專利名稱：單克隆免疫球蛋白制劑滅菌方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對單克隆免疫球蛋白的制備進(jìn)行滅菌以減少其中的活性生物污染物，如病毒、細(xì)菌、酵母菌、霉菌、支原菌、蛋白病毒和/或寄生蟲含量的方法。
背景技術(shù)：
抗體是由有機(jī)體暴露于機(jī)體認(rèn)為是威脅的外部物質(zhì)而相應(yīng)于產(chǎn)生的。抗體，或如眾所周知的免疫球蛋白(Ig)是免疫系統(tǒng)的細(xì)胞所含有的蛋白質(zhì)，我們將該細(xì)胞稱為B細(xì)胞或漿細(xì)胞。免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)復(fù)雜而具有明顯特征。簡單而言，各個免疫球蛋白由一蛋白質(zhì)鏈化合物組成，我們將其稱為重鏈與輕鏈。通過額外的二硫鍵使各個重鏈與一單輕鏈連接。并通過額外的二硫鍵依次使所產(chǎn)生的化合物與一同樣重-輕鏈化合物連接?？赏ㄟ^改變重鏈的結(jié)構(gòu)與數(shù)量由該細(xì)胞將此基本單元組合成若干個專門形式。不同的重鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同的分子，我們將其稱為免疫球蛋白的“類別”。這些類別還可具有不同數(shù)量的上述基本單元。
該免疫球蛋白分子的這些各種物理形式的產(chǎn)生是順序發(fā)生的。在這一過程中，一單個分子或抗原的分子特異性保持不變。這是因為上述變化均是在該免疫球蛋白分子中的未牽涉到確定該特定免疫球蛋白分子的特異性的那部分發(fā)生的。這在B細(xì)胞成熟過程中，這種“超變量區(qū)域”面臨著異常高度的重組作用。在由該細(xì)胞產(chǎn)生該第一免疫球蛋白分子之前，這些重組作用停止。結(jié)果，由一相應(yīng)少量的變量區(qū)域基因，該機(jī)體產(chǎn)生了大量具有不同特異性的潛在免疫球蛋白分子。
一旦一B細(xì)胞與一與其自身的免疫球蛋白分子鍵聯(lián)的分子相遇，且在從免疫系統(tǒng)內(nèi)的其它細(xì)胞接受信號的時候，該B細(xì)胞首先增殖為大量同樣細(xì)胞，(我們將其稱為克隆)，且然后區(qū)分成為一免疫球蛋白含有的漿細(xì)胞。這樣，將可能被制造的極大量的潛在免疫球蛋白分子限制為識別該機(jī)體所必須響應(yīng)的抗原。
所產(chǎn)生的免疫球蛋白特異性的廣泛數(shù)組造成了對機(jī)體所正進(jìn)行的保護(hù)，以使機(jī)體免受過去制造免疫球蛋白以做抵抗的那些有機(jī)體的感染?？傮w而言，結(jié)果為來自一單供體的原生質(zhì)內(nèi)所包含的該免疫球蛋白可具有上百萬個有用的免疫球蛋白特異性。既然其包括由該機(jī)體內(nèi)所有漿細(xì)胞所制造的免疫球蛋白分子，因此，我們將從原生質(zhì)制備免疫球蛋白稱為一多克隆免疫球蛋白制劑。
多克隆免疫球蛋白對于治療使制造Ig的能力缺乏或受損的人類疾病尤其有用。既然所有的漿細(xì)胞克隆均受到影響，則需要該原生質(zhì)中所發(fā)現(xiàn)的所有免疫球蛋白特異性的混合物以更正該不足。相對而言，當(dāng)要求特異性的一極端程度時，或當(dāng)探索一單個限定治療學(xué)目標(biāo)時，多克隆免疫球蛋白并非最佳解決方案。相反，由一單克隆所產(chǎn)生的具有所需特異性的該免疫球蛋白分子所組成的一免疫球蛋白制劑是最精確與最可預(yù)測的解決方案。我們將該種制備稱為一單克隆免疫球蛋白。
與多克隆免疫球蛋白相比，單克隆免疫球蛋白具有許多不同之處。它們的單個特異性使其在作為檢測試劑時非常精確。作為治療方法，它們沒有從多克隆免疫球蛋白所產(chǎn)生的混合或危險的副作用，如將具有有害特異性的免疫球蛋白的的導(dǎo)入引入病人。它們的物理特性也會有所不同。既然各個單克隆免疫球蛋白具有一獨(dú)特與不變的結(jié)構(gòu)，它的穩(wěn)定潛力、退化、聚合、溫度敏感性與其它特性也時獨(dú)特與不變的。一旦選擇生產(chǎn)一種合適的單克隆免疫球蛋白，其特性將不會改變，且因此能連續(xù)生產(chǎn)，并確保其性能與存儲特性。能夠按照制品要求制定產(chǎn)量的能力也使單克隆免疫球蛋白成為多克隆免疫球蛋白一高度合適的替代品。
單克隆免疫球蛋白制劑通常有三種方式。第一種方式涉及一細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)，該第二種方式使用了一動物作為單克隆免疫球蛋白的一暫時生物反應(yīng)器，且該第三種方式涉及將一所需單克隆單克隆免疫球蛋白的基因插入一動物，從而導(dǎo)致該單克隆免疫球蛋白在該動物的流質(zhì)或組織內(nèi)持續(xù)生產(chǎn)中，使得其能不斷產(chǎn)生(轉(zhuǎn)基因生產(chǎn))。
這些方法各會導(dǎo)致病原體將制品污染。在該第一種方法中，產(chǎn)生該單克隆免疫球蛋白的細(xì)胞會庇護(hù)在培養(yǎng)系統(tǒng)中可能會產(chǎn)生而未檢測出的病毒。細(xì)菌、酵母菌或霉菌對該培養(yǎng)系統(tǒng)的污染也會發(fā)生。
余下的兩種方法均涉及對一動物的使用，或使該動物作為該單克隆免疫球蛋白制造細(xì)胞的宿主，或使其作為一生物反應(yīng)器以制造該單克隆免疫球蛋白自身。顯然，這些制品面臨著被宿主動物所感染或庇護(hù)的病原體污染的危險。該種病原體包括病毒、細(xì)菌、酵母菌、霉菌、支原菌和寄生蟲，等等。
因此，在使用單克隆免疫球蛋白制品之前將制品中含有的所有生物活性污染物進(jìn)行去活化處理至關(guān)重要，特別是當(dāng)制品在輸血、器官移植和其他形式的人體治療中直接施行于人體時尤其如此，并且對于在含有各種類型的原生質(zhì)的介質(zhì)中制備的，并可能含有支原菌或其他病毒污染物的各種單克隆免疫球蛋白制品來說，去活化處理也尤其重要。
過去，人們采取的最多的方法是從制品中篩選或檢測出某種特定的污染物，而不是將制品中的污染物去除或去活化。污染物檢測呈陽性的制品不再被使用。例如，篩選步驟可包括從捐血者的血液中檢測某種特定的病毒。然而，這些步驟并不總是可靠，因為其無法檢測出數(shù)量很小的病毒。由于可導(dǎo)致虛假的陽性結(jié)果，檢測的價值或可靠性打了折扣。虛假陽性結(jié)果在某些情況下可危及生命，比如可能導(dǎo)致感染獲得性免疫缺損綜合癥(艾滋病)。此外，在某些情況下，需要幾周，甚至幾個月來判斷制品中是否含有污染物。
在進(jìn)行實驗以確定破壞病毒活性的技術(shù)能力的過程中，很少利用具有意義的實際病毒。這是由于考慮到進(jìn)行測試的工作者的安全，以及與設(shè)備污染與廢料處理所相關(guān)的困難與費(fèi)用。在此處，使用了同族與同級別的模型病毒。
一般而言，我們承認(rèn)其活性最難破壞的病毒為那些具有外殼的病毒，該外殼由蛋白質(zhì)等組成，且其活性最難破壞的病毒為尺寸最小的病毒。γ輻射與大多數(shù)其他形式的輻射以顯示這為事實，因為這些病毒小尺寸是它們小基因的產(chǎn)物。輻射對一分子的大量直接影響與分子的尺寸成正比，意思為，目標(biāo)分子越大，其影響越大。由此推斷，γ輻射已經(jīng)顯示濾過性毒菌基因越小，將其活性破壞所要求的輻射越高。
與人類與動物衍生的生物學(xué)有關(guān)的病毒中，相關(guān)的最小病毒屬于細(xì)小病毒一族與尺寸略大的有蛋白質(zhì)外殼的肝炎病毒。在人類中，該細(xì)小病毒B19，與肝炎A為主要關(guān)注對象。在豬衍生產(chǎn)品與組織中，最小的相應(yīng)病毒為豬細(xì)小病毒。既然這種病毒對人類無害，通常將其選擇作為該人類B19細(xì)小病毒與肝炎A的模型病毒。我們將對這個模型細(xì)小病毒的火星的破壞示范視為能充分證明所使用的方法能夠殺滅人類B19病毒與肝炎A，且擴(kuò)展而言，其也將能夠殺滅更大與不那么堅硬的病毒，如人體免疫缺損病毒(HIV)、細(xì)胞肥大病毒(CMV)、肝炎B與C等等。
較新的方法旨在去除或去活化制品中的污染物。這些方法包括熱處理，過濾和向制品中添加化學(xué)去活化劑或敏化劑。熱處理要求將制品加熱到約60℃，并保持70小時，但這可能會對敏感制品造成破壞。熱去活化可破壞制品中50％或以上的生物活動。過濾是指對制品進(jìn)行過濾，用物理方法去除污染物。遺憾的是，這種方法會將分子重量較大的制品一并去除，并且，在某些情況下，由于制品的分子結(jié)構(gòu)較大，較小的病毒無法通過過濾方法去除。化學(xué)敏化步驟是指在制品中添加有毒試劑，使其與病毒的DNA(DNA)/RNA(RNA)結(jié)合，并通過紫外線(UV)或輻射進(jìn)行活化，產(chǎn)生活性中間體和/或自由基，其鍵聯(lián)至DNA/RNA或突破病毒DNA/RNA主鏈中的化學(xué)鍵，或者將其交鍵或結(jié)合，使病毒無法復(fù)制。由于敏化劑有毒，甚至可誘變或致癌，不能直接施行于人體，因此該步驟要求將未結(jié)合的敏化劑從制品中洗出。
另一種對制品進(jìn)行滅菌的方法是用γ射線進(jìn)行照射。在進(jìn)行大劑量照射時，γ輻射可有效地破壞病毒和細(xì)菌。(參看基斯利，Keasly等，《照射之后生命是否存在？》“Is There Life After Irradiation？第二部分，《生物制藥》(BioPharm)1993年7-8月，和萊特曼，Leitman，《血液細(xì)胞照射在防止輸血后的移植體抗宿主疾病中的應(yīng)用》“Use ofBlood Cell Irradiation in the Prevention of Post TransfusionGraft-vs-Host Disease”，《輸血科學(xué)》(Transfusion Science)10219-239(1989))。然而，本領(lǐng)域公開發(fā)表的論文同時揭示，γ輻射可破壞輻射敏感制品，如血液。特別是大劑量的輻射會對紅細(xì)胞、血小板和粒細(xì)胞(granulocyte)造成傷害(萊特曼)。美國第4,620,908號專利案提出，蛋白質(zhì)制品必須在照射之前進(jìn)行冷凍，以維持蛋白質(zhì)制品的生存力(viability)。該專利指出，“如果在環(huán)境溫度下對蛋白質(zhì)材料進(jìn)行γ照射，材料將被完全破壞，即材料的活性將變得極低，實質(zhì)上不再有效。”這對于當(dāng)然也是蛋白質(zhì)的單克隆免疫球蛋白同樣實用。然而，如果為了照射目的將生物制品進(jìn)行冷凍，然后在施行于人體前將其融化，那么許多敏感生物制品，比如血液，將失去生存力和活性。
由于存在上述困難，我們?nèi)孕枰獙ふ覍慰寺∶庖咔虻鞍走M(jìn)行滅菌的方法，其既能降低活性生物污染物的含量，又不會對單克隆免疫球蛋白造成反作用。
發(fā)明說明因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提出既能降低活性生物污染物含量，又能避免對單克隆免疫球蛋白造成反作用的單克隆免疫球蛋白制劑的滅菌方法。本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征和優(yōu)點將在下文的優(yōu)選實施例部分進(jìn)行詳細(xì)闡述，通過本說明書的說明和對本發(fā)明的實踐，本發(fā)明的目標(biāo)、特征和優(yōu)點將更加明顯。本發(fā)明的這些目標(biāo)和優(yōu)點可經(jīng)由說明書和權(quán)利要求書中所特別指明的組成形式和方法實現(xiàn)和獲得。
依照這些和其他目標(biāo)，本發(fā)明的第一實施例是一種用于將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白制劑滅菌的方法，其包括(i)將單克隆免疫球蛋白制劑的溶劑殘留量減低到足以有效保護(hù)生物材料抵御電離輻射的水平；和(ii)按有效比率用射線對單克隆免疫球蛋白制劑照射一段有效時間，使其得到滅菌。
本發(fā)明的第二實施例是一種用于將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白制劑滅菌的方法，其包括(i)向生物材料中添加至少一種穩(wěn)定劑，其劑量應(yīng)足以有效保護(hù)單克隆免疫球蛋白制劑抵御輻射；和(ii)按有效比率用射線對單克隆免疫球蛋白制劑照射一段有效時間，使其得到滅菌。
本發(fā)明的第三實施例是一種用于將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白制劑滅菌的方法，其包括(i)將單克隆免疫球蛋白制劑的溶劑殘留量減低到足以有效保護(hù)單克隆免疫球蛋白制劑抵御輻射的水平；(ii)向生物材料中添加至少一種穩(wěn)定劑，其劑量應(yīng)足以有效保護(hù)單克隆免疫球蛋白制劑抵御輻射；和(iii)按有效比率用射線對單克隆免疫球蛋白制劑照射一段有效時間，使其得到滅菌。在本實施例中，步驟(i)和(ii)可互相顛倒。
本發(fā)明還提供了一種組合物，其包括至少一個單克隆免疫球蛋白與一至少一個穩(wěn)定劑，該穩(wěn)定劑是從由下列物質(zhì)組成的群中選出的抗壞血酸或其鹽或酯；谷胱甘肽；6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸；尿酸或其鹽或酯；甲硫氨酸；組氨酸；N-乙酰基半胱氨酸；二肽(dipetide)甘氨酸-甘氨酸；地奧司明；水飛薊素；一抗壞血酸或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物；一抗壞血酸或其鹽或酯、尿酸或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物；以及一尿酸或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物，該至少一種穩(wěn)定劑的劑量能有效保持該單克隆免疫球蛋白在用輻射與此組合物滅菌后能繼續(xù)使用。


圖1和2顯示某些穩(wěn)定劑對暴露于45kGy低劑量γ照射的凍干的抗胰島素單克隆免疫球蛋白的保護(hù)效果。
圖3A-3C顯示某些穩(wěn)定劑對暴露于45kGy低劑量γ照射的凍干的抗胰島素單克隆免疫球蛋白的保護(hù)效果。
圖4&5顯示首次凍干(primary lyophilizing)和二次凍干(secondary lyophilizing)對單克隆免疫球蛋白敏感性的保護(hù)效果。
圖6-11顯示某些穩(wěn)定劑對凍干的抗胰島素單克隆免疫球蛋白的活性的保護(hù)效果。
圖12顯示當(dāng)以高比率(30kGy/小時)照射試樣時，穩(wěn)定劑對凍干的抗胰島素單克隆免疫球蛋白的活性的保護(hù)效果。
圖13顯示穩(wěn)定劑對接受γ射線照射后的免疫球蛋白M(igM)的活性的效果。
圖14與15顯示穩(wěn)定劑對于接受γ輻射照射后的固定抗胰島素單克隆免疫球蛋白的效果。
圖16A、16B、17A與17B顯示抗壞血酸鹽在變化的濃度中對接受γ輻射照射后的固定抗胰島素單克隆免疫球蛋白的效果。
圖18A-18H顯示了穩(wěn)定劑對接受γ輻射照射后由人類血清白蛋白或蔗糖所補(bǔ)充的凍干的抗胰島素單克隆免疫球蛋白的效果。
圖19A-19F顯示穩(wěn)定劑對接受γ射線照射后的牛血清白蛋白所補(bǔ)充的凍干的抗胰島素單克隆免疫球蛋白的效果。
圖20A與20B在具有或不具有抗壞血酸鹽的情況下，各種劑量的γ輻射對抗胰島素單克隆免疫球蛋白的效果。
圖21A與21B顯示低pH(4.5)值對于L-抗壞血酸對暴露于45kGyγ照射單克隆免疫球蛋白的效果的效果。
圖22顯示由對受豬細(xì)小病毒(PPV)污染的單克隆免疫球蛋白進(jìn)行γ輻射照射而將濾過性毒菌活性破壞的程度。
圖23A與23B顯示當(dāng)使液體或凍干形式單克隆免疫球蛋白受e-電波輻射的照射時，抗壞血酸鈉鹽的存在與否對于對于所達(dá)到的活性保持力程度的效果。
具體實施例方式
定義除非另外定義，否則本說明書中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均與所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本說明中提及的所有的專利案和出版物均以引用方式明確并入本文中。
除非上下文另有明確說明，本說明書中所使用的單數(shù)形式“一個、”“一個、”與“該”包括單數(shù)參照意。
本說明書中所使用的術(shù)語“免疫球蛋白”與術(shù)語“抗體”同義，且包括所有類別的免疫球蛋白，其包括，而不限制于以下幾種IgG、IgM、IgA、IgD、IgE以及免疫球蛋白的所有亞類，如由包括人類的動物細(xì)胞中所找到或產(chǎn)生的IgG亞類IgG1、IgG2、IgG2、與IgG4。術(shù)語“免疫球蛋白”包括膜免疫球蛋白與分泌免疫球蛋白。膜免疫球蛋白是B細(xì)胞的橫跨膜蛋白質(zhì)，且作用為B細(xì)胞的抗體受體。除了缺乏在膜免疫球蛋白的C-終點的該氨基酸的橫跨膜區(qū)域，分泌免疫球蛋白結(jié)構(gòu)上與其膜配對物相同。分泌免疫球蛋白存在于細(xì)胞外的流質(zhì)與分泌物中。
術(shù)語“免疫球蛋白”還包括免疫球蛋白片段，其包括，而不限制于以下幾種片段F(ab’)2、Fab’、Fab、Fc、Facb、pFc’、與Fd，以及該技術(shù)中所知的免疫球蛋白衍生物與代謝物。免疫球蛋白的代謝物是一活性有機(jī)體所進(jìn)行的免疫球蛋白代謝所產(chǎn)生的。該技術(shù)范圍內(nèi)已知有多種方法制備免疫球蛋白的各種衍生物，其通常涉及打破該免疫球蛋白中的肽或二硫鍵。也可眼生該免疫球蛋白，以包括變型或人造或非自然氨基酸。免疫球蛋白的衍生物還包括與一半族成對，該半族可如一毒素(例如，白喉毒素、篦麻毒素)、一標(biāo)簽分子(例如二氫熒光素、得克薩斯紅)、一治療或診斷用放射性原子或分子(例如125I)、一酶(例如抗生物素蛋白、山葵過氧化物酶、堿性磷酸酯酶)等等。免疫球蛋白可包括后平移變型，例如，磷酸化、glyocsylation、十四?；?、含異戊間二烯基化、ADP-核糖基化、甲基化、乙?；⒘u基化、羧化、與氧化變型，或可陽離子化或陰離子化以改變該免疫球蛋白的整個電荷。
本說明書中所使用的術(shù)語“單克隆免疫球蛋白”指一單克隆所產(chǎn)生的同類免疫球蛋白，其與多克隆免疫球蛋白相比照。單克隆免疫球蛋白通常由使用聚乙烯乙二醇(PEG)將具有免疫性的老鼠或耗子的脾細(xì)胞與一非分泌器骨髓瘤熔合而制備的雜種細(xì)胞制造而成。將該熔合混合物平攤在HAT媒介上，其包括次黃嘌呤、氨喋呤與胸苷。則氨喋呤會將代謝途徑堵塞，但如果存在次黃嘌呤與胸苷，能將該堵塞旁路。該骨髓瘤細(xì)胞缺乏這種旁路，且因而在HAT媒介中死亡。在培養(yǎng)一或兩星期后，脾細(xì)胞自然死亡，但熔合的細(xì)胞生存下來，因為它們具有骨髓瘤的不死性與脾細(xì)胞的代謝旁路。一些熔合的細(xì)胞分泌抗體，且以一特定化驗方法檢測該上清液。隨后克隆生所需抗體的井。還可通過熟悉基因工程技術(shù)者所熟悉的各種技術(shù)生產(chǎn)單克隆免疫球蛋白，其導(dǎo)致了一單個套為單個免疫球蛋白代碼的內(nèi)在基因的誘導(dǎo)或結(jié)構(gòu)性表達(dá)，或其牽涉將一套基因的一套或一部分加入一細(xì)胞或有機(jī)體，從而導(dǎo)致一單個套為單個免疫球蛋白代碼的內(nèi)在基因的誘導(dǎo)或結(jié)構(gòu)性表達(dá)。
可使用上述技術(shù)結(jié)合微晶細(xì)胞培養(yǎng)在生物細(xì)胞培養(yǎng)(例如一腹水培養(yǎng))中或通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)單克隆免疫球蛋白。轉(zhuǎn)基因技術(shù)包括將一個或多個基因插入一受體有機(jī)體中。隨后該受體有機(jī)體連續(xù)或根據(jù)引導(dǎo)生產(chǎn)這些基因的蛋白質(zhì)制品，并將其合并或分泌進(jìn)入一組織(包括蛋)或流質(zhì)(包括血液、汗液、奶液、或尿液)。隨后收獲所導(dǎo)致的組織或流質(zhì)，并由其凈化出所需的單克隆免疫球蛋白。
本說明書中所使用的術(shù)語“單克隆免疫球蛋白的制備”包括而不限制于以下幾種(1)單獨(dú)由單克隆免疫球蛋白(如一單個特異性或結(jié)合具有不同特異性和/或不同類的單克隆免疫球蛋白)所組成的組合物，且其會包含雜質(zhì)(包括通過轉(zhuǎn)基因方法由單克隆球蛋白所生產(chǎn)的一組織或流質(zhì)自然產(chǎn)生的部分)；(2)組合物，其包括單克隆免疫球蛋白、藥物可接受稀釋液、載體、助理液、脂質(zhì)體與其他治療性試劑，等等，如此技術(shù)所了解；(3)部分凈化的進(jìn)程中單克隆免疫球蛋白中間體制備；以及(4)包含單克隆免疫球蛋白或其上固定由或排列有單克隆免疫球蛋白的物質(zhì)。以下將說明優(yōu)選的“單克隆免疫球蛋白的制備”。
在治療學(xué)應(yīng)用中，單克隆免疫球蛋白一般與緩沖或鹽溶液結(jié)合。該單克隆免疫球蛋白還可與另一治療學(xué)試劑結(jié)合。例如，評估防止血小板聚合的抗血小板單克隆免疫球蛋白可用于長期治療，以防止血栓癥的形成。在此應(yīng)用中，該抗血小板單克隆免疫球蛋白與阿司匹林同時使用。該單克隆免疫球蛋白與其他治療學(xué)試劑可同時包裝，以通過(例如)靜脈注射而使用。這也可以直接包含在一單個容器中的形式進(jìn)行。包裝的一更先進(jìn)形式的實例為在脂質(zhì)體中使用單克隆免疫球蛋白。一般而言，通過鍵聯(lián)至所需細(xì)胞或組織的結(jié)構(gòu)上或內(nèi)從而將該免疫球蛋白嵌入該作為目標(biāo)試劑的脂質(zhì)體的至少外層中。隨后脂質(zhì)體中所含藥物這個特定場所釋放，提供了更濃的藥物治療法，其比一般系統(tǒng)性治療法具有更大的治療指數(shù)。
對于治療用途而言，一般以在氮或真空下密封的液體、凍結(jié)、或(凍結(jié)-干燥)凍干形式提供該單克隆免疫球蛋白。隨后，通常將該單克隆免疫球蛋白與滅菌水重組(若需要，或按需要解凍)，并經(jīng)過一適當(dāng)途徑，施行，如通過直接或在放置于一靜脈(IV)包內(nèi)后進(jìn)行肌肉注射或靜脈注射。根據(jù)本發(fā)明，可使單克隆免疫球蛋白的制備在任何階段接受照射，包括但不限制于一原材料、一凈化的或部分凈化的進(jìn)行中中間體，大量或單獨(dú)或多重劑量密封，在密封前或密封后，在稀釋以進(jìn)行施行，或在該IV包或其它運(yùn)輸工具其自身內(nèi)。該照射可在任何便利溫度下進(jìn)行，該溫度需不對制備過程產(chǎn)生有害效果，且會在制備的凍結(jié)或共晶點以上或以下。有多種單克隆免疫球蛋白的制備方法可用于治療用途，如表1所列


上表來源《酶聯(lián)免疫吸附測定實際指南》，D.M.卡梅尼(Kemeny)，帕加馬出版社(Pergamon Press)*FD-凍結(jié)-干燥(凍干)，L-液體，I-固定于一表面，C-包含干燥材料的膠囊(口服給藥)單克隆免疫球蛋白的制備還可找到作為研究工具的應(yīng)用方法，其中大量用于診斷目的，尤其在血液工作中。涉及單克隆免疫球蛋白的一般的研究工具與診斷測試包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)、磁珠基礎(chǔ)測定與分離套件、以及熒光激活細(xì)胞分析和/或分類，等等。在由實驗室技術(shù)人員使用時，為了維護(hù)與安全，需要將該種診斷工具滅菌。用于診斷目的的單克隆免疫球蛋白的制備通常包括一固體支撐，如一量桿或塑料盤，其上或其內(nèi)通過共價化學(xué)反應(yīng)、干燥或其它已知方法固定有該單克隆免疫球蛋白。根據(jù)本發(fā)明，一完全商業(yè)包裝或套件、包括其上安裝有該單克隆免疫球蛋白的該固體支撐、說明書、試劑容器(例如一用于產(chǎn)生一標(biāo)準(zhǔn)曲線的參照樣本)，等等，可根據(jù)本發(fā)明將該商業(yè)包裝或套件滅菌。表2提出了許多商業(yè)診斷單克隆免疫球蛋白制品。


上表來源《酶聯(lián)免疫吸附測定實際指南》，D.M.卡梅尼(Kemeny)，帕加馬出版社(Pergamon Press)*FD-凍結(jié)-干燥(凍干)，L-液體，I-固定于一表面，C-包含干燥材料的膠囊(口服給藥)本說明書中所使用的術(shù)語“滅菌”指根據(jù)本發(fā)明使在所處理單克隆免疫球蛋白制劑中所發(fā)現(xiàn)的至少一種活性生物污染物含量降低。
本說明書中所使用的術(shù)語“生物污染物”指當(dāng)與單克隆免疫球蛋白制劑直接或間接接觸時可對單克隆免疫球蛋白制劑或其受體產(chǎn)生有害作用的污染物。這些生物污染物包括所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的各種病毒、細(xì)菌和寄生蟲，通常存在于或感染全血(whole blood)或血液成分等單克隆免疫球蛋白制劑。生物污染物包括，但不僅限于以下幾種病毒，比如人類免疫缺陷病毒和其他逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)、皰疹病毒、細(xì)小病毒(parvovirus)、費(fèi)羅病毒(filovirus)、環(huán)形病毒(circovirus)、副粘病毒(paramyxovirus)、巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus)、肝炎病毒(包括乙型肝炎和丙型肝炎)、痘病毒、披膜病毒(Togavirus)、埃布斯滕巴爾病毒(EbsteinBarrvirus)和細(xì)小病毒(parvovirus)；細(xì)菌，比如埃希氏桿菌、芽孢桿菌、彎曲菌、鏈球菌和葡萄球菌；寄生蟲，比如錐體蟲(Trypanosoma)和瘧原蟲，包括瘧原蟲種；酵母菌、霉菌、支原菌；以及蛋白病毒。本說明書中所使用的術(shù)語“活性生物污染物”指有能力導(dǎo)致有害作用的生物污染物。
本說明書中所使用的術(shù)語“生物相容溶液”(biologicallycompatible solution)指通過懸浮或溶解等方式含有單克隆免疫球蛋白，并保持其活性，即保持其基本生物和生化特征的溶液。這些生物相容溶液最好含有有效劑量的至少一種抗凝劑。
本說明書中所使用的術(shù)語“生物相容緩沖溶液”指pH值和滲透屬性(如滲透壓、滲透濃度和/或膠體滲透壓)適合于保持單克隆免疫球蛋白完全性的生物相容溶液。適當(dāng)?shù)纳锵嗳菥彌_溶液的pH值通常在4到8.5之間，并且等滲，或適度低滲或高滲。所屬技術(shù)的技術(shù)人員了解并可方便地得到生物相容緩沖溶液。
本說明書中所使用的術(shù)語“穩(wěn)定劑”指一種化合物或材料，能夠在當(dāng)單克隆免疫球蛋白制劑接受照射的劑量不足，妨礙了該單克隆免疫球蛋白制劑的安全和有效使用時減少對生物材料的破壞。穩(wěn)定劑包括，但不僅限于以下幾種抗氧化劑，如抗壞血酸和生育醇；以及自由基凈化劑，如乙醇。穩(wěn)定劑的優(yōu)選實例包括，但不僅限于以下幾種脂肪酸，包括6，8二巰基辛酸(硫辛酸)及其衍生物和類似物(α、β、二氫化、雙降和四環(huán)硫辛酸)、硫辛酸，6，8二巰基辛酸、dihydrolopoate(DL-6，8-二硫辛酸甲酯)、硫辛酰胺、二硫甲酯和四環(huán)二硫辛酸、呋喃脂肪酸；油酸、亞油酸和棕櫚酸及其酸鹽和衍生物；類黃酮、苯基丙醇和黃酮醇，如槲皮黃酮、蕓香苷及其衍生物，芹菜素、氨基黃酮、兒茶酚、桔皮苷以及柚苷；胡蘿卜素，包括β胡蘿卜素；C0-Q10；葉黃素；多羥基醇，如丙三醇、甘露醇；糖類，如木糖、葡萄糖、核糖、甘露糖、果糖、海藻糖；氨基酸類，如組氨酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、谷氨酸、色氨酸、鈉carpryl N-乙酰氨酸癸酰基鈉和甲硫氨酸；疊氮化物，如疊氮化鈉；酶，如超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化氫酶；尿酸及其衍生物，如1，3-二甲基尿酸和二甲基硫脲；別嘌呤醇；硫醇類，如谷胱甘肽和巰基丙氨酸；微量元素，如硒；維生素，如維生素A、維生素C(包括其衍生物和鹽類，如抗壞血酸鈉和棕櫚?？箟难峋S生素C)和維生素E(及其衍生物和鹽類，如醋酸生育酚和α三烯生育酚)；色原烷醇-α-C6；6羥基2，5，7，8-四甲基Chroma-2羧基酸(Trolox)及其衍生物；外源蛋白質(zhì)，如凝膠和白蛋白；三-3-甲基-2-苯基-2-吡唑啉-5-1(MCI-186)；西替沃酮；puercelin；柯因；二甲基亞砜(DMSO)；哌嗪二乙磺酸(PIPES)；咪唑；甲氧基補(bǔ)骨脂素(MOPS)；1，2-二噻烷-4，5-二醇；還原物質(zhì)，如丁羥甲醚(BHA)和丁羥甲苯(BHT)；膽固醇；丙丁酚；吲哚衍生物；水楊乙汞；氨基類固醇衍化物(Lazaroid)和甲磺酸替拉扎特；proanthenols；原花青素；硫酸銨；聚乙烯醇超氧化物歧化酶(PEG-SOD)；N-第三丁基-α-苯基硝酸靈(PBN)；和4-異煙肼-2，2，6，6-四甲基胡椒酸-1-烴氧基(Tempol)；抗壞血酸鹽、尿酸鹽與Trolox C的混合物(Asc/urate/Trolox C)；蛋白質(zhì)，肽與二肽；甘氨酸均二肽甘氨酸-甘氨酸(Gly-Gly)；減少的谷胱甘肽；地奧司明；普普若加林(pupurogalin)；五倍子酸及其衍生物，包括但不限制于丙基五倍子酸；，硫化甲醛鈉與水飛薊素。
本說明書中所使用的術(shù)語“溶劑殘留量”指單克隆免疫球蛋白制劑中的自由液體(freely-available liquid)含量。自由液體是指存在于單克隆免疫球蛋白制劑中，但是不與單克隆免疫球蛋白制劑中的某種或更多種非液體成分結(jié)合或復(fù)合的水或有機(jī)溶劑(如乙醇、異丙醇、聚乙二醇，等等)液體。自由液體包括細(xì)胞內(nèi)水分。本說明書所引用的溶劑殘留量是指采用經(jīng)美國食品及藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的，經(jīng)過修正的卡爾-費(fèi)歇爾法(Karl Fischer method)測定的含量(梅爾(Meyer)和博伊德(Boyd)，《化學(xué)分析》(Analytical Chem.)，31，215-219，1959；梅(May)等人，《化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化》(Biol.Standardization)，10，249-259，1982；FDA生物制品鑒定和研究中心，備審案件號89D-0140，83-93；1990)。根據(jù)縮使用的溶劑，可通過本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已知的方法確定其它溶劑的殘留水平。也可將殘留溶劑與溶質(zhì)的比例視為反映了該溶劑內(nèi)的該溶質(zhì)的濃度。當(dāng)這樣表達(dá)時，溶質(zhì)濃度越高，殘留溶劑量越低。
本說明書中所使用的術(shù)語“敏化劑”指一種能夠選擇性地針對病毒、細(xì)菌、蛋白病毒和/或寄生蟲污染物的物質(zhì)，使其對輻射去活化更加敏感，因而與不添加敏化劑的情況相比，可以采用較低的輻射率和/或較短的照射時間。適當(dāng)?shù)拿艋瘎┌ǎ粌H限于以下幾種補(bǔ)骨脂素及其衍生物和類似物(包括3碳乙氧基補(bǔ)骨脂素(3-carboethoxypsoralens)；白芷素、凱林(khelins)和含有鹵代物和半水溶物(watersolubilization moiety)的香豆素，如四價銨離子或磷離子；核酸結(jié)合化合物；溴化血卟啉；鄰-二苯；羥基茜草素；卟啉(porphorin)；二聚血卟啉酯衍生物的鹵代物或金屬代物、二聚血卟啉衍生物、苯卟啉衍生物、氫化二苯卟啉(hydrodibenzoporphyrin)二順丁烯二酰亞胺、氫化二苯卟啉、二氰化二磺(dicyano disulfone)、四乙酸二苯卟啉，和四乙酸二苯卟啉三丙酸氨基化合物；可用鹵素或金屬原子改良的阿霉素和道諾霉素；紡錘菌素；BD肽、S2肽；S-303(ALE化合物)；染料，如金絲桃素、亞甲基藍(lán)、四溴熒光素、熒光素(及其衍生物)，黃素、部花青540；感光化合物，如佛手柑內(nèi)酯；和SE肽。
本說明書中所使用的術(shù)語“輻射”指具有足夠能量將被照射單克隆免疫球蛋白的至少一些組分滅菌的輻射。輻射類型包括，但不僅限于以下幾種(i)粒子輻射(亞原子粒子流，如中子、電子、和/或質(zhì)子流)；(ii)電磁輻射(從不同的電磁場中產(chǎn)生，如無線電波、可見光(單色與多色)和不可見光、紫外線、X射線和γ射線以及其混合物)。我們經(jīng)常將該種輻射稱為電離(能夠在被照射材料上產(chǎn)生離子)輻射，如γ射線，以及非電離輻射，如可見光。該種輻射的來源可以變換，但一般而言，只要在一適當(dāng)時間與一適當(dāng)比率來產(chǎn)生滅菌效果，具體來源的材料區(qū)別很小。在實際應(yīng)用中，γ輻射通常是由鈷與銫的同位素產(chǎn)生，而X射線由發(fā)射X輻射的機(jī)器產(chǎn)生，且在被稱為“電子束”輻射的方法中，通常使用一電子來將材料滅菌，其涉及通過一機(jī)器進(jìn)行生產(chǎn)。
B.特別優(yōu)選實施例本發(fā)明的第一優(yōu)選實施例為一種用于滅菌對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白制劑的方法，其步驟包括(i)將單克隆免疫球蛋白中的溶劑殘留量減低到足以有效保護(hù)該單克隆免疫球蛋白制劑抵御輻射的水平；以及(ii)按有效比率用射線對單克隆免疫球蛋白制劑照射一段有效時間，使單克隆免疫球蛋白制劑得到滅菌。
本發(fā)明的第二實施例是一種用于滅菌對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白制劑的方法，其包括(i)向生物材料中添加至少一種穩(wěn)定劑，其劑量應(yīng)足以有效保護(hù)單克隆免疫球蛋白制劑抵御輻射；和(ii)按有效比率用射線對單克隆免疫球蛋白制劑照射一段有效時間，使單克隆免疫球蛋白制劑得到滅菌。
本發(fā)明的第三實施例是一種用于滅菌對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白制劑的方法，其包括(i)將生物材料的溶劑殘留量減低到足以有效保護(hù)單克隆免疫球蛋白制劑抵御輻射的水平；(ii)向生物材料中添加至少一種穩(wěn)定劑，其劑量應(yīng)足以有效保護(hù)單克隆免疫球蛋白制劑抵御輻射；和(iii)按有效比率用射線對單克隆免疫球蛋白制劑照射一段有效時間，使其得到滅菌。在本實施例中，步驟(i)和(ii)可互相顛倒。
依照本發(fā)明的方法，在用輻射對單克隆免疫球蛋白制劑進(jìn)行照射之前，應(yīng)降低單克隆免疫球蛋白制劑的溶劑殘留量。溶劑殘留量應(yīng)降低到足以保護(hù)單克隆免疫球蛋白制劑抵御輻射的水平。溶劑殘留量的適當(dāng)水平取決于接受照射的特定單克隆免疫球蛋白制劑的性質(zhì)和特點，也可由所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗確定。優(yōu)選情況為，當(dāng)溶劑是水時，溶劑殘留量應(yīng)低于約2.0％，低于1.0％更好，低于0.5％更好，最好是低于0.2％。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可通過熟悉此技術(shù)領(lǐng)域者所熟悉的一種方法可將該待滅菌單克隆球蛋白固定于一固體表面。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可將照射比率優(yōu)化以產(chǎn)生制品回復(fù)與完成操作所需時間的最有利組合。通過此處所說明的方法的適當(dāng)應(yīng)用，可達(dá)到低比率(小于等于3kGy/小時)與高比率(大于等于3kGy/小時)。
盡管不希望與任何操作性理論結(jié)合，但是人們公認(rèn)降低溶劑殘留量可降低單克隆免疫球蛋白制劑的自由度，因而保護(hù)其抵御電離性輻射的影響。通過將單克隆免疫球蛋白制劑的溫度降低到其低共熔點或凝固點以下來降低單克隆免疫球蛋白制劑的自由度可獲得相似結(jié)果。這些結(jié)果允許采用更高的照射率。因此，此處所說明餓方法可在任何不會導(dǎo)致?lián)p害該單克隆免疫球蛋白的溫度下進(jìn)行。
可采用所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方法和技術(shù)來降低單克隆免疫球蛋白制劑中的溶劑殘留量，從而將溶劑從單克隆免疫球蛋白制劑中去除。該方法可包括，但不限制于蒸發(fā)、濃縮、離心濃縮、玻璃化與噴濺干燥。降低單克隆免疫球蛋白制劑的溶劑殘留量的一種特別優(yōu)選方法是凍干法。根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選實施例，可將生物材料在照射之前儲存在真空或惰性空氣中(惰性氣體優(yōu)選，如氦或氬，高分子重量惰性氣體更佳，最好是氬)進(jìn)行凍干。
本發(fā)明中所采用的輻射可以是任何能夠?qū)⑿杼幚淼膯慰寺∶庖咔虻鞍字苿┲械囊环N或更多種生物污染物有效去活化的輻射。該輻射可為微粒子輻射，包括e電波輻射。優(yōu)選的輻射為電磁輻射，包括可見光、UV光與電磁輻射的各種波長的混合物，且特別優(yōu)選的輻射形式是γ輻射。
根據(jù)本發(fā)明的方法，用輻射照射單克隆免疫球蛋白制劑的比率應(yīng)足以將單克隆免疫球蛋白制劑的一種或更多種生物污染物有效去活化。適當(dāng)?shù)恼丈浔嚷嗜Q于輻射的特定形式以及被照射的特定單克隆免疫球蛋白制劑和被去活化的特定生物污染物的性質(zhì)和特點。適當(dāng)?shù)恼丈浔嚷室部捎伤鶎偌夹g(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗確定。在滅菌程序持續(xù)過程中，照射比率最好保持不變。當(dāng)這無法實行時，可利用一可變或間斷輻射。
根據(jù)本發(fā)明的一個特別優(yōu)選實施例，照射的比率不應(yīng)超過約3.0KGy/小時，在約0.1kGy/小時和3.0kGy/小時之間優(yōu)選，在約0.25kGy/小時和2.0kGy/小時之間更佳，在約0.5kGy/小時和1.5kGy/小時之間更佳，在約0.5kGy和1.0kGy/小時之間最佳。
根據(jù)本發(fā)明的另一特別優(yōu)選實施例，照射比率至少為約3.0kGy/小時，至少為約6kGy/小時優(yōu)選，至少為約16kGy/小時更佳，至少為約30kgy/小時更加，至少為約45kgy/小時或以上最佳。
用輻射照射單克隆免疫球蛋白制劑一段時間，使單克隆免疫球蛋白制劑中的一種或更多種生物污染物有效地去活化。與照射比率相結(jié)合，適當(dāng)?shù)恼丈鋾r間導(dǎo)致應(yīng)用于該單克隆免疫球蛋白的照射的適當(dāng)劑量。適當(dāng)?shù)碾婋x時間取決于輻射的特定形式和比率，以及被照射的特定生物材料和被去活化的特定生物污染物的性質(zhì)和特征。適當(dāng)?shù)碾婋x時間還可由所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗確定。
在用輻射照射單克隆免疫球蛋白制劑之前，可選擇向單克隆免疫球蛋白制劑中添加至少一種有效劑量的敏化劑，以增強(qiáng)該照射的抗微生物效果，同時使用此處所說明的方法將照射對單克隆免疫球蛋白的有害效果最小化。適當(dāng)?shù)拿艋瘎樗鶎偌夹g(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的敏化劑。
依照本發(fā)明的方法，對單克隆免疫球蛋白制劑進(jìn)行照射可在任何對需處理的單克隆免疫球蛋白制劑無害的溫度下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，在環(huán)境溫度下照射單克隆免疫球蛋白制劑。根據(jù)本發(fā)明的一個替代優(yōu)選實施例，在對比溫度下，最好在單克隆免疫球蛋白制劑的凝固點或低共熔點或更低的溫度下照射單克隆免疫球蛋白制劑。
為了避免該單克隆免疫球蛋白的退化，單克隆免疫球蛋白制劑的pH值小于7，優(yōu)選為小于6，更佳為小于5，更佳為小于4，且最佳為小于3。
應(yīng)當(dāng)理解，可將此處所說明的若干方法組合使用以進(jìn)一步將輻射對單克隆免疫球蛋白的有害效果最小化，同時維持該輻射過程的抗微生物屬性的充分效力。
C.實施例以下實施例用來說明，而并非限制本發(fā)明。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作各種修正和改進(jìn)。除非另有說明，所有輻射均使用一60Co來源實現(xiàn)。
例13在本實驗中，我們通過將凍干抗胰島素單克隆免疫球蛋白暴露于45kGy的低劑量γ輻射來評估某些穩(wěn)定劑的保護(hù)效果。測試的穩(wěn)定劑為抗壞血酸鈉、蛋氨酸和硫辛酸。
方法在2ml玻璃小試管中，將總?cè)莘e為0.5ml，含有50μg抗胰島素單克隆免疫球蛋白5mg牛血清白蛋白(1％)和無穩(wěn)定劑或50mM穩(wěn)定劑的試樣凍干。在真空狀態(tài)中將試樣塞緊。用γ射線照射試樣(總劑量45kGy，比率1.83kGy/小時，溫度4℃)，然后用水重組。
用標(biāo)準(zhǔn)ELISA協(xié)議測定獨(dú)立副樣的抗體結(jié)合活性96孔微滴定板，用2.5μg/ml的胰島素抗原覆蓋一夜。采用從5μg/ml開始的抗胰島素單克隆免疫球蛋白試樣的三重連續(xù)稀釋液。使用50ng/ml的與磷酸酶共軛的山羊抗小鼠Ig。在DEA緩沖液中使用1mg/ml的∑104堿性磷酸酶基質(zhì)。通過405-620nm的吸收率測定結(jié)合活性。
通過估算接受照射的試樣的滴定曲線相對于未接受照射試樣的位移(即觀察到同樣結(jié)合量所需的免疫球蛋白濃縮)來測定相對保護(hù)作用，未接受照射試樣處于未接受照射試樣的最大吸收率標(biāo)志的約50％處。
結(jié)果不含穩(wěn)定劑的凍干試樣在經(jīng)受45kGy的γ照射后保持50％的免疫球蛋白活動性。這一結(jié)果與先前45kGyγ照射幾乎破壞了在溶液中接受照射的免疫球蛋白的全部活性的結(jié)果形成了對照。因此，顯而易見，通過凍干減少殘留水分可非常有效地保護(hù)該單克隆免疫球蛋白。
添加抗壞血酸鈉使試樣在接受照射之后能夠完全恢復(fù)其活性。經(jīng)過與未接受照射的試樣相比可以發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸和硫辛酸也能充分恢復(fù)活性(76-83％)。實驗結(jié)果如圖1和2所示。使用普普羅加林(pupurogalin)可得到相似結(jié)果(65％的恢復(fù)活性)(數(shù)據(jù)未顯示)。
例2在本實驗中，我們通過將凍干抗胰島素單克隆免疫球蛋白暴露于45kGy的低劑量γ輻射來評估某些穩(wěn)定劑的保護(hù)效果。測試的穩(wěn)定劑為抗壞血酸鈉、N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽以及尿酸/trolox混合物和抗壞血酸/尿酸/trolox混合物。
方法在3ml玻璃小試管中，將總?cè)莘e為1.0ml，含有100μg抗胰島素單克隆免疫球蛋白、10mg牛血清白蛋白(1％)和無穩(wěn)定劑或穩(wěn)定劑的試樣凍干。在真空狀態(tài)中將試樣塞緊。用γ射線照射試樣(總劑量45kGy，比率1.83kGy/小時，溫度4℃)，然后用1.0ml水重組。
用標(biāo)準(zhǔn)ELISA協(xié)議測定獨(dú)立副樣的球蛋白結(jié)合活性96孔Maxisorb滴定板，用2.5μg/ml的胰島素抗原覆蓋一夜。采用從5μg/ml開始的抗胰島素單克隆免疫球蛋白試樣的三重連續(xù)稀釋液。使用50ng/ml的與磷酸酶共軛的山羊抗小鼠Ig。通過405-620nm的吸收率測定結(jié)合活性。
采用平行線分析軟件包(PLA 1.2，Stegmann Systemberatung)測定相對保護(hù)作用。
結(jié)果不含穩(wěn)定劑的凍干試樣在經(jīng)受45kGy的γ照射后保持70％的球蛋白活動性。這一結(jié)果不同于先前45kGyγ照射幾乎破壞了在溶液中接受照射的免疫球蛋白的全部活性的結(jié)果。因此，顯而易見，通過凍干減少殘留水分可非常有效地保護(hù)蛋白質(zhì)。
添加抗壞血酸鈉使試樣在接受照射之后使活性增加恢復(fù)20％，即照射之后，活動性恢復(fù)90％。其他穩(wěn)定劑恢復(fù)活性77-84％。實驗結(jié)果如圖3A-3C所示。
例3在本實驗中，我們測定首次凍干(制品中仍留有相對“高水分”)和首次與二次凍干的結(jié)合(使制品只含“低水分”)對單克隆免疫球蛋白敏感度的效果。
方法在3ml玻璃小試管中，將總?cè)莘e為1.0ml，含有100μg抗胰島素單克隆球蛋白(mAb)、10mg牛血清白蛋白(1％)和無穩(wěn)定劑或100mM穩(wěn)定劑的試樣凍干(使用首次凍干或首次與二次凍干的結(jié)合)。在真空狀態(tài)中將試樣塞緊。用γ射線照射試樣(總劑量45kGy，比率2.03到2.13kGy/小時之間，溫度4℃)，然后用1.0ml水重組。
用標(biāo)準(zhǔn)ELISA協(xié)議測定獨(dú)立副樣的免疫球蛋白結(jié)合活性Maxisorb滴定板，用2.5μg/ml的胰島素抗原覆蓋一夜。采用從5μg/ml開始的抗胰島素單克隆免疫球蛋白試樣的三重連續(xù)稀釋液。使用50ng/ml的與磷酸酶共軛的山羊抗小鼠Ig。通過405-620nm的吸收率測定結(jié)合活性。
結(jié)果不添加穩(wěn)定劑時，已經(jīng)經(jīng)過二次“低水分”干燥期的抗胰島素免疫球蛋白在照射之后的恢復(fù)度更好，即在不添加穩(wěn)定劑的情況下，較低的總水分含量可改善恢復(fù)度。
然而，在添加穩(wěn)定劑時，球蛋白在經(jīng)過45kGy照射后具有非常好的恢復(fù)度，無論是僅經(jīng)過首次“高水分”干燥期的試樣還是經(jīng)過了二次“低水分”干燥期的試樣。
本實驗的結(jié)果如圖4與圖5所示。
例4在本實驗中，我們某些穩(wěn)定劑對凍干抗胰島素單克隆免疫球蛋白的活性的保護(hù)效果。測試的穩(wěn)定劑為抗壞血酸鈉、trolox/抗壞血酸/尿酸混合物、N-乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽。
方法凍干，并在真空狀態(tài)下塞緊添加了1％人類血清白蛋白(以及5％蔗糖，可選)的抗胰島素單克隆免疫球蛋白，然后照射試樣(總劑量45kGy，比率1.83到1.88kGy/小時之間)采用上述的標(biāo)準(zhǔn)ELISA協(xié)議測定球蛋白結(jié)合活性。
結(jié)果以45kGy的劑量照射添加了1％HSA的抗胰島素單克隆免疫球蛋白導(dǎo)致其活動性平均損失約33％。添加下列穩(wěn)定劑可明顯改善恢復(fù)度20mM抗壞血酸鈉(恢復(fù)度100％)；200μMtrolox/1.5mM尿酸/20mM抗壞血酸(恢復(fù)度87％)；20mM N-乙酰基-半胱氨酸(恢復(fù)度82％)。以45kGy的劑量照射添加了1％蔗糖的含有1％HSA的抗胰島素單克隆免疫球蛋白導(dǎo)致其活動性平均損失約30％。添加下列穩(wěn)定劑可明顯改善恢復(fù)度20mM抗壞血酸鈉(恢復(fù)度88％)；200μM trolox/1.5mM尿酸/20mM抗壞血酸(恢復(fù)度84％)；20mM N-乙?；?半胱氨酸(恢復(fù)度72％)。
這些實驗的結(jié)果如圖6-11所示。
例5在本實驗中，我們測定當(dāng)試樣經(jīng)受高比率(30kGy/小時)照射時，穩(wěn)定劑(抗壞血酸)對凍干抗胰島素單克隆免疫球蛋白的活性的保護(hù)效果。
方法凍干抗胰島素單克隆免疫球蛋白，并以的30kGy/小時的比率對其進(jìn)行照射(總劑量45kGy)。采用上述的標(biāo)準(zhǔn)ELISA協(xié)議測定免疫球蛋白結(jié)合活性。
結(jié)果以45kGy的劑量照射凍干抗胰島素單克隆免疫球蛋白導(dǎo)致其活動性平均損失約32％。添加20mM抗壞血酸鈉可將活性恢復(fù)到未照射試樣的85％。本實驗的結(jié)果如圖15所示。
例6在本實驗中，我們以低比率照射添加或不添加穩(wěn)定劑的特別用于鼠IgG3的IgM單克隆免疫球蛋白。
方法照射液體抗鼠IgG3單克隆IgM(在含10mM疊氮化鈉的PBS緩沖液中；抗體濃度為666μg/μl)，比率1.8kGy/小時，總劑量為10kGy或45kGy。試樣不含穩(wěn)定劑，或者含有包括20mM檸檬酸、300μM尿酸和200mM抗壞血酸的穩(wěn)定劑混合物。
使用鼠IgG3作為覆蓋抗原，以及與磷酸酶共軛的抗白鼠IgM檢驗抗體，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)ELISA協(xié)議分析免疫球蛋白活性。
結(jié)果在接受總劑量為10kGy或45kGy的γ照射后，不含穩(wěn)定劑的液體試樣喪失了所有功能性免疫球蛋白活性。但是，如果添加穩(wěn)定劑混合物，接受10kGyγ照射后，活性可完全恢復(fù)，接受45kGyγ照射后，活性恢復(fù)88％。本實驗的結(jié)果圖13所示。
例7在本實驗中，使用固定的抗人類胰島素單克隆免疫球蛋白，使其暴露至45kGy的低劑量γ照射后，將測定特定穩(wěn)定劑的保護(hù)效果。受檢測穩(wěn)定劑為抗壞血酸鈉、降低的谷胱甘肽、硫化甲醛鈉、與聚丙二醇。
方法于4℃在覆蓋緩沖中將兩培養(yǎng)板用100μl/井的新制備的2μg/毫升抗胰島素免疫球蛋白覆蓋過夜。用PBS將該培養(yǎng)板簡單沖洗三次。制備PBS中的各穩(wěn)定劑的一兩重連續(xù)稀釋液。向各井加入100μl選定的穩(wěn)定劑。將該板緊緊用一蓋墊覆蓋。于將4℃一塊板以1.92kGy/小時總共照射45kGy。該控制板接受了0kGy且將其在4℃儲存。
用一標(biāo)準(zhǔn)ELISA協(xié)議確定免疫球蛋白結(jié)合活性。將該板井清空并用一整個容積的PBS清洗4次。將整個容積的阻塞緩沖(約380μl)加入所有井中，并在37℃培育兩個小時。將所有井用一整個容積的TBST(TBSpH 7.4并具有0.05％TWEEN 20)清洗4次。將一百μl的在結(jié)合緩沖中的59ng/毫升生物素標(biāo)簽的胰島素加入各個井。用一板封條將該板覆蓋，并在37℃培育1.5小時并不斷搖晃(實驗室濃度測定搖晃器設(shè)置為3)。將井用TBST清洗4次。將一百μl的在結(jié)合緩沖中的0.5μg/毫升磷酸酶標(biāo)簽鏈霉胍加入各個井。用一板封條將該板覆蓋，并在37℃培育一小時并不斷搖晃。隨后將井用TBST清洗4次。將一百μ1的在DEA緩沖中的0.1克/毫升∑104磷酸酶基板加入各個井。隨后在37℃將該板培育一小時并不斷搖晃。每5分鐘間隔于405nm-628nm確定吸收率。
結(jié)果如圖14與15所示，抗壞血酸鈉顯示了一依賴劑量的效果。包括31-250mM之間的抗壞血酸鈉表現(xiàn)出73-81％的保留活性的增加。
包含谷胱甘肽的樣本體現(xiàn)出25％的單克隆免疫球蛋白活性保持力的增加，其取決于谷胱甘肽的濃度約為31mM。
用硫化甲醛鈉處理的樣本體現(xiàn)出在穩(wěn)定劑濃度為31mM的情況下，比控制樣本多出約50％的維持活性。
所有三種形式的聚丙二醇(意即，聚丙二醇P400(Fluka31250)；聚丙二醇P1200(Fluka81370)；以及聚丙二醇P2000(Fluka81380)體現(xiàn)出一保護(hù)效果。用聚丙二醇處理的樣本體現(xiàn)出比控制樣本多出約50-60％的活性保持力的增加。
例8在本實驗中，確定保護(hù)固定抗胰島素單克隆免疫球蛋白抵御45kGy的γ照射的抗壞血酸鈉的最佳濃度。同時還確定了1.5mM尿酸的存在是否對暴露至γ照射的固定單克隆免疫球蛋白的穩(wěn)定性是否有任何效果。
方法于4℃在覆蓋緩沖中將兩培養(yǎng)板用100μl/井的新制備的2μg/毫升抗胰島素免疫球蛋白覆蓋過夜。丟棄覆蓋溶液，并用PBS將該培養(yǎng)板簡單沖洗二次。將二十五μl的4X抗壞血酸鹽溶液加入適當(dāng)?shù)木小⑵呤濡蘬的水加入該無尿酸鹽的井中(a-d行)。將二十五μl的水加入包含尿酸鹽的井中(e-h行)將十五μl的3mM尿酸鹽加入該包含尿酸鹽的井中(e-h行)。將該板緊緊用一96-井蓋墊覆蓋。于4℃將一塊板以1.9kGy/小時總共照射45kGy。在4℃將另一控制板儲存作為一行動控制。
用一標(biāo)準(zhǔn)ELISA協(xié)議確定免疫球蛋白結(jié)合活性。將該板井清空并用一整個容積的PBS清洗兩次。通過將整個容積的阻塞緩沖(約380μl)加入所有井中，并在37℃培育兩個小時，使得不存在具體的結(jié)合點被阻塞。將所有井用TBST清洗三次。將一百μl的在結(jié)合緩沖中的10ng/毫升生物素標(biāo)簽的胰島素(在結(jié)合緩沖內(nèi)按照1∶100,000稀釋)加入各個井。用一板封條將該板覆蓋，并在37℃培育一小時并不斷搖晃(實驗室濃度測定搖晃器設(shè)置為三)。將井用TBST清洗，每套兩次，共四套，通常每套間隔五分鐘。將一百μl的在結(jié)合緩沖中的25ng/毫升磷酸酶標(biāo)簽鏈霉胍(在結(jié)合緩沖內(nèi)按照1∶20,000稀釋)加入各個井。用一板封條將該板覆蓋，并在37℃培育一小時并不斷搖晃。隨后將井用TBST清洗，每套兩次，共四套，通常每套間隔五分鐘。將一百μl的在DEA緩沖中的1ng/毫升∑104磷酸酶基板加入各個井。隨后在37℃將該板培育一小時并不斷搖晃。每5分鐘間隔于405nm-628nm確定吸收率。
結(jié)果我們確定，在一水性環(huán)境中(存在尿酸的情況下)，為固定抗胰島素單克隆免疫球蛋白提供最大保護(hù)所需要的抗壞血酸鈉的最佳濃度為150mM。在約150mM的抗壞血酸鹽濃度的情況下，所達(dá)到的抗胰島素結(jié)合活性的恢復(fù)約為50％。加入1.5mM的尿酸導(dǎo)致了抗壞血酸劑量曲線的略微左移(-5mM)，并顯示出以一較低濃度達(dá)到最大的活性回復(fù)。圖16A顯示了完整的數(shù)據(jù)套，且圖16B是確定這些值所使用的數(shù)據(jù)的關(guān)鍵區(qū)域的擴(kuò)展。
例9在本實驗中，確定保護(hù)固定抗胰島素單克隆免疫球蛋白抵御45kGy的γ照射的抗壞血酸鈉的最佳濃度。實驗還確定了2.25mM尿酸的存在是否會影響抗壞血酸鹽的穩(wěn)定效果穩(wěn)定性。
方法于4℃在覆蓋緩沖中將兩培養(yǎng)板用100μl/井的新制備的2.5μg/毫升抗胰島素免疫球蛋白覆蓋過夜。丟棄覆蓋溶液，并用PBS將該培養(yǎng)板簡單沖洗二次。將二十五μl的4X抗壞血酸鹽溶液加入適當(dāng)?shù)木?。將七十五μl的水加入該無尿酸鹽的井中(a-d行)。將七十五μl的尿酸鹽堆加入包含尿酸鹽的井中(e-h行)(f.c＝2.25mM)。將該板緊緊用一96-井蓋墊覆蓋。于4℃將一塊板以1.9kGy/小時總共照射45kGy。在4℃將另一控制板儲存作為一行動控制。
按照例8所述確定單克隆免疫球蛋白的結(jié)合活性。
結(jié)果如圖17A與17中所顯示，我們確定，在一水性環(huán)境中(存在尿酸的情況下)，為固定抗胰島素單克隆免疫球蛋白提供最大保護(hù)所需要的抗壞血酸鈉的最佳濃度為70mM。這與例8形成對比，例8顯示了抗壞血酸鈉的最佳濃度為150mM。在此例中達(dá)到了約100％的抗胰島素結(jié)合活性的回復(fù)，二在例8中知達(dá)到了約50％。在約150mM的抗壞血酸鹽濃度的情況下，所達(dá)到的抗胰島素結(jié)合活性的恢復(fù)約為50％。加入尿酸(2.5mM)再次導(dǎo)致了抗壞血酸劑量曲線的略微左移(-5mM)，并顯示出以一較低抗壞血酸鹽濃度(-25mM)達(dá)到最大的活性回復(fù)。我們發(fā)現(xiàn)，對于無尿酸的受照射樣本，其存在一雙相屬性。在0-20抗壞血酸鹽之間，回復(fù)率大大提高，在20-50mM的抗壞血酸鹽之間平穩(wěn)，隨后再次升高直至觀察到約為70mM的抗壞血酸鹽的最大恢復(fù)率。
例10在本實驗中，我們將評估各種穩(wěn)定劑對于受照射的由1％人類血清白蛋白(HSA)與5％蔗糖不中的凍干抗胰島素單克隆免疫球蛋白的保護(hù)效果。受測穩(wěn)定劑為抗(壞雪酸mM)；trolox(200mM)、尿酸(1.5mM)、與抗壞雪酸(20mM)的混合物；n-乙?；?1-半胱氨酸(20mM)；降低的谷胱甘肽(20mM)；與二肽，Gly-Gly(20mM)。
方法將樣本凍干約64小時，在真空下停止，并由鋁制折壓封條密封。在4℃以1.83-1.88kGy/小時的劑量率總共照射樣本45.1-46.2kGy。
用一標(biāo)準(zhǔn)ELISA協(xié)議確定單克隆免疫球蛋白結(jié)合活性。于4℃將Maxisorp板用人類重組細(xì)胞胰島素以2.5μg/毫升覆蓋過夜。在37℃用200μl的堵塞緩沖(PBS，pH7.4，2％BSA)將該板堵塞兩小時并用清洗緩沖(TBS，pH7，0.05％TWEEN20)清洗六此。將樣本重新懸浮在500μl的高純度水(100ng/μl)中，在一300μlU型底部的板中稀釋至5μg/毫升，用堵塞緩沖將該板覆蓋過夜活兩小時。執(zhí)行三重連續(xù)稀釋，最終濃度為0.0022μg/毫升。在37℃將板培育一個小時，并不斷攪動，然后用一清洗緩沖清洗6次。在結(jié)合緩沖中將磷酸酶標(biāo)簽山羊抗鼠IgG(H+L)稀釋至50ng/毫升，并將100μl加入各個井。并在37℃將板培育一個小時，在37℃培育一小時，并不斷攪動。然后用一清洗緩沖清洗6次。將一百μl的∑104基板(1克/毫升在DEA緩沖中)加入各個井，并在室溫下進(jìn)行反應(yīng)。減去620nM吸收率后，一MultiskanMCC/340上的板讀數(shù)為405nM。
如圖18A-18H中所顯示，用1％HSA補(bǔ)充的凍干抗胰島素單克隆免疫球蛋白，用γ將其照射至45kGy，導(dǎo)致了其活性平均降低1.5倍(親抗原性平均降低33％)。
在存在穩(wěn)定劑的情況下將樣本照射至45kGy會產(chǎn)生變化的結(jié)果20mM抗壞血酸鹽＝~100％回復(fù)200uM trolox，1.5mM尿酸鹽，20mM抗壞血酸鹽＝~87％回復(fù)
20mM降低的谷胱甘肽＝~76％回復(fù)20mM Gly-Gly＝~100％回復(fù)在將樣本照射至45kGy時，將5％的蔗糖加入包含1％HSA的凍干抗胰島素單克隆免疫球蛋白會導(dǎo)致樣本活性平均回復(fù)70％(活性平均降低約1.5倍或親抗原性平均降低30％)。
在存在前述穩(wěn)定劑的情況下，當(dāng)樣本被輻射至45kGy時，若加入了5％的蔗糖，則活性會降低20mM抗壞血酸鹽＝-88％回復(fù)200uM trolox，1.5mM尿酸鹽，20mM抗壞血酸鹽＝-84％回復(fù)20mM降低的谷胱甘肽＝-69％回復(fù)20mM Gly-Gly＝-79％回復(fù)將20mM抗壞血酸鹽，20mM Gly-Gly或加入20mM的抗壞血酸鹽與Gly-Gly加入具有不同特異性的另一單克隆IgG制備中(抗-Igλ光鏈)，會達(dá)到相似的結(jié)果。
例11在本實驗中，評估了抗壞血酸鹽(Asc，20mM)，抗壞血酸鹽(20mM)/尿酸鹽(1.5mM)/trolox(200uM)雞尾酒(AUT)、n-乙酰基-半胱氨酸(中性形式NAC-n，酸性形式NAC-a，都為20mM)，Gly-Gly(20mM)，降低的谷胱甘肽(GSH，20mM)，地奧司明(39.3uM)與水飛薊素(246uM)對凍干抗胰島素單克隆免疫球蛋白的保護(hù)效果。
方法在3ml玻璃小試管中，將總?cè)莘e為1.0ml，含有100μg抗胰島素單克隆免疫球蛋白，附帶有10克BSA(1％)以及/無相關(guān)穩(wěn)定劑的樣本凍干。在真空狀態(tài)中γ射線照射樣本(總劑量45kGy，劑量比率1.83kGy/小時之間，溫度4℃)，然后用1ml水重組。對不包含免疫球蛋白的四重樣本進(jìn)行卡爾·費(fèi)希爾濕度分析。
通過一標(biāo)準(zhǔn)ELISA協(xié)議確定獨(dú)立性獨(dú)立樣本的免疫球蛋白結(jié)合活性將Maxisorp板用2.5μg/毫升的胰島素抗原覆蓋過夜。在5μg/毫升時開始對該抗胰島素單克隆免疫球蛋白使用三重連續(xù)稀釋。在50克/毫升使用山羊抗鼠磷酸酶共軛。采用平行線分析軟件包(PLA1.2，Stegmann Systemberatung)計算與其相應(yīng)未受照射樣本相比受照射樣本的相對力量值。由賓夕法尼亞州Westchester的M-scan公司實施質(zhì)譜分析法。
如圖19A-19F所顯示，在存在1％牛血清白蛋白的情況下對凍干抗胰島素單克隆免疫球蛋白進(jìn)行照射會導(dǎo)致其固定抗原免疫球蛋白的親抗原性損失約30％(相對于未受照射的樣本)。單獨(dú)添加抗壞血酸鹽將回復(fù)改進(jìn)20％，使得在照射后約回復(fù)90％的親抗原性。添加抗壞血酸鹽/尿酸鹽/trolox雞尾酒/二肽甘氨酸Gly-Gly、中性n-乙酰基-半胱氨酸、降低的谷胱甘肽、或水飛薊素會導(dǎo)致親抗原性回復(fù)77-84％。
將200mM抗壞血酸鹽，200mM Gly-Gly或加入200mM的抗壞血酸鹽與Gly-Gly加入具有不同特異性的另兩個其他單克隆IgG制備中(抗-Igλ光鏈與抗IgG1)，會達(dá)到相似的結(jié)果。
例12在本實驗中，評估了在存在或不存在抗壞血酸鹽的情況下以液體形式受照射的抗胰島素單克隆免疫球蛋白抗壞血酸鹽的穩(wěn)定性。
方法將抗胰島素單克隆免疫球蛋白稀釋至1克/毫升，并在4℃時在存在或不存在200mM抗壞血酸鹽的情況下用γ射線照射至一總劑量為0，15，或45kGY的程度。
大體按照前一實例中所述通過一標(biāo)準(zhǔn)ELISA協(xié)議確定獨(dú)立性獨(dú)立樣本的免疫球蛋白結(jié)合活性。
結(jié)果如圖20A與20B所顯示，與室內(nèi)稀釋控制與0kGy加抗壞血酸鹽控制相比，加入200mM抗壞血酸鹽導(dǎo)致用15Kgvy的射線照射的樣本的免疫球蛋白結(jié)合活性回復(fù)100％，且導(dǎo)致用45Kgvy的射線照射的樣本的免疫球蛋白結(jié)合活性回復(fù)71.7％與80.4％。按照由聚丙烯酰胺凝膠電泳所確定，在不存在穩(wěn)定劑的情況下對抗胰島素免疫球蛋白的照射導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的退化，如在聚丙烯酰胺凝膠上的高分子重量帶所顯示。此外，顯然，材料大大損失了。加入200mM的抗壞血酸鹽對于在15kGy與45kGy受輻射的免疫球蛋白具有一保護(hù)性效果，如一完整IgG1帶與一重及輕鏈帶所顯示。
當(dāng)均分該15kGy加200mM抗壞血酸鹽的副本時，該抗原結(jié)合活性與該稀釋控制的結(jié)合活性并無顯著不同。與其相比，與室內(nèi)稀釋控制與槳料控制相比，將包含抗壞血酸的樣本照射至45kGy會導(dǎo)致親抗原性相應(yīng)平均降低2-與2.5-成。該SDS-PAGE分析表明在不存在抗壞血酸的情況下，照射該抗胰島素單克隆免疫球蛋白會導(dǎo)致材料大量損失，并產(chǎn)生一高分子重量退化。加入200mM抗壞血酸鹽能防止退化形成，并導(dǎo)致在照射至15Gy與45kGy后，該免疫球蛋白相應(yīng)回復(fù)約80％與約50％。
例13執(zhí)行本實驗以確定是否低pH值(4.5)會減少L-抗壞血酸對被用γ射線照射至45kGy的單克隆免疫球蛋白的穩(wěn)定效果。
方法于pH6.8與4.5時在存在與不存在200mM L-抗壞血酸的情況下將液體形式的抗胰島素單克隆Ig(抗人類胰島素單克隆免疫球蛋白，凈化的克隆#7F8；升華設(shè)計國際#E86102M，7125000組)以一1.774kGy/小時(60Co)的比率照射至一總劑量為45kGy。在照射后，在一ELISA測試重使用胰島素覆蓋板作為目標(biāo)測試分析樣本的抗原-特定結(jié)合能力。經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE電泳在降低與未降低條件下對Ig進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。
結(jié)果如圖21A與21B所顯示，該ELISA功能測試清晰的顯示出在存在抗壞血酸鹽的情況下，單克隆免疫球蛋白的回復(fù)并不取決于pH值。pH值6.8與4.5的圖表實際上是雙重的。加入抗壞血酸時并在照射之后，在兩個pH值中均可看到活性略微損失，然而此降低的程度與當(dāng)不存在抗壞血酸鹽的情況下進(jìn)行照射而導(dǎo)致的活性完全損失相比是很小的。
SDS-PAGE電泳凝膠顯示出在pH3.8與pH4.5的情況下，若不存在抗壞血酸，則在45kGy時該免疫球蛋白會完全被破壞。加入200mM的抗壞血酸在照射后維持了同樣透明的結(jié)構(gòu)。若pH值為4.5則可消除退化現(xiàn)象。
這些結(jié)果表明，在存在200mM抗壞血酸的情況下，可至少將單克隆Ig照射至45kGy，同時在pH值6.7與4.5保持結(jié)構(gòu)與活性。
例14在本實驗重，評估了在將一用豬細(xì)小病毒(PPV)感染的抗胰島素單克隆免疫球蛋白用60Coγ射線以約1.8kGy/小時的比率在4℃時進(jìn)行照射時濾過性毒菌滅活水平與單克隆免疫球蛋白活性保持力。
方法我們利用PPV作為人類細(xì)小病毒B19的一模型病毒，該病毒被人們視為在人類來源的生物物質(zhì)中所關(guān)注的最困難的非包絡(luò)病毒，它是細(xì)小病毒族其他成員的極其相似物，我們也將該其他細(xì)小病毒族成員視為動物來源的生物物質(zhì)中最困難的病毒。
將一高滴定率穿入一用于抵抗胰島素的單克隆免疫球蛋白的制備中。將一殺蟲劑，(抗壞血酸鈉鹽)加入一些樣本中，最終濃度為200mM。
在4℃時于1.8kGy/小時的大約比率將待照射樣本暴露至60Co輻射。
在照射一些樣本后，取出穿入樣本的整除部分并將其用于滴定剩余感染病毒粒子的數(shù)量。簡單而言，以一被成為細(xì)胞病理效應(yīng)測試(CPE)的濾過性毒菌檢測生物鑒定法來測試該樣本。一細(xì)胞系，其能被PPV病毒感染，并被其細(xì)胞溶解(豬腎細(xì)胞，也被成為PK-13細(xì)胞)，將該細(xì)胞系加入96-井測試板以形成一約70％匯合的單層。以一限制連續(xù)稀釋(5重稀釋)將樣本的四重整除部分加入該井。然后將板培育7-8添，并檢查以確定活細(xì)胞是否還存留在該井中。按卡伯(Karber)的說明使用一限制-稀釋方法分析所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，以確定該濾過性毒菌的滴定率，該結(jié)果在附圖中了有所顯示，為每毫升Log10TCID50滴定率。
結(jié)果如以下的表4與圖22所顯示，對γ射線的應(yīng)用以一依賴劑量的方式有效阻止了該病毒的活動。將200mM的抗壞血酸鈉鹽加入該單克隆免疫球蛋白導(dǎo)致了在較低劑量的濾過性毒菌滅活顯著降低，但在較高劑量時，此效果要小很多。將45kGy的γ射線應(yīng)用于包含抗壞血酸鹽的樣本導(dǎo)致4組以上的濾過性毒菌滅活。


例15執(zhí)行本實驗中以評估在存在或不存在抗壞血酸鈉鹽的情況下將液體與凍干形式的單克隆免疫球蛋白用e電波輻射照射時所達(dá)到的活性保持力水平方法測試液體的抗胰島素IgG1，并在凍干后也驚醒測試。準(zhǔn)備具有或不具有200與20mM抗壞血酸鈉鹽的樣本，樣本相應(yīng)為液體與凍干狀態(tài)。
在77-88°F時，以一大約為45kGy/小時的比率將待照射樣本(具有或不具有抗壞血酸鹽)暴露至e電波輻射。該e-電波能量為7MeV，且所給總劑量為約45kGy?？刂茦颖居晌词苷丈涞臉颖九c一參照控制樣本組成，該未受照射的樣本具有或不具有抗壞血酸鹽傳送至或來自該照射點，該參照控制樣本并不被傳送至該照射點。在傳輸過程中，將樣本保持在4℃。下表5顯示了樣本表5樣本

在照射之后，用蒸餾水重組該凍干樣本。然后按實例10中所說明的抗人類胰島素ELISA測試檢測所有的樣本。由于該濃度的Ig產(chǎn)生了最大OD的約50％，手動測量抗原結(jié)合活性的恢復(fù)情況。
入下表6中可見，當(dāng)處于液體狀態(tài)時，應(yīng)用e電波輻射能完全滅活該Ig。在存在抗壞血酸鹽的情況下，活性明顯回復(fù)，但回復(fù)程度有限。
在照射以前，將Ig凍干，這對于活性回復(fù)比單獨(dú)將抗壞血酸鹽加入液體要具有更大效果。當(dāng)將無抗壞血酸鹽的Ig照射時，約有50％的抗原結(jié)合活性回復(fù)。在凍干之前加入20mM抗壞血酸鹽導(dǎo)致活性完全回復(fù)。該ELISA的結(jié)果如圖23A與23B所顯示。
表6大約抗原結(jié)合活性

以上對本發(fā)明進(jìn)行了充分說明，應(yīng)當(dāng)理解在不脫離本發(fā)明的范圍及其任何實施例的情況下，所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員當(dāng)可在更廣或等同的條件、模式和其他參數(shù)范圍內(nèi)實施本發(fā)明。本說明書中所提及的所有專利或文獻(xiàn)均以引用方式完整并入本文中。所引用的任何文獻(xiàn)是未在其歸檔日期前的發(fā)表，且不應(yīng)當(dāng)將其視為承認(rèn)本發(fā)明不比先前發(fā)明的該文獻(xiàn)日期居前。
權(quán)利要求
1.一種用于將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白制劑滅菌的方法，該方法包括(i)將單克隆免疫球蛋白制劑的溶劑殘留量減低到足以有效保護(hù)所述單克隆免疫球蛋白制劑抵御所述輻射的水平；以及(ii)按有效比率用適當(dāng)射線對所述單克隆免疫球蛋白制劑照射一段使所述單克隆免疫球蛋白制劑得到有效滅菌的時間。
2.一種用于將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白制劑滅菌的方法，該方法包括(i)向單克隆免疫球蛋白制劑中添加至少一種穩(wěn)定劑，其劑量應(yīng)足以有效保護(hù)所述單克隆免疫球蛋白制劑抵御所述輻射；和(ii)按有效比率用適當(dāng)射線對單克隆免疫球蛋白制劑照射一段使所述單克隆免疫球蛋白制劑得到有效滅菌的時間。
3.一種用于將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白制劑滅菌的方法，該方法包括(i)向單克隆免疫球蛋白制劑中添加至少一種穩(wěn)定劑，其劑量應(yīng)足以有效保護(hù)所述單克隆免疫球蛋白制劑抵御所述輻射；和(ii)按低比率用適當(dāng)射線對單克隆免疫球蛋白制劑照射一段使所述生物材料得到有效滅菌的時間。
4.一種用于將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白制劑滅菌的方法，該方法包括(i)將生物材料的溶劑殘留量減低到足以有效保護(hù)所述單克隆免疫球蛋白制劑抵御所述輻射的水平；和(ii)按低比率用適當(dāng)射線對所述單克隆免疫球蛋白制劑照射一段使所述單克隆免疫球蛋白制劑得到有效滅菌的時間。
5.一種用于將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白制劑滅菌的方法，該方法包括(i)將單克隆免疫球蛋白制劑的溶劑殘留量減低到足以有效保護(hù)所述單克隆免疫球蛋白制劑抵御所述電離輻射的水平；(ii)向所述單克隆免疫球蛋白制劑中添加至少一種穩(wěn)定劑，其劑量應(yīng)足以有效保護(hù)所述單克隆免疫球蛋白制劑抵御所述輻射；和(iii)按有效比率用適當(dāng)射線對所述單克隆免疫球蛋白制劑照射一段有效時間，使所述單克隆免疫球蛋白制劑得到滅菌，其中步驟(i)和(ii)可按顛倒順序?qū)嵤?br> 6.一種用于將對輻射敏感的單克隆免疫球蛋白制劑滅菌的方法，該方法包括(i)將單克隆免疫球蛋白制劑的溶劑殘留量減低到足以有效保護(hù)所述單克隆免疫球蛋白制劑抵御所述電離輻射的水平；(ii)向所述單克隆免疫球蛋白制劑中添加至少一種穩(wěn)定劑，其劑量應(yīng)足以有效保護(hù)所述單克隆免疫球蛋白制劑抵御所述輻射；以及(iii)按低比率用適當(dāng)射線對所述單克隆免疫球蛋白制劑照射一段有效時間，使所述單克隆免疫球蛋白制劑得到滅菌，其中步驟(i)和(ii)可按顛倒順序?qū)嵤?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶劑為水。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述溶劑為水。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述溶劑為水。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述溶劑為水。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述殘留水量通過添加一種有機(jī)溶劑來減少。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述殘留水量通過添加一種有機(jī)溶劑來減少。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述殘留水量通過添加一種有機(jī)溶劑來減少。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述殘留水量通過添加一種有機(jī)溶劑來減少。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶劑為有機(jī)溶劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述溶劑為有機(jī)溶劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述溶劑為有機(jī)溶劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述溶劑為有機(jī)溶劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量后將該單克隆免疫球蛋白制劑懸浮于一有機(jī)溶劑中。
20.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量后將該單克隆免疫球蛋白制劑懸浮于一有機(jī)溶劑中。
21.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量后將該單克隆免疫球蛋白制劑懸浮于一有機(jī)溶劑中。
22.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量后將該單克隆免疫球蛋白制劑懸浮于一有機(jī)溶劑中。
23.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量后將該單克隆免疫球蛋白制劑懸浮于一有機(jī)溶劑中。
24.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量后將該單克隆免疫球蛋白制劑懸浮于一有機(jī)溶劑中。
25.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量后將該單克隆免疫球蛋白制劑懸浮于一有機(jī)溶劑中。
26.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量后將該單克隆免疫球蛋白制劑懸浮于一有機(jī)溶劑中。
27.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量后將該單克隆免疫球蛋白制劑懸浮于一有機(jī)溶劑中。
28.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量后將該單克隆免疫球蛋白制劑懸浮于一有機(jī)溶劑中。
29.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量后將該單克隆免疫球蛋白制劑懸浮于一有機(jī)溶劑中。
30.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量后將該單克隆免疫球蛋白制劑懸浮于一有機(jī)溶劑中。
31.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量后將該單克隆免疫球蛋白制劑懸浮于一有機(jī)溶劑中。
32.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量后將該單克隆免疫球蛋白制劑懸浮于一有機(jī)溶劑中。
33.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量后將該單克隆免疫球蛋白制劑懸浮于一有機(jī)溶劑中。
34.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中在減少該殘留溶劑量后將該單克隆免疫球蛋白制劑懸浮于一有機(jī)溶劑中。
35.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白制劑選自IgG與其片段、衍生物、及代謝物；IgM與其片段、衍生物、及代謝物；IgA與其片段、衍生物、及代謝物；IgD與其片段、衍生物、及代謝物；IgE與其片段、衍生物、及代謝物；以及其混合物。
36.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白是IgG或其片段或其衍生物或其代謝物。
37.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白是IgM或其片段或其衍生物或其代謝物。
38.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白是IgA或其片段或其衍生物或其代謝物。
39.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白是IgD或其片段或其衍生物或其代謝物。
40.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白是IgE或其片段或其衍生物或其代謝物。
41.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白包括選自以下的免疫球蛋白F(ab’)2、Fab’、Fab、Fc、Facb、pFc’、與Fd；或其衍生物與代謝物。
42.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該有效比率不得大于約3.0kGy/小時。
43.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該有效比率不得大于約2.0kGy/小時。
44.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該有效比率不得大于約1.0kGy/小時。
45.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該有效比率不得大于約0.3kGy/小時。
46.根據(jù)權(quán)利要求1、2或5的任何一項所述的方法，其中該有效比率大于約3.0kGy/小時。
47.根據(jù)權(quán)利要求1、2或5的任何一項所述的方法，其中該有效比率至少為約6.0kGy/小時。
48.根據(jù)權(quán)利要求1、2或5的任何一項所述的方法，其中該有效比率至少為約18.0kGy/小時。
49.根據(jù)權(quán)利要求1、2或5的任何一項所述的方法，其中該有效比率至少為約45kGy/小時。
50.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中在一低氧環(huán)境中維持該單克隆免疫球蛋白。
51.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中在一低氬環(huán)境中維持該單克隆免疫球蛋白。
52.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中在一真空環(huán)境中維持該單克隆免疫球蛋白。
53.根據(jù)權(quán)利要求1、4、5或6的任何一項所述的方法，其中通過選自以下方法的方法降低該殘留溶劑量凍干、干燥、濃縮、加入溶質(zhì)、蒸發(fā)、化學(xué)萃取、噴濺干燥、以及玻璃化。
54.根據(jù)權(quán)利要求1、4、5或6的任何一項所述的方法，其中該殘留溶劑量低于10％。
55.根據(jù)權(quán)利要求1、4、5或6的任何一項所述的方法，其中該殘留溶劑量低于5％。
56.根據(jù)權(quán)利要求1、4、5或6的任何一項所述的方法，其中該殘留溶劑量低于2％。
57.根據(jù)權(quán)利要求1、4、5或6的任何一項所述的方法，其中該殘留溶劑量低于1％。
58.根據(jù)權(quán)利要求1、4、5或6的任何一項所述的方法，其中該殘留溶劑量低于0.5％。
59.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中在進(jìn)行照射該單克隆免疫球蛋白制劑的步驟之前，將至少一個敏感器添加至該單克隆免疫球蛋白制劑中。
60.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白制劑包含至少一個蛋白病毒以作為生物污染物。
61.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白制劑包含至少一個病毒作為生物污染物。
62.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其中在進(jìn)行照射該單克隆免疫球蛋白制劑的步驟之前，至少將一個穩(wěn)定劑添加至該單克隆免疫球蛋白制劑。
63.根據(jù)權(quán)利要求2、3、5或6的任何一項所述的方法，其中至少一個該穩(wěn)定劑是抗氧化劑。
64.根據(jù)權(quán)利要求2、3、5或6的任何一項所述的方法，其中至少一個該穩(wěn)定劑是自由基凈化劑。
65.根據(jù)權(quán)利要求2、3、5或6的任何一項所述的方法，其中至少一個該穩(wěn)定劑由于其反應(yīng)氧氣特性而降低損壞。
66.根據(jù)權(quán)利要求2、3、5或6的任何一項所述的方法，其中至少一個穩(wěn)定劑選自抗壞血酸或其鹽或酯；谷胱甘肽；6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸；尿酸或其鹽或酯；甲硫氨酸；組氨酸；N-乙酰基半胱氨酸；硫辛酸；硫化甲醛鈉；五倍子酸或其衍生物；桔酸丙酯；以及該穩(wěn)定劑中兩種或多種的混合。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中該兩個或多個該穩(wěn)定劑的混合物選自抗壞血酸或其鹽或其酯與尿酸或其鹽或其酯的混合物，抗壞血酸或其鹽或其酯以及6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物；抗壞血酸或其鹽或酯、尿酸或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物；以及尿酸或其鹽或酯的混合物；硫辛酸；硫化甲醛鈉；五倍子酸或其衍生物；五倍子酸丙酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物。
68.根據(jù)權(quán)利要求2、3、5或6的任何一項所述的方法，其中至少一個該穩(wěn)定劑包含二肽甘氨酸-甘氨酸。
69.根據(jù)權(quán)利要求2、3、5或6的任何一項所述的方法，其中至少一個該穩(wěn)定劑包含地奧司明。
70.根據(jù)權(quán)利要求2、3、5或6的任何一項所述的方法，其中至少一個該穩(wěn)定劑包含水飛薊素。
71.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射為粒子輻射或電磁輻射或其混合物。
72.根據(jù)權(quán)利要求71的一項所述的方法，其中該電磁輻射選自無線電波、微電波、可見與不可見光，紫外線，X射線輻射，γ輻射與其組合。
73.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是γ輻射。
74.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是電子束。
75.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是可見光。
76.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是紫外線。
77.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是X射線輻射。
78.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是多色可見光。
79.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是一個或多個波長的可見光與紫外線的組合。
80.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是在環(huán)境溫度下執(zhí)行的。
81.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是在一低于該環(huán)境溫度的溫度下執(zhí)行的。
82.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是在單克隆免疫球蛋白的凝固點以下的溫度下執(zhí)行的。
83.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該輻射是在單克隆免疫球蛋白的共晶點以下的溫度下執(zhí)行的。
84.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白制劑的pH值小于7。
85.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白制劑的pH值小于6。
86.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白制劑的pH值小于5。
87.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白制劑的pH值小于4。
88.根據(jù)權(quán)利要求1-6的任何一項所述的方法，其中該單克隆免疫球蛋白制劑的pH值小于3。
89.一種組合物，其包括至少一個單克隆免疫球蛋白以及至少一個選自以下物質(zhì)的穩(wěn)定劑抗壞血酸或其鹽或酯；谷胱甘肽；6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸；尿酸或其鹽或酯；甲硫氨酸；組氨酸；N-乙酰基半胱氨酸；二肽甘氨酸-甘氨酸；水飛薊素；硫辛酸；硫化甲醛鈉；五倍子酸鹽或其衍生物；桔酸丙酯；抗壞血酸或其鹽或酯與尿酸或其鹽或酯的混合物；抗壞血酸或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物；抗壞血酸或其鹽或酯以及尿酸或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物，尿酸或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲苯丙二氫吡喃-2-羧酸的混合物，該至少一個穩(wěn)定劑的劑量能有效保持該單克隆免疫球蛋白使得在用輻射對該組合物進(jìn)行滅菌后能夠?qū)⑵浒茨康氖褂谩?br> 90.根據(jù)權(quán)利要求89所述的該組合物，其具有一殘留溶劑量，其低至足以在用照射對該組合物進(jìn)行消毒時保持該單克隆免疫球蛋白使得在用輻射對該組合物進(jìn)行滅菌后能夠?qū)⑵浒茨康氖褂谩?br> 91.根據(jù)權(quán)利要求89所述的該組合物，其具有一低于10％的殘留溶劑量。
92.根據(jù)權(quán)利要求89所述的該組合物，其具有一低于5％的殘留溶劑量。
93.根據(jù)權(quán)利要求89所述的該組合物，其具有一低于2％的殘留溶劑量。
94.根據(jù)權(quán)利要求89所述的該組合物，其具有一低于1％的殘留溶劑量。
95.根據(jù)權(quán)利要求89所述的該組合物，其具有一低于0.5％的殘留溶劑量。
96.根據(jù)權(quán)利要求89所述的該組合物，其具有一小于7的pH值。
97，根據(jù)權(quán)利要求89所述的該組合物，其具有一小于6的pH值。
96.根據(jù)權(quán)利要求89所述的該組合物，其具有一小于5的pH值。
97.根據(jù)權(quán)利要求89所述的該組合物，其具有一小于4的pH值。
98.根據(jù)權(quán)利要求89所述的該組合物，其具有一小于3的pH值。
全文摘要
提出對單克隆免疫球蛋白制劑進(jìn)行滅菌以減少其中的活性生物污染物，如病毒、細(xì)菌、酵母菌、霉菌、支原菌和寄生蟲含量的方法。
文檔編號A61K47/14GK1541110SQ02815742
公開日2004年10月27日 申請日期2002年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月14日
發(fā)明者T·格列布, W·H·伯吉斯, W·N·德羅安, R－Y·福格, M·J·麥克費(fèi), D·M·曼, A·麥克貝恩, ８, T 格列布, 伯吉斯, 吮炊, 德羅安, 曼, 麥克費(fèi) 申請人:科利昂特有限公司