專利名稱：用于骨誘導(dǎo)蛋白的磷酸鈣傳遞載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用作骨誘導(dǎo)蛋白傳遞載體的含有磷酸鈣的復(fù)合材料，本發(fā)明還進一步涉及生物相容的骨誘導(dǎo)復(fù)合材料，可被用于骨再生和骨增長，以及在骨折、牙齒植入、骨植入和修補等時用于組織修復(fù)和強化。
背景技術(shù)：
在生物藥劑學(xué)領(lǐng)域，許多研究者正致力于開發(fā)有效的可植入性載體，用于藥物傳遞和其它的外科用途。這種載體必須是生物相容性的，并且還必須能夠保護打算被傳遞的任何一種生物活性作用劑的活性。許多生物活性作用劑都是不穩(wěn)定的，當(dāng)它們被摻入進傳遞材料時容易喪失活性。蛋白質(zhì)活性的保存已經(jīng)成為特別困難的問題。
在藥物傳遞研究領(lǐng)域，磷酸鈣陶瓷由于已知它們具有良好的生物相容性和對蛋白質(zhì)試劑的親和性，已被研究作為潛在的傳遞載體(見例如，Ijntema等，國際藥學(xué)雜志112215(1994)；Itoka 3u等.J.Orth.Res.10440(1992)；shinto等，骨關(guān)節(jié)外科雜志74-B600(1992)；以及Uchida等，J.Orth.Res.10440(1992))，這些材料的大多數(shù)是以預(yù)制、燒結(jié)的顆粒狀或小塊狀羥基磷灰石形式呈現(xiàn)，這種預(yù)制品存在幾個缺點，包括局限的適應(yīng)骨骼缺陷的能力，特別是在塊狀材料的情況下；顆粒狀材料不充分的結(jié)構(gòu)完整性(它們未結(jié)合在一起)；以及難以用塊狀的顆粒狀材料對缺損的骨骼組織外形做植入模型。但是，特別棘手的問題是塊狀羥基磷灰石提供的結(jié)構(gòu)支撐必須借助于機械手段被固定在適當(dāng)?shù)奈恢茫@就大大地限制了它的使用和它的整形效果。并且，要將羥基磷灰石塊料鋸磨成適合于病人特定缺損的形狀也是非常困難的。顆粒狀材料可產(chǎn)生較好的整形效果，但是，這種材料具有非常有限的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，在外科手術(shù)過程中和之后都難以保持。通常，所有這些制品都是通過高溫?zé)Y(jié)產(chǎn)生的陶瓷，并且不是單獨的結(jié)晶體，而是它們具有熔合在一起的結(jié)晶界面。大多數(shù)陶瓷類型的材料一般說來功能上是生物不可吸收的(通常具有每年不超過大約1％的吸收率)。
以珊瑚為基礎(chǔ)的多孔不可再吸收材料允許與骨交互生長，但是最終成為只有大約20％的骨，其余的80％作為疤痕組織存在。由Osteogen研制的HA RESORB是一種可吸收的羥基磷灰石形式，但它不是水泥。它呈顆粒狀，不具粘性。HA RESORB是松散地面不是粘結(jié)地被填充在適當(dāng)?shù)奈恢?。其廣泛的用途在于，它可非?？斓乇还侨〈?。在牙齒材料行業(yè)，HAPSET是磷酸鈣顆粒和可粘結(jié)性燒石膏(硫酸鈣)的一種組合物。這種材料實際上不是羥基磷灰石，并且對于大多數(shù)生物學(xué)用途，它含有非常多的硫酸鈣。這種組合物的硫酸鈣成分是可再吸收的，但磷酸鈣顆粒不可再吸收。
至少有一類磷酸鈣組合物是用于形成羥基磷灰石的前體，并且是生物相容性的，它們具有在其它磷酸鈣生物材料不可得到的二種獨特性質(zhì)(1)自我硬化，形成具有足夠強度、適合許多醫(yī)學(xué)和牙科應(yīng)用的團塊，以及(2)在被植入骨中時，此材料可緩慢地被再吸收，并可完全被形成的新骨取代，而接受移植的組織不喪失容積或完整性。參見Brown和Chow的美國專利Nos.Re.33,221和Re.33,161，其中公開了磷酸鈣再礦質(zhì)化組合物和一種基于相同磷酸鈣組合物的精細結(jié)晶非陶瓷可逐漸再吸收的羥基磷灰石材料的制備方法。
Constantg等(美國專利Nos 5,053,212和5,129,905)描述了一個實際上相同的磷酸鈣系統(tǒng)，它由磷酸四鈣(TTCP)和磷酸單鈣(MCP)或它的單水合物形式(MCPM)組成。據(jù)報導(dǎo)此系統(tǒng)包括將MCP轉(zhuǎn)化成磷酸二鈣，它再與TTCP反應(yīng)形成羥基磷灰石(HA)，作為最終產(chǎn)物，HA是牙齒和骨的主要礦物成分。
另一種類型的磷酸鈣組合物包含作為反應(yīng)物的非晶體磷灰石磷酸鈣，促進劑和水性流體，形成一種逐漸硬化的糊狀物。見例如Lee等的美國專利Nos.5,650,176；5,676,976；5,683,461；6,027,742和6,117,456。此系統(tǒng)提供了一種生物活性陶瓷材料，它是生物相容性的，可生物再吸收，并且在室溫下可長時間使用。這種生物活性陶瓷材料可在低溫下成形，它是可成形的和/或可注射的材料，并進一步反應(yīng)還可以硬化成具有高強度。這種生物活性陶瓷材料含有少量結(jié)晶磷灰石磷酸鈣固體，其鈣與磷的比例(Ca/P)與天然存在的骨礦物質(zhì)相類似，并且具有與天然骨相似的剛性和斷裂面粗糙度。此生物活性陶瓷復(fù)合材料是高度可生物再吸收的，并且它的生物可吸收性和反應(yīng)性可以被調(diào)節(jié)，以便適合特定治療和/或植入部位的要求。該材料可以被制備成可高生物再吸收和/或骨化的骨化，骨螺絲釘和其它固定物，以及包括獸醫(yī)應(yīng)用的醫(yī)用部件。
再造外科的目的之一是能夠使用病人自己的細胞或者生長促進蛋白，以新組織代替受損傷的組織。例如，研究者已竭力創(chuàng)建了一種軟骨再生系統(tǒng)，其中是在使用多聚體支架的情況下將分離出的軟骨細胞注射進入受損傷的區(qū)域(見例如Atala等，泌尿?qū)W雜志150747(1993)；Freed等，細胞生物化學(xué)雜志51257(1993)，以及其中引用的文獻)。在進行骨修理的情況下已經(jīng)研制出類似的種植支架系統(tǒng)，在此是將成骨細胞用于與多聚物或陶瓷支架連接(見例如Elgendy等，生物材料14263(1993)；Lshaug等，生物醫(yī)學(xué)材料研究雜志281445(1994)。特別有意義的是骨誘導(dǎo)物質(zhì)，例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(如重組人BMP-2)，脫礦物質(zhì)骨基質(zhì)，轉(zhuǎn)化生長因子(如TGF-β)，以及已知誘導(dǎo)骨形成的各種其它有機物質(zhì)。
已經(jīng)設(shè)計出三種通常類型的以磷酸鈣為基礎(chǔ)的支架材料，特定地與種植的組合物一起使用。第一種類型的支架材料由預(yù)先形成的磷酸鈣為基礎(chǔ)的小顆粒組成，并有生物活性物質(zhì)結(jié)合在其表面。一般來說，為了避免引發(fā)炎癥反應(yīng)要求較大的顆粒(理想地是100-1000μm)。但是，這種預(yù)先制成的大顆粒材料不容易通過小口徑針頭注射，而需要經(jīng)皮注射。此外，可以只要將活性因子與預(yù)先形成的小顆粒混合，使之包被在顆粒表面，而不是使此活性因子被包埋或者分散在整個基質(zhì)中。包埋活性因子，當(dāng)基質(zhì)被再吸收時將便于更多的生物分子受控釋放。預(yù)先形成的顆粒材料通常難以操作和應(yīng)用。而且，大多數(shù)預(yù)先形成的羥基磷灰石顆粒材料是通過燒結(jié)過程產(chǎn)生的，致使它們基本上不可再吸收。
用于種植組合物的第二種類型支架材料由可植入的多孔羥基磷灰石或磷酸三鈣小塊組成?？芍苽渚哂胁煌潭瓤紫堵实目芍踩攵嗫紫缎K狀材料，通常是使用控制了微粒尺寸的反應(yīng)物的干燥混合物。增加孔隙率的其它方法包括化學(xué)的或物理學(xué)浸蝕和過濾。雖然它們通常都能提供充分的支撐，但是多孔隙塊狀材料具有幾個顯著缺點。首先，像上面所述的預(yù)制的顆粒狀材料，塊狀支架沒有包埋在整個體積中的骨誘導(dǎo)物質(zhì)，因此會阻礙活性物質(zhì)的受控釋放。第二，可植入的塊狀材料不是可注射的，而因此需要更強烈的植入步驟。最后，重要的是，整體的塊狀材料在臨床應(yīng)用中可能阻礙骨形成的速度，而在這種情況下都希望加速愈合，先于愈合過程的正常時間。這種延遲可能是由于固體載體的緩慢再吸收，以及隨后活性物質(zhì)的延遲釋放。整塊基質(zhì)的存在也可能妨礙細胞向骨折部位遷移和浸潤。設(shè)想塊狀基質(zhì)中，在孔隙之間包含相互連接的管道，新骨生長將取決于孔隙，并受到支架壁的限制，這樣將限制新骨的形成。
第三種類型的支架材料包括磷酸鈣水泥。不同于預(yù)先制成的顆粒材料和整體的塊狀材料，水泥是易于注射的，并且可以使骨誘導(dǎo)物質(zhì)包埋在其整個體積中。但是，這種水泥傾向于形成本質(zhì)上是微孔隙的整體凝集物。雖然對使用生物可降解的孔隙形成器的大孔隙模型已有描述(見例如PCT專利公報No.WO98/16209，在此被引入作為參考)，但是，這種水泥形成含有管道的整體支架結(jié)構(gòu)，而不是微孔隙的顆粒結(jié)構(gòu)，如上所述，這種整體結(jié)構(gòu)將明顯地限制新骨生長。
因此，盡管在此領(lǐng)域付出了相當(dāng)大的努力，但仍然需要有一種可生物相容性的，易于再吸收的，并且不損害藥物活性的藥物傳遞載體。理想的是，這種載體應(yīng)該是可注射的，有展延性使其能注射或植入進不同大小的斷裂和損傷部位，并能促進生物活性物質(zhì)均勻地分布于整個基質(zhì)中，這樣有利于活性物質(zhì)的受控釋放，最后當(dāng)施加于手術(shù)或缺損部位時，應(yīng)該能形成分立開的大顆粒。為了促進細胞遷移和滲入，分泌細胞外骨基質(zhì)，并且為血管形成提供通道，理想的是形成顆粒狀，顆粒狀還可提供較大的表面面積，有利于再吸收和活性物質(zhì)的釋放，并可增加細胞與基質(zhì)的相互作用。本發(fā)明解決了這些需要，提供了幾種用于藥物傳遞和組織修補的材料和組合物。
發(fā)明概述在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于治療哺乳動物骨損傷的組合物，它包含磷酸鈣材料，有效劑量的泡騰劑，以及生物活性物質(zhì)。磷酸鈣材料可以是無定形的磷灰石磷酸鈣，羥基磷灰石，磷酸三鈣或氟磷灰石。在優(yōu)選的實施方案中，磷酸鈣材料是無定形的磷灰石磷酸鈣，例如一種稀少結(jié)晶的磷灰石磷酸鈣。這種稀少結(jié)晶的磷灰石磷酸鈣可具有類似于天然存在的骨礦物質(zhì)的鈣-磷(Ca∶P)比例，在優(yōu)選的實施方案中，此Ca∶P比例小于1∶1.50，優(yōu)選地大約是1∶1.40。骨生成蛋白可以是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)家族中的一員，包括BMP-2，BPM-4，BMP-5，BMP-6，BMP-7，BMP-10，BMP-12和BMP-13。在優(yōu)選的實施方案，其骨生成蛋白是BMP-2或BMP-6。泡騰劑可以是選自如下種類的氣體二氧化碳，空氣，氮氣，氦氣，氧氣和氬氣。在優(yōu)選的實施方案，其泡騰劑是碳酸氫鈉。該碳酸氫鈉可以以大約10％-40％(W/W)的濃度存在。這種組合物還可進一步包含如下一種或幾種補充材料例如藥劑學(xué)允許的鹽，多糖，肽，蛋白質(zhì)，氨基酸，合成的聚合物，天然聚合物和表面活性劑；固體結(jié)構(gòu)例如海綿，網(wǎng)狀物，薄膜，纖維，凝膠，細絲，微粒和納米顆粒；易受生物侵蝕的聚合物例如膠原，糖原，幾丁質(zhì)，纖維素，淀粉，角蛋白，絲，核酸，脫礦物質(zhì)骨基質(zhì)，衍生化的透明質(zhì)酸，聚酐，聚原酸酯，聚乙醇酸，聚乳酸以及它們的共聚物和衍生物；α-羥基羧酸例如聚(L-丙交酯)(PLLA)，聚(D，L-丙交酯)(PDLLA)，聚乙交酯(PGA)，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，聚(D，L-丙交酯-共-三亞甲基碳酸酯)，和聚羥基丁酸酯(PHB)，以及聚酐，它們共聚物和衍生物；SiO2、Na2O、CaO、P2O5、Al2O3和CaF2；以及多糖、肽和脂肪酸。該組合物還可進一步包含第二種活性作用劑，例如Hedgehog，F(xiàn)razzled，Chordin，Noggin，Cerberus和Follistatin蛋白。
另一方面，本發(fā)明涉及治療哺乳動物骨缺損的方法，包括對骨缺損部位施加有效劑量的骨生成組合物，其中該骨生成組合物包含骨形態(tài)發(fā)生蛋白，磷酸鈣材料和泡騰劑，在優(yōu)選的實施方案，其泡騰劑是碳酸氫鈉。
還有另一方面，本發(fā)明涉及將骨生成蛋白，磷酸鈣材料和泡騰劑用于制備傳遞骨生成蛋白的藥劑。
發(fā)明詳述本發(fā)明的目標(biāo)是適合用于骨組織修復(fù)再生和增長的骨誘導(dǎo)組合物。該組合物包含生物相容性和生物可再吸收的磷酸鈣材料，泡騰劑和生物活性作用劑。一旦硬化，這種磷酸鈣材料將為新骨生長提供可再吸收的支架。泡騰劑通過促進形成分離的大顆粒而防止磷酸鈣形成單一的整體結(jié)構(gòu)，在磷酸鈣硬化的過程中這些大顆?？煞稚㈤_。生物活性作用劑可刺激增強現(xiàn)存的或者滲入的前體細胞或其它細胞的骨生成活性。這種骨誘導(dǎo)組合物在例如osteopenc骨中具有使骨組織骨質(zhì)增長和再生的用途，以及在骨斷裂時用于組織修復(fù)和增強，用于牙齒植入，骨移植和修補等。
在此使用的各詞“磷酸鈣材料”意指一種含有磷酸鈣作為主要成分的合成的骨代用品材料。適合的以磷酸鈣為基礎(chǔ)的材料是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于無定形磷灰石磷酸鈣，羥基磷灰石，磷酸三鈣和氟磷灰石。在優(yōu)選的實施方案，其磷酸鈣材料是稀少結(jié)晶的磷灰石磷酸鈣固體，它具有類似于天然存在的骨礦物質(zhì)的鈣-磷(Ca/P)比例。通過組合作為反應(yīng)物的無定形磷灰石磷酸鈣，促進劑和水性液體，形成可逐漸變硬的糊狀物，這樣可制備這種材料。在另一實施方案中，是通過結(jié)晶磷酸鈣反應(yīng)物的固態(tài)酸-堿反應(yīng)，形成結(jié)晶的羥基磷灰石固體來制備磷酸鈣材料。
“泡騰劑”指的是一種氣體物質(zhì)，或者是一種可導(dǎo)致氣泡形成，起泡沫或釋放氣體的物質(zhì)。
在此使用的名詞“無定形的”意指具有顯著無定形特征的材料。顯著的無定形特征預(yù)示著具有大于75％無定形含量，更優(yōu)選地是大于90％無定形含量，并且以寬的無特征峰X-射線衍射圖為特征。
“生物活性的”是指在植入物和植入物周圍誘導(dǎo)硬組織形成的材料。當(dāng)在軟組織中植入時，其生物活性還可能需要有生長因子或營養(yǎng)因子存在，或者需要種植具有硬組織形成細胞類型的植入物。
在此使用的名詞“生物相容的”意指該材料對受植入者不會引發(fā)明顯的有害反應(yīng)。經(jīng)常有這樣的情況，當(dāng)外來物體被導(dǎo)入活體內(nèi)時，此物體將誘發(fā)出免疫反應(yīng)，例如對宿主有不利影響的炎癥反應(yīng)。例如，雖然一般認為羥基磷灰石是“生物相容的”，但是，當(dāng)結(jié)晶羥基磷灰石微載體被嵌入動物肌肉內(nèi)，仍然看到有明顯的炎癥和組織壞死(見例如Ijnterma等，國際藥學(xué)雜志112215(1994))。
“可生物再吸收的”指的是材料在體內(nèi)能夠被再吸收。再吸收過程包括通過體液，酶或細胞的作用消除原來植入物材料。例如，再吸收的磷酸鈣可以被再沉積作為骨礦物質(zhì)，或者在體內(nèi)被再利用，或排泄出。在此使用的名詞“高度可生物再吸收的”意指在一年內(nèi)，肌肉內(nèi)或皮下植入的材料其總重量的至少80％被再吸收了。在優(yōu)選的實施方案，該材料將在9個月內(nèi)，6個月內(nèi)，3個月內(nèi)，理想地在1個月內(nèi)被再吸收。
泡騰劑的“有效用量”是材料變硬過程中足以影響大顆粒形成的泡騰劑用量，并且將取決于所使用的磷酸鈣材料。一般來說，泡騰劑的用量是按重量的大約1％-90％加入，優(yōu)選地是按重量的大約1％-50％，更優(yōu)選地是按重量的大約10％-40％。
如在此使用的“大顆?！币庵钢睆皆诖蠹s100微米-1毫米的顆?；蛭⒘！１景l(fā)明的磷酸鈣組合物變硬時形成的大顆粒材料是生物相容性的(也就是說，這種大顆粒具有避免引起炎癥反應(yīng)的足夠大小)，并且如下面所述，是大孔隙的。
在此使用的“大孔隙的”指的是已變硬的磷酸鈣材料具有允許細胞遷移和滲入的足夠直徑的孔隙。在優(yōu)選的實施方案，按照本發(fā)明形成的大孔隙材料具有大于30微米的孔隙直徑，更優(yōu)選地直徑在大約30-200微米，而最優(yōu)選地直徑在大約50-100微米。本發(fā)明的大孔隙材料有助于細胞遷移和滲入其中，分泌細胞外骨基質(zhì)，并促進細胞-基質(zhì)間的相互作用。
生物活性作用劑的“有效劑量”，是足以刺激增強現(xiàn)存或者滲入的前體細胞或其它細胞的骨生成活性的生物活性作用劑用量，該劑量將取決于被治療缺損的大小和性質(zhì)，以及所使用磷酸鈣材料的組成。一般地，被遞送的生物活性作用劑的劑量在大約0.1-100mg的范圍內(nèi)，優(yōu)選地是大約1-100mg，最優(yōu)選地是大約10-80mg。
補充材料的“有效用量”是足以使復(fù)合材料產(chǎn)生所要求機械或化學(xué)特性的補充材料用量。
“硬化”是指使可延展的磷酸鈣組合物轉(zhuǎn)化成為堅硬磷酸鈣材料的過程。當(dāng)磷酸鈣材料變?yōu)榛旧喜豢勺冃蔚墓腆w時，則被認為是“硬化了”。這種硬化的磷酸鈣材料具有最小的可壓縮性，并且有助于承受與彈性變形相反的塑性變形。
在此使用的名詞“稀少結(jié)晶的磷灰石磷酸鈣”，“PCA磷酸鈣”和“PCA材料”，都是指一種合成的稀少結(jié)晶的磷灰石磷酸鈣。這種稀少結(jié)晶的磷灰石(PCA)材料不一定局限于單一的磷酸鈣物相，只要它具有特征性X-射線衍射(XRD)圖形和FTIR圖形。PCA磷酸鈣基本上具有與骨相同的XRD頻譜。通常其頻譜特征是在20°-35°的范圍內(nèi)有唯一的二個寬峰，并在26°伴有一個中心峰，在32°伴有另一個中心峰，并且在563cm-1，1034cm-1，1638cm-1和3432cm-1(±2cm-1)有FTIR峰。在603cm-1和875cm-1可見尖銳的肩峰，并在1422cm-1和1457cm-1伴有具最大值的雙峰。
在此使用的“水合前體物”是指干燥的PCA前體物在有限量水溶液(即每克前體物粉末加少于大約1ml水溶液)存在下，通過水合作用形成的糊狀物或油灰狀物。這種水合前體物在不同的組合中，取決于其轉(zhuǎn)化進展的程度，可能既含有反應(yīng)物又含有產(chǎn)物。在此所述的可注射的和可成形的PCA前體糊狀物都是水合前體物。優(yōu)選的“可注射性”水合前體物具有適合于通過18號皮下注射針頭傳送的粘稠度。
在此使用的名詞“促進劑”，是指促進水合前體物硬化，并可增進無定形磷酸鈣(ACP)向PCA磷酸鈣轉(zhuǎn)化的作用劑或處理劑。某些促進劑參與轉(zhuǎn)化并被摻入PCA材料中，另一些被稱為“被動”促進劑的促進劑不包含在轉(zhuǎn)化過程中。
“活性的”在此用于指當(dāng)與液體混合形成水合前體物時，在有與此前體物材料硬化有關(guān)的促進劑存在下，磷酸鈣進行向PCA材料轉(zhuǎn)化的能力。優(yōu)選的ACPs具有如下特征能夠完全轉(zhuǎn)化，能夠快速轉(zhuǎn)化并同時硬化，能夠同其它惰性化合物一起進行轉(zhuǎn)化，以及/或者能夠轉(zhuǎn)化成基本均一的PCA材料。在使ACP與第二種磷酸鈣反應(yīng)的情況下，其“轉(zhuǎn)化”可以包含ACP和第二種磷酸鈣的轉(zhuǎn)化。硬化程度和硬化過程的動力學(xué)也是活性的重要因素。某些ACPs比另一些ACPs更具活性。如果存在弱促進劑如磷酸二鈣二水合物(DCPD)時，ACP能進行轉(zhuǎn)化和硬化成PCA材料，則認為它是“高度活性的”。優(yōu)選的高度活性ACP，在37℃，存在弱促進劑DCPD和水的情況下，在小于12小時內(nèi)可產(chǎn)生硬化的PCA材料，在大約1-5小時內(nèi)，理想的在10-30分鐘內(nèi)硬化就基本上完成了。
磷酸鈣材料本發(fā)明的磷酸鈣成分可以是本領(lǐng)域已知的任何一種生物相容的磷酸鈣材料。借助于多種方法中的任何一種，使用任何適合的起始成分，都可以產(chǎn)生這種磷酸鈣材料。例如，通過組合作為反應(yīng)物的無定形磷灰石磷酸鈣，促進劑，以及水性液體以形成硬化的糊狀物，可產(chǎn)生這種磷酸鈣材料。按另一種方式，還可通過結(jié)晶磷酸鈣反應(yīng)物的固態(tài)酸-堿反應(yīng)形成結(jié)晶羥基磷灰石固體來產(chǎn)生此磷酸鈣材料，以形成結(jié)晶的羥基磷灰石固體。本領(lǐng)域還已知制造磷酸鈣基質(zhì)材料的其它一些方法。
稀少結(jié)晶的磷灰石(PCA)磷酸鈣在一個實施方案，其磷酸鈣材料是稀少結(jié)晶的磷灰石(PCA)磷酸鈣，在專利申請U.S.S.N.08/6501704和美國專利No.5,650,176中描述了PCA材料，在此均都整體引入作為參考。此材料還被如下名稱的一組專利申請描述“傳遞載體”，“使無定形磷酸鈣轉(zhuǎn)化形成新穎的生物陶瓷”，“整形外科和牙齒的陶瓷植入物”，以及“生物活性陶瓷組合物”，它們都是在1997年10月16日提出申請，并被變讓與ETEX公司(Cambridge，MA)，在此被引入作為參考。鑒于這些相關(guān)申請中每個都有大量公開內(nèi)容，對于PCA材料的詳細內(nèi)容在此將不作過多說明，將滿足于概述它的特征。
該PCA材料的特征表現(xiàn)為它的生物可再吸收性和它的最少結(jié)晶性。它的結(jié)晶特性基本上與天然骨相同。PCA材料還是生物相容性的，對受植入者無害。
可以糊狀物或油灰狀物的形式(即作為水合的前體物)將這種PCA材料植入病人體內(nèi)。因為本發(fā)明可以在體外開始制備均勻的大孔隙磷酸鈣材料，并可在室溫下緩慢地進行，所以，該材料要在用于手術(shù)部位之前“成形”而使不能使用的可能性最小。在生理條件下(即體溫和體內(nèi)壓力下)反應(yīng)明顯加速，使材料在適當(dāng)位置硬化。在手術(shù)安裝時這種性質(zhì)特別有用，此時一般要求將定做部件安裝在植入位置。例如，含有泡騰劑和生物活性作用劑的PCA糊狀物可被使用，并用于填充骨折部位。
按另一種方式，該PCA材料可在體外預(yù)先硬化，裝入所需要的生物活性作用劑和泡騰劑，晚些時候再被植入。這種方法在不必要定做外形的情況下，以及在要求制備大量植入物的情況下是有用的。
一般情況下，本發(fā)明的成形反應(yīng)是在應(yīng)用于手術(shù)部位之后完成。在生理條件下，該材料一般在少于5小時之內(nèi)硬化，在大約1-5小時內(nèi)基本硬化。優(yōu)選地該材料在大約10-30分鐘內(nèi)基本硬化。該PCA材料的粘度和可成形性，以及其成形反應(yīng)的速度，都可根據(jù)治療的需要，通過修改幾個簡單的參數(shù)而改變(見例如Lee等的美國專利No.6,027,742，在此被整體引入作為參考)。
通過對干燥的前體物成分混合物加入蒸餾水，形成糊狀物或油灰狀物形式的濃稠的水合前體物，可啟動產(chǎn)生該PCA材料的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。其它的水性試劑如緩沖液，生理鹽水，血清或組織培養(yǎng)基，可用于代替蒸餾水。在另一些實施方案中，對前體物粉末加入了足夠的水以便形成糊狀物，一旦加入本發(fā)明的其它成分，這種糊狀物容易以18號針頭注射。最經(jīng)常的情況是，所形成的可生物再吸收的磷酸鈣材料將是“鈣缺乏的”，與對于羥基磷灰石大約1.67的理想化學(xué)計量值相比較，它具有小于1.5的鈣-磷比例。
通過組合此PCA前體物，以有限量的水水合(以便形成糊狀物或油灰狀物)，并使它硬化成為PAC材料，可以確定合適的PAC材料。理想的前體物在濕潤的環(huán)境，在體溫下或者在體溫附近在少于5小時之內(nèi)能夠硬化，而優(yōu)選地在10-30分鐘之內(nèi)能夠硬化。然后可將以這種方式硬化的構(gòu)件置于試驗動物的肌肉內(nèi)或皮下，并檢測生物再吸收性。理想的材料是當(dāng)植入一個1-5克的小球，在一年內(nèi)至少80％被再吸收了。優(yōu)選地是該材料可以被完全再吸收。一般地說，要測定皮下部位材料再吸收的克數(shù)比較容易。
在使用至少一種無定形磷酸鈣(ACP)前體物的反應(yīng)中可形成這種PCA材料，優(yōu)選地是使用活化的或者活性的ACP(見例如PCT專利申請NO WO98/16209，實施例1-4)。在某些情況下，該反應(yīng)可只使用一種前體物ACP，此ACP以受控的方式部分地或全部轉(zhuǎn)化成PCA材料。還可使用非參與性促進劑以促進活化的ACP轉(zhuǎn)化成PCA材料。無論如何，可以在體外開始、可以以糊狀物形態(tài)進行、并在37℃顯著加速、導(dǎo)致形成硬化磷酸鈣產(chǎn)物的反應(yīng)都是非常優(yōu)選的。
在水存在時ACP變成PCA材料的轉(zhuǎn)化被促進。ACP一般提供為粉末，并與任何其它的反應(yīng)物(例如第二種磷酸鈣)組合在一起，使它與有限量水相接觸，導(dǎo)致形成糊狀物或油灰狀物。然后，該水合的前體物硬化，并且此硬化過程與PCA材料的形成相關(guān)。ACP變成PCA磷酸鈣的轉(zhuǎn)化是作為必定會硬化的糊狀物或油灰狀物以受控的方式進行，在牙科，整形外科或其它治療應(yīng)用中具有實用價值。
當(dāng)無定形磷酸鈣被用作產(chǎn)生可再吸收PCA材料的唯一前體物時，重要的是控制ACP轉(zhuǎn)化成高度結(jié)晶羥基磷灰石的自然趨勢。另一方面，轉(zhuǎn)化的時間進程應(yīng)該足夠快速而具有外科實用價值，一種方法是使含有結(jié)晶形成抑制劑的前體物ACP(見例如WO98/16209，實施例1)與不含結(jié)晶形成抑制劑的ACP(如促進劑)組合?？稍诟稍餇顟B(tài)使這些反應(yīng)物與適當(dāng)粒度的，并含有過量抑制劑的ACP相混合。然后通過加入水可使反應(yīng)物水合，隨后提高溫度(例如，像發(fā)生在導(dǎo)入體內(nèi)之后)，使反應(yīng)物轉(zhuǎn)化成PCA材料。受控轉(zhuǎn)化的其它方法包括使用催化劑。
結(jié)晶羥基磷灰石在第二個實施方案，其磷酸鈣材料是結(jié)晶羥基磷灰石(HA)。在例如Brown和Chow的美國專利Nos.Re.33,221和Re.33,161中描述了結(jié)晶HA，在此二者均被引入作為參考。Brown和Chow的專利公開了制備磷酸鈣再礦質(zhì)化組合物的方法，以及制備基于相同磷酸鈣結(jié)合物的，精細結(jié)晶的非陶瓷，可逐漸再吸收的羥基磷灰石載體材料的方法。Constanty等在美國專利No.5,053,212和5,129,905(二者均被引入作為參考)中描述了一個相類似磷酸鈣系統(tǒng)，它由磷酸四鈣(TTCP)和磷酸單鈣(MCP)或它的單水合物形式(MCPM)組成。在此實施方案，是通過結(jié)晶磷酸鈣反應(yīng)物的固態(tài)酸-堿反應(yīng)形成結(jié)晶羥磷炭石固體來產(chǎn)生磷酸鈣材料。
結(jié)晶HA材料(通常被稱為碳酸磷灰石)可被制備以致使它們是可流動的，可塑的，并且能夠在原位硬化(見Constants的美國專利No.5,962,028)。通過組合濕的和干燥的反應(yīng)形成基本均勻的混合物，使此混合物適當(dāng)?shù)爻尚?，并使此混合物硬化，可以制成這種HA材料(通常被稱為碳酸氣飽和的羥基磷灰石)。按另一種方式，還可以將前體反應(yīng)混合物施用于手術(shù)部位，并使其在原位硬化和/或成形。硬化過程中，該混合物結(jié)晶成為固體，并且基本上是整體的磷灰石結(jié)構(gòu)。
這種反應(yīng)物一般將由如下成分組成基本上沒有非結(jié)合水的磷酸源，堿土金屬，特別是鈣源，任選的結(jié)晶核，特別是羥基磷灰石或磷酸鈣結(jié)晶，碳酸鈣，以及生理學(xué)允許的潤滑劑，例如可能含有多種溶質(zhì)的水。可將其干成分預(yù)先制成混合物，隨后在基本上呈現(xiàn)均勻混合的條件下與液體成分組合。
磷酸來源可以是任何一種部分地被中和的磷酸，特別是像在單堿磷酸鈣，相當(dāng)于和包括第一質(zhì)子完全中和。另外或補充地說，它可以由基本上沒有結(jié)合水的，可能以結(jié)晶形式的正磷酸組成。鈣來源通常將包括帶相反電荷的離子，如碳酸鹽或磷酸鹽等，特別是磷酸鈣和磷酸鹽如磷酸四鈣或磷酸三鈣的二重來源。
可在加入濕成分之前將各種干成分組合。通過攪拌可組合這些成分，并且攪拌可用于調(diào)節(jié)各成分之間反應(yīng)的程度。在開始攪拌之前或者在完成機械攪拌之前，可加入任何一種或全部干成分，在攪拌之后，當(dāng)仍然是靜止?fàn)顟B(tài)時使此混合物退火，隨后是一段持續(xù)靜置時間，在此過程中混合物發(fā)生硬化。
泡騰劑本發(fā)明提供了一種新穎的方法，用于產(chǎn)生在生理條件下(即施用之后)可“自我形成顆?！辈⒎稚⒊蔀橛不拇箢w?；虼笪⒘５牧姿徕}基質(zhì)或支架材料。這種磷酸鈣材料可以是本領(lǐng)域熟知的任何生物相容性的磷酸鈣材料，例如上述的PCA磷酸鈣材料和結(jié)晶羥基磷灰石材料。令人吃驚的是，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)，對這些磷酸鈣材料加入泡騰劑可基本改變這種材料的生物學(xué)、化學(xué)和機械學(xué)性質(zhì)，從而顯著地提高它的治療實用價值。本發(fā)明的泡騰劑可以是在生理溫度和/或壓力下產(chǎn)生氣泡或釋放氣體的任何藥劑學(xué)允許的物質(zhì)。
目前用于產(chǎn)生磷酸鈣材料為以種植組合物用途的可利用的所有方法，都存在某些固有的缺點，包括為了以注射器施用，由于在生產(chǎn)或制備過程顆粒形成而導(dǎo)致的有限可注射性。為了避免引起炎癥反應(yīng)，供生物活性物質(zhì)附著的預(yù)先制成的磷酸鈣顆粒必須是大顆粒(理想的是100-1000μm)。但是，這種預(yù)先制成的大顆粒不容易為滿足經(jīng)皮注射的要求通過小號針頭注射。并且，這些顆粒通常難以操作和使用，并且許多都是通過燒結(jié)過程產(chǎn)生的，這就使它們基本上不可再吸收。此外，活性作用劑只可以與預(yù)先形成的顆?；旌隙鴮?dǎo)致表面包涂，而不是被均衡地包埋或分散在整個材料中。分散便于當(dāng)基質(zhì)被再吸收時生物分子更多地受控釋放。
本發(fā)明的一個重要方面是，在手術(shù)安裝時容易使用本發(fā)明的生物陶瓷材料，這是超越本領(lǐng)域已知的其它骨代用品復(fù)合材料的顯著改進。具體地說，將泡騰劑加到該組合物的其它成分(例如磷酸鈣材料和任何補充材料)中，引起在特定條件(即生理溫度和/或壓力)下氣體發(fā)生泡沫或起泡。起泡或發(fā)泡引起當(dāng)體內(nèi)注射或植入時磷酸鈣材料形成顆粒并分散開。當(dāng)硬化和/或粘結(jié)反應(yīng)進行時，同時出現(xiàn)顆粒形成，并且使活性作用劑(可將它與其它成分混合，或者在臨施用之前加到混合物中)均勻地分散在每個顆粒的整個體積中。
加入適量的泡騰劑以防止形成整體的磷酸鈣團塊。泡騰劑迅速和完全地與廣泛多種磷酸鈣和其它具有鈣或磷的材料反應(yīng)，提供均勻的可注射性傳遞載體。取決于特定的磷酸鈣材料，選擇泡騰劑以便足以干擾其硬化或粘結(jié)過程，使之形成比較均勻的顆粒，但是并不達到致使磷酸鈣水泥“無活性”的程度。只有在體內(nèi)注射或植入之后加入泡騰劑才引起發(fā)生真正的顆粒形成。因此，在注射或植入之前的磷酸鈣材料的制備和/或這種水泥的配制過程中，不發(fā)生顆粒形成。泡騰劑存在時形成的顆粒是足夠地大顆粒，可防止發(fā)炎反應(yīng)(一般大于30μm)，又是足夠地小顆粒，可提供優(yōu)勢的表面面積與體積比例。大的表面面積與體積的比例，使之當(dāng)新骨再生時能夠迅速再吸收磷酸鈣材料。大的表面面積還有助于生物活性作用劑的釋放，另一方面又可在手術(shù)部位仍然保留此作用劑持續(xù)骨誘導(dǎo)所需要的適當(dāng)長的時間。此外，大的表面面積與體積的比例還有助于細胞遷移和滲入材料基質(zhì)中分泌細胞外骨基質(zhì)，并且提供形成道路。使用本發(fā)明的方法和組合物在體內(nèi)形成的顆粒在1-2000μm的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在30-1000μm的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地在30-500μm的范圍內(nèi)，而最優(yōu)選地在50-100μm的范圍內(nèi)。
在一個實施方案中，其泡騰劑是一種溶解在水合磷酸鈣材料中的氣體?？稍趬毫ο率乖摎怏w溶解于材料中，也就是說，通過使此復(fù)合材料經(jīng)受這種氣體加壓，但是，它對粘結(jié)反應(yīng)是惰性的。然后當(dāng)置于生理溫度下(即當(dāng)注射或植入時)，由于隨著溫度增加氣體溶度降低，該氣體被釋放出來。在這些狀況下，只是在體內(nèi)硬化過程中發(fā)生氣體消散和隨后的顆粒形成，并不會發(fā)生在施用之前。這點是特別引人注目的，因為不希望在室溫下在注射器內(nèi)發(fā)生顆粒形成。僅作為例子的適合氣體包括二氧二碳，空氣，氮氣，氦氣，氧氣和氬氣。
在另一實施方案中，其泡騰劑是一種揮發(fā)性液體，在生理溫度下它會蒸發(fā)。
在還有另一實施方案中，其泡騰劑是一種固體材料，溶解時它會放出氣體。例如，碳酸氫鈉當(dāng)它轉(zhuǎn)化為不穩(wěn)定的碳酸中間產(chǎn)物時會放出二氧化碳氣體，中間產(chǎn)物隨之變?yōu)槎趸己退?br> 生物活性作用劑任何促進或刺激新骨生長的有效的生物作用劑都可通過本發(fā)明的磷酸鈣材料傳送。特別有意義的是骨誘導(dǎo)物質(zhì)例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(例如重組的人BMP-2)，脫礦質(zhì)化的骨基質(zhì)，轉(zhuǎn)化生長因子(例如TGF-β)，以及已知誘導(dǎo)骨形成的其它有機物種類。另一方面或者此外，為了盡量充分地骨化，傳遞載體可隨同骨形成細胞一起被種植。
骨誘導(dǎo)蛋白生物活性作用劑優(yōu)選地選自被稱為轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)蛋白質(zhì)超家族的蛋白質(zhì)家族，它包括激活素(activin)，抑制素(mhibin)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)。最優(yōu)選的是，該活性作用劑包括選自一般被稱為BMP的蛋白質(zhì)亞類的至少一種蛋白質(zhì)，已發(fā)現(xiàn)這種蛋白質(zhì)具有骨生成活性以及其它的生長和分化活性。這些BMPs包括例如在美國專利No.5,108,922；5,013,649；5,116,738；5,106,748；5,187,076；和5,141,905中公開的BMP蛋白BMP-2,BMP-3，BMP-4，BMP-5，BMP-6和BMP-7，在PCT專利公報WO91/18098中公開的BMP-8，在PCT專利公報WO93/00432中公開的BMP-9，在PCT專利申請WO94/26893中公開的BMP-10，在PCT專利申請WO94/26892中公開的BMP-11，或者在PCT專利申請WO95/16035中公開的BMP-12或BMP-13，在美國專利5,635,372中公開的BMP-15，或者在美國專利5,965,403中公開的BMP-16。作為活性作用劑在本發(fā)明有用的其它TGF-β蛋白包括Vgr-2，(Jones等，分子內(nèi)分泌學(xué)61961-1968(1992))，以及任何生長和分化因子(GDFs)，包括在如下PCT專利申請中描述的WO94/15965，WO94/15949，WO95/01801，WO95/01802，WO94/21681，WO94/15966，WO95/10539，WO96/01845，WO96/02559等等。在WO94/01557中公開的BIP，在JP專利公報號7-250688中公開的HP00269，以及在PCT專利申請WO93/16099中公開的MP52也可用于本發(fā)明。所有上述專利申請中的公開內(nèi)容在此被引入作為參考。目前優(yōu)選地用于本發(fā)明的BMP亞群包括BMP-2，BMP-4，BMP-5，BMP-6，BMP-7，BMP-10，BMP-12和BMP-13。最優(yōu)選的活性作用劑是BMP-2，在美國專利5,013,649中公開了它的序列，它的公開內(nèi)容在此被引入作為參考。也可以使用本領(lǐng)域已知的其它一些BMPs和TGF-β。
這種活性作用劑可以重新組合產(chǎn)生，或者從蛋白質(zhì)組合物中純化得到。該活性作用劑如果是TGF-β如BMP，或者其它的二聚體蛋白質(zhì)，則可以是同型二聚體，或者可以是帶有其它BMP的異型二聚體(如各由一個單體BMP-2和BMP-6組成的異型二聚體)，或者是帶有TGF-β超家族其它成員如激活素，抑制素和TGF-β1的異型二聚體(如各由一個單體BMP和TGF-β超家族相關(guān)成員組成的異型二聚體)。例如，在已公布的PCT專利申請WO93/09229中描述了這種異型二聚體蛋白的例子，其說明書在此被引入作為參考。
這種活性作用劑可以進一步包含一些補充成分如Hedgehog，F(xiàn)razzled，Chordin，Noggin，Cerberus和Follistatin蛋白。在如下文獻中概述了這些蛋白質(zhì)家族Sasai等，細胞79779-790(1994)(Chordin)，PCT專利公報WO94/05800(Noggin)，以及Fukui等發(fā)生生物學(xué)159131-139(1993)(Follistatin)。在WO96/16668，WO96/17924和WO95/18856中描述了Hedgehog蛋白。Frazzled蛋白家族是最近發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)家族，它與被稱為Frizzled的受體蛋白家族的細胞外結(jié)合功能區(qū)具有高度同源性。Wang等細胞化學(xué)雜志2714468-4476(1996)中描述了這種Frizzled的基因家族和蛋白質(zhì)家族。該活性作用劑還可以包括其它一些可溶性受體如在PCT專利公報WO95/0798中公開的被截剪的可溶性受體。根據(jù)WO95/07982的論述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將可意識到，對于其它許多受體蛋白都可以制備這種被截剪的可溶性受體。這些也應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。上述文獻在此均被引入作為參考。
在此活性作用劑的有效用量，是可有效到刺激增加現(xiàn)有的或滲入的前體細胞或其它細胞骨形成活性的用量，并且將取決于待治療缺損的大小和性質(zhì)，以及所使用的載體。一般地，將被逆送的蛋白質(zhì)用量在大約0.1-100mg的范圍內(nèi)，優(yōu)選地是大約1-100mg，最優(yōu)選地是大約10-80mg。
骨形成細胞在一個實施方案，為了最充分地骨化，可將磷酸鈣組合物隨同骨形成細胞如前體細胞，干細胞和/或成骨細胞一起種植。通過將磷酸鈣組合物置于與該病人自身來源的骨形成細胞接觸就最容易地達到此目的?？梢栽诠窍嚓P(guān)聯(lián)的組織、血液或流體中找到這些細胞，這種液體包括已經(jīng)同骨或骨物質(zhì)或者部位接觸的外源性液體，而骨物質(zhì)或骨部位包括骨膜的松質(zhì)骨或骨髓。當(dāng)連同一些部件如螺絲和釘子一起使用時，這些部件導(dǎo)入骨中將伴隨有骨膜破裂和/或出血，則不需要作進一步的接種。對于板狀材料，它僅對抗皮質(zhì)骨，誘發(fā)將咬合這些部件的骨膜損傷是可取的。在還有其它一些實施方案中，有實用價值的是，通過在植入部位除去部分皮質(zhì)骨，在骨內(nèi)手術(shù)準備一個安裝位置。可將從該病人收集的骨形成細胞導(dǎo)入植入物中以便增加骨化作用。如果在受植入者排斥骨形成細胞之前出現(xiàn)了所要求數(shù)量的骨質(zhì)再生，使用非自體移位骨細胞也屬于本發(fā)明的范圍。因此，在某些實施方案中，從初始來源，細胞系或細胞庫得到的細胞和組織都可能是有用的。見Lee等的美國專利No.6,132,463，在此將它引入作為參考。
補充材料通過將磷酸鈣材料，泡騰劑和生物活性作用劑與選用的補充材料組合在一起，可制備本發(fā)明的復(fù)合材料。磷酸鈣可用作加強材料或基質(zhì)，或者作為二者。該磷酸鈣材料在其初始的水合形成一般保持在大約PH6-7，因此與廣泛的添加物是相容性的，沒有有害作用。補充材料的選用是根據(jù)它與磷酸鈣和其它成分的可相容性，以及它賦與此組合物一些特性(生物的，化學(xué)的或機械的特性)的能力，這些特性是特定的治療目的所希望的。例如，可選擇補充材料以便改善此磷酸鈣材料的張力和硬度，增加其抗斷裂韌性，提供成形能力，以及/或者改變其流動性和凝固時間。
可以不同的用量和不同的物理形態(tài)將補充材料加到磷酸鈣組合物中，取決于所預(yù)期的治療用途。例如，這種補充材料可以是固體結(jié)構(gòu)形式，例如海綿、網(wǎng)狀物、薄膜、纖維、凝膠、細絲或顆粒狀，包括微粒和納米顆粒。補充材料本身可以是一種組合物，補充材料可以是與可再吸收磷酸鈣密切混合的顆粒狀或液體添加物或攙入劑。當(dāng)與PCA磷酸鈣材料密切混合時，該補充材料可在肉眼可見的水平干擾其粘結(jié)反應(yīng)。這種情況隨著補充材料包涂了一定百分數(shù)的水泥微粒，致使被包涂的微粒發(fā)生弱粘結(jié)反應(yīng)而出現(xiàn)。另一種情況是，這種液體或固體可引起活性成分之間發(fā)生物理學(xué)分離，導(dǎo)致水泥成形(或顆粒)的病灶區(qū)。這種補充材料對磷酸鈣可起基質(zhì)的作用，磷酸鈣被包埋或散布在此基質(zhì)內(nèi)。按另一種方式磷酸鈣可對補充材料起基質(zhì)的作用，補充材料被散布在其中。補充材料還可被用作磷酸鈣體表的涂料，例如作為裝配后涂料，以便延遲再吸收時間，或者影響此生物陶瓷材料的性質(zhì)。最后，還可用磷酸鈣組合物包涂補充材料。
補充材料理想地是生物相容性的，也就是說，當(dāng)被導(dǎo)入受植入者時該材料不會引起有害的反應(yīng)，在許多情況下，還希望此補充材料是可生物再吸收的。補充材料對鈣，磷酸鹽或磷酸鈣可以具有親和力，這將增加磷酸鈣/補充材料界面的強度。此親和力可以是特異性的，或者是通過非特異性離子相互作用中介的。僅作為例子，適合于在此組合物中用作基質(zhì)的易受生物侵蝕的聚合物包括但不局限于膠原、糖原、幾丁質(zhì)、纖維素、淀粉、角蛋白、絲、核酸、脫礦質(zhì)骨基質(zhì)、衍生化的透明質(zhì)酸、聚酐、聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、以及它們的共聚物。特別是已知如下聚合物是易受生物侵蝕的并適合用于本發(fā)明αZ-羥基羧酸的聚酯如聚(L-丙交酯)(PLLA)，聚(D，L-丙交酯)(PDLLA)，聚乙交酯(PGA)，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，聚(D，L-丙交酯-共-三亞甲基碳酸酯)，和聚羥基丁酸酯(PHB)，以及聚酐如聚(酐-共-酰亞胺)，以及它們的共聚物。此外，生物活性玻璃組合物如包含SiO2、Na2O，CaO、P2O5、Al2O3和/或CaF2的組合物都可用于同本發(fā)明的磷酸鈣組合物組合。有用的其它易受生物侵蝕的聚合物可包括多糖，肽和脂肪酸。
易受生物侵蝕的聚合物有益地被用于制備可生物再吸收的硬部件，例如但不限于用于骨植入部位的骨質(zhì)之間的釘子、銷桿、螺絲、板材和錨狀物?？缮镌傥盏睦w維可以須狀物形式存在，它按照本領(lǐng)域已知的組合物設(shè)計和制造原理與磷酸鈣相互作用。通過壓制磷酸鈣和聚合物的粉末狀微?；旌衔锟墒惯@種硬部件成形。另外，用PLLA纖維可以使磷酸鈣基質(zhì)加強，用于制備可生物降解的自我加強的組合物，使用的PLLA纖維與Tormala等，臨床醫(yī)學(xué)材料1029-34(1992)描述的纖維相似，此文獻在此被引入作為參考。
可生物再吸收的聚合物還可被用于制備骨膠質(zhì)或油灰用在承重部位。可將補充材料加到組合物中以便增加骨膠質(zhì)的可壓縮性和承重性能。特別是可將碳纖維或其它增強纖維加到組合物中。在產(chǎn)生纖維增強的骨代用膠質(zhì)的過程中，有益的是等離子刻蝕這種纖維以便改善磷酸鈣/纖維界面的品質(zhì)和強度。還可以使磷酸鈣在37℃硬化，被制成粉末或者制成碎片，并且同如下已知的材料混合粘合劑如骨膠質(zhì)水泥，填充物，灰泥，環(huán)氧樹脂和其它的磷酸鈣；或者凝膠例如但不限于硫酸鈣，海藻膠質(zhì)，膠原或可購買到的產(chǎn)品如Endooone(Merck)，Hapset(Lifecore Biomedicd)，SRS(Norian)，Bonesource(Leibinger)，Collografe(Zimmer)，Osteograft(CereMed)以及Simplex(Howmedica)。為了應(yīng)用，在硬化的磷酸鈣將被分散在粘合劑物質(zhì)中的情況下，最通常地是借助于本領(lǐng)域已知的方法制備此粘合劑，并使它以大致相等的體積同磷酸鈣微粒混合，盡管實際的比例將以本領(lǐng)域已知的方式改變，以便產(chǎn)生所要求粘稠度，可塑性和粘性的組合物。
在還有另一實施方案中，可用本發(fā)明的磷酸鈣組合物包涂一般由聚酯制成的編織的縫合材料，以便改善它們的生物相容性?？赏ㄟ^將縫合材料浸入包含磷酸鈣材料的水泥漿中來制備包涂的縫合材料，通過對縫合材料和磷酸鈣微粒二者之一，或者對二者作表面處理，可改善縫合材料對磷酸鈣涂料的親和性。表面處理包括等離子刻蝕和/或化學(xué)結(jié)合。
在其它一些實施方案中，提供了一種包含磷酸鈣材料和不可再吸收或微少再吸收材料的組合物。適合的不易侵蝕性或少量侵蝕性材料包括右旋糖酐，聚乙烯，聚甲基異丁烯酸酯(PMMA)，碳纖維，聚乙烯醇(PVA)，聚(乙烯對苯二酸酯)，聚酰胺，生物玻璃，以及前面列舉的用于骨膠質(zhì)或油灰的化合物。
另一種用途是將一些有用的物體如栓釘或增強網(wǎng)長期埋入骨本身。這種物對于穩(wěn)固地附著于天然骨起錨的作用。這在使韌帶和腱附著于骨特別有用?？蓪缮镌傥蘸凸腔牧姿徕}的物體，以及適合的不可再吸收性硬部件置入骨中，并且在骨膠質(zhì)配制中進一步用添加的磷酸鈣材料或復(fù)合材料加以保護。因此，在磷酸鈣材料再骨化之后，這種硬部件成為被埋置于骨中。
在本發(fā)明的還有另一實施方案中，通過將磷酸鈣或復(fù)合材料與可改變復(fù)合材料的再吸收特性、凝固時間和/或流動性的添加物混合，制備了一種組合物。例如，可將硅酮油或其它潤滑聚合物或者液體加入到組合物中，以便為了通過注射器對受植入者投遞，改善組合物的流動性。優(yōu)選地，該潤滑劑是生物相容性的，并且在磷酸鈣組合物在體內(nèi)凝固之后能夠迅速從骨代用品材料組合物中瀝濾出。適合的潤滑劑，僅作為例子，包括聚合物蠟、脂類和脂肪酸?？梢园创蠹s0.1％-30％的重量濃度使用潤滑劑。
下面的實施例即將對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案作詳細說明。可以預(yù)料到，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)這些描述，在其實踐中將出現(xiàn)許多修改和變化。相信這些修改和變化將包括在所附的權(quán)利要求中。這些實施例無論如何都構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
此申請說明書全篇引用的所有參考文獻、專利和公布的專利申請的全部內(nèi)容，在此都被引入作為參考。
實施例這些實施例中使用的所有成分都是藥品純度等級。磷酸鈣成分是作為商品得到的骨代用品材料，由Etex公司(38 Sydney Street.Cambridge.MA 02139)以商品名CEREDEX出售的。所用的生物活性作用劑是重組的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)。在美國專利No.5,013,649 4詳述了BMP-2的制備方法和特性。
實施例1磷酸鈣組合物的制備如在美國專利No.5,650,176中所述的制備稀少結(jié)晶的無定形磷酸鈣磷灰石糊狀物，不同的是對無定形磷酸鈣(ACP)粉末前體物加入了按重量20％碳酸氫鈉。然后用有限量水將此ACP水合形成糊狀物，在室溫下20-30分鐘之內(nèi)此糊狀物仍然是可操作的。
實施例2體外植入分析如實施例1中所述制備磷酸鈣組合物。然后將水合的糊狀物注射進入體溫下的生理鹽水浴中。在模仿的體內(nèi)條件下(即37℃)，此磷酸鈣材料硬化成為大顆粒。
實施例3肌肉內(nèi)注射如實施例1中所述制備含有按重量20％碳酸氫鈉的第一種磷酸鈣組合物。如在美國專利No.5,650,176中所述制備第二種磷酸鈣糊狀物，不同的是對無定形磷酸鈣(ACP)粉末前體物加入了按重量29％聚乙二醇，然后用有限量水將此二種ACP組合物水合形成二種糊狀物，在外植入注射幾小時之后它們二者都形成大約100-1000微米的大顆粒。此外(資料未顯示)，注射20μgrhBMP-2之后顆粒形成發(fā)生，在整體凝固磷酸鈣水泥中，或者在自-形成顆粒的磷酸鈣組合物中傳遞此生物活性作用劑。使用在大顆粒(磷酸鈣)組合物中傳遞的rhBMP-2在21天誘導(dǎo)的骨形成量顯著多于對照材料(整體水泥)，資料未被顯示。并且，使用大顆粒磷酸鈣材料傳遞的rhBMP-2局部保留顯著地少于對照材料(即大約30％對75％，資料未被顯示)，本發(fā)明的大顆粒組合物可使骨誘導(dǎo)蛋白較快地釋放，由于增加了可供破骨細胞再吸收此基質(zhì)的表面面積?；|(zhì)的這種再吸收作用本身又從該磷酸鈣材料中釋放出可溶性rhBMP-2。
實施例4骨切開術(shù)腓骨內(nèi)注射如實施例1中所述制備含有按重量％碳酸氫鈉的磷酸鈣組合物。將20μg rhBMP-2加入到所形成的ACP組合物中，然后用有限量的水使它水合形成糊狀物。將0.5cc這種水合的材料注射進入非人類靈長動物手術(shù)骨切開的腓骨中。一天之后出現(xiàn)明顯的大顆粒形成和分散。與此相對比，不含碳酸氫鈉的標(biāo)準磷酸鈣材料(對照)在注射后1周仍然是整體的固體團塊(資料未被顯示)。
實施例5非人類靈長動物腓骨骨切手術(shù)如實施例4中所述制備含有20重量％碳酸氫鈉的磷酸鈉組合物(rhBMP-2/NaBSM20)，此研究的目的是確定在外科手術(shù)后7天，對成年雄性Cynomolgus猴一次經(jīng)皮注射施用rhBMP-2/NaBSM20，對加速腓骨骨切開術(shù)傷口愈合的效果。將這些結(jié)果同以前的研究相比較，以前是在外科手術(shù)后3小時作這種注射(資料未被顯示)。在12只動物制造了雙側(cè)腓骨骨切開手術(shù)，用小的骨髓內(nèi)栓釘加以固定。在制造骨切開術(shù)創(chuàng)傷后7天，對6只動物的一側(cè)骨切開術(shù)傷口注射每毫升NaBSM20含有1.5mg rhBMP-2的NaBSM20 0.5mL。留下其對側(cè)腓骨骨切開術(shù)傷口不治療作為手術(shù)對照。對其余6只動物的一側(cè)骨切開術(shù)傷口注射不含rhBMP-2的緩沖劑/NaBSM20作為載體對照。同樣其對側(cè)骨切開術(shù)傷口作為不治療的手術(shù)對照。
手術(shù)后每隔1周所作的定期放射照相顯示出，在rhBMP-2/NaBSM治療的骨切開術(shù)傷口早在注射后1周就有礦質(zhì)化的骨形成。到注射后2周，放射照相明顯可見有相當(dāng)多的新骨形成。早在治療后3-5周(骨切開術(shù)后4-6周)就存在跨越骨切開術(shù)傷口的橋接新骨細胞。到治療后7周(骨切開術(shù)后8周)放射照相顯示此骨切開術(shù)傷口被愈合。此時已不存在殘余NaBSM載體材料的痕跡。在對側(cè)手術(shù)對照直到注射后大約3-4周(骨切開術(shù)后4-5周)才出現(xiàn)新骨形成的痕跡。在rhBMP-2/NaBSM治療組治療后7周(骨切開術(shù)后8周)，在其對側(cè)手術(shù)對照仍然沒有橋接細胞或骨切開術(shù)傷口愈合的放射照相痕跡。在第二組動物，其緩沖劑/NaBSM治療的一側(cè)和對側(cè)手術(shù)對照的放射照相顯示與rhBMP-2/NaBSM治療組中對側(cè)手術(shù)對照相似。在緩沖劑/NaBSM治療的骨切開手術(shù)傷口，在注射后7周(骨切開術(shù)后8周)仍然存在殘余載體的痕跡。
在骨切開術(shù)后8周，rhBMP-2/NaBSM20治療的骨切開術(shù)傷口的抗扭機械強度，顯著地大于正常骨的強度和硬度(1.58±0.40對1.24±0.26Nm)。與其對側(cè)手術(shù)對照(0.72±0.19Nm)，以及與緩沖劑/NaBSM20治療組和該組的對側(cè)手術(shù)骨切開對照(0.87±0.29和0.74±0.21Nm)相比較，rhBMP-2/NaBSM20治療組的抗扭強度也顯著地較大。緩沖劑/NaBSM20治療的骨切開傷口與來自相同動物對側(cè)手術(shù)對照骨切開傷口相比較，以及與rhBMP-2/NaBSM治療動物的手術(shù)對照相比較，它們的抗扭機械強度沒有顯著的差別。在大約14-16周后未治療的手術(shù)對照骨切開傷口才達到接近正常骨的機械強度。對于骨切開術(shù)傷口的硬度地觀察到類似的結(jié)果。
此研究證明，響應(yīng)在制造骨切開術(shù)傷口后7天注射rhBMP-2/NaBSM20，大于50％地加速了骨切開術(shù)傷口的愈合。與在以前的研究中，在骨切開術(shù)后3小時和1天以rhBMP-2/NaBSM和rhBMP-2/aBSM治療的骨切開術(shù)傷口中觀察到的相比較其新骨形成的出現(xiàn)快得多。與骨切開術(shù)后3小時和1天治療的相比較，在手術(shù)后7天治療的動物其骨切開術(shù)傷口抗扭機械強度也比較大。當(dāng)在3小時和1天這二個時間點給予治療，骨切開術(shù)傷口愈合的加速大約是30-40％，初步結(jié)果表明，在制造骨切開術(shù)傷口后2周給予治療也可以達到加速骨切開術(shù)傷口愈合的目的。這種研究的結(jié)果都表明，在制造這種骨切開術(shù)傷口后3小時-7天給予該組合物或rhBMP-2/NaBSM，都可顯著地加速骨切開術(shù)傷口愈合。
權(quán)利要求
1.一種用于治療哺乳動物骨缺損的組合物，它包含作為第一種生物活性作用劑的骨生成蛋白，作為載體的磷酸鈣材料，以及有效用量的泡騰劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中的骨生成蛋白是選自骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)家族的成員。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中的骨生成蛋白選自BMP-2，BMP-4，BMP-5，BMP-6，BMP-7，BMP-10，BMP-12和BMP-13。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中的骨生成蛋白是BMP-2或BMP-6。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何之一的組合物，其中的磷酸鈣材料選自由無定形磷灰石磷酸鈣，羥基磷灰石，磷酸三鈣和氟磷灰石組成的磷酸鈣。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何之一的組合物，其中的磷酸鈣材料是無定形磷灰石磷酸鈣。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何之一的組合物，其中的磷酸鈣材料是稀少結(jié)晶的磷灰石磷酸鈣。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中該稀少結(jié)晶的磷灰石磷酸鈣具有與天然存在的骨礦物質(zhì)相似的鈣-磷比例。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的組合物，其中該稀少結(jié)晶的磷灰石磷酸鈣具有小于1∶1.50的鈣-磷比例。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任何之一的組合物，其中該稀少結(jié)晶的磷灰石磷酸鈣具有大約1∶1.40的鈣-磷比例。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任何之一的組合物，其中的泡騰劑是選自二氧化碳、空氣、氮氣、氦氣、氧氣和氬氣的氣體。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任何之一的組合物，其中的泡騰劑是碳酸氫鈉。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其中碳酸氫鈉是以大約10重量％-40重量％的濃度存在。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任何之一的組合物，還進一步包含選自如下物質(zhì)的補充材料藥劑學(xué)允許的鹽，多糖，肽，蛋白質(zhì)，氨基酸，合成的聚合物，天然聚合物和表面活性劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任何之一的組合物，還進一步包含選自固體結(jié)構(gòu)的補充材料，這類固體結(jié)構(gòu)包括海綿，網(wǎng)狀物，薄膜，纖維，凝膠，細絲，微粒和納米顆粒。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任何之一的組合物，還進一步包含選自易受生物侵蝕的聚合物的補充材料，這類聚合物包括膠原，糖原，幾丁質(zhì)，纖維素，淀粉，角蛋白，絲，核酸，脫礦質(zhì)化骨基質(zhì)，衍生化的透明質(zhì)酸，聚酐，聚原酸酯，聚乙醇酸，聚乳酸以及它們的共聚物和衍生物。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任何之一的組合物，還進一步包含選自聚酯和聚酐，以及它們的共聚物和衍生物的補充材料，其中該聚酯由α-羥基羧酸組成，例如聚(L-丙交酯)(PLLA)，聚(D，L-丙交酯)(PDLLA)，聚乙交酯(PGA)，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，聚(D，L-丙交酯-共-三亞甲基碳酸酯)和聚羥基丁酸酯(PHB)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任何之一的組合物，還進一步包含至少一種選自SiO2，Na2O，CaO，P2O5，Al2O3和CaF2的補充材料。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任何之一的組合物，還進一步包含選自多糖，肽和脂肪酸的補充材料。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任何之一的組合物，還進一步包含第二種活性作用劑，其中該第二種活性作用劑選自Hedgehog，F(xiàn)razzled，Chordin，Noggin，Cerberus和Follistatin蛋白。
21.一種用于治療哺乳動物骨缺損的組合物，它包含作為第一種生物活性作用劑的骨形態(tài)發(fā)生蛋白，作為載體的磷酸鈣材料，以及有效用量的泡騰劑，其中該泡騰劑是選自二氧化碳，空氣，氮氣，氦氣，氧氣和氬氣的一種氣體。
22.一種用于治療哺乳動物骨缺損的組合物，它包含作為第一種生物活性作用劑的骨形態(tài)發(fā)生蛋白，作為載體的磷酸鈣材料，以及有效用量的泡騰劑，其中該泡騰劑是碳酸氫鈉。
23.一種治療哺乳動物骨缺損的方法，包括對骨缺損部位施用有效劑量的骨生成組合物，其中該骨生成組合物包含骨形態(tài)發(fā)生蛋白，磷酸鈣材料以及泡騰劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中的骨生成蛋白是選自骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)家族的成員。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白選自BMP-2，BMP-4，BMP-5，BMP-6，BMP-7，BMP-10，BMP-12和BMP-13。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白是BMP-2或BMP-6。
27.根據(jù)權(quán)利要求23-26中任何之一的方法，其中的磷酸鈣材料選自由無定形磷灰石磷酸鈣，羥基磷灰石，磷酸三鈣和氟磷灰石組成的磷酸鈣。
28.根據(jù)權(quán)利要求23-26中任何之一的方法，其中的磷酸鈣材料是無定形磷灰石磷酸鈣。
29.根據(jù)權(quán)利要求23-26中任何之一的方法，其中的磷酸鈣材料是稀少結(jié)晶的磷灰石磷酸鈣。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中該稀少結(jié)晶的磷灰石磷酸鈣具有與天然存在的骨礦物質(zhì)相似的鈣-磷比例。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中該稀少結(jié)晶的磷灰石磷酸鈣具有小于1∶1.50的鈣-磷比例。
32.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中該稀少結(jié)晶的磷灰石磷酸鈣具有大約1∶1.40的鈣-磷比例。
33.一種治療哺乳動物骨缺損的方法，包括對骨缺損部位施用有效劑量的骨生成組合物，其中該骨生成組合物包含骨形態(tài)發(fā)生蛋白，磷酸鈣材料，以及碳酸氫鈉。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中碳酸氫鈉是以大約10重量％-40重量％的濃度加入的。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34的方法，其中的骨生成組合物還進一步包含選自如下物質(zhì)的補充材料藥劑學(xué)允許的鹽，多糖，肽，蛋白質(zhì)，氨基酸，合成的聚合物，天然聚合物和表面活性劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求33或34的方法，其中的骨生成組合物還進一步包含選自聚酯和聚酐，以及它們的共聚物和衍生物的補充材料，其中該聚酯由α-羥基羧酸組成，例如聚(L-丙交酯)(PLLA)，聚(D，L-丙交酯)(PDLLA)，聚乙交酯(PGA)，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，聚(D，L-丙交酯-共-三亞甲基碳酸酯)和聚羥基丁酸酯(PHB)。
37.根據(jù)權(quán)利要求33或34的方法，其中的骨生成組合物還進一步包含至少一種選自SiO2，Na2O，CaO，P2O5，Al2O3和CaF2的補充材料。
38.骨生成蛋白，磷酸鈣材料和泡騰劑，在制備用于治療哺乳動物骨缺損的藥物中的用途。
全文摘要
一種用于治療哺乳動物骨缺損的組合物。該組合物包含骨生成蛋白，作為載體的磷酸鈣材料，以及有效用量的泡騰劑。還公開了配制這種組合物的方法和使用這種骨生成組合物治療骨質(zhì)疏松和/或骨質(zhì)缺乏的骨的方法。
文檔編號A61K38/18GK1541100SQ02815639
公開日2004年10月27日 申請日期2002年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月8日
發(fā)明者R·H·-M·黎, H·J·西赫爾曼, R H -M 黎, 西赫爾曼 申請人:惠氏公司