專利名稱：新的神經(jīng)毒性的分子靶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)，遺傳學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明具體涉及檢測(cè)，鑒定和/或治療(或者控制)神經(jīng)退行性疾病，尤其是肌萎縮側(cè)索硬化癥的新方法。本發(fā)明同時(shí)涉及鑒定或者篩選對(duì)這些疾病有活性的化合物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于實(shí)施上述方法的化合物，基因，細(xì)胞，質(zhì)?；蛘呓M合物。本發(fā)明主要來自于鑒定磷酸二酯酶4B在這些疾病中的作用并且描述了磷酸二酯酶4B作為這些病癥中的靶或者治療、診斷或者試驗(yàn)標(biāo)記的應(yīng)用。
很多神經(jīng)退行性疾病被描述為具有與興奮毒性現(xiàn)象相關(guān)的組分或者階段。這種情形諸如阿默氏癥，帕金森癥，多發(fā)性硬化和亨汀頓舞蹈癥。
肌萎縮側(cè)索硬化癥(或者稱作ALS)是伴隨著不同類型的諸如路易士小體的包含體，并且特征在于脊髓和皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的細(xì)胞程序性死亡的神經(jīng)退行性疾病，所述皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡有時(shí)相關(guān)于額葉性癡呆癥。沒有突變記述的散發(fā)形式和與編碼超氧化物歧化酶的SOD1基因的突變相關(guān)的家族性形式(FALS)共存。大多數(shù)病例是散發(fā)的，家族性形式(FALS)非常少見。很可能是長(zhǎng)時(shí)間的無癥狀時(shí)期存在于臨床癥狀出現(xiàn)之前，這些臨床癥狀多變并難以分類。未來在治療上的發(fā)展將使得用基于疾病分子原因的治療策略代替癥狀性治療成為可能。在細(xì)胞水平，這些癥狀相關(guān)于皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡。這種神經(jīng)元的死亡已經(jīng)與不同的現(xiàn)象聯(lián)系起來，這些現(xiàn)象是多種神經(jīng)退行性疾病的基礎(chǔ)。諸如與谷氨酸，氧化應(yīng)激，針對(duì)神經(jīng)元標(biāo)記(在ALS情況下的鈣通道)的自身免疫，以及細(xì)胞骨架異常聯(lián)系起來的興奮毒性的情況。雖然這些現(xiàn)象是已知的，但是包括ALS的這些疾病的一個(gè)或者多個(gè)病因仍然不清楚。即使FALS相關(guān)于編碼超氧化物歧化酶的SOD1基因的突變，但是神經(jīng)元開始進(jìn)行細(xì)胞死亡的機(jī)制還是未知的，所述細(xì)胞死亡中至少一種是細(xì)胞程序性死亡。
闡述參與涉及細(xì)胞死亡的不同現(xiàn)象的分子事件將許可開發(fā)新的治療策略。利用人活體組織檢查樣本很難進(jìn)行這些事件的研究。這些活體組織檢查樣本顯然來自于死后樣品，這些樣本的質(zhì)量很難控制并且僅僅反應(yīng)疾病的最后階段出現(xiàn)的病理狀態(tài)。
動(dòng)物模型提供的生物樣品使得不同發(fā)病階段的分析和與健康對(duì)照的比較成為可能。就這一點(diǎn)來講，如果使用許可獲自西北大學(xué)(Northwestern University)，表達(dá)攜帶在FALS中普遍流行的一種突變(突變G93A)的人SOD1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠可獲自Jackson實(shí)驗(yàn)室。這個(gè)模型在120天內(nèi)重現(xiàn)具有類似于人類疾病的那些癥狀的疾病的致死結(jié)果。相關(guān)于SOD1基因的突變G93A的ALS癥狀的出現(xiàn)并非產(chǎn)生于超氧化物歧化酶活性的降低而是由于酶產(chǎn)生自由基能力的增強(qiáng)引起的。盡管擁有了這方面的認(rèn)識(shí)，控制ALS不同階段的分子事件依然知之甚少。這些分子事件的復(fù)雜性反應(yīng)了疾病的進(jìn)展在所研究的轉(zhuǎn)基因模型中，在30天沒有觀察到神經(jīng)元的異?；蛘吲R床表現(xiàn)。60天是癥狀出現(xiàn)不久之前的一個(gè)階段，但是大腦已經(jīng)具有細(xì)胞生理改變的特征，諸如線粒體代謝的改變，與興奮毒性現(xiàn)象相關(guān)的應(yīng)激和神經(jīng)元死亡。在90天，50％的皮層和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡并且伴隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活開始了神經(jīng)元細(xì)胞程序性死亡的活動(dòng)過程。在這個(gè)階段不再觀察到興奮毒性的現(xiàn)象。神經(jīng)元死亡與半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase)的激活相關(guān)，所述半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶的激活似乎沒有參與疾病的早期階段。
闡明特異于疾病不同階段的不同分子事件應(yīng)允許鑒定新的治療靶以及新的治療標(biāo)記。進(jìn)行這種鑒定的一種最有效的方法在于鑒定基因和蛋白，所述蛋白的表達(dá)表征了病理生理狀態(tài)。
本發(fā)明描述了鑒定參與興奮毒性現(xiàn)象和神經(jīng)元死亡的遺傳事件。因此，本發(fā)明給相關(guān)于這些現(xiàn)象的疾病提供了新的治療和診斷方法以及鑒定活性化合物的新的靶子。
更具體而言，對(duì)于提取自大腦和脊髓樣品的RNA已經(jīng)進(jìn)行了定性差異分析，沒有預(yù)先提取神經(jīng)元目的是考慮與疾病發(fā)展相關(guān)的最大程度的選擇性剪接事件。根據(jù)DATAS的方法(描述于申請(qǐng)WO99/46403中)通過定性差異篩選進(jìn)行分析，所述方法具有無與倫比的優(yōu)點(diǎn)。
本專利申請(qǐng)?zhí)貏e來自于申請(qǐng)人在60天齡ALS模型動(dòng)物的大腦中選擇性剪接的所有組成成分的構(gòu)建物。這種含有多于200個(gè)不同序列的所有組成成分包括興奮毒性現(xiàn)象中的主要參與成分，諸如鉀通道和NMDA受體。來自編碼參與應(yīng)激反應(yīng)的蛋白，包括熱激蛋白的RNA的序列也是所有組成成分的組成部分，強(qiáng)調(diào)了后面的應(yīng)激在ALS早期階段的作用。改變的能量代謝明顯表現(xiàn)出影響發(fā)生該種疾病的動(dòng)物的皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。例如，線粒體肌酸激酶的內(nèi)含子6特異性分離自60天齡的動(dòng)物在病理狀態(tài)下表達(dá)的信使RNA。通過保持這個(gè)內(nèi)含子中斷編碼序列產(chǎn)生編碼失活形式的酶的信使RNA。這個(gè)觀察結(jié)果與下列生化發(fā)現(xiàn)一致線粒體肌酸激酶活性的減少與這種酶的量在相同轉(zhuǎn)基因模型動(dòng)物的神經(jīng)元中的減少相關(guān)。
構(gòu)成所有組成成分的序列特異性通過下列事實(shí)得以證實(shí)在90天齡的動(dòng)物中，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行相同定性差異分析導(dǎo)致不同的所有組成成分，在所有組成成分中，尤其是缺乏興奮毒性的不同標(biāo)記。剪接修飾的分析證實(shí)疾病的階段不同，分子事件相異。
以特別有趣和意想不到的方式，對(duì)來自60天齡的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物的RNA進(jìn)行DATAS分析引起從來自磷酸二酯酶4B的mRNA分離cDNA片段。這種片段相應(yīng)于特異性存在于對(duì)照動(dòng)物中的外顯子片段，并因此在60天階段的SOD1G93A轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)特異性缺失。這種片段跨越從小鼠PDE48終止子編號(hào)的核苷酸377到486(SEQ IDNO1)(序列也可獲自GenBank，登錄號(hào)AF208023)。這個(gè)序列包括2912個(gè)堿基，缺失的片段相應(yīng)于堿基2760到2869。這是一個(gè)非編碼區(qū)并且在對(duì)照動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中差異表達(dá)，原因在于選擇性使用非編碼3’外顯子或者是使用兩種選擇性聚腺苷酸化位點(diǎn)。這種差異表達(dá)已經(jīng)通過示于圖1A和1B中的RT-PCR試驗(yàn)加以闡明。
因此，本申請(qǐng)闡述了磷酸二酯酶4B參與了興奮毒性過程的發(fā)展以及神經(jīng)元的死亡。獲得的結(jié)果表明PDE4B在病理性神經(jīng)組織中高水平表達(dá)，所述表達(dá)與相應(yīng)的RNA的結(jié)構(gòu)修飾有關(guān)，尤其是與在3’非編碼部分區(qū)域的缺失有關(guān)。這個(gè)結(jié)果與通過DATAS在序列中鑒定到的mRNA不穩(wěn)定序列完全一致。通過剪接或者通過使用選擇性聚腺苷酸化序列，它們?cè)赑DE4B mRNA中的缺失能夠引起穩(wěn)定化，從而提高這個(gè)RNA編碼部分的表達(dá)。這個(gè)事件特異性發(fā)生在病理受試者而非對(duì)照受試者的大腦中。
因此本發(fā)明描述了引起PDE4B mRNA在病理受試者大腦中表達(dá)提高的最初分子事件，并且所述原始分子事件隨著時(shí)間的推移相關(guān)于興奮毒性現(xiàn)象和/或神經(jīng)元的死亡。此外，本發(fā)明首次表明PDE4B表達(dá)的提高相關(guān)于ALS的早期階段。因此PDE4B是這些疾病的治療發(fā)展中的一個(gè)新的和重要的治療靶，尤其是用于這些疾病發(fā)展的早期階段，并且提出了疾病的真正分子基礎(chǔ)而非并發(fā)癥或者炎性組分。本發(fā)明也提供了診斷，篩選，檢測(cè)，確定這些疾病的趨勢(shì)或者監(jiān)控這些疾病的進(jìn)展或者治療效果的新方法。
檢測(cè)，診斷和篩選因此，本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供檢測(cè)受試者興奮毒性狀態(tài)或者神經(jīng)元應(yīng)激的方法，所述方法包括測(cè)定來自受試者的樣品中磷酸二酯酶4，尤其是磷酸二酯酶4B的體外表達(dá)。本方法優(yōu)選包括測(cè)定PDE4B基因的3’非編碼區(qū)和基因的其它區(qū)，尤其是編碼區(qū)的差異表達(dá)。
因此本發(fā)明的進(jìn)一步的目的就是提供檢測(cè)受試者興奮毒性狀態(tài)或者神經(jīng)元應(yīng)激的方法，包括檢測(cè)來自受試者樣品中的磷酸二酯酶4，尤其是磷酸二酯酶4B的突變RNA的存在，尤其是全部或者部分3’非編碼區(qū)缺失的形式。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是將包括所有或者部分來自PDE4B基因或者信使RNA的序列的核酸用于實(shí)施診斷或者檢測(cè)神經(jīng)元應(yīng)激的狀態(tài)以及更具體是興奮毒性狀態(tài)的方法。
本發(fā)明總體上基于使用互補(bǔ)于所有或者部分PDE4B基因或者信使的核酸用于檢測(cè)相關(guān)于興奮毒性，應(yīng)激，神經(jīng)元死亡等的病理事件。更一般而言，本發(fā)明提供了診斷，篩選，鑒定或者監(jiān)控退行性疾病的方法，包括闡明在PDE4基因中或者在相應(yīng)的RNA中，典型的在PDE4B中的改變。
PDE4的表達(dá)，或者差異表達(dá)，或者改變形式的存在可以通過傳統(tǒng)分子生物學(xué)的方法，諸如，例如測(cè)序，雜交，擴(kuò)增，RT-PCR，凝膠遷移等進(jìn)行確定。本發(fā)明可以應(yīng)用于診斷或者檢測(cè)不同的病理現(xiàn)象，包括興奮毒性現(xiàn)象，諸如，阿默氏癥，帕金森氏癥，多發(fā)性硬化，ALS，亨汀頓舞蹈癥或者腦局部缺血?？梢杂糜谠缙跈z測(cè)，以闡明傾向性，指導(dǎo)治療的選擇和適應(yīng)性，監(jiān)控疾病的進(jìn)展等等。尤其適于檢測(cè)早期階段的多發(fā)性硬化或者ALS。
為了實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的診斷或者檢測(cè)的遺傳方法，更優(yōu)選使用能夠闡明PDE4B mRNA的缺失形式，尤其是所有或者部分3’非編碼區(qū)缺失形式的核酸。特定的例子為使用互補(bǔ)于位于序列SEQ ID NO1的殘基2760到2869之間的所有或者部分區(qū)域的核酸，或者相應(yīng)的人PDE4B基因或者mRNA序列的殘基。編碼人PDE4B的cDNA序列和相應(yīng)的蛋白顯示在序列SEQ ID NO3和4(也可參見Genbank，登錄號(hào)NM 002600)中。人PDE4B基因或者RNA的3’非編碼區(qū)對(duì)應(yīng)于SEQID NO3的殘基2461到4068。
以有利的方式，使用的核酸(作為探針)包括所有或者部分編碼位于序列SEQ ID NO1的核苷酸2384到2869之間或者序列SEQ IDNO3的核苷酸2461和4068之間的PDE4B基因或者RNA的3’非編碼區(qū)的序列或者其互補(bǔ)序列。
根據(jù)具體的實(shí)施方案，本發(fā)明使用互補(bǔ)于位于下列的一種序列中的區(qū)域的核酸-SEQ ID NO1的殘基2384到2869-SEQ ID NO1的殘基2500到2869-SEQ ID NO1的殘基2760到2869-SEQ ID NO1的殘基2780到2850-SEQ ID NO1的殘基2790到2810-SEQ ID NO3的殘基2600到4040-SEQ ID NO3的殘基3000到4040-SEQ ID NO3的殘基3500到4040-SEQ ID NO3的殘基3900到4040在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用互補(bǔ)于缺失了所有或者部分3’非編碼部分產(chǎn)生的PDE4 RNA區(qū)域序列的核酸。區(qū)域的缺失實(shí)際上在序列中建立了新的連接，所述序列特異于缺失形式并且可被用于闡明這種形式在樣品中的存在。
優(yōu)選的，探針和靶序列之間的互補(bǔ)程度是完全的從而確保更加特異性的雜交。但是，應(yīng)該明白也可以允許一些錯(cuò)配。用于實(shí)施上述方法的核酸可以是DNA或者RNA，優(yōu)選為合成的DNA。優(yōu)選包括10到500個(gè)堿基，通常10到100個(gè)堿基。應(yīng)該理解如果需要，可以使用更長(zhǎng)的核酸，雖然這不是優(yōu)選的。核酸優(yōu)選為單鏈DNA，從10到500個(gè)堿基，至少互補(bǔ)于PDE4B的3’非編碼序列的區(qū)域。核酸可通過，例如放射性，酶，發(fā)光，熒光，化學(xué)方法等進(jìn)行標(biāo)記。
用于檢測(cè)PDE4基因中存在改變的另一方法使用可以選擇性擴(kuò)增部分PDE4 RNA的引物或者核酸引物對(duì)，優(yōu)選含有3’非編碼區(qū)的部分。通常使用允許選擇性擴(kuò)增PDE4 RNA改變形式的引物，尤其是通過缺失部分RNA 3’區(qū)建立的特異性連接的引物。
在這個(gè)方面，本發(fā)明的一個(gè)目的就是基于互補(bǔ)于PDE4B 3’非編碼區(qū)部分的引物，并且允許擴(kuò)增這個(gè)區(qū)的一部分。引物優(yōu)選包括8到20個(gè)堿基。引物優(yōu)選由位于SEQ ID NO1的核苷酸2384到2869之間或者序列SEQ ID NO3的核苷酸2461和4068之間序列的8到20個(gè)連續(xù)殘基的片段或者其互補(bǔ)序列組成。本發(fā)明的另一個(gè)目的就是提供允許對(duì)至少部分PDE4 3’非編碼區(qū)進(jìn)行特異性擴(kuò)增的引物對(duì)，所述引物對(duì)包括至少一個(gè)如上所述的引物。
為了實(shí)施本發(fā)明的方法，將來自受試者的含有核酸的生物樣品與諸如上述的核酸(探針，引物等等)體外接觸，并且檢測(cè)雜交體或者擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。生物樣品可以是血液，體液，細(xì)胞，組織等樣品。核酸可以固定在玻璃，二氧化硅，尼龍等載體上。
檢測(cè)，篩選或者診斷的過程可以通過使用來自受試者的不同類型的樣品，諸如，例如活體檢查組織，尤其是神經(jīng)組織進(jìn)行。以尤其令人驚訝和有利的方式，本發(fā)明進(jìn)一步顯示與興奮毒性現(xiàn)象相關(guān)的PDE4表達(dá)的去調(diào)節(jié)可直接在肌肉組織中加以闡明。這種情況在神經(jīng)退行性疾病諸如ALS的病例中尤其顯著。
在ALS的發(fā)展期間，退行性現(xiàn)象通過缺陷性神經(jīng)支配不僅發(fā)生在大腦中也發(fā)生在脊髓中并且隨之發(fā)生在肌肉中。圖2描述了來自對(duì)照小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉中PDE4B mRNA表達(dá)的修飾，通過利用與來自同樣這些動(dòng)物大腦的RNA進(jìn)行試驗(yàn)的相同的PCR引物進(jìn)行檢測(cè)。以類似的但是稍遜的方式，在癥狀出現(xiàn)之前階段的末期，即90天齡時(shí)，動(dòng)物的肌肉中特異性觀察到PDE4B的3’非編碼區(qū)而非這種mRNA的其它區(qū)域(尤其是編碼區(qū))表達(dá)的降低。
研究和治療ALS過程中遇到的一個(gè)困難就是建立早期診斷。觀察到PDE4B mRNA在ALS肌肉中去調(diào)節(jié)使得有可能從病人的活體檢查組織肌肉中建立早期診斷。這種診斷基于檢測(cè)PDE4B的3’非編碼區(qū)和其它的序列，尤其是編碼部分之間的差異表達(dá)。
用于檢測(cè)受試者神經(jīng)元應(yīng)激，顯著的興奮毒性，尤其是相關(guān)于神經(jīng)退行性疾病的狀態(tài)的特異性方法包括測(cè)定來自所述受試者肌肉細(xì)胞樣品中PDE4B基因的表達(dá)，或者PDE4B信使缺失形式的存在。
為了測(cè)定差異表達(dá)，人們使用例如相應(yīng)于(換言之，特異于)部分3’非編碼區(qū)的探針以及相應(yīng)于部分PDE4B編碼區(qū)的探針。用這些探針分別檢測(cè)的信號(hào)可以評(píng)估差異表達(dá)。另一方法使用允許一方面擴(kuò)增部分3’非編碼區(qū)而另一方面擴(kuò)增部分編碼區(qū)的兩對(duì)引物。
另一個(gè)目的是提供分析PDE4表達(dá)的試劑盒，尤其是3’非編碼區(qū)和編碼區(qū)之間差異表達(dá)的試劑盒，所述試劑盒包括特異于3’非編碼區(qū)部分序列的核苷酸探針和特異于編碼區(qū)部分序列的核苷酸探針。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于分析PDE4表達(dá)的試劑盒，尤其是3’非編碼區(qū)和編碼區(qū)之間差異表達(dá)的試劑盒，所述試劑盒包括一對(duì)允許特異性擴(kuò)增至少部分的PDE4的3’非編碼區(qū)的核苷酸引物以及一對(duì)允許特異性擴(kuò)增至少部分的PDE4編碼區(qū)的核苷酸引物。
治療磷酸二酯酶水解諸如cAMP和cGMP的環(huán)核酸，調(diào)節(jié)不同信號(hào)級(jí)聯(lián)。PDE4B水解cAMP，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)這種第二信使的濃度。cAMP在細(xì)胞存活和細(xì)胞程序性死亡平衡中的作用已被廣泛描述于文獻(xiàn)中。具體而言，cAMP級(jí)聯(lián)在包括例如Akt和P13K激酶的細(xì)胞存活級(jí)聯(lián)中以及在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子CREB的活性中具有綜合作用。值得提及的是這種轉(zhuǎn)錄因子參與神經(jīng)元存活和神經(jīng)突出的生長(zhǎng)。但是，PDE以及，優(yōu)選PDE4抑制劑的使用從未被設(shè)想用于提高神經(jīng)元的存活并且尤其是用于保護(hù)神經(jīng)元抗興奮毒性。已經(jīng)有人提出用于抑制炎性現(xiàn)象的PDE4抑制劑，可能在諸如阿默氏癥的神經(jīng)退行性疾病中是有用的。這種認(rèn)識(shí)是基于減少在神經(jīng)退行性活動(dòng)期間大腦中觀察到的炎癥的目的，并且完全不是基于直接抑制神經(jīng)元死亡的基本目的。
本發(fā)明闡述了相關(guān)于神經(jīng)元興奮毒性的進(jìn)展的剪接事件和影響PDE4B基因的選擇性聚腺苷酸化位點(diǎn)的存在，并且提供了證實(shí)使用PDE4抑制劑治療ALS更通常用于提高興奮毒性現(xiàn)象期間神經(jīng)元存活性，尤其是從這些疾病的早期階段開始的分子基礎(chǔ)。
因此本發(fā)明的另一個(gè)目的就是基于使用能夠抑制或者降低PDE4B表達(dá)或者活性的化合物，目的在于制備設(shè)計(jì)用來治療神經(jīng)退行性疾病，尤其是早期階段的神經(jīng)退行性疾病，更優(yōu)選用來降低與神經(jīng)退行性疾病，諸如ALS，阿默氏癥或者帕金森癥相關(guān)的早期神經(jīng)元興奮毒性的組合物。
一個(gè)特別的目的在于使用PDE4抑制劑用于制備設(shè)計(jì)用來治療ALS，尤其是用來降低患有ALS的受試者興奮毒性或者增加患有ALS的受試者的神經(jīng)元存活率的組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是使用能夠抑制(優(yōu)選以選擇的方式)序列SEQ ID NO2或者4的PDE4B的表達(dá)或者活性的化合物，目的在于制備設(shè)計(jì)用于降低神經(jīng)元興奮毒性的組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供治療與神經(jīng)元應(yīng)激相關(guān)的疾病，尤其是興奮毒性的方法，所述方法包括給受試者施用抑制PDE4B活性或者表達(dá)的化合物，優(yōu)選是選擇性抑制PDE4的化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是基于治療ALS的方法，尤其是用于提高患有ALS的受試者神經(jīng)元存活率的方法，所述方法包括給受試者施用PDE4抑制劑，優(yōu)選是一種選擇性抑制PDE4的化合物。
在本發(fā)明的上下文，術(shù)語“治療”是指預(yù)防，治愈，緩解治療，以及病人處理(減輕痛苦，提高生命期望值，減緩疾病的惡化)等等。治療可以連同其它藥物或者治療一起進(jìn)行，尤其是疾病的晚期階段，諸如半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶抑制劑或者其它的活性化合物。
使用的化合物可以是能夠抑制PDE4表達(dá)，尤其是PDE4B表達(dá)的任一化合物，也就是說，特別是抑制基因轉(zhuǎn)錄，RNA成熟加工，mRNA翻譯，翻譯后蛋白修飾等的任何化合物。所述化合物可以是抑制RNA修飾，尤其是3’非編碼區(qū)的部分缺失的化合物。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，化合物為能夠抑制PDE4B基因轉(zhuǎn)錄或者相應(yīng)的mRNA翻譯的反義核酸。反義核酸可以包括PDE4B基因的所有或者部分序列，其片段，PDE4B信使或者其互補(bǔ)序列。反義核酸可以主要包括互補(bǔ)于位于SEQ ID NO1的殘基218到2383之間或者SEQ ID NO3的殘基766到2460之間序列的區(qū)域，并且抑制(或者減少)其翻譯成蛋白。反義核酸可以為DNA，RNA，核酶等。它可以為單鏈或者雙鏈。它也可以是由反義基因編碼的RNA。如果它為反義寡核苷酸，通常含有少于100個(gè)堿基，例如從10到50個(gè)堿基。這種寡核苷酸可被修飾以提高其穩(wěn)定性，其對(duì)核酸酶的抗性，其進(jìn)入細(xì)胞的穿透性等。
根據(jù)其它的實(shí)施方案，化合物為肽，例如包括PDE4蛋白(尤其是PDE4B)的區(qū)域并且能夠拮抗其活性。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，化合物為天然或者合成來源的化合物，尤其是植物，細(xì)菌，病毒，動(dòng)物，真核生物，合成或者半合成來源，能夠調(diào)節(jié)PDE4B的表達(dá)或者活性的有機(jī)或者無機(jī)分子。
在一個(gè)優(yōu)選的變體中，化合物為抑制PDE4的合成化合物?？梢允褂貌煌愋偷囊种苿?。優(yōu)選為來自吡唑并吡啶家族的化合物，其中一個(gè)具體的例子為etazolate，或者來自黃嘌呤(或者2，6-二氧嘌呤)衍生物家族，尤其是包括己酮可可堿(pentoxifylline)的化合物。
來自吡唑并吡啶家族的化合物尤其選自下列化合物具有下式的etazolate 4-丁基氨基-1-乙基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯(tracazolate)，4-丁基氨基-1-乙基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(4-氨基-吡唑并[3，4-b]吡啶-1-基)-β-D-1-脫氧-呋喃核糖，1-乙基-4-(N’-異亞丙基-聯(lián)氨基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯(SQ 20009)，4-氨基-6-甲基-1-正戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶，4-氨基-1-乙基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯(去丁基tracazolate)，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-甲酰胺(carboxamide)，
1-乙基-6-甲基-4-甲基氨基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-6-甲基-1-丙基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-乙基-4-乙基氨基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-1-丁基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，5-(4-氨基-吡唑并[3，4-b]吡啶-1-基)-2-羥甲基-四氫呋喃-3-醇，1-烯丙基-4-氨基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸，4-氨基-1-乙基-3，6-二甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-二甲基氨基-1-乙基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-乙基-6-甲基-4-丙基氨基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-4-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-1-丁-3-烯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-烯丙酰胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-異丙酰胺，4-氨基-1-戊基-N-正丙基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-甲酰胺，4-氨基-1-丁基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-丙-2-炔基酰胺，4-氨基-1-(3-甲基-丁基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并<3，4-b>吡啶-5-N-(2-丙烯基)甲酰胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-丁酰胺，4-氨基-1-丁-3-炔基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-丁-3-烯基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-烯丙酰胺，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-6-甲基-1-(3-甲基-丁基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，
4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸異丁酯，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-丁酰胺，4-氨基-6-甲基-1-(3-甲基-丁-2-烯基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-環(huán)丙酰胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-異羥肟酸乙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸丙-2-炔基酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-4-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-4-烯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-丙酰胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-環(huán)丙基甲基-酰胺，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸2-甲基烯丙酯，4-氨基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-烯丙酰胺(ICI190，622)，4-氨基-1-戊-4-炔基-N-2-丙烯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-甲酰胺，4-氨基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-丙-2-炔基酰胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-丁-2-炔基酰胺，4-氨基-6-甲基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-(2-環(huán)丙基-乙基)-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-己-5-炔基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-環(huán)丙基甲基-酰胺，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸丁-3-烯基酯，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸環(huán)丙基甲酯，4-丁基氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-烯丙酰胺，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸2-環(huán)丙基-乙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸環(huán)丙基甲酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-4-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸環(huán)丙基甲酯，4-氨基-1-芐基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-芐基酰胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-苯基酰胺，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸芐酯，4-疊氮基-1-β-D-呋喃核糖基吡唑并[3，4-b]吡啶，1-戊-3-炔基-N-2-丙烯基-4-丙酰胺基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-甲酰胺，2-(4-氨基-吡唑并[3，4-b]吡啶-1-基)-5-羥甲基-四氫-呋喃-3，4-二醇，2-(6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-乙醇，3-(6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-丙-1-醇，3-(6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-乙酸丙酯，2-(6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-丙酸乙酯，2-(6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-戊酸乙酯，2-(6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-苯甲酸乙酯，3-(6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-戊酸丙酯，N-苯亞甲基-N’-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，N-呋喃-2-基亞甲基-N’-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，N-(4-氟-苯亞甲基)-N’-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，
N-(3-呋喃-2-基-亞丙烯基)-N’-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，N-(4-甲氧基-苯亞甲基)-N’-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，4-[(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-亞肼甲基]-芐腈，N-苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯-5-基亞甲基-N’-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-N’-(4-硝基-苯亞甲基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-N’-(2-硝基-苯亞甲基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-N’-(4-三氟甲基-苯亞甲基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-N’-(5-硝基-呋喃-2-基亞甲基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-N’-(2-三氟甲基-苯亞甲基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-N’-(6-硝基-苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯-5-基亞甲基)-肼，4-(3-氯-4-甲氧基-芐基氨基)-1-乙基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸，4-(3-氯-4-甲氧基-芐基氨基)-1-乙基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-(吡啶-4-基甲基)-酰胺，4-(3-氯-4-甲氧基-芐基氨基)-1-乙基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-(四氫-呋喃-2-基甲基)-酰胺，4-(3-氯-4-甲氧基-芐基氨基)-1-乙基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-(5-羥基-戊基)-酰胺，4-(3-氯-4-甲氧基-芐基氨基)-1-乙基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-[3-(2-氧-吡咯烷-1-基)-丙基]-酰胺，4-叔-丁基氨基-1-(2-氯-2-苯基-乙基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(2-氯-2-苯基-乙基)-4-環(huán)丙基氨基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(2-氯-2-苯基-乙基)-4-丙基氨基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(2-氯-2-苯基-乙基)-4-苯基氨基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-丁基氨基-1-(2-氯-2-苯基-乙基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(2-氯-2-苯基-乙基)-4-(2-乙氧基-乙基氨基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-芐基氨基-1-(2-氯-2-苯基-乙基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(2-氯-2-苯基-乙基)-4-苯乙基氨基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，在黃嘌呤衍生物中，人們尤其使用(i)(ω-1)-羥烷基-二烷基黃嘌呤，其中(ω-1)-羥烷基含有5或者6個(gè)碳原子，并且在1或者7位，在其他7或者1位的烷基含有1到12個(gè)碳原子并且在3位的烷基含有1到4個(gè)碳原子，(ii)(ω-1)-氧烷基-二甲基黃嘌呤，其中(ω-1)-氧烷基含有5或者6個(gè)碳原子并且在1或者7位，或者(iii)具有含4到12個(gè)碳原子的烷基或者在1或者7位具有芐基的二甲基黃嘌呤的衍生物。
通常，氧烷基-二烷基黃嘌呤包括，例如1-(5-氧己基)-3，7-和7-(5-氧己基)-1，3-二甲基黃嘌呤。也可使用其他黃嘌呤，諸如尤其是在1或者7位用丁基，異戊基，己基，月桂基或者芐基取代的3，7-二甲基黃嘌呤和1，3-二甲基黃嘌呤，以及在(ω-1)-位用羥基或者氧基取代的這些化合物的類似物，例如1-(4-羥戊基)-和1-(5-羥己基)-3，7-二甲基黃嘌呤，7-(4-羥戊基)-和7-(5-羥己基)-1，3-二甲基黃嘌呤，1-(4-氧戊基)-和1-(5-氧己基)-，1-(2-甲基-3-氧丁基)-和1-(2-乙基-3-氧丁基)-3，7-二甲基黃嘌呤和相應(yīng)的在7位具有(ω-1)-羥烷基或者(ω-1)-氧烷基的1，3-二甲基化合物。上述羥烷基-二甲基黃嘌呤的類似物是那些在1或者7位沒有被羥烷基占據(jù)，具有除了甲基以外的2到12個(gè)碳原子的烷基，諸如，1-乙基-，1-丙基-，1-丁基-和1-異丁基-3-甲基-7-(5-羥己基)-黃嘌呤和7-乙基-，7-丙基-，7-丁基-和7-異丁基-1-(5-羥己基)-3-甲基黃嘌呤，和相應(yīng)的在位點(diǎn)上具有除了甲基以外的含有2到4個(gè)碳原子的烷基，諸如尤其是，乙基，正丙基，異丙基，異丁基或者正丁基的化合物。
在這些黃嘌呤衍生物中，人們尤其使用具有下式的己酮可可堿(Pentoxifylline) 因此，本發(fā)明首次提議PDE4B作為治療靶用于治療與興奮毒性相關(guān)的分子事件。根據(jù)具體的實(shí)施方案，本發(fā)明可被用于抑制或者降低神經(jīng)退行性疾病早期階段的神經(jīng)元的興奮毒性。尤其是應(yīng)用于治療阿默氏癥，帕金森氏癥，多發(fā)性硬化，ALS，亨汀頓舞蹈癥和腦局部缺血。
本發(fā)明的其它目的基于使用上述化合物，尤其是etazolate或者己酮可可堿用于治療ALS，以顯著降低ALS早期階段的神經(jīng)元興奮毒性，或者使用上述化合物，尤其是己酮可可堿或者etazolate用于制備設(shè)計(jì)用來抑制患有ALS的病人PDE4B活性的組合物。
本發(fā)明同時(shí)涉及治療ALS的方法，所述方法包括施用選擇性抑制序列SEQ ID NO2或者4的PDE4B的表達(dá)或者活性的化合物。優(yōu)選的，本發(fā)明的方法用于治療神經(jīng)退行性疾病的早期階段。
可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任一方法進(jìn)行給藥，優(yōu)選通過口服途徑或者通過注射，通常通過腹膜內(nèi)，腦內(nèi)，靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)或者肌內(nèi)的途徑給藥。優(yōu)選使用口服途徑給藥。給藥劑量可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所接受的劑量。通常，對(duì)于天然是化合物的抑制劑化合物而言，注射大約0.01mg到100mg/kg。對(duì)于核酸化合物而言，給藥劑量例如從大約0.01mg到100mg每劑量。應(yīng)該理解，可以進(jìn)行反復(fù)注射，有可能與其它活性制劑或者任一藥學(xué)上可接受的介質(zhì)(例如，在穩(wěn)定劑等存在下，緩沖液，等滲鹽溶液等)聯(lián)合使用。
本發(fā)明可用于哺乳動(dòng)物，尤其用于人類。實(shí)施例中列舉的結(jié)果顯示了PDE4B抑制劑對(duì)提高處于興奮毒性狀態(tài)的神經(jīng)元的存活率的效果。
可選擇的方法和手段本發(fā)明的其它目的涉及選擇，鑒定或者鑒別對(duì)與興奮毒性，或者神經(jīng)元應(yīng)激相關(guān)疾病有活性的化合物的方法，所述方法包括將化合物與表達(dá)PDE4B(尤其是缺乏3’非編碼區(qū)的變體)的細(xì)胞接觸，并且鑒定抑制這個(gè)蛋白表達(dá)或者活性的化合物。
所述方法可用于不同的細(xì)胞群，諸如哺乳動(dòng)物來源(人，鼠等等)的初級(jí)細(xì)胞或者細(xì)胞系。優(yōu)選的，使用不天然表達(dá)PDE4B，用編碼需要的變體的核酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。用這種方式，方法的可選擇性提高了。也可使用低等真核生物(酵母等)或者原核生物的細(xì)胞。
篩選方法也可通過測(cè)定試驗(yàn)化合物結(jié)合PDE4B或者其變體或者其片段的能力在無細(xì)胞系統(tǒng)中實(shí)施。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及如上所述的編碼多肽的任一核酸，含有核酸的載體，重組細(xì)胞，及其應(yīng)用。載體可以為質(zhì)粒，噬菌體，粘粒，病毒，人工染色體等等。優(yōu)選的載體的例子為質(zhì)粒載體，諸如來自市售的質(zhì)粒(pUC，pcDNA，pBR等等)。這種載體優(yōu)選含有選擇的基因和/或復(fù)制起點(diǎn)和/或轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。其它的具體載體為例如，病毒或者噬菌體，尤其是復(fù)制缺陷型重組病毒，諸如來自逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，AAV，皰疹病毒，桿狀病毒等的病毒。載體可用于任一感受態(tài)宿主，諸如，例如原核或者真核細(xì)胞。它們可以為細(xì)菌(例如大腸桿菌)，酵母(例如，糖酵母或者克魯維氏酵母)，植物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是人等等。它們可以是細(xì)胞系，初級(jí)細(xì)胞，混合培養(yǎng)物等。
本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)根據(jù)下列用于說明而非限制目的的實(shí)施例將更加明顯。


圖1大腦(1A)和肌肉(1B)樣本中PDE4B的半定量PCR。
圖2己酮可可堿(Pentoxifylline)保護(hù)初級(jí)神經(jīng)元防止形成與由紅藻氨酸誘導(dǎo)的興奮毒性相關(guān)的小腦顆粒體。
圖3己酮可可堿(Pentoxifylline)保護(hù)初級(jí)神經(jīng)元防止形成與由NMDA/絲氨酸誘導(dǎo)的興奮毒性相關(guān)的小腦顆粒體。
圖4etazolate的神經(jīng)元保護(hù)效果防止由大腦顆粒細(xì)胞上的NMDA/絲氨酸誘導(dǎo)的毒性。
圖5etazolate的神經(jīng)元保護(hù)效果防止由大腦顆粒細(xì)胞上的紅藻氨酸誘導(dǎo)的毒性。
圖6己酮可可堿(Pentoxifylline)的神經(jīng)元保護(hù)效果防止由皮層神經(jīng)元上的NMDA/絲氨酸誘導(dǎo)的毒性。
圖7己酮可可堿(Pentoxifylline)的神經(jīng)元保護(hù)效果防止由皮層神經(jīng)元上的紅藻氨酸誘導(dǎo)的毒性。
圖8etazolate的神經(jīng)元保護(hù)效果防止由皮層神經(jīng)元上的NMDA/絲氨酸誘導(dǎo)的毒性。
圖9etazolate的神經(jīng)元保護(hù)效果防止由皮層神經(jīng)元上的紅藻氨酸誘導(dǎo)的毒性。
圖108-溴-cAMP的神經(jīng)元保護(hù)效果防止由大腦顆粒細(xì)胞上的NMDA/絲氨酸誘導(dǎo)的毒性。
圖118-溴-cAMP的神經(jīng)元保護(hù)效果防止由大腦顆粒細(xì)胞上的紅藻氨酸誘導(dǎo)的毒性。
實(shí)施例實(shí)施例1鑒定作為興奮毒性分子靶的PDE4對(duì)從不同階段的動(dòng)物樣本的大腦中提取的聚腺苷?；?poly A+)的RNA進(jìn)行定性差異分析，不用預(yù)先分離神經(jīng)元從而考慮與疾病的發(fā)展相關(guān)的可選擇剪接事件的最大值。
poly A+RNA通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行制備。尤其是，可以通過諸如，硫氰酸胍的離液劑處理，然后利用溶劑(例如，酚，氯仿)的方法提取總RNA。這種方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的[參見Maniatis等人，Chomczynsli等人，Anal.Biochem.162(1987)156]，而且通過使用市售的試劑盒可以很容易的進(jìn)行操作。poly A+RNA根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法從總RNA中制備，并且以市售試劑盒的形式提供。這些poly A+RNA作為利用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板。以優(yōu)選的方式，使用缺失RNase H活性的逆轉(zhuǎn)錄酶，從而獲得在大小上大于用傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄酶獲得的第一個(gè)互補(bǔ)DNA鏈。這種不含RNase H的逆轉(zhuǎn)錄酶制備物可以市售獲得。
在疾病發(fā)生的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)(30天，60天和90天)，poly A+RNA以及單鏈cDNA從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(T)和同系基因的對(duì)照動(dòng)物(C)制備而來。
根據(jù)DATAS方法，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行mRNA(C)與cDNA(T)的雜交，以及mRNA(T)與cDNA(C)的交互雜交。
然后根據(jù)DATA方法的操作流程純化mRNA/cDNA異雙鏈體。
不與互補(bǔ)DNA配對(duì)的RNA序列通過RNAse H的作用從這些異雙鏈體釋放，因?yàn)檫@種酶降解成對(duì)的RNA序列。這種未配對(duì)的序列代表在相互同源的RNA之間存在的定性差異。這種定性差異可以位于RNA序列上的任一位點(diǎn)，在序列的5’或者3’區(qū)或者在序列中間，尤其在編碼序列中。根據(jù)他們的位點(diǎn)，這些序列可能不只是選擇性剪接，還可能是易位或者缺失的結(jié)果。
然后根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，更具體的是描述于DATAS方法專利中的那些方法，克隆代表定性差異的RNA序列。
這些序列進(jìn)入組成定性差異文庫的cDNA文庫。一種這樣的文庫含有健康狀態(tài)特異的外顯子和內(nèi)含子；另一種文庫就含有病理狀況下的剪接事件的特征。
通過與探針雜交檢測(cè)克隆的差異表達(dá)，所述探針由研究中的差異狀態(tài)下提取的信使RNA的反轉(zhuǎn)錄獲得。保留顯示差異雜交的克隆用于后面的分析。通過DATAS鑒定的序列對(duì)應(yīng)于通過在病理狀態(tài)和正常狀態(tài)中的剪接而差異表達(dá)的內(nèi)含子和/或外顯子。這些剪接事件可以特異于疾病發(fā)展的特定階段或者為正常狀態(tài)的特征。
將這些序列與數(shù)據(jù)庫比較可以將獲得的信息進(jìn)行分類，并且提議根據(jù)診斷和治療目的對(duì)序列加以合理選擇。
對(duì)來自60天齡轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物的RNA實(shí)施DATAS已經(jīng)分離了來自磷酸二酯酶4B mRNA的cDNA片段。這個(gè)片段相應(yīng)于特異性存在于對(duì)照動(dòng)物中的外顯子片段，并且因此在60天齡階段的SOD1G93A轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)特異性缺失。這個(gè)片段包括從鼠PDE4B的終止密碼子開始編號(hào)的核苷酸377到486(SEQ ID NO1)。這個(gè)序列包括2912個(gè)堿基，缺失的片段相應(yīng)于堿基2760到2869。由于選擇性使用3’非編碼外顯子或者由于使用兩種可選擇的聚腺苷酰化位點(diǎn)，這個(gè)區(qū)是非編碼的并且在對(duì)照動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物之間差異表達(dá)。
實(shí)施例2RT-PCR試驗(yàn)證實(shí)差異表達(dá)PDE4B在神經(jīng)元應(yīng)激狀態(tài)下的差異表達(dá)和參考狀態(tài)相比通過描述于圖1的RT-PCR試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。
這些實(shí)驗(yàn)根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行并且使隨后表達(dá)PDE4B mRNA兩個(gè)不同區(qū)域成為可能。這樣的一個(gè)區(qū)域跨越了這個(gè)mRNA的起始密碼子(PDE4B 5’)，其它區(qū)域部分跨越了通過DATAS(PDE4B DATAS)方法鑒定的片段。所使用的PCR引物的位置顯示在圖1中。
PO RNA是核糖體RNA，作為內(nèi)部對(duì)照以檢測(cè)相同量的RNA用于每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。用從30天齡，60和90天齡，即，在病理癥狀出現(xiàn)之前的對(duì)照動(dòng)物(C)和轉(zhuǎn)基因(T)動(dòng)物提取的RNA進(jìn)行分析。
來自對(duì)照或者30，60，或者90天齡的SOD1 G93A小鼠大腦的總RNA利用標(biāo)準(zhǔn)SuperscriptTM操作流程(Invitrogen)轉(zhuǎn)錄為cDNA。為了進(jìn)行半定量PCR，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10倍。DATAS片段的特異性引物對(duì)應(yīng)于有義鏈的核苷酸2526到2545(5’GCC AGG CCG TGAAGC AAA TA3’；SEQ ID NO5)，和反義鏈核苷酸2790到2807(5’TCAAAG ACG CGA AAA CAT 3’；SEQ ID NO6)并且對(duì)于5′引物片段而言，引物對(duì)應(yīng)于有義鏈的核苷酸145到165(5’CCG CGT CAG TGC CTTTGC TAT 3’；SEQ ID NO7)，和反義鏈的核苷酸426到404(5’CGC TGTCGG ATG CTT TTA TTC AC 3’；SEQ ID NO8)。P0基因作為參考并且利用下列引物進(jìn)行擴(kuò)增，有義鏈5’TCG CTT TCT GGA GGG TGT C3’(SEQ ID NO9)和反義鏈CCG CAG GGG CAG CAG TGG 3’(SEQ IDNO10)。
如下所述進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)的擴(kuò)增-在94℃ 30秒-在57℃ 1分鐘-在72℃ 30秒，然后在72℃ 2分鐘一個(gè)循環(huán)不同的PCR產(chǎn)物加樣到1.5％的瓊脂糖凝膠上。用兩種不同的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)三次。
圖1顯示了從動(dòng)物的大腦或者肌肉提取的RNA獲得的結(jié)果。
如果從所有樣品的PO RNA擴(kuò)增相同量的cDNA，用PDE4BmRNA觀察到變化。在90天齡的動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)到最顯著的改變?cè)谵D(zhuǎn)基因動(dòng)物的大腦中觀察到PDE4 5’片段表達(dá)增加的同時(shí)，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的大腦中出現(xiàn)PDE4B(DATAS)表達(dá)非常顯著的降低。
這種發(fā)現(xiàn)建立了PDE4B的3’非編碼區(qū)mRNA片段表達(dá)的降低和這個(gè)相同的信使的5’編碼區(qū)表達(dá)的提高之間的關(guān)聯(lián)。這個(gè)結(jié)果和在由DATAS鑒定的序列中存在mRNA去穩(wěn)定序列完全一致，并且表明PDE4B表達(dá)和興奮毒性現(xiàn)象之間的關(guān)聯(lián)。
實(shí)施例3通過PDE4的抑制劑抑制興奮毒性對(duì)于這個(gè)實(shí)施例，大鼠大腦顆粒以及皮層神經(jīng)元根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)。
初級(jí)大鼠大腦顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)7天齡Wistar大鼠去頭并且解剖大腦。除去腦膜后，將組織切割成小塊并在37℃胰酶消化15分鐘。細(xì)胞在研磨機(jī)上進(jìn)行研磨分離并以300,000細(xì)胞/cm2接種在添加了10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的基礎(chǔ)Eagle培養(yǎng)基上。第二天，添加10μM的ARA-C(一種抗有絲分裂劑)以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。培養(yǎng)9天以后，用磷酸二酯酶抑制劑己酮可可堿和etazolate處理細(xì)胞，3小時(shí)后在10μg的D-絲氨酸的存在下加入毒素50μM的紅藻氨酸或者100μM的N-甲基-D-天冬氨酸。在毒素之前立即加入8-溴-cAMP。所有處理至少重復(fù)兩次并在至少兩種不同的培養(yǎng)物中進(jìn)行。溫育6小時(shí)以后，通過MTT試驗(yàn)評(píng)估毒性。結(jié)果歸一化到未處理對(duì)照的平均數(shù)，用Wilcoxon試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。顯著性水平設(shè)定為p＜0.05。
初級(jí)皮層細(xì)胞的培養(yǎng)取出來自Wistar大鼠的16天齡胚胎并且解剖皮層。在37℃用胰蛋白酶處理25分鐘后，細(xì)胞在研磨機(jī)中研磨分離，然后以300,000細(xì)胞/cm2接種在添加了10％馬血清，10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的極限必需培養(yǎng)基上。培養(yǎng)4天以后，一半的培養(yǎng)基用添加了5％馬血清和2mM谷氨酰胺的極限必需培養(yǎng)基替換。同一天，添加10μM的5-氟-2-脫氧尿苷(一種抗有絲分裂劑)。培養(yǎng)7和11天以后，用由添加了5％馬血清和2mM谷氨酰胺的MEM組成的條件培養(yǎng)基替換一半的培養(yǎng)基；這種培養(yǎng)物在使用前在一層皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞上傳代。在第14天，在10μg的D-絲氨酸的存在下加入毒素50μM的紅藻氨酸或者20μM的N-甲基-D-天冬氨酸之前1小時(shí)用磷酸二酯酶抑制劑己酮可可堿和etazolate處理細(xì)胞。所有的處理至少重復(fù)兩次并在至少兩種不同的培養(yǎng)物中進(jìn)行。溫育6小時(shí)以后，通過MTT試驗(yàn)評(píng)估毒性。結(jié)果歸一化到未處理對(duì)照的平均數(shù)，用Wilcoxon試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。顯著性水平設(shè)定為p＜0.05。
MTT利用MTT試驗(yàn)測(cè)定毒性。與化合物溫育后，加入MTT使得每孔的終濃度為0.5mg/ml。然后，將微孔板在37℃黑暗條件下培養(yǎng)30分鐘。對(duì)培養(yǎng)基抽氣，并將晶體重新懸浮在500μl的DMSO(二甲基亞砜)中。讀取550nm處的吸光度并且計(jì)算百分比存活率。
結(jié)果結(jié)果示于圖2到10中。這些結(jié)果顯示了本發(fā)明的化合物對(duì)于神經(jīng)元存活的保護(hù)效果。當(dāng)神經(jīng)元用PDE4抑制劑共處理時(shí)，觀察到對(duì)兩種興奮毒性誘導(dǎo)劑(NMDA/絲氨酸和紅藻氨酸)的劑量依賴性保護(hù)效果。用己酮可可堿和etazolate觀察到這樣的保護(hù)效果。
圖2和3顯示利用己酮可可堿對(duì)大腦顆粒細(xì)胞獲得的結(jié)果。它們顯示在NMDA/絲氨酸處理的情況下己酮可可堿對(duì)這些細(xì)胞提供43％的保護(hù)，以及在紅藻氨酸誘導(dǎo)的毒性的情況下對(duì)這些細(xì)胞提供33％的保護(hù)。
圖4和5顯示了利用etazolate對(duì)大腦顆粒細(xì)胞獲得的結(jié)果。它們顯示在NMDA/絲氨酸處理的情況下etazolate對(duì)這些細(xì)胞提供60％的保護(hù)，以及在紅藻氨酸誘導(dǎo)的毒性的情況下對(duì)這些細(xì)胞提供57％的保護(hù)。
圖6和7顯示了利用己酮可可堿對(duì)皮層神經(jīng)元獲得的結(jié)果。它們顯示在NMDA/絲氨酸處理的情況下己酮可可堿對(duì)這些細(xì)胞提供50％的保護(hù)，以及在紅藻氨酸誘導(dǎo)的毒性的情況下對(duì)這些細(xì)胞提供66％的保護(hù)。
圖8和9顯示了利用etazolate對(duì)皮層神經(jīng)元獲得的結(jié)果。它們顯示在NMDA/絲氨酸處理的情況下etazolate對(duì)這些細(xì)胞提供33％的保護(hù)，以及在紅藻氨酸誘導(dǎo)的毒性的情況下對(duì)這些細(xì)胞提供25％的保護(hù)。
這種保護(hù)的相關(guān)性通過利用提高cAMP(一種PDE底物)的濃度獲得的保護(hù)的百分比進(jìn)行證實(shí)，作為大腦顆粒細(xì)胞的例子顯示在圖10和11中。NMDA/絲氨酸處理觀察到40％的保護(hù)，而紅藻氨酸處理觀察到40％的保護(hù)。
因此本發(fā)明不僅顯示PDE4B參與興奮毒性的機(jī)制，尤其是在ALS模型中，而且還顯示PDE4抑制劑在與興奮毒性相關(guān)的應(yīng)激中保持神經(jīng)元存活率的能力。
實(shí)施例4人類的臨床應(yīng)用這個(gè)實(shí)施例描述了PDE4抑制劑臨床應(yīng)用在處理人ALS的條件。這個(gè)實(shí)施例顯示了本發(fā)明的治療潛能和其在人類中的實(shí)施條件。
在這個(gè)臨床試驗(yàn)中，處理是基于己酮可可堿和2-氨基-6-三糖甲氧苯噻唑(riluzole)的聯(lián)合使用，前者每天三次400mg的劑量，每天總共1200mg的劑量。己酮可可堿以片劑的形式給藥。這是一個(gè)多中心、雙盲、安慰劑對(duì)照的試驗(yàn)，試驗(yàn)對(duì)象是400名包括18到80年齡段的男性和女性的病人，代表散發(fā)或者家族性ALS，并且用2-氨基-6-三糖甲氧苯噻唑(50mg b.i.d)至少治療3個(gè)月。用己酮可可堿治療的計(jì)劃時(shí)間為18個(gè)月。
最終的主要效果為存活率，生命質(zhì)量和肌肉試驗(yàn)。
本發(fā)明的其它方面和應(yīng)用涉及- 使用所有或者部分來自PDE4B信使RNA的序列用于診斷或者篩選或者鑒定具有與興奮毒性現(xiàn)象相關(guān)的組分或者階段的神經(jīng)退行性疾病，諸如阿默氏癥，帕金森氏癥，多發(fā)性硬化，亨汀頓舞蹈癥，ALS或者腦局部缺血，- 使用包括反義RNA的任一核酸用于在患有這種疾病的病人體內(nèi)抑制PDE4B的表達(dá)，- 利用任一化合物，尤其是己酮可可堿，etazolate，或者含有它們的任一組合物用于在患有這種疾病的病人體內(nèi)抑制PDE4B的活性，
- 利用所有或者部分來自PDE4B信使RNA的序列用于鑒定組織以及局部缺血的狀態(tài)。
序列表<110>埃克森海特治療股份有限公司(Exonhit Therapeutics SA)<120>新的神經(jīng)毒性的分子靶(New Molecular Target of Neurotoxicity)<130>SCT040204-47<140>
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<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2912<212>DNA<213>Mus musculus<220>
<221>CDS<222>(218)..(2383)<400>1aaaggcagcc tgataaagct ccttgtgaca ggctgtcttg ccagtctccc agtatgctcc 60tcttgctctg aagtgctcca ggattgaaac cacagcttcc caaattagcc tgggaagagt 120gtgcggaccc agcagccttt taacccgcgt cagtgccttt gctatgttca agactgctgt 180tttggatggt gaatgctagc tagcactcca tcgagac atg aca gca aaa aat tct 235Met Thr Ala Lys Asn Ser1 5cca aaa gaa ttt act gct tcg gaa tct gag gtt tgc ata aag act ttc 283Pro Lys Glu Phe Thr Ala Ser Glu Ser Glu Val Cys Ile Lys Thr Phe10 15 20aag gag cag atg cgc ttg gaa ctt gag ctt cca aag cta cca gga aac 331Lys Glu Gln Met Arg Leu Glu Leu Glu Leu Pro Lys Leu Pro Gly Asn25 30 35aga cct aca tct ccc aaa att tct cca cgc agt tca cca agg aat tca 379
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Val Ser Leu Gln Glu Glu Ser Tyr Gln Lys Leu Ala Met Glu Thr Leu195 200 205Glu Glu Leu Asp Trp Cys Leu Asp Gln Leu Glu Thr Ile Gln Thr Tyr210 215 220Arg Ser Val Ser Glu Met Ala Ser Asn Lys Phe Lys Arg Met Leu Asn225 230 235 240Arg Glu Leu Thr His Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser Gly Asn Gln Val245 250 255Ser Glu Tyr Ile Ser Asn Thr Phe Leu Asp Lys Gln Asn Asp Val Glu260 265 270Ile Pro Ser Pro Thr Gln Lys Asp Arg Glu Lys Lys Lys Lys Gln Gln275 280 285Leu Met Thr Gln Ile Ser Gly Val Lys Lys Leu Met His Ser Ser Ser290 295 300Leu Asn Asn Thr Ser Ile Ser Arg Phe Gly Ile Asn Thr Glu Asn Glu305 310 315 320Asp His Leu Ala Lys Glu Leu Glu Asp Leu Asn Lys Trp Gly Leu Asn325 330 335Ile Phe Asn Val Ala Gly Tyr Ser His Asn Arg Pro Leu Thr Cys Ile340 345 350Met Tyr Ala Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr Phe Lys Ile355 360 365Ser Ser Asp Thr Phe Val Thr Tyr Met Met Thr Leu Glu Asp His Tyr370 375 380His Ser Asp Val Ala Tyr His Asn Ser Leu His Ala Ala Asp Val Ala385 390 395 400Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr Pro Ala Leu Asp Ala Val Phe405 410 415Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Ala Ala Ile His Asp420 425 430Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn Thr Asn Ser435 440 445Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu Glu Asn His His450 455 460Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu His Cys Asp Ile Phe465 470 475 480Gln Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln Thr Leu Arg Lys Met Val Ile485 490 495Asp Met Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Ser Leu Leu Ala500 505 510Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser Ser Gly Val515 520 525Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Thr Asp Arg Ile Gln Val Leu Arg Asn Met530 535 540
Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Ser Leu Glu Leu Tyr545 550 555 560Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu Glu Phe Phe Gln Gln Gly Asp565 570 575Lys Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met Cys Asp Lys His580 585 590Thr Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp Tyr Ile Val595 600 605His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val Gln Pro Asp Ala Gln610 615 620Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Asn Trp Tyr Gln Ser Met625 630 635 640Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro Pro Leu Asp Glu Arg Ser Arg Asp Cys645 650 655Gln Gly Leu Met Glu Lys Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu Glu Glu Glu660 665 670Asp Ser Glu Gly Pro Glu Lys Glu Gly Glu Gly His Ser Tyr Phe Ser675 680 685Ser Thr Lys Thr Leu Cys Val Ile Asp Pro Glu Asn Arg Asp Ser Leu690 695 700Glu Glu Thr Asp Ile Asp Ile Ala Thr Glu Asp Lys Ser Pro Ile Asp705 710 715 720Thr<210>3<211>4068<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(766)..(2460)<223>PDE4B<400>3gaattcctcc tctcttcacc ccgttagctg ttttcaatgt aatgctgccg tccttctctt 60gcactgcctt ctgcgctaac acctccattc ctgtttataa ccgtgtattt attacttaat 120gtatataatg taatgttttg taagttatta atttatatat ctaacattgc ctgccaatgg 180tggtgttaaa tttgtgtaga aaactctgcc taagagttac gactttttct tgtaatgttt 240
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<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Met Lys Glu His Gly Gly Thr Phe Ser Ser Thr Gly Ile Ser Gly Gly1 5 10 15Ser Gly Asp Ser Ala Met Asp Ser Leu Gln Pro Leu Gln Pro Asn Tyr20 25 30Met Pro Val Cys Leu Phe Ala Glu Glu Ser Tyr Gln Lys Leu Ala Met35 40 45Glu Thr Leu Glu Glu Leu Asp Trp Cys Leu Asp Gln Leu Glu Thr Ile50 55 60Gln Thr Tyr Arg Ser Val Ser Glu Met Ala Ser Asn Lys Phe Lys Arg65 70 75 80Met Leu Asn Arg Glu Leu Thr His Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser Gly85 90 95Asn Gln Val Ser Glu Tyr Ile Ser Asn Thr Phe Leu Asp Lys Gln Asn100 105 110Asp Val Glu Ile Pro Ser Pro Thr Gln Lys Asp Arg Glu Lys Lys Lys115 120 125Lys Gln Gln Leu Met Thr Gln Ile Ser Gly Val Lys Lys Leu Met His130 135 140Ser Ser Ser Leu Asn Asn Thr Ser Ile Ser Arg Phe Gly Val Asn Thr145 150 155 160Glu Asn Glu Asp His Leu Ala Lys Glu Leu Glu Asp Leu Asn Lys Trp165 170 175Gly Leu Asn Ile Phe Asn Val Ala Gly Tyr Ser His Asn Arg Pro Leu180 185 190Thr Cys Ile Met Tyr Ala Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr195 200 205Phe Arg Ile Ser Ser Asp Thr Phe Ile Thr Tyr Met Met Thr Leu Glu210 215 220Asp His Tyr His Ser Asp Val Ala Tyr His Asn Ser Leu His Ala Ala225 230 235 240Asp Val Ala Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr Pro Ala Leu Asp245 250 255Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Ala Ala260 265 270Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn275 280 285Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu Glu290 295 300Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu His Cys305 310 315 320
Asp Ile Phe Met Asn Leu Thr Lys Lys Gln Arg Gln Thr Leu Arg Lys325 330 335Met Val Ile Asp Met Val Leu Ala Thr Asp Met Ser Lys His Met Ser340 345 350Leu Leu Ala Asp Leu Lys Thr Met Val Glu Thr Lys Lys Val Thr Ser355 360 365Ser Gly Val Leu Leu Leu Asp Asn Tyr Thr Asp Arg Ile Gln Val Leu370 375 380Arg Asn Met Val His Cys Ala Asp Leu Ser Asn Pro Thr Lys Ser Leu385 390 395 400Glu Leu Tyr Arg Gln Trp Thr Asp Arg Ile Met Glu Glu Phe Phe Gln405 410 415Gln Gly Asp Lys Glu Arg Glu Arg Gly Met Glu Ile Ser Pro Met Cys420 425 430Asp Lys His Thr Ala Ser Val Glu Lys Ser Gln Val Gly Phe Ile Asp435 440 445Tyr Ile Val His Pro Leu Trp Glu Thr Trp Ala Asp Leu Val Gln Pro450 455 460Asp Ala Gln Asp Ile Leu Asp Thr Leu Glu Asp Asn Arg Asn Trp Tyr465 470 475 480Gln Ser Met Ile Pro Gln Ser Pro Ser Pro Pro Leu Asp Glu Gln Asn485 490 495Arg Asp Cys Gln Gly Leu Met Glu Lys Phe Gln Phe Glu Leu Thr Leu500 505 510Asp Glu Glu Asp Ser Glu Gly Pro Glu Lys Glu Gly Glu Gly His Ser515 520 525Tyr Phe Ser Ser Thr Lys Thr Leu Cys Val Ile Asp Pro Glu Asn Arg530 535 540Asp Ser Leu Gly Glu Thr Asp Ile Asp Ile Ala Thr Glu Asp Lys Ser545 550 555 560Pro Val Asp Thr<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5gccaggccgt gaagcaaata20
<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6tcaaagacgc gaaaacat 18<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7ccgcgtcagt gcctttgcta t 21<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8cgctgtcgga tgcttttatt cac 23<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9tcgctttctg gagggtgtc 19<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10ccgcaggggc agcagtgg 18
權(quán)利要求
1.檢測(cè)受試者興奮毒性狀態(tài)或者神經(jīng)元應(yīng)激狀態(tài)的方法，所述方法包括體外測(cè)定來自受試者的樣品中磷酸二酯酶4，尤其是磷酸二酯酶4B的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述方法包括檢測(cè)來自受試者的樣品中磷酸二酯酶4，尤其是磷酸二酯酶4B的突變RNA的存在，具體是全部或者部分3’非編碼區(qū)缺失的形式。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2的方法，所述方法包括將來自受試者的含有核酸的生物樣品體外與包括全部或者部分來自PDE4B信使RNA或者基因的序列的核酸接觸，并且檢測(cè)雜交體的形成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中樣品包括神經(jīng)或者肌肉細(xì)胞。
5.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的方法，用于診斷或者檢測(cè)阿默氏癥，帕金森氏癥，多發(fā)性硬化，亨汀頓舞蹈癥，ALS或者腦局部缺血。
6.至少一種抑制或者降低PDE4B表達(dá)或者活性的化合物在制備設(shè)計(jì)用于治療神經(jīng)退行性疾病的組合物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中化合物為能夠抑制PDE4B基因轉(zhuǎn)錄或者相應(yīng)的信使翻譯的反義核酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中化合物為天然或者合成來源的化合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中化合物選自吡唑并吡啶家族，尤其是etazolate，以及黃嘌呤衍生物家族，尤其是己酮可可堿。
10.根據(jù)權(quán)利要求6到9中之一的應(yīng)用，用于抑制或者降低神經(jīng)退行性疾病早期階段的神經(jīng)元的興奮毒性。
11.根據(jù)權(quán)利要求6到10中之一的應(yīng)用，用于提高患有ALS的病人神經(jīng)元的存活率。
12.根據(jù)權(quán)利要求6到11中之一的應(yīng)用，用于治療阿默氏癥，帕金森氏癥，多發(fā)性硬化，亨汀頓舞蹈癥，或者腦局部缺血。
13.根據(jù)權(quán)利要求6到11中之一的應(yīng)用，用于治療ALS，尤其是用于降低ALS早期階段的神經(jīng)元的興奮毒性。
14.己酮可可堿在制備設(shè)計(jì)用于提高患有ALS病人的神經(jīng)元存活率的組合物中的應(yīng)用。
15.etazolate在制備設(shè)計(jì)用于提高患有ALS病人的神經(jīng)元存活率的組合物中的應(yīng)用。
16.至少一種屬于吡唑并吡啶家族的PDE4抑制劑化合物在制備設(shè)計(jì)用于提高患有ALS病人的神經(jīng)元存活率的藥物組合物中的應(yīng)用。
17.核苷酸引物，其組成為位于序列SEQ ID NO1的核苷酸2384和2869之間或者序列SEQ ID NO3的核苷酸2461和4068之間的序列或者其互補(bǔ)序列的8到20個(gè)連續(xù)殘基的片段。
18.分析PDE4表達(dá)，尤其是3’非編碼區(qū)和編碼區(qū)之間的差異表達(dá)的試劑盒，所述試劑盒包括特異于部分3’非編碼區(qū)序列的核苷酸探針以及特異于部分編碼區(qū)序列的核苷酸探針。
19.分析PDE4表達(dá)，尤其是3’非編碼區(qū)和編碼區(qū)之間的差異表達(dá)的試劑盒，所述試劑盒包括一對(duì)允許特異性擴(kuò)增至少部分PDE4的3’非編碼區(qū)的核苷酸引物以及一對(duì)允許特異性擴(kuò)增至少部分PDE4編碼區(qū)的核苷酸引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物學(xué)，遺傳學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及檢測(cè)，鑒定和/或治療(或者控制)神經(jīng)退行性疾病，尤其是肌萎縮側(cè)索硬化癥的新方法。本發(fā)明同時(shí)涉及鑒定或者篩選對(duì)這些疾病有活性的化合物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于實(shí)施上述方法的化合物，基因，細(xì)胞，質(zhì)?；蛘呓M合物。特別地，本發(fā)明描述了PDE4B在這些疾病中的作用及其作為治療、診斷或者試驗(yàn)靶的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1541278SQ02815840
公開日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2002年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月14日
發(fā)明者阿里·艾特·伊赫列夫, 安內(nèi)利斯·熱欣卡, 法比安·施魏格霍費(fèi)爾, 施魏格霍費(fèi)爾, 斯 熱欣卡, 阿里 艾特 伊赫列夫 申請(qǐng)人:埃克森海特治療股份有限公司