專利名稱：使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過在含有表皮生長因子(EGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和肝細(xì)胞生長因子(HGF)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)它們，使骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的一種方法，以及含有神經(jīng)細(xì)胞作為有效成分用于治療神經(jīng)疾病的組合物。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞具有在培養(yǎng)中無限分裂的能力并且在特異性的分化刺激物的刺激下產(chǎn)生構(gòu)成組織的特化細(xì)胞。
根據(jù)它們的分化潛能，干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)和組織特異性干細(xì)胞。ES細(xì)胞是在胚泡期從胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)分離而來，并且是多潛能的，即它們實(shí)際上能夠分化為在生物中發(fā)現(xiàn)的全部類型的細(xì)胞。
相反，組織特異性干細(xì)胞在胚胎發(fā)育過程中器官形成的階段出現(xiàn)，并且它們是器官特異性的和多能的，即它們通常定向產(chǎn)生構(gòu)成特定器官的細(xì)胞。這些組織特異性干細(xì)胞在大多數(shù)成年人器官中保留并履行不斷補(bǔ)充正常或病理性發(fā)生的細(xì)胞損失的關(guān)鍵任務(wù)。代表性的組織特異性干細(xì)胞包括在骨髓中存在的造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。造血干細(xì)胞產(chǎn)生各種血細(xì)胞如紅細(xì)胞和白細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)締組織細(xì)胞，例如成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞。
近來，由于人胚胎干細(xì)胞的成功分離，干細(xì)胞的臨床應(yīng)用已經(jīng)吸引越來越多的興趣。干細(xì)胞最值得注意的潛在應(yīng)用是它們作為用于細(xì)胞置換治療的細(xì)胞供應(yīng)的理想來源。幾乎不可治愈的疾病，例如神經(jīng)變性疾病如帕金森氏病和阿爾茨海默氏病，由骨髓損傷，白血病，中風(fēng)，幼年發(fā)作性糖尿病，心梗塞和肝硬變引起的四肢麻痹，是由于構(gòu)成器官的細(xì)胞的破壞和永久性功能失調(diào)所導(dǎo)致，其中從外部補(bǔ)充細(xì)胞的損失的細(xì)胞置換治療已經(jīng)作為一種有效治療出現(xiàn)。
然而，盡管細(xì)胞置換治療的明顯益處，在它的臨床應(yīng)用中存在許多限制。具體地，其中將從供體組織分離的完全分化的細(xì)胞移植于患者中的常規(guī)方法，有難以獲得足夠量的提供給患者的細(xì)胞的問題。為了解決該問題，在細(xì)胞置換治療中可使用從分離的胚胎干細(xì)胞分化而來的特定組織的細(xì)胞或從分離的和增殖的組織特異性干細(xì)胞分化而來的細(xì)胞。
到目前為止，已經(jīng)證明小鼠胚胎干細(xì)胞在培養(yǎng)皿上可以分化為各種細(xì)胞如造血細(xì)胞，心肌細(xì)胞，分泌胰島素的胰細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。另外，幾個(gè)報(bào)道已經(jīng)證明，從干細(xì)胞分化的細(xì)胞的移植在由細(xì)胞損失導(dǎo)致的疾病的治療中有效。例如，當(dāng)將從胚胎干細(xì)胞分化的合成髓鞘質(zhì)的少突膠質(zhì)細(xì)胞移植于小鼠中時(shí)，小鼠中的髓鞘質(zhì)的合成增加(Brustle等，Science，285754-756，1999)。通過將從胚胎干細(xì)胞分化的分泌胰島素的細(xì)胞移植于糖尿病小鼠模型中調(diào)節(jié)血糖水平(Soria等，Diabetes，49157-162，2000)。另外，通過將由胚胎干細(xì)胞分化的神經(jīng)細(xì)胞移植于有骨髓損傷的小鼠中顯著地治療了由骨髓損傷導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)障礙(McDonald等，Nat.Med.，5(12)1410-1412，1999)。
然而，由于只是最近才成功分離出人胚胎干細(xì)胞，并且沒有關(guān)于胚胎干細(xì)胞在培養(yǎng)皿上分化為除了神經(jīng)細(xì)胞以外的其它特化細(xì)胞的報(bào)道，由胚胎干細(xì)胞分化的特異性的組織細(xì)胞在細(xì)胞置換治療中的臨床應(yīng)用還保持在一個(gè)可能性的水平上。
另外，由于從胚胎干細(xì)胞分化為靶細(xì)胞的效率低，在移植中有由和靶細(xì)胞混合的其它細(xì)胞導(dǎo)致的有害副作用的風(fēng)險(xiǎn)。因此，為了從胚胎干細(xì)胞分化的細(xì)胞更安全的臨床應(yīng)用，存在開發(fā)一種精確分化方法的需要。
另一方面，在當(dāng)組織特異性干細(xì)胞被用于細(xì)胞置換治療中的情形下，在長期培養(yǎng)中，可能出現(xiàn)細(xì)胞增殖能力降低或分化為不利的細(xì)胞的問題。另外，為了治療神經(jīng)變性疾病如帕金森氏病需要移植神經(jīng)細(xì)胞。因?yàn)橹苯訌幕颊攉@得神經(jīng)干細(xì)胞是困難的，它們通常通過培養(yǎng)從死胎腦組織分離的神經(jīng)干細(xì)胞并且使它們分化為神經(jīng)細(xì)胞而獲得。然而，胎腦的使用引起倫理問題并且被不充足的供應(yīng)所限制，并且可能導(dǎo)致免疫排斥。另外，大部分的神經(jīng)干細(xì)胞易于分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞而不是神經(jīng)元。
因此，如果可能使在患者自身骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為在細(xì)胞置換治療中使用的神經(jīng)細(xì)胞，可以很容易地供應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞并且象免疫排斥的問題在治療中將不會(huì)出現(xiàn)。
到目前為止，已認(rèn)為一種類型的干細(xì)胞只分化為屬于一個(gè)特定系統(tǒng)的組織細(xì)胞。據(jù)報(bào)道在各種生長因子如血小板衍生生長因子，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和表皮生長因子(EGF)的存在下，間充質(zhì)干細(xì)胞體外形成集落(Kuznetsov等，Br.J.Haematol.，97561，1997；和van den Bos C.等，Human Cell，1045，1997)，并且大約三分之一的原始貼壁細(xì)胞具有多潛能性，從而分化為結(jié)締組織細(xì)胞如成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞(Pittenger MF等，Science，284143，1999)。另外，F(xiàn)errari G.等報(bào)道骨髓是形成新肌的生肌前體細(xì)胞的來源(Science，2791528，1998)。
最近的研究報(bào)道間充質(zhì)干細(xì)胞還能分化為神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞。例如，Sanchez-Ramos等報(bào)道間充質(zhì)干細(xì)胞在視黃酸和腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的存在下經(jīng)培養(yǎng)分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞(Exp.Neurology，164247-256，2000)。Dale Woodbury等報(bào)道在骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞在抗氧化劑如β-巰基乙醇和二甲基亞砜(DMSO)的存在下分化為神經(jīng)細(xì)胞(J.Neuro.Res.，61364-370，2000)。然而，強(qiáng)分化誘導(dǎo)試劑如DMSO的使用在臨床應(yīng)用中可能導(dǎo)致問題。
本發(fā)明者已努力發(fā)現(xiàn)高度安全和能夠使骨髓中的干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的物質(zhì)，并且已發(fā)現(xiàn)HGF促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，還發(fā)現(xiàn)將EGF和bFGF加入培養(yǎng)基中，與HGF一起，不但顯著地促進(jìn)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，而且增強(qiáng)產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞的擴(kuò)增。
已報(bào)道當(dāng)將它們加入到用于培養(yǎng)從腦組織分離的神經(jīng)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中時(shí)，EGF和bFGF刺激神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞(Melissa等，Exp.Neurology，158265-278，1999)。
已報(bào)道HGF增強(qiáng)在海馬和中腦中的神經(jīng)元的生存力，并且誘導(dǎo)在新大腦皮質(zhì)移植(neocortical explant)中軸突的生長(Hamanoue M等，J.Neurosci.Res.，43554-564，1996)。另外，在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，它作為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生存因子起作用(Ebens A等，Neuron，171157-1172，1996)，并且參與感覺神經(jīng)元和副交感神經(jīng)元的生長和生存(Fleur Davey等，Mol.Cell Neurosci.，1579-87，2000)。
然而，尚未報(bào)道通過在含有EGF，bFGF和HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)它們，能夠使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞或單核細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供通過所述方法分化的神經(jīng)細(xì)胞和一種包括神經(jīng)細(xì)胞作為有效成分的用于治療神經(jīng)疾病的藥物組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于治療哺乳動(dòng)物中神經(jīng)疾病的方法，其包括將通過上述方法生產(chǎn)的神經(jīng)細(xì)胞施用于需要其的受治療者。
因此，依照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種用于使骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法，其包括在含有表皮生長因子(EGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和肝細(xì)胞生長因子(HGF)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。


本發(fā)明上述和其它的目的和特征從結(jié)合下述附圖的本發(fā)明的下述描述中將變得明顯，其中所述附圖分別表示圖1來源于在含有10ng/ml EGF，20ng/ml bFGF和20ng/ml HGF的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周的骨髓單核細(xì)胞的貼壁細(xì)胞的顯微照片(×100；以下，使用相同的放大率)；圖2從在含有10ng/ml EGF，20ng/ml bFGF和20ng/ml HGF的培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周的骨髓單核細(xì)胞分化來的神經(jīng)細(xì)胞的顯微照片；圖3A和3B分別為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞顯微照片，其是從圖2的神經(jīng)細(xì)胞分離而來；圖4A到4C圖2分化的神經(jīng)細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果，其中圖4A是NSE-陽性細(xì)胞；圖4B，NeuN-陽性細(xì)胞和圖4C，GFAP-陽性細(xì)胞
圖5A至圖5C分別為從間充質(zhì)干細(xì)胞分化的成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的顯微照片；圖6在其接種在含有10ng/ml EGF，20ng/ml bFGF和20ng/ml HGF的培養(yǎng)基上之后即刻拍攝的間充質(zhì)干細(xì)胞的顯微照片；圖7由在含有10ng/ml EGF，20ng/ml bFGF和20ng/ml HGF的培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周的間充質(zhì)干細(xì)胞分化的神經(jīng)細(xì)胞的顯微照片；圖8A至8C圖7分化的神經(jīng)細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果，其中圖8A是NSE-陽性細(xì)胞；圖8B，NeuU-陽性細(xì)胞和圖8C，GFAP-陽性細(xì)胞。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種使從骨髓分離的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法，其包括在含有表皮生長因子(EGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和肝細(xì)胞生長因子(HGF)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。
另外，還提供通過所述方法分化的神經(jīng)細(xì)胞和一種包括神經(jīng)細(xì)胞作為有效成分用于治療神經(jīng)疾病的藥物組合物。
如在此使用，術(shù)語“神經(jīng)細(xì)胞”指包括神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的類神經(jīng)細(xì)胞(nerve-like cell)。
為了使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，優(yōu)選在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞超過一周時(shí)間，所述培養(yǎng)基含有1-1,000ng/ml，優(yōu)選5-10ng/ml的EGF，1-1000ng/ml，優(yōu)選10-20ng/ml的bFGF和1-1000ng/ml，優(yōu)選5-20ng/ml的HGF。更優(yōu)選培養(yǎng)干細(xì)胞超過4周時(shí)間。在培養(yǎng)開始大約4周后，形成幾個(gè)細(xì)胞組成的神經(jīng)細(xì)胞集落，在大約8周后，通過神經(jīng)細(xì)胞集落的連續(xù)生長和增殖產(chǎn)生大量的神經(jīng)細(xì)胞。
相反，如果在相同但缺少HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞不能分化為神經(jīng)細(xì)胞。另外，如果只用HGF處理它們，早期分化發(fā)生，因而抑制增殖。該結(jié)果暗示在培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞以獲得神經(jīng)細(xì)胞的本發(fā)明的方法中，EGF和bFGF刺激細(xì)胞增殖，HGF刺激干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞。另外，當(dāng)只使用所述因子的一種時(shí)不能獲得充足量的神經(jīng)細(xì)胞。
在8-周的培養(yǎng)后一旦神經(jīng)細(xì)胞完全分化和增殖，即使在只用EGF和bFGF處理的時(shí)候，它們也可以進(jìn)一步增殖而不丟失它們作為神經(jīng)細(xì)胞的獨(dú)特特征。在另一方面，如果只用HGF隨后處理完全分化和增殖的神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞繼續(xù)分化而不增殖，因此，細(xì)胞量減少。因此，在培養(yǎng)8周后，優(yōu)選通過在含有EGF和bFGF的培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)它們以使神經(jīng)細(xì)胞增殖。
依照使用EGF，bFGF和HGF的本方法，大于80％的總分化細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞，基于細(xì)胞量，其包含60-80％，優(yōu)選65-75％的神經(jīng)元和20-40％，優(yōu)選25-35％的星形膠質(zhì)細(xì)胞，并且不含有小膠質(zhì)細(xì)胞。
在本發(fā)明中，間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)選從人骨髓獲得。源于骨髓的單核細(xì)胞包含造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)它們1-2周時(shí)，造血干細(xì)胞容易地分化為成熟血細(xì)胞。因此，此后增殖的干細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞，其在20代的傳代培養(yǎng)后繼續(xù)增殖。間充質(zhì)干細(xì)胞分化為包括成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的各種結(jié)締組織細(xì)胞。
此外，當(dāng)在本發(fā)明方法中使用包含間充質(zhì)干細(xì)胞的骨髓單核細(xì)胞代替分離的間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，還可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞的大量生產(chǎn)。
由于神經(jīng)細(xì)胞是通過使用在人體內(nèi)存在的特異的蛋白質(zhì)，即EGF，bFGF和HGF，而未使用有害的分化誘導(dǎo)物如DMSO，由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來，本方法特別在安全方面是有利的。另外，因?yàn)閺幕颊咦陨砉撬杩梢援a(chǎn)生對于疾病治療足夠量的神經(jīng)細(xì)胞，由于神經(jīng)細(xì)胞迅速的有效性和降低的免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)，它的臨床應(yīng)用將是可行的。
依照本發(fā)明從間充質(zhì)干細(xì)胞分化的神經(jīng)細(xì)胞可以作為一種細(xì)胞組合物的活性成分使用，該組合物用于神經(jīng)疾病的細(xì)胞置換治療?？梢酝ㄟ^使用本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞治療的神經(jīng)疾病的非限制性實(shí)施例包括神經(jīng)變性疾病如帕金森氏病，阿爾茨海默氏病，皮克病，亨廷頓舞蹈病，肌萎縮性側(cè)索硬化和局部缺血性腦病。本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞還可以用于由神經(jīng)細(xì)胞的異常損失導(dǎo)致的各種疾病以及由脊髓損傷導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)障礙的治療。
通過將用本發(fā)明方法分化的神經(jīng)細(xì)胞和藥用賦形劑或載體混和，或通過按照任何常規(guī)程序使用藥用稀釋劑將其稀釋，可以制備用于預(yù)防或治療神經(jīng)疾病的細(xì)胞組合物。合適載體，賦形劑和稀釋劑的實(shí)例是乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，木糖醇，赤蘚糖醇，麥芽糖醇，淀粉，阿拉伯膠，藻酸鹽，明膠，磷酸鈣，硅酸鈣，纖維素，甲基纖維素，微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羥基苯甲酸甲酯類，羥基苯甲酸丙酯類，滑石，硬脂酸鎂和礦物油。制劑可另外包括填料，抗凝集劑，潤滑劑，濕潤劑，香料，乳化劑，防腐劑等。可通過使用本領(lǐng)域熟知的任何程序來配制本發(fā)明的藥物組合物，以便在將它們對哺乳動(dòng)物給藥后，提供活性成分的迅速，持續(xù)或延遲的釋放。因此，制劑可以是無菌的注射液，混懸液，乳劑，溶液等形式，其中無菌注射液是優(yōu)選的。
因此，本發(fā)明還提供一種在哺乳動(dòng)物中治療神經(jīng)疾病的方法，其包括以治療疾病有效的量對需要其的受試者給藥用本發(fā)明方法生產(chǎn)的神經(jīng)細(xì)胞。
通過任何常規(guī)方法可以將通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的神經(jīng)細(xì)胞注射于患者內(nèi)。例如，可使用Douglas Kondziolka的方法(D.Kondziolka等，Neurology55556-569，2000)。具體地，將患者的顱骨切除以產(chǎn)生一個(gè)具有大約1cm直徑的孔，將含有神經(jīng)細(xì)胞的HBSS(Hank’s平衡鹽溶液)注射于大約3個(gè)位點(diǎn)。注射是通過用于將所需的細(xì)胞溶液在正確位置注射于腦的深層部分的具有長針頭和立體定位支架的注射器進(jìn)行的?？梢酝ㄟ^包括透皮，皮下，靜脈內(nèi)和肌內(nèi)輸入，外科定向輸入，通過血管導(dǎo)管插入術(shù)的損害內(nèi)的輸入的各種途徑給藥本發(fā)明的細(xì)胞組合物。
神經(jīng)細(xì)胞的典型單位劑量可從1×106細(xì)胞至1×109細(xì)胞變化，并且可每周或每月給藥。然而，應(yīng)該理解實(shí)際給藥的活性成分的量應(yīng)該根據(jù)各種相關(guān)因素確定，所述因素包括待治療的疾病，患者癥狀的嚴(yán)重程度，選擇的給藥途徑，個(gè)體患者的年齡，性別和體重；因此，上述劑量不應(yīng)該是想以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
下列實(shí)施例是打算進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明而不限制其范圍。
另外，下面給出的對于固體在固體混合物中，液體在液體中和固體在液體中的百分比是分別基于重量/重量(wt/wt)，體積/體積(vol/vol)和重量/體積(wt/vol)，并且除非特別另外說明，所有的反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。
實(shí)施例1分離骨髓中的單核細(xì)胞從每個(gè)健康志愿者的骨盆取大約10ml的骨髓，并保存在含肝素的玻璃管中。將30ml磷酸緩沖鹽水(PBS)加至10ml骨髓中，將20ml得到的混合物緩慢轉(zhuǎn)移至10ml Ficoll-PaqueTM plus溶液(1.077g/ml，Amersham Pharmacia Biotech)之上，并在2000rpm進(jìn)行密度梯度離心20分鐘?；厥瘴挥陧攲雍虵icoll-PaqueTM plus層之間界面的單核細(xì)胞層，并在1800rpm進(jìn)行離心5分鐘以獲得單核細(xì)胞。
實(shí)施例2單核細(xì)胞的培養(yǎng)將實(shí)施例1中獲得的單核細(xì)胞以1×106細(xì)胞/cm2的密度接種于含有基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。在37℃，5％的CO2下孵育培養(yǎng)瓶。在4小時(shí)后，用新鮮基本培養(yǎng)基洗滌培養(yǎng)瓶以去除未貼壁細(xì)胞?；九囵B(yǎng)基為含有3.5μM氫化可的松(Sigma)，以相等的摩爾比與無脂肪酸的牛血清白蛋白(Gibco BRL)混合的50ng/ml的亞油酸(Sigma公司)，0.1μM CuSO4·5H2O(Sigma)，50pM ZnSO4·7H2O(Sigma公司)，3ng/ml H2SeO3(Sigma)，1.05mg/ml NaHCO3(Sigma公司)，1.19mg/ml HEPES(Sigma)，100U/ml青霉素(Gibco BRL)，10mg/ml鏈霉素(Gibco BRL)和25mg/ml兩性霉素(Gibco BRL)的Williams’E培養(yǎng)基(Gibco BRL)。
實(shí)施例3單核細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞為了證實(shí)實(shí)施例2獲得的單核細(xì)胞是否能分化為神經(jīng)細(xì)胞，在37℃，5％的CO2下在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)單核細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有10ng/ml表皮生長因子(Gibco BRL)，20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(R&D系統(tǒng))和20ng/ml肝細(xì)胞生長因子(R&D系統(tǒng))(“分化培養(yǎng)基”)。一周兩次補(bǔ)充分化培養(yǎng)基。
大約4周后，神經(jīng)細(xì)胞集落出現(xiàn)并不斷增殖(參見表1和圖1)。
大約8周后，觀察到由長突出物如軸突和短突出物如樹突組成的神經(jīng)元狀細(xì)胞和只包括短樹突的星形膠質(zhì)細(xì)胞狀的細(xì)胞(參見圖2和3)。另外，在8周后，即使在只含有EGF和bFGF的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，細(xì)胞增殖而它們的形狀不變(參見表2)。
然而，當(dāng)在只含有EGF和bFGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞不分化為神經(jīng)細(xì)胞。另外，當(dāng)在只含有HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞早期分化，因此它們既不生長也不增殖(參見表1)。
表1.間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)8周后細(xì)胞數(shù)/ml培養(yǎng)物

表2.通過在含有EGF，bFGF和HGF的培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周從間充質(zhì)干細(xì)胞分化的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)4或8周后細(xì)胞的增殖(接種細(xì)胞數(shù)1×105)

實(shí)施例4免疫細(xì)胞化學(xué)使實(shí)施例3中獲得的神經(jīng)細(xì)胞以1×104細(xì)胞/cm2的密度附著在1cm2的蓋玻片上，所述神經(jīng)細(xì)胞是通過在含有EGF，bFGF和HGF的培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周從骨髓的單核細(xì)胞分化而來。用0.1M磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞5分鐘，用含有4％低聚甲醛的0.1M磷酸鹽緩沖液固定15分鐘，并用0.1M磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次。用含1％BSA和2％Triton X-100的0.1M PBS處理細(xì)胞5分鐘，然后使其與第一抗體小鼠抗人神經(jīng)元特異性的烯醇化酶(NSE)(Chemico公司)，小鼠抗人神經(jīng)元特異性的核蛋白(NeuN)(Chemicon公司)，小鼠抗人β-微管蛋白III(Sigma公司)和小鼠抗人膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)(Sigma公司)反應(yīng)16小時(shí)。
在與第一抗體的反應(yīng)完成后，除去殘余抗體并用含有0.5％BSA的0.1M PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次15分鐘。另外加入第二抗體，兔抗鼠IgG(Sigma公司)并孵育30分鐘。用含0.5％BSA的0.1 M PBS洗滌細(xì)胞，一次5分鐘。通過使用含有抗生物素蛋白-生物素的Vectastain Elite ABC試劑盒(Vector Laboratory公司)進(jìn)行反應(yīng)30分鐘。用0.1M的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，每次5分鐘，另外加入DAB(脫水3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽，Sigma公司)作為顯色底物，使混合物反應(yīng)5分鐘。通過用0.1M磷酸鹽緩沖液處理反應(yīng)物5分鐘并用該緩沖液洗滌它們兩次，每次5分鐘來終止反應(yīng)。將得到的反應(yīng)物干燥，并用蒸餾水洗滌5分鐘。通過依次使用蒸餾水，70％，80％，95％和100％的乙醇處理將細(xì)胞脫水和固定。
上述免疫細(xì)胞化學(xué)染色的結(jié)果在圖4A至4C中顯示，其中，對于神經(jīng)元標(biāo)記NeuN，NSE和β-微管蛋白III，以及星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP，分化的細(xì)胞顯示陽性結(jié)果。這些結(jié)果顯示細(xì)胞分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，其是通過它們的生物化學(xué)以及形態(tài)特征來判斷。然而，對于小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記OX-42細(xì)胞顯示陰性，證明單核細(xì)胞不分化為小膠質(zhì)細(xì)胞。
檢驗(yàn)神經(jīng)元(對NeuN和NSE為陽性)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(對GFAP為陽性)在細(xì)胞中的比例并在在表3中顯示，所述細(xì)胞是通過在含有EGF+bFGF+HGF或EGF+bFGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)8周從骨髓的單核細(xì)胞分化而來。
表3

從表3可見，當(dāng)在含有EGF+bFGF+HGF的培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周時(shí)約80％的總分化細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)細(xì)胞由約70％的神經(jīng)元和約30％的星形膠質(zhì)細(xì)胞組成。
實(shí)施例5間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)為了了解在骨髓的單核細(xì)胞中的間充質(zhì)干細(xì)胞是否將分化為神經(jīng)細(xì)胞，培養(yǎng)單核細(xì)胞并從中分離間充質(zhì)干細(xì)胞。如下檢驗(yàn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為各種細(xì)胞的能力。
將如在實(shí)施例2中培養(yǎng)的單核細(xì)胞以1×103細(xì)胞/cm2的密度接種于含有用10％FBS(胎牛血清)補(bǔ)充的DMEM(Gibco BRL)的培養(yǎng)瓶中。
將細(xì)胞在5％CO2的氣氛下37℃培養(yǎng)。在1～2周后，將增殖的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在20代傳代培養(yǎng)后增殖繼續(xù)。
由骨髓獲得的單核細(xì)胞包括成熟白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，脂肪細(xì)胞以及將分化為這些細(xì)胞的干細(xì)胞，所述干細(xì)胞分為造血和間充質(zhì)干細(xì)胞。產(chǎn)生血細(xì)胞如紅細(xì)胞，白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的造血干細(xì)胞不能增殖，但在普通的培養(yǎng)基中容易分化為成熟血細(xì)胞。因此，可以看到如上繼續(xù)增殖的細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞。
為了證實(shí)增殖的細(xì)胞的確是間充質(zhì)干細(xì)胞，用各種細(xì)胞因子和化學(xué)試劑處理細(xì)胞，并依照Pittenger等，Science，284143-147，1999的方法檢驗(yàn)它們分化為包括成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的各種結(jié)締組織細(xì)胞。
為了使干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，使用100mM地塞米松和10mM β-甘油磷酸(β-glycerol phosphate)和50nM抗壞血酸-2-磷酸酯和10％FBS處理細(xì)胞。
另外，為了證實(shí)干細(xì)胞分化為成軟骨細(xì)胞的能力，將培養(yǎng)的干細(xì)胞離心以獲得細(xì)胞沉淀，用不含血清的100nM地塞米松和10ng/ml TGF-β3處理。
通過用0.5mM 1-甲基3-異丁基黃嘌呤，1mM地塞米松，10g/ml胰島素，100nM吲哚美辛(indomethacine)和10％FBS處理干細(xì)胞誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。
通過堿性磷酸酶染色(Jaiswal等，J.Cell Biochem.，64(2)295-312，1997)檢驗(yàn)成骨細(xì)胞；通過II型膠原的RT-PCR(Mackay等，Tissue Eng.，4(4)415-428，1998)和用甲苯胺藍(lán)染色檢驗(yàn)成軟骨細(xì)胞；通過用油紅O染色檢驗(yàn)脂肪細(xì)胞。
結(jié)果，從圖5A，5B和5C可見，在光學(xué)顯微鏡下在所有樣品中觀察到陽性結(jié)果。這些結(jié)果證明體外培養(yǎng)和增殖的間充質(zhì)干細(xì)胞還保持能夠分化為各種結(jié)締組織細(xì)胞如成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的干細(xì)胞性能。
實(shí)施例6間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞為了檢驗(yàn)實(shí)施例5中分離的間充質(zhì)干細(xì)胞是否能分化為神經(jīng)細(xì)胞，在用EGF，bFGF和HGF補(bǔ)充的培養(yǎng)基中，按照實(shí)施例3的方法培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。
結(jié)果，與源于骨髓的單核細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞分化類似，在4周后形成神經(jīng)細(xì)胞集落，并且神經(jīng)細(xì)胞繼續(xù)生長和增殖直至第8周。圖6和圖7舉例說明了分別在接種后和在8周培養(yǎng)后即刻拍攝的細(xì)胞的顯微照片。
在第8周后，即使只用EGF和bFGF處理，細(xì)胞繼續(xù)增殖而保持神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)特征。
同樣，按照實(shí)施例4的方法，對分化細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。
結(jié)果，與源于骨髓的單核細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞獲得的結(jié)果類似，對于神經(jīng)元標(biāo)記(neural marker)NeuN，NSE和β-微管蛋白III以及星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP，分化細(xì)胞顯示陽性結(jié)果。因此，證實(shí)了間充質(zhì)干細(xì)胞不僅分化為神經(jīng)元而且分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞(參見圖8A至8C)。圖8A至圖8C顯示免疫細(xì)胞化學(xué)染色的結(jié)果，圖8A代表NSE-陽性細(xì)胞；圖8B，NeuN-陽性細(xì)胞；和圖8C，GFAP-陽性細(xì)胞。
雖然關(guān)于上述具體的實(shí)施方案已經(jīng)描述了本發(fā)明，但應(yīng)承認(rèn)那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和改變，這些修改和改變也屬于如后附的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法，其包括在含有表皮生長因子(EGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和肝細(xì)胞生長因子(HGF)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述間充質(zhì)干細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞在含有1-1000ng/mlEGF，1-1000ng/ml bFGF和1-1000ng/ml HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)超過一周的時(shí)間。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述培養(yǎng)進(jìn)行超過4周的時(shí)間。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞在含有EGF，bFGF和HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)超過一周時(shí)間，并且使產(chǎn)生的分化神經(jīng)細(xì)胞在含有EGF和bFGF的培養(yǎng)基中增殖。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞從人的骨髓分離。
6.權(quán)利要求1的方法，其中將從骨髓分離的并且包含間充質(zhì)干細(xì)胞的單核細(xì)胞用作間充質(zhì)干細(xì)胞的一種來源。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)細(xì)胞包含神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。
8.通過權(quán)利要求1至7任何一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的一組神經(jīng)細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8所述的神經(jīng)細(xì)胞組，其基于細(xì)胞數(shù)，含有60-80％神經(jīng)元和20-40％星形膠質(zhì)細(xì)胞。
10.一種治療神經(jīng)疾病的細(xì)胞組合物，其包含權(quán)利要求8的神經(jīng)細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的細(xì)胞組合物，其中所述神經(jīng)疾病是一種神經(jīng)變性疾病或由于脊髓損傷導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)障礙。
12.權(quán)利要求11的細(xì)胞組合物，其中所述神經(jīng)變性疾病選自帕金森氏病，阿爾茨海默氏病，皮克病，亨廷頓舞蹈病，肌萎縮性側(cè)索硬化和局部缺血性腦病。
13.一種用于在哺乳動(dòng)物中治療神經(jīng)疾病的方法，其包括以治療所述疾病有效的量對需要其的受試者給藥通過權(quán)利要求1的方法生產(chǎn)的神經(jīng)細(xì)胞。
全文摘要
一種使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法，其包括在含有表皮生長因子(EGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和肝細(xì)胞生長因子(HGF)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，并且由此生產(chǎn)的神經(jīng)細(xì)胞可用于神經(jīng)疾病的治療。
文檔編號(hào)A61P25/16GK1549856SQ02808391
公開日2004年11月24日 申請日期2002年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月19日
發(fā)明者金炫壽, 尹熙勛 申請人:金炫壽