專利名稱:卡洛孢苷衍生物、其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及新的活性物質(zhì)(卡洛孢苷衍生物),其是在微生物Gloeoporus dichrous Bres.ST001714,DSM 13784發(fā)酵時(shí)形成的,還涉及它們的制備方法、它們作為藥物的應(yīng)用、含有卡洛孢苷衍生物的藥物和微生物Gloeoporus dichrous Bres.ST 001714,DSM 13784。
1994年卡洛孢苷首次被描述為磷脂酶C的抑制劑(W.Weber等,J.Antibiotics,47,1188-1194)。同年,分離出了兩個(gè)其他類似的次級(jí)代謝物(R.Shan等,Nat.Prod,Lett.,4,171-178)。式I(下面)所示本發(fā)明化合物和其中所描述的物質(zhì)在結(jié)構(gòu)上不同。
癌癥是人和動(dòng)物的疾病,它通常是致命的,是由機(jī)體本身細(xì)胞的失控生長(zhǎng)引起的。癌癥是給予瘤(腫瘤或癌)惡性生長(zhǎng)的形成或者白細(xì)胞惡性退化和成熟障礙(白血病)的名字。通過(guò)機(jī)體本身細(xì)胞的轉(zhuǎn)化而形成癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。癌細(xì)胞的惡性通過(guò)生長(zhǎng)的自主性顯示出來(lái),也就是說(shuō)它能不受抑制的、浸潤(rùn)性的生長(zhǎng)而不會(huì)適應(yīng)器官的結(jié)構(gòu)安排并破壞組織。惡性的一個(gè)確切的標(biāo)志是在腫瘤細(xì)胞隨血液或淋巴液傳播后,在遠(yuǎn)離腫瘤的地方形成轉(zhuǎn)移。癌癥是人類最普遍的死因之一,因此非常需要治愈或治療惡性退化的方法和手段。
惡性腫瘤的可能療法除了手術(shù)切除腫瘤外,可能的根本方法還有用X射線、α、β、γ射線進(jìn)行照射的放射性治療,免疫治療和化學(xué)治療。免疫治療在現(xiàn)今應(yīng)用程度有限。腫瘤的化學(xué)治療意味著施用細(xì)胞毒(細(xì)胞抑制劑)治療腫瘤和局部手術(shù)治療或放射治療后的殘余腫瘤細(xì)胞。這些物質(zhì)特異性干涉細(xì)胞分裂的特定過(guò)程,從而有高比例的正在分裂的細(xì)胞的組織(如快速生長(zhǎng)的腫瘤組織)反應(yīng)更加敏感。所使用的有烷基化化合物,例如環(huán)磷酰胺(The Merk Index,12thEd.page 463),代謝拮抗劑如氨甲蝶呤(TheMerk Index,12thEd.page 1025),生物堿如長(zhǎng)春新堿(The Merk Index,12thEd.page 1704)和抗生素如道諾霉素(The Merk Index,12thEd.page479)和阿霉素(The Merk Index,12thEd.page 581-582)。然而,由于多方面的副作用,所有這些藥物都有很多的缺點(diǎn)以致病人的死亡只能延遲而不能避免。此外,在退化(癌)細(xì)胞中出現(xiàn)了抗藥性。這樣現(xiàn)在的藥物不再有細(xì)胞抑制作用,但因?yàn)楦弊饔枚哂卸拘?。而且,組合或依次使用細(xì)胞抑制劑超過(guò)單個(gè)細(xì)胞抑制劑(單療)的療效,這一事實(shí)已經(jīng)顯現(xiàn)出來(lái),這樣多化學(xué)療法有可能不會(huì)增加很大的副作用。由于所有這些原因,很需要并在世界范圍內(nèi)尋找新的化療藥物。
細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶(=CDK)在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中起著中心的角色。它們催化磷酸化反應(yīng)從而啟動(dòng)反應(yīng)的級(jí)聯(lián),引起細(xì)胞周期中G1期(生長(zhǎng)期1)向S期(合成期)的過(guò)渡。細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶因此代表治療癌癥和其他細(xì)胞增殖病理障礙的疾病的好的治療目標(biāo)。調(diào)節(jié)細(xì)胞周期并防止細(xì)胞失控分裂的低分子量的抑制劑將是對(duì)治療癌癥病人有用的藥物。
申請(qǐng)人令人驚訝地發(fā)現(xiàn),在微生物菌株Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST001714,DSM 13784能夠高效生產(chǎn)在極低濃度時(shí)抑制細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶的新的細(xì)胞抑制劑。
因此,本發(fā)明涉及菌株Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST001714,DSM 13784產(chǎn)生的活性物質(zhì)(卡洛孢苷衍生物)及其生理上可耐受的鹽、酯和明顯的化學(xué)等價(jià)物。
這樣本發(fā)明涉及式I所示化合物及其生理上可耐受的鹽
其中R1、R2和R3是互相獨(dú)立的,是H或有2-10個(gè)碳原子、優(yōu)選2到6個(gè)原子、特別優(yōu)選2個(gè)原子的?;?;且R4為H或-C(O)(CH2)nCOOH,其中n為1到7,優(yōu)選1到3,特別優(yōu)選1或2;但R1、R2、R3和R4不同時(shí)全是H。
式I所示化合物的酰基可以是直鏈或有分支的,飽和的或單不飽和的或二不飽和的。
有2個(gè)碳原子的?;侵咐缫阴;?。
飽和的、無(wú)分支的酰基的例子有乙酸殘基(C=2)、丙酸殘基(C=3)、丁酸殘基(C=4)、戊酸殘基(C=5)、己酸殘基(C=6)、庚酸殘基(C=7)、辛酸殘基(C=8)、壬酸殘基(C=9)、癸酸殘基(C=10)。
單不飽和的無(wú)分支的?;睦佑斜┧釟埢?C=3)、丁烯酸殘基(C=4)或乙烯基乙酸殘基(C=4)。
二不飽和的無(wú)分支的?;睦邮巧嚼嫠釟埢?C=6)。
卡洛孢苷是活性很弱的抗生素,由一個(gè)水楊酸和一個(gè)二糖組成。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)單位由一個(gè)烷基鏈連接。式I所示化合物中的糖基元可以是二糖,其在每種情況下由D-吡喃糖型的己醛糖(例如D-吡喃葡萄糖或D-吡喃半乳糖)和己醛糖的糖酸(onic acid)(例如葡萄糖酸)組成。糖基元優(yōu)選為D-吡喃甘露糖基-D-甘露糖酸,其不被或被上面定義的R2、R3和/或R4所代替。
本發(fā)明還涉及
a)式I所示化合物(其中R1=乙?;?;R2=R3=R4=H(=卡洛孢苷B分子式C38H62O16,MW 774.9))和其生理上可耐受的鹽;b)式I所示化合物(其中R1=R3=乙?;籖2=H;R4=丙二?;?=卡洛孢苷C分子式C43H66O20,MW 902.99))和其生理上可耐受的鹽;c)式I所示化合物(其中R1=R2=H;R3=乙?;籖4=丙二?;?=卡洛孢苷D分子式C41H64O19,MW 806.96))和其生理上可耐受的鹽;d)式I所示化合物(其中R1=R3=H;R2=乙?;籖4=丙二?;?=卡洛孢苷E分子式C41H64O19,MW 806.96))和其生理上可耐受的鹽;e)式I所示化合物(其中R1=R2=R4=H;R3=乙?;?;(=卡洛孢苷F分子式C38H62O16,MW 774.9))和其生理上可耐受的鹽。
除非另外說(shuō)明,式I所示化合物手性中心可是R或S構(gòu)型。本發(fā)明涉及旋光純的化合物,還涉及立體異構(gòu)體混合物,如對(duì)映異構(gòu)體的混合物和非對(duì)映異構(gòu)體混合物。
根據(jù)本發(fā)明,可通過(guò)在合適的條件下于培養(yǎng)基中發(fā)酵Gloeoporusdichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714,DSM 13784或者其變種或突變株,直到在培養(yǎng)基中積累式I所示的一種或多種卡洛孢苷衍生物,由此得到式I所示化合物。通過(guò)隨后將化合物分離,并在適當(dāng)時(shí)轉(zhuǎn)化成化學(xué)等價(jià)物和其生理上可耐受的鹽得到卡洛孢苷衍生物。
因此,本發(fā)明還涉及制備式I所示化合物的方法,該方法包含在合適的條件下于培養(yǎng)基中發(fā)酵微生物Gloeoporus dichrous(Fr..Fr.)Bres.ST 001714,DSM 13784或者其一種變種或突變株,直到在培養(yǎng)基中積累一種或多種目標(biāo)化合物,隨后將該化合物從培養(yǎng)基中分離,并在適當(dāng)時(shí)轉(zhuǎn)化成化學(xué)等價(jià)物和/或其生理上可耐受的鹽。
菌株ST 001714,DSM 13784,其突變株和/或變種優(yōu)選在有碳源和氮源以及常用無(wú)機(jī)鹽的營(yíng)養(yǎng)溶液或固體培養(yǎng)基(也稱作培養(yǎng)基)中發(fā)酵,直到在培養(yǎng)基中積累本發(fā)明化合物,然后從培養(yǎng)基中分離這些化合物,并在適當(dāng)時(shí)分成單獨(dú)的活性組分。
本發(fā)明的方法可用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模(毫升到升的范圍)和工業(yè)規(guī)模(立方米的范圍)的發(fā)酵。
菌株Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714生長(zhǎng)在預(yù)培養(yǎng)基中。根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定,于1999年12月14日將分離株保藏在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1B,3300 Brunswick,Germany),保藏號(hào)DSM13784。
Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714,DSM 13784有白色的菌絲體和紫色的孢子。它優(yōu)先在樺木屬中發(fā)生,但也可感染其他宿主,例如榿木屬、柳屬、楊屬、榆屬、李屬。
也可用能合成一種或多種本發(fā)明化合物的菌株Gloeoporusdichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714,DSM 13784的突變株和變種將其代替。這樣的突變株可用本身已知的方法通過(guò)物理手段例如放射(如用紫外線或X射線)或化學(xué)突變劑如甲磺酸乙酯(EMS)、2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮(MOB)或N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)產(chǎn)生。
篩選合成本發(fā)明一種或多種化合物的突變株和變種根據(jù)下面的方案進(jìn)行-將平板培養(yǎng)物凍干;-用有機(jī)溶劑提取凍干物;-用固相從培養(yǎng)濾液中提取該化合物;和-通過(guò)HPLC、TLC或分析生物活性進(jìn)行分析。
下面描述的發(fā)酵條件應(yīng)用于Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST001714,已保藏的分離株DSM 13784和其突變株與變種。
在含有碳源和氮源以及通常的無(wú)機(jī)鹽的營(yíng)養(yǎng)溶液中,Gloeoporusdichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714,DSM 13784產(chǎn)生卡洛孢苷衍生物。
合適的且優(yōu)選的發(fā)酵碳源為可同化的糖類和糖醇如葡萄糖、乳糖、蔗糖或D-甘露醇以及含糖的天然產(chǎn)物,例如麥芽膏。合適的含氮營(yíng)養(yǎng)物為氨基酸、肽和蛋白質(zhì)以及它們的降解產(chǎn)物如酪蛋白、蛋白胨或胰蛋白胨,還有肉膏、酵母抽提物,碾磨過(guò)的種子如谷物、小麥、豆、大豆或棉樹(shù)的種子,酒渣、肉粉或酵母抽提物,但還有銨鹽和硝酸鹽,但特別還有合成的或生物合成的肽。營(yíng)養(yǎng)溶液可能含有的無(wú)機(jī)鹽為例如,堿金屬或堿土金屬、鐵、鋅、鈷和錳的氯化物、碳酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽。
在營(yíng)養(yǎng)溶液中本發(fā)明化合物產(chǎn)生的特別好,該營(yíng)養(yǎng)溶液含有約0.05%到5%、優(yōu)選1%到2%的麥芽膏,0.05%到3%、優(yōu)選0.05%到1%的酵母抽提物和0.2%到5%,優(yōu)選0.5%到2%的葡萄糖,0.5%到3%、優(yōu)選0.5%到3%的纖維素粉和微量硫酸銨。每種情況的百分?jǐn)?shù)基于整個(gè)營(yíng)養(yǎng)溶液的重量。
在該營(yíng)養(yǎng)溶液中,Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714,DSM 13784產(chǎn)生卡洛孢苷衍生物的混合物。本發(fā)明一種或多種卡洛孢苷衍生物的量可能依賴營(yíng)養(yǎng)溶液的組成而變化。此外,可能通過(guò)改變培養(yǎng)基的組成控制各種卡洛孢苷衍生物的合成,以致某種卡洛孢苷衍生物根本不產(chǎn)生或者由微生物產(chǎn)生的量在檢測(cè)到的極限以下。
該微生物進(jìn)行需氧培養(yǎng),就是說(shuō),例如在搖瓶或發(fā)酵罐中搖動(dòng)或攪動(dòng)浸沒(méi)培養(yǎng),適當(dāng)時(shí)通入空氣或氧氣或者在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。發(fā)酵可在溫度范圍為約18到35℃、優(yōu)選約20到30℃、特別是在25到30℃進(jìn)行。pH范圍應(yīng)該在5到8之間,優(yōu)選5.5和6.5之間。該微生物一般在這些條件下培養(yǎng)24到720小時(shí),優(yōu)選288到576小時(shí)。
培養(yǎng)有利的是分為多個(gè)階段進(jìn)行,即首先在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)預(yù)培養(yǎng)物,然后轉(zhuǎn)移到實(shí)際的生產(chǎn)培養(yǎng)基,例如體積比為1∶10主培養(yǎng)基中。例如通過(guò)將菌絲體轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)溶液并讓其生長(zhǎng)約36到120小時(shí),優(yōu)選48到72小時(shí)得到預(yù)培養(yǎng)物。菌絲體可通過(guò)例如將菌株在固體或液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基如麥芽/酵母瓊脂或土豆/右旋糖瓊脂中生長(zhǎng)約3到40天,優(yōu)選10到30天得到。
可基于培養(yǎng)液的pH或菌絲體的體積和層析方法如高效液相層析(HPLC)或特定生物活力監(jiān)視發(fā)酵的進(jìn)展。
下面描述的分離方法用于純化本發(fā)明的卡洛孢苷衍生物。
考慮到天然物質(zhì)的化學(xué)、物理和生物特性,用已知的方法從培養(yǎng)液中分離或純化本發(fā)明的卡洛孢苷衍生物。HPLC可用于分析培養(yǎng)液中或各個(gè)分離階段的各種卡洛孢苷衍生物的濃度,用校準(zhǔn)液方便地比較所產(chǎn)生物質(zhì)的量。
為了分離本發(fā)明化合物,將培養(yǎng)液或連帶固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)物凍干,然后用可選地能與水混合的有機(jī)溶劑將卡洛孢苷衍生物從凍干物中提取出來(lái)。有機(jī)溶劑相含有本發(fā)明的天然物質(zhì),適當(dāng)時(shí)將其真空濃縮并進(jìn)一步純化。
本發(fā)明的一種或多種化合物的進(jìn)一步純化通過(guò)在合適的物質(zhì)上層析進(jìn)行,例如優(yōu)選在分子篩、硅膠、氧化鋁上,在離子交換劑或吸附樹(shù)脂或在反相(反相,RP)上進(jìn)行??彐哕昭苌锿ㄟ^(guò)該層析分離??彐哕昭苌锏膶游鲇镁彌_水溶液或水和有機(jī)溶液的混合液進(jìn)行。
水或有機(jī)溶液的混合液指所有水混溶的有機(jī)溶劑,優(yōu)選甲醇、丙醇和乙腈,在濃度為5到80%、優(yōu)選20到50%的溶劑中,或者所有緩沖的和有機(jī)溶劑混溶的水溶液。所要用的緩沖液和上面所說(shuō)的相同。
卡洛孢苷衍生物的分離是基于它們極性的不同時(shí)用反相層析進(jìn)行,例如在MCI(來(lái)自Mitsubishi,Japan的吸附樹(shù)脂)或Amberlite XAD(TOSOHAAS)上,在其他疏水物質(zhì)如RP-8或RP-18相上進(jìn)行。還可用正相層析如在硅膠、氧化鋁等上進(jìn)行分離。
卡洛孢苷衍生物的層析用緩沖的或酸化的水溶液或水溶液與乙醇或其他與水混溶的有機(jī)溶劑的混合液進(jìn)行。丙醇和乙腈優(yōu)選用作有機(jī)溶劑。
緩沖的或酸化的水溶液指,例如水、磷酸鹽緩沖液,乙酸銨溶液、檸檬酸鹽緩沖液,濃度為0到0.5M,以及甲酸、乙酸、三氟乙酸或技術(shù)人員所知的所有商業(yè)上可得到的酸,優(yōu)選濃度為0到1%。對(duì)于緩沖水溶液,優(yōu)選0.1%的乙酸銨。
層析以梯度進(jìn)行,該梯度起始為100%的水,最終為100%的溶劑,優(yōu)選用20%到100%的丙酸或乙腈的線性梯度進(jìn)行。
一個(gè)備選的方案是進(jìn)行凝膠層析或疏水層析。
凝膠層析在聚丙烯酰胺或共聚物膠,如Biogel-P 2(Biorad)或Fractogel TSK HW 40(Merck,Germany或Toso Haas,USA)上進(jìn)行。
上述層析的順序可以顛倒。
本發(fā)明化合物在固態(tài)和pH范圍在3到8、優(yōu)選5到7之間的溶液中穩(wěn)定,這樣其可并入常規(guī)藥物制劑中。
由于它們寶貴的藥理學(xué)性質(zhì),本發(fā)明化合物的一種或多種化合物適合用在人或獸藥作為藥物。
這樣本發(fā)明涉及式I所示化合物或其生理上可耐受的鹽的應(yīng)用,用于生產(chǎn)治療癌癥的細(xì)胞抑制劑。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明式I所示化合物的所有明顯的化學(xué)等價(jià)物。這些等價(jià)物為顯示出輕微的化學(xué)上不同的化合物,也就是說(shuō),有相同的功效或在溫和條件下能轉(zhuǎn)化成本發(fā)明化合物的化合物。上述等價(jià)物還包括,例如本發(fā)明化合物的鹽、還原產(chǎn)物、酯、醚、縮醛或酰胺,以及技術(shù)人員用標(biāo)準(zhǔn)方法可制備的等價(jià)物,還包括所有旋光對(duì)映體、非對(duì)映體和所有立體異構(gòu)的形式。
式I所示化合物的生理上可耐受的鹽指其有機(jī)和無(wú)機(jī)鹽,在Remington’s Pharmaceutical Sciences(17thedition,1418頁(yè)(1985))中有描述。由于物理和化學(xué)穩(wěn)定性和可溶性,優(yōu)選酸性基團(tuán)的鈉、鉀、鈣和銨鹽;優(yōu)選堿性基團(tuán)的鹽酸、硫酸、磷酸或羧酸或磺酸如乙酸、檸檬酸、苯甲酸、馬來(lái)酸、延胡索酸、酒石酸和p-甲苯磺酸的鹽。
酯、醚和縮醛可通過(guò)文獻(xiàn)例如在Advanced Organic Synthesis,4thEdition,J.March,John Wiley & Sons,1992或Protective Groups inOrganic Synthesis 3rdEdition,T.W.Greene & P.G.M.Wuts,John Wiley& Sons,1999中描述的方法制備。
羧基可用例如LiAlH4還原成醇。
最初可通過(guò)堿水解除去式I所示化合物的苷部分(W.Weber等,J.Antibiotics,47,1188-1194)。然后可通過(guò)糖基化作用引入任何想要的糖殘基(例如Knigs-Knorr反應(yīng))。相應(yīng)方法在文獻(xiàn)例如在CarbohydrateChemistry,J.F.Kennedy,Oxford University Press,1988中有描述。
卡洛孢苷衍生物作用的機(jī)理還不知道,但可檢測(cè)到它們的重要的效應(yīng)。
通過(guò)一種試驗(yàn)檢測(cè)到CDK的抑制劑,在該試驗(yàn)中,測(cè)定了細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶對(duì)特異性肽底物的磷酸化速度。細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶通過(guò)結(jié)合特定細(xì)胞周期蛋白而被激活。[γ-P]-磷酸鹽被該酶從[γ-P]-ATP轉(zhuǎn)移到肽底物。該試驗(yàn)在96孔微量滴定板中進(jìn)行測(cè)定了轉(zhuǎn)移到底物的[γ-P]-磷酸鹽的放射性。
卡洛孢苷衍生物的IC50值見(jiàn)表1所示;它是使50%的CDK-4失活的濃度。
本發(fā)明還涉及含有至少一種本發(fā)明化合物的藥物。
本發(fā)明卡洛孢苷衍生物的一種或多種化合物原則上可不用稀釋而直接給藥。優(yōu)選的應(yīng)用是和合適的賦形劑或載體物質(zhì)混合??捎玫妮d體物質(zhì)是藥理學(xué)上合適的且藥物中常用的載體物質(zhì)和/或賦形劑。
本發(fā)明藥物一般口服或胃腸外給藥,但原則上也可直腸給藥。合適的固體或液體藥物制劑為,例如顆粒劑、散劑、(包衣的)片劑、(微)膠囊、栓劑、糖漿、乳劑、混懸劑、氣溶膠、滴劑或安瓿注射液的形式以及緩釋活性物質(zhì)的產(chǎn)品,在其生產(chǎn)過(guò)程中使用通常的載體和添加劑和/或助劑例如崩解劑或粘合劑、包衣劑、溶脹劑、助流劑或潤(rùn)滑劑、調(diào)味劑、增甜劑或加溶劑??赡芴岬降某S玫妮d體或賦形劑為,例如碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露醇和其他糖,滑石粉、乳蛋白、明膠、淀粉、維生素、纖維素及其衍生物、動(dòng)植物油、聚乙二醇和溶劑,例如無(wú)菌水、醇、甘油和多元醇。
口服劑量單位可適時(shí)微膠囊化以便延遲釋放或延長(zhǎng)至更長(zhǎng)的時(shí)期,例如通過(guò)將活性物質(zhì)顆粒包衣或嵌入合適的聚合物、蠟等中。
該藥物產(chǎn)品優(yōu)選以劑量單位生產(chǎn)并給藥,每劑量單位含有特定劑量的本發(fā)明卡洛孢苷衍生物的一種或多種化合物作為其活性成分。對(duì)于固體劑量單位如片劑、膠囊和栓劑,該日劑量可最多約500mg,但優(yōu)選約0.1到200mg,對(duì)于安瓿注射液的形式,每天最多約200mg,但優(yōu)選約0.5到100mg。
所要施用的日劑量取決于哺乳動(dòng)物的體重、年齡、性別和身體狀況。然而,在某種情況下,高一點(diǎn)或低一點(diǎn)的日劑量也是合適的。日劑量的施用可通過(guò)單個(gè)劑量單位或多個(gè)小劑量單位一次性給藥,也可在特定間隔后將分開(kāi)的劑量多次給藥。
本發(fā)明的藥物通過(guò)用常用載體,合適時(shí),添加劑和/或賦形劑將一種或多種本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化成合適的劑型生產(chǎn)。
本發(fā)明用下面的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明。百分?jǐn)?shù)值基于重量。除非另外指出,液體的混合比基于體積。
實(shí)施例實(shí)施例1制備Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714,DSM13784的甘油培養(yǎng)物置于300ml無(wú)菌錐形瓶中的100ml營(yíng)養(yǎng)溶液(麥芽膏2.0%,酵母抽提物0.2%,葡萄糖1.0%,(NH4)2HPO40.05%,pH6.0)在25℃、140rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上與菌株Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST001714,DSM13784孵育一起7天。取該培養(yǎng)物1.5ml,然后用2.5ml 80%甘油稀釋并保存在-135℃。
實(shí)施例2在裝有Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714,DSM13784的錐形瓶中制備預(yù)培養(yǎng)物置于100ml無(wú)菌錐形瓶中的30ml營(yíng)養(yǎng)溶液(麥芽膏2.0%,酵母抽提物0.2%,葡萄糖1.0%,(NH4)2HPO40.05%,pH 6.0)在25℃、140rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上與菌株Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714,DSM 13784一起孵育4天。然后,2ml該預(yù)培養(yǎng)物用于接種平板以制備主要培養(yǎng)物。
實(shí)施例3在固體培養(yǎng)平板上制備Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714,DSM 13784的主要培養(yǎng)物將無(wú)菌25×25cm平板(得自Nunc)中倒入200ml下面的營(yíng)養(yǎng)溶液20g/l麥芽膏、2g/l酵母提取物、10g/l葡萄糖和0.5g/l(NH4)2HPO4,pH6.0。這些平板每個(gè)接種2ml預(yù)培養(yǎng)物。約480J時(shí)后達(dá)到本發(fā)明一種或多種化合物的最大產(chǎn)量。
實(shí)施例4生產(chǎn)卡洛孢苷衍生物準(zhǔn)備50個(gè)25×25cm的平板并接種預(yù)培養(yǎng)物營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基20g/l麥芽膏2g/l酵母提取物10g/l葡萄糖0.5g/l(NH4)2HPO4pH6(滅菌前)孵育時(shí)間480小時(shí)孵育溫度25℃實(shí)施例5從Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714,DSM13784的平板培養(yǎng)物中分離卡洛孢苷混合物完成Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714,DSM 13784的發(fā)酵后,將按照實(shí)施例3所得的平板培養(yǎng)物凍干,凍干物用5升甲醇提取。將含有活性物質(zhì)的甲醇溶液過(guò)濾除去殘?jiān)⒄婵諠饪s。濃縮物用水稀釋后加樣到事先準(zhǔn)備的1.0升MCI GEL,CHP20P柱。用從水到100%乙腈梯度洗脫。將柱流出液(25ml/min)分部收集(每部分25ml),并將含有卡洛孢苷衍生物的部分(從40%乙腈到100%乙腈洗脫部分)合并。真空濃縮并凍干得到8.5g黃褐色粉末。
實(shí)施例6用RP18層析初步分離卡洛孢苷衍生物將0.5g實(shí)施例4所得產(chǎn)物加樣到Nucleosil100-7 C18 HD柱(柱體40mm×250mm)。用20%乙腈(+水及0.1%乙酸銨)到100%乙腈梯度洗脫,流速為35ml/min。分部(35ml)收集柱流出液??彐哕昭苌镏饕诘?9到第68部分。將它們合并,真空除去溶劑并凍干。這樣得到卡洛孢苷B(22.4mg)和F(10.5mg)的純度已經(jīng)大于95%。所得卡洛孢苷C(第41部分;43.4mg)、D(第43-45部分;76.2mg)和E(第43-45部分;76.2mg)純度約70%,因此用層析進(jìn)一步純化。
實(shí)施例7純化卡洛孢苷C、D和E將20mg實(shí)施例5中分離濃縮的卡洛孢苷C加樣到LUNA5μC18(2)柱(柱體10mm×250mm)并用溶于0.1%乙酸銨/水的25到35%的乙腈梯度層析。洗脫液流速為6.5ml/min,每部分為6.5ml??彐哕誄在第35到42部分中。將上述部分凍干得到純度大于95%的卡洛孢苷C(7.5mg)。
將25mg實(shí)施例5所得的卡洛孢苷D和卡洛孢苷E的混合物加樣到LUNA5μC18(2)柱(柱體10mm×250mm)并用溶于0.1%乙酸銨/水的30到40%的乙腈梯度層析。洗脫液流速為6.5ml/min,每部分為6.5ml??彐哕誅在第18和19部分中,卡洛孢苷E在第20到21部分中。將上述部分凍干得到純度大于95%的卡洛孢苷D(7.0mg)和卡洛孢苷E(6.0mg)。
本發(fā)明物質(zhì)的理化和光譜性質(zhì)概述于下
卡洛孢苷B分子式C38H62O16分子量774.9UV最大208、244、3101H-和13C-NMR見(jiàn)表2高分辨FAB質(zhì)譜表明在m/z 775.4120Da處有強(qiáng)MH+信號(hào),和計(jì)算得到的質(zhì)量(對(duì)C38H63O16,單種同位素)775.4116Da很好的吻合。
卡洛孢苷C分子式C43H66O20分子量902.99UV最大208,244,3101H-和13C-NMR見(jiàn)表3高分辨FAB質(zhì)譜表明在m/z 903.4264Da處有強(qiáng)M+H+信號(hào),和計(jì)算得到的質(zhì)量(對(duì)C36H71O25,單種同位素)903.4284Da很好的吻合。
卡洛孢苷D分子式C41H64O19分子量860.96UV最大208、244、3101H-和13C-NMR見(jiàn)表4高分辨FAB質(zhì)譜表明在m/z 883.3942Da處有強(qiáng)M+Na+信號(hào),和計(jì)算得到的質(zhì)量(對(duì)C41H64O19Na,單種同位素)883.3939Da很好的吻合。
卡洛孢苷E分子式C41H64O19分子量860.96UV最大208、244、3101H-和13C-NMR見(jiàn)表4高分辨FAB質(zhì)譜表明在m/z 833.3942Da處有強(qiáng)M+Na+信號(hào),和計(jì)算得到的質(zhì)量(對(duì)C41H64O19Na,單種同位素)883.3939Da很好的吻合。
卡洛孢苷F分子式C38H62O16分子量774.9UV最大208、244、3101H-和13C-NMR見(jiàn)表5高分辨FAB質(zhì)譜表明在m/z 775.4128Da處有強(qiáng)M+H+信號(hào),和計(jì)算得到的質(zhì)量(對(duì)C38H63O16,單種同位素)775.4116Da很好的吻合。
表2在甲醇-d4和DMSO-d6中于300K測(cè)定卡洛孢苷B的1H和13C化學(xué)位移
a)在MeOD或DMSO(聚集)中沒(méi)有觀察到這些質(zhì)子/碳原子的信號(hào)。
表3在甲醇-d4中于300K測(cè)定卡洛孢苷C的1H和13C化學(xué)位移
a)沒(méi)有觀察到這些原子核的信號(hào)(信號(hào)變的很寬)。
b)信號(hào)變寬c)8’位的質(zhì)子信號(hào)僅在新鮮制備的溶液中觀察到(與氘快速互換)。
表4在甲醇-d4中于300K測(cè)定卡洛孢苷D和E的1H和13C化學(xué)位移
a)這些信號(hào)不能清楚的匹配。
表5在甲醇-d4中于300K測(cè)定卡洛孢苷F的1H和13C化學(xué)位移
實(shí)施例8CDK-4抑制劑的生物分析為了確定IC50,所制備的本發(fā)明天然物質(zhì)的儲(chǔ)備液濃度為10mM。將384孔閃光板在室溫用50μl(50μg/孔)生物素標(biāo)記的肽底物包被2小時(shí)后用PBS緩沖液洗滌3次。反應(yīng)時(shí),將30μl用緩沖液稀釋的卡洛孢苷衍生物和20μl事先混合的ATP/細(xì)胞周期蛋白D1/CDK4溶液(終濃度1μCi33P-γ-ATP,2μM ATP和1μg酶混合物)吸移到板上。37℃反應(yīng)2小時(shí)后,將板每次用80μl3%的磷酸洗滌3次,然后用MicroBeta計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)30秒。用數(shù)學(xué)方程式確定抑制百分比。為了確定IC50值,分析10個(gè)濃度的新鮮稀釋的本發(fā)明物質(zhì)的DMSO溶液。
國(guó)際保藏證明相關(guān)部分的中文譯文安萬(wàn)特醫(yī)藥德國(guó)有限公司65926法蘭克福1.微生物特征保藏人賦予的特征參考號(hào)ST 001714國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)賦予的保藏號(hào)DSM 137842.科學(xué)描述和/或分類名稱給出的分類名稱3.收到日本國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)于2000年10月13日收到上述1中的微生物。
4.略。
5.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)名稱德意志微生物保藏中心
權(quán)利要求
1.式I所示化合物及其生理上可耐受的鹽 其中R1、R2和R3是互相獨(dú)立的,為H或有1-10個(gè)碳原子的?;?;R4為H或-C(O)(CH2)nCOOH,其中n為1到7;但R1、R2、R3和R4不同時(shí)全是H。
2.權(quán)利要求1中所要求的式I所示化合物及其生理上可耐受的鹽,其中R1、R2和R3是互相獨(dú)立的,為H或乙酰基;且R4為H或丙二酰基(n=1)。
3.權(quán)利要求1或2中所要求的式I所示化合物及其生理上可耐受的鹽,其中R1為乙?;?;且R2、R3和R4為H。
4.權(quán)利要求1或2中所要求的式I所示化合物及其生理上可耐受的鹽,其中R1和R3為乙?;籖2為H;且R4為丙二?;?br>
5.權(quán)利要求1或2中所要求的式I所示化合物及其生理上可耐受的鹽,其中R1和R2為H;R3為乙酰基;且R4為丙二酰基。
6.權(quán)利要求1或2中所要求的式I所示化合物及其生理上可耐受的鹽,其中R1和R3為H;R2為乙?;磺襌4為丙二?;?br>
7.權(quán)利要求1或2中所要求的式I所示化合物及其生理上可耐受的鹽,其中R1、R2和R4為H;且R3為乙?;?。
8.權(quán)利要求1-7中之一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的式I所示化合物或其生理上可耐受的鹽,其可通過(guò)微生物Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST001714,DSM 13784或其變種或突變株之一在合適的條件下發(fā)酵、分離一種或多種卡洛孢苷衍生物并在適當(dāng)時(shí)將其轉(zhuǎn)化成生理上可耐受的鹽得到。
9.制備權(quán)利要求1-7中之一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的式I所示化合物或其生理上可耐受的鹽的制備方法,其包括將微生物Gloeoporusdichrous(Fr.Fr.)Bres.ST 001714,DSM 13784或其變種或突變株之一在合適的條件下發(fā)酵、分離一種或多種卡洛孢苷衍生物并在適當(dāng)時(shí)將其轉(zhuǎn)化成生理上可耐受的鹽。
10.權(quán)利要求9所要求的方法,其中發(fā)酵在有氧、溫度18到35℃,pH5到8的條件下進(jìn)行。
11.用作藥物的權(quán)利要求1-8中之一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的式I所示化合物或其生理上可耐受的鹽。
12.用作CDK抑制劑的權(quán)利要求1-8中之一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的式I所示化合物或其生理上可耐受的鹽。
13.權(quán)利要求1-8中之一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的式I所示化合物或其生理上可耐受的鹽的應(yīng)用,用于生產(chǎn)治療癌癥或其他有細(xì)胞增殖病理障礙的疾病的藥物。
14.含有至少一種權(quán)利要求1-8中之一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的式I所示化合物或其生理上可耐受的鹽的藥物。
15.權(quán)利要求14所要求的藥物的生產(chǎn)方法,其包括將至少一種權(quán)利要求1-8中之一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的式I所示化合物或其生理上可耐受的鹽及合適的賦形劑和/或載體轉(zhuǎn)化成合適的劑型。
16.微生物Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST001714,DSM13784。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的活性物質(zhì)(卡洛孢苷衍生物),其是在微生物Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST001714,DSM13784發(fā)酵時(shí)形成的。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)上述活性物質(zhì)的方法、它們作為藥物的應(yīng)用、含有卡洛孢苷衍生物的藥物,還涉及微生物Gloeoporus dichrous(Fr.Fr.)Bres.ST001714,DSM 13784本身。
文檔編號(hào)A61K35/74GK1499976SQ02807479
公開(kāi)日2004年5月26日 申請(qǐng)日期2002年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月9日
發(fā)明者C·埃德, M·庫(kù)爾茨, M·布倫斯特魯普, L·托蒂, C 埃德, 姿固羋稱 申請(qǐng)人:安萬(wàn)特醫(yī)藥德國(guó)有限公司