乙酰膽堿性受體alpha3亞型，但這對于雪貂的反射性支氣管收縮不是必需的?！癟healpha3 subtype of the nicotinic acetylcholine receptor is expressed inairway-related neurons of the nucleus tractus solitarius，but is notessential for reflex bronchoconstriction in ferrets.”Neurosci Lett287(2)141-5.
18.Singh，S.P.，R.Kalra，P.Puttfarcken，A.Kozak，J.Tesfaigzi，和M.L.Sopori.2000.急性和慢性煙堿暴露通過不同的途徑調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)“A cute and chronic nicotine exposures modulate the immunesystem through different pathways.”Toxicol Appl Pharmaco1164(1)65-72.
19.Kalra，R.，S.P.Singh，S.M.Savage，G.L.Finch，和M.L.Sopori.2000.吸煙對免疫應(yīng)答的影響慢性煙草暴露削弱T細胞中抗原介導的信號作用并耗盡IP3敏感性鈣離子儲備“Effects of cigarettesmoke on immune responsechronic exposure to cigarette smokeimpairs antigen-mediated signaling in T cells and depletesIP3-sensitive Ca(2+)stores.”J Pharmacol Exp Ther 293(1)166-71.
20.Sugano，N.，K.Shimada，K.Ito，和S.Mural.1998.煙堿通過調(diào)節(jié)核因子kappaB活化而抑制U937細胞中炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。“Nicotine inhibits the production of inflammatory mediators in U937cells through modulation of nuclear factor-kappaB activation.”Biochem Biophys Res Commun 252(1)25-8.
21.Yates，S.L.，M.Bencherif，E.N.Fluhler，和P.M.Lippiello.1995.大鼠慢性暴露于主流煙草后煙堿乙酰膽堿性受體上調(diào)以及煙堿的alpha4beta2受體“Up-regulation of nicotinic acetylcholine receptorsfollowing chronieexposure of rats to mainstream cigarette smoke oralpha 4 beta 2 receptors to nicotine.”Biochem Pharmacol50(12)2001-8.
22.Sopori，M.L.，和W.Kozak.1998.吸煙的免疫調(diào)節(jié)作用“Immunomodulatory effects of cigarette smoke.”J Neuroimmunol83(1-2)148-56.
23.Lahmouzi，J.，F(xiàn).Simain-Sato，M.P.Defresne，M.C.De Pauw，E.Heinen，T.Grisar，J.J.Legros，和R.Legrand.2000.“體外煙堿對兔牙齦成纖維細胞的作用Effect of nicotine on rat gingival fibroblastsin vitro.”Connect Tissue Res 41(1)69-80.
24.Geng，Y.，S.M.Savage，S.Razanai-Boroujerdi，和M.L.Sopori.1996.煙堿對免疫應(yīng)答的作用.iI.慢性煙堿處理誘導T細胞無反應(yīng)性“Effects of nicotine on the immune response.II.Chronicnicotine treatment induces T cell anergy.”J Immunol 156(7)2384-90.
25.McCrea，K.A.，J.E.Ensor，K.Nail，E.R.Bleecker，和J.D.Hasday.1994.吸煙者肺中改變的細胞因子調(diào)節(jié)“Altered cytokineregulation in the lungs of cigarette smokers.”Am J Respir Crit CareMed 150(3)696-703.
26.Ohta，T.，N.Yamashita，M.Maruyama，E.Sugiyama，和M.Kobayashi.1998.吸煙減少人肺泡巨噬細胞分泌白介素8“Cigarettesmoking decreases interleukin-8 secretion by human alveolarmacrophages.”Respir Med 92(7)922-7.
27.Suzuki，N.，S.Wakisaka，Y.Takeba，S.Mihara，和T.Sakane.1999.吸煙對人淋巴細胞Fas/Fas配體表達的作用“Effects ofcigarette smoking on Fas/Fas ligand expression of humanlvmphocytes.”Cell Immunol 192(.1)48-53.
28.Zia，S.，A.Ndoye，V.T.Nguyen，和S.A.Grando.1997.煙堿增強調(diào)節(jié)鈣離子代謝與調(diào)節(jié)呼吸上皮細胞粘附及運動的alpha3，alpha4，alpha5與alpha7煙堿性受體的表達“Nicotine enhancesexpression of the alpha 3，alpha 4，alpha 5，and alpha 7 nicotinicreceptors modulating Calcium metabolism and regulating adhesionand motility of respiratory epithelial cells.”Res Commun Mol PatholPharmacol 97(3)243-62.
29.Zhang，S.，和T.M.Petro.1996.煙堿對小鼠CD4 T細胞反應(yīng)的作用“The effect of nicotine on murine CD4 T cell responses.Int JImmunopharmacol 18(8-9)467-78.
30.Bugeon，L.，和M.J.Dallman.2000.T細胞的共刺激“Costimulation of T cells.“Am J Respir Crit Care Med 162(4 Pt2)S164-8.
31.Green，J.M.2000.B/7/CD28/CTLA4 T細胞活化途徑，對炎性肺部疾病的提示“The B7/CD28/CTLA4 T-cell activation pathway.Implications for inflammatory lung disease.“Am J Respir Cell MolBiol 22(3)261-4.
32.Lenschow，D.J.，L.Walunas，和J.A.Bluestone.1996.T細胞共刺激的CD28/B7系統(tǒng)“CD28/B7 system of T cell costimulation.”Annu Rev Immunol 14233-58.
33.Walunas，T.L.，和J.A.Bluestone.1998.CTLA-4在體內(nèi)調(diào)節(jié)耐受誘導及T細胞分化“CTLA-4 regulates tolerance induction andT cell differentiation in vivo.”J Immunol 160(8)3855-60.
34.Walunas，T.L.，D.J.Lenschow，C.Y.Bakker，P.S.Linsley，G.J Freeman，J.M.Green，C.B.Thompson，和J.A.Bluestone.1994CTLA-4能作用為T細胞活化的負性調(diào)節(jié)物“CTLA-4 can function asa negative regulator of T cell activation”Immunity 1(5)405-13.
35.IsraeI-Assayag，E.，A.Dakhama，S.Lavigne，M.Laviolette，和Y.Cormier.1999.過敏性肺炎中肺泡巨噬細胞上共刺激分子的表達“Expression of costimulatory molecules on alveolar macrophages inhypersensitivity pneumonitis.”Am J Respir Cdt Care Med159(6)1830-4.
36.IsraeI-Assayag，E.，M.Fournier，和Y.Cormier.1999.CTLA4-Ig對T細胞共刺激的阻斷抑制了小鼠過敏性肺炎中的肺部炎癥“Blockade of T cell costimulation by CTLA4-Ig inhibits lunginflammation in murine hypersensitivity pneumonitis.”J Immunol163(12)6794-9.
37.Larche，M.，S.J.Till，B.M.Haselden，J.North，J.Barkans，C.J.Corrigan，A.B.Kay，和D.S.Robinson.1998.在特應(yīng)性哮喘中通過CD86的共刺激參與氣道抗原呈遞細胞及T細胞對過敏原的反應(yīng)“Costimulation through CD86 is involved in airwayantigen-presenting cell and T cell responses to allergen in atopicasthmatics.”J Immunol 161(11)6375-82.
38.Mathur，M.，K.Herrmann，Y.Qin，F(xiàn).Gulmen，X.Li，R.Krimins，J.Weinstock，D.Elliott，J.A.Bluestone，和P.Padrid.1999.CD28與CD80或CD86的相互作用足以誘導小鼠的過敏性氣道炎癥“CD28 interactions with either CD80 or CD86 are sufficient toinduce allergic airway inflammation in mice.”A m J Respir Cell MolBiol 21(4)498-509.
39.Nicod，L.P.，和P.Isler.1997.結(jié)節(jié)病中肺泡巨噬細胞共表達高水平的CD86(B7.2)、CD40及CD30L“Alveolar macrophages insarcoidosis coexpress high levels of CD86(B7.2)，CD40，and CD30L.”Am J Respir Cell Mol Biol 17(1)91-6.
40.Kesingland，A.C.，C.T.Gentry，M.S.Panesar，M.A.Bowes，J.M.Vernier，R.Cube，K.Walker，和L.Urban.2000.煙堿乙酰膽堿性受體激動劑(+)-地棘蛙素及ABT-594在持續(xù)性炎性和神經(jīng)病性疼痛模型中的止痛特性“A nalgesic profile of the nicotinic acetylcholinereceptor agonists，(+)- epibatidine and ABT-594 in models ofpersistent inflammatory and neuropathic pain.”Pain 86(1-2)113-8.
41.Mellon，R.D.，和B.M.Bayer.1999.嗎啡、煙堿和地棘蛙素對淋巴細胞活性及下丘腦-垂體-腎上腺軸反應(yīng)的作用“The effects ofmorphine，nicotine and epibatidine on lymphocyte activity andhypothalamic-pituitary-adrenal axis responses.”J PharmacolExp Ther 288(2)635-42.
42.Yokotani，K.，M.Wang，S.Okada，Y.Murakami，和M.Hirata.2000.煙堿乙酰膽堿性受體介導的分離的大鼠胃釋放去甲腎上腺素的表征“Characterization of nicotinic acetylcholinereceptor-mediated noradrenaline release from the isolated ratstomach.”Eur J Pharmaco1402(3)223-9.
43.Yost，C.S.，和B.D.Winegar.1997.激動劑和競爭性拮抗劑對成人與胎兒型煙堿乙酰膽堿性受體的效力“Potency of agonists andcompetitive antagonists on adult- and fetal- type nicotinicacetylcholine receptors.”Cell Mol Neurobiol 17(1)35-50.
44.Fecho，K.，K.A.Maslonek，L.A.Dykstra，和D.T.Lysle.1993.交感神經(jīng)系統(tǒng)誘導的免疫狀態(tài)的改變DMPP單獨和聯(lián)合嗎啡的免疫調(diào)節(jié)作用“Alterations of immune status induced bv thesympathetic nervous systemimmunomodulatory effects of DMPPalone and in combination with morphine.”Brain Behav Immun7(3)253-70.
45.Thompson，D.C.，R.J.Altiere，和L.Diamond.1990.煙堿性激動劑對貓的支氣管舒縮緊張性的調(diào)節(jié)“Nicotinic agonistmodulation of feline bronchomotor tone.”Clin Exp PharmacolPhysiol 17(2)83-97.
46.Barnes PJ.2001.COPD治療的未來進展“Future Advancesin COPD Therapy”Respiration 68(5)441-8.
47.Lasky JA和Ortiz，LA.2001.抗纖維化治療用于治療肺纖維化“Antifibrotic therapy for the treatment of pulmonary fibrosis.”Am J Med Sci 322(4)213-21.
48.Baron，J.A.1996.煙堿和吸煙的有益作用真實的，可能的以及假的?！癇eneficial effects of nicotine and cigarette smokingthereal，the possible and the spurious.”Br Med Bull 52(1)58-73.
49.Waldum，H.L.，O.G.Nilsen，T.Nilsen，H.Rorvik，v.Syversen，A.K.Sanvik，O.A.Haugen，S.H.Torp，和E.Brenna.1996.吸入煙堿的長期作用“Long-term effects of inhaled nicotine.”Life Sci58(16)1339-46.
50.Warren，C.P.1977.外源性過敏性肺泡炎一種在非吸煙者中更常見的疾病“Extrinsic allergic alveolitisa disease commoner innon-smokers.”Thorax 32(5)567-9.
51.Cormier，Y.，G.M.Tremblay，M.Fournier，和E.Israel-Assayag.1994.長期病毒強化肺對Saccharopolysporarectivirgula的反應(yīng)“Long-term viral enhancement of lung response toSaccharopolyspora rectivirgula.”Am J Respir Cdt Care Med 149(2Pt1)490-4.
52.Gudmundsson，G.，和G.W.Hunninghake.1997.干擾素-γ對于過敏性肺炎發(fā)生是必要的“Interferon-gamma is necessary for theexpression of hypersensitivity pneumonitis.”J Clin Invest99(10)2386-90.
53.Denis，M.，M.Bedard，M.Laviolette，和Y.Cormier.1993.關(guān)于農(nóng)民肺患者支氣管肺泡灌洗液中單核因子釋放及天然殺傷細胞活性的研究“A study of monokine release and natural killer activityin the bronchoalveolar lavage of subjects with farmer′s lung.”AmRev Respir Dis 147(4)934-9.
54.Wahlstrom，J.，K.Katchar，H.Wigzell，O.Olerup，A.Eklund，和J.Grunewald.2001.對結(jié)節(jié)病中肺部和血液CD4(+)及CD8(+)T細胞中細胞內(nèi)細胞因子的分析“Analysis of intracellular cytokines incd4(+)and cd8(+)lung and blood t cells in sarcoidosis.”Am J RespirCdt Care Med 163(1)115-21.
55.Cohn，L.，C.Herrick，N.Niu，R.Homer，和K.Bottomly.2001.IL-4通過抑制IFN-gamma產(chǎn)生而促進氣道嗜酸性粒細胞增多說明了IFN-gamma在調(diào)節(jié)過敏性氣道炎癥中的新作用“IL-4 promotesairway eosinophilia by suppressing IFN-gamma productiondefininga novel role for IFN-gamma in the regulation of allergic airwayinflammation.”J Immunol 166(4)2760-7.
56.Laliberte R.，Rouabhia M，Bosse M，Chakir J.2001哮喘支氣管成纖維細胞降解膠原的能力減弱“Decreased capacity of asthmaticbronchial fibroblasts to degrade collagen.”Matrix BiolJan；19(8)743-53.
57.Boulet，L.P.，H.Turcotte，M.Laviolette，F(xiàn).Naud，M.C.Bernier，S.Martel，和J.Chakir.2000.新診斷哮喘相對長期輕度哮喘中的氣道過高反應(yīng)性，炎癥及上皮下膠原沉積，吸入皮質(zhì)類固醇的影響“Airway hyperresponsiveness，inflammation，and subepithelialcollagen deposition in recently diagnosed versus long-standing mildasthma.Influence of inhaled corticosteroids.”A m J Respir Crit CareMed 162(4 Pt 1)1308-13.
58.Dempsey，O.J.2000.白三烯受體拮抗劑治療“Leukotrienereceptor antagonist therapy.”Postgrad Med J 76(902)767-73.
59.Busse，W.W.1998.白三烯與炎癥“Leukotrienes andinflammation.”Am J Respir Crit Care Med 157(6 Pt 2)S210-3；discussion S247-8.
60.Zisman，D.A.，.J.P.Lynch，G.B.Toews，E.A.Kazerooni，A.Flint，和F.J.Martinez.2000.環(huán)磷酰胺治療特發(fā)性肺纖維化在對皮質(zhì)類固醇無反應(yīng)患者中的前瞻性研究“Cyclophosphamide in thetreatment of idiopathic pulmonary fibrosisa prospective study inpatients who failed to respond to corticosteroids.”Chest117(6)1619-26.
61.Redington，A.E.2000.纖維化和氣道重建“Fibrosis andairway remodelling.”Clin Exp Allergy 30 Suppl142-5.
62.Frew，A.J.，和Plummeridge MJ.2001.哮喘的可選擇藥物“Alternative agents in asthma.”J Allergy Clin Immunol 108(1)3-10.
權(quán)利要求
1.減輕或預防動物炎癥的方法，包括向所述動物施用結(jié)合并調(diào)節(jié)煙堿性受體功能的藥劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的藥劑引起煙堿性受體功能的上調(diào)。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的炎癥是肺部炎性疾病的結(jié)果。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的肺部炎性疾病選自如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺間質(zhì)纖維化(IPF)、結(jié)節(jié)病、過敏性肺炎(HP)、慢性HP以及閉塞性細支氣管炎伴機化性肺炎(BOOP)。
5.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述的藥劑是二甲基苯基哌嗪鎓(DMPP)。
6.結(jié)合并調(diào)節(jié)煙堿性受體功能的藥劑用于制備減輕或預防動物炎性疾病的藥物的用途。
7.權(quán)利要求6的用途，其中所述的炎性疾病是肺部炎性疾病。
8.權(quán)利要求6或7的用途，進一步包括其他能夠減輕或預防炎性疾病的藥劑。
9.權(quán)利要求6到8中任何一項的用途，其中所述藥物是口服、舌下、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、吸入或鼻用的形式。
10.權(quán)利要求7的用途，其中所述的肺部炎性疾病選自如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺間質(zhì)纖維化(IPF)、結(jié)節(jié)病、過敏性肺炎(HP)、慢性HP以及閉塞性細支氣管炎伴機化性肺炎(BOOP)。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述疾病是哮喘。
12.權(quán)利要求11的用途，其中所述藥劑通過靶向于參與與哮喘相關(guān)的炎癥、支氣管高反應(yīng)或支氣管(纖維化)重建的煙堿性受體而減輕或預防哮喘。
13.權(quán)利要求6到12中任何一項的用途，其中所述藥劑是二甲基苯基哌嗪鎓(DMPP)。
全文摘要
本發(fā)明涉及煙堿性受體激動劑用于治療炎性疾病，包括多種肺部疾病的用途。這些激動劑比其他的抗炎藥物如類固醇有著更少的副作用。另外，這些激動劑能單獨或與其他抗炎藥物聯(lián)合使用以減輕肺病。
文檔編號A61P11/06GK1498108SQ02807138
公開日2004年5月19日 申請日期2002年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月23日
發(fā)明者Y·科爾米耶, E·伊斯雷爾-阿薩亞格, M-R·布朗謝, Y 科爾米耶, 估錐 阿薩亞格, 祭市 申請人:拉瓦爾大學