專利名稱：用于光動力診斷或治療的可注射蓋倫制劑配方及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于光動力診斷或治療(PDT)的可注射蓋倫制劑配方，它包含由改性細(xì)菌葉綠素產(chǎn)生的光敏劑和制藥學(xué)上可接受的水相賦形劑。
本發(fā)明還涉及制備這種可注射蓋倫制劑配方的方法。
背景技術(shù)：
五十多年前就已經(jīng)揭示出卟啉可積聚在腫瘤組織中并可以通過就地吸收光線而在這些被輻照的腫瘤組織中發(fā)射熒光。
正是基于這些性質(zhì)，卟啉被證明可構(gòu)成一種通過熒光定位檢測腫瘤的引人注目的方法。
近些年，在癌癥治療中使用光敏劑成為眾多具有廣闊前景的研究課題的研究對象，使得人們對這項以光動力療法(PDT)而著稱的技術(shù)的關(guān)注不斷增強。
在這種光動力治療(PDT)技術(shù)中，給藥能夠在細(xì)胞增殖的組織中優(yōu)先定位的光敏劑，并使用單色光(激光)或多色光(燈)且其波長可被光敏物質(zhì)吸收的光照射這些組織。
本身無毒的光敏物質(zhì)在通過吸收光子被激發(fā)后具有把能量傳遞給周圍的氧后返回其基態(tài)的性質(zhì)，氧的形式則為單態(tài)氧(II型光氧化)和/或氧自由基(I型光氧化)。
氧的這些衍生物具有很強的活性，并且有毒，它們氧化與之接觸的所有組織成分。
而且，它們幾乎不散逸且存留時間短，使得通過輻照光敏劑產(chǎn)生的光毒性作用保留在局部范圍內(nèi)。
光動力療法的主要適應(yīng)癥主要涉及癌學(xué)、病毒學(xué)、眼科學(xué)，尤其是老年黃斑變性(DMLA)的治療、心臟病學(xué)(血管成形術(shù)后的動脈再狹窄)、風(fēng)濕病學(xué)和皮膚病學(xué)。
目前已經(jīng)研究了大量光敏分子在光動力治療中的應(yīng)用。
關(guān)于血卟啉衍生物，尤其是Photofrin(卟吩姆鈉，一種二血卟啉的醚和酯混合物，由Quadra Logic Technologies，Inc.Vancouver，BC，Canada銷售)在光動力治療中的應(yīng)用已經(jīng)得到廣泛研究(如參見Dougherty，T.J.，Photochem.Photobiol.，46，569(1987)；Kessel等人Photochem.Photobiol.，46 563(1987)；Dougherty，T.J.，Semin.Surg.Oncol.，2，24(1986)；McCaughan，J.S.，Photochem.Photobiol.46，903(1987)；以及Gomer，C.J.，Semin.Hematol.，26(1)27(1989))。
大部分臨床研究使用了由卟啉化合物(卟啉、血卟啉、羥基-乙基-乙烯基-次卟啉、原卟啉的單體以及卟啉二聚物和聚合物)的混合物構(gòu)成的血卟啉衍生物(HPD)(例如，參見Dougherty，T.J.，Photochem.Photobiol.46，569(1987))。
從這些研究可以看出這些血卟啉衍生物的治療應(yīng)用有兩個主要缺陷。
第一其波長可激活化合物的光并不能足夠深地穿透到組織中(例如，參見Doiron等人，pp.281-291Porphyrins in Tumor Phototherapy，由A.Andreoni和R.Cuulbreddu編輯，Plenum Press，New York，1984)，使得這些化合物的應(yīng)用被限制在治療較小的腫瘤，而不能治療位于組織深處的腫瘤。
這類血卟啉衍生物的第二個主要缺陷是它們有積聚在患者組織中的趨勢，尤其會引起皮膚和眼睛的光過敏反應(yīng)，這會在治療后持續(xù)四到八周的時間，這就必須采取特殊的預(yù)防措施，如不暴露在太陽下，涂抹全效防曬霜，穿著適當(dāng)?shù)囊挛锊⑴浯魈栫R。
Photofrin是獲得市場準(zhǔn)入(AMM)用于光動力療法的這類血卟啉衍生物的唯一實例(如1994年在美國，自1996年起在歐洲獲得市場準(zhǔn)入(AMM))，它是一種可注射的水溶液，包含吸收630nm光的卟啉化合物的混合物，所引起的皮膚和眼睛的光過敏反應(yīng)在治療之后還會持續(xù)兩個月。
為了消除上述血卟啉衍生物的缺陷，出現(xiàn)了新一代光敏劑，它們的共同特點是它們都是具有確定結(jié)構(gòu)的純化合物，吸收波長在650-800nm之間的光。
用于光動力治療并屬于第二代光敏劑的例子是苯并卟啉衍生物(如參見A.M.Richter，S.Yip，H.Meadows等人“Photosensitizing potenciesof the structural analogues of benzoporphyrin derivative in differentbiological test systems”J Clin Laser Med Surg 1996，14，335-341；J.G.Levy，A.Chan.H.A.Strong“The clinical status of benzoporphyrinderivative”SPIE 1996，262586-95；U.Schmidt-Erfurht，W.Bauman，E.Gragoudas等人“Photodynamic therapy of experimental choroidalmelanoma using lipoprotein-delivered benzoporphyrin”O(jiān)phtalmology1994，10189-99)。
這類苯并卟啉衍生物的優(yōu)點在于，可以用比激活血卟啉衍生物更長的波長(～690nm)的光來激活化合物，從而使光更深地穿透到組織當(dāng)中。
而且，使用這類苯并卟啉衍生物被證明可以顯著地減少皮膚和眼睛的光過敏反應(yīng)。
不過，苯并卟啉衍生物(BPD)的主要缺陷是不溶于水介質(zhì)，使得它們的通過腸胃道外的給藥顯得很困難。
美國專利US-A-5.289.378提出通過把苯并卟啉衍生物加到脂質(zhì)體中來減輕此缺陷。
作為在光動力療法中用于治療其中老年黃斑變性(DMLA)占據(jù)明顯優(yōu)勢的中心新血管形成的包含苯并卟啉衍生物的脂質(zhì)體可注射配方的例子，可以列舉Visudyne(Ciba-Vision)，它包含作為光敏分子吸收波長為690nm的光并且隨著時間的推移僅僅導(dǎo)致有限的皮膚和眼睛的光過敏反應(yīng)的verteporfin。
尤其可以列舉具有下述通式的細(xì)菌葉綠素衍生物作為屬于新一代的用于光動力治療的光敏劑的其它例子
其中，M表示金屬原子或兩個氫原子，R1、R2和R3各自獨立地表示氫原子或可變基團。
舉例來說，這些化合物的命名如下當(dāng)M代表鎂R1代表葉綠基R2代表H原子R3代表-COOCH3基團的時候，則被稱作Bchl或細(xì)菌葉綠素當(dāng)M代表鎂R1代表H原子R2代表H原子R3代表-COOCH3基團的時候，則被稱作Bchlide或細(xì)菌脫植基葉綠素；以及當(dāng)M代表2個氫原子，且R1代表H原子R2代表H原子R3代表-COOCH3基團的時候，則被稱作
BPhéide或細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸。
這類衍生物中的一些在DE-A-41 21 876，EP-A-0584 552和WO97/19081中特別得到描述。
被證明特別有益的其它細(xì)菌葉綠素衍生物是其中鎂原子被鈀原子取代的細(xì)菌葉綠素衍生物，如在WO 00/33833中所描述的。
在WO 00/33833中描述并且其中金屬被改性的這些細(xì)菌葉綠素衍生物中，具有如下通式(I)的化合物以及它們的鹽被證明特別有利， 其中R2代表H、OH或COOR4基團，其中R4是氫或C1-C12烷基或C3-C12環(huán)烷基R3代表H、OH或C1-C12烷基或烷氧基，并且*表示不對稱碳，而且在上述式(I)所示化合物中，具有下式(II)的鈀-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a或其鹽隨著時間的推移與其它細(xì)菌葉綠素衍生物相比被證實具有非常令人滿意的光毒性和穩(wěn)定性，
而且，又被稱作Pd-Bphéide a的鈀-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a吸收波長約為760nm的光，也就是說，所用波長比其它光敏劑要長，這樣可使光更深入地穿透到組織中，并且它幾乎不會或完全不會引起皮膚的光過敏反應(yīng)。
不過，具有上式(I)的所有化合物都具有非常明顯的親脂性，非常容易在水介質(zhì)中聚集，使得它們的通過腸胃道外給藥應(yīng)用很困難。
WO 00/33833特別要求保護一種包含上式(I)的化合物，優(yōu)選上式(II)的Pd-Bphéide a和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
在WO 00/33833的說明書中，還提到為了制備這種可通過系統(tǒng)方式給藥的藥物組合物，必須加入一定量無毒的并且足以溶解該化合物的表面活性劑。
在WO 00/33833中特別描述并且用于動物活體實驗的包含Pd-Bphéide a的組合物包括溶解光敏劑所需的大量CrémophoreEL(20-50％).
在這類組合物中，CrémophoreEL起到了表面活性劑的作用，它可以減少聚集體形成并且溶解Pd-Bphéide a。
CrémophoreEL是一種可在市場上購買的聚氧乙烯蓖麻油類的乳化賦型劑，它為人熟知是由于其能夠溶解各種不同親脂有效成分而被用在藥物組合物中。
不過，含有多于5％的CrémophoreEL的組合物難以在人體內(nèi)以系統(tǒng)方式使用，因為已知會出現(xiàn)過敏類不良后果。
用已知在注射液中用作親脂成分溶解劑的其它表面活性劑，如Solutol HS 15TM、丙撐二醇、多乙氧基醚、大豆卵磷脂、蛋卵磷脂和N-甲基吡咯烷酮(Pharmasolve)代替CrémophoreEL的實驗沒有取得令人滿意的結(jié)果。
鑒于用作光動力治療中的光敏劑的上述式(I)化合物，特別是上述式(II)Pd-Bphéide a的特別有利的性質(zhì)，需要提供一種能夠?qū)θ梭w進(jìn)行靜脈給藥且不會由于存在賦形劑而有出現(xiàn)并發(fā)癥危險的包含上式(I)化合物的蓋倫制劑配方。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可注射的蓋倫制劑配方，在該配方中，具有上式(I)的化合物完全溶解，并且包含非常少量的表面活性劑。
本發(fā)明的目的在發(fā)明人出人意料地注意到以下事實之后得以實現(xiàn)，即在Pd-Bphéide a中加入少量非水助溶劑，即加入少量芐醇/乙醇混合物或丙撐二醇可以將Pd-Bphéide a成鹽后溶解在水介質(zhì)中。
根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及一種用于光動力治療或診斷(PDT)的可注射蓋倫制劑配方，所述蓋倫制劑配方包括-由下述通式(I)表示的化合物 其中R2代表H、OH或COOR4基團，其中R4是氫或C1-C12烷基或是C3-C12環(huán)烷基R3代表H、OH或C1-C12烷基或烷氧基，并且*表示不對稱碳，其存在形式為堿金屬鹽，用量不超過10mg/ml，作為光敏劑，以及-藥學(xué)上可接受的水相賦形劑，其特征在于藥學(xué)上可接受的該水相賦形劑至少包括用作光敏劑溶解劑的其中混合比為15∶85-25∶75的芐醇-乙醇混合物或丙撐二醇，和可減少光敏劑聚集的其數(shù)量相對于配方總重不超過20％的表面活性劑。
根據(jù)第二方面，本發(fā)明涉及用在光動力診斷或治療(PDT)中包含作為光敏劑且用量多達(dá)10mg/ml的呈堿金屬鹽形式的由以下通式(I)所表示的化合物和藥學(xué)上可接受的水相賦形劑的可注射蓋倫制劑配方的制備方法 其中R2代表H、OH或COOR4基團，其中R4是氫或C1-C12烷基或是C3-C12環(huán)烷基R3代表H、OH或C1-C12烷基或烷氧基，并且*表示不對稱碳，所述方法依次包括下列步驟(1)用混合比為15∶85-25∶75的芐醇-乙醇混合物或丙撐二醇所構(gòu)成的溶解劑浸潤式(I)所示呈其酸形式的光敏劑；(2)添加所用重量相對于配方最終重量不超過20％的表面活性劑；(3)添加用量足以中和式(I)光敏劑的酸性官能團的堿金屬氫氧化物；(4)攪拌水相混合物，其方式足以使光敏劑充分成鹽并且完全溶解。
(5)添加緩沖劑，以把pH調(diào)節(jié)到生理上可接受的值7.2±0.4；(6)必要時，借助用于可注射制劑的水調(diào)節(jié)配方的體積。
根據(jù)第三方面，本發(fā)明涉及利用此方法獲得的可注射蓋倫制劑配方產(chǎn)物。
本發(fā)明的蓋倫制劑配方包括非常少量的表面活性劑，其主要作用是減少聚集體形成。
本發(fā)明由此提供一種蓋倫制劑配方，其中光敏劑，即以鹽形式存在的具有上式(I)的化合物完全溶解，該配方在光動力治療領(lǐng)域可以以對人體造成很小危險的方式注射入人體。
通過閱讀以下本發(fā)明詳細(xì)描述部分了解本發(fā)明的其它優(yōu)點。
本發(fā)明的詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明，在光動力治療中應(yīng)用的可注射蓋倫制劑配方包括-用作光敏劑的堿金屬鹽形式的式(I)化合物 其中R2代表H、OH或COOR4基團，其中R4是氫或C1-C12烷基或C3-C12環(huán)烷基R3代表H、OH或C1-C12烷基或烷氧基，并且*表示不對稱碳，以及-藥學(xué)上可接受的水相賦形劑。
在本發(fā)明的蓋倫制劑配方中，具有上式(I)的化合物優(yōu)選是具有下式(II)的堿金屬鹽形式的Pd-Bphéide a
式(I)化合物或式(II)化合物的堿金屬鹽可以是鈉鹽或鉀鹽。
優(yōu)選地，式(I)化合物或式(II)化合物的堿金屬鹽是鈉鹽。
具有上式(I)的化合物，特別是由上式(II)所表示的Pd-Bphéidea以及它們的堿金屬鹽可通過諸如WO 00/33833所描述的方法制備。
包含在本發(fā)明的可注射蓋倫制劑配方中的光敏化合物的量不應(yīng)超過10mg/ml，因為如果其用量超過10mg/ml，則該光敏化合物不能完全溶解。
當(dāng)該可注射蓋倫制劑配方被用于光動力治療領(lǐng)域時，包含在該配方中的光敏劑的用量優(yōu)選不應(yīng)低于0.1mg/ml，因為如果低于這個濃度，有待給藥的該配方的體積會過大。
不過，如果本發(fā)明的可注射蓋倫制劑配方用于光動力診斷領(lǐng)域，則可以考慮低于0.1mg/ml的光敏劑用量。
包含在本發(fā)明可注射蓋倫制劑配方中的藥學(xué)上可接受的水相賦形劑的目的是溶解光敏劑，同時為配方提供長期穩(wěn)定性。
這種藥學(xué)上可接受的水相賦形劑至少包括作為光敏劑溶解劑的芐醇-乙醇混合物或丙撐二醇，以及能夠減少光敏劑聚集的其數(shù)量相對于配方總重不超過20％的表面活性劑。
當(dāng)該藥物賦形劑包括作為溶解劑的芐醇-乙醇混合物時，芐醇與乙醇的混合比例應(yīng)當(dāng)為15∶85-25∶75v/v。
當(dāng)混合物中芐醇的比例低于15時，光敏劑不能完全溶解。
當(dāng)混合物中芐醇的比例高于25時，混合物不再與水混溶。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，該賦形劑包含其中芐醇與乙醇的混合比為20∶80的芐醇-乙醇混合物。
芐醇-乙醇混合物優(yōu)選地以相對于配方總體積不超過5％的數(shù)量包含在該賦形劑中。
根據(jù)歐洲藥典和美國藥典(USP)的規(guī)定，本發(fā)明可注射蓋倫制劑配方中所含的芐醇和乙醇應(yīng)當(dāng)符合在可注射配方中使用所需的純度要求。
當(dāng)該藥物賦形劑包括丙撐二醇作為潤濕劑時，丙撐二醇優(yōu)選地以相對于配方總體積不超過5％的數(shù)量包含在該賦形劑中。
根據(jù)歐洲藥典和美國藥典(USP)的規(guī)定，本發(fā)明可注射蓋倫制劑配方中所含的丙撐二醇應(yīng)當(dāng)符合在可注射配方中使用所需的純度要求。
包含在藥學(xué)上可接受的水相賦形劑中的表面活性劑可以是能夠減少光敏劑在可注射蓋倫制劑配方中聚集的任何表面活性劑，并且其含量不超過整個配方重量的20％。
舉例來說，這種表面活性劑可以是CrémophoreEL(BASF，德國)、CrémophoreEL P(BASF，德國)、Solutol HS 15TM(BASF，德國)、丙撐二醇、多乙氧基醚、大豆卵磷脂、蛋卵磷脂和N-甲基吡咯烷酮(Pharmasolve，BASF，德國)。
優(yōu)選地，該表面活性劑是CrémophoreEL、CrémophoreELP或Solutol HS 15TM。
本發(fā)明特別優(yōu)選的配方包括作為表面活性劑的其數(shù)量相對于配方總體積不超過5％的CrémophoreEL或CrémophoreEL P。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，該配方包括0.25％(重)Pd-Bphéide a、5％(體積/重量)其中芐醇∶乙醇混合比為20∶80的芐醇-乙醇混合物，以及5％(重)CrémophoreEL P。
本發(fā)明的可注射蓋倫制劑配方可根據(jù)依次包括下述步驟的方法來制備(1)用混合比為15∶85-25∶75的芐醇-乙醇混合物或丙撐二醇所構(gòu)成的溶解劑浸潤呈其酸形式的式(I)或式(II)所示光敏劑；(2)添加所用重量不超過配方最終重量20％的表面活性劑；(3)添加用量足以中和具有式(I)或式(II)光敏劑的酸性官能團的堿金屬氫氧化物水溶液；(4)攪拌該水相混合物，其方式足以使光敏劑充分成鹽并且完全溶解。
(5)添加緩沖劑，以把pH調(diào)節(jié)到生理上可接受的值7.2±0.4；(6)必要時，借助用于可注射制劑的水調(diào)節(jié)配方的體積。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，優(yōu)選地，溶解劑以不超過配方總體積的5％的體積用量被添加。
在本發(fā)明的方法中，為了浸潤光敏劑而添加的溶解劑優(yōu)選是混合比為20∶80的芐醇-乙醇混合物。
由于芐醇與稀氫氧化納溶液不能混溶，因此不可能通過芐醇進(jìn)行浸潤。
按照所示比例把乙醇添加到芐醇當(dāng)中可使浸潤的有機相與稀氫氧化納溶液混溶。
根據(jù)歐洲藥典和美國藥典(USP)的規(guī)定，為了浸潤光敏劑而添加的芐醇和乙醇或丙撐二醇應(yīng)當(dāng)符合在可注射配方中使用時所需的純度要求。
為了減少光敏劑在可注射蓋倫制劑配方中的聚集而添加的表面活性劑有如CrémophoreEL、CrémophoreEL P、Solutol HS 15TM、丙撐二醇、多乙氧基醚、大豆卵磷脂、蛋卵磷脂和N-甲基吡咯烷酮(Pharmasolve)。
優(yōu)選地，添加的表面活性劑是CrémophoreEL、CrémophoreEL P或Solutol HS 15TM。
表面活性劑的添加量根據(jù)所使用的表面活性劑以及光敏劑在配方中的最終濃度的不同而有所不同。
不過，該數(shù)量不能超過配方最終重量的20％。
在本發(fā)明方法的特別優(yōu)選實施方式中，以不超過配方總體積的5％的體積用量添加作為表面活性劑的CrémophoreEL或CrémophoreEL P。
本發(fā)明方法中使用的堿金屬氫氧化物可以是氫氧化納或氫氧化鉀，并且以水溶液形式加入。
堿金屬氫氧化物以把式(I)化合物或式(II)化合物的酸性官能團完全成鹽的用量被加入到呈其酸形式的式(I)或式(II)化合物中。
優(yōu)選地，所用堿金屬氫氧化物是氫氧化鈉，以便得到的可注射蓋倫制劑配方包含鈉鹽形式的式(I)化合物，優(yōu)選式(II)化合物。
應(yīng)當(dāng)保證充分地攪拌以使光敏劑充分成鹽并使其在介質(zhì)中完全溶解。
本發(fā)明方法中所用的調(diào)節(jié)pH的試劑可以是例如檸檬酸、磷酸及其(一氫及二氫)鈉鹽、D-酒石酸、L-酒石酸、D-蘋果酸、L-蘋果酸。
調(diào)節(jié)pH用的試劑以緩沖可注射蓋倫制劑使其pH值為生理上可接受的7.2±0.4所需的量加入。
在本發(fā)明的特別優(yōu)選實施方式中，被加入的調(diào)節(jié)pH用的試劑是檸檬酸，因為改善氣體存在下，它使配方具有長期穩(wěn)定性。
為了提高利用本發(fā)明方法獲得的可注射配方的穩(wěn)定性，該方法的不同步驟(1)-(6)優(yōu)選在惰性氣體的氣氛下實施。
在本發(fā)明方法獲得的可注射蓋倫制劑配方中，式(I)化合物或優(yōu)選式(II)化合物完全溶解，這表現(xiàn)為其透明且沒有任何沉淀物。
而且，通過本發(fā)明方法獲得的可注射配方呈現(xiàn)出良好的長期穩(wěn)定性。
在本發(fā)明的蓋倫制劑組合物中，式(I)化合物且優(yōu)選式(II)化合物為單體形式，不過該化合物中有一定量的聚集體(低聚物)形式。
不過，當(dāng)注射本發(fā)明可注射蓋倫制劑配方時，處在該配方中的低聚物一旦接觸到體液，尤其是血液就會很快地變?yōu)閱误w，這樣，活性光敏物質(zhì)就完全為單體形式。
既然Pd-Bphéide a在760nm附近出現(xiàn)峰值，則對本發(fā)明可注射配方進(jìn)行紫外光譜分析就提供了有關(guān)該配方中包含的Pd-Bphéide a的令人感興趣的指示，其聚集可通過在約815nm附近出現(xiàn)峰值來判斷，而尤其是其通過氧化所進(jìn)行的解聚過程可通過峰值，特別是760nm附近出現(xiàn)的峰值的淺色團位移來判斷。
以下各實施例用于說明本發(fā)明。但不應(yīng)把它們看作是對本發(fā)明保護范圍的限制。
實施例在以下各實施例當(dāng)中，除非特別指明，使用的所有試劑均可在市場上購買獲得，尤其來自于SDS(BP 4-Valdonne，F(xiàn)-13124 Peypin)，MerckEurolab(Europarc，F(xiàn)-33608 Pessac Cedex)，BASF(德國)，F(xiàn)lüka(Buchs，瑞士)等。
光敏劑Pd-Bphéide a的制備注制備方法全部都是在無光化性的光及氮氣氛下進(jìn)行。
1)細(xì)菌葉綠素a(BChla)的提取所用試劑嗜硫小紅卵菌(Rhodovolum Sulfidophilum)細(xì)胞 11kg甲醇[SDS或Merk，用于合成的純度，純度≥99.8％]126L操作方式在25℃下用甲醇(57L)提取冷凍嗜硫小紅卵菌細(xì)胞(11kg)并將其過濾。細(xì)胞濾渣用47L甲醇重新溶解并過濾。在用22L甲醇沖洗濾渣之后，濾液在減壓條件下合并和濃縮。
如此獲得約3500g包含70g BChla的粗產(chǎn)物(BChla的量通過紫外測定來確定)。
2)細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a的合成所用試劑在步驟1)得到的包含70g細(xì)菌葉綠素a的粗產(chǎn)物 3500g三氟乙酸[SDS，滿足合成用的純度，純度≥99％]7L氯仿[SDS，滿足合成用的純度，純度≥99.9％] 11.2L操作方式把包含70g細(xì)菌葉綠素a的粗產(chǎn)物(3500g)溶解在氯仿(11.2L)中并加入三氟乙酸(7L)。反應(yīng)的進(jìn)展由CCM跟蹤。當(dāng)不再檢測出有起始產(chǎn)物時，則把56L水和14L氯仿加入到反應(yīng)介質(zhì)中。在攪拌隨后潷析之后，把兩相分離。有機相用水(25L)沖洗并把氯仿減壓濃縮至體積為6L。
粗Bphéide以氯仿溶液的形式獲得，并且在提純之前并不將其離析。
3)細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a的提純試劑在步驟2)獲得的粗Bphéide的氯仿溶液環(huán)已烷[SDS，滿足合成用的純度，純度≥99％]10L戊烷[SDS，滿足合成用的純度，純度≥99％] 7L
甲醇[SDS或Merck，滿足合成用的純度，純度≥99.8％] 3L二氧化硅[SDS，60AC.C.，70-200μm] 300g乙酸乙酯[Merck，純，純度99.5％] 6L操作方式將環(huán)已烷(10L)添加到粗Bphéide的氯仿溶液中，并通過添加環(huán)已烷把溶劑減壓蒸鎦，直到去除氯仿且體積達(dá)到7L為止。產(chǎn)物隨后通過加入戊烷(7L)來沉淀，并在30℃下攪拌15分鐘并過濾。在真空烘箱(30℃)中干燥之后，獲得60g的半提純產(chǎn)物(UV純度50-60％)。
把半提純產(chǎn)物(60g)溶解在95/5的氯仿/甲醇混合物(6L)中，并加入300g二氧化硅。攪拌10分鐘之后，過濾該介質(zhì)。用6L乙酸乙酯稀釋濾液，減壓蒸餾溶劑。隨著濃縮過程的進(jìn)行不斷地加入乙酸乙酯，直到餾出物密度等于0.9為止。溶液體積由此被調(diào)整為3.0L。過濾該溶液，隨后在30℃下在真空烘箱中干燥所獲得的粉末。
離析出約35g提純的Bphéide(UV純度80％)。
4)鈀-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a的合成試劑在步驟3)獲得的提純的Bphéide 6.25g乙酸鈀[SDS或MERCK，含量≥99％w/w] 13.15g抗壞血酸[SDS，純度≥99％] 105g氯仿[SDS，滿足合成用的純度，純度≥99.9％] 2.2L甲醇[SDS，滿足合成用的純度，純度≥99.8％] 3.3L無水硫酸鈉[SDS，用于合成，純度≥99.5％]1.5kg操作方式把抗壞血酸(105g)溶解在3.3L甲醇中，并將該介質(zhì)加熱至35℃。把溶解在1.5L氯仿中的Bphéide(6.25g)用10分鐘的時間添加到上述介質(zhì)中。在攪拌10分鐘之后，用10分鐘的時間把溶解在0.7L氯仿中的乙酸鈀(13.15g)添加到反應(yīng)介質(zhì)中。反應(yīng)的進(jìn)程通過UV跟蹤。在15分鐘(完全加入)之后，該混合物回到20℃，并將其倒入20L水中。在攪拌和潷析之后，各相得以分離。用水(20L)沖洗有機相，直到pH≥5，然后將其用硫酸鈉(1.5kg)干燥。在減壓濃縮溶劑之后，得到5.85g的粗產(chǎn)物(UV純度85％)。
5)鈀-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a的提純所用試劑在步驟4)獲得的粗Pd-Bphéide5.85g(UV純度85％)氯仿[SDS，滿足合成用的純度，純度≥99.9％] 175ml操作方式把粗產(chǎn)物(5.85g)重新溶解在氯仿(175ml)中并攪拌5分鐘。把該懸浮液過濾并在烘箱(30℃)中把獲得的固體真空干燥。
離析出5.0g提純的Pd-Bphéide a(HPLC純度＞97％)。
氯仿中的UV/VISλmax[nm](相對強度330(0.798)；385(0.597)；535(0.292)；760(1.711))。
在丙酮-D6中的1H-RMM[ppm]9.27，8.86，8.77(每個s，1H，5-，10-，20-H)；6.01(s，1H，132-H)；4.7至4.0(4m，1H，7-，8-，17-，18-H)；3.86(s，3H，132-CO2CH3)；3.51(s，3H，2-CH3)；3.34(s，3H，12-CH3)；3.07(s，3H，3-COCH3)；2.7至2.1(3m，2H，8-，171，172-CH2)；1.79，1.69(每個d，3H，7-，18-CH3)；1.09(t，3H，8-CH2CH3).
C35H36N4O6Pd的計算SM714，1670(M+)。測得值714，1688(M+)。
元素分析計算值(％)C58.79 H5.07 N7.83 O13.42 Pd14.88測得值(％)C59.13 H5.12 N7.72 O13.33 Pd14.69用上面獲得的Pd-Bphéide a制備下述的可注射配方。
可注射配方1配方1包含作為光敏劑的2.5mg/ml的Pd-Bphéide a賦形劑有機相芐醇/乙醇(20/80) 5％(體積/重量)表面活性劑CrémophoreEL P 5％(重)
NaOHO.O28MpH用0.01M檸檬酸調(diào)節(jié)到7.2±0.4按如下方法制備配方1在大小適合盛裝2.5mg按上述方法制備的Pd-Bphéide a的玻璃容器中，加入50μl的20∶80v/v芐醇和乙醇的混合物，并輕輕攪動該混合物。隨后向該混合物中添加50mg的CrémophoreEL P并渦動攪拌該混合物。隨后向該混合物中添加500μl的8.4×10-3M氫氧化鈉NaOH溶液，并渦動攪拌該混合物幾秒鐘。之后，該混合物置于超聲波下30分鐘(溫度＜25℃)，其間不時進(jìn)行手動攪拌。然后，用0.01M檸檬酸調(diào)節(jié)pH至7.2±0.4，借助用于可注射制劑的水(EPPI)將該混合物補足至1g。
下表1表示配方1的確切組成表1

本發(fā)明配方1是透明的，呈現(xiàn)非常深的顏色(深紫色)，沒有任何沉淀痕跡，這表明Pd-Bphéide a完全溶解。
本發(fā)明配方1中Pd-Bphéide a的紫外吸收光譜顯示在344、385、538、763和818nm處有五個主要峰值，其中DO763/818之比大于1，從光譜的角度來看，這表示單體占產(chǎn)物的50％以上。
根據(jù)ICH條件，配方1在4℃時穩(wěn)定存在至少6個月，這通過HPLC和UV測定得到驗證。
在不同種類的動物體中靜脈注射一次或重復(fù)注射進(jìn)行可注射配方1的毒性研究-雄性大鼠(Sprague Dawley)，6至12只，劑量(2×5，2×10和2×20mg/kg)。在其尾部靜脈注射該產(chǎn)物。
-兔(新西蘭Albino)，5只，注射劑量5mg/kg。三次靜脈注射，一次動脈內(nèi)注射，一次靜脈周圍注射該產(chǎn)物。
-猴(體重從2.5-3.2kg不等的獼猴)，6-10只，按照性別分類，注射劑量(1，2，5和6mg/kg)。在隱靜脈或頭靜脈中注射該產(chǎn)物，每天一次，共14天。
-猴(體重從2.25-4.7kg不等的獼猴)，3-6只，注射劑量(2和5mg/kg)。在隱靜脈或頭靜脈中注射該產(chǎn)物。
通過分析臨床體征，對血和尿進(jìn)行生物化驗、心血管檢驗和組織病理檢驗對動物進(jìn)行評價。
這些研究顯示對Pd-Bphéide a及其可注射配方1良好耐受直到注射速度達(dá)4ml/min為止。
可注射配方2配方2包含作為光敏劑的5mg/ml的Pd-Bphéide a賦形劑有機相芐醇/乙醇(20/80)5％(體積/重量)表面活性劑CrémophoreEL 5％(重)NaOH0.028M
pH用0.01M檸檬酸調(diào)節(jié)到7.2±0.4配方2的制備方法如下在大小適合盛裝5mg按上述方法制備的Pd-Bphéide a的玻璃容器中，加入50μl的20∶80v/v芐醇和乙醇的混合物，并輕輕攪動該混合物。隨后向該混合物中添加50mg的CrémophoreEL并渦動攪拌該混合物。隨后向該混合物中添加500μl的0.028M氫氧化鈉NaOH溶液，并渦動攪拌該混合物幾秒鐘。之后，該混合物置于超聲波下30分鐘(溫度＜25℃)，其間不時進(jìn)行手動攪拌。然后，用0.01M檸檬酸調(diào)節(jié)pH至7.2±0.4，借助用于可注射制劑的水(EPPI)將該混合物補足至1g。
下表2表示配方2的確切組成表2

本發(fā)明配方2是透明的，呈現(xiàn)非常深的顏色(深紫色)，沒有任何沉淀痕跡，這表明Pd-Bphéide a完全溶解。
本發(fā)明配方2中Pd-Bphéide a的紫外吸收光譜顯示在344、385、538、763和818nm處存在五個主要峰值，其中DO763/818之比接近1，從光譜的角度來看，這表示單體占產(chǎn)物的50％。
根據(jù)ICH條件，配方2在4℃時穩(wěn)定存在至少6個月，這通過HPLC和UV測定得到驗證。
以下的生物實驗表明，活性成分良好的溶解性以及相對于單體形式的聚集體形式的減少具有重要性，而且是必須的。
在體重為3-4kg的新西蘭白兔身上進(jìn)行了用以研究一次注射按配方配制的產(chǎn)物的解聚實驗。
這項研究用了三只兔子。
在這些兔子的耳靜脈中注射的劑量是5mg/Kg，也就是說，對于一只3kg的兔子來說，則注射3ml濃度為5mg/ml的可注射配方1。
注射速度在0.3-1ml/分鐘之間變化。
通過使用多通道檢測系統(tǒng)，Pd-Bphéide a的吸收光譜可利用反射光譜連續(xù)測量。該系統(tǒng)可檢測該產(chǎn)物在活體動物組織中的情況。這樣就可以跟蹤有機體中聚集體的演變情況。
在這些條件下，低聚物在活體中解聚為單體形式的速度非常快，在15-30分鐘之間。
如果配方中沒有Crémophore，則不能進(jìn)行這種活體解聚，由此產(chǎn)生的單體的濃度非常小。
在不同種的動物體內(nèi)一次或重復(fù)靜脈給藥可注射配方2后進(jìn)行該配方的毒性研究1.小鼠(OF，體重從25到35克不等)，10只，按照性別分類，劑量(0.2×25，2×50，2×75和1×100mg/kg)。在尾部靜脈注射該產(chǎn)物。
2.鼠(Sprague Dawley，體重從150到230克不等)，4-10只，按照性別分類，劑量(4-200mg/kg)。在尾部靜脈注射該產(chǎn)物。
3.猴(獼猴，體重從1.8-3.5kg不等)，1只，按照性別分類，劑量(8，16和24mg/kg)。在隱靜脈或頭靜脈中注射該產(chǎn)物，一天一次，共7天。
通過分析臨床體征，對血和尿進(jìn)行生物化驗和組織病理檢驗對動物進(jìn)行評價。
這些研究表明只要緩慢注射以使存在的低聚物逐漸解聚為單體形式就可良好耐受Pd-Bphéide a及其可注射配方2。
可注射配方3配方3包含5mg/ml用作光敏劑的Pd-Bphéide a賦形劑有機相芐醇/乙醇(20/80) 5％(體積/重量)表面活性劑Solutol HS 15 10％(重)NaOH0.028MpH用0.01M檸檬酸調(diào)節(jié)到7.2±0.4按如下方法制備配方3在大小適合盛裝5mg按上述方法制備的Pd-Bphéide a的玻璃容器中，加入50μl的20∶80v/v芐醇和乙醇的混合物，并輕輕攪拌該混合物。隨后向該混合物中添加100mg的10％(重)的Solutol HS 15并且對該混合物進(jìn)行渦動攪拌。隨后向該混合物中添加500μl的0.028M氫氧化鈉NaOH溶液，并渦動攪拌該混合物幾秒鐘。之后，該混合物置于超聲波下30分鐘(溫度＜25℃)，其間不時進(jìn)行手動攪拌。然后，用0.01M檸檬酸將pH調(diào)節(jié)至7.2±0.4，借助用于可注射制劑的水(EPPI)將該混合物補足至1g。
下表3表示配方3的確切組成
表3

本發(fā)明配方3是透明的，呈現(xiàn)非常深的顏色(深紫色)，沒有任何沉淀痕跡，這表明Pd-Bphéide a完全溶解。
本發(fā)明配方3中Pd-Bphéide a的紫外吸收光譜顯示在344、385、538、763和818nm處有五個主要峰值，其中DO763/818之比接近1，從光譜的角度來看，這表示單體占產(chǎn)物的50％。
根據(jù)ICH條件，配方3在4℃時穩(wěn)定存在至少6個月，這通過HPLC和UV測定得到驗證。
可注射配方4配方4包含1mg/ml用作光敏劑的Pd-Bphéide a
賦形劑有機相芐醇/乙醇(20/80) 5％(體積/重量)表面活性劑CrémophoreEL 5％(重)NaOH0.007MpH用0.01M檸檬酸調(diào)節(jié)到7.2±0.4按如下方法制備配方4在大小適合盛裝1mg按上述方法制備的Pd-Bphéide a的玻璃容器中，加入50μl的20∶80v/v芐醇和乙醇的混合物，并輕輕攪動該混合物。隨后向該混合物中添加50mg的CrémophoreEL并渦動攪拌該混合物。隨后向該混合物中添加500μl的0.007M氫氧化鈉NaOH溶液，并渦動攪拌該混合物幾秒鐘。之后，該混合物置于超聲波下30分鐘(溫度＜25℃)，其間不時進(jìn)行手動攪拌。然后，用0.01M檸檬酸調(diào)節(jié)pH至7.2±0.4，借助用于可注射制劑的水(EPPI)將該混合物補足至1g。
下表4表示配方4的確切組成
表4

本發(fā)明配方4是透明的，呈現(xiàn)非常深的顏色(深紫色)，沒有任何沉淀痕跡，這表明Pd-Bphéide a完全溶解。
本發(fā)明配方4中Pd-Bphéide a的紫外吸收光譜顯示在344、385、538、763和818nm處有五個主要峰值，其中DO763/818之比為80/20，從光譜的角度來看，這表示單體占產(chǎn)物的80％。
根據(jù)ICH條件，配方4在4℃時穩(wěn)定存在至少6個月，這通過HPLC和UV測定得到驗證。
可注射配方5
配方5包含1mg/ml用作光敏劑的Pd-Bphéide a水相賦形劑有機相丙撐二醇 5％(體積/重量)表面活性劑CrémophoreEL 5％(重)NaOH0.007MpH用0.01M檸檬酸調(diào)節(jié)到7.2±0.4按如下方法制備配方5在大小適合盛裝1mg按上述方法制備的Pd-Bphéide a的玻璃容器中，加入50μl丙撐二醇，并輕輕攪動該混合物。隨后向該混合物中添加50mg的CrémophoreEL并渦動攪拌該混合物。隨后向該混合物中添加500μl的0.007M氫氧化鈉NaOH溶液，并渦動攪拌該混合物幾秒鐘。之后，該混合物置于超聲波下30分鐘(溫度＜25℃)，其間不時進(jìn)行手動攪拌。然后，用0.01M檸檬酸調(diào)節(jié)pH至7.2±0.4，借助用于可注射制劑的水(EPPI)將該混合物補足至1g。
下表5表示配方5的確切組成
表5

本發(fā)明配方5是透明的，呈現(xiàn)非常深的顏色(深紫色)，沒有任何沉淀痕跡，這表明Pd-Bphéide a完全溶解。
本發(fā)明配方5中Pd-Bphéide a的紫外吸收光譜顯示在344、385、538、763和818nm處有五個主要峰值，其中DO763/818之比為60/40，從光譜的角度來看，這表示單體占產(chǎn)物的60％。
根據(jù)ICH條件，配方5在4℃時穩(wěn)定存在至少6個月，這通過HPLC和UV測定得到驗證。
對比配方1對比配方1包含1mg/ml的Pd-Bphéide a賦形劑表面活性劑CrémophoreEL 5％(重)NaOH0.007M
pH用0.01M檸檬酸調(diào)節(jié)到7.2±0.4按如下方法制備對比配方1在大小適合盛裝1mg按上述方法制備的Pd-Bphéide a的玻璃容器中，加入50mg的CrémophoreEL并渦動攪拌該混合物。隨后向該混合物中添加500μl的0.007M氫氧化鈉NaOH溶液，并渦動攪拌該混合物幾秒鐘。之后，該混合物置于超聲波下30分鐘(溫度＜25℃)，其間不時進(jìn)行手動攪拌。然后，用0.01M檸檬酸調(diào)節(jié)pH至7.2±0.4，借助用于可注射制劑的水(EPPI)將該混合物補足至1g。
下表6表示對比配方1的確切組成表6

此對比配方1含有沉淀，這充分表明在沒有芐醇/乙醇混合物或丙撐二醇存在時，Pd-Bphéide a未完全溶解。
對比配方2對比配方2包含1mg/ml的Pd-Bphéide a賦形劑乙醇5％表面活性劑CrémophoreEL 5％ (重)
NaOH0.007MpH調(diào)節(jié)到7.2±0.4對比配方2的制備方法如下在大小適合盛裝1mg按上述方法制備的Pd-Bphéide a的玻璃容器中，加入50μl乙醇，并輕輕攪動該混合物。隨后向該混合物中添加50mg的CrémophoreEL并渦動攪拌該混合物。隨后向該混合物中添加500μl的0.007M氫氧化鈉NaOH溶液，并渦動攪拌該混合物幾秒鐘。之后，該混合物置于超聲波下30分鐘(溫度＜25℃)，其間不時進(jìn)行手動攪拌。然后，用0.01M檸檬酸調(diào)節(jié)pH至7.2±0.4，借助用于可注射制劑的水(EPPI)將該混合物補足至1g。
下表7表示對比配方2的確切組成表7

此對比配方2出現(xiàn)絮凝現(xiàn)象，這充分表明在沒有芐醇時，Pd-Bphéidea未完全溶解。
權(quán)利要求
1.用于光動力治療或診斷的可注射蓋倫制劑配方，所述蓋倫制劑配方包括-作為光敏劑且用量不超過10mg/ml的堿金屬鹽形式的由以下通式(I)表示的化合物 其中R2代表H、OH或COOR4基團，其中R4是氫或C1-C12烷基或是C3-C12環(huán)烷基R3代表H、OH或C1-C12烷基或烷氧基，并且*表示不對稱碳，以及-藥學(xué)上可接受的水相賦形劑，其特征在于藥學(xué)上可接受的該水相賦形劑至少包括用作光敏劑溶解劑的其中混合比為15∶85-25∶75的芐醇-乙醇混合物或丙撐二醇，和可減少光敏劑聚集的其數(shù)量相對于配方總重不超過20％的表面活性劑。
2.權(quán)利要求1的可注射配方，其特征在于式(I)的光敏劑是由下式(II)表示的堿金屬鹽形式的鈀-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a
3.權(quán)利要求1或2的蓋倫制劑配方，其特征在于式(I)化合物或式(II)化合物為鈉鹽形式。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的可注射配方，其特征在于溶解劑是該配方中所含的芐醇-乙醇混合物，其體積用量不超過配方總量的5％。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的可注射蓋倫制劑配方，其特征在于溶解劑是混合比為20∶80v/v的芐醇-乙醇混合物。
6.權(quán)利要求1-3中任一項的可注射配方，其特征在于溶解劑是該配方中所含的丙撐二醇，其體積用量不超過配方總量的5％。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的可注射配方，其特征在于表面活性劑是CrémophoreEL、CrémophoreEL P或Solutol HS 15TM。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的可注射配方，其特征在于它包含作為表面活性劑的CrémophoreEL或CrémophoreELP，所用重量不超過配方總重量的5％。
9.用于光動力診斷或治療的可注射蓋倫制劑配方的制備方法，其中所述制劑包含作為光敏劑且用量至多為10mg/ml的堿金屬鹽形式的由以下通式(I)表示的化合物和藥學(xué)上可接受的水相賦形劑 其中R2代表H、OH或COOR4基團，其中R4是氫或C1-C12烷基或是C3-C12環(huán)烷基R3代表H、OH或C1-C12烷基或烷氧基，并且*表示不對稱碳，所述方法依次包括下列步驟(1)用由混合比為15∶85-25∶75的芐醇-乙醇混合物或丙撐二醇所構(gòu)成的溶解劑浸潤呈其酸形式的式(I)光敏劑；(2)添加所用重量不超過配方最終重量20％的表面活性劑；(3)添加用量足以中和式(I)光敏劑的酸性官能團的堿金屬氫氧化物；(4)攪拌水相混合物，其方式足以使光敏劑充分成鹽并且完全溶解。(5)添加緩沖劑，以把pH調(diào)節(jié)到生理上可接受的值7.2±0.4；(6)必要時，借助用于可注射制劑的水調(diào)節(jié)配方的體積。
10.權(quán)利要求9的可注射蓋倫制劑配方的制備方法，其特征在于呈其酸形式的式(I)所示光敏劑是由下式(II)表示的鈀-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a
11.權(quán)利要求9或10的可注射蓋倫制劑配方的制備方法，其特征在于溶解劑的體積加入量不超過溶液總量的5％。
12.權(quán)利要求9-11中任一項的可注射蓋倫制劑配方的制備方法，其特征在于加入的溶解劑是混合比為20∶80v/v的芐醇-乙醇混合物。
13.權(quán)利要求9-12中任一項的可注射蓋倫制劑配方的制備方法，其特征在于加入的表面活性劑是CrémophoreEL、CrémophoreELP或Solutol HS 15TM。
14.權(quán)利要求9-13中任一項的可注射蓋倫制劑配方的制備方法，其特征在于加入的表面活性劑是CrémophoreEL或CrémophoreELP，并且加入的重量不超過配方總重量的5％。
15.權(quán)利要求9-14中任一項的可注射蓋倫制劑配方的制備方法，其特征在于堿金屬氫氧化物是氫氧化鈉。
16.權(quán)利要求9-15中任一項的可注射蓋倫制劑配方的制備方法，其特征在于用以調(diào)節(jié)pH而加入的緩沖劑是檸檬酸。
17.權(quán)利要求9-16中任一項的可注射蓋倫制劑配方的制備方法，其特征在于步驟(1)-(6)在惰性氣氛中進(jìn)行。
18.根據(jù)權(quán)利要求9-17中任一項的方法獲得的可注射蓋倫制劑配方產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于光動力治療或診斷(PDT)的可注射蓋倫制劑配方及其制備方法。該配方包括由下述通式(I)表示的用作光敏劑且其用量不超過10mg/ml的堿金屬鹽形式的化合物其中R
文檔編號A61P17/00GK1529594SQ02814291
公開日2004年9月15日 申請日期2002年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月17日
發(fā)明者P－H·布倫, A·普魯?shù)禄裟? J－L·巴諾克斯, P-H 布倫, 團悼慫, 車祿裟 申請人:斯特巴生物技術(shù)股份有限公司