專利名稱：含有至少兩種效價(jià)的疫苗組合物,其中一種效價(jià)是添加了助劑的,另一種效價(jià)是未添加助劑的的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的主題具體地是一種穩(wěn)定化的甲型肝炎/傷寒(HA-Vi)雙效價(jià)疫苗組合物，其中Vi效價(jià)在至少約24小時(shí)期間保持其免疫能力。
甲型肝炎和傷寒是兩種已經(jīng)有疫苗的疾病。世界上衛(wèi)生條件還遠(yuǎn)未達(dá)到最理想的地區(qū)，都會(huì)發(fā)現(xiàn)有這兩種疾病。由于各自傳染物共同地具有同樣的傳播途徑(口-糞便途徑)，還由于這些疾病的流行地區(qū)覆蓋面非常寬闊，所以將這兩種效價(jià)合并在同一產(chǎn)品中似乎是很有意義的。特別地，很容易理解在旅行者用的疫苗范圍內(nèi)，HA-Vi結(jié)合要比分開(kāi)服用兩種單效價(jià)疫苗HA和Vi更具吸引力。
為了證明HA和Vi效價(jià)是相容的，特別在無(wú)毒、免疫能力和穩(wěn)定性方面是相容的，已經(jīng)進(jìn)行了許多研究工作。這些研究使用了由市場(chǎng)上已經(jīng)有的單效價(jià)疫苗制備的HA-Vi組合，它們主要在于兩個(gè)方面一方面，將SmithKline Beecham Biological(Rixensart，比利時(shí))生產(chǎn)的HavrixTM(HA)和(Vi)單效價(jià)疫苗組合進(jìn)行了這些研究，另一方面，將Aventis Pasteur(里昂，法國(guó))生產(chǎn)的AvaximTM(HA)和TyphimViTM(Vi)單效價(jià)疫苗組合進(jìn)行了這些研究。
在這兩組研究中，HA單效價(jià)疫苗由失活的甲型肝炎病毒構(gòu)成，并且吸附在氫氧化鋁上。同樣地，傷寒單效價(jià)疫苗由仍是未添加助劑的傷寒沙門(mén)氏菌莢膜的多糖構(gòu)成。最后，以同樣方式，將這些相應(yīng)的單效價(jià)疫苗(這些單效價(jià)疫苗是以液體形式銷售的)簡(jiǎn)單混合生產(chǎn)出雙效價(jià)組合。因此，一定劑量的AvaximTM和一定劑量的Typhim ViTM混合在一起得到一定劑量的HA-Vi雙效價(jià)組合。
在沒(méi)有實(shí)施臨床試驗(yàn)范圍內(nèi)的注射之前，使用構(gòu)建的組合曾進(jìn)行了不到二十個(gè)月的兩組研究工作。這些研究工作表明，這些雙效價(jià)組合與相應(yīng)的單效價(jià)是等效的，特別在免疫能力方面。于是，SmithKlineBeecham Biological的雙效價(jià)組合滿足了英國(guó)當(dāng)局的要求，因此已經(jīng)準(zhǔn)許進(jìn)入這個(gè)國(guó)家的市場(chǎng)。但是，這種準(zhǔn)入有一個(gè)有效期確定為在生產(chǎn)后12個(gè)月的限制。
在疫苗領(lǐng)域內(nèi)，特別考慮到在分配前控制分批所需要的時(shí)間時(shí)，有效期為12個(gè)月是不夠的。確定有效期為24個(gè)月或更好地為36個(gè)月大大有利于這些批疫苗推向市場(chǎng)。
然而，在HA-Vi組合的情況下，本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)在生產(chǎn)日期過(guò)16-18個(gè)月后，Vi疫苗逐漸失去其免疫能力，并且提出一種有關(guān)這種不穩(wěn)定性根源的假設(shè)。事實(shí)上，具有Vi免疫原性特征的Vi多糖O-乙酰基團(tuán)隨著時(shí)間推移會(huì)水解，特別在堿性條件下更是如此。這種水解被認(rèn)為是造成Vi多糖免疫能力下降的原因，這種水解是由于組分Vi吸附在氫氧化鋁上所致，而氫氧化鋁是作為HA效價(jià)添加劑存在于雙效價(jià)組合中。單效價(jià)疫苗彼此一混合，Vi效價(jià)就立刻吸附在鋁凝膠上。這種吸附導(dǎo)致Vi多糖保持在堿性環(huán)境中。事實(shí)上，氫氧化鋁帶正電荷的吸引介質(zhì)的OH-離子，這樣造成在鋁凝膠微環(huán)境中pH升高，在吸附后Vi就定位在鋁凝膠上。至于O-乙?；鶊F(tuán)的水解，這種水解是一種非常緩慢的現(xiàn)象時(shí)，其作用是在約16-18個(gè)月后才真正覺(jué)察出來(lái)。
本申請(qǐng)人不僅證明了Vi效價(jià)隨著時(shí)間推移的不穩(wěn)定性問(wèn)題，而且本申請(qǐng)人提出一種解決方法，該方法在于在雙效價(jià)組合中再添加一種化合物，它阻止鋁凝膠吸附Vi，同時(shí)保持以添加形式的HA效價(jià)。有利地，這種化合物可以是一種陰離子，例如磷酸根或檸檬酸根。
在其更一般的教導(dǎo)中，本發(fā)明因此涉及一種疫苗組合物，該組合物含有至少兩個(gè)效價(jià)(i)與氫氧化鋁一起添加的第一效價(jià)和(ii)含有細(xì)菌莢膜多糖的第個(gè)二效價(jià)，該多糖含有一個(gè)或多個(gè)O-乙?；鶊F(tuán)，并且由于添加了第一效價(jià)，氫氧化鋁不吸附第二效價(jià)，這是由于附加化合物的存在將阻止氫氧化鋁吸附第二效價(jià)，不干擾第一效價(jià)的吸附。
根據(jù)一種有利的實(shí)施方式，因保護(hù)陰離子化合物的存在，可阻止吸附第二效價(jià)，其條件是它提供為最終疫苗使用所需要的所有安全保證。這種保護(hù)化合物可以是磷酸鹽、檸檬酸鹽或碳酸鹽。還可能使用不同陰離子的組合，例如磷酸根與檸檬酸根的組合。作為典型提示，明確指出特別地可以用含有磷酸一鉀、磷酸二鈉和氯化鈉的溶液提供磷酸根。
使用保護(hù)化合物尤其能夠長(zhǎng)時(shí)間地(24個(gè)月或24個(gè)月以上)，優(yōu)選地在正常儲(chǔ)存溫度或更高(例如37℃)溫度下在保存過(guò)程中穩(wěn)定第二效價(jià)的抗原活性。采用不同的技術(shù)，在生產(chǎn)該組合物時(shí)測(cè)量這種活性，然后隨著時(shí)間推移或在生產(chǎn)日期過(guò)去至少24個(gè)月再進(jìn)行同樣的測(cè)量，比較所得到的這些結(jié)果就可以估算出免疫活性的穩(wěn)定性。當(dāng)不能確定數(shù)字化數(shù)據(jù)彼此間在統(tǒng)計(jì)上有不同時(shí)，則應(yīng)該認(rèn)為免疫活性是穩(wěn)定的。采用ELISA技術(shù)，使用在疫苗領(lǐng)域中通常使用的技術(shù)，可以實(shí)施抗原免疫活性的測(cè)定。
第一效價(jià)可以是任何疫苗效價(jià)，沒(méi)有類型或結(jié)構(gòu)的限制，其條件當(dāng)然是需要其添加。特別可以列舉甲型肝炎效價(jià)(HepA或HA)、乙型肝炎效價(jià)(HepB)和肺炎球菌效價(jià)。這種第一效價(jià)可以由失活病毒構(gòu)成，失活病毒例如為失活的HA病毒或失活的脊髓灰質(zhì)炎病毒；減弱的病毒；病毒或細(xì)菌亞單位抗原，例如乙型肝炎病毒的表面抗原，白喉或破傷風(fēng)類毒素。
第二效價(jià)按照定義是由共軛或未共軛多糖構(gòu)成，它們?cè)谄渲貜?fù)單元中含有一個(gè)或多個(gè)O-乙?；鶊F(tuán)。傷寒沙門(mén)氏菌的莢膜多糖(還稱之Vi多糖)和腦膜炎奈瑟球菌群A的莢膜多糖滿足這個(gè)定義。在這些情況下，因此可以談到Vi效價(jià)，或傷寒效價(jià)和甲型腦膜炎(meningo A)效價(jià)。
關(guān)于“細(xì)菌莢膜多糖”，應(yīng)該理解是由具有莢膜多糖特征的重復(fù)單元鏈構(gòu)成的多糖，無(wú)論其大小，也與其輔助修飾無(wú)關(guān)。在本發(fā)明組合物中的多糖重復(fù)單元必須包括至少一個(gè)O-乙?；鶊F(tuán)。
為了本發(fā)明的目的，根據(jù)完全常規(guī)的技術(shù)由源細(xì)菌出發(fā)可以得到純化形式的多糖。按照需要，該多糖可以是(i)片段的或非片段的和(ii)與載體多肽共軛或未共軛的，例如白喉或破傷風(fēng)類毒素。
在更特定的范圍內(nèi)，本發(fā)明的目的是一種疫苗組合物，它含有(i)與氫氧化鋁一起添加的HA效價(jià)和(ii)由Vi多糖構(gòu)成的傷寒效價(jià)；其中Vi效價(jià)未被氫氧化鋁吸附的組合物。
為了本發(fā)明的目的，可以通過(guò)用氫氧化鋁進(jìn)行沉淀，或者通過(guò)用氫氧化鋁吸附的方法來(lái)添加第一效價(jià)。
用于添加第一效價(jià)的氫氧化鋁可以是純氫氧化鋁(即只含有Al3+離子和氫氧根的鋁化合物)，或以這個(gè)名稱為人們所知的任何氫氧化鋁，即使從化學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看，它們不是只由氫氧化鋁構(gòu)成。因此還可能涉及混合的鋁化合物，例如以堿式磷酸鋁或堿式硫酸鋁名稱表示的鋁化合物。一般地，可能涉及特別地含有羥基基團(tuán)的鋁化合物。作為典型說(shuō)明，可列舉Superfos Biosector公司銷售的AlhydrogelTM氫氧化鋁。
為阻止吸附第二效價(jià)，同時(shí)保持呈添加形式的第一效價(jià)，應(yīng)該添加足夠數(shù)量的磷酸根、檸檬酸根或碳酸根離子(保護(hù)化合物)。這個(gè)數(shù)量取決于各種因素，其中包括第一效價(jià)的數(shù)量與性質(zhì)，其添加方式，氫氧化鋁的數(shù)量與性質(zhì)，以及第二效價(jià)的數(shù)量。為了一旦確定了其它因素就可決定用于阻止第二效價(jià)吸附的化合物的適當(dāng)量，疫苗領(lǐng)域里的技術(shù)人員可完全直接考慮這些制約因素，以便氫氧化鋁被磷酸根離子飽和，同時(shí)保持呈添加形式的第一效價(jià)。
但是，明確指出市售的疫苗通常含有0.6-1.5mg鋁/ml。在市售的Hep A疫苗中，只要氧化鋁凝膠的吸附位點(diǎn)遠(yuǎn)未飽和，就會(huì)發(fā)現(xiàn)與HepA抗原相比，通常劑量(以鋁量表示)的氧化鋁凝膠大大過(guò)量。因此，實(shí)際上，只是鋁量似乎是確定應(yīng)該存在的保護(hù)化合物數(shù)量的決定因素。
對(duì)于含有0.3mg呈氫氧化鋁形式和0.5ml體積的鋁的本發(fā)明組合物，再添加約20mM磷酸根是合適的。如果鋁為這同樣體積，而量加倍，再添加兩倍磷酸根，即40mM是合適的。但是對(duì)于1ml體積含有0.6mg鋁的本發(fā)明組合物，20mM磷酸根就足夠了。
作為說(shuō)明，指出本發(fā)明的雙效價(jià)疫苗體積為0.5ml時(shí)可以含有(i)160抗原單位或1440 ELISA單位的失活的甲型肝炎病毒，該病毒吸附在(ii)含有0.3mg鋁的氫氧化鋁上；(iii)0.025mg Vi多糖；以及(iv)20mM磷酸根。
上述抗原單位和ELISA單位分別是Aventis Pasteur公司和SmithKline Beecham Biological公司(van Hoecke等人，J.Travel.Med.(1998)5116和André等人，inProg.Med.Virol.，Melnick JLEd，Basel，Karger(1990)3772)，借助專有標(biāo)準(zhǔn)的ELISA試驗(yàn)所確定的單位。不可能是另外的，因?yàn)闆](méi)有Hep A疫苗的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明的組合物有利地呈液體形式，疫苗劑量有利地配制成0.5-1ml的體積，其中包括邊界。
本發(fā)明的組合物可以這樣制備(i)往含有除傷寒效價(jià)之外的通過(guò)氫氧化鋁添加的效價(jià)的制劑中添加磷酸根、檸檬酸根或碳酸根離子；(ii)把在步驟(i)得到的制劑與含有傷寒效價(jià)的制劑混合。
實(shí)施例制備本發(fā)明的HA-Vi組合物A-制備吸附的HA組分一批失活HA病毒的抗原效價(jià)是885U ELISA/ml，把99ml這種HA病毒與5.94ml 25％2-苯氧基-乙醇混合。然后均化15分鐘，然后用Millipak 40MPGL 04SH2過(guò)濾器過(guò)濾制劑。過(guò)濾后，得到95ml效價(jià)為835U ELISA/ml的制劑。
往這種制劑中添加47.5ml含有3.14mg鋁/ml的氧化鋁凝膠。用48m l40mM PBS(磷酸鹽緩沖液)補(bǔ)足。在5℃下攪拌一夜(18小時(shí))，以便HA組分吸附在氧化鋁凝膠上。pH是7.28。
B-制備濃縮10倍的Vi多糖溶液根據(jù)Gotschlich等人，Prog.Immunobiol.Standard(1972)5485描述的方法制備Vi多糖粉末。在裝有16.64mg Vi(9.5g％殘留濕度，即15.06mg干重)的30ml瓶中，在連續(xù)攪拌下，逐步倒入25.1ml為注射制備的蒸餾水(ppi)。繼續(xù)在5℃下攪拌24小時(shí)，以便使多糖完全溶解。用0.22微米Millex GV SLGV 025過(guò)濾器過(guò)濾這種制劑。用5ml ppi蒸餾水洗滌該過(guò)濾器。最后體積因此是30.1ml。
C-制備HAVi雙效價(jià)疫苗往62ml在步驟A得到的制劑(HA)中添加10.6ml 94mM磷酸鹽溶液，然后添加8.1ml在步驟B中得到的制劑(Vi)。這樣得到疫苗的特征如下最后磷酸鹽的濃度20mMpH7.3摩爾滲透壓濃度578mosm/kg。
然后把這種稱之為P2制劑的制劑再分成劑量0.5ml的份。
同時(shí)還制備了兩種其它雙效價(jià)組合物P2′和P2″，它們不再含有20mM磷酸鹽，而分別含有10mM和40mM磷酸鹽。為此，根據(jù)種類添加了10.6ml 17.6mM或246mM的磷酸鹽溶液。
立刻研究P2、P2′和P2″組合物中的HA和Vi組分的性質(zhì)或在離心后研究這些組合物中的HA和Vi組分性質(zhì)，給出這些組分在這些組合物中的性質(zhì)(采用ELISA方法檢測(cè)這些組分)。觀察到，在10mM磷酸鹽時(shí)，HA仍被吸附，但Vi吸附在氧化鋁凝膠上，而在40mM磷酸鹽時(shí)，Vi不再被吸附，但HA部分被解吸。在20mM磷酸鹽時(shí)，這些所尋求的條件都滿足HA仍被吸附同時(shí)Vi不被吸附。
接著，研究了在5℃±3℃下P2劑量在30個(gè)月期間的穩(wěn)定性。具體地采用ELISA方法評(píng)價(jià)了從其整體與離心后的上清液(吸附在與凝膠一起沉淀的氧化鋁凝膠上的組分)所取疫苗劑量中Vi多糖的抗原本領(lǐng)；這樣還能夠確定未吸附Vi的百分?jǐn)?shù)。
ELISA是以間接方法方式實(shí)施的。待定劑量的Vi抗原是處在覆蓋板底部的抗-Vi抗體與小鼠的抗-Vi抗體之間的夾層中。添加生物素基化的抗鼠IgG的抗體，然后添加與辣根過(guò)氧化物酶偶合的生物素基化的鏈霉胍配合物。添加鄰亞苯基二胺二鹽酸鹽(OPD)使該反應(yīng)顯色。OPD的降解表現(xiàn)出著橙褐色，這種著色與Vi抗原量成比例。其強(qiáng)度可用分光光度計(jì)測(cè)量。
在96-孔板中，分配100μl抗傷寒沙門(mén)氏菌血清。在37℃下培育5小時(shí)，然后排空該板，再用含有0.05％吐溫的PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌三次。添加200μl稀釋在PBS中的奶粉溶液，使空位點(diǎn)飽和。在37℃下培育1小時(shí)30分鐘，然后排空該板，再洗滌三次。制備以倍率2稀釋的標(biāo)準(zhǔn)疫苗的系列稀釋液，以便達(dá)到一定的標(biāo)準(zhǔn)范圍。以適當(dāng)方式對(duì)待測(cè)定疫苗劑量以及參比劑量(能夠證實(shí)標(biāo)準(zhǔn)范圍)進(jìn)行稀釋；將100μl每種稀釋液分配到孔中，再在37℃下培育一夜。排空該板，再進(jìn)行洗滌。然后向孔中添加100μl適當(dāng)稀釋抗Vi鼠血清。再在37℃下培育1小時(shí)，然后排空該板，再進(jìn)行洗滌。這時(shí)固定生物素基化的鼠抗免疫球蛋白(向每個(gè)孔中加入100μl適當(dāng)稀釋液)。再在37℃下培育1小時(shí)，然后排空該板，再進(jìn)行洗滌。這時(shí)固定與過(guò)氧化物酶偶合的生物素基化鏈霉胍(向每個(gè)孔中加入100μl適當(dāng)稀釋液)。再在37℃下培育1小時(shí)，然后排空該板，再進(jìn)行洗滌。向每個(gè)孔中添加100μl 1mg/ml OPD在pH5檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液中的溶液，使該板顯色。在100μl 2N硫酸添加到孔中之前，在黑暗中在室溫下培育30分鐘。使用分光光度計(jì)在492nm處讀其板。確定了隨濃度變化的吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線。與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，計(jì)算出每種試驗(yàn)稀釋液的效價(jià)，以ng/ml表示。為了得到每個(gè)試驗(yàn)疫苗劑量的平均效價(jià)，求出用全部稀釋液所得效價(jià)的平均值。該效價(jià)以μg/劑量給出。
還測(cè)量了離心后上清液中存在的Vi多糖的O-乙?；臄?shù)量。使用羥胺，采用比色方法測(cè)定了O-乙?；?Hestrin S.J.Biol.Chim.(1949)180249)。在堿性介質(zhì)中羥胺與這些酯生成異羥肟酸，該酸在鐵鹽存在下給出栗色，可采用分光光度計(jì)在540nm處測(cè)定其強(qiáng)度。
同時(shí)，使用以與P2同樣方式制備的稱之為制劑P1的制劑進(jìn)行同樣的研究，其唯一不同之處在于在制備雙效價(jià)疫苗時(shí)不添加磷酸鹽。在這種情況下，Vi組分沒(méi)有立刻吸附在氧化鋁凝膠上，為了在離心后進(jìn)行測(cè)定，如P2一樣，合適的是預(yù)先解吸它。通過(guò)調(diào)節(jié)pH和介質(zhì)的離子強(qiáng)度，可達(dá)到這種解吸。在離心后，讓氧化鋁凝膠與150mM檸檬酸三鈉溶液在37℃下接觸6小時(shí)。然后離心回收上清液，其中有Vi組分。
下表I中列出這些結(jié)果。
表I
還研究了在25℃±2℃6個(gè)月內(nèi)與在37℃±3℃3個(gè)月內(nèi)P2配方的穩(wěn)定性。這些結(jié)果列于下面表II和III。
表II
表III
權(quán)利要求
1.一種疫苗組合物，該組合物含有(i)與含有羥基基團(tuán)的鋁化合物一起添加的第一效價(jià)，(ii)含有細(xì)菌莢膜多糖的第二效價(jià)，其多糖含有一個(gè)或多個(gè)O-乙?；鶊F(tuán)和(iii)磷酸根離子、檸檬酸根離子或碳酸根離子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中第一效價(jià)是甲型肝炎效價(jià)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其中甲型肝炎效價(jià)由失活的甲型肝炎病毒構(gòu)成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的疫苗組合物，其中第二效價(jià)是傷寒效價(jià)，它由傷寒沙門(mén)氏菌莢膜的Vi多糖構(gòu)成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其中傷寒效價(jià)在至少24個(gè)月期間具有穩(wěn)定的抗原效價(jià)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述的疫苗組合物，其中通過(guò)氫氧化鋁或堿式磷酸鋁的鋁化合物添加第一效價(jià)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的疫苗組合物，其中通過(guò)鋁化合物吸附來(lái)添加第一效價(jià)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求所述疫苗組合物的生產(chǎn)方法，其中(i)往一種制劑中添加磷酸根、檸檬酸根或碳酸根離子，該制劑含有通過(guò)含有羥基基團(tuán)的鋁化合物添加的第一效價(jià)；和(ii)把在步驟(i)得到的制劑與含有第二效價(jià)的制劑混合，其中第二效價(jià)由含有一個(gè)或多個(gè)O-乙?；鶊F(tuán)的細(xì)菌莢膜的多糖構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種疫苗組合物，該組合物含有兩種效價(jià)(i)第一效價(jià)，它與氫氧化鋁一起添加，(ii)含有細(xì)菌莢膜多糖的第二效價(jià)，其多糖含有一個(gè)或多個(gè)O－乙?；鶊F(tuán)，并且由于保護(hù)化合物的存在它不吸附在氫氧化鋁上，該保護(hù)化合物可以是磷酸鹽、檸檬酸鹽或碳酸鹽，并且它阻止這種吸附。第一效價(jià)可以是任何疫苗效價(jià)。根據(jù)一種特別方式，疫苗組合物含有(i)氫氧化鋁吸附的甲型肝炎效價(jià)和(ii)由傷寒沙門(mén)氏菌莢膜的Vi多糖構(gòu)成的傷寒效價(jià)。
文檔編號(hào)A61K39/295GK1541108SQ02815645
公開(kāi)日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2002年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月8日
發(fā)明者A·弗朗松, A 弗朗松 申請(qǐng)人:艾文蒂斯巴斯德公司