專利名稱：核酸傳遞系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因和類似核酸傳遞至體內(nèi)靶點(diǎn)。更具體地說，本發(fā)明涉及由脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因向血管生成血管(angiogenic blood vessel)的傳遞。
背景技術(shù)：
整聯(lián)蛋白是一類已知結(jié)合胞外基質(zhì)蛋白的細(xì)胞受體，因此介導(dǎo)一般稱為細(xì)胞粘附事件的細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-胞外基質(zhì)相互作用。盡管文獻(xiàn)中描述了許多整聯(lián)蛋白及結(jié)合整聯(lián)蛋白的配體，但大部分整聯(lián)蛋白的生物學(xué)功能仍令人困惑。整聯(lián)蛋白受體構(gòu)成了一個(gè)蛋白家族，其共有結(jié)構(gòu)特征是由α和β亞單位形成非共價(jià)異二聚體糖蛋白復(fù)合物，Cheresh & Mecham編輯，整聯(lián)蛋白；與胞外基質(zhì)的分子生物學(xué)反應(yīng)，Academic Press，Inc.，San Diego，CA 92101(1994)，Horton，Int.J.Exp.Pathol.，71741-759(1990)。這些整聯(lián)蛋白在組織內(nèi)的許多細(xì)胞相互作用中所起的特異性細(xì)胞粘附作用仍在研究之中。
內(nèi)皮-基質(zhì)的相互作用在形成新生血管的血管發(fā)生過程中起作用。稱為αVβ3整聯(lián)蛋白的細(xì)胞粘著受體位于參與血管發(fā)生的活性內(nèi)皮細(xì)胞表面。
眾所周知，血管發(fā)生還是惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的必要條件。在沒有血管發(fā)生的情況下，局部腫瘤擴(kuò)張受到抑制。此外，已知特異性血管發(fā)生標(biāo)志αVβ3整聯(lián)蛋白的表達(dá)與腫瘤分級有關(guān)。
現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)攜帶非肽整聯(lián)蛋白拮抗劑作為靶向藥物的陽離子脂質(zhì)體可傳遞核酸(例如基因)至血管生成血管。根據(jù)需要適當(dāng)選擇的核酸可抑制或促進(jìn)血管生長，因此提供一種治療血管發(fā)生依賴性疾病的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供包含非肽整聯(lián)蛋白受體拮抗劑和核酸的靶向脂質(zhì)體。這些靶向脂質(zhì)體當(dāng)全身或局部導(dǎo)入時(shí)，有效地將核酸(例如基因、反義寡核苷酸序列、DNA、RNA等)選擇性傳遞至預(yù)定的靶點(diǎn)，例如體內(nèi)的血管生成血管。選定核酸可以此方式傳遞至血管生成血管，以介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞吸收核酸進(jìn)行表達(dá)或反義傳遞?？梢詫?shí)現(xiàn)對新生血管生長的破壞。此外，如有需要，通過適當(dāng)選擇要傳遞的核酸，可誘導(dǎo)新生血管生長。
更具體地說，αVβ3整聯(lián)蛋白受體靶向脂質(zhì)體是一種大小不超過約100nm的納米顆粒，其為單層或多層囊泡，包含陽離子兩性分子(例如陽離子脂質(zhì))、中性脂質(zhì)、具有αVβ3整聯(lián)蛋白靶向結(jié)構(gòu)域和疏水結(jié)構(gòu)域的靶向脂質(zhì)以及核酸(例如基因、反義寡核苷酸序列、DNA序列、RNA序列等)。所述靶向脂質(zhì)體還可選地包含中性脂質(zhì)。在所述靶向脂質(zhì)中，靶向結(jié)構(gòu)域可直接與疏水結(jié)構(gòu)域相連?；蛘?，所述靶向結(jié)構(gòu)域可共價(jià)結(jié)合至親水連接結(jié)構(gòu)域(表面連接體)，其再共價(jià)結(jié)合至疏水結(jié)構(gòu)域。所述核酸可與脂質(zhì)體中存在的陽離子兩性分子復(fù)合。所述靶向結(jié)構(gòu)域包含非肽αVβ3整聯(lián)蛋白拮抗劑。
在所述靶向脂質(zhì)體中，基于脂質(zhì)體中脂質(zhì)的總摩爾數(shù)，陽離子兩性分子(例如陽離子脂質(zhì))的存在量為約1至約50mol％，靶向脂質(zhì)的靶向結(jié)構(gòu)域的存在量為約1至約20mol％。構(gòu)成靶向脂質(zhì)體的脂質(zhì)在其各自的疏水部分可具有寡聚化和/或多聚化功能基團(tuán)，存在于脂質(zhì)體中的所述脂質(zhì)的至少一部分可通過所述基團(tuán)互相交聯(lián)。如有需要，陽離子脂質(zhì)還可具有可交聯(lián)基?；蛘?，陽離子脂質(zhì)可沒有可交聯(lián)基。
本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體可用于傳遞核酸來治療癌癥、炎癥、眼病等。所述靶向脂質(zhì)體還可用于傳遞基因來鑒別血管中的治療標(biāo)靶。
本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體為多點(diǎn)結(jié)合(multibinding)納米顆粒，不大于約250nm，優(yōu)選約40至約100nm，包含陽離子脂質(zhì)或細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑連同與之復(fù)合的核酸。優(yōu)選的靶向脂質(zhì)可表示為L-X-K，其中L為靶向結(jié)構(gòu)域，例如整聯(lián)蛋白受體拮抗劑(如αVβ3受體拮抗劑)等，X為用作疏水結(jié)構(gòu)域K表面連接體的親水結(jié)構(gòu)域?；蛘?，所述靶向脂質(zhì)可表示為L-K，其中靶向結(jié)構(gòu)域L直接結(jié)合至疏水結(jié)構(gòu)域K。
適于本發(fā)明目的的非肽整聯(lián)蛋白受體拮抗劑L在生理pH值為具有陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)的兩性離子，可作用于或結(jié)合整聯(lián)蛋白受體。陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)通過間隔基(例如二價(jià)芳基)互相分開。受體拮抗劑分子上陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)之間的間距為約10至約100埃，可由烷氧基苯甲酸、雙環(huán)或三環(huán)化合物、螺環(huán)化合物等產(chǎn)生，條件是由其分開的陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)可在生理pH值下與整聯(lián)蛋白受體相互作用。合適的整聯(lián)蛋白受體拮抗劑可圖示如下
說明性的非肽αVβ3受體拮抗劑以下式表示 其中游離氨基(NH2)可用于使所述拮抗劑直接或通過表面連接基共價(jià)結(jié)合至脂質(zhì)體的疏水結(jié)構(gòu)域。
美國專利笫5,561,148號、第5,776,973號和第6,204,280號以及專利公開WO00/63178、WO01/10841、WO01/14337、WO01/14338、WO97/45137、WO98/35949和WO00/26212描述了其它在結(jié)合至靶向脂質(zhì)親水結(jié)構(gòu)域時(shí)適用于本發(fā)明目的的非肽αVβ3受體拮抗劑。
非肽整聯(lián)蛋白受體拮抗劑L和可選表面連接基X組合構(gòu)成了適于結(jié)合核酸載體(例如陽離子脂質(zhì)體等)的αVβ3受體靶向分子或基團(tuán)。然后所產(chǎn)生的靶向脂質(zhì)體通過與其復(fù)合結(jié)合至預(yù)先確定的核酸(例如基因)。
附圖簡述在附圖中，

圖1圖示說明了本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體；圖2圖解了本發(fā)明的交聯(lián)靶向脂質(zhì)體；圖3圖解了本發(fā)明的另一種交聯(lián)靶向脂質(zhì)體；圖4圖示說明了靶向脂質(zhì)體的全身循環(huán)；圖5圖示說明了靶向脂質(zhì)體在生血管部位的匯集；圖6和7圖示說明了DNA(例如基因)向目標(biāo)細(xì)胞的傳遞；圖8圖示說明適于測試αVβ3拮抗劑的粘附測定；圖9以曲線圖顯示使用圖8所示的粘附測定獲得的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體結(jié)合αVβ3受體；圖10以圖解顯示的數(shù)據(jù)表明，使用本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體有效地將綠色熒光蛋白(GFP)基因靶向傳遞至體內(nèi)的αVβ3表達(dá)細(xì)胞；攜帶所述基因的靶向脂質(zhì)體顯示以αVβ3依賴方式轉(zhuǎn)染細(xì)胞；使用的細(xì)胞為人黑素瘤細(xì)胞M21和M21L；M21細(xì)胞表達(dá)αVβ3整聯(lián)蛋白，而M21L細(xì)胞不表達(dá)αVβ3整聯(lián)蛋白(αV-無效)；圖11以圖解顯示的數(shù)據(jù)表明，使用本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體將螢火蟲熒光素酶基因體內(nèi)選擇性靶向表達(dá)αVβ3的腫瘤血管細(xì)胞；靶向基因載體顯示以αVβ3依賴方式轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞；使用的細(xì)胞為移植入小鼠的人黑素瘤細(xì)胞M21和M21L；M21細(xì)胞表達(dá)αVβ3整聯(lián)蛋白，而M21L細(xì)胞不表達(dá)αVβ3整聯(lián)蛋白；圖12以曲線圖顯示的數(shù)據(jù)證實(shí)移植腫瘤生長的體內(nèi)抑制和消退是由于給予了與表達(dá)血管發(fā)生抑制性突變型Raf蛋白的基因結(jié)合的靶向脂質(zhì)體；圖13以曲線圖顯示的數(shù)據(jù)證實(shí)移植腫瘤生長的體內(nèi)抑制和消退是由于給予了與表達(dá)血管發(fā)生抑制性突變型Raf蛋白的基因結(jié)合的靶向脂質(zhì)體；圖14展示的顯微照片證實(shí)使用本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體將GFP編碼基因體內(nèi)傳遞至小雞CAM的血管生成血管；圖15展示的顯微照片證實(shí)通過玻璃體內(nèi)注射結(jié)合GFP編碼基因的本發(fā)明靶向脂質(zhì)體，將該基因體內(nèi)傳遞至小鼠眼睛的血管；圖16展示的顯微照片證實(shí)通過靶向脂質(zhì)體介導(dǎo)的突變型Raf編碼基因向小鼠視網(wǎng)膜血管生成血管的傳遞，使體內(nèi)新生血管凋亡；圖17圖解了靶向脂質(zhì)體合成流程1，詳述了關(guān)鍵中間體三價(jià)脂質(zhì)-整聯(lián)蛋白拮抗劑綴合物12的合成；以及圖18圖解了靶向脂質(zhì)體合成流程2，該流程概述了通過合適脂質(zhì)的自裝配和多聚化由三價(jià)脂質(zhì)-整聯(lián)蛋白拮抗劑綴合物12形成納米顆粒靶向脂質(zhì)體(NP)。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述圖1-3和18圖示說明了本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體，其由結(jié)合脂質(zhì)的整聯(lián)蛋白受體拮抗劑(如αVβ3受體拮抗劑)和核酸載體(例如陽離子兩性分子，如陽離子脂質(zhì))構(gòu)成。所述脂質(zhì)體還可包含中性或兩性填充脂質(zhì)(filler lipid)。
靶向脂質(zhì)具有靶向結(jié)構(gòu)域，包括共價(jià)結(jié)合至疏水結(jié)構(gòu)域的αVβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑。靶向結(jié)構(gòu)域可直接結(jié)合至疏水結(jié)構(gòu)域，或者靶向結(jié)構(gòu)域可結(jié)合至親水結(jié)構(gòu)域，如連接基(表面連接體)，親水結(jié)構(gòu)域再結(jié)合至疏水結(jié)構(gòu)域。
適用于本發(fā)明目的的整聯(lián)蛋白受體拮抗劑在生理pH值為兩性離子，并具有可作用于或結(jié)合整聯(lián)蛋白受體的陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)。所述陽離子和陰離子基團(tuán)通過間隔基(例如二價(jià)芳基)互相分開。受體拮抗劑分子上陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)之間的間距為約10至約100埃，可由對-烷氧基苯甲酸、雙環(huán)或三環(huán)化合物、螺環(huán)化合物等產(chǎn)生，條件是由其分開的陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)可在生理pH值下與整聯(lián)蛋白受體相互作用。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“芳基”是指含至少一個(gè)6-碳芳香環(huán)的烴基，其還可包含直鏈、支鏈或環(huán)狀烴取代基。術(shù)語“雜芳基”是指含至少一個(gè)含碳-雜原子的芳香環(huán)的基團(tuán)，其還可包含直鏈、支鏈或環(huán)狀烴取代基，其中所述雜原子可為選自元素周期表中IUPAC命名為15(氮類)和16(氧類)的任一元素，包括L.A.Paquette，現(xiàn)代雜環(huán)化學(xué)原理，Benjamin/Cummings Publishing Company，Inc.(1968)所公開化合物的芳族雜環(huán)基，該文獻(xiàn)的相關(guān)公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。當(dāng)在本文中提及芳基和雜芳基時(shí)，其可為未取代的，或者可為取代的。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“雜環(huán)基”是指含至少一個(gè)含碳-雜原子的非芳香環(huán)的基團(tuán)，其還可包含直鏈、支鏈或環(huán)狀烴取代基，其中所述雜原子可為選自元素周期表中IUPAC命名為15(氮類)和16(氧類)的任一元素，包括Paquette(同上)所公開化合物的非芳族雜環(huán)基，該文獻(xiàn)的相關(guān)公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。雜環(huán)基可為未取代的，或者可由烷基或反應(yīng)性功能基(例如鹵素、氨基、羥基、羧酸基、磺酸基等)取代。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“烷基”是指烴基部分，其可為直鏈、支鏈，或者可含有碳環(huán)結(jié)構(gòu)。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“烯基”是指具有至少一個(gè)碳-碳雙鍵的烷基。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“炔基”是指具有至少一個(gè)碳-碳三鍵的烷基。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“取代的”是指用烷基、苯基或功能基取代上述基團(tuán)之一的一個(gè)或多個(gè)氫原子，所述功能基例如為羥基、烷氧基、氨基、亞硝基、硝基、偶氨基、疊氮基、酰胺基、羧基、氧代、硫醇、次硫酸基、磺?；?、氧膦基、膦?；⒎?、氯、溴、碘以及R.Panieo等編輯，有機(jī)化合物IUPAC命名法指引，Blackwell Science Ltd.(1993)描述的類似基團(tuán)，所述文獻(xiàn)的相關(guān)公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“脂質(zhì)體”是指其壁為脂質(zhì)分子的球狀物，脂質(zhì)分子互相之間可共聚合或可以不共聚合。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“脂質(zhì)”是指油、脂肪、脂肪樣物質(zhì)中任一成員，其特征為可溶于相對非極性溶劑，但僅微溶于水性溶劑。脂質(zhì)由存在于活體組織的四類主要化合物構(gòu)成，包括脂肪酸、中性脂肪(例如三酰甘油、脂肪酸酯和皂類、長鏈(脂肪)醇和蠟、鞘氨基醇和其它長鏈堿基、糖脂、磷脂、鞘脂、胡蘿卜素、多萜醇、甾醇等)以及萜烯和類似的類異戊二烯。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑”是指適于基因傳遞和表達(dá)的陽離子脂質(zhì)，由陽離子頭基團(tuán)組成，其通過連接體連接至疏水結(jié)構(gòu)域或部分。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“中性”當(dāng)修飾脂質(zhì)時(shí)包括不帶電脂質(zhì)(例如膽固醇等)以及兩性脂質(zhì)(例如二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰膽堿等)。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“膽甾醇基”是指衍生自或結(jié)構(gòu)上類似膽甾醇的甾族烴基部分。
本文和所附權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“整聯(lián)蛋白受體拮抗劑”是指選擇性結(jié)合并拮抗整聯(lián)蛋白受體(例如αVβ3受體、αVβ5受體、αVβ6受體等)的非肽化合物。
說明性的所述αVβ3拮抗化合物以下式表示 其中游離氨基(NH2)可用于使所述拮抗劑通過表面連接基(例如羧基和/或其它合適的活性基團(tuán))共價(jià)結(jié)合至脂質(zhì)體的疏水結(jié)構(gòu)域。
美國專利第5,561,148號、第5,776,973號和笫6,204,280號以及專利公開WO00/63178、WO01/10841、W001/14337、WO01/14338、WO97/45137、WO98/35949和WO00/26212描述了其它在直接或間接結(jié)合靶向脂質(zhì)的疏水結(jié)構(gòu)域時(shí)適用于本發(fā)明目的的說明性非肽αVβ3受體拮抗劑，所述文獻(xiàn)的相關(guān)公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。所述αVβ3受體拮抗劑例舉如下如WO01/14338所述的
等；如WO01/14337所述的 等；如WO00/63178所述的 等；如WO01/10841所述的
等；前提是所述化合物包括或經(jīng)修飾后包括可與表面連接體或疏水結(jié)構(gòu)域反應(yīng)形成靶向脂質(zhì)的功能基或橋聯(lián)基。所述修飾在化學(xué)領(lǐng)域眾所周知。例如，以上例舉化合物的一個(gè)芳族部分可用氨基、羥基或硫醇基化學(xué)取代，提供一種連接表面連接體的方法?；蛘?，例如可用羧酸取代芳基，而表面連接體可為氨基取代基。
使用在非肽整聯(lián)蛋白受體拮抗劑與表面連接體或疏水結(jié)構(gòu)域之間產(chǎn)生共價(jià)鍵的常規(guī)化學(xué)技術(shù)，使所述拮抗劑共價(jià)連接親水表面連接體或直接連接疏水結(jié)構(gòu)域。產(chǎn)生所述鍵的反應(yīng)化學(xué)在本領(lǐng)域眾所周知，包括使用表面連接體或疏水結(jié)構(gòu)域與整聯(lián)蛋白拮抗劑配體上的互補(bǔ)功能基團(tuán)。優(yōu)選相對于配體上存在的可鍵合功能基團(tuán)或者可導(dǎo)入配體用于鍵合的功能基團(tuán)選擇表面連接體或疏水結(jié)構(gòu)域上的互補(bǔ)功能基團(tuán)。再者，所述互補(bǔ)功能基團(tuán)在本領(lǐng)域眾所周知。例如，羧酸與伯胺或仲胺在合適的周知活化劑存在下反應(yīng)形成可共價(jià)連接配體與表面連接體或疏水結(jié)構(gòu)域的酰胺鍵；胺基與磺酰鹵基團(tuán)反應(yīng)形成可共價(jià)連接配體與表面連接體或疏水結(jié)構(gòu)域的磺酰胺鍵；而醇或酚基與烷基鹵或芳基鹵反應(yīng)形成可共價(jià)結(jié)合整聯(lián)蛋白拮抗劑配體與表面連接體或疏水結(jié)構(gòu)域的醚鍵。
或者，整聯(lián)蛋白受體拮抗劑可包含疏水結(jié)構(gòu)域，例如C18-C30烷基、C18-C30烯基、C18-C30炔基、膽甾醇基等。
有或沒有間隔性表面連接體的疏水結(jié)構(gòu)域與整聯(lián)蛋白受體拮抗劑的連接位置保留了受體結(jié)合位點(diǎn)的相互作用，具體地說，其使得拮抗劑自身適于結(jié)合整聯(lián)蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)。所述鍵的位置和合成方案在本領(lǐng)域眾所周知。
包含疏水結(jié)構(gòu)域或可共價(jià)結(jié)合疏水結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選αVβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑用下式(I)和(II)表示
其中在式(I)中，R1和R2均為氫，或一起形成橋聯(lián)1，2-亞苯基(C6H4)基團(tuán)或橋聯(lián)乙烯基(-CH＝CH-)；X是-C(O)-或共價(jià)鍵；n是1，2或3；Z1是-C(O)-R3、-C(O)OR3或SO2R3；而R3是苯基、取代的苯基、吡啶基、芐基、取代的芐基、C1-C4鹵代烷基、C2-C30烷基、C2-C30烯基、C2-C30炔基或膽甾醇基；以及其中式(II)中，R4和R5均為氫，或一起形成共價(jià)鍵；Y是-C(O)-或-CH2-；Z2是-C(O)-R6、-C(O)OR6或SO2R6；R6是苯基、取代的苯基、吡啶基、芐基、取代的芐基、C1-C4鹵代烷基、C2-C30烷基、C2-C30烯基、C2-C30炔基或膽甾醇基；而Het是2-吡啶基或2-咪唑基。
式(I)的整聯(lián)蛋白受體拮抗劑的非限制性實(shí)例包括以下的化合物Ia、Ib、Ic、Id、Ie和If。這些具體化合物的制備描述于PCT公開WO98/35949。
式(II)的整聯(lián)蛋白受體拮抗劑的非限制性實(shí)例包括以下的化合物IIa、IIb、IIc、IId、IIe和IIf。這些具體化合物的制備描述于PCT公開WO00/26212。


優(yōu)選的αVβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑在不與靶向脂質(zhì)的疏水結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接時(shí)，其分子量(MW)約200至約800道爾頓，更優(yōu)選為450至約610道爾頓。
共價(jià)連接或包含疏水結(jié)構(gòu)域的αVβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑與陽離子脂質(zhì)組合產(chǎn)生的陽離子脂質(zhì)體生物可相容且基本無免疫原性。靶向脂質(zhì)體的生物活性可能易受親水表面連接體(如果存在并又在靶向脂質(zhì)體整體構(gòu)型上的話)的化合價(jià)、幾何形狀、組成、大小、柔性或剛性等以及表面連接體的相對親水性等的影響。因此，如果存在親水表面連接體，則最好選擇親水表面連接體使靶向脂質(zhì)體生物活性最大化?？蛇x擇表面連接體以增強(qiáng)靶向分子生物活性。一般來說，可由任何使拮抗劑定位于其結(jié)合位點(diǎn)的有機(jī)分子結(jié)構(gòu)中選擇表面連接體。在這一點(diǎn)上，可將表面連接體看作一個(gè)“框架”，在其上排列著一個(gè)或多個(gè)整聯(lián)蛋白拮抗劑，以便產(chǎn)生需要的定位結(jié)果。定位可包括例如以距離脂質(zhì)體表面合適的距離提供拮抗劑，以使拮抗劑和整聯(lián)蛋白受體的活性位點(diǎn)有效地相互作用。
例如，可通過包括在框架基團(tuán)中含有單環(huán)或多環(huán)基團(tuán)(包括芳基和/或雜芳基基團(tuán))或含有加入一個(gè)或多個(gè)碳-碳多鍵(烯基、亞烯基、炔基或亞炔基)的結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)不同取向。其它基團(tuán)還可以包括為支鏈或直鏈形式的寡聚物和多聚物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，剛性由存在的環(huán)狀基團(tuán)(例如芳基、雜芳基、環(huán)烷基、雜環(huán)基等)賦予。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述環(huán)為6元環(huán)或10元環(huán)。在另一實(shí)施方案中，所述環(huán)為芳族環(huán)，例如苯基或萘基。
Xiong等，Science 296151-155(2002)描述了在結(jié)合了整聯(lián)蛋白拮抗劑時(shí)αVβ3整聯(lián)蛋白胞外部分的晶體結(jié)構(gòu)。用于實(shí)施本發(fā)明的αVβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑所具有的結(jié)構(gòu)以類似于Xiong等描述的作用方式和αVβ3整聯(lián)蛋白受體相互作用。
熟練技術(shù)人員可輕易控制表面連接體的不同親水特性以及脂質(zhì)體上帶電部分的存在與否。例如，可通過用聚(氧化烯)基團(tuán)(例如聚(乙二醇)、聚(丙二醇)等)取代烯基，將衍生自1，6-己二胺(H2N(CH2)6NH2)或相關(guān)多胺的表面連接體的疏水特性修飾得明顯更親水。
可通過將輔助基團(tuán)加入或插入到表面連接體之上或其中改良表面連接體的特性，例如改變脂質(zhì)體(在水、脂肪、脂質(zhì)、生物流體等中)的溶解性、疏水性、親水性、表面連接體柔性、抗原性、穩(wěn)定性等。例如，將一個(gè)或多個(gè)聚(乙二醇)(PEG)基團(tuán)引入表面連接體之上或其中，可增強(qiáng)納米顆粒脂質(zhì)體的親水性和水溶性，同時(shí)增加分子量和分子大小，并且根據(jù)表面連接體的特性還可增加體內(nèi)保留時(shí)間。此外，PEG可降低抗原性，并潛在增強(qiáng)表面連接體的整體剛性。
可增強(qiáng)脂質(zhì)體水溶性/親水性的輔助基團(tuán)對實(shí)施本發(fā)明有效。因此，使用輔助基團(tuán)增強(qiáng)本發(fā)明脂質(zhì)體的水溶性和/或親水性屬于本發(fā)明范疇，所述輔助基團(tuán)例如少量重復(fù)單元的乙二醇、丙二醇、醇、多元醇(例如甘油、丙氧基甘油、糖(包括單糖、寡糖)等)、羧酸(例如少量重復(fù)單元的谷氨酸、丙烯酸等)、胺(例如四乙撐五胺)等。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于改善水溶性/親水性的輔助基團(tuán)為聚醚。輔助基團(tuán)可連接至靶向脂質(zhì)上的表面連接體，或可連接至脂質(zhì)體中的其它脂質(zhì)，例如陽離子脂質(zhì)或中性填充脂質(zhì)。
將親脂輔助基團(tuán)加入到表面連接體結(jié)構(gòu)中來增強(qiáng)本文所述脂質(zhì)體的脂溶性和/或疏水性也屬于本發(fā)明范疇。用于本發(fā)明表面連接體的親脂基團(tuán)包括(僅作為實(shí)例)未取代或取代的芳基和雜芳基，但至少由允許其共價(jià)連接至表面連接體的基團(tuán)取代。其它用于本發(fā)明表面連接體的親脂基團(tuán)包括脂肪酸衍生物，其在水性介質(zhì)中在達(dá)到相對較高的濃度之前不形成雙層。
可通過包含大和/或剛性的輔助基團(tuán)操控表面連接體的柔性。存在大或剛性基團(tuán)可阻礙表面連接體中的鍵、表面連接體和輔助基團(tuán)之間鍵或者表面連接體和功能基團(tuán)之間鍵的自由轉(zhuǎn)動。剛性基團(tuán)可包括例如基團(tuán)中存在環(huán)和/或多鍵抑制其構(gòu)象不穩(wěn)定性的基團(tuán)，例如芳基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基和雜環(huán)基?？少x予剛性的其它基團(tuán)包括多肽基團(tuán)，例如寡或聚脯氨酸鏈。
靜電也可以賦予剛性。因此，如果輔助基團(tuán)帶正電或負(fù)電，則帶同種電荷的輔助基團(tuán)將迫使表面連接體變成帶同種電荷的輔助基團(tuán)間距離最大的構(gòu)型。使帶同種電荷的基團(tuán)間更接近的能耗代價(jià)將使得表面連接體處于維持帶同種電荷的輔助基團(tuán)分開的構(gòu)型。另外，攜帶相反電荷的輔助基團(tuán)趨向于吸引相反電荷部分，很有可能形成分子間離子鍵和分子內(nèi)離子鍵。這種非共價(jià)機(jī)制將使得表面連接體成為相反電荷基團(tuán)可以鍵合的構(gòu)像。加入表面連接體后加入帶電或去保護(hù)后帶電荷的輔助基團(tuán)，包括通過改變pH、氧化、還原或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的導(dǎo)致去除保護(hù)基的其它機(jī)制對羧基、羥基、硫醇基或氨基去保護(hù)，都屬于本發(fā)明范疇。
剛性也可以由內(nèi)部氫鍵合或疏水折疊賦予。
大基團(tuán)可包括例如大原子、離子(例如碘、硫、金屬離子等)或含大原子的基團(tuán)、多環(huán)基團(tuán)(包括芳基、非芳基)和加入一個(gè)或多個(gè)碳-碳多鍵(即烯基和炔基)的結(jié)構(gòu)。大基團(tuán)還可以包括支鏈或直鏈形式的寡聚物和多聚物。預(yù)計(jì)支鏈形式提供給所述結(jié)構(gòu)的剛性要強(qiáng)于相似分子量的直鏈形式。
在某些實(shí)施方案中，剛性由存在的環(huán)狀基團(tuán)(例如芳基、雜芳基、環(huán)烷基、雜環(huán)基等)賦予。在其它實(shí)施方案中，表面連接體含有一個(gè)或幾個(gè)六元環(huán)。在另一實(shí)施方案中，所述環(huán)為芳基，例如苯基或萘基。
適當(dāng)選擇表面連接體以提供合適的取向、限制/非限制性轉(zhuǎn)動、需要程度的疏水性/親水性等，完全屬于本領(lǐng)域技術(shù)。消除或降低本文所述納米顆粒的抗原性也屬于本領(lǐng)域技術(shù)。在某些案例中，可通過使用聚(乙二醇)基之類的基團(tuán)消除或降低納米顆?？乖浴?br> 核酸載體為陽離子兩性分子，例如陽離子脂質(zhì)、陽離子脂質(zhì)體或具有陽離子基團(tuán)的膠束，其通常能夠通過與負(fù)電荷核酸序列相互作用結(jié)合核酸，形成能夠進(jìn)入細(xì)胞的復(fù)合物。圖1、2、3、17和18圖解了靶向脂質(zhì)體。
適于本發(fā)明目的的陽離子脂質(zhì)(細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑)例如為1，2-二油酰氧-3-(N，N，N-三甲銨)丙烷氯化物(DOTAP)、二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)、二油酰二甲基氯化銨、二油酰-L-α-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N-膽甾醇基氧西維因(carbaryl)-3，7，12-三氮雜十五烷-1，15-二胺(CTAP)等。優(yōu)選的陽離子脂質(zhì)為DOTAP。其它合適的陽離子脂質(zhì)描述于Miller，Angew.Chem.Int.Ed.371768-1785(1998)，后文稱為“Miller”以及Copper等，Chem.Eur.J.4(1)137-151(1998)，這些文獻(xiàn)在相關(guān)程度上通過引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明的靶向脂質(zhì)體可交聯(lián)、部分交聯(lián)或未交聯(lián)。交聯(lián)脂質(zhì)體可包含交聯(lián)以及非交聯(lián)的組分。
本發(fā)明的代表性非交聯(lián)靶向脂質(zhì)體為一種脂質(zhì)混合物，其包含DOTAP(陽離子脂質(zhì))、類固醇(中性脂質(zhì))、聚乙二醇(親水輔助組分)，例如PEG-350(具有350個(gè)氧乙烯重復(fù)單元的聚氧乙烯)，以及共價(jià)結(jié)合或包含脂質(zhì)的非肽整聯(lián)蛋白受體拮抗劑。DOTAP∶類固醇∶聚乙二醇的比率優(yōu)選分別為約1∶1∶0.12，所包含的含非肽整聯(lián)蛋白受體拮抗劑脂質(zhì)(整聯(lián)蛋白靶向脂質(zhì))的量足以提供相對較高的αVβ3整聯(lián)蛋白親合性。靶向脂質(zhì)體優(yōu)選包含整聯(lián)蛋白靶向脂質(zhì)，其量以脂質(zhì)體中脂質(zhì)組分的總mol數(shù)為基準(zhǔn)為約1-約20mol％，更優(yōu)選為約8-約12mol％。
本發(fā)明優(yōu)選的交聯(lián)靶向脂質(zhì)體包含聚合兩性或中性脂質(zhì)、聚合整聯(lián)蛋白靶向脂質(zhì)和適于結(jié)合核酸的聚合陽離子脂質(zhì)。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述交聯(lián)靶向脂質(zhì)體包含聚合兩性或中性脂質(zhì)、聚合整聯(lián)蛋白靶向脂質(zhì)和非聚合陽離子脂質(zhì)。
含聚合脂質(zhì)的脂質(zhì)體可通過例如加入合適的自由基聚合引發(fā)劑、用合適波長的紫外燈輻射或聚合領(lǐng)域已知的其它方法交聯(lián)。
合適的陽離子脂質(zhì)或細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑可商購，也可如Sipkins等，Nature Medicine，1998，4(5)(1998)，623-626所述或Miller(同上)所述制備。制備。
陽離子脂質(zhì)體可由單一陽離子兩性分子形成，或者可由陽離子兩性分子與中性脂質(zhì)組合而成，例如由3，3-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇和二油酰L-α-磷脂酰乙醇胺組合而成。
親水特性緣于存在磷酸根、膦酸根、羧酸根、硫酸根、磺酸根、巰基、氨基、硝基、羥基或本領(lǐng)域眾所周知的其它類似基團(tuán)。疏水性可通過包含以下基團(tuán)賦予包括但不限于最高達(dá)20個(gè)碳原子的長鏈飽和和不飽和脂肪烴基團(tuán)，以及由一個(gè)或多個(gè)芳基、雜芳基、環(huán)烷基和/或雜環(huán)基取代的所述基團(tuán)。優(yōu)選的脂質(zhì)為磷酸甘油酯和鞘酯。磷酸甘油脂的代表性實(shí)例包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇聚糖、磷脂酸、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿和二亞油酰磷脂酰膽堿。沒有含磷基團(tuán)的化合物(如鞘脂和鞘糖脂家族)也屬于命名為脂質(zhì)的類別。另外，上述兩親脂質(zhì)可與其它脂質(zhì)(包括三甘油酯和類固醇，例如膽固醇、改良膽固醇等)混合。
整聯(lián)蛋白受體拮抗劑可包含疏水結(jié)構(gòu)域或連接表面連接體或以任何合適部位直接連接疏水結(jié)構(gòu)域，例如連接在直鏈末端或其任一中間位置，只要此連接不干擾拮抗劑與整聯(lián)蛋白受體的結(jié)合。如果有需要，整聯(lián)蛋白受體拮抗劑還可包含或具有可選二價(jià)橋聯(lián)基，以促進(jìn)與表面連接體的連接。
圖1圖示說明了為球形顆粒的靶向脂質(zhì)體，其在顆粒表面具有核酸結(jié)合位點(diǎn)和整聯(lián)蛋白靶向位點(diǎn)。
圖2圖示了本發(fā)明的交聯(lián)靶向脂質(zhì)體。圖3圖示了另一個(gè)交聯(lián)靶向脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體中存在陽離子脂質(zhì)，但不與其交聯(lián)。下文的材料與方法部分詳細(xì)描述了制備此靶向脂質(zhì)體的實(shí)施方案。所述交聯(lián)脂質(zhì)體在其外表面上存在衍生自膽堿部分并能夠結(jié)合核酸的陽離子基團(tuán)以及來自結(jié)合親水表面連接體的整聯(lián)蛋白拮抗劑基團(tuán)的整聯(lián)蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)。
通過使帶負(fù)電核酸接觸存在于脂質(zhì)體上的陽離子基團(tuán)，例如通過在生理pH的藥學(xué)上可接受的水性介質(zhì)中混合核酸和靶向脂質(zhì)體，可使核酸結(jié)合交聯(lián)脂質(zhì)體納米顆粒。所形成的復(fù)合核酸的靶向脂質(zhì)體在體外和體內(nèi)都很容易被接觸靶向脂質(zhì)體的存在整聯(lián)蛋白的細(xì)胞吸收。
靶向脂質(zhì)體正電荷對核酸負(fù)電荷的比率優(yōu)選大于1，更優(yōu)選至少約1.2。
為選擇性靶向或拮抗整聯(lián)蛋白(例如αVβ3整聯(lián)蛋白)，本發(fā)明的化合物和組合物可以單位劑量形式和藥用載體、溶媒和佐劑一起，以治療有效量胃腸外、口服、吸入或局部給藥。本文使用的術(shù)語“胃腸外”包括靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、膜內(nèi)、眼內(nèi)(例如玻璃體內(nèi))和腹腔給藥，以及通過輸注技術(shù)給藥。
可利用任何合適的給藥途徑。包含本發(fā)明結(jié)合核酸的納米顆粒的藥用組合物可以預(yù)定治療有效劑量使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用藥學(xué)領(lǐng)域已知的臨床前和臨床研究很容易確定治療特定病癥或抑制其發(fā)展所需的治療有效量。
本文使用的術(shù)語“治療有效量”是指臨床醫(yī)生或研究者所尋找的激發(fā)組織、系統(tǒng)、動物或人的生物學(xué)或藥學(xué)反應(yīng)的活性成分用量。
本文使用的術(shù)語“抑制”是指病癥的舒緩、中斷或停止，但不是一定表示病癥完全消除。本質(zhì)上，患者生命延長表明病癥受到有益地控制。
本發(fā)明的結(jié)合核酸的靶向脂質(zhì)體或含所述靶向脂質(zhì)的組合物的劑量方案基于若干因素，例如患者的年齡、體重、性別和疾病類型、病癥嚴(yán)重性、給藥途徑以及使用的特定靶向分子或配體的拮抗活性。劑量方案可根據(jù)前述因素改變。與約0.01mg至約1000mg/kg體重相似的劑量水平對治療前述病癥有效。優(yōu)選的劑量水平為約0.01mg至約100mg/kg體重。
對于注射給藥，用藥用載體(例如水、鹽水或葡萄糖水溶液)配制本發(fā)明描述的含靶向脂質(zhì)體的組合物。對于注射，通常的日劑量為約0.01mg至約100mg/kg體重，根據(jù)上述因素每日以單劑或多劑注射。
為抑制血管發(fā)生，例如，給予需要抑制血管發(fā)生的患者治療有效量的本發(fā)明所述靶向脂質(zhì)體，其攜帶能夠表達(dá)血管發(fā)生抑制性蛋白或肽的核酸，例如核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)。接著給予的核酸進(jìn)入細(xì)胞核，并在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)蛋白。
提供以下的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的各個(gè)方面。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，可在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下對本文公開的實(shí)施例和說明性實(shí)施方案進(jìn)行修改。
材料和方法制備納米顆粒要構(gòu)建結(jié)合整聯(lián)蛋白的多價(jià)靶向脂質(zhì)體，首先設(shè)計(jì)并合成可聚合脂質(zhì)整聯(lián)蛋白靶向分子12(圖17；流程1)。以其芐氧羰基(CBZ)衍生物保護(hù)?；撬?的氨基產(chǎn)生2，然后形成磺酰氯3，3偶合叔丁氧羰基二氨基丙酸4，產(chǎn)生化合物5。5皂化產(chǎn)生化合物6，去除叔丁氧羰基(BOC)后得到關(guān)鍵中間體7。7與苯甲酸衍生物8偶合產(chǎn)生化合物9，9氫化以去胺的保護(hù)，同時(shí)還原嘧啶環(huán)，產(chǎn)生整聯(lián)蛋白受體拮抗劑-連接體綴合物10。Duggan等，J.Med.Chem.，2000，43，3736-3745先前已經(jīng)描述了化合物8的合成，該文獻(xiàn)的相關(guān)公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。使用苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(BOP)使3當(dāng)量10與三羧酸螯合劑脂質(zhì)11偶合，產(chǎn)生關(guān)鍵的三價(jià)整聯(lián)蛋白拮抗劑脂質(zhì)12。Storrs等，J Magn.Reson.Imaging，1995，5，719-724先前已經(jīng)描述了化合物11的制備，該文獻(xiàn)的相關(guān)公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。用甲醇鈉的甲醇溶液處理11得到化合物15(即11的三鈉鹽)。如Storrs等(同上)所述，通過加熱15和三氯化銪溶液合成銪-螯合劑脂質(zhì)復(fù)合物14。
圖18的流程2概述了由Storrs等(同上)先前描述的通過自組裝和聚合合適的脂質(zhì)形成交聯(lián)靶向脂質(zhì)體(NP)。通過合并三價(jià)脂質(zhì)-整聯(lián)蛋白拮抗劑12、丁二炔兩性磷酸脂13和銪-螯合劑脂質(zhì)復(fù)合物14的氯仿溶液，合成代表性的交聯(lián)靶向脂質(zhì)體。將化合物14以1％(重量)加入所有配制物中，以便使用熒光顯微鏡檢術(shù)目測顆粒。向此脂質(zhì)的氯仿溶液中加入陰離子螯合劑脂質(zhì)15或陽離子脂質(zhì)16(DOTAP)，以便改變表面電荷。通過改變脂質(zhì)體中化合物12的量控制NP上整聯(lián)蛋白拮抗劑的表面密度。
為形成囊泡，蒸發(fā)合并的脂質(zhì)溶液至干，高真空干燥去除任何殘余溶劑，形成脂質(zhì)薄膜。使用去離子水將干燥的脂質(zhì)薄膜水化至已知的脂質(zhì)密度(30mM)。然后按照Leaver等，Biochim.Biophys.Acta，1983，732，210-218的方法，在保持pH為7.0-7.5的同時(shí)，使用探針尖端超聲器以高于凝膠-液體晶體相轉(zhuǎn)變(Tm64℃)的溫度超聲處理所獲得的懸浮液。大約超聲處理1小時(shí)后溶液變得澄清。然后通過在濕冰床上將所述溶液冷卻至0℃，并用手提式UV燈于約254nm輻射所述溶液大約2小時(shí)，對囊泡進(jìn)行聚合。獲得的脂質(zhì)體(NP1至NP6)為橙黃色，并具有兩條可見吸附帶，集中在490nm和535nm，由綴合的烯-炔(ene-yne)丁二炔聚合物產(chǎn)生。根據(jù)動態(tài)光散射(DLS)測定，NP的平均直徑為40nm-50nm。NP1至NP4的ζ電勢為-42至-53mV(即NP1-NP4帶負(fù)電荷)，NP5和NP6的ζ電勢分別為+35和+43mV(即NP5和NP6帶正電荷)(Brookhaven Instruments，Holtsville，NY)。所述脂質(zhì)體在使用150mM氯化鈉、50mM組氨酸和5％葡萄糖溶液配制為用于體內(nèi)的溶液后穩(wěn)定數(shù)月，物理和生物特性沒有明顯變化。
下表1提供了脂質(zhì)體NP1至NP6的成分，以組分12(靶向脂質(zhì))、13(兩性脂質(zhì))、14(陰離子螯合劑脂質(zhì))和16(陽離子脂質(zhì)；DOTAP)的mol％表示。
表1-脂質(zhì)體成分NP1-NP6脂質(zhì)體 mol％mol％ mol％ mol％靶向脂質(zhì) 兩性脂質(zhì)陰離子脂質(zhì)陽離子脂質(zhì)NP1 10 80 100NP2 189 100NP3 0.1 90 100NP4 090 100NP5 10 80 0 10NP6 090 0 10如圖18的概述，使用0.1、1和10mol％整聯(lián)蛋白拮抗劑脂質(zhì)復(fù)合化合物12和化合物13通過聚合囊泡構(gòu)建脂質(zhì)體，在聚合之前另外加入材料14、15和16到脂質(zhì)體中，以改變表面電荷密度，使脂質(zhì)體可通過熒光目測。為簡便起見，圖18沒有列出可選的僅含1mol％脂質(zhì)體的化合物13。含有10mol％化合物12的材料(NP1和NP5)對整聯(lián)蛋白αVβ3鍵合位點(diǎn)的親合性最高。在使用時(shí)間分辨熒光顯微鏡檢術(shù)的競爭性整聯(lián)蛋白結(jié)合測定中，消耗了超過100倍的游離配體10(65μm)才將NP1和αVβ3整聯(lián)蛋白的結(jié)合降低50％，盡管事實(shí)上NP1在其表面上僅具有0.5μM當(dāng)量的整聯(lián)蛋白拮抗劑10。在使用結(jié)合至玻連蛋白包被平板的αVβ3陽性M21黑素瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞粘附抑制測定中，游離配體10的IC50為64μM。形成強(qiáng)烈對比的是，在表面上的陰離子顆粒NP1的IC50為0.27μM當(dāng)量化合物10。這表示當(dāng)10在NP上時(shí)對細(xì)胞表面的親合力是游離配體的200倍以上。對于陰離子顆粒NP5，IC50為0.35μM當(dāng)量化合物10，親合力大約是游離配體的180倍，如下表2所示。因此，不管表面電荷如何，與單體配體相比，NP對整聯(lián)蛋白的親合力大約增加180-200倍。該結(jié)果證實(shí)，NP表面和細(xì)胞表面之間發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用。此相互作用與NP上的表面電荷無關(guān)，而是與特定受體配體的相互作用直接相關(guān)。通過在NP表面上以多價(jià)提供整聯(lián)蛋白拮抗劑，可使親合力比游離配體增加大約兩個(gè)數(shù)量級。當(dāng)NP制備物中化合物12的量分別下降10倍和100倍至1mol％和0.1mol％(如NP2和NP3)時(shí)，阻斷細(xì)胞粘附的能力下降約1至2個(gè)數(shù)量級，分別如下表2所示。
表2脂質(zhì)體NP1-NP6的物理和生物特性材料大小 ζ電勢 競爭性抑制 細(xì)胞粘附測定 多價(jià)效果IC50(游離(nm) (mV) 測定(μM10) IC50(μM NP上10) [10]/NP上的[10])NP1 45.1± -42 65 0.27 2370.6NP2 42.8± -49 24 7 91.5NP3 44.4± -53 1 30.5 20.8NP4 46.4± -49 NA 抑制 NA0.7NP5 41.7± 3560 0.35 1832.2NP6 36.8± 43NA 抑制 NA0.9脂質(zhì)體NP5代表本發(fā)明的代表性交聯(lián)靶向脂質(zhì)體。
通用合成方法使用的所有溶劑和試劑都是試劑級。在公用真空(house vacuum)或Welch直流真空泵提供的減壓下以≤40℃進(jìn)行溶劑蒸發(fā)。如所述對每個(gè)實(shí)例用JEOL FX90Q記錄其在CDCl3、CD3OD、D2O或混合物中的1H和13C-NMR光譜，質(zhì)子光譜為90MHz，碳光譜為大約23MHz。(注意盡管可溶于CDCl3，但向脂質(zhì)中加入CD3OD抑制反膠束形成，由此產(chǎn)生較尖銳的光譜)。1H實(shí)驗(yàn)光譜以殘余CHCl3(7.25ppm)作為參比，13C實(shí)驗(yàn)光譜以CDCl3中線(77.00ppm)作為參比。用PerSeptive DE儀器(質(zhì)譜，The Scripps Research Institute，La Jolla，CA)進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜。在玻璃基板型Merck 60 F254(0.2mm；EMSeparations，Wakefield，RI)上進(jìn)行TLC，顯色板按常規(guī)用硫酸鈰(1％)和鉬酸銨(2.5％)的10％硫酸水溶液噴霧，加熱至約150℃。其它顯色劑包括碘(一般用途)、0.5％茚三酮的丙酮溶液(用于胺)和紫外燈(用于UV發(fā)色團(tuán))。
N-芐氧羰基-牛磺酸鈉鹽(2)。將?；撬?(約40g，320mmol)溶解在4N氫氧化鈉溶液(80ml)和水(約200ml)中。向該溶液中滴加芐氧基碳酰氯(約48ml，330mmol)，劇烈攪拌約4小時(shí)。加入10％碳酸氫鈉溶液(約300ml)和4N氫氧化鈉溶液(約45ml)將溶液pH維持在堿性。然后用乙醚(約1000ml)洗滌獲得的反應(yīng)混合物，將水層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，再在高真空下經(jīng)五氧化二磷過夜干燥，產(chǎn)生約12.7g(14％)2。1H-NMR(D2O)δ7.50(5H，s，Ar-H)，5.21(2H，s，Ar-CH2)，3.62(2H，t，CH2)，3.14(2H，t，CH2)。
2-芐氧羰基氨基乙烷磺酰氯(3)。在正壓氬氣下將N-CBZ-牛磺酸鈉鹽2(約12.7g，32mmol)懸浮在無水乙醚(約30ml)中，并在約15分鐘內(nèi)以5份五氯化磷(約7g，33.6mmol)處理。于室溫下攪拌反應(yīng)物約4小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。加入冰水(約10ml)，以冰浴冷卻燒瓶和內(nèi)容物后研磨獲得的殘余物。再加入冰水(約50ml)，固化產(chǎn)物。過濾收集固體，用冰水(約20ml)洗滌，經(jīng)五氧化二磷過夜干燥，產(chǎn)生約6.95g(78％)3。1H-NMR(CDCl3)δ7.35(5H，s，Ar-H)，5.12(2H，s，Ar-CH2)，3.89(2H，t，CH2)與3.85(2H，t，CH2)重疊。
3-丁氧羰基氨基-2-(S)-芐氧羰基氨基乙基亞磺酰氨基丙酸甲酯(5)。在正壓氬氣下用冰浴冷卻磺酰氯3(約21.6g，78mmol)和3-N-丁氧羰基氨基-2-氨基丙酸甲酯(4，約9.96g，39.2mmol)的無水四氫呋喃(THF，150ml)溶液的混合物。在正壓氬氣下于約30分鐘內(nèi)，使用預(yù)先干燥的滴液漏斗向該溶液中滴加入N-甲基嗎啉(約16ml，145mmol)的無水THF(約275ml)溶液。在冰浴中攪拌約1小時(shí)后，通過TLC觀察到基本上所有磺酰氯(Rf＝0.65)都已消耗完(洗脫液乙酸乙酯/己烷1∶1)。但是，仍存在未反應(yīng)的二氨基丙酸(Rf＝0.1，茚三酮噴霧)。在約3小時(shí)內(nèi)再加入磺酰氯(約5.0g，18mmol)。然后過濾獲得的反應(yīng)產(chǎn)物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，并溶解在乙酸乙酯(約100ml)中，用冷稀鹽酸(約20ml)、飽和碳酸氫鈉溶液(約20ml)然后是飽和氯化鈉溶液(約20ml)洗滌，接著經(jīng)無水硫酸鈉干燥。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，真空下過夜干燥獲得的殘余物。通過首先溶解在乙酸乙酯中，然后加入等體積己烷，使干燥的殘余物重結(jié)晶，獲得為無色固體的甲酯5約13.4g(約74％)。1H-NMR(CDCl3)δ7.36(5H，s，Ar-H)，5.83(1H，d，NH)，5.55(1H，t，NH)，5.12(2H，s，Ar-CH2)，5.06(1H，t，NH)，4.26(2H，m，CH)，3.79(3H，s，CH3)，3.70(2H，dd，CH2)，3.26(2H，dd，CH2)，1.43(9H，s，(CH3)3)。
3-丁氧羰基氨基-2-(S)-芐氧羰基氨基乙基亞磺酰氨基丙酸(6)。以冰浴冷卻甲酯5(約13.3g，28.9mmol)的四氫呋喃(約160ml)溶液。向該溶液中加入氫氧化鋰(約5.42g，128mmol)的冰水(160ml)溶液。去除冰浴使獲得的反應(yīng)混合物緩慢升溫至室溫，于室溫?cái)嚢杌旌衔锛s1小時(shí)。然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑。用乙醚(20ml)洗滌殘余的水性部分，然后用稀鹽酸酸化至約pH4。以冰浴冷卻該溶液，然后和乙酸乙酯(約100ml)混合，接著使用冰冷稀鹽酸再酸化至約pH1，并立即用乙酸乙酯(約2×200ml)提取。用鹽水(約50ml)洗滌乙酸乙酯層，經(jīng)無水硫酸鈉干燥。然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，獲得的殘余物在高真空下過夜干燥，獲得約13.3g泡沫固體，將其由己烷/乙酸乙酯(1∶1)中重結(jié)晶，獲得約11.6g(89.7％)的6。1H-NMR(CDCl3)δ7.33(5H，s，Ar-H)，6.12(1H，d，NH)，5.68(1H，t，NH)，5.26(1H，t，NH)，5.1(2H，s，Ar-CH2)，4.24(2H，m，CH2)，3.67(2H，t，CH2)，3.27(2H，t，CH2)，1.45(9H，s，C(CH3)3)。
3-氨基-2-(S)-芐氧羰基氨基乙基亞磺酰氨基-丙酸(7)。用三氟乙酸(約68ml)的二氯甲烷(約350ml)處理N-BOC-β-氨基酸6(約11.5g，25.8mmol)約1.5小時(shí)，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。將獲得的殘余物溶解在水(約200ml)中并凍干，獲得約10.9g(98.8％)的固體7。1H-NMR(CDCl3)δ7.30(5H，s，Ar-H)，6.07(1H，d，NH)，5.61(1H，t，NH)，5.20(1H，t，NH)，5.17(2H，s，Ar-CH2)，4.11(2H，m，CH2)，3.53(2H，t，CH2)，3.32(2H，t，CH2)。C13H19N3O6S的DCI-MS為m/z(離子)346(M+H)(C13H19N3O6S+H的理論值，m/z346)。
4-[2-(嘧啶-2-基氨基)乙氧基]苯甲?；?2-(S)-芐氧羰基氨基乙基亞磺酰氨基-β-丙氨酸(9)。在正壓氬氣下將苯甲酸衍生物8(約6.4g，24.7mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(約3.6g，31mmol)溶解在無水二甲亞砜(約110ml)中，并以冰浴冷卻。向該溶液中加入1-(3-(二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽鹽酸(約4.9g，25.6mmol)。于冰冷的溫度攪拌該溶液1小時(shí)，然后使其升至室溫。再于室溫持續(xù)攪拌約24小時(shí)。向獲得的混合物中加入β-氨基酸7(約12.2g，25.8mmol)的溶液，然后加入N-甲基嗎啉。于氬氣下攪拌獲得的反應(yīng)混合物約3天。然后將獲得的混合物傾倒入水(約1L)中，用稀鹽酸酸化至約pH1.5，并用乙酸乙酯(約5×500ml)提取。用飽和氯化鈉溶液(約50ml)洗滌合并的有機(jī)相，然后經(jīng)無水硫酸鈉干燥。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。獲得的殘余物用乙酸乙酯研磨，過濾，然后在高真空下干燥，獲得約10.5g(72.5％)9。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.30(2H，d，Ar-H)，7.99(2H，d，Ar-H)，7.34(5H，s，Ar-H)，7.00(2H，d，Ar-H)，6.60(1H，dd，Ar-H)，5.01(2H，s，CH2)，4.15(1H，t，CH)，3.67(2H，t，CH2)，3.56(2H，t，CH2)，3.17(2H，t，CH2)。
4-[2-(3，4，5，6-四氫嘧啶-2-基氨基)乙氧基]苯甲?；?2-(S)-氨基乙基亞磺酰氨基-β-丙氨酸(10)。將嘧啶衍生物9(約3.7g，6.4mmol)的溶液溶解在乙酸(約190ml)和濃鹽酸(約17ml)中。獲得的溶液與10％披鈀碳(約1.62g)混合，在約45psi的氫氣中氫化約5小時(shí)。然后通過C鹽床過濾獲得的混合物，用水洗滌。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，高真空下干燥獲得的殘余物。將干燥的殘余物溶解在水(約100ml)中，用1N氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至約7，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。將獲得的殘余物溶解在甲醇(約20ml)中并過濾。過濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，溶解在水(約275ml)中并凍干。然后獲得的凍干產(chǎn)物由水中重結(jié)晶，獲得約2.96g(約78.9％)產(chǎn)物10。1H-NMR(D2O)δ7.80(2H，d，Ar-H)，7.14(2H，d，Ar-H)，4.49(1H，s，CHaHb)，4.28(2H，t，CH2)，3.94(1H，dd，CHaHb)，3.61(6H，m，CH2)，3.32(4H，t，CH2)，1.90(2H，t，CH2)。C18H28N6O6S的ES-MSm/z(離子)457(M+H)(C18H28N6O6S+H的理論值，m/z457)。(12)。用預(yù)先火焰干燥并充氬氣的3頸RB燒瓶，將(PDA-PEG3)2-DTPA-(COOH)3(約11.69mg，50μmol)溶解在無水CH3CN(約5ml)、無水CH2Cl2(約2ml)和Et3N(約1ml)中。向獲得的溶液加入BOP試劑(約134mg，150μmol)，獲得的混合物充分?jǐn)嚢?分鐘，以獲得脂質(zhì)溶液。在充氬氣的干燥小瓶中制備10(約69mg，150μmol)的無水CH3CN(約5ml)和無水二甲基甲酰胺(DMF)(約2ml)混合物溶液。使用干燥注射器在連續(xù)攪拌下將10的溶液加入脂質(zhì)溶液中。將如此產(chǎn)生的反應(yīng)混合物于黑暗中攪拌10小時(shí)。TLC(溶劑CHCl3、CH3OH、H2O和CH3COOH)顯示起始物質(zhì)(Rf＝0.53)完全消失。有一個(gè)主產(chǎn)物(Rf＝0.2)和5個(gè)副產(chǎn)物(Rf＜0.18)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，獲得的殘余物在高真空下干燥約24小時(shí)，獲得粗產(chǎn)物。使用半制備型硅膠柱通過正常相HPLC純化粗產(chǎn)物，流速約5ml/分鐘(梯度系統(tǒng)起始為100％CHCl3，約5分鐘；然后為75％CHCl3/25％CH3OH，10分鐘；然后為50％CHCl3/50％CH3OH，10分鐘；然后為25％CHCl3/75％CH3OH，10分鐘；最后為100％CH3OH，約20分鐘)。合并含主產(chǎn)物的組分(保留時(shí)間＝35-37分鐘)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，獲得的殘余物在高真空下干燥約24小時(shí)，獲得約35.5mg(26.5％)目的產(chǎn)物。高分辨率MALDI-FTMSm/z 2681.4711(C130H209N25O29S3+H的理論值，m/z 2681.4882)。
實(shí)施例實(shí)施例1細(xì)胞粘附測定使用人黑素瘤細(xì)胞系M21在包被玻連蛋白的平板上進(jìn)行細(xì)胞粘附測定。將多價(jià)脂質(zhì)體NP1-NP6以及單體配體10分別與M21細(xì)胞溫育，加至包被玻連蛋白的48孔平板上。溫育1小時(shí)后，洗滌各孔，用結(jié)晶紫溶液對粘附細(xì)胞染色，檢測約590nm的光密度(OD)。檢測的OD與結(jié)合至玻連蛋白平板的細(xì)胞數(shù)成比例，將OD對不同配制物中NP表面上的組分10濃度作圖，以計(jì)算IC50。
圖8圖解了細(xì)胞粘附測定，其中表達(dá)αVβ3的M21人黑素瘤細(xì)胞與共價(jià)結(jié)合整聯(lián)蛋白拮抗劑(配體)的脂質(zhì)體或單獨(dú)配體混合。然后將細(xì)胞置于玻連蛋白平板上，洗滌并染色。然后使用平板計(jì)數(shù)器對結(jié)合細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)。
圖9以曲線圖列出了使用圖8所示的粘附測定所獲得的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)顯示結(jié)合整聯(lián)蛋白拮抗劑的脂質(zhì)體強(qiáng)烈抑制細(xì)胞粘附(IC50＝1μM)，而單獨(dú)的拮抗劑(配體)抑制細(xì)胞粘附的效果(IC50＝0.5mM)相差很遠(yuǎn)。
實(shí)施例2體外轉(zhuǎn)染測定將分別有或沒有共價(jià)連接αVβ3靶向配體的約30nmol陽離子脂質(zhì)體NP5和NP6各與約2μg編碼綠色熒光蛋白(GFP)的質(zhì)粒DNA的5％葡萄糖溶液復(fù)合，然后體外接觸黑素瘤細(xì)胞約1小時(shí)。24小時(shí)后通過計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)相比測定轉(zhuǎn)染效率。使用的細(xì)胞是人黑素瘤細(xì)胞M21和M21L。M21細(xì)胞表達(dá)αVβ3整聯(lián)蛋白，而M21L細(xì)胞不表達(dá)αVβ3整聯(lián)蛋白(αV無效)。
如圖10所示，用與GFP基因復(fù)合的靶向脂質(zhì)體(NPS)處理的αV表達(dá)細(xì)胞(M21)表現(xiàn)出的轉(zhuǎn)染程度(＞125,000細(xì)胞/百萬)是用非靶向脂質(zhì)體(NP6)(無拮抗劑；約25,000細(xì)胞/百萬)或單獨(dú)DNA(無脂質(zhì)體，約12,000細(xì)胞/百萬)處理的αV表達(dá)細(xì)胞的5倍或更高。相比之下，αV無效細(xì)胞(M21L)顯示加入GFP基因沒有優(yōu)勢，獲得相對較低水平的轉(zhuǎn)染(25,000細(xì)胞/百萬)，而與接受的處理無關(guān)。因此，靶向基因載體顯示以αVβ3依賴方式轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
實(shí)施例3靶向脂質(zhì)體介導(dǎo)的體內(nèi)靶向腫瘤的基因傳遞將各約450nmol的NP5和NP6與各約30μg的編碼螢火蟲熒光素酶的質(zhì)粒DNA的各約200μl 5％葡萄糖溶液靜電復(fù)合，然后將每種復(fù)合DNA的脂質(zhì)體溶液靜脈注射入具有不表達(dá)αVβ3(M21L)的約150mm3皮下黑素瘤的動物。約24小時(shí)后處死動物，切除所述器官和腫瘤，測定熒光素酶活性。除使用組織研磨機(jī)以器官重量標(biāo)化的Bright-Glo裂解試劑量研磨全部器官以外，按照生產(chǎn)商的指引，使用Bright-Glo熒光素酶檢測試劑盒(Promega Corp.，Madison，WI)測定熒光素酶活性。
如圖11所示，相比于肺、肝和心臟組織，與熒光素酶基因復(fù)合的靶向脂質(zhì)體(NP5)在腫瘤組織中顯示高度選擇性表達(dá)，表達(dá)水平約4pg熒光素酶/mg組織，相比之下估計(jì)在其它組織中的表達(dá)水平低于pg/mg組織。與熒光素酶復(fù)合的非靶向脂質(zhì)體(NP6)對轉(zhuǎn)染任何組織都無效。加入約過量20倍的可溶性整聯(lián)蛋白拮抗劑配體通過靶向配體有效抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
實(shí)施例4靶向脂質(zhì)體介導(dǎo)性傳遞突變型Raf基因至腫瘤血管使移植腫瘤消退將不表達(dá)αVβ3的黑素瘤(M21L)皮下注射入腰窩，使其生長至約70mm3，此時(shí)用200μl5％葡萄糖溶液(對照)、與約30μg編碼顯性失活突變形式的Raf激酶(Raf-ATPμ)的質(zhì)粒DNA復(fù)合的靶向脂質(zhì)體NP5的200μl5％葡萄糖溶液或與不編碼任何DNA的穿梭載體復(fù)合的靶向脂質(zhì)體NP5的200μl5％葡萄糖溶液靜脈注射小鼠。約15天后，以相同的處理方式再注射腫瘤。在圖12所示的時(shí)間點(diǎn)，使用公式腫瘤體積＝(最小直徑)2×最大直徑/2檢測腫瘤大小。
如圖12所示，用復(fù)合顯性失活突變形式的Raf激酶(Raf-ATPμ)的靶向脂質(zhì)體NP5處理具有約70mm3初始體積的黑素瘤的小鼠，導(dǎo)致腫瘤體積開始增加至約550mm3，接著在約30天后腫瘤消退，至第35天穩(wěn)定至約200mm3體積的穩(wěn)定狀態(tài)(圖12中標(biāo)記為“顆粒/Raf(-)”)。該穩(wěn)定狀態(tài)的腫瘤大小又保持了30天，此時(shí)終止實(shí)驗(yàn)。在用單獨(dú)的靶向脂質(zhì)體NP5(無基因)(標(biāo)記為“顆粒/穿梭載體”)或單獨(dú)的突變型Raf基因(無脂質(zhì)體)處理的小鼠中，腫瘤在35天的整個(gè)階段中持續(xù)生長，沒有任何消退跡象。因?yàn)樗瞿[瘤不表達(dá)αVβ3，但新生血管內(nèi)皮細(xì)胞確實(shí)表達(dá)αVβ3，所以腫瘤生長的減弱更可能使由于腫瘤血管的血管發(fā)生受到抑制。
實(shí)施例5靶向脂質(zhì)體介導(dǎo)性傳遞突變型Raf基因至腫瘤血管使移植黑素瘤消退如實(shí)施例4處理腫瘤，只是在初始治療前使腫瘤生長至約300mm3，此時(shí)向其注射(a)約450nmol靶向脂質(zhì)體NP5，其靜電復(fù)合約30μg編碼Raf-ATPμ的質(zhì)粒DNA的約200μl5％葡萄糖溶液，(b)約450nmol非靶向脂質(zhì)體NP6，其靜電復(fù)合約30μg編碼Raf-ATPμ的質(zhì)粒DNA的約200μl5％葡萄糖溶液，或(c)約450nmol靶向脂質(zhì)體NP，其與和約20mol過量整聯(lián)蛋白αVβ3競爭配體混合的約30μg編碼Raf-ATPμ的質(zhì)粒DNA的約200μl5％葡萄糖溶液靜電復(fù)合。在圖13所示的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行腫瘤檢測，其中(a)標(biāo)記為“Raf(-)”，(b)標(biāo)記為“非靶向”，(c)標(biāo)記為“過量”。還包括未處理的對照。
如圖13所示，在初始生長階段后，用復(fù)合顯性失活突變形式的Raf激酶(Raf-ATPμ)的靶向脂質(zhì)體NP5處理具有300mm3初始體積黑素瘤的小鼠，也使腫瘤體積比未處理的對照組減小。
實(shí)施例6靶向脂質(zhì)體介導(dǎo)的傳遞是血管發(fā)生血管選擇性的將約300nmol NP5與約20μg的編碼綠色熒光蛋白(GFP)的質(zhì)粒DNA的約50μl5％葡萄糖溶液復(fù)合，然后靜脈注射入雞胚，雞胚的尿囊絨膜(CAM)預(yù)先暴露于用1mg/ml bFGF飽和的濾碟達(dá)24小時(shí)，以刺激血管發(fā)生。復(fù)合物注射后1天，收集CAM組織，用PBS洗滌，用4％低聚甲醛固定，并檢測熒光的存在情況。結(jié)果示于圖14。
由圖14的顯微照片可見，GFP高度定位于CAM的血管系統(tǒng)。
實(shí)施例7由靶向脂質(zhì)體介導(dǎo)的突變型Raf基因向腫瘤血管的傳遞誘導(dǎo)血管凋亡，隨后腫瘤細(xì)胞死亡將不表達(dá)αVβ3的黑素瘤皮下注射入小鼠腰窩。使產(chǎn)生的腫瘤生長至約200mm3，此時(shí)用約450nmol NP5靜脈注射小鼠，所述NP5復(fù)合約30μg編碼Raf-ATPμ的質(zhì)粒DNA約200μl5％葡萄糖溶液或復(fù)合穿梭載體的約200μl5％葡萄糖溶液。約72小時(shí)后切除腫瘤，用4％低聚甲醛固定，制成切片，使用檢測片段化DNA的TUNEL法(Intergen Corp，Purchase，NY)對Von Willebrand因子(血管標(biāo)記物)和凋亡染色。
圖15所示的顯微照片表明，接觸納米顆粒/穿梭載體(對照)的腫瘤顯示相對較高的血管密度，幾乎沒有細(xì)胞經(jīng)歷凋亡。相反，接觸NP5/Raf-ATPμ的腫瘤的大部分血管經(jīng)歷凋亡，腫瘤的大部分區(qū)域在距凋亡血管的固定距離死亡，推測是由于輸血不足。
實(shí)施例8靶向脂質(zhì)體介導(dǎo)的傳遞是血管發(fā)生血管選擇性的在小鼠中，側(cè)支由淺表血管叢視網(wǎng)膜毛細(xì)血管出芽，穿過視網(wǎng)膜，在出生后第8天(P8)和第10天(P10)之間形成深部血管叢。在該研究中，在P10對小鼠玻璃體內(nèi)注射復(fù)合約0.15μg編碼綠色熒光蛋白的質(zhì)粒DNA的約1μl5％葡萄糖溶液的靶向脂質(zhì)體NP5，然后玻璃體內(nèi)注射。注射復(fù)合GFP基因的NP5后約24小時(shí)，處死小鼠，用連接抗膠原蛋白IV抗體(一種血管標(biāo)記物)的羅丹明免疫染色視網(wǎng)膜，通過雙光子激光掃描顯微鏡進(jìn)行評測，以檢測視網(wǎng)膜血管中GFP的相對水平。
圖16的顯微照片顯示GFP高度定位于視網(wǎng)膜血管。
可在不背離本發(fā)明新特征的精神和范圍的情況下，對上述實(shí)施方案和實(shí)施例實(shí)施眾多的變化和修改。本文闡述的具體實(shí)施方案沒有限制作用，或者應(yīng)當(dāng)推斷出沒有限制作用。所附權(quán)利要求書用于覆蓋屬于權(quán)利要求書范圍的所有所述修改。
權(quán)利要求
1.一種αvβ3整聯(lián)蛋白靶向脂質(zhì)體，其包含陽離子兩性分子；中性脂質(zhì)；具有靶向結(jié)構(gòu)域和結(jié)合靶向結(jié)構(gòu)域的疏水結(jié)構(gòu)域的靶向脂質(zhì)；以及與所述陽離子脂質(zhì)復(fù)合的核酸；所述陽離子脂質(zhì)的存在量為約1至約50mol％，所述靶向脂質(zhì)的存在量為約1至約20mol％，mol％值是基于脂質(zhì)體中脂質(zhì)的總摩爾數(shù)，而所述靶向結(jié)構(gòu)域包括非肽αvβ3整聯(lián)蛋白拮抗劑。
2.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述陽離子兩性分子為陽離子脂質(zhì)。
3.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體中存在的至少一部分脂質(zhì)具有互相交聯(lián)的功能基團(tuán)。
4.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，其中所述非肽αvβ3整聯(lián)蛋白拮抗劑在生理pH值為兩性離子，具有通過間隔基互相分開的陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)，所述間隔基在陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)之間產(chǎn)生的間距為約10埃至約100埃。
5.權(quán)利要求4的脂質(zhì)體，其中所述間隔基包括二價(jià)芳基。
6.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述核酸為DNA。
7.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述核酸為基因。
8.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述核酸為反義寡核苷酸序列。
9.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述核酸為RNA。
10.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體的顆粒大小不超過約250nm。
11.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體的顆粒大小為約40nm至約100nm。
12.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體的顆粒大小為約75nm至約100nm。
13.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體的顆粒大小為約40nm至約65nm。
14.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述非肽αvβ3整聯(lián)蛋白拮抗劑的分子量為約455道爾頓至約605道爾頓。
15.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述非肽αvβ3整聯(lián)蛋白拮抗劑的分子量為約200道爾頓至約800道爾頓。
16.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，其中所述非肽αvβ3整聯(lián)蛋白拮抗劑由式(I)表示 其中在式(I)中，R1和R2均為氫，或一起形成橋聯(lián)1，2-亞苯基(C6H4)基團(tuán)或橋聯(lián)乙烯基(-CH＝CH-)；X是-C(O)-或共價(jià)鍵；n是1，2或3；Z1是-C(O)-R3、-C(O)OR3或SO2R3；而R3是苯基、取代的苯基、吡啶基、芐基、取代的芐基、C1-C4鹵代烷基、C2-C30烷基、C2-C30烯基、C2-C30炔基或膽甾醇基。
17.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，其中所述非肽αvβ3整聯(lián)蛋白拮抗劑由式(II)表示 其中在式(II)中，R4和R5均為氫，或一起形成共價(jià)鍵；Y是-C(O)-或-CH2-；Z2是-C(O)-R6、-C(O)OR6或SO2R6；R6是苯基、取代的苯基、吡啶基、芐基、取代的芐基、C1-C4鹵代烷基、C2-C30烷基、C2-C30烯基、C2-C30炔基或膽甾醇基；而Het是2-吡啶基或2-咪唑基。
18.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體不含交聯(lián)脂質(zhì)，其顆粒大小為約75nm至約100nm。
19.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體包含交聯(lián)脂質(zhì)，其顆粒大小為約40nm至約65nm。
20.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體，其中所述靶向脂質(zhì)和中性脂質(zhì)至少部分互相交聯(lián)，而所述陽離子兩性分子基本沒有交聯(lián)。
21.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，其中所述陽離子脂質(zhì)為1，2-二油酰氧基-3-(N，N，N-三甲銨)丙烷氯化物。
22.權(quán)利要求21的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體還包含具有約250至約500個(gè)氧乙烯重復(fù)單元的聚(乙二醇)。
23.權(quán)利要求22的脂質(zhì)體，其中所述聚(乙二醇)包含約350個(gè)氧乙烯重復(fù)單元。
24.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體包含1，2-二油酰氧基-3-(N，N，N-三甲銨)丙烷氯化物、膽固醇和聚(乙二醇)，它們的比率分別為約1∶1∶012。
25.權(quán)利要求2的脂質(zhì)體，其中所述核酸能夠在已經(jīng)引入所述脂質(zhì)體的細(xì)胞中表達(dá)蛋白或肽。
26.權(quán)利要求25的脂質(zhì)體，其中所述核酸能夠表達(dá)血管發(fā)生抑制性蛋白或肽。
27.權(quán)利要求26的脂質(zhì)體，其中血管發(fā)生抑制性蛋白為Raf蛋白。
28.一種將核酸導(dǎo)入存在αvβ3整聯(lián)蛋白的細(xì)胞中的方法，該方法包括使所述細(xì)胞接觸權(quán)利要求1的αvβ3整聯(lián)蛋白受體靶向脂質(zhì)體。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述非肽αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑為選擇性αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑在生理pH值具有能夠結(jié)合整聯(lián)蛋白受體的陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)，而其中所述陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)通過間隔基互相分開，所述間隔基在所述拮抗劑的陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)之間產(chǎn)生的間距為約10埃至約100埃。
31.一種抑制血管發(fā)生的方法，該方法包括給予需要抑制血管發(fā)生的患者治療有效量的權(quán)利要求1的αvβ3整聯(lián)蛋白受體靶向脂質(zhì)體，所述靶向脂質(zhì)體能夠表達(dá)血管發(fā)生抑制性蛋白或肽。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述非肽αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑為選擇性αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑在生理pH值具有能夠結(jié)合整聯(lián)蛋白受體的陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)，而其中所述陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)通過間隔基互相分開，所述間隔基在所述拮抗劑的陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)之間產(chǎn)生的間距為約10埃至約100埃。
34.權(quán)利要求31的方法，其中所述脂質(zhì)體眼內(nèi)給藥以治療血管性眼病。
35.權(quán)利要求31的方法，其中所述脂質(zhì)體靜脈內(nèi)給藥。
36.權(quán)利要求31的方法，其中所述脂質(zhì)體通過注射入腫瘤給藥。
37.一種抑制腫瘤生長的方法，該方法包括給予需要抑制腫瘤生長的患者治療有效量的權(quán)利要求1的αvβ3整聯(lián)蛋白受體靶向脂質(zhì)體，所述靶向脂質(zhì)體能夠表達(dá)血管發(fā)生抑制性蛋白或肽。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述非肽αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑為選擇性αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑在生理pH值具有能夠結(jié)合整聯(lián)蛋白受體的陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)，而其中所述陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)通過間隔基互相分開，所述間隔基在所述拮抗劑的陽離子基團(tuán)和陰離子基團(tuán)之間產(chǎn)生的間距為約10埃至約100埃。
40.權(quán)利要求37的方法，其中所述脂質(zhì)體靜脈內(nèi)給藥。
41.權(quán)利要求37的方法，其中所述脂質(zhì)體通過注射入腫瘤給藥。
42.一種誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括使血管內(nèi)皮細(xì)胞接觸誘導(dǎo)凋亡有效量的權(quán)利要求1的αvβ3整聯(lián)蛋白受體靶向脂質(zhì)體，所述靶向脂質(zhì)體能夠表達(dá)凋亡誘導(dǎo)性蛋白或肽。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述凋亡誘導(dǎo)性蛋白為Raf蛋白。
全文摘要
α
文檔編號A61K48/00GK1535163SQ02814966
公開日2004年10月6日 申請日期2002年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月30日
發(fā)明者D·A·徹雷斯, J·霍德, M·貝德納斯基, D A 徹雷斯, 履傷夠 申請人:斯克里普斯研究學(xué)院, 萊蘭斯坦福初級大學(xué)評議會