專利名稱：唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
這項(xiàng)發(fā)明是關(guān)于唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素(Siglec)抑制劑以及含有此種抑制劑的藥品組分。此外，此發(fā)明還提供了提高該抑制劑結(jié)合選擇性的方法，并詳述了此抑制劑的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥。
背景技術(shù)：
Siglecs(能與唾液酸結(jié)合的免疫球蛋白樣凝集素)是類Ig型凝集素，其結(jié)構(gòu)特征是具有一個(gè)能介導(dǎo)唾液酸結(jié)合的N端V組區(qū)段，其Ig區(qū)中C2組Ig區(qū)數(shù)目不同。凝集素家族最初是在單獨(dú)研究唾液酸黏附素(Siglec-1CD169)和CD22(Siglec-2)時(shí)發(fā)現(xiàn)的。唾液酸黏附素(Siglec-1 CD169)是一類巨噬細(xì)胞凝集素類黏附分子。CD22是一個(gè)Ig超家族的B細(xì)胞特異性表面抗原(IgSF)，在激活B細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在體外測(cè)定唾液酸復(fù)合糖時(shí)發(fā)現(xiàn)這兩種分子都能介導(dǎo)細(xì)胞之間的相互作用?？寺⊥僖核狃じ剿乇砻髌浣Y(jié)構(gòu)序列高度類似于CD22分子，因此認(rèn)為，另外兩個(gè)IgSF蛋白髓磷脂相關(guān)性球蛋白(MAG/Siglec-4)和CD33(Siglec-3，以前并不知道該分子結(jié)合到唾液酸)，因具有此種結(jié)構(gòu)關(guān)系也都?xì)w屬于Siglec家族。人類其它6個(gè)Siglec分子(Siglec5-10)也已經(jīng)被鑒定出來(lái)，其特征也被描述。這些以前不為人知的分子顯示出其細(xì)胞內(nèi)外序列均高度類似于CD33，因此它們總的被稱為“CD33相關(guān)SIGLECS”(文獻(xiàn)1綜述)。文獻(xiàn)7描述了來(lái)源于人樹(shù)突狀細(xì)胞的Siglec-11的克隆及特點(diǎn)。
表1概述了上面所提到的Siglec的發(fā)現(xiàn)及潛在功能。
表1 Siglec的發(fā)現(xiàn)及潛在功能

從上面表格可以看出Siglec還參與減輕免疫反應(yīng)，維持組織髓磷脂在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及血細(xì)胞生成。
由Siglec介導(dǎo)的作用有兩種類型一是通過(guò)結(jié)合Siglec分子，引起表達(dá)相應(yīng)Siglec的細(xì)胞產(chǎn)生信號(hào)(如抑制B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)；通過(guò)磷酸化ITIM來(lái)抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性)；二是與Siglec相結(jié)合的細(xì)胞產(chǎn)生信號(hào)(如MAG/Siglec-4)調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)(1，2))Siglecs與其不同的配體結(jié)合時(shí)可引起兩種效應(yīng)(3)第一，單價(jià)物質(zhì)可減少Siglec分子之間以及與其它分子間生物學(xué)上的交聯(lián)，這可減弱信號(hào)；第二，多價(jià)物質(zhì)則能增強(qiáng)觸發(fā)信號(hào)。因此，選用一些合適的特異性物質(zhì)對(duì)這些過(guò)程進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)是可能的。
唾液酸是九碳糖大家族的俗稱，包括了所有神經(jīng)氨酸或KDN的衍生物。一般來(lái)說(shuō)，它們通常存在于與大量的蛋白質(zhì)或脂質(zhì)相連的低聚糖鏈的暴露的非還原端上。
SIGLEC上唾液酸結(jié)合位點(diǎn)存在于N末端區(qū)域，此區(qū)是一V組區(qū)，并有特征性的Siglec的結(jié)構(gòu)。此結(jié)合位點(diǎn)的位置及參與結(jié)合的氨基酸是通過(guò)X線對(duì)Siglec-1(唾液酸黏附素)和2，3-唾液酸乳糖形成的結(jié)晶進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)的。用合成的唾液酸的衍生物(5，6)進(jìn)行半抗原抑制試驗(yàn)可確定唾液酸的結(jié)合部位的作用。簡(jiǎn)而言之，研究表明，在其它方面，唾液酸的C-9位羥基在H鍵結(jié)合時(shí)提供一個(gè)H供體，起實(shí)質(zhì)性作用。此羥基可被一個(gè)氨基取代(5)。
SIGLEC必須有與結(jié)合位點(diǎn)親合力很高的配體才能對(duì)生物功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。
因此，本發(fā)明的目的是提供具有高親合力的SIGLEC抑制劑。特別是提供能夠盡可能特異性地結(jié)合到單一SIGLEC受體上的高親合力的SIGLEC抑制劑。

發(fā)明內(nèi)容
下面是可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的SIGLEC抑制劑的通式
X代表負(fù)電荷基團(tuán)，選自羧基、磷酸根、硫酸根以及它們的衍生物；Y代表H原子、烴基或芳基、羥基、聚糖、多聚糖載體分子或它們的衍生物；Z選自O(shè)，N，C和S原子；R1代表H原子、羥基，或它們的衍生物；R2代表羥基或氨基，或是它們的衍生物；R3代表羥基或是其衍生物；R4代表羥基或是其衍生物；R5代表一個(gè)取代或未被取代的氨基，取代物選自于取代或未被取代的甲酰、烷?；?、環(huán)烷?；?、芳香?；㈦s芳香?；?、烴基、芳基、環(huán)炔或雜芳基，這些殘基都包含一個(gè)或多個(gè)未飽和鍵；其中R4作為H原子受體；R5作為H原子供體；R6代表H原子或烴基、離子基團(tuán)或它們的衍生物；R6’代表H原子或烴基、離子基團(tuán)或它們的衍生物；至少一個(gè)取代物來(lái)自R6，并且R6’是一疏水基團(tuán)，最好是H原子或甲基；R7代表H原子或是其它基團(tuán)，最好是一個(gè)能提高Siglec抑制劑藥理特性的基團(tuán)。
下面說(shuō)明了一些本說(shuō)明書(shū)中使用的專業(yè)術(shù)語(yǔ)。
“Siglec”包括所有的Siglec分子，參考文獻(xiàn)8中可獲得關(guān)于Siglec分子的詳細(xì)定義。例如，Siglec分子中Siglec-1到Siglec-10的氨基酸序列可參考文獻(xiàn)1(表1)。有關(guān)Siglec-11的序列可參考文獻(xiàn)7，此外，也可從公用數(shù)據(jù)庫(kù)(Entraez)中獲得有關(guān)Siglec分子的氨基酸序列(網(wǎng)址www.ncbi.nlm.nih.gov./entrez)。從這方面看，Siglec-1分子可存在于自然界的自然發(fā)生的細(xì)胞或人工模擬環(huán)境中。
“Siglec抑制劑”通常是表示具有抑制唾液酸分子(尤其是其天然配體)結(jié)合到Siglec蛋白的化合物。本發(fā)明中，Siglec抑制劑是激活還是滅活一個(gè)特定的Siglec蛋白，取決于該抑制劑本身的結(jié)構(gòu)。可參考的唾液酸化合物是甲基-α-5’-N-乙酰神經(jīng)氨酸。這種抑制劑最好是通過(guò)半抗原抑制試驗(yàn)確定。半抗原抑制試驗(yàn)是用一個(gè)兔源性Fc嵌合體(此嵌合體由Siglec的N端和人IgG的Fc段構(gòu)成)與放射標(biāo)記的抗Fc抗體混合后，再與各種濃度的待測(cè)抑制劑一起孵育，然后加入合適的靶細(xì)胞(首選人紅細(xì)胞)。經(jīng)過(guò)4℃孵育過(guò)夜后，通過(guò)洗滌清除未結(jié)合的化合物，結(jié)合部分的放射性就可以被確定。用這種方法獲得的資料可確定引起50％的結(jié)合位點(diǎn)抑制時(shí)所需的抑制劑濃度(IC50值)(5，6)。此試驗(yàn)中最好的操作方法是用10μl具有103Bq125I與相同體積、三倍濃度的待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行混合，4℃孵育一小時(shí)，隨后加入10μl靶細(xì)胞懸液(最好是0.25-0.5％的人紅細(xì)胞)，4℃孵育過(guò)夜。未結(jié)合的放射活性物質(zhì)用200μl清洗緩沖液(最好是含有0.1％(w/v)牛血清白蛋白的磷酸根緩沖液生理鹽水)清洗5次將其去除。Y計(jì)數(shù)器可確定細(xì)胞結(jié)合活性。作為控制，通常將不含待測(cè)物質(zhì)的經(jīng)過(guò)及未經(jīng)唾液酸酶處理的細(xì)胞的結(jié)合力作為對(duì)照。將無(wú)抑制劑處理的獲得抑制數(shù)值定為0，唾液酸酶處理的細(xì)胞所活動(dòng)的數(shù)值定為100％。
“衍生物”總的來(lái)說(shuō)與殘基X，Y，R1-R4有關(guān)，神經(jīng)氨酸中此類基團(tuán)被生物等效(BIOISOSTERIC)基團(tuán)所取代，后者表現(xiàn)出同樣的生物學(xué)活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已熟知“生物等效(BIOISOSTERIC)”概念。
“取代的甲酰、烷?；?、芳香?；?、雜芳?；?、烴基、芳基、環(huán)炔或異芳基”，是指這些相關(guān)的基團(tuán)上有取代，但并不改變其生物學(xué)特性。其中包括低碳烴基取代物，如甲基、乙基、丙基、丁基。
本發(fā)明中X代表一個(gè)負(fù)電荷基團(tuán)，推測(cè)它可能與Siglec受體的精氨酸殘基形成一個(gè)鹽橋。其天然發(fā)生的取代物是一個(gè)羧基。適宜的衍生物包括如磷酸根或硫酸根，此外，膦酸根或磺酸根也可作為其衍生物，其他的衍生物還有亞甲基羧基或乙烯羧基。
本發(fā)明中Y代表H原子、烴基或芳基、羥基、聚糖、多聚糖載體分子或它們的衍生物。天然發(fā)生取代物是一個(gè)羥基。這個(gè)羥基適宜的衍生物是一個(gè)氨基或一個(gè)硫代基。適宜的聚糖是己糖、氨基己糖和/或戊糖或它們的衍生物，最好是葡萄糖或半乳糖或是它們的衍生物。此外，聚糖可以是寡聚糖和多糖。寡聚糖和多糖可來(lái)源于一個(gè)或多個(gè)單體(混合糖)。本發(fā)明中要求的多聚體載體分子是具有提高藥理作用的分子，如延長(zhǎng)滯留時(shí)間。結(jié)合許多Siglec抑制劑配體的多聚體載體分子可促進(jìn)交聯(lián)，并隨后引起Siglec受體分子的激活。因此，可通過(guò)應(yīng)用這種多聚體載體分子進(jìn)行很好的調(diào)節(jié)。
本發(fā)明要求的載體分子包含有一個(gè)核心，而數(shù)量不等的本發(fā)明提供的抑制劑通過(guò)合適的襯底固定到載體中。通過(guò)對(duì)含有核心和本發(fā)明提供的抑制劑的多聚體可控制其預(yù)期的藥理學(xué)效應(yīng)。多聚體(核心)是樹(shù)狀聚合大分子(dendrimers)、聚丙烯酰胺或聚丙交酯(polylacde)。本發(fā)明提供的抑制劑可以是通過(guò)化學(xué)或酶學(xué)的方法結(jié)合到多聚體上。
本發(fā)明中Z選自O(shè)，N，C或S原子。
本發(fā)明中R1代表H原子，羥基或他們的衍生物。適合的羥基的衍生物是在應(yīng)用中可被取代的氨基或硫代基。
本發(fā)明中R2代表羥基或氨基，或是它們的衍生物，天然發(fā)生的替代物是一個(gè)乙酰氨基。合適的衍生物是如那些氨基被乙?；?、丙?；?、丁基、戊基取代的物質(zhì)。烷酰基可被一個(gè)或更多的鹵素原子所取代。從文獻(xiàn)5中化合物4至12還可找到更多衍生物。對(duì)R2位進(jìn)行修飾可提高針對(duì)特定Siglec分子的Siglec抑制劑的特異性。
本發(fā)明中R3代表羥基或是其衍生物。就此方面，其合適的衍生物，如可在實(shí)際應(yīng)用中被取代氨基或硫代基。
本發(fā)明中R4代表羥基或是其衍生物。就此方面，其合適的衍生物是那些可作為H離子受體的基團(tuán)。如其衍生物中可以是氨基或硫代基，其可在實(shí)際應(yīng)用中被取代，作為H受體的性質(zhì)則被保留。
本發(fā)明中R6和R6’相互獨(dú)立地代表H原子或羥基，或帶電基團(tuán)或者他們的衍生物，至少一個(gè)取代物來(lái)自R6，并且R6’是一疏水基團(tuán)，最好是H原子或甲基。合適的衍生物是一些低碳烴基取代物如甲基、乙基、丙基、丁基。合適的陰離子基團(tuán)如羧基、磷酸根、硫酸根。
本發(fā)明中R7代表一個(gè)H原子或其它基團(tuán)，這些基團(tuán)最好能提高Siglec抑制劑的藥理學(xué)特性。具有提高Siglec抑制劑的藥理學(xué)特性的基團(tuán)可以是多聚體載體分子。完整的Siglec抑制劑最好應(yīng)該具有恰當(dāng)?shù)挠H水性，使得該抑制劑在親水相和疏水相中具有相同分散性。
此外，本發(fā)明中還考慮到Siglec抑制劑共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合天然復(fù)合糖或糖蛋白的作用。
令人驚奇的是，將疏水性取代物引入到9-氨基-9-脫氧-唾液酸(尤其是神經(jīng)氨酸)的氨基上，就可獲得5’-乙酰神經(jīng)氨酸相關(guān)的更高親合力的Siglec抑制劑。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施例，能獲得特異性結(jié)合某些Siglec蛋白并能抑制它們的Siglec抑制劑。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施例，烷?；x自乙酰基，丙?；?，丁酰基，戊?；?，己?；?，庚?；刘；?，壬?；凸秕；?，優(yōu)選己酰基.本發(fā)明中帶支鏈的烷?；部梢钥紤]。
進(jìn)一步，優(yōu)選的實(shí)施例中，環(huán)烷?；x自C3-C6環(huán)烷?；?，優(yōu)選環(huán)己烷?；?。
優(yōu)選的實(shí)施例中芳?；x自C4-C15芳酰基，優(yōu)選苯甲?；?、萘甲酰基或蒽甲?；?，由此這些殘基主要影響抑制劑的選擇性。通過(guò)適當(dāng)?shù)倪x擇能夠以此調(diào)整抑制劑的選擇性。
另一優(yōu)選的實(shí)施例中，雜芳碳酰基選自吡啶碳?；?，喹那定?；氨搅虼；?。
另一實(shí)施例中烴基選自C1-C20的烴基，最好是選自甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基。
本發(fā)明中具有支鏈的烴基也可考慮。
另一實(shí)施例中環(huán)烴基選自C3-C6環(huán)烴基。
另一實(shí)施例中芳基選自苯基，萘基，二苯基及蒽基。本發(fā)明中芳基也可選自縮合及未縮合的芳基。
雜芳基選自吡啶基，喹那定基及苯硫基。
根據(jù)本發(fā)明，雜芳基還包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知縮合雜芳環(huán)和非縮合雜芳環(huán)。
一個(gè)首選的化合物是甲基-α-9-N-(萘基-2-羰基)-氨基-9-脫氧-Neu-5AC。此唾液酸衍生物結(jié)合到Siglec-1的能力比對(duì)照化合物(2-α-甲基-5-N-乙酰-神經(jīng)氨酸)約強(qiáng)12倍，結(jié)合到Siglec-4a的能力更強(qiáng)(比對(duì)照化合物約強(qiáng)236倍)。
甲基-α-9-N-(聯(lián)苯-4-羰基)-氨基-9-脫氧-Neu5Ac也要作為優(yōu)選。此化合物結(jié)合Siglec-2的能力比對(duì)照化合物2-a-甲基-5-N-乙?；?9-神經(jīng)氨酸約強(qiáng)150倍。
另外，甲基-α-9-N-苯氨基-9-脫氧-Neu-5AC也作為優(yōu)選。此化合物結(jié)合Siglec-4a(MAG)的能力比對(duì)照化合物2-α-甲基-5-N-乙?；?神經(jīng)氨酸約強(qiáng)704倍。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明提供的SIGLEC抑制劑中X代表位于軸向位置的羧基；Y代表氫原子，鄰位甲基、鄰位苯甲基或一個(gè)羥基的衍生物；Z代表個(gè)O原子；R1代表羥基；R2代表氨基乙酰基；R3代表羥基；R4代表羥基；R6代表H原子；R6’代表H原子；R7代表H原子。
除了Y以外，這里所引用的取代物與唾液酸中天然發(fā)生的取代物相匹配。
本發(fā)明還提供了具有Siglec高親合力的Siglec抑制劑的的制造方法，其包括如下步驟A、在神經(jīng)氨酸或其衍生物的R5位置引入選自本發(fā)明提供殘基的取代物；
B、測(cè)定上述取代物產(chǎn)物與某一Siglec分子親合力；C、選擇出具有高親合力的產(chǎn)物；D、根據(jù)實(shí)際需要，可對(duì)C步產(chǎn)物，在除R5位外的其他位置進(jìn)行取代，優(yōu)選R2位置。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，將一個(gè)疏水性取代物引入神經(jīng)氨酸或其衍生物的R5位，可獲得具有針對(duì)Siglec分子的較高親合力的Siglec抑制劑?？赏ㄟ^(guò)結(jié)合試驗(yàn)或半抗原抑制試驗(yàn)，可對(duì)針對(duì)某一特定Siglec分子測(cè)定產(chǎn)物的親合力。半抗原抑制試驗(yàn)所需的實(shí)驗(yàn)條件，前已述及，優(yōu)選文獻(xiàn)5，6所述。通過(guò)進(jìn)一步在R5位之外引入，最好是R2位，取代物，可增強(qiáng)針對(duì)某一特定Siglec分子所選出的產(chǎn)物的親合力。適合的R5位的取代物也是適合于R2位的取代物。
本研究還提供了提高Siglec抑制劑結(jié)合選擇性的方法，包括在神經(jīng)氨酸或其衍生物的R5位上引入權(quán)利要求1-10之一中所述的選自R5殘基的取代物。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，根據(jù)他們的專業(yè)知識(shí)，按照本項(xiàng)發(fā)明來(lái)合成這個(gè)化合物原則上是可能的。首選的合成原料是5-N-乙?；窠?jīng)氨酸。可通過(guò)一系列反應(yīng)生成烴基、芳基、烴基-α-O-或α-S-糖苷。
下一步是用一個(gè)氨基取代5-N-乙?；窠?jīng)氨酸中O或S-糖苷C9位(本發(fā)明中的R5)的羥基。這種轉(zhuǎn)換可通過(guò)合適化合物9-O-甲苯磺酰(9-O-tosyl)完成。此反應(yīng)最好使用改良的Mitsunobu反應(yīng)完成。因此，該方法獲得9-氨基-9-脫氧-5-N-乙酰-神經(jīng)氨酸的烴基、芳基、烴基-α-O或α-S-糖苷可提供合成5-N-乙酰-9-(聯(lián)苯-4-羰基)-氨基-9-脫氧-神經(jīng)氨酸或其類似物(此類似物C-9(本發(fā)明中的R5)位穩(wěn)定的氨基上有一個(gè)可變的芳基)所需的烴基、芳基、烴基-α-O或α-S-糖苷。多種方法可使氨基獲得酸性功能，如用鹽酸或酸酐，或借助碳化二亞胺，或通過(guò)硝基苯酚、五氟酚等來(lái)激活其酸性功能本項(xiàng)發(fā)明還提供了藥物組合物，它包括至少一種本發(fā)明提供Siglec抑制劑及一種藥學(xué)上可用的載體。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施例，用于治療的Siglec抑制劑對(duì)于Siglec分子應(yīng)盡可能具有選擇性。藥學(xué)上可用的載體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是早已熟知的。此外還要有合適的稀釋劑。一般來(lái)說(shuō)，任何一種給藥方法都是可行的，即可通過(guò)靜脈、腹腔內(nèi)、皮下、皮內(nèi)注射及口服給藥，但首選的是口服給藥。
醫(yī)生可按常規(guī)決定給藥劑量。
另外，本發(fā)明中Siglec抑制劑還可用于治療由Siglec介導(dǎo)的疾病，尤其是免疫系統(tǒng)疾病。Siglec-2參與B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，因此，本發(fā)明中的Siglec抑制劑可用于調(diào)節(jié)B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)?；谝陨嫌^點(diǎn)，過(guò)敏反應(yīng)、自身免疫性疾病、慢性炎癥都可用Siglec抑制劑進(jìn)行治療。
Siglec-4a具有軸突生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，本發(fā)明中的Siglec抑制劑可用來(lái)對(duì)抗Siglec-4的軸突生長(zhǎng)抑制作用，因此具有促進(jìn)損傷的神經(jīng)的再生能力，如可用于治療截癱。再如，Siglec-7參與調(diào)控自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的細(xì)胞毒性作用，因此根據(jù)本發(fā)明的唾液酸衍生物可用來(lái)調(diào)節(jié)這些細(xì)胞的細(xì)胞毒性。如可用于治療腫瘤、病毒感染尤其是AIDS。
有研究提示，其它的Siglecs參與調(diào)控免疫系統(tǒng)，參考表1。因此本發(fā)明提供Siglec抑制劑也用來(lái)調(diào)控免疫系統(tǒng)。
本發(fā)明提供的Siglec抑制劑可增強(qiáng)B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，這點(diǎn)可通過(guò)Ca2+分泌增多得到證實(shí)。采用本發(fā)明的Siglec抑制劑可引起Ca2+分泌增多，已經(jīng)在鼠Daudi細(xì)胞或B細(xì)胞試驗(yàn)中得到驗(yàn)證。此發(fā)明中，運(yùn)用Siglec抑制劑可增強(qiáng)B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。這一事實(shí)為免疫缺陷病治療藥物的研制開(kāi)辟了新的前景。與此相關(guān)的首選化合物是甲基-α-9-N-(聯(lián)二苯基-4-羰基)-氨基-9-脫氧-Neu5AC(舉例子中已提到)。此種化合物還表現(xiàn)出對(duì)人CD22高度選擇性親合力，這些抑制劑可能的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥是那些B細(xì)胞激活失調(diào)引起的免疫性疾病，如臨床上常見(jiàn)的各種免疫缺陷病(CVID)和IgA缺陷癥。CVID病人B細(xì)胞不能啟動(dòng)有效的免疫反應(yīng)，并表現(xiàn)出低丙種球蛋白血癥，他們易于發(fā)生嚴(yán)重感染。目前治療僅靠免疫球蛋白，但后者因具有很強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)性、較窄的適應(yīng)范圍而被認(rèn)為是一個(gè)有爭(zhēng)議的療法。IgA缺陷癥的病人也可用免疫球蛋白治療，但基于上述原因以及該類病人通常癥狀輕微，其應(yīng)用并不廣泛。
下面用例子對(duì)該發(fā)明進(jìn)行了說(shuō)明，但本發(fā)明的范圍不應(yīng)局限于此。在利用本發(fā)明時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)本發(fā)明實(shí)施其他應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
材料和方法Siglec抑制劑的合成將上面提到的一種物質(zhì)甲基-α-5-N-乙?；?9--氨基-9-脫氧-神經(jīng)氨酸上的氨基酰化作為例子。這里描述了合成甲基-α-5-N-乙?；?9-N-(聯(lián)苯-4-羰基)-氨基-9-脫氧-神經(jīng)氨酸的方法。
甲基-α-5-N-乙?；?9--疊氮基-9-脫氧-神經(jīng)氨酸(1)1、根據(jù)文獻(xiàn)提供的方法，經(jīng)過(guò)對(duì)酯基適當(dāng)?shù)?-疊氮化和皂化作用，從甲基-α-5-N-乙?；?9-O-甲苯磺酰基-神經(jīng)氨酸甲酯中合成。
2.采用Mitsunobu反應(yīng)體系，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)，直接從已知的甲基-α-N-乙?；?神經(jīng)氨酸合成。
將0.1g甲基-α-5-N-乙酰基-神經(jīng)氨酸的三乙氨鹽溶于0.4ml干吡啶和1ml N，N-二甲基-甲酰氨中(DMF)，得到的溶液在真空中濃縮，再用干燥的DMF熏1-2次(A)。0.19g的四甲基胍溶于0.25ml干吡啶和1ml DMF所形成的混合液中，得到的溶液在真空中濃集，再用干燥DMF熏1-2次(B)。將A溶液溶于0.8ml DMF中，并加入B溶液和0.13ml 98-100％甲酸形成的混合液，將A+B溶液加入到含有0.17g三苯膦和0.125ml偶氮二碳酸二異丙酯(diisopropylazodicarboxylate)的干燥1.2ml四氫呋喃混合液中，使用前需先在0℃孵育15分鐘。反應(yīng)溫度控制在0℃-20℃，大約24小時(shí)后終止反應(yīng)，并加入0.5ml甲醇。得到的溶液在真空中濃縮，用乙酸乙酯/H2O或亞甲氯/H2O震蕩搖出，并用硅膠色譜儀測(cè)定(閃爍法)。
洗脫物首先甲醇/乙酸乙酯/乙酸(20％)1/6/1，后為1/4/1。
產(chǎn)率理論上為70-80％甲基-a-5-N-乙?；?9-氨基-9-脫氧-神經(jīng)氨酸(2)在常壓下用氧化鈀在水中對(duì)9-疊氮化合物(1)進(jìn)行氫化。
產(chǎn)率95％甲基-α-5-N-乙?；?9-N-(聯(lián)苯-4-羰基)-氨基-9-脫氧-神經(jīng)氨酸(3)在含有N，N’二環(huán)己基碳二酰亞胺的乙酸乙酯中，0.4g聯(lián)苯-4-羧酸與0.28g硝基苯酚，室溫下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成聯(lián)苯(4)-羧酸4-硝基苯酯，后者在乙酸乙酯/二乙酯/己烷中結(jié)晶析出。
甲基-α-5-N-乙?；?9-脫氧-神經(jīng)氨酸(2)30mg溶于0.6ml干燥DMF中，在室溫下，在12.9ml三乙胺存在的前提下，與39mg上述硝苯基酯反應(yīng)完全。通過(guò)硅膠色譜儀進(jìn)行純化分析(閃爍法)。
洗脫物首先甲醇/乙酸乙酯/乙酸(20％)1/6/1，后用1/5/1，最后1/4/1?；衔?3)的產(chǎn)率93％高分辨NMR分光鏡檢查及FAB-MS可顯示合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
半抗原抑制試驗(yàn)半抗原抑制試驗(yàn)在參考文獻(xiàn)(5，6)提供的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行。
結(jié)果表2





IC50值是指在半抗原抑制試驗(yàn)中，Siglec抑制劑引起50％結(jié)合位點(diǎn)抑制時(shí)，該抑制劑的濃度。每種唾液酸衍生物的rIP值是通過(guò)對(duì)照化合物5-N-乙酰神經(jīng)氨酸的IC50值與待測(cè)化合物的IC50值的比值來(lái)確定的。riP值＞1.0的唾液酸衍生物比參考的化合物具有更好的結(jié)合力，而riP值＜1.0的唾液酸衍生物比參考的化合物結(jié)合力差。n.d.表示沒(méi)有測(cè)定。
化合物BPC--Neu5AC被用來(lái)按已知的方法評(píng)價(jià)選擇性和活性，在BPC-Neu5AC存在的情況下，用抗IgM抗體刺激Daudi細(xì)胞可引起Ca2+濃度增高。這種化合物也可明顯提高經(jīng)抗IgM刺激的人血B淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。這些資料提示，經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)增強(qiáng)是由于選擇性抑制CD22的配體結(jié)合區(qū)域引起的。配體結(jié)合的減弱引起CD22胞內(nèi)段抑制劑區(qū)的部分激活。
(甲基-α-9-N-(聯(lián)苯-4-羰基)-氨基-9-脫氧-Neu5Ac)(BPC-Neu5Ac)
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權(quán)利要求
1.具有如下結(jié)構(gòu)的唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素抑制劑 X代表負(fù)電荷基團(tuán)，選自羧基、磷酸根、硫酸根以及它們的衍生物；Y代表H原子、烴基或芳基、羥基、聚糖、多聚糖載體分子或它們的衍生物；Z選自O(shè)，N，C和S原子；R1代表H原子、羥基，或它們的衍生物；R2代表羥基或氨基，或是它們的衍生物；R3代表羥基或是其衍生物；R4代表羥基或是其衍生物；R5代表一個(gè)取代或未被取代的氨基，取代物選自于取代或未被取代的甲?；⑼轷；?、環(huán)烷酰基、芳香?；?、雜芳香?；?、烴基、芳基、環(huán)烴基或雜芳基，這些殘基都包含一個(gè)或多個(gè)未飽和鍵；其中R4作為H原子受體，R5作為H原子供體；R6代表H原子或烴基、離子基團(tuán)或它們的衍生物；R6’代表H原子或烴基、離子基團(tuán)或它們的衍生物；至少一個(gè)取代物來(lái)自R6，并且R6’是一疏水基團(tuán)，最好是H原子或甲基；R7代表H原子或是其它基團(tuán)，最好是一個(gè)能提高Siglec抑制劑藥理特性的基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Siglec抑制劑，其特征在于烷?；x自乙?；?，丙?；?，丁?；祯；?，己?；；?，辛酰基，壬酰基和癸?；?，優(yōu)選己酰基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Siglec抑制劑，其特征在于環(huán)烷?；x自C3-C6中的環(huán)烷?；?，優(yōu)選環(huán)己?；?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Siglec抑制劑，其特征在于芳香?；x自C4-C15芳香酰基，優(yōu)選苯甲酰基、萘甲?；蜉旒柞；?。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Siglec抑制劑，其特征在于雜芳香?；x自吡啶?；?，喹那定羰基和苯硫酰基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Siglec抑制劑，其特征在于烴基選自C1-C20的烴基，優(yōu)選甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Siglec抑制劑，其特征在于環(huán)烴基選自C3-C6的環(huán)烴基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Siglec抑制劑，其特征在于芳基選自苯基，萘基及蒽基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Siglec抑制劑，其特征在于雜芳基選自于吡啶基和苯硫基。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Siglec抑制劑，其特征在于X代表位于軸向位置的羧基；Y代表氫原子，鄰位甲基、鄰位苯甲基或一個(gè)羥基的衍生物；Z代表個(gè)O原子；R1代表羥基；R2代表氨基乙?；?；R3代表羥基；R4代表羥基；R6代表H原子；R6’代表H原子；R7代表H原子。
11.提高抑制劑親和選擇性的方法，包括在神經(jīng)氨酸或其衍生物的R5位上引入權(quán)利要求1-10之一中所述的R5殘基取代物。
12.合成具有對(duì)SIGLEC分子高親合力Siglec抑制劑的方法，包括A.在神經(jīng)氨酸或其衍生物的R5位上引入權(quán)利要求1-10之一中所述的R5殘基取代物；B.測(cè)定上一步產(chǎn)物對(duì)某一SIGLEC分子的親合力；C.選擇具有高親合力的產(chǎn)物；D.必要情況下，可對(duì)C步產(chǎn)物的在除R5位外的其他位置進(jìn)行取代，優(yōu)選R2位置。
13.藥物組合物，含有權(quán)利要求1-10之一所述的Siglec抑制劑和藥學(xué)上適合的載體。
14.權(quán)利要求1-10之一所述的Siglec抑制劑在治療Siglec介導(dǎo)的疾病中的應(yīng)用。
15.權(quán)利要求1-10之一所述的Siglec抑制劑用于調(diào)節(jié)B細(xì)胞介導(dǎo)的的免疫反應(yīng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的Siglec抑制劑在治療過(guò)敏反應(yīng)，自身免疫性疾病和慢性炎癥中的應(yīng)用。
17.權(quán)利要求1-10之一所述的Siglec抑制劑在改善損傷神經(jīng)的再生能力的應(yīng)用。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的Siglec抑制劑在治療截癱和多發(fā)性硬化中的應(yīng)用。
19.權(quán)利要求1-10之一所述的Siglec抑制劑在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性中應(yīng)用。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的Siglec抑制劑用于治療腫瘤性疾病。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的Siglec抑制劑用于治療病毒感染。
22.根據(jù)權(quán)利要求15所述的Siglec抑制劑用于增強(qiáng)B細(xì)胞免疫反應(yīng)，尤其適用于免疫缺陷病人。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)受體分子具有高親合力的唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素(SIGLEC)抑制劑。本發(fā)明提供的SIGLEC抑制劑能特別對(duì)某一已知的SIGLEC分子具有選擇性。本發(fā)明還提供了制備這些SIGLEC抑制劑的方法，以及增加對(duì)某一特定SIGLEC分子選擇性的方法。本發(fā)明還提供了含有該抑制劑的藥物組合物以及這些抑制劑在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P37/08GK1656113SQ02812170
公開(kāi)日2005年8月17日 申請(qǐng)日期2002年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月19日
發(fā)明者偌格·凱姆, 瑞恩哈爾德·布諾斯默 申請(qǐng)人:偌格·凱姆, 瑞恩哈爾德·布諾斯默