專利名稱：作為治療和預(yù)防變態(tài)反應(yīng)的藥物的乳酸菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能降低個體產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)傾向的新型乳酸菌菌株。具體來講，本發(fā)明涉及表達(dá)表面多肽的重組乳酸菌菌株，所述表面多肽包括作為IgE分子Fc區(qū)的至少一部分的模擬物的小的和較大的肽。本發(fā)明也涉及含有所述微生物或其活性級分的食品或藥用組合物。
免疫系統(tǒng)是一個復(fù)雜而多樣性的防御系統(tǒng)，保護(hù)機(jī)體免受諸如病毒、細(xì)菌、寄生蟲和真菌或僅僅較大的化學(xué)物質(zhì)等任何生物或化學(xué)因子的攻擊。雖然免疫系統(tǒng)是維護(hù)機(jī)體完整性不可缺少的部分，但在某些時候其自身也可能引起疾病，例如自身免疫病、炎癥或變態(tài)反應(yīng)。
變態(tài)反應(yīng)是免疫系統(tǒng)對各種物質(zhì)(變應(yīng)原)的不當(dāng)反應(yīng)。一般來講，個體不會對環(huán)境中經(jīng)常遇到的物質(zhì)(諸如花粉或食品)產(chǎn)生顯著免疫反應(yīng)，認(rèn)為這種不反應(yīng)性主要是因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)自身的抑制機(jī)制。然而，在受損條件下，免疫系統(tǒng)不實(shí)現(xiàn)所述抑制活性，產(chǎn)生對變應(yīng)原的特異性免疫反應(yīng)一變態(tài)反應(yīng)。
普遍確立的一個變態(tài)反應(yīng)機(jī)制涉及一系列事件，始于變應(yīng)原攝取，此步需要變應(yīng)原穿越上皮屏障、到達(dá)并激活位于緊密連接之下的固有層或上皮中的效應(yīng)細(xì)胞。與變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的臨床癥狀主要是早期特異性免疫應(yīng)答和晚期炎癥反應(yīng)的結(jié)果。在早期，由宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對變應(yīng)性物質(zhì)的免疫球蛋白E(IgE)，隨之通過受體蛋白結(jié)合到諸如肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上。IgE分子結(jié)合并交聯(lián)到細(xì)胞表面后，細(xì)胞釋放組胺和細(xì)胞因子，繼而通過募集炎性細(xì)胞到鼻和上呼吸道中，介導(dǎo)晚期反應(yīng)。隨后嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和血小板流入，開始了炎癥期，放大初始的免疫應(yīng)答，繼而觸發(fā)更多炎性細(xì)胞的釋放。
過去，患有變態(tài)反應(yīng)的個體數(shù)量一直在上升，這通常是歸結(jié)于諸如排放廢氣引起的大氣污染加重。人們也認(rèn)為蛋白質(zhì)類物質(zhì)消費(fèi)的增加造成所述，特別是造成食物過敏的發(fā)生日益增多。此外，在發(fā)達(dá)國家中遇到的微生物感染不足，也被認(rèn)為是特應(yīng)性疾病上升的另一可能原因。
因此，本領(lǐng)域存在著治療變態(tài)反應(yīng)的需求，至今為止也提出了各種不同的方法。
至于食物過敏的治療，有些方法依賴于改進(jìn)食品材料本身，以降低其變應(yīng)原可能性。這可以通過改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)、或限制或禁止引起這一麻煩的食品材料或組分的方法來達(dá)到。但是所涉及的問題常常是，在相應(yīng)的食品材料中具體變應(yīng)原物質(zhì)常常是未知的，所以多數(shù)情況下并不清楚該選擇性去除或改變哪種組分。
一種不同的治療食物過敏和食物不耐受的方法是恢復(fù)和維護(hù)腸道的完整性，使食物變應(yīng)原基本不會穿過去。在這一方面，US 5,192,750描述了應(yīng)用N-乙酰葡萄糖胺使粘膜能夠?qū)κ澄镒儜?yīng)原的運(yùn)輸形成必要屏障，并維持正常功能。
一個最普遍的治療變態(tài)反應(yīng)的方法是一種免疫療法，其中涉及重復(fù)注射變應(yīng)原，持續(xù)幾年的時間，來給患者對所述變應(yīng)原脫敏。然而其過程耗費(fèi)時間，需要多年的治療，還常達(dá)不到給病人脫敏的目標(biāo)。
根據(jù)最近的方法，建議給予個體接種針對IgE分子的疫苗，來抑制肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的觸發(fā)。為此，WO 97/3 1948提供了供疫苗接種用的在三維構(gòu)象上類似IgE分子部分的特異性多肽，IgE分子是與在變態(tài)反應(yīng)和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中起作用的介質(zhì)釋放有關(guān)的免疫球蛋白。設(shè)想個體自身的免疫系統(tǒng)將最終形成針對所述IgE分子的抗體，這樣，所述IgE免疫球蛋白會被清除掉。
然而，所述方法存在與正常疫苗接種程序所共有的缺點(diǎn)，因?yàn)樗錾飳W(xué)活性物質(zhì)必須通過侵入性方式給藥，例如采用靜脈內(nèi)注射，這種給藥途徑一般來講是病人所不喜歡的。另一方面，當(dāng)選擇口服途徑時，必須設(shè)計合適的蓋侖制劑配方，以便讓生物活性物質(zhì)通過胃腸道而不受到破壞。在這一方法中所遇到的另一問題是，擬表位(mimotope)在多數(shù)情況下是短鏈肽，自身不能引發(fā)真正的免疫應(yīng)答，所以在所述組合物中除了載體和賦形劑外，不得不包括佐劑。
因此，本領(lǐng)域需要提供治療變態(tài)反應(yīng)的改良方法。具體來講，本發(fā)明的一個目的是提供能以有效、簡便、成本合算的、最好不需要醫(yī)師和不會帶來與該治療相關(guān)的負(fù)面影響的方式治療變態(tài)反應(yīng)的方法。
通過提供在其表面表達(dá)一種多肽的新型乳酸菌株，來達(dá)到以上目的，該多肽含有至少一種模擬IgE分子的構(gòu)象表位的至少一部分(擬表位)的多肽序列。
在圖中，

圖1顯示約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)重組體的蛋白質(zhì)染色和免疫印跡分析。(A)野生型Lal的蛋白染色(第1道)，帶有Lal的pMd112TT(LalTT，第2道)或pMD112ε4(Lalε4，第3道)。(B)在LalTT(第2道)和Lalε4(第3道)上的蛋白酶PrtB的表達(dá)。通過用1∶2000稀釋度的抗PrtB血清進(jìn)行免疫印跡分析，對約108個細(xì)菌進(jìn)行分析。野生型Lal作為陰性對照上樣(第1道)。用辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔IgG(Fc)抗體檢測結(jié)合抗體。(C)在LalTT表面破傷風(fēng)擬表位的表達(dá)(第2道)。用1∶1000稀釋度的抗TT血清進(jìn)行免疫印跡分析，對約108個細(xì)菌/狹線進(jìn)行分析。用Lal(第1道)和LalE4(第3道)作陰性對照。用辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔IgG(Fc)抗體檢測結(jié)合抗體。(D)在Lalε4表面ε4擬表位的表達(dá)(第3道)。用10μg/ml濃度的抗E4血清(SDS280)進(jìn)行免疫印跡分析，對約108個細(xì)菌/狹線進(jìn)行分析。用Lal(第1道)和LalTT(第2道)作陰性對照。用辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔IgG(Fc)抗體檢測結(jié)合抗體。箭頭表示A-D中所看到的蛋白酶條帶的高度。
圖2顯示了在ELISA中抗TT IgG與乳酸菌表面展示的ε擬表位的結(jié)合測定的結(jié)果。
圖3顯示了在ELISA中抗ε4 IgG與乳酸菌表面展示的ε擬表位的結(jié)合測定的結(jié)果。
在產(chǎn)生本發(fā)明的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過提供一種帶有包含上述肽序列的重組表面多肽的乳酸菌，可以使個體獲得對IgE的特異性免疫，從而使得所述個體對幾乎所有抗原的變態(tài)反應(yīng)都受到抑制。
雖然并不希望受任何理論的束縛，但目前的設(shè)想是，乳酸菌被攝食后在胃腸道會保持一段時間，能向個體免疫系統(tǒng)呈遞所述抗原，使得所述個體發(fā)生有效免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生抗IgE的抗體。這一事實(shí)更加出乎意料，因?yàn)椴荒茴A(yù)料到，包含這樣一種表面蛋白的細(xì)菌，經(jīng)過胃腸道途徑實(shí)現(xiàn)給藥后，是否最終向個體免疫系統(tǒng)呈遞相應(yīng)的抗原一擬表位一從而使免疫系統(tǒng)能識別該抗原并誘發(fā)對它的免疫應(yīng)答。而且，很明顯，所述擬表位呈遞給免疫系統(tǒng)所處的生物學(xué)環(huán)境，使得應(yīng)用佐劑誘發(fā)針對所述抗原的免疫應(yīng)答來說，是不需要的。
按照優(yōu)選實(shí)施方案，所述含有含擬表位表面多肽的乳酸菌屬于乳桿菌群或雙岐桿菌(Bifidobacterium)群或乳球菌(Lactococcus)群，更優(yōu)選源自嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、約氏乳桿菌、加氏乳桿菌(L.gasseri)，干酪乳桿菌(L.casei)，類干酪乳桿菌(L.paracasei)或路氏乳桿菌(L.reuteri)菌群，所述這些菌群都來源于人類或動物。按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，所述乳酸菌是一種益生乳酸菌。作為益生菌，人們應(yīng)理解為是能夠以基本上有活力的活體形式穿越胃腸道和任選地也能夠刺激宿主免疫系統(tǒng)的微生物。按照最優(yōu)選的實(shí)施方案，所述乳酸菌是約氏乳桿菌。
只要可以插入所述“擬表位肽序列”使得它可以是免疫系統(tǒng)可及的，那么所述表面多肽的性質(zhì)并不是關(guān)鍵。按照優(yōu)選的實(shí)施方案，其中已插入模擬IgE免疫球蛋白的構(gòu)象表位的序列的所述表面多肽/蛋白質(zhì)，是保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)的細(xì)胞表面錨定蛋白酶，其序列已發(fā)表在Gilbert等(1996)J.Bacteriol，178，3059-3065.。這種蛋白被鑒定是2000個氨基酸的蛋白，其構(gòu)成為負(fù)責(zé)細(xì)胞輸出所述酶的33個氨基酸的前導(dǎo)肽(前區(qū))組成的、后接負(fù)責(zé)切割后激活所述酶的蛋白水解活性的一系列154個氨基酸(原區(qū))和700-800個氨基酸的活性位點(diǎn)。有人提出，隨后的區(qū)域(約1000個氨基酸)在切割特異性和所產(chǎn)生多肽的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)方面起作用，并且也跨越細(xì)胞壁。所述蛋白酶以其羧基端錨定于細(xì)胞壁，最后200個氨基酸負(fù)責(zé)特異性共價連接到細(xì)胞壁的肽聚糖結(jié)構(gòu)上。
可以按照本領(lǐng)域熟知的方法，讓所述多肽在所述乳酸菌中表達(dá)。例如用市售載體pNZ124(Platteuw等，(1994)Appl.Env.Microbiol.60，587)、pGK12(Wakle等，(1996)FEMS Microbiol.138，233)或pG+host9(Maguin等，(1996)J.Bacteriol 178，193)可以用于附加型表達(dá)。目前，考慮到染色體整合的高度穩(wěn)定性，這種方式對于編碼相應(yīng)多肽的重組基因可能是優(yōu)選的。為了整合到染色體中，可以通過例如用來自包含所述耐受原性肽的乳酸菌的重組基因，取代內(nèi)源基因，來應(yīng)用同源重組。目前，將重組基因引入宿主染色體的方法完全在技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。
通過用用帶有針對IgE的Fc部分的抗體篩選隨機(jī)肽和人Fab抗體噬菌體展示文庫，可以發(fā)現(xiàn)模擬IgE的構(gòu)象表位的肽序列(Seq.Id.No.1-17)和抗獨(dú)特型VH和VL序列(Seq.Id.No.18-19)。優(yōu)選的擬表位和抗獨(dú)特型Fab序列選自
Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (A) (Seq.Id.No.1)，Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (B) (Seq.Id.No.2)，Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp (C) (Seq.Id.No.3)，Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (D) (Seq.Id.No.4)，Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (E) (Seq.Id.No.5)，Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (F) (Seq.Id.No.6)，Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (G) (Seq.Id.No.7)，Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (H) (Seq.Id.No.8)，Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val (I) (Seq.Id.No.9)，Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met (J) (Seq.Id.No.10)，Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser (K) (Seq.Id.No.11)，Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp (L) (Seq.Id.No.12)，Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly (M) (Seq.Id.No.13)，Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg (N) (Seq.Id.No.14)，Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser (O) (Seq.Id.No.15)，Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg (P) (Seq.Id.No.16)，Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser (Q) (Seq.Id.No.17)，Gln-Val-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Pro-Gly-Leu-Val-Lys-Pro-Ser-Glu-Thr-Leu-Ser-Leu-Thr-Cys-Thr-Val-Ser-Gly-Gly-Ser-Ile-Ser-Ser-Gly-Gly-Tyr-Tyr-Trp-Thr-Trp-Ile-Arg-Gln-Arg-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Ile-Gly-Tyr-Ile-Tyr-Tyr-Ser-Gly-Ser-Thr-Ser-Tyr-Ash-Pro-Se -Leu-Lys-Ser-Arg-Val-Thr-Met-Ser-Val-Asp-Thr-Ser-Lys-Asn-Gln-Phe-Ser-Leu-Arg-Leu-Thr-Ser-Val-Thr-Ala-Ala-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Arg-Glu-Arg-Gly-Glu-Thr-Gly-Leu-Tyr-Tyr-Pro-Tyr-Tyr-Tyr-Ile-Asp-Val-Trp-Gly-Thr-Gly-Thr-Thr-Val-Thr-Val-Ser-Ser (S) (Seq.Id.No.18)Glu-Leu-Val-Val-Thr-Gln-Pro-Ala-Ser-Val-Ser-Gly-Ser-Pro-Gly-Gln-Ser-Ile-Thr-Ile-Ser-Cys-Thr-Gly-Thr-Arg-Ser-Asp-Val-Gly-Gly-Tyr-Asn-Tyr-Val-Ser-Trp-Tyr-Gln-Gln-His-Pro-Gly-Lys-Ala-Pro-Lys-Leu-Met-Ile-Tyr-Asp-Val-Ser-Asn-Arg-Pro-Ser-Gly-Val-Ser-Asn-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Lys-Ser-Gly-Asn-Thr-Ala-Ser-Leu-Thr-Ile-Ser-Gly-Leu-Gln-Ala-Glu-Asp-Glu-Ala-Asp-Tyr-Tyr-Cys-Ser-Ser-Tyr-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Leu-Gly-Val-Phe-Gly-Gly-Gly-Thr-Lye-Leu-Thr-Val-Leu-Gly (T) (Seq.Id.No 19)
關(guān)于肽的分離和/或制備以及模擬IgE的部分恒定區(qū)的抗獨(dú)特型VH和VL序列的更詳細(xì)的信息，參考WO97/31948，其中的內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明也涉及含有至少一種以上描述的這樣的乳酸菌的食品和藥物組合物，特別是疫苗。
所述菌株可以以從105到1012個cfu(菌落形成單位)/克材料的量包含在所述組合物中。所述食品組合物可以是乳、酸乳、凝乳、干酪、發(fā)酵乳、基于乳的發(fā)酵產(chǎn)品、冰淇淋、基于發(fā)酵谷物的產(chǎn)品、基于乳的粉末、嬰兒配制食品，或?qū)游飦碚f，寵物食品。所述藥用組合物可以是片劑、液體細(xì)菌懸液、干口服補(bǔ)充劑、濕口服補(bǔ)充劑、干管飼劑(tube-feeding)或濕管飼劑的形式。
本發(fā)明所述乳酸菌和所述食品/藥用組合物可以用于治療與其中涉及IgE抗體的免疫反應(yīng)的變態(tài)反應(yīng)有關(guān)的任何疾病，例如鼻炎、特應(yīng)性皮炎、紅斑等。同樣，人們會認(rèn)識到，本發(fā)明所述細(xì)菌/組合物適合用作“接種疫苗用藥物(vaccination agent)”，以普遍預(yù)防個體變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生。這只需讓需要治療變態(tài)反應(yīng)的人進(jìn)食按照本發(fā)明的食品或藥用組合物，就可以容易地完成。所述細(xì)菌經(jīng)攝取后，將在腸道內(nèi)定居一段時間，因此，根據(jù)所述細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)量和給予本發(fā)明組合物的時期，所述擬表位被呈遞給個體，使之可以形成針對所述擬表位的免疫應(yīng)答。人們將會認(rèn)識到，除了含有本發(fā)明組合物所含的乳酸菌外，也可采用已知刺激免疫系統(tǒng)的藥物，從而改善針對所述擬表位的免疫應(yīng)答。
以下實(shí)施例進(jìn)一步闡明了本發(fā)明，但不限于此。
實(shí)施例1重組多肽的構(gòu)建將兩種肽與保加利亞乳桿菌的細(xì)胞表面錨定蛋白酶融合，以展顯在細(xì)菌Lal(CNCM I-1225)的表面，所述肽即肽ε4(Seq.Id.No.1)和另一破傷風(fēng)毒素來源的肽(以下用TT表示；其序列見下)(用作對照)。
將所述擬表位(ε4)與保加利亞乳桿菌來源的細(xì)胞表面蛋白酶(PrtB)(Gilbert等，(1996)J.Bacteriol，178，3059-3065)符合讀框地融合。
首先采用以下兩種引物擴(kuò)增所述蛋白酶基因和其啟動子5`-TTITGTGGATCCTTAACTTCATAGCACG-3’(所述基因啟動子的上游，攜帶一個BamHI位點(diǎn))5`-ATATTATCTAGAATTGAATAGATTGCC-3’(所述基因rho不依賴性終止子的下游，攜帶一個XbaI位點(diǎn))用BamHI和XbaI切割所述擴(kuò)增產(chǎn)物，并克隆到用同樣的限制性酶消化的乳酸菌載體pNZ124中，最終通過電穿孔引入到無質(zhì)粒(β-半乳糖苷酶和蛋白酶陰性)乳酸乳球菌(Lactoccoccus lactis)中。
采用兩端側(cè)翼是兩個半胱氨酸殘基的所述TT肽和ε4肽的序列，取代所述已克隆的蛋白酶的活性位點(diǎn)區(qū)。加入所述半胱氨酸殘基，是因?yàn)檫@兩種肽從噬菌體展示文庫中作為側(cè)翼是兩個半胱氨酸的環(huán)肽被分離出來的。因?yàn)檫@些肽并不代表天然的表位而是模擬天然表位，所以它們被稱為擬表位9 18 275′TGC ATT AAT CAT AGA GGA TAT TGG GTT TGC 3′--- --- --- --- --- --- --- --- --- ---ε4Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys9 18 275′TGC ACA GAT CCT TCT GGA GCA TCT GCA CCT TGC 3′--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- TTCys Thr Asp Pro Ser Gly Ala Ser Ala Pro Cys為達(dá)到此目的，用NheI在前導(dǎo)肽的切割位點(diǎn)的序列下游50bp處、以及用PvuI在更下游的800bp處，切割所述已克隆的蛋白酶。編碼目標(biāo)肽的DNA序列(參見上文)，作為兩種寡聚核苷酸，插入到所述兩個限制位點(diǎn)之間，這些設(shè)計是為了當(dāng)它們雜交在其兩端產(chǎn)生兩個限制位點(diǎn)。所述寡聚核苷酸的設(shè)計考慮到但與所述蛋白酶連接時，所述重組蛋白的閱讀框架仍然是可讀框。用所述限制性酶切割所述擴(kuò)增產(chǎn)物。在兩種情況下，DNA片段與所述蛋白酶基因連接，并通過電穿孔將其導(dǎo)入約氏乳桿菌。
實(shí)施例2約氏乳桿菌的轉(zhuǎn)化為了進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將約氏乳桿菌Lal菌株(可得自the Institute Pasteur(巴斯德研究所)，保藏號CNCM I-1225)在MRS肉湯、37℃、缺氧條件下培養(yǎng)過夜。用一等份該培養(yǎng)物接種(1∶10)含0.5M蔗糖的另一培養(yǎng)肉湯(MRS)。在另外以2％在200ml MRS+0.5M蔗糖中再次接種后，讓培養(yǎng)物生長至OD595為0.6。以5000rpm、4℃離心10分鐘收集細(xì)胞，沉淀物用1/2體積的含1M蔗糖和2.5mM CaCl2的溶液洗滌兩次，用1/4體積的含1M蔗糖、2.5mM CaCl2的溶液洗滌一次，離心后獲得的沉淀物重新懸浮在3.5ml的含1M蔗糖、2.5mM CaCl2+0.459ml的87％甘油(終濃度10％)的溶液中。所述細(xì)胞或者直接用于轉(zhuǎn)化或在-80℃冷凍。
對于電穿孔，將40μl細(xì)胞與10-100ng DNA(小于5μl的體積)混合，并轉(zhuǎn)移至冰冷的0.2cm的電穿孔樣品池中。在冰冷的0.2cm電穿孔樣品池中，以200Ω、25μF、2.5kV施加脈沖。向該樣品池中加入1ml的MRS+20mM MgCl2、2mM CaCl2，懸浮液保溫于37℃2-3小時。分別用10μl、100μl等份在含合適抗生素的MRS瓊脂平板上鋪平板。這些平板在與前述相同的溫度中、在缺氧條件下、溫育20-48小時。采用含氯霉素(10μg/ml)的MRS作為選擇性培養(yǎng)基。
實(shí)施例3抗蛋白酶PrtB的抗血清的產(chǎn)生為了產(chǎn)生針對PrtB的抗血清，用表達(dá)蛋白酶B(PrtB)的德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus)菌株ATCC11842皮下免疫兔子。讓細(xì)菌在MRS肉湯中、在GasPak缺氧系統(tǒng)中42℃生長過夜。用一等份的培養(yǎng)物接種含0.5M蔗糖的另一MRS肉湯，讓培養(yǎng)物于42℃生長5小時，直到OD595為0.6。以5000rpm、4℃離心收集所述細(xì)胞，沉淀物用10ml PBS洗滌兩次，再重新懸浮于2ml PBS中。用1.5ml PBS重新懸浮的細(xì)胞免疫兔子3次，每次間隔2周，在最后一次給藥后7天給兔子采血。用2×109約氏乳桿菌(Lal)純化血清6次。
實(shí)施例4針對所述TT和ε4擬表位的抗血清的產(chǎn)生為了產(chǎn)生針對所述TT和ε4擬表位的抗血清，用聚肟-TT擬表位構(gòu)建體或與匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)相結(jié)合的ε4擬表位來皮下免疫兔子。兔子免疫4次，每次間隔2周，最后一次注射后7天給動物采血。用與ε4擬表位偶聯(lián)的CH-Sepharose 4B，對所述抗ε4血清進(jìn)行免疫親合層析。
實(shí)施例5用抗體檢測擬表位-PrtB融合蛋白為了檢測所述乳酸菌是否以為抗體可及或?yàn)榭贵w所識別的方式表達(dá)所述擬表位，將含有未經(jīng)修飾的所述PrtB基因的細(xì)菌、或含有重組基因(分別編碼所述ε4或所述TT擬表位)的細(xì)菌，培養(yǎng)于25ml含10μg/ml氯霉素的培養(yǎng)基中。在3000×g、4℃下離心15分鐘收獲細(xì)菌細(xì)胞，用5ml TBS洗滌，再離心。最后在450μl Tris緩沖鹽溶液(TBS25mM Tris/HCl，pH 7.0，0.8％NaCl，0.02％KCl)和150μl 4×非還原性樣品緩沖液(80mM Tris/HCl pH 6.8，2.5％SDS，0.15％甘油，0.05％溴酚藍(lán))中重新懸浮細(xì)菌沉淀物。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(6％丙烯酰胺-Bis，0.5M Tris-HCl pH 8.8)，在25mM Tris、192mM甘氨酸緩沖液(pH 8.3)中，在100V下跑電泳60分鐘，對20μl等份進(jìn)行分離。該凝膠用BMFast染料(Boehringer Mannheim，德國)染色，或電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Protran BA 83，Schleicher&Schuell，Dassel，德國)。轉(zhuǎn)移后，用PBS/5％BSA在室溫下對所述膜封閉2小時。用兔抗TT血清(1∶1000)或抗PrtB血清(1∶2000)在室溫下對免疫印跡保溫過夜，再在室溫下用1∶1000稀釋度的辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔IgG保溫3小時，用4-氯-1-萘酚處理2分鐘，使免疫印跡顯色。
如圖1所示，可以觀察到，用合適的抗體檢測，重組約氏乳桿菌顯示是特異性條帶，表明用所述重組細(xì)菌可以產(chǎn)生正確構(gòu)象的所述ε4和所述TT擬表位以及所述蛋白酶PrtB。
實(shí)施例6ELISA檢測約氏乳桿菌(Lal)的表面抗原表達(dá)轉(zhuǎn)化細(xì)菌在含有10μl/ml氯霉素的50ml培養(yǎng)基中生長過夜。以3000×g、4℃離心15分鐘收獲細(xì)菌細(xì)胞，用5ml TBS洗滌，再離心。最后該細(xì)菌沉淀物重新懸浮于900μl TBS和100μl 0.5M碳酸氫鹽緩沖液(pH 9.6)中。Costar EIA/RIA半孔板(Costar，cambridge，MA)在37℃用每孔50μl細(xì)菌液(約108細(xì)菌)包被過夜。用10μl/ml濃度的TTd作為包被抗原，評估包被效率。用PBS/0.1％Tween-20徹底清洗板子，直到?jīng)]有細(xì)菌殘留。用PBS/5％BSA在37℃封閉各孔2小時，用50μl10μl/ml濃度的兔抗TT血清或親和純化的兔抗ε4血清IgG抗體，在37℃保溫4小時。用PBS/0.1％Tween-20清洗六次后，將板子在37℃與1∶1000稀釋度的辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔IgG保溫1.5小時。用PBS/0.1％Tween-20清洗六次，再用四甲基對二氨基聯(lián)苯(TMB；Fluka Chemie AG，Buchs，瑞士)顯色。用1M H2SO4終止反應(yīng)，在450nm處用ELISA讀出器(Molecular devices，Basel，瑞士)測量吸光度值。
如圖2和3所示，抗TT和抗ε4抗體特異性識別表達(dá)TT和ε4擬表位的活重組Lal，表明這兩種擬表位已表達(dá)并展示在所述細(xì)菌細(xì)胞表面。
序列表<110>雀巢制品公司(Société des produits Nestlé S.A.)<120>作為治療和預(yù)防變態(tài)反應(yīng)的藥物的乳酸菌<130>80284<140>
<141>2001-03-02<160>19<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>1Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val1 5<210>2<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>2Arg Asn His Arg Gly Tyr Trp Val1 5<210>3<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>3Arg Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Leu Trp1 5 10<210>4<211>10
<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>4Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly1 5 10<210>5<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>5Val Asn Leu Pro Trp Ser Arg Ala Ser Gly1 5 10<210>6<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>6Val Asn Leu Thr Trp Ser Phe Gly Leu Glu1 5 10<210>7<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>7Val Asn Leu Pro Trp Ser Phe Gly Leu Glu1 5 10<210>8<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>8Val Asn Arg Pro Trp Ser Phe Gly Leu Glu1 5 10
<210>9<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>9Val Lys Leu Pro Trp Arg Phe Tyr Gln Val1 5 10<210>10<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>10Val Trp Thr Ala Cys Gly Tyr Gly Arg Met1 5 10<210>11<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>11Gly Thr Val Ser Thr Leu Ser1 5<210>12<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>12Leu Leu Asp Ser Arg Tyr Trp1 5<210>13<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>13Gln Pro Ala His Ser Leu Gly1 5
<210>14<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>14Leu Trp Gly Met Gln Gly Arg1 5<210>15<211>15<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>15Leu Thr Leu Ser His Pro His Trp Val Leu Asn His Phs Val Ser1 5 10 15<210>16<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>16Ser Met Gly Pro Asp Gln Thr Leu Arg1 5<210>17<211>6<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>17Val Asn Leu Thr Trp Ser1 5<210>18<211>126<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>18
Gln Val Tys Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly20 25 30Gly Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser50 55 60Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe65 70 75 80Ser Leu Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95Cys Ala Arg Glu Arg Gly Glu Thr Gly Leu Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Tyr100 105 110Ile Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210>19<211>112<212>PRT<213>Homo sapiens sapiens<400>19Glu Leu Val Val Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Arg Ser Asp Val Gly Gly Tyr20 25 30Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu35 40 45Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser85 90 95
Ser Thr Leu Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110
權(quán)利要求
1.一種乳酸菌群的細(xì)菌菌株，所述細(xì)菌菌株表達(dá)一種表面多肽，所述多肽含有模擬IgE分子構(gòu)象表位的至少一部分的肽序列。
2.權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株，所述細(xì)菌菌株選自乳桿菌(Lactobacillus)群或雙岐桿菌(Bifidobacterium)群或乳球菌(Lactococcus)群，更優(yōu)選源自嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、約氏乳桿菌(L.johnsonii)、加氏乳桿菌(L.gasseri)、干酪乳桿菌(L.casei)、類干酪乳桿菌(L.paracasei)或路氏乳桿菌(L.reuteri)菌群。
3.權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌菌株，其中所述表面多肽是保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)的細(xì)胞表面錨定蛋白酶。
4.任一前述權(quán)利要求所述的細(xì)菌菌株，其中所述肽序列來源于選自SEQ.ID.No.1-SEQ.ID.No.19的序列。
5.一種食品組合物，所述食品組合物含有任一前述權(quán)利要求的細(xì)菌菌株或其上清液。
6.權(quán)利要求5所述的食品組合物，所述組合物選自乳、酸乳、凝乳、干酪、發(fā)酵乳、基于乳的發(fā)酵產(chǎn)品、冰淇淋、基于發(fā)酵谷物的產(chǎn)品、基于乳的粉末、嬰兒配制食品或?qū)櫸锸称贰?br> 7.權(quán)利要求5或6所述的食品材料，其中所述細(xì)菌菌株的含量范圍為107-1012cfu/劑型。
8.一種藥用組合物，所述藥用組合物含有權(quán)利要求1到4中任一項所述的細(xì)菌菌株。
9.權(quán)利要求8所述的藥用組合物，其中所述細(xì)菌菌株的含量范圍為1010-1012cfu/劑型。
10.權(quán)利要求1到4中任一項的細(xì)菌菌株在制備用于治療變態(tài)反應(yīng)和/或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)發(fā)生的可攝取載體中的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求6到9中任一項的食品組合物或藥用組合物在制備用于治療變態(tài)反應(yīng)和/或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)發(fā)生的可攝取載體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及能降低個體對各種變應(yīng)原產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)傾向的乳酸菌。具體來講，本發(fā)明涉及表達(dá)表面多肽的重組乳酸菌菌株，所述表面多肽包含可作為IgE分子Fc區(qū)的至少一部分的模擬物的肽或抗體片段。本發(fā)明也涉及含有所述微生物或其活性級分的食品或藥物組合物。
文檔編號A61K39/00GK1505678SQ02809094
公開日2004年6月16日 申請日期2002年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月2日
發(fā)明者B·M·施塔德勒, M·沃格爾, J·－E·格爾蒙德, R·弗里特舍, B M 施塔德勒, じ穸 傻, 穸 , 鍰厴 申請人:雀巢制品公司