專(zhuān)利名稱(chēng)：IFNα-21基因的新的多核苷酸和多肽的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本發(fā)明要求對(duì)2001年3月30日提交的、名為《Nouveauxpolynucléotides comportant des polymorphismes de type SNPfonctionnels dans la séquence nucléique du gène IFNalpha21ainsi que de nouveaux polypeptides codés par cespolynucléotides et leurs utilisations thérapeutiques.》的法國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)0104404的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及來(lái)源于IFNα-21基因核苷酸序列的包含新的SNP的新的多核苷酸、以及來(lái)源于天然野生型IFNα-21蛋白質(zhì)的包含該SNP所致突變的新的多肽、及其治療用途。
相關(guān)技術(shù)干擾素α21基因，以下簡(jiǎn)稱(chēng)IFNα-21，如下列文獻(xiàn)所述-Goeddel，D.V.，Leung，D.W；″The structure of eightdistinct cloned human leukocyte interferon cDNAs″；Nature 290(5801)，20-26(1981)。
-Olopade OI.，Bohlander SK.；″Mapping of the shortestregion of overlap of deletions of the short arm of chromosome9 associated with human neoplasia″；Genomics 14(2)，437-443(1992)。
該基因的核苷酸序列可得自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的HTG部分，登錄號(hào)為AC009445。
IFNα-21信使RNA序列如NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)NM_002175所述。
IFNα-21基因的結(jié)構(gòu)和功能同源性接近于人干擾素α(IFNα)，特別是IFNα-2。
已知IFNα具有抗細(xì)胞增殖作用，并與抗病毒和抗寄生蟲(chóng)反應(yīng)有關(guān)。
已知IFNα還抑制其它幾種細(xì)胞因子在造血干細(xì)胞水平的表達(dá)，并抑制某些腫瘤的細(xì)胞增殖。
已知IFNα還降低腎癌EGF受體的表達(dá)，抑制某些線(xiàn)粒體基因的表達(dá)，抑制成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖，特別是在體外，并阻斷B淋巴細(xì)胞的抗體合成。
已知IFNα還誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表面上的腫瘤特異性抗原的表達(dá)，并通過(guò)作用于ISRE(干擾素刺激反應(yīng)元件)的特定轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)位于ISRE型啟動(dòng)子區(qū)控制下的基因。
已知IFNα與各種病癥和/或人類(lèi)疾病有關(guān)，例如各種癌癥，如惡性腫瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病和肝癌、頸癌、頭癌和腎癌，心血管疾病，與免疫系統(tǒng)無(wú)關(guān)的代謝疾病，例如肥胖癥，傳染病，例如乙型肝炎、丙型肝炎和AIDS，肺炎，潰瘍性結(jié)腸炎，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如阿爾茨海默氏病、精神分裂癥和抑郁癥，組織或器官移植的排斥，創(chuàng)傷愈合，透析患者的貧血，變態(tài)反應(yīng)，哮喘，多發(fā)性硬化，骨質(zhì)疏松癥，銀屑病，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，克羅恩氏病(Crohn’sdisease)，自身免疫疾病和病癥、胃腸疾病乃至與化學(xué)治療有關(guān)的疾病。
IFNα特別用于治療某些白血病、轉(zhuǎn)移性腎癌以及伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤，例如愛(ài)滋病情況下的Kaposi肉瘤。IFNα還有效對(duì)抗其它類(lèi)型腫瘤和某些病毒感染。FDA(食品和藥品管理局)確認(rèn)IFNα也可用于治療生殖器疣或性病。
更具體而言，利用原位雜交將IFNα-21定位于帕金森氏病或阿爾茨海默氏病患者的腦中。
與其它細(xì)胞相比，小神經(jīng)膠質(zhì)(microglial)細(xì)胞大量表達(dá)IFNα-21。
阿爾茨海默氏病患者的頂葉神經(jīng)元顯示存在IFNα-21，提示IFNα-21可能與其病理有關(guān)(例如參見(jiàn)Kawaguchi N，Yamada T，Yoshiyama Y.No To Shinkei.1997 Jan.；49(1)69-73)。
然而，IFNα特別是IFNα-21用于藥物組合物時(shí)具有很多副作用，例如急性超敏反應(yīng)(蕁麻疹、支氣管收縮、過(guò)敏性休克等)、心率不齊、低血壓、癲癇發(fā)作、甲狀腺功能問(wèn)題、流感樣綜合癥(發(fā)熱、出汗、肌痛)等。
此外，用IFNα治療的患者可以產(chǎn)生中和該分子的抗體，從而降低其效率。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)IFNα-21基因的新的多肽和新的多核苷酸類(lèi)似物，其能夠具有不同于天然野生型IFNα-21蛋白質(zhì)的功能性。
這些新的多肽和多核苷酸可以特別用于治療或預(yù)防前述病癥或疾病，并避免其所具有的全部或部分缺點(diǎn)。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的首要目的在于新的多核苷酸，其因包含一個(gè)或幾個(gè)SNP(單核苷酸多態(tài)性)而不同于參考的野生型IFNα-21基因核苷酸序列。
參考的野生型人IFNα-21基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1由2001個(gè)核苷酸組成，包含核苷酸670(起始密碼子)-1239(終止密碼子)的570個(gè)核苷酸的編碼序列。
申請(qǐng)人已經(jīng)鑒定了參考的野生型IFNα-21基因核苷酸序列中的8個(gè)SNP。這8個(gè)SNP如下c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277c。
應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明意義上，定位上文定義的SNP的相應(yīng)編號(hào)是相對(duì)于核苷酸序列SEQ ID NO.1的編號(hào)而言。
字母a、t、c和g分別對(duì)應(yīng)于含氮堿基腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤。
第一個(gè)字母對(duì)應(yīng)于野生型核苷酸，而最后一個(gè)字母對(duì)應(yīng)于突變的核苷酸。
因此，例如SNP c794g對(duì)應(yīng)于參考的野生型IFNα-21基因核苷酸序列SEQ ID NO.1中的794位核苷酸胞嘧啶(c)突變?yōu)楹塑账狲B(niǎo)嘌呤(g)。
本申請(qǐng)人利用申請(qǐng)人于2000年12月6日提交的名為″Process forthe determination of one or several functional polymorphism(s)in the nucleotide sequence of a preselected functionalcandidate gene and its applications″的專(zhuān)利申請(qǐng)F(tuán)R 00 22894(此處引用以供參考)中所述測(cè)定方法，鑒定出了這些SNP。
該專(zhuān)利申請(qǐng)中所述方法可以從隨機(jī)個(gè)體群體中的至少一個(gè)個(gè)體中鑒定一個(gè)(或幾個(gè))已存在的SNP。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，在隨機(jī)選取的個(gè)體群體中的不同個(gè)體中分離例如包含編碼序列的IFNα-21基因核苷酸序列片段。
在DHPLC分析(″變性高效液相層析″)之后，對(duì)某些具有異質(zhì)雙鏈性質(zhì)(即性質(zhì)不同于參考的野生型IFNα-21基因序列)的樣品進(jìn)行這些片段的測(cè)序。
這樣測(cè)序的片段然后與參考的野生型IFNα-21基因片段的核苷酸序列作比較，并鑒定本發(fā)明的SNP。
因此，該SNP是天然的，其中每一個(gè)均存在于世界群體的某些個(gè)體中。
參考的野生型IFNα-21基因編碼對(duì)應(yīng)于氨基酸序列SEQ ID NO.2的189個(gè)氨基酸的未成熟蛋白質(zhì)，通過(guò)斷裂包括前23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽而轉(zhuǎn)變?yōu)?66個(gè)氨基酸的成熟蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的每個(gè)編碼SNP，即c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g，引起IFNα-21基因核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)在氨基酸序列水平的改變。
這些氨基酸序列的改變?nèi)缦耂NP c794g引起對(duì)應(yīng)于氨基酸序列SEQ ID NO.2的IFNα-21基因的未成熟蛋白質(zhì)42位氨基酸丙氨酸(A)突變?yōu)楦拾彼?G)，其位于成熟蛋白質(zhì)的19位。在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中，根據(jù)是否涉及成熟蛋白質(zhì)抑或未成熟蛋白質(zhì)，而分別將該SNP編碼的突變稱(chēng)為A19G或A42G。
SNP c973a引起對(duì)應(yīng)于氨基酸序列SEQ ID NO.2的IFNα-21基因的未成熟蛋白質(zhì)102位氨基酸谷氨酰胺(Q)突變?yōu)橘?lài)氨酸(K)，其位于成熟蛋白質(zhì)的79位。在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中，根據(jù)是否涉及成熟蛋白質(zhì)抑或未成熟蛋白質(zhì)，而分別將該SNP編碼的突變稱(chēng)為Q79K或Q102K。
SNP g1011c引起對(duì)應(yīng)于氨基酸序列SEQ ID NO.2的IFNα-21基因的未成熟蛋白質(zhì)114位氨基酸谷氨酰胺(Q)突變?yōu)榻M氨酸(H)，其位于成熟蛋白質(zhì)的91位。在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中，根據(jù)是否涉及成熟蛋白質(zhì)抑或未成熟蛋白質(zhì)，而分別將該SNP編碼的突變稱(chēng)為Q91H或Q114H。
SNP t1049a引起對(duì)應(yīng)于氨基酸序列SEQ ID NO.2的IFNα-21基因的未成熟蛋白質(zhì)127位氨基酸纈氨酸(V)突變?yōu)樘於彼?D)，其位于成熟蛋白質(zhì)的104位。在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中，根據(jù)是否涉及成熟蛋白質(zhì)抑或未成熟蛋白質(zhì)，而分別將該SNP編碼的突變稱(chēng)為V104D或V127D。
SNP t1155a引起對(duì)應(yīng)于氨基酸序列SEQ ID NO.2的IFNα-21基因的未成熟蛋白質(zhì)162位氨基酸半胱氨酸(C)突變?yōu)榻K止密碼子(終止)，其位于成熟蛋白質(zhì)的139位。在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中，根據(jù)是否涉及成熟蛋白質(zhì)抑或未成熟蛋白質(zhì)，而分別將該SNP編碼的突變稱(chēng)為C139stop或C162stop。
SNP a1204g引起對(duì)應(yīng)于氨基酸序列SEQ ID NO.2的IFNα-21基因的未成熟蛋白質(zhì)179位氨基酸賴(lài)氨酸(K)突變?yōu)楣劝彼?E)，其位于成熟蛋白質(zhì)的156位。在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中，根據(jù)是否涉及成熟蛋白質(zhì)抑或未成熟蛋白質(zhì)，而分別將該SNP編碼的突變稱(chēng)為K156E或K179E。
SNP c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g引起符合本發(fā)明的多肽較之野生型參考IFNα-21基因核苷酸序列編碼的多肽，其空間構(gòu)象改變。
按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，通過(guò)計(jì)算機(jī)分子模建(modeling)，例如利用de novo(例如SEQFOLD/MSI)、同源性(例如MODELER/MSI)、最小化勢(shì)場(chǎng)(force field)(例如DISCOVER、DELPHI/MSI)和/或分子動(dòng)力學(xué)(例如CFF/MSI)模建工具，可以觀察到這些改變。
下文實(shí)驗(yàn)部分給出了上述模式的實(shí)例。
計(jì)算機(jī)分子模建表明，成熟突變蛋白質(zhì)的Q79K突變包括因氫鍵破壞而使野生型IFNα-21蛋白質(zhì)螺旋C的N端移位(displacement)，如

圖1A和1B所示。
實(shí)際上，在Q79K突變型IFNα-21蛋白質(zhì)中，野生型IFNα-21蛋白的Q79殘基側(cè)鏈氧原子、E83殘基的酸性基團(tuán)以及螺旋C間的氫鍵消失。
因此，Q79K突變蛋白質(zhì)具有不同于天然野生型IFNα-21蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象，其結(jié)構(gòu)和功能顯著變化。
計(jì)算機(jī)分子模建表明，成熟突變蛋白質(zhì)的Q91H突變包括螺旋C在突變位置的移位，如圖2A和2B所示。出現(xiàn)幾個(gè)氫鍵和鹽橋，特別位于H91和D76氨基酸的側(cè)鏈之間，使螺旋更具剛性。
因此，Q91H突變蛋白質(zhì)具有不同于天然野生型IFNα-21蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象，結(jié)構(gòu)和功能顯著變化。
計(jì)算機(jī)分子模建表明，成熟突變蛋白質(zhì)的V104D突變包括螺旋C和D之間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)在突變位置的改變，如圖3A和3B所示。在突變結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)幾個(gè)氫鍵(一方面為Q102和G105，另一方面為Q52、E107和T109)，使螺旋C和D之間的環(huán)更具剛性。此外，還觀察到螺旋BN端略微移位。
這些空間改變影響到與IFNα-21結(jié)合其受體有關(guān)的殘基。
因此，V104D突變蛋白質(zhì)具有不同于天然野生型IFNα-21蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象，結(jié)構(gòu)和功能顯著變化。
計(jì)算機(jī)分子模建表明，成熟突變蛋白質(zhì)的C139stop突變引起蛋白質(zhì)翻譯過(guò)早停止，導(dǎo)致通常與野生型IFNα-21蛋白質(zhì)螺旋E有關(guān)的多肽片段消失，如圖4所示。
螺旋E對(duì)于IFNα-21與其受體結(jié)合必不可少。缺少螺旋E導(dǎo)致突變蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，并引起蛋白質(zhì)三維構(gòu)象變化，其中蛋白質(zhì)的疏水核心接觸外部親水性介質(zhì)。因此，該突變蛋白質(zhì)必須改變其三維構(gòu)象，使其疏水核心為親水性殘基所覆蓋，以免接觸外部親水性介質(zhì)。
因此，C139stop突變蛋白質(zhì)具有不同于天然野生型IFNα-21蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象，結(jié)構(gòu)和功能顯著變化。
計(jì)算機(jī)分子模建表明，成熟突變蛋白質(zhì)的K156E突變包括螺旋EC端的伸展以及C末端環(huán)狀的改變，如圖5A和5B所示。
該突變?cè)鰪?qiáng)了氫鍵網(wǎng)絡(luò)，并在E156和R161殘基之間形成鹽橋。這些改變使IFNα-21蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在此區(qū)域更為剛性。已知蛋白質(zhì)該區(qū)域與其抗病毒活性有關(guān)。因此，可預(yù)測(cè)K156E突變型IFNα-21蛋白質(zhì)的抗病毒活性被顯著破壞，并預(yù)測(cè)156位谷氨酸導(dǎo)致成熟IFNα-21的結(jié)構(gòu)和功能改變。
本發(fā)明的其它SNP，即t1265c、t1277c，并不包含IFNα-21基因核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)在氨基酸序列SEQ ID NO.2水平的改變。SNP t1265c、t1277c是非編碼SNP。
本發(fā)明的多核苷酸可以按此方式進(jìn)行基因分型，以便確定這些多核苷酸在群體中的等位基因頻率。下文實(shí)驗(yàn)部分給出了基因分型的實(shí)施例。
通過(guò)測(cè)定生物活性，可以同樣進(jìn)行本發(fā)明多肽的功能性測(cè)定。
在此方面，例如可測(cè)定本發(fā)明的多肽與天然野生型IFNα-21蛋白質(zhì)相比，對(duì)Daudi細(xì)胞系的抗增殖作用(Pielher等人J.Biol.Chem.；275卷，51期，40425-40433，12月22，2000；″New structural andFunctional Aspects of the type I Interferon-Receptorinteraction revealed by comprehensible mutational analysis ofthe binding interface″)。
本發(fā)明目的還在于本發(fā)明的多核苷酸和多肽、以及從這些多核苷酸和多肽開(kāi)始而獲得和/或鑒定的治療性分子的用途，特別是用于預(yù)防和治療某些人類(lèi)病癥和/或疾病。
附圖簡(jiǎn)述圖1A和1B表示包含SNP c973a(Q79K)的本發(fā)明編碼蛋白質(zhì)以及天然野生型IFNα-21蛋白質(zhì)的模型。圖1B表示圖1A所示每種蛋白質(zhì)下部模型的特寫(xiě)(close up)。
在圖1A和1B中，黑色條帶代表天然野生型IFNα-21蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而白色條帶代表Q79K突變型IFNα-21蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
圖2A和2B表示包含SNP g1011c(Q91H)的本發(fā)明編碼蛋白質(zhì)以及天然野生型IFNα-21蛋白質(zhì)的模型。圖2B表示圖2A所示每種蛋白質(zhì)左部模型的特寫(xiě)。
在圖2A和2B中，黑色條帶代表天然野生型IFNα-21蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而白色條帶代表Q91H突變型IFNα-21蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
圖3A和3B表示包含SNP t1049a(V104D)的本發(fā)明編碼蛋白質(zhì)以及天然野生型IFNα-21蛋白質(zhì)的模型。圖3B表示圖3A所示每種蛋白質(zhì)上部模型的特寫(xiě)。
在圖3A和3B中，黑色條帶代表天然野生型IFNα-21蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而白色條帶代表V104D突變型IFNα-21蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
圖4表示包含SNP t1155a(C139stop)的本發(fā)明編碼蛋白質(zhì)(圖4B)以及天然野生型IFNα-21蛋白質(zhì)(圖4A)的模型。圖4C表示圖4A和4B的兩個(gè)蛋白質(zhì)的疊加。在圖4中，黑色條帶代表天然野生型IFNα-21的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而白色條帶代表C139stop突變型IFNα-21蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
圖5A和5B表示包含SNP a1204g(K156E)的本發(fā)明編碼蛋白質(zhì)以及天然野生型IFNα-21蛋白質(zhì)的模型。
圖5B表示圖5A所示每種蛋白質(zhì)上部模型的特寫(xiě)。在圖5中，黑色條帶代表天然野生型IFNα-21蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而白色條帶代表K156E突變型IFNα-21蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
圖6表示預(yù)先經(jīng)VSV病毒感染以及A42G、Q114H/V127D、或K179E突變型IFNα-21蛋白質(zhì)處理的小鼠，與利用野生型IFNα-2處理、或未經(jīng)處理的小鼠相比的存活率。
在此圖中，橫坐標(biāo)對(duì)應(yīng)存活時(shí)間(天)，縱坐標(biāo)對(duì)應(yīng)VSV感染小鼠的相對(duì)存活率。黑色三角形、十字形、黑色菱形分別代表經(jīng)A42G突變型IFNα-21、Q114H/V127D突變型IFNα-21以及K179E突變型IFNα-21處理的VSV感染小鼠的數(shù)據(jù)。
黑色正方形代表經(jīng)野生型IFNα-2處理的VSV感染小鼠的數(shù)據(jù)，空三角形代表未經(jīng)處理的VSV感染小鼠的數(shù)據(jù)。
發(fā)明詳述定義″參考野生型基因的核苷酸序列″應(yīng)理解為人IFNα-21基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1。
該序列可得自GenBank登錄號(hào)AC009445，IFNα-21信使RNA序列如NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)NM_002175所述。此外，人IFNα-21基因描述于Goeddel，D.V.，Leung，D.W″The structure of eight distinctcloned human leukocyte interferon cDNAs″；Nature 290(5801)，20-26(1981)，以及Olopade OI.，Bohlander SK.″Mapping of theshortest region of overlap of deletions of the short arm ofchromosome 9 associated with human neoplasia″；Genomics 14(2)，437-443(1992)。
″天然野生型IFNα-21蛋白質(zhì)″應(yīng)理解為由參考的野生型IFNα-21基因的核苷酸序列編碼的成熟蛋白質(zhì)。天然野生型非成熟IFNα-21蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.2所示肽序列。
″多核苷酸″應(yīng)理解為多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，可以是修飾或未修飾的DNA或RNA。
術(shù)語(yǔ)多核苷酸包括，例如單鏈或雙鏈DNA、由一個(gè)或幾個(gè)單鏈區(qū)以及一個(gè)或幾個(gè)雙鏈區(qū)的混合物組成的DNA、單鏈或雙鏈RNA以及由一個(gè)或幾個(gè)單鏈區(qū)以及一個(gè)或幾個(gè)雙鏈區(qū)的混合物組成的RNA。術(shù)語(yǔ)多核苷酸還可以包括包含一個(gè)或幾個(gè)三鏈區(qū)的RNA和/或DNA。多核苷酸同樣可理解為因穩(wěn)定性或其它原因包含一個(gè)或幾個(gè)堿基修飾的而修飾骨架的DNA和RNA。修飾堿基可理解為，例如諸如次黃苷等稀有堿基。
″多肽″應(yīng)理解為包含通過(guò)正?；蛐揎椀碾逆I(例如，諸如在同型空間配位肽的情況下)彼此互聯(lián)的至少兩個(gè)氨基酸的肽、寡肽、寡聚體或蛋白質(zhì)。
多肽可以由除遺傳密碼定義的20個(gè)氨基酸以外的氨基酸組成。多肽同樣可以由利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的天然過(guò)程(諸如翻譯后成熟過(guò)程)或化學(xué)過(guò)程修飾的氨基酸組成。文獻(xiàn)中充分詳述了這些修飾。這些修飾可以出現(xiàn)在多肽的任何位置肽骨架、氨基酸鏈乃至羧基或氨基末端。
多肽可以是泛素化之后的分支狀，或者有或無(wú)分支的環(huán)狀。這類(lèi)修飾可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的天然或合成的翻譯后過(guò)程的結(jié)果。
例如，多肽修飾可理解為包括乙酰化、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價(jià)固定、血紅素的共價(jià)固定、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)固定、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)固定、磷脂酰肌醇的共價(jià)固定、共價(jià)或非共價(jià)交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、半胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲?；?、γ-羧基化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、十四?；?、氧化、蛋白水解過(guò)程、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、seneloylation、硫酸酯化(sulfatation)、氨基酸加成，諸如精氨酸化或泛素化。文獻(xiàn)中充分詳述了這些修飾PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，第二版，T.E.Creighton，New York，1993，POST-TRANSLATIONAL COVALENTMODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1983，Seifter等人″Analysis for proteinmodifications and nonprotein cofactors″，Meth.Enzymol.(1990)182626-646，以及Rattan等人″Protein SynthesisPost-translational Modifications and Aging″，Ann NY Acad Sci(1992)66348-62。
″分離的多核苷酸″或″分離的多肽″應(yīng)理解為從人體中分離或利用技術(shù)方法產(chǎn)生的、分別如前文定義的多核苷酸或多肽。
″同一性″應(yīng)理解為測(cè)定核苷酸或多肽序列的同一性。
同一性是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的術(shù)語(yǔ)，在文獻(xiàn)中有詳述。參見(jiàn)COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk，A.M.，Ed.，OxfordUniversity Press，New York，1998；BIOCOMPUTING INFORMATICS ANDGENOME PROJECT，Smith，D.W.，Ed.，Academic Press，New York，1993；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，PART I，Griffin，A.M.andGriffin H.G.，Ed，Humana Press，New Jersey，1994；以及SEQUENCEANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje，G.，Academic Press，1987。
文獻(xiàn)中同樣詳述了一般用于確定兩個(gè)序列間同一性和相似性的方法。參見(jiàn)GUIDE TO HUGE COMPUTER，Martin J.Bishop，Ed，AcademicPress，San Diego，1994，以及Carillo H.和Lipton D.，Siam JApplied Math(1988)481073。
例如，與核苷酸序列SEQ ID NO.1具有至少95％同一性的多核苷酸是與該序列相比，每100個(gè)核苷酸中包含至多5個(gè)突變點(diǎn)的多核苷酸。
這些突變點(diǎn)可以是一個(gè)(或幾個(gè))核苷酸的一個(gè)(或幾個(gè))替換、添加和/或缺失。
同樣，例如與氨基酸序列SEQ ID NO.2具有至少95％同一性的多肽是與該序列相比，每100個(gè)氨基酸中包含至多5個(gè)突變點(diǎn)的多肽。
這些突變點(diǎn)可以是一個(gè)(或幾個(gè))氨基酸的一個(gè)(或幾個(gè))替換、添加和/或缺失。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽并不完全分別等同于核苷酸序列SEQ IDNO.1或氨基酸序列SEQ ID NO.2，應(yīng)理解這些序列包含至少一個(gè)本發(fā)明的SNP，而被認(rèn)為是這些序列的變體。
本發(fā)明的多核苷酸通常與包含至少一個(gè)本發(fā)明的SNP的核苷酸序列SEQ ID NO.1具有相同或幾乎相同的生物活性。
同樣，本發(fā)明的多肽通常與包含至少一個(gè)本發(fā)明的編碼SNP的氨基酸序列SEQ ID NO.2具有相同或幾乎相同的生物活性。
例如，通過(guò)定點(diǎn)誘變或直接合成，可以獲得本發(fā)明的變體。
″SNP″可理解為核苷酸序列中堿基的任何天然變異。核苷酸序列的SNP可以是編碼、沉默或非編碼型。
編碼SNP是包括在核苷酸序列的編碼序列內(nèi)、涉及該核苷酸序列所編碼氨基酸序列中的氨基酸改變的一種多態(tài)性。在這種情況下，術(shù)語(yǔ)SNP經(jīng)外延同樣適用于氨基酸序列的突變。
沉默SNP是包括在核苷酸序列的編碼序列內(nèi)、不涉及該核苷酸序列所編碼的氨基酸序列中的氨基酸改變的一種多態(tài)性。
非編碼SNP是包括在核苷酸序列的非編碼序列中的一種多態(tài)性。該多態(tài)性特別發(fā)現(xiàn)于內(nèi)含子、拼接區(qū)、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或增強(qiáng)子位點(diǎn)序列中。
″功能性SNP″可理解為如前文定義的、包括在核苷酸序列或氨基酸序列中的具有功能性的SNP。
″功能性″可理解為多肽或多核苷酸的生物活性。
本發(fā)明的多肽或多核苷酸的功能性可以是保留、增加、降低或抑制野生型參考基因的核苷酸序列編碼的多肽或后者核苷酸序列的生物活性。
本發(fā)明的多肽或多核苷酸的功能性同樣可以是野生型參考基因的核苷酸序列編碼的多肽或后者核苷酸序列的生物活性的本質(zhì)改變。
生物活性可以特別涉及本發(fā)明的多肽與受體有或沒(méi)有親和力。
多核苷酸本發(fā)明的首要目的在于分離的多核苷酸，其包含a)與序列SEQ ID NO.1或其編碼序列(核苷酸670-1239)具有至少80％同一性、優(yōu)選至少90％同一性、更優(yōu)選至少95％同一性以及更加優(yōu)選至少99％同一性的核苷酸序列，應(yīng)當(dāng)理解該核苷酸序列包含至少一個(gè)以下編碼SNP c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g或b)與a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明意義上，編號(hào)對(duì)應(yīng)于該SNP在核苷酸序列SEQID NO.1中的定位。
本發(fā)明同樣涉及分離的多核苷酸，其包含a)核苷酸序列SEQ ID NO.1或其編碼序列，應(yīng)當(dāng)理解這些序列中每一個(gè)均包含至少一個(gè)以下編碼SNPc794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g，或b)與a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸由序列SEQ ID NO.1或其編碼序列組成，應(yīng)當(dāng)理解這些序列中每一個(gè)均包含至少一個(gè)以下編碼SNPc794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g。
根據(jù)本發(fā)明，前面定義的多核苷酸包含選自c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a和a1204g的單一編碼SNP。
如上定義的多核苷酸同樣可以包括至少一個(gè)下列非編碼SNPt1265c、t1277c。
本發(fā)明的目的同樣在于分離的多核苷酸，其包含以下或由以下組成a)核苷酸序列SEQ ID NO.1或其編碼序列，應(yīng)當(dāng)理解這些序列中每一個(gè)均包含至少一個(gè)以下非編碼SNPt1265c、t1277c，或b)與a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其由部分的a)核苷酸序列SEQ ID NO.1或其編碼序列，應(yīng)當(dāng)理解這些序列中每一個(gè)均包含至少一個(gè)下列編碼SNPc794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277c，或b)與a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成。
該分離的多核苷酸由至少10個(gè)核苷酸組成。
優(yōu)選地，如上定義的分離的多核苷酸由10-40個(gè)核苷酸組成。
本發(fā)明的目的還在于分離的多核苷酸，其編碼的多肽包含a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之間所含氨基酸的氨基酸序列，
應(yīng)當(dāng)理解a)和b)中的每個(gè)氨基酸序列均包含至少一個(gè)下列編碼SNPA42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop、K179E。
應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明意義上，定位A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop、K179E SNP的相應(yīng)編號(hào)是相對(duì)于氨基酸序列SEQ IDNO.2的編號(hào)而言。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選目的，前面定義的多肽包含單個(gè)如上定義的編碼SNP。
優(yōu)選的，本發(fā)明多核苷酸由DNA或RNA分子組成。
本發(fā)明多核苷酸可以利用標(biāo)準(zhǔn)DNA或RNA合成方法獲得。
利用定點(diǎn)誘變從IFNα-21基因的核苷酸序列開(kāi)始，通過(guò)核苷酸序列SEQ ID NO.1中每個(gè)SNP的突變核苷酸修飾野生型核苷酸，同樣可以獲得本發(fā)明的多核苷酸。
例如，利用定點(diǎn)誘變從IFNα-21基因的核苷酸序列開(kāi)始，將核苷酸序列SEQ ID NO.1中794位核苷酸胞嘧啶(c)修飾為核苷酸鳥(niǎo)嘌呤(g)，可以獲得包含SNP c794g的本發(fā)明多核苷酸。
可以這樣應(yīng)用的定點(diǎn)誘變方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。特別提到的是文獻(xiàn)TA Kunkel，1985″Proc.Natl.Acad.Sci.USA″82488。
分離的多核苷酸同樣可以包括，例如編碼前(Pre-)、原(Pro-)或前原(Pre-Pro-)蛋白質(zhì)氨基酸序列或諸如六組氨酸肽等標(biāo)志氨基酸序列的核苷酸序列。
本發(fā)明的多核苷酸同樣可以連接編碼其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的核苷酸序列，以獲得融合蛋白質(zhì)或其它純化產(chǎn)物。
本發(fā)明的多核苷酸同樣可以包括諸如5’和/或3’非編碼序列的核苷酸序列，例如轉(zhuǎn)錄或非轉(zhuǎn)錄序列、翻譯或非翻譯序列、拼接信號(hào)序列、多腺苷酸化序列、核糖體結(jié)合序列乃至穩(wěn)定mRNA的序列。
與核苷酸或多核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列可定義為可以在嚴(yán)格條件下與該核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
″嚴(yán)格雜交條件″一般但不一定理解為可使具有至少80％、優(yōu)選大于或等于90％、更優(yōu)選大于或等于95％、最優(yōu)選大于或等于97％的同一性的核苷酸序列雜交的化學(xué)條件。
可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法獲得嚴(yán)格條件，例如將多核苷酸在包含50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH＝7.6)、5×Denhardt液、10％硫酸葡聚糖和20μg變性鮭精DNA的溶液中，于42℃溫育，然后于0.1×SSC、65℃洗滌濾膜。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，如果該嚴(yán)格條件可使具有100％同一性的核苷酸序列雜交，則認(rèn)為該核苷酸序列與如a)中所述核苷酸序列嚴(yán)格互補(bǔ)。
在本發(fā)明的涵義中可以理解，與一個(gè)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列包含至少一個(gè)本發(fā)明的反義SNP。
因此，舉例來(lái)說(shuō)，如果該核苷酸序列包含SNP c794g，則其互補(bǔ)核苷酸序列在相當(dāng)于794的位置包含胞嘧啶(c)核苷酸。
包含SNP的多核苷酸的鑒定、雜交和/或擴(kuò)增本發(fā)明的目的還在于以下全部或部分的用途a)與核苷酸序列SEQ ID NO.1具有80-100％同一性(優(yōu)選至少90％同一性、更優(yōu)選95％同一性、特別優(yōu)選100％同一性)的多核苷酸，和/或b)包含至少一個(gè)SNP的本發(fā)明多核苷酸以鑒定、雜交和/或擴(kuò)增與核苷酸序列SEQ ID NO.1或必要時(shí)其編碼序列(核苷酸670-1239)具有80-100％同一性(優(yōu)選至少90％同一性、更優(yōu)選95％同一性、特別優(yōu)選100％同一性)的多核苷酸的全部或部分，應(yīng)當(dāng)理解，這些序列中每個(gè)均包含至少一個(gè)下列SNPc794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277c。
基因分型并測(cè)定SNP頻率本發(fā)明的目的同樣在于以下全部或部分的用途a)與核苷酸序列SEQ ID NO.1具有80-100％同一性(優(yōu)選至少90％同一性、更優(yōu)選95％同一性、特別優(yōu)選100％同一性)的多核苷酸，和/或
b)包含至少一個(gè)SNP的本發(fā)明多核苷酸用于與核苷酸序列SEQ ID NO.1或必要時(shí)其編碼序列(核苷酸670-1239)具有80-100％同一性(優(yōu)選至少90％同一性、更優(yōu)選95％同一性、特別優(yōu)選100％同一性)的多核苷酸的全部或部分的基因分型，應(yīng)當(dāng)理解，這些序列中每個(gè)均包含至少一個(gè)下列SNPc794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277c。
根據(jù)本發(fā)明，可以對(duì)個(gè)體或個(gè)體的群體進(jìn)行基因分型。
在本發(fā)明的涵義中，基因分型可定義為用于測(cè)定個(gè)體或個(gè)體群基因型的方法。基因型由存在于一個(gè)或多個(gè)特定座位的等位基因構(gòu)成。
″個(gè)體群″可理解為以隨機(jī)或非隨機(jī)方式選擇的一群個(gè)體。這些個(gè)體可以是人類(lèi)、動(dòng)物、微生物或植物。
個(gè)體群一般包含至少10個(gè)成員，優(yōu)選100-300個(gè)成員。
可以根據(jù)種族或表現(xiàn)型選擇個(gè)體，特別是受以下疾病和/或疾病影響的個(gè)體惡性腫瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病和肝癌、頸癌、頭癌和腎癌、心血管疾病、諸如與免疫系統(tǒng)無(wú)關(guān)的代謝疾病，例如肥胖癥，傳染病，特別是病毒性感染，如乙型肝炎、丙型肝炎和AIDS，肺炎、潰瘍性結(jié)腸炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如阿爾茨海默氏病、精神分裂癥和抑郁癥，組織或器官移植排斥、創(chuàng)傷愈合、透析患者的貧血、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、多發(fā)性硬化、骨質(zhì)疏松癥、銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病、自身免疫疾病和異常、胃腸疾病乃至與化學(xué)治療有關(guān)的疾病。
優(yōu)選對(duì)個(gè)體群進(jìn)行本發(fā)明功能性SNP的基因分型。
現(xiàn)有許多可以用來(lái)進(jìn)行SNP基因分型的技術(shù)(特別參見(jiàn)KwokPharmacogenomics，2000，卷1，95-100頁(yè)，″High-throughputgenotyping assay approaches″)。這些技術(shù)基于以下四原理之一等位基因特異性寡核苷酸雜交、任選在脫氧核苷酸存在下通過(guò)雙脫氧核苷酸的寡核苷酸延伸、等位基因特異性寡核苷酸的連接或等位基因特異性寡核苷酸的斷裂。其中每個(gè)技術(shù)都可與檢測(cè)系統(tǒng)相連，例如直接或偏振熒光測(cè)定、或質(zhì)譜分析。
利用熱ddNTP(由不同熒光團(tuán)標(biāo)記的兩種不同的ddNTP)和冷ddNTP(兩種不同的非標(biāo)記的ddNTP)的微型測(cè)序，結(jié)合偏振熒光掃描儀，可以特別進(jìn)行基因分型。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知利用讀取偏振熒光的微型測(cè)序方法(FP-TDI技術(shù)或熒光偏振模板-直接染料-終止物參入)。
它可以對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增每一個(gè)體DNA后獲得的產(chǎn)物進(jìn)行。選擇包括含所研究SNP的多核苷酸基因區(qū)域的PCR產(chǎn)物。在PCR熱循環(huán)儀的最后步驟之后，將平板置于偏振熒光掃描儀，利用熒光團(tuán)特異性激發(fā)和發(fā)射濾器讀取標(biāo)記堿基。以圖表報(bào)告標(biāo)記堿基的強(qiáng)度值。
就本發(fā)明SNP的PCR擴(kuò)增而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易根據(jù)本發(fā)明SNP的位置，分別選擇有義和反義引物。
例如，用于PCR擴(kuò)增引物的有義和反義核苷酸序列可以分別為SEQ ID NO.3有義引物GGTTCAAGGTTACCCATCTCSEQ ID NO.4反義引物TTTGAAATGGCAGAAGTCAT該核苷酸序列可以擴(kuò)增具有核苷酸序列SEQ ID NO.1中620-1315位核苷酸的696個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段。
然后對(duì)個(gè)體群中由包含SNP的基因編碼的每個(gè)等位基因的頻率(等位頻率)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可確定其影響的重要性及其在不同亞群、特別是必要時(shí)在構(gòu)成該個(gè)體群的不同種群中的分布。
分析基因型數(shù)據(jù)，估計(jì)在所研究群體中觀察到的不同等位基因的分布頻率?？山柚谲浖?，例如SAS-suite(SAS)或SPLUS(MathSoft)，計(jì)算等位頻率。利用軟件ARLEQUIN和SAS-suite，可以比較本發(fā)明SNP在個(gè)體群中不同種群的等位分布。
本發(fā)明SNP作為遺傳標(biāo)志鑒于SNP改變的基因功能性序列(例如啟動(dòng)子、拼接位點(diǎn)、編碼區(qū))很可能與疾病易感性或抗性直接有關(guān)，所有SNP(不論功能性與否)均可能提供用于鑒定與疾病狀態(tài)有關(guān)的一個(gè)或幾個(gè)基因的重要標(biāo)志，從而可能與該疾病狀態(tài)間接相關(guān)(參見(jiàn)Cargill等人(1999).NatureGenetics 22231-238；Riley等人(2000).Pharmacogenomics139-47；Roberts L.(2000).Science 2871898-1899)。
因此，本發(fā)明還涉及包含在IFNα-21基因的多核苷酸的至少一個(gè)下列SNP的數(shù)據(jù)庫(kù)c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277c。
應(yīng)當(dāng)理解，所述SNP根據(jù)核苷酸序列SEQ ID NO.1編號(hào)。
可分析該數(shù)據(jù)庫(kù)，確定以下兩者之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(i)IFNα-21基因多核苷酸中的至少一個(gè)下列SNPc794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277c，以及(ii)疾病或疾病抗性。
本發(fā)明還涉及IFNα-21基因多核苷酸中的至少一個(gè)下列SNP的用途c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277c，用于開(kāi)發(fā)疾病或疾病抗性的診斷/預(yù)后試劑盒。
如上定義的本發(fā)明SNP可直接或間接與疾病或疾病抗性有關(guān)。
優(yōu)選地，這些疾病可能是上文定義的疾病。
表達(dá)載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明目的還在于包含至少一種本發(fā)明多核苷酸的重組載體。
可以使用多種表達(dá)系統(tǒng)，包括而不限于染色體、附加體和衍生病毒。更特別而言，所用重組載體可來(lái)自于細(xì)菌質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、酵母附加體、插入元件、酵母染色體元件、諸如桿狀病毒等病毒、諸如SV40等乳頭狀瘤病毒、痘苗病毒、腺病毒、?？怂苟徊《?fox pox viruses)、假狂犬病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒。
這些重組載體同樣可以是粘?；蚴删Ｑ苌铩？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，例如MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，Sambrook等人，第四版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)中所述方法，將核苷酸序列插入重組表達(dá)載體。
該重組載體可以包括控制多核苷酸表達(dá)調(diào)節(jié)的核苷酸序列、以及可表達(dá)和轉(zhuǎn)錄本發(fā)明多核苷酸、翻譯本發(fā)明多肽的核苷酸序列，根據(jù)所用宿主細(xì)胞選擇這些序列。
因此，例如可以將合適的分泌信號(hào)引入重組載體，以便將本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、周質(zhì)間隙、膜或細(xì)胞外環(huán)境。
本發(fā)明目的還在于包含本發(fā)明重組載體的宿主細(xì)胞。
可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，例如BASIC METHODS INMOLECULAR BIOLOGY，Davis等人，第二版，McGraw-HillProfessional Publishing，1995和MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL(同上)中所述方法，例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、陽(yáng)離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染，將重組載體引入宿主細(xì)胞。
例如，宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞諸如鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌(E.coli)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)細(xì)胞，真菌細(xì)胞諸如酵母細(xì)胞和曲霉菌屬、鏈霉菌屬細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞諸如果蠅S2和Spodoptera Sf9細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞諸如CHO、COS、HeLa、C127、BHK、HEK 293細(xì)胞，以及所治療受試者的人類(lèi)細(xì)胞乃至植物細(xì)胞。
例如，可用來(lái)表達(dá)本發(fā)明多肽或作為藥物組合物中活性產(chǎn)物的宿主細(xì)胞參見(jiàn)下文。
多肽本發(fā)明目的還在于分離的多肽，其包含與以下序列具有至少80％同一性、優(yōu)選至少90％同一性、更優(yōu)選至少95％同一性、更加優(yōu)選至少99％同一性的氨基酸序列a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之間所含氨基酸的氨基酸序列，應(yīng)當(dāng)理解，a)和b)中的每個(gè)氨基酸序列均包含至少一個(gè)下列編碼SNPA42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop、K179E。
本發(fā)明的多肽同樣可以包含a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之間所含氨基酸的氨基酸序列，
應(yīng)當(dāng)理解，a)和b)中的每個(gè)氨基酸序列均包含至少一個(gè)下列編碼SNPA42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop、K179E。
本發(fā)明的多肽可以更特別由以下序列組成a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之間所含氨基酸的氨基酸序列，應(yīng)當(dāng)理解，a)和b)中的每個(gè)氨基酸序列均包含至少一個(gè)下列編碼SNPA42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop、K179E。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽包含選自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的單個(gè)編碼SNP。
本發(fā)明的目的同樣在于制備上述多肽的方法，其中在培養(yǎng)基中培養(yǎng)前面定義的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)基中分離該多肽。
按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，例如利用諸如鹽、特別是硫酸銨、乙醇、丙酮或三氯乙酸等離液劑沉淀；酸提??；離子交換層析；磷酸纖維素層析；疏水作用層析；親合層析；羥基磷灰石層析或排阻層析，可以從宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化所述多肽。
″培養(yǎng)基″可理解為從中分離或純化本發(fā)明多肽的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基可以由細(xì)胞外培養(yǎng)基和/或細(xì)胞裂解物組成。如果該多肽的構(gòu)象在分離或純化期間改變，同樣可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法恢復(fù)該多肽的活性構(gòu)象。
抗體本發(fā)明的目的還在于獲得免疫特異性抗體的方法。
″抗體″可理解為包括單克隆、多克隆、嵌合、單鏈、人源化抗體以及Fab片段，包括Fab或免疫球蛋白表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)物。
利用本發(fā)明的多肽免疫動(dòng)物，可以獲得免疫特異性抗體。
本發(fā)明還涉及前面定義的本發(fā)明多肽的免疫特異性抗體。
本發(fā)明的多肽、其片段之一、類(lèi)似物、其變體之一或表達(dá)該多肽的細(xì)胞，也可以用來(lái)產(chǎn)生免疫特異性抗體。
術(shù)語(yǔ)″免疫特異性″是指該抗體對(duì)于本發(fā)明的多肽比對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)已知的其它多肽具有更好的親合力。
按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，將本發(fā)明的多肽、其片段之一、類(lèi)似物或表位片段、或表達(dá)該多核苷酸的細(xì)胞給予哺乳動(dòng)物、優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物，可以獲得免疫特異性抗體。
為制備單克隆抗體，可以從細(xì)胞系開(kāi)始，使用抗體制備的典型方法，例如雜交瘤技術(shù)(Kohler等人，Nature(1975)256495-497)，三源雜交瘤(trioma)技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，Immunology Today(1983)472)以及EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等人，″The EBV-hybridoma technique and its application to human lungcancer，″Monoclonal Ant ibodies and Cancer Therapy(27卷，UCLASymposia on Molecular and Cellular Biology，New Series)(R.A.Reisfeld和S.Sell編著)，77-96頁(yè)，Alan R.Liss，Inc.N.Y.，1985，pp.77-96)。
同樣可以使用單鏈抗體制備技術(shù)，例如美國(guó)專(zhuān)利4,946,778所述。
諸如小鼠等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物同樣可以用來(lái)制備人源化抗體。
與本發(fā)明多肽相互作用的試劑本發(fā)明的目的同樣在于鑒定活化或抑制本發(fā)明多肽的試劑的方法，其包含a)制備包含本發(fā)明的含有至少一個(gè)SNP的多核苷酸的重組載體，b)制備包含a)中重組載體的宿主細(xì)胞，c)將b)中宿主細(xì)胞接觸待測(cè)試劑，以及d)確定待測(cè)試劑產(chǎn)生的活化或抑制作用。
本發(fā)明的多肽還可以用于篩選與其相互作用的化合物的方法。
這些化合物可以是本發(fā)明多肽固有活性的活化劑(激動(dòng)劑)或抑制劑(拮抗劑)。這些化合物同樣可以是本發(fā)明多肽的配基或底物。參見(jiàn)Coligan等人，Current Protocols in Immunology 1(2)，Chapter 5(1991)。
一般而言，為實(shí)施上述方法，最理想的是制備表達(dá)本發(fā)明多肽的合適的宿主細(xì)胞。上述細(xì)胞可以是，例如哺乳動(dòng)物、酵母、昆蟲(chóng)(例如果蠅)或細(xì)菌(例如大腸桿菌)的細(xì)胞。
然后將這些細(xì)胞或這些細(xì)胞的膜提取物置于待測(cè)化合物的存在下。
然后觀察該待測(cè)化合物與本發(fā)明多肽的結(jié)合力以及對(duì)功能性反應(yīng)的抑制或活化作用。
使用直接或間接標(biāo)記的待測(cè)試劑，可以進(jìn)行上述方法的步驟d)。還可以包括一個(gè)使用標(biāo)記或非標(biāo)記的試劑以及標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)劑的競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)。
同樣可以利用根據(jù)待檢信號(hào)而適當(dāng)選擇的檢測(cè)方法，確定待檢試劑是否對(duì)表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞產(chǎn)生活化或抑制信號(hào)。
上述活化或抑制劑可以是多核苷酸、在某些情況下是寡核苷酸或多肽，例如蛋白質(zhì)或抗體。
本發(fā)明的目的還在于鑒定受本發(fā)明多肽活化或抑制的試劑的方法，其包含a)制備包含本發(fā)明的含有至少一個(gè)SNP的多核苷酸的重組載體，b)制備包含a)中重組載體的宿主細(xì)胞，c)將b)中宿主細(xì)胞置于待測(cè)試劑的存在下，以及d)確定該多肽對(duì)待測(cè)試劑產(chǎn)生的活化或抑制作用。
受本發(fā)明多肽活化或抑制的試劑是在該多肽存在下，分別對(duì)活化或抑制反應(yīng)的試劑。受本發(fā)明多肽直接或間接活化或抑制的試劑可以由多肽例如膜或核受體、激酶并更優(yōu)選酪氨酸激酶、轉(zhuǎn)錄因子或多核苷酸組成。
疾病檢測(cè)本發(fā)明目的還在于分析受試者中本發(fā)明多核苷酸和/或本發(fā)明多肽的生物學(xué)特性的方法，其包含以下至少一項(xiàng)a)確定受試者基因組中存在或缺少本發(fā)明的多核苷酸；b)確定受試者中本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)水平；c)確定在受試者中存在或缺少本發(fā)明的多肽；d)確定在受試者中本發(fā)明多肽的濃度；和/或
e)確定受試者中本發(fā)明多肽的功能性。
可分析受試者或受試者樣品中這些生物學(xué)特性。
這些生物學(xué)特性可進(jìn)行遺傳診斷和確定受試者是否患有與存在本發(fā)明多核苷酸和/或本發(fā)明多肽有關(guān)的疾病、不適或病癥，或具有患有疾病、不適或病癥的危險(xiǎn)，或反之具有對(duì)疾病、不適或病癥形成的部分抗性。
這些疾病可以是病癥和/或人類(lèi)疾病，例如癌癥和腫瘤、傳染病、性病、免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫疾病和病癥、心血管疾病、代謝疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、以及與化學(xué)治療有關(guān)的疾病。
所述癌癥和腫瘤包括，包含轉(zhuǎn)移的腎癌、黑色素瘤的惡性腫瘤、包含濾泡性淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛樣細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性骨髓性白血病的白血病、肝癌、頸癌、頭癌和腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、類(lèi)癌瘤以及包含AIDS情況下的Kaposi肉瘤在內(nèi)的伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤。
所述傳染病包括病毒性傳染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相關(guān)疾病可能包括組織或器官移植排斥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病以及潰瘍性結(jié)腸炎。
所述代謝疾病可能包括上述非免疫相關(guān)性疾病，例如肥胖癥。
所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂癥和抑郁癥。
所述疾病和病癥還可能包括創(chuàng)傷愈合、透析患者的貧血以及骨質(zhì)疏松癥。
該方法還可遺傳診斷受試者中與存在本發(fā)明SNP編碼的突變等位基因有關(guān)的疾病或疾病抗性。
優(yōu)選在步驟a)中檢測(cè)包含前面定義的至少一個(gè)編碼SNP的多核苷酸的存在與否。
可以從所研究受試者的生物樣品(例如細(xì)胞、血液、尿、唾液)、或其活檢或尸檢樣品開(kāi)始，檢測(cè)該多核苷酸。例如，可使用基因組DNA直接或于PCR擴(kuò)增后進(jìn)行檢測(cè)。同樣可按類(lèi)似方式使用RNA或cDNA。
然后可將本發(fā)明多核苷酸的核苷酸序列與受試者基因組中檢測(cè)到的核苷酸序列作比較。
可以通過(guò)測(cè)序、DNA雜交方法、DNA片段在有或無(wú)變性劑的電泳凝膠中的遷移率差異、或解鏈溫度差異，進(jìn)行核苷酸序列的比較。參見(jiàn)Myers等人，Science(1985)2301242。利用核酸酶保護(hù)試驗(yàn)(例如RNase和S1核酸酶)或化學(xué)裂解劑，同樣可以揭示核苷酸序列精確位點(diǎn)的上述結(jié)構(gòu)改變。參見(jiàn)Cotton等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(1985)854397-4401。同樣可以利用包含本發(fā)明多核苷酸片段的寡核苷酸探針進(jìn)行篩選。
許多為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法可用于確定本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)，并鑒定這些多核苷酸的遺傳變異性(參見(jiàn)Chee等人，Science(1996)，Vol 274，pp 610-613)。
在步驟b)中，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，例如PCR、RT-PCR、RNase保護(hù)、Northern印跡及其它雜交方法，定量該多核苷酸編碼的RNA(及編碼多肽)的水平，可測(cè)定該多核苷酸的表達(dá)水平。
在步驟c)和d)中，利用公知的方法，例如放射免疫測(cè)定、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)、Western印跡和ELISA試驗(yàn)，可以測(cè)定本發(fā)明多肽在受試者或來(lái)自受試者樣品中的存在與否及其濃度。
步驟d)之后，測(cè)定的本發(fā)明多肽的濃度可與通常在受試者中發(fā)現(xiàn)的天然野生型蛋白質(zhì)的濃度相比。
本領(lǐng)域技術(shù)人員借助于現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)或諸如前述常規(guī)試驗(yàn)或測(cè)定，可以確定對(duì)以上所致疾病、不適或病癥表現(xiàn)出敏感性或反之抗性的高低閾值。
在步驟e)中，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，例如上述體外試驗(yàn)，或使用表達(dá)本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞，可以測(cè)定本發(fā)明多肽的功能性。
治療性化合物及疾病治療本發(fā)明的目的還在于包含本發(fā)明多肽作為活性劑的治療性化合物。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明多肽的用途，用于制備意在預(yù)防或治療各種人類(lèi)病癥和/或疾病的治療性化合物。這些疾病可以是病癥和/或人類(lèi)疾病，例如癌癥和腫瘤、傳染病、性病、免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫疾病和異常、心血管疾病、代謝疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、以及與化學(xué)治療有關(guān)的病癥。
所述癌癥和腫瘤包括，包含轉(zhuǎn)移的腎癌、黑色素瘤的惡性腫瘤、包含濾泡性淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛樣細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性骨髓性白血病的白血病、肝癌、頸癌、頭癌和腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、類(lèi)癌瘤以及包含AIDS情況下的Kaposi肉瘤的伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤。
所述傳染病包括病毒性傳染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相關(guān)疾病可能包括組織或器官移植排斥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病以及潰瘍性結(jié)腸炎。
所述代謝疾病可能包括上述非免疫相關(guān)性疾病，例如肥胖癥。
所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂癥和抑郁癥。
所述疾病和病癥還可能包括創(chuàng)傷愈合、透析患者的貧血以及骨質(zhì)疏松癥。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽還可以用于制備意在預(yù)防或治療各種人類(lèi)病癥和/或疾病的治療性化合物，例如某些病毒性感染，如乙型和丙型慢性肝炎，白血病例如毛樣細(xì)胞白血病和慢性骨髓性白血病，多發(fā)性骨髓瘤、濾泡性淋巴瘤、類(lèi)癌瘤、惡性黑色素瘤、轉(zhuǎn)移性腎癌、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病以及伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤，例如在AIDS情況下的Kaposi肉瘤、以及生殖器疣或性病。
可以獲得本發(fā)明多肽的某些化合物以及通過(guò)或由該多肽獲得或鑒定的化合物同樣可以作為治療性化合物，用于治療人體。
正因?yàn)槿绱耍景l(fā)明的目的還在于包含含有至少一個(gè)前面定義的編碼SNP的本發(fā)明多核苷酸、前面定義的重組載體、前面定義的宿主細(xì)胞、和/或前面定義的抗體作為活性劑的藥物。
本發(fā)明還涉及包含至少一個(gè)前面定義的編碼SNP的本發(fā)明多核苷酸、前面定義的重組載體、前面定義的宿主細(xì)胞、和/或前面定義的抗體的用途，用于制備意在預(yù)防或治療各種人類(lèi)病癥和/或疾病的藥物。這些疾病可以是病癥和/或人類(lèi)疾病，例如癌癥和腫瘤、傳染病、性病、免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫疾病和病癥、心血管疾病、代謝疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、以及與化學(xué)治療有關(guān)的疾病。
所述癌癥和腫瘤包括，包含轉(zhuǎn)移的腎癌、黑色素瘤的惡性腫瘤、包含濾泡性淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛樣細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性骨髓性白血病在內(nèi)的白血病、肝癌、頸癌、頭癌和腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、類(lèi)癌瘤以及包含AIDS情況下的Kaposi肉瘤的伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤。
所述傳染病包括病毒性傳染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相關(guān)疾病可能包括組織或器官移植排斥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病以及潰瘍性結(jié)腸炎。
所述代謝疾病可能包括上述非免疫相關(guān)性疾病，例如肥胖癥。
所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂癥和抑郁癥。
所述疾病和病癥還可能包括創(chuàng)傷愈合、透析患者的貧血以及骨質(zhì)疏松癥。
優(yōu)選地，本發(fā)明涉及包含至少一個(gè)前面定義的SNP的本發(fā)明多核苷酸、前面定義的重組載體、前面定義的宿主細(xì)胞、和/或前面定義的抗體的用途，用于制備意在預(yù)防或治療各種人類(lèi)病癥和/或疾病的藥物，例如某些病毒性感染，如乙型和丙型慢性肝炎，白血病例如毛樣細(xì)胞白血病和慢性骨髓性白血病，多發(fā)性骨髓瘤、濾泡性淋巴瘤、類(lèi)癌瘤、惡性黑色素瘤、轉(zhuǎn)移性腎癌、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病以及伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤，例如在AIDS情況下的Kaposi肉瘤，以及生殖器疣或性病。
本發(fā)明用作活性劑的多肽和其它化合物的劑量取決于所選擇的化合物、治療適應(yīng)癥、給藥方式、制劑性質(zhì)、受試者性質(zhì)及醫(yī)生的判斷。
用作活性劑時(shí)，一般按1-100μg/kg受試者的劑量給予本發(fā)明的多肽。
本發(fā)明的目的還在于藥物組合物，其包含至少一種上述化合物，例如本發(fā)明的多肽、包含至少一個(gè)前面定義的SNP的本發(fā)明多核苷酸、前面定義的重組載體、前面定義的宿主細(xì)胞、和/或前面定義的抗體作為活性劑，以及藥物可接受的賦形劑。
該活性劑有利地以生理有效劑量存在于這些藥物組合物中。
例如，這些藥物組合物可以是固體或液體，并以目前用于人類(lèi)醫(yī)學(xué)的藥物形式存在，例如簡(jiǎn)單或包衣片劑、軟膠囊(gelcap)、顆粒劑、焦糖劑、栓劑、優(yōu)選可注射制劑和可注射用粉末?？梢园凑粘Ｓ梅椒ㄖ苽溥@些藥物形式。
活性劑可以摻入通常用于藥物組合物的賦形劑，例如滑石粉、阿拉伯膠、乳糖、淀粉、葡萄糖、甘油、乙醇、硬脂酸鎂、可可脂、含水或無(wú)水載體、動(dòng)物或植物來(lái)源的脂質(zhì)、石蠟衍生物、乙二醇、各種濕潤(rùn)劑、分散劑或乳化劑、防腐劑。
本發(fā)明的活性劑可以單獨(dú)使用或與其它化合物聯(lián)用，例如治療性化合物，諸如白細(xì)胞介素或干擾素等其它細(xì)胞因子。
根據(jù)給藥方式，調(diào)整該藥物組合物的不同劑型。
可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同給藥途徑，給予該藥物組合物。
本發(fā)明的目的同樣在于診斷性組合物，其包含至少一種上述化合物(例如本發(fā)明的多肽、本發(fā)明多核苷酸的全部或部分、前面定義的重組載體、前面定義的宿主細(xì)胞、和/或前面定義的抗體)作為活性劑，以及合適的藥物可接受的賦形劑。
該診斷性組合物可包含，例如一般用于診斷性組合物的合適的賦形劑，諸如緩沖液和防腐劑。
本發(fā)明的目的同樣在于下列的用途a)治療有效量的本發(fā)明多肽，和/或b)本發(fā)明的多核苷酸，和/或c)前面定義的來(lái)自所需治療受試者的宿主細(xì)胞，以制備意在增加本發(fā)明多肽在受試者中表達(dá)或活性的治療性化合物。
因此，為治療需要增加本發(fā)明多肽表達(dá)或活性的受試者，可能有幾種方法。
可給予受試者治療有效量的本發(fā)明多肽，連同藥物可接受的賦形劑。
還可通過(guò)給予受試者本發(fā)明的多核苷酸，增加本發(fā)明多肽的內(nèi)源性生成。例如，可以將該多核苷酸插入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。利用包含編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體感染細(xì)胞，以使轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生包含目的基因的感染性病毒顆粒，可以從該細(xì)胞開(kāi)始分離上述載體。參見(jiàn)Human Molecular Genetics，Strachan和Read，第20章，Gene Therapy and other Molecular Genetic-based TherapeuticApproaches，BIOS Scientifics Publishers Ltd(1996)。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用如上定義的包含至少一個(gè)編碼SNP的多核苷酸。
同樣可給予受試者屬于自身的宿主細(xì)胞，預(yù)先取出這些宿主細(xì)胞，并如前所述進(jìn)行修飾，使其表達(dá)本發(fā)明多肽。
本發(fā)明同樣涉及a)治療有效量的前面定義的免疫特異性抗體，和/或b)可抑制本發(fā)明多核苷酸表達(dá)的多核苷酸的用途，以便制備意在降低本發(fā)明多肽在受試者中表達(dá)或活性的治療性化合物。
因此，可給予受試者治療有效量的諸如前面定義的抑制劑和/或抗體，可能聯(lián)用，連同藥物可接受的賦形劑。
通過(guò)給予受試者可抑制本發(fā)明多核苷酸表達(dá)的本發(fā)明的互補(bǔ)多核苷酸，同樣有可能降低本發(fā)明多肽的內(nèi)源性生成。
優(yōu)選使用如上定義的包含至少一個(gè)編碼SNP的互補(bǔ)多核苷酸。
本發(fā)明還涉及IFNα-21蛋白質(zhì)在制備藥物中的用途，用于預(yù)防或治療具有IFNα-21變體所致病癥或疾病的患者，該變體與該患者基因組存在與核苷酸序列SEQ ID NO.1具有至少95％同一性(優(yōu)選97％同一性、更優(yōu)選99％同一性、特別優(yōu)選100％同一性)的核苷酸序列有關(guān)，只要該核苷酸序列包含下列SNP之一c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277c。
優(yōu)選地，該藥物用于預(yù)防或治療選自下列之一的疾病癌癥和腫瘤、傳染病、性病、免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫疾病和病癥、心血管疾病、代謝疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及與化學(xué)治療有關(guān)的疾病。
所述癌癥和腫瘤包括，包含轉(zhuǎn)移的腎癌、黑色素瘤的惡性腫瘤、包含濾泡性淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛樣細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性骨髓性白血病的白血病、肝癌、頸癌、頭癌和腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、類(lèi)癌瘤以及包含AIDS情況下的Kaposi肉瘤的伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤。
所述傳染病包括病毒性傳染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相關(guān)疾病可能包括組織或器官移植排斥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病以及潰瘍性結(jié)腸炎。
所述代謝疾病可能包括上述非免疫相關(guān)性疾病，例如肥胖癥。
所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂癥和抑郁癥。
所述疾病和病癥還可能包括創(chuàng)傷愈合、透析患者的貧血以及骨質(zhì)疏松癥。
包含本發(fā)明SNP的IFNα-21多肽的類(lèi)似(mimetic)化合物本發(fā)明還涉及具有與下列多肽基本類(lèi)似的生物活性的新化合物a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之間所含氨基酸的氨基酸序列；只要a)和b)中所述氨基酸序列包含SNP K179E。
例如，如實(shí)驗(yàn)部分所述，通過(guò)測(cè)定刺激樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的能力、CD4+或CD8+T淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、單核細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、體外或體內(nèi)抗病毒活性、對(duì)Daudi Burkitt細(xì)胞系的細(xì)胞抗增殖活性、對(duì)TF-1細(xì)胞系的細(xì)胞抗增殖活性，可評(píng)價(jià)所述生物活性。
如實(shí)驗(yàn)部分所述，K179E突變型IFNα-21在下列方面不同于野生型IFNα-2*K179E突變型IFNα-21具有較強(qiáng)的刺激樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的能力；*K179E突變型IFNα-21具有較強(qiáng)的刺激CD4+或CD8+T淋巴細(xì)胞釋放IFN-γ的能力；*K179E突變型IFNα-21在感染VSV的細(xì)胞培養(yǎng)物中具有低于野生型IFNα-2的抗病毒活性。
如實(shí)驗(yàn)部分所述，K179E突變型IFNα-21對(duì)Daudi Burkitt細(xì)胞系具有略微低于天然野生型IFNα-21的細(xì)胞抗增殖活性。
同樣如實(shí)驗(yàn)部分所述，K179E突變型IFNα-21對(duì)TF-1細(xì)胞系具有類(lèi)似于野生型IFNα-2的細(xì)胞抗增殖活性，在EMCV小鼠模型中具有類(lèi)似于野生型IFNα-2的抗病毒活性。
如上定義的本發(fā)明的新化合物可能具有基本上類(lèi)似于K179E突變型IFNα-21的生物活性。
根據(jù)所研究的生物活性類(lèi)型，所述化合物可能還具有低于或高于K179E突變型IFNα-21的生物活性。
所述化合物可能是生物化學(xué)化合物，例如多肽或肽，或有機(jī)化學(xué)化合物，例如合成肽類(lèi)似物。
本發(fā)明還涉及包含K179E SNP的本發(fā)明多肽在鑒定如上定義的化合物中的用途。
本發(fā)明還涉及鑒定本發(fā)明化合物的方法，其包含以下步驟a)確定待測(cè)化合物的生物活性，例如樹(shù)突狀細(xì)胞成熟、CD4+或CD8+T淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、單核細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、體外或體內(nèi)抗病毒活性、對(duì)Daudi Burkitt細(xì)胞系的細(xì)胞抗增殖活性；b)比較i)步驟a)測(cè)定的待測(cè)化合物的活性，與ii)氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽的活性，或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之間所含氨基酸的氨基酸序列的活性；只要該氨基酸序列包含K179E SNP；以及c)根據(jù)步驟b)中進(jìn)行的比較，確定該待測(cè)化合物是否具有比氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽、或與包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位所含氨基酸的氨基酸序列基本類(lèi)似、或低、或高的活性；只要該氨基酸序列包含K179E SNP。
優(yōu)選該待測(cè)化合物可能預(yù)先鑒定自合成肽組合文庫(kù)、高通量篩選、或由計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)而設(shè)計(jì)，以具有與氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽、或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位所含氨基酸的氨基酸序列相同的三維結(jié)構(gòu)；只要該氨基酸序列包含K179E SNP。
本發(fā)明還涉及具有與下列多肽基本類(lèi)似的生物活性的新化合物a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之間所含氨基酸的氨基酸序列；只要a)和b)中所述氨基酸序列包含SNP Q114H和V127D。
例如，如實(shí)驗(yàn)部分所述，通過(guò)測(cè)定刺激樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的能力、CD4+或CD8+T淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、單核細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、體外或體內(nèi)抗病毒活性、對(duì)Daudi Burkitt細(xì)胞系的細(xì)胞抗增殖活性、對(duì)TF-1細(xì)胞系的細(xì)胞抗增殖活性，可評(píng)價(jià)所述生物活性。
如實(shí)驗(yàn)部分所述，包含SNP Q114H和V127D兩者的IFNα-21(所述雙突變下文記作″Q114H/V127D″)在下列方面不同于野生型IFNα-2
*Q114H/V127D突變型IFNα-21具有較高的刺激CD4+或CD8+T淋巴細(xì)胞釋放IFN-γ的能力；*Q114H/V127D突變型IFNα-21在感染VSV的細(xì)胞培養(yǎng)物中具有較低的抗病毒活性如實(shí)驗(yàn)部分所述，Q114H/V127D突變型IFNα-21對(duì)Daudi Burkitt細(xì)胞系具有低于天然野生型IFNα-21的細(xì)胞抗增殖活性。
同樣如實(shí)驗(yàn)部分所述，Q114H/V127D突變型IFNα-21在EMCV小鼠模型中具有類(lèi)似于野生型IFNα-2的抗病毒活性、類(lèi)似于野生型IFNα-2的刺激單核細(xì)胞釋放IL-10、IL-12和TNF-α的能力、以及類(lèi)似于野生型IFNα-2的對(duì)TF-1細(xì)胞系的細(xì)胞抗增殖活性。
如上定義的本發(fā)明新化合物可能具有基本類(lèi)似于Q114H/V127D突變型IFNα-21的生物活性。
根據(jù)所研究的生物活性類(lèi)型，所述化合物可能還具有低于或高于Q114H/V127D突變型IFNα-21的生物活性。
所述化合物可能是生物化學(xué)化合物，例如多肽或肽，或有機(jī)化學(xué)化合物，例如合成肽類(lèi)似物。
本發(fā)明還涉及包含Q114H/V127D SNP的本發(fā)明多肽在鑒定如上定義的化合物中的用途。
本發(fā)明還涉及鑒定本發(fā)明化合物的方法，其包含以下步驟a)確定生物活性，例如樹(shù)突狀細(xì)胞成熟、CD4+或CD8+T淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、單核細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、體外或體內(nèi)抗病毒活性、對(duì)Daudi Burkitt細(xì)胞系的細(xì)胞抗增殖活性；b)比較i)步驟a)測(cè)定的待測(cè)化合物的活性，與ii)氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽的活性，或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之間所含氨基酸的氨基酸序列的活性；只要該氨基酸序列包含Q114H/V127D SNP；以及c)根據(jù)步驟b)中進(jìn)行的比較，確定該待測(cè)化合物是否具有與氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽、或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位所含氨基酸的氨基酸序列基本類(lèi)似、或更低、或更高的活性；只要該氨基酸序列包含Q114H/V127D SNP。
優(yōu)選該待測(cè)化合物可能預(yù)先鑒定自合成肽組合文庫(kù)、高通量篩選、或由計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)而設(shè)計(jì)，以具有與氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽、或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位所含氨基酸的氨基酸序列相同的三維結(jié)構(gòu)；只要該氨基酸序列包含Q114H/V127DSNP。
鑒定和設(shè)計(jì)化合物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
例如，關(guān)于這些方法的文獻(xiàn)可能有-Silverman R.B.(1992).″Organic Chemistry of Drug Designand Drug Action″.Academic Press，1st edition(January 15，1992).
-Anderson S和Chiplin J.(2002).″Structural genomics；shaping the future of drug design″Drug Discov.Today.7(2)105-107.
-Selick HE，Beresford AP，Tarbit MH.(2002).″The emergingimportance of predictive ADME simulation in drug discovery″.Drug Discov.Today.7(2)109-116.
-Burbidge R，Trotter M，Buxton B，Holden S.(2001).″Drugdesign by machine learningsupport vector machines forpharmaceutical data analysis″.Comput.Chem.26(1)5-14.
-Kauvar L.M.(1996).″Peptide mimetic drugsa comment onprogress and prospects″14(6)709.
本發(fā)明的藥物可用于制備意在預(yù)防或治療選自下列疾病之一的藥物癌癥和腫瘤、傳染病、性病、免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫疾病和病癥、心血管疾病、代謝疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及與化學(xué)治療有關(guān)的疾病。
所述癌癥和腫瘤包括，包含轉(zhuǎn)移的腎癌、黑色素瘤的惡性腫瘤、包含濾泡性淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛樣細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性骨髓性白血病的白血病、肝癌、頸癌、頭癌和腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、類(lèi)癌瘤以及包含AIDS情況下的Kaposi肉瘤在內(nèi)的伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤。
所述傳染病包括病毒性傳染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相關(guān)疾病可能包括組織或器官移植排斥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病以及潰瘍性結(jié)腸炎。
所述代謝疾病可能包括上述非免疫相關(guān)性疾病，例如肥胖癥。
所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂癥和抑郁癥。
所述疾病和病癥還可能包括創(chuàng)傷愈合、透析患者的貧血以及骨質(zhì)疏松癥。
本發(fā)明的化合物可能用于制備意在預(yù)防或治療選自下列疾病的藥物某些病毒性感染，如乙型和丙型慢性肝炎，白血病例如毛樣細(xì)胞白血病和慢性骨髓性白血病，多發(fā)性骨髓瘤、濾泡性淋巴瘤、類(lèi)癌瘤、惡性黑色素瘤、轉(zhuǎn)移性腎癌、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病以及伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤，例如在AIDS情況下的Kaposi肉瘤，以及生殖器疣或性病。
實(shí)驗(yàn)部分實(shí)施例1包含SNP c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g的核苷酸序列的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)以及野生型參考基因的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的模建。
第一步，從得自PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(編碼1ITF)的IFNα-2結(jié)構(gòu)開(kāi)始，利用軟件Modeler(MSI，San Diego，CA)，構(gòu)建IFNα-21的三維結(jié)構(gòu)。
然后修飾該成熟多肽的片段，以便復(fù)制突變A19G、Q79K、Q91H、V104D、C139stop和K156E。
利用程序AMBER和DISCOVER(MSIMolecular SimulationsInc.)，對(duì)該突變片段進(jìn)行1000次分子最小化步驟。
然后利用相同程序和相同勢(shì)場(chǎng)，進(jìn)行兩次分子動(dòng)態(tài)計(jì)算運(yùn)行。
在所有情況下，于300°K計(jì)算50,000步，由300個(gè)平衡步終止。
模建結(jié)果由圖1、2、3、4和5所示。
實(shí)施例2個(gè)體群中SNP c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g的基因分型SNP的基因分型是根據(jù)微型測(cè)序原理，其中通過(guò)讀取偏振熒光進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)。該技術(shù)由熒光微型測(cè)序(FP-TDI技術(shù)或熒光偏振模板直接染料終止物摻入)組成。
對(duì)群體中每一個(gè)體基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行微型測(cè)序。選擇PCR產(chǎn)物，使其包括含待基因分型的SNP的基因區(qū)域。去除未使用的PCR引物以及未摻入的dNTP，然后進(jìn)行微型測(cè)序。
微型測(cè)序包含利用聚合酶和熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸，延長(zhǎng)位于SNP位點(diǎn)緊上游的寡核苷酸引物。通過(guò)讀取偏振熒光，直接分析該延伸過(guò)程產(chǎn)生的產(chǎn)物。
所有這些步驟及讀取，均在同一PCR平板上進(jìn)行。
因此，基因分型需要5個(gè)步驟1)PCR擴(kuò)增2)利用酶促消化純化PCR產(chǎn)物3)寡核苷酸引物延伸4)讀取5)解讀每一SNP c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g均在相同條件下進(jìn)行基因分型步驟1和2。步驟3、4和5針對(duì)其中每一多態(tài)性是特異的。
1)從來(lái)自不同種族來(lái)源的268位個(gè)體的基因組DNA開(kāi)始，進(jìn)行IFNα-21基因核苷酸序列的PCR擴(kuò)增。
美國(guó)Coriell Institute提供了這些基因組DNA。
該268位個(gè)體分布如下
來(lái)自其中每一個(gè)體的基因組DNA構(gòu)成一個(gè)樣品。
所有SNP的PCR擴(kuò)增均開(kāi)始于下列引物SEQ ID NO.5有義引物GGTTCAAGGTTACCCATCTCSEQ ID NO.6反義引物TTTGAAATGGCAGAAGTCAT這些核苷酸序列可以擴(kuò)增具有核苷酸序列SEQ ID NO.1中620-1315位核苷酸的696個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段。
每個(gè)SNP均以PCR產(chǎn)物作為微型測(cè)序的模板。
每個(gè)樣品PCR反應(yīng)的總反應(yīng)體積為5μl。
該反應(yīng)體積由下表所示試劑組成
這些試劑分布于ABGene提供的具有384孔的黑色PCR平板中(refTF-0384-k)。將該平板密封、離心，然后置于用于384孔平板的熱循環(huán)儀(MJ Research的Tetrad)，進(jìn)行下列溫育PCR循環(huán)94℃1分鐘，繼之以3個(gè)步驟的36個(gè)循環(huán)(94℃ 15秒、56℃ 30秒、68℃1分鐘)。
2)然后利用兩種酶蝦堿性磷酸酶(SAP)和核酸外切酶I(Exo I)純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。其中第一種酶使PCR擴(kuò)增期間未摻入的dNTP去磷酸化，第二種酶去除單鏈DNA殘基，特別是PCR期間未使用的引物。
在PCR平板的每個(gè)孔中，每種樣品加入5μl反應(yīng)混合物，進(jìn)行消化。該反應(yīng)混合物由以下試劑組成
加樣后，將平板密封、離心，然后置于用于384孔平板的熱循環(huán)儀(MJ Research的Tetrad)，進(jìn)行下列溫育SAP-EXO消化37℃ 45分鐘、80℃ 15分鐘。
加入每個(gè)制備的樣品5μl反應(yīng)混合物，對(duì)消化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行延伸或微型測(cè)序步驟。
微型測(cè)序步驟3)、讀取步驟4)以及解讀步驟5)針對(duì)每一SNPc794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g是特異的。
下文描述了所有這些步驟，詳述了其中每個(gè)多態(tài)性所使用的特定條件。
3)微型測(cè)序根據(jù)對(duì)應(yīng)于位于本發(fā)明SNP位點(diǎn)上游的核苷酸序列，確定基因分型所需的兩個(gè)微型測(cè)序引物的序列。包含該SNP的PCR產(chǎn)物是雙鏈DNA產(chǎn)物，因此可以對(duì)有義鏈或反義鏈進(jìn)行基因分型。所選引物由LifeTechnologies Inc制備。
下表顯示針對(duì)每一SNP已經(jīng)測(cè)試的微型測(cè)序的引物序列以及用于基因分型的最佳條件
首先利用16個(gè)樣品驗(yàn)證SNP的微型測(cè)序，然后對(duì)由268位個(gè)體和10個(gè)對(duì)照組成的一組個(gè)體群進(jìn)行基因分型。
然后如下表所示，進(jìn)行延伸或微型測(cè)序步驟
15X延伸緩沖液由250mM Tris-HCl pH9、250mM KCl、25mMNaCl、10mM MgCl2和40％甘油組成。
2對(duì)于ddNTP，根據(jù)研究的多態(tài)性使用4種堿基的混合物。只有構(gòu)成功能性SNP的2種目的堿基(野生型核苷酸/突變的核苷酸)標(biāo)記Tamra或R110。例如對(duì)于SNP c973a，ddNTP的混合物由以下組成-2.5μM未標(biāo)記ddCTP，-2.5μM未標(biāo)記ddATP，-2.5μM ddTTP(1.875μM未標(biāo)記ddTTP以及0.625μM Tamra標(biāo)記的ddTTP)，-2.5μM ddGTP(1.875μM未標(biāo)記ddGTP以及0.625μM R110標(biāo)記的ddGTP)。
加樣后，將平板密封、離心，然后置于用于384孔平板的熱循環(huán)儀(MJ Research的Tetrad)，進(jìn)行下列溫育延伸循環(huán)93℃ 1分鐘、繼之以35個(gè)由2個(gè)步驟組成的循環(huán)(93℃ 10秒、55℃ 30秒)。
在熱循環(huán)儀最后步驟之后，將平板直接置于LJL Biosystems Inc的AnalystHT型偏振熒光閱讀儀。利用Criterion Host軟件，通過(guò)兩種方法讀取平板。第一種方法可利用Tamra特異性的發(fā)射和激發(fā)濾器(激發(fā)550-10nm、發(fā)射580-10nm)讀取該熒光團(tuán)標(biāo)記的堿基，第二種方法可利用R110特異性的發(fā)射和激發(fā)濾器(激發(fā)490-10nm、發(fā)射520-10nm)讀取該熒光團(tuán)標(biāo)記的堿基。兩種情況均使用二色性的雙反射鏡(dichroic double mirror)(R110/Tamra)，其它的閱讀參數(shù)為Z-高度1.5mm衰減器關(guān)斷積分時(shí)間100,000微妙原始數(shù)據(jù)單位計(jì)數(shù)/秒偏振轉(zhuǎn)換按孔平板穩(wěn)定時(shí)間0毫秒PMT設(shè)置精確讀取(+)、靈敏度2動(dòng)態(tài)起偏鏡發(fā)射靜態(tài)起偏鏡S從而獲得包含Tamra濾器和R110濾器的mP(毫偏振度)計(jì)算值的文件結(jié)果。從平行面(//)和垂直面(⊥)所得強(qiáng)度值開(kāi)始，按照下列公式，計(jì)算這些mP值mP＝1000(//-g⊥)/(//+g⊥).
在該運(yùn)算中，值⊥利用因子g權(quán)重。這是必須由預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的機(jī)器參數(shù)。
步驟4)和5)解讀并確定基因型。
利用Microsoft Inc.Excel軟件、和/或LJL Biosystems Inc開(kāi)發(fā)的Allele Caller軟件，圖解報(bào)告mP值。
橫坐標(biāo)表示Tamra標(biāo)記堿基的mP值，縱座標(biāo)表示R110標(biāo)記堿基的mP值。強(qiáng)mP值表示摻入了該熒光團(tuán)標(biāo)記的堿基，反之，弱mP值表明該堿基未摻入。
可獲得多達(dá)三個(gè)同源組的具有不同基因型的核苷酸序列。
一旦對(duì)不同組進(jìn)行了鑒定，便可以使用Allele Caller軟件，以表格形式直接獲取所確定的每一個(gè)體的基因型。
SNP c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g的微型測(cè)序結(jié)果完成基因分型步驟以后，針對(duì)此處所研究的SNP，使用上述圖形確定個(gè)體群中個(gè)體的基因型。
對(duì)于SNP c794g，理論上所測(cè)試個(gè)體的基因型為純合子CC、或雜合子CG、或純合子GG。實(shí)際上，如下所示，在個(gè)體群中未檢測(cè)到純合子基因型GG。
對(duì)于SNP c973a，理論上所測(cè)試個(gè)體的基因型為純合子CC、或雜合子CA、或純合子AA。實(shí)際上，如下所示，在個(gè)體群中未檢測(cè)到純合子基因型AA。
對(duì)于SNP g1011c，理論上所測(cè)試個(gè)體的基因型為純合子GG、或雜合子GC、或純合子CC。實(shí)際上，如下所示，在個(gè)體群中未檢測(cè)到純合子基因型CC。
對(duì)于SNP t1049a，理論上所測(cè)試個(gè)體的基因型為純合子TT、或雜合子TA、或純合子AA。實(shí)際上，如下所示，在個(gè)體群中未檢測(cè)到純合子基因型AA。
對(duì)于SNP t1155a，理論上所測(cè)試個(gè)體的基因型為純合子TT、或雜合子TA、或純合子AA。實(shí)際上，如下所示，在個(gè)體群中未檢測(cè)到純合子基因型AA。
對(duì)于SNP a1204g，理論上所測(cè)試個(gè)體的基因型為純合子AA、或雜合子AG、或純合子GG。實(shí)際上，如下所示，在個(gè)體群中未檢測(cè)到純合子基因型GG。
所測(cè)基因型在個(gè)體群中的分布以及計(jì)算所研究的6個(gè)SNP的不同等位頻率的結(jié)果如下表所示
在上表中-N代表個(gè)體數(shù)目。
-％代表特定亞群中個(gè)體的百分比。
-等位頻率代表特定亞群中突變等位基因的百分比。
-95％IC代表最小和最大的95％置信度區(qū)間。
必須說(shuō)明，例如對(duì)于SNP c973a，反義讀取的等位基因g對(duì)應(yīng)于有義讀取的等位基因c，并涉及未成熟IFNα-21蛋白質(zhì)序列102位存在的谷氨酰胺(Q)，因而反義讀取的等位基因t對(duì)應(yīng)于有義讀取的等位基因a，對(duì)應(yīng)于相應(yīng)蛋白質(zhì)序列該位置的賴(lài)氨酸(K)。
通過(guò)按系統(tǒng)發(fā)生的群體以及按SNP考查這些結(jié)果，可以看出-對(duì)于SNP c794g，6個(gè)CG雜合子個(gè)體來(lái)自非裔美洲人和東南亞人亞群。
-對(duì)于SNP c973a，4個(gè)CA雜合子個(gè)體來(lái)自歐洲人和非歐裔高加索人亞群。
-對(duì)于SNP g1011c，唯一的GC雜合子個(gè)體來(lái)自歐裔高加索人亞群。
-對(duì)于SNP t1049a，唯一的TA雜合子個(gè)體來(lái)自非裔美洲人亞群。
-對(duì)于SNP t1155a，8個(gè)TA雜合子個(gè)體來(lái)自非裔美洲人和歐裔高加索人亞群。
-對(duì)于SNP a1204g，15個(gè)AG雜合子個(gè)體來(lái)自美洲印第安人、歐洲人和非歐裔高加索人、墨西哥人、東北亞人和南美人亞群。
實(shí)施例3.在酵母中表達(dá)天然野生型IFNα-21以及A42G、Q102K、Q114H/V127D、K179E突變型IFNα-21a)在真核生物表達(dá)載體pPicZα-topo中克隆天然野生型IFNα-21和突變型IFNα-21利用來(lái)自相應(yīng)SNP雜合子個(gè)體的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增編碼天然野生型IFNα-21成熟部分以及A42G、Q102K、Q114H/V127D、K179E突變型IFNα-21的核苷酸序列。
可以進(jìn)行該擴(kuò)增的PCR引物為SEQ ID NO.19有義引物TGTGATCTGCCTCAGACCCAC
SEQ ID NO.20反義引物TCATTCCTTCCTCCTTAATCTTTCTTG將PCR產(chǎn)物插入真核生物表達(dá)載體pPicZα-TOPO，位于可甲醇誘導(dǎo)的雜合啟動(dòng)子AOX1控制下(TOPOTM-cloning；Invitrogen Corp.)。
該載體可使真核蛋白質(zhì)在巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)中異源表達(dá)。
在核對(duì)載體編碼重組蛋白質(zhì)區(qū)域的核苷酸序列之后，利用Pme1限制酶將載體線(xiàn)性化，并利用該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤氏酵母菌株(Invitrogen)。
b)天然野生型IFNα-21和突變型IFNα-21蛋白質(zhì)在巴斯德畢赤氏酵母中的異源表達(dá)及純化將包含編碼天然野生型IFNα-21或編碼A42G、Q102K、Q114H/V127D或K179E突變型IFNα-21的克隆的兩個(gè)50ml BMGY培養(yǎng)基(2％蛋白胨、1％酵母抽提物、1.34％YNB、1％甘油、100mM磷酸鉀、0.4mg/L生物素pH6.0)的飽和前培養(yǎng)物在30℃、200轉(zhuǎn)/分(rpm)振蕩培養(yǎng)24-48小時(shí)。
當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到飽和細(xì)胞密度時(shí)(相當(dāng)于波長(zhǎng)600nm下所測(cè)光密度12)，用來(lái)按5OD/mL接種到250ml BMMY培養(yǎng)基(2％蛋白胨、1％酵母抽提物、1.34％YNB、0.5％甲醇、100mM磷酸鉀、0.4mg/L生物素pH6.0)。
然后利用終濃度1％的甲醇，將培養(yǎng)瓶于180轉(zhuǎn)/分振蕩下30℃誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)24小時(shí)。
由于在編碼序列上游存在″α因子″信號(hào)肽序列，酵母將蛋白質(zhì)分泌于培養(yǎng)基中。α因子在加工過(guò)程中自然斷裂。
將懸浮液離心，從所獲上清開(kāi)始，利用HPLC純化蛋白質(zhì)。
在開(kāi)始前步驟，超濾(Labscale，截留5000Da，Millipore)后透析可使酵母上清在50mM Tris-Cl pH9.0、25mM NaCl的緩沖液中濃縮10倍。
第一個(gè)層析步驟可利用于藍(lán)色瓊脂糖凝膠柱(Amersham Pharmacia)的親和回收蛋白質(zhì)。一方面通過(guò)SDS PAGE型電泳，另一方面通過(guò)針對(duì)IFNα-21蛋白質(zhì)的特異性抗體的免疫檢測(cè)，證實(shí)在收集組分中存在該蛋白質(zhì)。在此步驟，目的蛋白質(zhì)的純度高于75％。
在第二個(gè)純化步驟中，凝膠過(guò)濾可使對(duì)應(yīng)于IFNα-21蛋白質(zhì)的收集組分利用50mM Tris pH9.0、25mM NaCl更換緩沖液。
最后的純化步驟包括利用離子交換層析柱分離蛋白質(zhì)。
將包含重組蛋白質(zhì)的組分注入預(yù)先用Tris 50mM pH9、NaCl 25mM緩沖液平衡的陰離子交換柱(ResourceQ 6.0mL，Pharmacia)。通過(guò)0,025-1M NaCl梯度的Tris(50mM pH9)緩沖液的移動(dòng)，進(jìn)行蛋白質(zhì)洗脫。
利用SDS/PAGE凝膠估計(jì)目的蛋白質(zhì)的純度，利用光密度法(Quantity one，Biorad)和BCA分析(bicinchoninic酸和硫酸銅，Sigma)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
按照該方案獲得純化的天然野生型IFNα-21以及A42G、Q102K、Q114H/V127D或K179E突變型IFNα-21蛋白質(zhì)，最后按比例放大，生產(chǎn)大量蛋白質(zhì)，用于下述功能測(cè)試。
實(shí)施例4.評(píng)價(jià)天然野生型IFNα-21以及A42G、Q114H/V127D或K179E突變型IFNα-21的免疫調(diào)節(jié)活性IFN I型(IFNα和IFNβ)能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的某些功能。已經(jīng)證明它們可增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)成熟增強(qiáng)MHC I類(lèi)(HLA-ABC)和II類(lèi)(HLA-DR)分子的表達(dá)，增強(qiáng)與T淋巴細(xì)胞共刺激有關(guān)的分子、CD80、CD86和CD83分子的表達(dá)，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的刺激功能。
a)A42G、Q114H/V127D或K179E突變型IFNα-21對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的作用首先研究A42G、Q114H/V127D或K179E突變型IFNα-21對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的免疫調(diào)節(jié)活性，并與選作商品化內(nèi)含子A(Intron A)產(chǎn)物代表的野生型IFNα-2作比較。
為此，首先從利用GM-CSF和IL-4細(xì)胞因子培養(yǎng)的成人外周血單核細(xì)胞中生成樹(shù)突狀細(xì)胞。利用CD 14+細(xì)胞純化試劑盒純化以后，將這些樹(shù)突狀細(xì)胞置于100ng/ml野生型IFNα-2或A42G、Q114H/V127D或K179E突變型IFNα-21存在下，通過(guò)FACS分析確定其表現(xiàn)型，目的在于尋找MHC I類(lèi)和II類(lèi)分子以及CD40、CD80、CD86、CD83和CD1a標(biāo)志的表達(dá)。這些樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟狀態(tài)也與未經(jīng)IFNα處理所獲樹(shù)突狀細(xì)胞相比，后者提供了未刺激樹(shù)突狀細(xì)胞的對(duì)照。
每個(gè)標(biāo)志以及3次實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定的熒光強(qiáng)度平均值，按任意單位表示，如下表所示
該測(cè)試結(jié)果表明，K179E突變型IFNα-21蛋白質(zhì)具有較高的刺激樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的能力，該刺激效應(yīng)高于野生型IFNα-2。
b)Q114H/V127D或K179E突變型IFNα-21對(duì)T淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的作用將T淋巴細(xì)胞置于相應(yīng)突變型IFNα-21蛋白質(zhì)以及有或沒(méi)有強(qiáng)抗原(SEB)的存在下，以模擬抗侵襲免疫應(yīng)答，通過(guò)測(cè)定T淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，同樣研究Q114H/V127D或K179E突變型IFNα-21的免疫調(diào)節(jié)活性。同樣在用作對(duì)照并選作內(nèi)含子A商品化產(chǎn)物代表的野生型IFNα-2存在下進(jìn)行該測(cè)試。
為此，從健康供體分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，在包含抗CD3和抗CD28抗體或SEB的合適培養(yǎng)基中刺激16小時(shí)。每個(gè)培養(yǎng)物中加入4μg/mL野生型IFNα-2或Q114H/V127D、或K179E突變型IFNα-21。刺激之后，T淋巴細(xì)胞利用抗CD3、抗CD4和抗CD69抗體或抗CD3、抗CD8和抗CD69抗體細(xì)胞外標(biāo)記，利用針對(duì)Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ)或Th2型細(xì)胞因子(IL-10)的特異性抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記。利用FACScalibur和CellQuest軟件分析熒光細(xì)胞。
所得結(jié)果表明，突變型IFNα-21蛋白質(zhì)和野生型IFNα-2不刺激IL-10和IFN-γ的釋放，因而在缺少SEB時(shí)并不活化T淋巴細(xì)胞。相反，突變型IFNα-21蛋白質(zhì)和野生型IFNα-2刺激SEB活化的T淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子(IL-10和IFN-γ)，如下表所示。該表顯示T淋巴細(xì)胞在SEB存在下釋放細(xì)胞因子，表示為CD4+CD69+細(xì)胞或CD8+CD69+細(xì)胞分別對(duì)于CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的百分比，以及CD69+細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比。
這些結(jié)果清楚表明，Q114H/V127D突變型IFNα-21和K179E突變型IFNα-21強(qiáng)烈刺激經(jīng)SEB抗原預(yù)先活化的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子(IFNγ和IL-10)。在該測(cè)試中，T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素γ在Q114H/V127D突變型IFNα-21或K179E突變型IFNα-21存在下高于野生型IFNα-2存在條件下。
c)Q114H/V127D或K179E突變型IFNα-21對(duì)單核細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的作用最后，通過(guò)在有或無(wú)細(xì)菌性毒劑(LPS)存在下測(cè)定單核細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子，研究Q114H/V127D或K179E突變型IFNα-21的免疫調(diào)節(jié)活性。同樣在用作對(duì)照并選作內(nèi)含子A商品化產(chǎn)物代表的野生型IFNα-2存在下進(jìn)行該測(cè)試。
為此，從健康供體分離人外周血單核細(xì)胞(PBMC)，分析其表現(xiàn)型，以確定CD64+CD4dim細(xì)胞的相對(duì)量(CD64和CD4dim是血液?jiǎn)魏思?xì)胞的標(biāo)志)。過(guò)夜培養(yǎng)之后，將這些PBMC在單獨(dú)的培養(yǎng)基(未刺激的細(xì)胞)或LPS存在下(刺激的細(xì)胞)培養(yǎng)。在每個(gè)培養(yǎng)物中加入4μg/mL野生型IFNα-2或突變型IFNα-21。培養(yǎng)后，利用抗CD64和抗CD4dim細(xì)胞外標(biāo)記細(xì)胞，并利用針對(duì)Th1型細(xì)胞因子(TNF-α)、IL-12和IL-10的特異性抗體細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記細(xì)胞。
利用FACScalibur和CellQuest軟件分析熒光細(xì)胞。
所得結(jié)果表明，在缺少LPS時(shí)，突變型IFNα-21蛋白質(zhì)和野生型IFNα-2不刺激細(xì)胞因子(IL-10、IL-12和TNF-α)的釋放。相反，存在LPS時(shí)，Q114H/V127D和K179E突變型IFNα-21蛋白質(zhì)以及野生型IFNα-2刺激單核細(xì)胞釋放細(xì)胞因子(IL-10、IL-12和TNF-α)，如下表所示。該表顯示單核細(xì)胞在存在LPS時(shí)釋放的細(xì)胞因子，表示為CD64+CD4dim細(xì)胞的百分比以及CD4dim CD64+細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比。
實(shí)施例5.評(píng)價(jià)A42G、Q102K、Q114H/V127D和K179E突變型IFNα-21的體外抗增殖活性a)對(duì)Daudi Burkitt細(xì)胞系人淋巴母細(xì)胞的增殖對(duì)A42G、Q102K、Q114H/V127D和K179E突變型IFNα-21蛋白質(zhì)以及野生型IFNα-21蛋白質(zhì)進(jìn)行這些測(cè)試。將預(yù)先在RPMI 1640培養(yǎng)基中(補(bǔ)充有10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺)培養(yǎng)的細(xì)胞(人DaudiBurkitt淋巴瘤細(xì)胞系，下文稱(chēng)為″Daudi細(xì)胞″)按細(xì)胞密度4.104細(xì)胞/孔接種于96孔板。
將每孔中的Daudi細(xì)胞與濃度遞增的突變型或野生型IFNα-21蛋白質(zhì)接觸。每個(gè)待鑒定的IFNα-21按終濃度為0.003pM-600nM進(jìn)行測(cè)試。
然后將Daudi細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)66小時(shí)，其后在培養(yǎng)物中加入U(xiǎn)ptiblue試劑(Uptima)。再溫育4小時(shí)以后，測(cè)定590nm處發(fā)射的熒光(激發(fā)560nm)，定量細(xì)胞增殖速率。
突變型或野生型IFNα-21的抗增殖活性是根據(jù)IC50的測(cè)定，其對(duì)應(yīng)于抑制50％細(xì)胞生長(zhǎng)的IFNα-21濃度。
每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行至少3次實(shí)驗(yàn)，一式三份，可以測(cè)定每個(gè)IFNα-21的平均IC50值。可以比較對(duì)應(yīng)于突變型與野生型蛋白質(zhì)IC50值的比值。結(jié)果匯總于下表(標(biāo)準(zhǔn)差如括號(hào)內(nèi)所示)
該測(cè)試表明，A42G、Q114H/V127D和K179E突變型IFNα-21蛋白質(zhì)對(duì)Daudi細(xì)胞的細(xì)胞抗增殖活性低于野生型IFNα-21。特別而言，Q114H/V127D IFNα-21與野生型IFNα-21相比，對(duì)Daudi細(xì)胞的細(xì)胞抗增殖活性低約10-16倍。
b)對(duì)TF-1紅白血病細(xì)胞系還評(píng)價(jià)了A42G、Q114H/V127D和K179E突變型IFNα-21對(duì)紅白血病細(xì)胞系的作用。同樣在用作對(duì)照并選作內(nèi)含子A商品化產(chǎn)物代表的野生型IFNα-2存在下進(jìn)行該測(cè)試。
為此，將TF-1細(xì)胞與濃度遞增的突變型IFNα-21或野生型IFNα-2(0.001-1000ng/ml)接觸，測(cè)定細(xì)胞增殖。
結(jié)果可以表示為IC30，即對(duì)應(yīng)于抑制30％細(xì)胞增殖的IFNα濃度，匯總于下表
這些數(shù)據(jù)表明，這3個(gè)突變型IFNα-21對(duì)TF-1細(xì)胞具有弱的抗增殖作用，該作用類(lèi)似于野生型IFNα-2，提示A42G、Q114H/V127D和K179E突變型IFNα-21的血液學(xué)毒性并不高于野生型IFNα-2。
實(shí)施例6.評(píng)價(jià)A42G、Q114H/V127D和K179E突變型IFNα-21的抗病毒活性IFN在抗病毒防護(hù)中具有重要作用。IFN的抗病毒活性部分應(yīng)歸于IFN誘導(dǎo)的酶系統(tǒng)，例如-2’5’寡腺苷酸合成酶，催化腺苷寡聚物合成。這些寡聚物可活化RNase L，一種一旦活化便可破壞病毒RNA的內(nèi)切核糖核酸酶。
-抑制病毒轉(zhuǎn)錄本合成和/或成熟的Mx蛋白質(zhì)(GTP酶)。該活性主要作用于流感病毒。
-由雙鏈RNA活化的PKR蛋白質(zhì)(或p68激酶)?；罨腜KR可抑制蛋白質(zhì)合成。
也可通過(guò)其它機(jī)制誘導(dǎo)IFN的抗病毒活性，例如對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒而言，抑制病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞、復(fù)制、結(jié)合、顆粒排出以及病毒顆粒的傳染力。
最后，IFN通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的某些功能、特別是促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答(包括增加MHC I類(lèi)和II類(lèi)分子、增加IL-12和IFN-γ生成、增加CTL活性等)，而發(fā)揮間接的抗病毒活性，利用細(xì)胞培養(yǎng)物體外以及小鼠模型體內(nèi)評(píng)價(jià)了A42G、Q114H/V127D和K179E突變型IFNα-21的抗病毒活性。兩個(gè)測(cè)試均利用用作對(duì)照并選作內(nèi)含子A商品化產(chǎn)物代表的野生型IFNα-2平行進(jìn)行。
a)細(xì)胞培養(yǎng)物體外抗病毒活性該測(cè)定利用水泡性口膜炎病毒(VSV)可以評(píng)價(jià)A42G、Q114H/V127D和K179E突變型IFNα-21以及野生型IFNα-2在細(xì)胞培養(yǎng)物中的抗病毒活性。
為此，在濃度遞減的突變型IFNα-21和野生型IFNα-2存在下培養(yǎng)WISH人上皮細(xì)胞24小時(shí)。然后利用水泡性口膜炎病毒(VSV)感染細(xì)胞24-48小時(shí)，測(cè)定細(xì)胞溶解作用。
通過(guò)比較IC50值，即對(duì)應(yīng)于抑制50％VSV誘導(dǎo)的細(xì)胞溶解作用的IFN濃度，確定所測(cè)各種IFNα的抗病毒作用。
同樣實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次，測(cè)定的IC50平均值如下表所示
因此，在VSV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中，A42G、Q114H/V127D和K179E突變型IFNα-21具有低于野生型IFNα-2的抗病毒活性。
b)小鼠模型體內(nèi)抗病毒活性在EMCV(腦心肌炎病毒)小鼠模型中進(jìn)行體內(nèi)測(cè)試。
人IFN在小鼠中顯示劑量依賴(lài)性抗病毒活性，一般比相同數(shù)量的小鼠IFN低100-1,000倍(Meister等人(1986).J.Gen.Virol.67，1633-1644)。
利用腦心肌炎病毒(EMCV)腹膜內(nèi)注射小鼠，引起以有關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腦炎為特征的快速進(jìn)行性致命疾病(Finter NB(1973).FrontBiol.2295-360)。已經(jīng)證明，小鼠和人干擾素-α均有效保護(hù)小鼠抵抗致命的EMCV感染(Tovey和Maury(1999).J.IFN Cytokine Res.19145-155)。
利用100xLD50 EMCV腹膜內(nèi)(ip)感染20只6周齡的Swiss小鼠組，然后1小時(shí)后利用2μg A42G、Q114H/V127D、K179E突變型IFNα-21或野生型IFNα-2制劑處理，以后每日一次，進(jìn)行3天。對(duì)照組動(dòng)物只利用賦形劑處理。每日跟蹤動(dòng)物存活率，進(jìn)行21天。
結(jié)果如圖6所示，表明A42G、Q114H/V127D或K179E突變型IFNα-21處理小鼠的相對(duì)存活率相比未處理小鼠高很多，但是仍類(lèi)似于野生型IFNα-2處理小鼠所觀察的結(jié)果。
所有這些結(jié)果表明，A42G、Q114H/V127D和K179E突變型IFNα-21具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。
序列表<110>Escary，Jean-Louis<120>IFNα-21基因的新多核苷酸和多肽<130>021349/0012<150>FR 0104404<151>2001-03-30<160>20<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2001<212>DNA<213>人類(lèi)(Homo sapiens)<400>1attttgtcat ataaagcaaa attcaaagct tcatatatat actatgagaa aaattttaaa60aaattattga ttcatatttt tagcagtttt gaatgattaa ctatgtaatt atattcatat120tattaatgtg tatttatata gatttttatt ttgcatatgt aatttcataa aacaaaattt180acatgaacaa attacattaa aagttattcc acaaatatac ttatcaaatt aagttaaatg240tcaatagctt ttaaacttag attttagttt aacatttctg tcattcttta ctttgaataa300aaagagcaaa ctttatagtt tttatctgtg aagtagagat atacatatta tacataaata360gataagccaa atctgtgtta ctaaaatttc atgaagattt caattagaaa aaaataccat420aaaatgtttt gagtgcaggg gaaaaatagg caatgatgaa aaaaaatgaa aaacatctgt480aaacacatgt agagagtgca taaagaaagc aaaaacagag atagaaagta aaactagggc540atttagaaaa tggaaattag tatgttcact atttaagacc tacgcacaga gcaaagtctt600cagaaaacct agaggccaag gttcaaggtt acccatctca agtagcctag caatattggc660aacatcccaa tggccctgtc cttttcttta ctgatggccg tgctggtgct cagctacaaa720tccatctgtt ctctgggctg tgatctgcct cagacccaca gcctgggtaa taggagggcc780ttgatactcc tggcacaaat gggaagaatc tctcctttct cctgcctgaa ggacagacat840gactttggat tcccccagga ggagtttgat ggcaaccagt tccagaaggc tcaagccatc900tctgtcctcc atgagatgat ccagcagacc ttcaatctct tcagcacaaa ggactcatct960
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Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu65 70 75 80His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser85 90 95Ser Ala Thr Trp Glu Gln Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu100 105 110Asn Gln Gln Leu Asn Asp Met Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly115 120 125Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys130 135 140Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser145 150 155 160Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser165 170 175Leu Ser Lys Ile Phe Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu180 185<210>3<211>20<212>DNA<213>人類(lèi)<400>3ggttcaaggt tacccatctc20<210>4<211>20<212>DNA<213>人類(lèi)<400>4ggttcaaggt tacccatctc20<210>5<211>20<212>DNA<213>人類(lèi)<400>5ggttcaaggt tacccatctc20<210>6<211>20
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1.分離的多核苷酸，其包含全部或部分的a)核苷酸序列SEQ ID NO.1，只要所述核苷酸序列包含至少一個(gè)選自c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g和t1265c的SNP；或b)與a)中核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其包含SEQ ID NO.1的670-1239位核苷酸，只要該序列包含至少一個(gè)選自c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a和a1204g的編碼SNP。
3.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中所述的多核苷酸由至少10個(gè)核苷酸組成。
4.分離的多核苷酸，其編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一個(gè)選自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的編碼SNP的多肽。
5.分離的多核苷酸，其編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有兩個(gè)編碼SNP Q114H和V127D的多肽。
6.分離的多核苷酸，其編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有編碼SNP K179E的多肽。
7.鑒定或擴(kuò)增與核苷酸序列SEQ ID NO.1具有80-100％同一性的多核苷酸的全部或部分的方法，其包含該多核苷酸在合適的雜交條件下與權(quán)利要求1的多核苷酸雜交。
8.與核苷酸序列SEQ ID NO.1具有80-100％同一性的多核苷酸的全部或部分的基因分型方法，其包含以下步驟擴(kuò)增受試者或受試者群體基因組DNA的目的區(qū)域，并確定位于核苷酸序列SEQ ID NO.1中選自794、973、1011、1049、1155、1204和1265的至少一個(gè)位點(diǎn)的等位基因。
9.權(quán)利要求8的方法，其中通過(guò)微型測(cè)序進(jìn)行基因分型。
10.包含權(quán)利要求1的多核苷酸的重組載體。
11.包含權(quán)利要求10的重組載體的宿主細(xì)胞。
12.分離多肽的方法，其包含在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)基中分離所述多肽。
13.由權(quán)利要求1的分離的多核苷酸編碼的多肽。
14.分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一個(gè)選自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的編碼SNP。
15.權(quán)利要求13的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的氨基酸24-189、并具有至少一個(gè)選自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的編碼SNP。
16.權(quán)利要求13的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位氨基酸、并具有兩個(gè)編碼SNP Q114H和V127D。
17.權(quán)利要求13的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位氨基酸、并具有編碼SNP K179E。
18.獲得免疫特異性抗體的方法，其包含利用權(quán)利要求13的多肽免疫動(dòng)物，并從該動(dòng)物收集所述抗體。
19.權(quán)利要求18的方法所產(chǎn)生的免疫特異性抗體。
20.在一種或多種待測(cè)化合物中鑒定可活化或抑制分離多肽活性的試劑的方法，該分離的多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一個(gè)選自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的編碼SNP，所述方法包含a)提供包含權(quán)利要求10的重組載體的宿主細(xì)胞；b)所述宿主細(xì)胞與待測(cè)化合物接觸，c)確定對(duì)所述多肽活性的活化或抑制作用，從而鑒定所述的活化劑或抑制劑。
21.在一種或多種待測(cè)化合物中鑒定其活性受分離多肽增強(qiáng)或抑制的試劑的方法，該分離的多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一個(gè)選自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的編碼SNP，所述方法包含a)提供包含權(quán)利要求10的重組載體的宿主細(xì)胞；b)所述宿主細(xì)胞與待測(cè)化合物接觸，c)確定對(duì)該試劑活性的增強(qiáng)或抑制作用，從而鑒定所述被增強(qiáng)或被抑制的試劑。
22.分析受試者生物學(xué)特征的方法，其包含進(jìn)行至少一個(gè)下列步驟a)確定在受試者基因組中存在或缺少權(quán)利要求1的多核苷酸；b)確定在受試者中權(quán)利要求1的多核苷酸的表達(dá)水平；c)確定在受試者中存在或缺少權(quán)利要求13的多肽；d)確定在受試者中權(quán)利要求13的多肽的濃度；或e)確定在受試者中權(quán)利要求13的多肽的功能性。
23.包含一種或多種化合物的治療劑，所述化合物選自包含核苷酸序列SEQ ID NO.1的全部或部分的分離的多核苷酸，只要該核苷酸序列包含至少一個(gè)選自c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g和t1265c的SNP，或者與所述核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；包含所述多核苷酸的重組載體；包含所述重組載體的宿主細(xì)胞；包含氨基酸序列SEQID NO.2的全部或部分、并具有至少一個(gè)選自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的編碼SNP的分離的多肽；特異性針對(duì)所述多肽的抗體。
24.用于預(yù)防或治療個(gè)體疾病的方法，所述疾病選自癌癥和腫瘤、傳染病、免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫相關(guān)疾病、心血管疾病、代謝疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及化學(xué)治療相關(guān)疾病，其包含給予個(gè)體治療有效量的權(quán)利要求23的治療劑，外加藥物可接受的賦形劑。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述癌癥和腫瘤包含轉(zhuǎn)移的腎癌、黑色素瘤、包含濾泡性淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛樣細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性骨髓性白血病的白血病、肝癌、頸癌、頭癌和腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、類(lèi)癌瘤以及伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤，包含AIDS情況下的Kaposi肉瘤。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述代謝疾病包含非免疫相關(guān)性疾病，例如肥胖癥。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述傳染病包含病毒性傳染，包括慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病包含阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂癥以及抑郁癥。
29.權(quán)利要求24的方法，其中所述免疫和自身免疫相關(guān)疾病包含組織或器官移植排斥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病以及潰瘍性結(jié)腸炎。
30.預(yù)防或治療個(gè)體疾病的方法，所述疾病選自創(chuàng)傷愈合、透析患者的貧血和/或骨質(zhì)疏松癥，包含給予該個(gè)體治療有效量的權(quán)利要求23的治療劑，外加藥物可接受的賦形劑。
31.增加或降低受試者中權(quán)利要求13的多肽活性的方法，其包含給予治療有效量的一種或多種包含核苷酸序列SEQ ID NO.1的全部或部分的分離的多核苷酸，只要該核苷酸序列包含至少一個(gè)選自c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g和t1265c的SNP，或與該核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；包含該多核苷酸的重組載體；包含該重組載體的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞可得自待治療的受試者；包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一個(gè)選自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的編碼SNP的分離的多肽；特異性針對(duì)該多肽的抗體；以及藥物可接受的賦形劑。
32.預(yù)防或治療個(gè)體與其基因組中存在權(quán)利要求1的多核苷酸有關(guān)的病癥或疾病的方法，其包含給予治療有效量的一種或多種包含核苷酸序列SEQ ID NO.1的全部或部分、并具有至少一個(gè)選自c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g和t1265c的SNP的分離的多核苷酸，或與該核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；包含一種該多核苷酸的重組載體；包含該重組載體的宿主細(xì)胞；包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一個(gè)選自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的編碼SNP的分離的多肽；特異性針對(duì)一種該多肽的抗體；以及藥物可接受的賦形劑。
33.確定至少一個(gè)選自IFNα-21基因中c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g和t1265c的SNP與疾病或疾病抗性之間統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性的方法，其包含a)對(duì)一組個(gè)體進(jìn)行基因分型；b)確定該疾病或疾病抗性在該組個(gè)體中的分布；c)將基因型數(shù)據(jù)與該疾病或疾病抗性的分布作比較；以及d)對(duì)上述比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析。
34.診斷或確定疾病或疾病抗性預(yù)后的方法，其包含檢測(cè)IFNα-21基因中至少一個(gè)選自c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g和t1265c的SNP。
35.在一種或多種待測(cè)化合物中鑒定與Q114H/V127D突變型IFNα-21基因產(chǎn)物具有基本類(lèi)似的生物活性的化合物的方法，該方法包含以下步驟a)確定所述化合物的生物活性，例如樹(shù)突狀細(xì)胞成熟、CD4+或CD8+T淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、單核細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、體外或體內(nèi)抗病毒活性、對(duì)Daudi Burkitt細(xì)胞系的細(xì)胞抗增殖活性、對(duì)TF-1細(xì)胞系的細(xì)胞抗增殖活性；b)將由步驟a)確定的該化合物活性與Q114H/V127D突變型IFNα-21基因產(chǎn)物活性作比較。c)根據(jù)步驟b)進(jìn)行的比較確定該化合物是否具有與Q114H/V127D突變型IFNα-21基因產(chǎn)物基本類(lèi)似的活性。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述待測(cè)化合物鑒定自合成肽組合文庫(kù)、高通量篩選、或通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)而設(shè)計(jì)，以具有與SEQ ID NO.2的多肽、或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的24-189位所含氨基酸的氨基酸序列相同的三維結(jié)構(gòu)，只要該氨基酸序列包含Q114H和V127D SNP。
37.利用權(quán)利要求35的方法鑒定的化合物。
38.從一種或多種待測(cè)化合物中鑒定與K179E突變型IFNα-21基因產(chǎn)物具有基本類(lèi)似的生物活性的化合物的方法，該方法包含以下步驟a)確定所述化合物的生物活性，例如樹(shù)突狀細(xì)胞成熟、CD4+或CD8+T淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、單核細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、體外或體內(nèi)抗病毒活性、對(duì)Daudi Burkitt細(xì)胞系的細(xì)胞抗增殖活性、對(duì)TF-1細(xì)胞系的細(xì)胞抗增殖活性；b)將由步驟a)確定的該化合物活性與K179E突變型IFNα-21基因產(chǎn)物活性作比較。c)根據(jù)步驟b)進(jìn)行的比較，確定該化合物是否具有與K179E突變型IFNα-21基因產(chǎn)物基本類(lèi)似的活性。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述待測(cè)化合物鑒定自合成肽組合文庫(kù)、高通量篩選、或通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)而設(shè)計(jì)，以具有與SEQ ID NO.2的多肽、或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的24-189位所含氨基酸的氨基酸序列相同的三維結(jié)構(gòu)，只要該氨基酸序列包含K179E SNP。
40.利用權(quán)利要求38的方法鑒定的化合物。
41.用于預(yù)防或治療個(gè)體疾病的方法，所述疾病選自癌癥和腫瘤、傳染病、免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫相關(guān)疾病、心血管疾病、代謝疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及化學(xué)治療相關(guān)疾病，其包含給予該個(gè)體治療有效量的權(quán)利要求37或40的試劑，外加藥物可接受的賦形劑。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述癌癥和腫瘤包含轉(zhuǎn)移的腎癌、黑色素瘤、包含濾泡性淋巴瘤和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛樣細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性骨髓性白血病的白血病、肝癌、頸癌、頭癌和腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、類(lèi)癌瘤以及伴隨免疫缺陷出現(xiàn)的腫瘤，包含AIDS情況下的Kaposi肉瘤。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述傳染病包含病毒性傳染，包括慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
44.權(quán)利要求41的方法，其中所述免疫和自身免疫相關(guān)疾病包含組織或器官移植排斥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病以及潰瘍性結(jié)腸炎。
45.權(quán)利要求41的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病包含阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂癥以及抑郁癥。
46.權(quán)利要求41的方法，其中所述代謝疾病包含非免疫相關(guān)性疾病，例如肥胖癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及來(lái)源于IFNα－21基因核苷酸序列的包含新的SNP的新的多核苷酸、以及來(lái)源于天然野生型IFNα－21蛋白質(zhì)的包含由至少一個(gè)本發(fā)明的SNP所致至少一個(gè)突變的新的多肽、及其治療用途。
文檔編號(hào)A61P25/28GK1531600SQ02809055
公開(kāi)日2004年9月22日 申請(qǐng)日期2002年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月30日
發(fā)明者J－L·伊斯卡利, J-L 伊斯卡利 申請(qǐng)人:吉恩奧迪塞公司