專利名稱：用于將蛋白定向到胞外體的方法和化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于將多肽在膜囊泡中進(jìn)行選擇性表達(dá)的組合物和方法。本發(fā)明還涉及適合于生產(chǎn)這樣的膜囊泡的遺傳結(jié)構(gòu)和重組細(xì)胞。本發(fā)明還涉及這樣的功能化膜囊泡以及生產(chǎn)抗體的方法、產(chǎn)生或調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法、以及篩選和鑒定使用它們的結(jié)合配偶體的方法。具體來說，本發(fā)明使用天然或合成來源的lactadherin或其部分用于在膜囊泡中選擇性表達(dá)多肽。本發(fā)明可以用于實(shí)驗(yàn)、研究、治療、預(yù)防或診斷領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胞外體是來源于胞內(nèi)體的囊泡，在后胞內(nèi)體多囊泡體與細(xì)胞質(zhì)膜融合后被分泌到細(xì)胞外環(huán)境中(4)。已知多種組織類型的細(xì)胞可以分泌胞外體，例如樹枝狀細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和肥大細(xì)胞。不同來源的胞外體表現(xiàn)出含有不同類型的蛋白和脂類部分(5，6)。它們都顯著地含有參與抗原呈遞和免疫調(diào)節(jié)的蛋白，表明胞外體在引起調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的細(xì)胞-細(xì)胞傳遞過程中發(fā)揮作用。事實(shí)上，用來自腫瘤抗原的肽刺激樹枝狀細(xì)胞(DC)分泌的胞外體，可以在使用匹配的腫瘤的動(dòng)物模型中引發(fā)抗腫瘤反應(yīng)(7，8)。生產(chǎn)、純化胞外體的方法或使用胞外體用于治療或作為研究工具已經(jīng)有所描述，例如在WO99/03499、WO00/44389和WO97/05900中，在此引為參考。
考慮到它們的免疫原性和治療性質(zhì)，能夠修飾胞外體的成分以改變它們的性質(zhì)將是特別有用的。在這一方面，在本技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)描述了重組的胞外體，它來自于用編碼重組蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。這些重組胞外體含有質(zhì)粒編碼的重組蛋白(WO00/28001)。
發(fā)明概述本發(fā)明現(xiàn)在公開生產(chǎn)重組胞外體的新方法。本發(fā)明還公開在胞外體中選擇性表達(dá)多肽的方法。本發(fā)明還描述新的嵌合分子以及含有它們的重組細(xì)胞，可用于生產(chǎn)這些重組胞外體。本發(fā)明還涉及這樣的功能化膜囊泡以及生產(chǎn)抗體的方法、產(chǎn)生或調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法以及使用它們篩選和鑒定結(jié)合配偶體的方法。
本發(fā)明是基于意外的發(fā)現(xiàn)，即Lactadherin在許多產(chǎn)胞外體的細(xì)胞中表達(dá)，并且在這些細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)Lactadherin幾乎專一地與胞外體相關(guān)(圖1)。這種高度特異性的亞細(xì)胞定位不僅在內(nèi)源的Lactadherin上發(fā)生，而且在用編碼Lactadherin的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胞外體產(chǎn)生細(xì)胞后得到的外源Lactadherin上也發(fā)生(圖2)。我們發(fā)現(xiàn)，通過刪除Lactadherin的C1/C2結(jié)構(gòu)域上的特定的短部分，Lactadherin的亞細(xì)胞定位被改變了(圖2)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈地支持Lactadherin的C1/C2結(jié)構(gòu)域含有高度特異性的定位于胞外體表面的定位基元，對(duì)Lactadherin的C1/C2結(jié)構(gòu)域的修飾改變了定位到其它表面上的特異性。我們發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象在幾個(gè)種間是保守的，因?yàn)橛镁幋a人重組Lactadherin的質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染來自小鼠和倉鼠的胞外體產(chǎn)生細(xì)胞系，產(chǎn)生的人重組Lactadherin也幾乎分別專一地結(jié)合于小鼠和倉鼠的胞外體中(圖3)。此外，在倉鼠細(xì)胞系中表達(dá)的小鼠重組Lactadherin也在倉鼠胞外體中發(fā)現(xiàn)(圖3)。
由此分析出，在一個(gè)蛋白中引入Lactadherin的部分或全部C1和/或C2結(jié)構(gòu)域或其功能等價(jià)物可以使產(chǎn)生的嵌合蛋白定位于胞外體和其它脂質(zhì)結(jié)構(gòu)上。
本發(fā)明還公開允許鑒定其它的定位多肽或基因的方法，這可以用于構(gòu)建嵌合基因或蛋白用于定位胞外體或在胞外體中表達(dá)。這些嵌合蛋白可以用于產(chǎn)生重組的囊泡，它們被定制后獲得新的所需功能。由于胞外體內(nèi)在的性質(zhì)，即免疫原性和無毒性，得到的重組胞外體代表了一種新的工具，在研究和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣泛的用途。值得注意的是，胞外體誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)的潛力使它們成為理想的工具，用于制備針對(duì)在重組胞外體中表達(dá)的抗原的抗體。同樣，具有生物活性的嵌合蛋白也可用于產(chǎn)生重組胞外體，它們被定制后獲得新的治療性質(zhì)。Lactadherin這種意外的定位多肽以及在胞外體中選擇性表達(dá)的能力也提供了新的方法，以純化這些多肽，包括Lactadherin本身。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于將多肽定位于胞外體的方法，包括a)提供一種嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼融合了定位多肽的所述多肽，該定位多肽包含了Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；以及b)在體內(nèi)或離體將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生重組胞外體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是在胞外體表面選擇性表達(dá)多肽的方法，包括a)提供一種嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼融合了Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的部分的所述多肽；b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生重組胞外體；以及c)收集該重組胞外體，其中該胞外體在其表面上帶有由該嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)編碼的多肽。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是制備功能化胞外體的方法，包括a)提供一種嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼一種融合了Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的部分的多肽；b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生功能化的胞外體，在它們的表面上呈遞該多肽，以及c)收集和/或純化該功能化胞外體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是生產(chǎn)含有Lactadherin或其一部分的多肽的方法，該方法包括
a)提供一種編碼該多肽的遺傳結(jié)構(gòu)；b)將該遺傳結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生功能化的胞外體，在它們的表面上呈遞該多肽；c)收集和/或純化該功能化胞外體，以及d)從該功能化胞外體中回收和/或純化該多肽或其片段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過上述方法制備的功能化胞外體以及含有這樣的功能化胞外體和可藥用的賦形劑或載體的組合物。
本發(fā)明還涉及嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼了一個(gè)目的多肽，該多肽與一個(gè)含有Lactadherin的C1和/或C2結(jié)構(gòu)域的定位部分或下面鑒定的另一種定位多肽融合。目的多肽可以是例如抗原、細(xì)胞因子、配體、受體、免疫球蛋白、標(biāo)記多肽、酶、離子通道或其一部分。這樣的嵌合基因的特定例子編碼從SEQ ID NO22-27、32或33中選擇的多肽或其缺失了C末端8個(gè)氨基酸殘基的片段。
本發(fā)明還包括了含有上述的嵌合遺傳結(jié)構(gòu)的載體，以及含有嵌合遺傳結(jié)構(gòu)或上述載體的重組細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了鑒定或篩選胞外體定位多肽的方法，以及產(chǎn)生能夠選擇性定位到膜囊泡(例如胞外體)上的嵌合蛋白的方法。嵌合蛋白一般是由一個(gè)多肽序列(例如天然存在的蛋白如抗原、細(xì)胞因子、配體、受體或免疫球蛋白的完整的或部分序列)融合到一個(gè)定位多肽的序列上而組成的，定位多肽通常是Lactadherin或其包括C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的部分，優(yōu)選為C1/C2功能結(jié)構(gòu)域。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面在于一種篩選、鑒定或選擇胞外體定位多肽的方法，該方法包括●提供第一個(gè)遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼一種侯選多肽，優(yōu)選為侯選的跨膜多肽；
●將第一個(gè)遺傳結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞，并測(cè)試侯選多肽在胞外體中的表達(dá)；●選擇一個(gè)在胞外體中表達(dá)的侯選多肽，以及制備第二個(gè)遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼與跨膜抗原或受體融合的該選擇的多肽；●將第二個(gè)遺傳結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞并測(cè)試融合多肽在胞外體中的表達(dá)；以及●選擇引起跨膜抗原或受體在胞外體中有效表達(dá)的多肽。
我們的結(jié)果顯示，使用上述的方法，可以鑒定、選擇和/或改進(jìn)不同的含有指導(dǎo)在胞外體中表達(dá)的特異性定位信號(hào)的蛋白或多肽。這些多肽需要在胞外體中表達(dá)和將其他分子定位到這些囊泡的能力。這些多肽可以是從跨膜蛋白衍生的，并且可以包括這樣的蛋白的全部或其一部分，一般為含有至少是跨膜區(qū)的部分。這些結(jié)構(gòu)特別適合于將抗原投送到胞外體中，特別是受體和跨膜蛋白。該方法可以用于選擇特異性的單個(gè)定位多肽，或用于篩選遺傳結(jié)構(gòu)的文庫。
獲得的重組胞外體可用于許多研究和治療用途，包括培養(yǎng)抗體、產(chǎn)生具有改進(jìn)的治療性質(zhì)的胞外體、抗原遞送以及文庫篩選以鑒定蛋白-蛋白相互作用的相對(duì)物。
本發(fā)明還可有利地用于產(chǎn)生合成的脂質(zhì)囊泡。事實(shí)上，本發(fā)明可用于將分子定位到胞外體之外的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中，例如任何天然存在的囊泡或含有質(zhì)膜雙層的細(xì)胞器、以及合成的含有脂的囊泡如脂質(zhì)體或任何具有疏水性質(zhì)的合成微粒。這樣的脂質(zhì)囊泡優(yōu)選被改造成含有(或富集有)磷脂酰絲氨酸和/或其它的天然包含在胞外體中的脂類，以便允許嵌合分子的有效定位和結(jié)合。
此外，本發(fā)明可用于投送任何選定的與Lactadherin或其一部分人工融合的分子。在這一點(diǎn)上，本發(fā)明不限于遺傳融合，還包含了化學(xué)融合，即任何Lactadherin與一個(gè)分子的化學(xué)(共價(jià))復(fù)合物。


圖1Lactadherin到胞外體的定位。
圖2外源的Lactadherin到胞外體的定位。
圖3Lactadherin的選擇性表達(dá)在種間是保守的。
圖4與Lactadherin融合的生物活性的IL-2在胞外體中的選擇性表達(dá)。
圖5重組人Lactadherin的純化。
圖6免疫接種DNA時(shí)APC的交叉引發(fā)。
圖7重組的侯選跨膜多肽在胞外體中的表達(dá)。在胞外體及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞裂解物中檢測(cè)到重組的MelanA/MART1(組A)、CD40L(組B)和CD81(組C)。
圖8在胞外體中重組嵌合蛋白的表達(dá)。
圖9在用含Lactadherin的胞外體免疫的小鼠的血清中檢測(cè)抗Lactadherin抗體。
發(fā)明詳述本發(fā)明公開生產(chǎn)重組胞外體的新方法及其應(yīng)用。更具體來說，本發(fā)明使用一種定位多肽，例如Lactadherin或其部分，來選擇性表達(dá)天然或合成來源的多肽或?qū)⒋硕嚯亩ㄎ坏侥つ遗葜?。本發(fā)明可以用于實(shí)驗(yàn)、研究、治療、預(yù)防或診斷領(lǐng)域。
本發(fā)明源自于發(fā)現(xiàn)了Lactadherin的新的意外的性質(zhì)。具體來說，本發(fā)明顯示Lactadherin在胞外體中選擇性表達(dá)，并可以用于在這樣的囊泡中選擇性表達(dá)多肽。
正如上面指出的，本發(fā)明提供了在胞外體中定位或(選擇性)表達(dá)多肽的方法、功能化胞外體的方法以及生產(chǎn)多肽的方法，這些方法使用了一個(gè)編碼嵌合多肽的嵌合基因或遺傳結(jié)構(gòu)。嵌合多肽包含了與Lactadherin或其功能結(jié)構(gòu)域融合的目的多肽。
LactadherinLactadherin是一種首先在乳腺組織中被鑒定的蛋白。它是乳汁的成分，在乳汁脂肪球的表面與幾種其他的蛋白相結(jié)合。Lactadherin在其N末端含有表皮生長因子樣(EGF-like)區(qū)域，其中含有在整合蛋白配體中發(fā)現(xiàn)的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(R-G-D)序列基序。該基序介導(dǎo)了Lactadherin與αvβ3和αvβ5整合蛋白的結(jié)合。Lactadherin的C末端含有一個(gè)C1/C2結(jié)構(gòu)域，其參與了Lactadherin與乳汁脂肪球的相互作用。幾種結(jié)合于其它細(xì)胞表面的其它蛋白也有相關(guān)的C1/C2結(jié)構(gòu)域。Lactadherin的C1/C2結(jié)構(gòu)域已經(jīng)顯示出傾向于結(jié)合到含有磷脂酰絲氨酸脂質(zhì)的表面(參考文獻(xiàn)1到3)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Lactadherin出現(xiàn)在由鼠科動(dòng)物樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的胞外體的表面。在這一方面，WO00/30667涉及了使用Lactadherin或其變體將抗原投送到樹突狀細(xì)胞或在體內(nèi)介導(dǎo)免疫反應(yīng)。US5455031公開了長形式的人Lactadherin的克隆。
本發(fā)明源自于發(fā)現(xiàn)了Lactadherin的新的意外的性質(zhì)，即Lactadherin在胞外體中選擇性表達(dá)或定位多肽的能力。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“選擇性”表明細(xì)胞表達(dá)的Lactadherin(或嵌合多肽)幾乎專一地出現(xiàn)在胞外體的表面，盡管可以觀察到有殘余或少量的Lactadherin出現(xiàn)在其它的細(xì)胞區(qū)室或膜中。本發(fā)明部分基于意外地確定了Lactadherin主要表達(dá)在胞外體的表面，并可用于生產(chǎn)其中富集了與Lactadherin結(jié)合的所需分子的胞外體或脂質(zhì)囊泡。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語在其表面“帶有”分子的胞外體(或囊泡)被定義為含有與它們的膜結(jié)合的這類分子的囊泡。分子可以暴露在囊泡外面，也可以包含在囊泡內(nèi)部(即與膜的內(nèi)側(cè)結(jié)合)。一般來說，本發(fā)明允許在囊泡的表面有效地呈遞分子，即在囊泡的外面暴露它們。
在執(zhí)行本發(fā)明中可以使用不同來源或起源的Lactadherin。一般來說，優(yōu)選使用哺乳動(dòng)物的Lactadherin或其部分。哺乳動(dòng)物L(fēng)actadherin包括例如人、鼠科動(dòng)物、大鼠、牛、豬和馬的Lactadherin。最優(yōu)選的Lactadherin是人或鼠科動(dòng)物的Lactadherin或其片段或其功能等價(jià)物。
在這方面，本發(fā)明優(yōu)選使用(1)人的Lactadherin或鼠的Lactadherin，(2)人或鼠的Lactadherin片段，其中含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域，更優(yōu)選為C1/C2功能結(jié)構(gòu)域，或(3)與(1)或(2)中的多肽具有至少50％一級(jí)結(jié)構(gòu)同一性的多肽。
人的Lactadherin的氨基酸序列描述在SEQ ID NO7(長形式)和8(短形式)中。相應(yīng)的核酸分子的例子分別由SEQ ID NO5和6代表。鼠的Lactadherin的氨基酸序列描述在SEQ ID NO10中。也可參見Stubbs等(PNAS 87(21)，1990，8417)，以及Genbank登錄號(hào)M38337。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，嵌合基因含有一種Lactadherin，其氨基酸序列包含了SEQ ID NO7、8、10或其含有C2功能結(jié)構(gòu)域的片段。
在本發(fā)明的另一個(gè)特定實(shí)施方案中，嵌合基因含有一種Lactadherin，其氨基酸序列包含了SEQ ID NO7、8、10或其含有C1功能結(jié)構(gòu)域的片段。
在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，嵌合基因含有一種Lactadherin，其氨基酸序列包含了SEQ ID NO7、8、10的C1/C2功能結(jié)構(gòu)域。
人Lactadherin的C2結(jié)構(gòu)域含有SEQ ID NO7的229到387位氨基酸殘基。人Lactadherin的C1結(jié)構(gòu)域含有SEQ ID NO7的69到225位氨基酸殘基。在一個(gè)典型的例子中，嵌合結(jié)構(gòu)編碼SEQ ID NO7的至少229到387位或69到225位氨基酸殘基。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，嵌合結(jié)構(gòu)編碼了SEQ ID NO7的至少69到387位氨基酸。
鼠Lactadherin的C2結(jié)構(gòu)域含有SEQ ID NO10的271到426位氨基酸殘基。鼠Lactadherin的C1結(jié)構(gòu)域含有SEQ ID NO10的111到266位氨基酸殘基。在一個(gè)典型的例子中，嵌合結(jié)構(gòu)編碼SEQ IDNO10的至少271到426位或111到266位氨基酸殘基。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，嵌合結(jié)構(gòu)編碼SEQ ID NO10的至少111到426位氨基酸。在其他特定的實(shí)施方案中，嵌合結(jié)構(gòu)編碼SEQ ID NO10的至少109到426位氨基酸。
如上所述，定位部分可以是與上述(1)或(2)中的多肽具有至少50％一級(jí)結(jié)構(gòu)同一性的多肽。同一性可以按照各種已知的技術(shù)來確定，例如通過計(jì)算機(jī)程序，優(yōu)選為CLUSTAL方法。在更優(yōu)選的情況下，定位多肽與(1)或(2)中的多肽具有至少60％，優(yōu)選至少70％的同一性。這樣的Lactadherin變體(或功能等價(jià)物)應(yīng)保留將多肽定位到胞外體中的能力。這個(gè)性質(zhì)可以被證實(shí)，如同在實(shí)施例中描述的那樣，例如通過產(chǎn)生一個(gè)嵌合基因，它含有與標(biāo)記多肽融合的該變體，將這個(gè)嵌合基因在胞外體產(chǎn)生細(xì)胞中表達(dá)，然后確定標(biāo)記多肽在胞外體表面的存在。優(yōu)選的Lactadherin變體與上述的(1)或(2)中的多肽具有至少85％的同一性?？赡艿淖凅w包括氨基酸缺失、取代、突變和/或添加。
這樣的變體或功能等價(jià)物的具體的例子包括其它含有C1/C2結(jié)構(gòu)域的多肽或蛋白或其片段。具體來說，這樣的功能性變體的具體例子包括Del-1、Neuropilin-1、凝集因子5和凝集因子8或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的片段。
定位多肽的篩選本發(fā)明還公開了可加以生產(chǎn)、篩選和/或分離的其它有效的定位多肽。具體來說，本發(fā)明顯示了可以根據(jù)它們?cè)诎怏w中的表達(dá)和它們將其它多肽投送到這樣的囊泡中的能力來篩選多肽。本發(fā)明表明，在胞外體中天然表達(dá)的多肽并不一定代表了有效的定位多肽，而并不在這些囊泡中天然表達(dá)的多肽可以人工地產(chǎn)生并能夠有效地投送目的的多肽。本發(fā)明還表明，一般在胞外體中不表達(dá)的多肽可以通過重組DNA技術(shù)被迫進(jìn)入這些區(qū)室中。
盡管唯一在胞外體中被發(fā)現(xiàn)的胞外體特異性蛋白例如Lactadherin被優(yōu)選用來將蛋白定位到胞外體中，但在胞外體中富集或不是專門在胞外體中存在的蛋白，對(duì)于將其它蛋白定位到胞外體中來說也是潛在的侯選者。本發(fā)明提供了鑒定和使用這種侯選者的方法。為了說明這一點(diǎn)，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)重組的MelanA/MART1、CD40L和CD81，在用編碼這些跨膜分子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后在胞外體中得到表達(dá)。這些結(jié)果在實(shí)施例6中描述。MelanA/MART1是一種腫瘤相關(guān)的胞內(nèi)膜蛋白，最近在來自腫瘤細(xì)胞的胞外體中被發(fā)現(xiàn)。提示這種情況的發(fā)生反映了胞外體將全長的腫瘤抗原傳遞到APC的能力(9)。我們的發(fā)現(xiàn)表明MelanA/MART1事實(shí)上是來自MelanA/MART1+腫瘤胞外體的胞外體的一個(gè)整合成分。CD40L是一種重要的免疫反應(yīng)刺激劑，是我們的發(fā)現(xiàn)首次表明它可以在胞外體中檢測(cè)到。與之相反，CD81是一種已知的胞外體的成分，先前已知它在來自B細(xì)胞的胞外體中富集。我們構(gòu)建了包含與一個(gè)7-跨膜受體CCR7融合的MelanA/MART1或CD81的嵌合蛋白，發(fā)現(xiàn)MelanA/MART1-CCR7嵌合蛋白幾乎專一地在胞外體中表達(dá)，而單獨(dú)的CCR7只在細(xì)胞表面上檢測(cè)到。相比之下，令人吃驚的是，盡管CD81由胞外體天然表達(dá)，CD81與CCR1的嵌合結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生任何可檢測(cè)到的蛋白(見實(shí)施例6)。因此我們的方法表明存在有效的胞外體定位多肽，并允許鑒定和選擇這樣的多肽，用于將抗原、重要的跨膜抗原和受體定位到胞外體中。
因此，本發(fā)明的另一方面在于篩選、鑒定或選擇胞外體定位多肽的方法，該方法包括●提供第一個(gè)遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼一個(gè)侯選多肽，優(yōu)選為侯選的跨膜多肽；●將第一個(gè)遺傳結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞，并測(cè)試侯選多肽在胞外體中的表達(dá)；●選擇一個(gè)在胞外體中表達(dá)的侯選多肽，以及制備第二個(gè)遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼與被定位多肽融合的所述選定的多肽；●將第二個(gè)遺傳結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞并測(cè)試融合多肽在胞外體中的表達(dá)；以及●選擇引起被定位多肽在胞外體中有效表達(dá)的多肽。
我們的結(jié)果顯示，使用上述的方法，可以鑒定、選擇和/或改進(jìn)不同的含有指導(dǎo)在胞外體中表達(dá)的特異性定位信號(hào)的蛋白或多肽。這些多肽需要在胞外體中表達(dá)和將其他分子定位到這些囊泡的能力。這些多肽可以是從跨膜蛋白衍生的，并且可以包括這樣的蛋白的全部或其一部分，一般為含有至少是跨膜結(jié)構(gòu)域的部分。這些結(jié)構(gòu)特別適合于將抗原投送到胞外體中，特別是受體和跨膜蛋白。
在優(yōu)選情況下，定位多肽是或者含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。侯選定位多肽實(shí)際上可以來自任何含有這樣的跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白，例如受體、通道等。這樣的定位多肽的具體例子包括MelanA/MART1、CD40L、CD81等或其一部分。定位多肽可以含有整個(gè)的跨膜蛋白，或僅僅是其含有至少一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的部分。
由于侯選定位多肽的本質(zhì)，本方法基本上適合于鑒定多肽，所述多肽適用于將跨膜多肽投送到胞外體或?qū)⒍嚯耐端偷桨怏w內(nèi)。最優(yōu)選的定位多肽因此是那些跨膜的多肽，例如受體、跨膜抗原或其一部分。本發(fā)明具有特別的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗试S篩選能夠在特定的囊泡中有效表達(dá)復(fù)合分子，例如具有幾個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的受體(例如G蛋白偶聯(lián)受體或“GPCR”)的定位多肽。
侯選定位多肽或融合多肽在胞外體中的表達(dá)可以根據(jù)多種技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，這些技術(shù)公開于本申請(qǐng)的整個(gè)說明書中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將遺傳結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞，從這種修飾的細(xì)胞中制備胞外體，然后測(cè)量在該胞外體中表達(dá)的多肽?？梢允褂枚喾N技術(shù)測(cè)量表達(dá)，包括使用定位或被定位多肽的特異性配體。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，使用特異性針對(duì)定位部分或在融合多肽中引入的標(biāo)記序列的抗體來測(cè)定表達(dá)。
在制備融合多肽時(shí)，可以將被定位的部分放置在定位多肽的上游或下游，即C端或N端。融合的方向決定了被定位多肽的表達(dá)類型。具體來說，將被定位多肽偶聯(lián)到定位多肽的細(xì)胞內(nèi)部分會(huì)導(dǎo)致被定位多肽在囊泡內(nèi)部表達(dá)(對(duì)可溶性抗原而言)。另一方面，對(duì)于表達(dá)跨膜的受體，可以由專業(yè)技術(shù)人員根據(jù)結(jié)構(gòu)調(diào)整偶聯(lián)的類型，以允許適當(dāng)?shù)恼郫B并插入到胞外體膜中。
如同后面將公開的那樣，偶聯(lián)可以是直接的，也可以通過一個(gè)間隔分子，胞外體產(chǎn)生細(xì)胞可以有各種不同的來源和起源。
此外，不同的融合可以平行方式，也可以在同樣的囊泡內(nèi)加以表達(dá)和試驗(yàn)。在這一點(diǎn)上，本方法可以用于選擇特異性的單個(gè)定位多肽或者用于篩選遺傳結(jié)構(gòu)文庫。
本方法允許生產(chǎn)改進(jìn)的定位多肽和能夠高度有效地在胞外體中表達(dá)的融合分子。
在這一方面，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)能夠表達(dá)選定的跨膜多肽的胞外體的方法，該方法包括●如上所述選擇一種定位多肽，
●提供一種編碼了與定位多肽融合的選定的跨膜多肽的遺傳結(jié)構(gòu)，●將該遺傳結(jié)構(gòu)在胞外體產(chǎn)生細(xì)胞中表達(dá)，以及●從該修飾細(xì)胞中生產(chǎn)和分離胞外體。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)表達(dá)GPCR或其含有至少一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的部分的胞外體的方法，該方法包括●提供一種遺傳結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)編碼了與含有跨膜結(jié)構(gòu)域和/或如上所述選定的定位多肽融合的GPCR或其部分，●將該遺傳結(jié)構(gòu)在胞外體產(chǎn)生細(xì)胞中表達(dá)，并且●從該表達(dá)GPCR或其部分的修飾細(xì)胞中生產(chǎn)和分離胞外體。
本發(fā)明還涉及表達(dá)重組GPCR或其一部分的胞外體。
本發(fā)明還涉及含有從Melan/MART1、CD40L和CD80中選擇的定位多肽以及被定位多肽的融合多肽。在更優(yōu)選情況下，被定位多肽含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還涉及任何編碼這樣的融合多肽的多核苷酸序列。具體來說，這樣融合的說明性例子以SEQ ID NO32和33提供。
目的多肽本發(fā)明可用于在(從)胞外體或其它脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中定位、選擇性表達(dá)或生產(chǎn)(例如純化)各種多肽，例如抗原、細(xì)胞因子、配體、受體、免疫球蛋白、標(biāo)記多肽(例如標(biāo)記蛋白，如綠色熒光蛋白或酶)、酶、離子通道等，或其一部分。一般來說，本發(fā)明可以與任何目的多肽一起使用，例如任何具有生物學(xué)或免疫學(xué)性質(zhì)的多肽。此外，本發(fā)明可用于同時(shí)在胞外體中表達(dá)或定位幾個(gè)不同的編碼不同多肽的嵌合遺傳結(jié)構(gòu)，以進(jìn)一步擴(kuò)展活性范圍或重組復(fù)合分子。
優(yōu)選的多肽的例子是抗原，例如腫瘤抗原、病毒抗原和微生物抗原。腫瘤抗原的說明性例子是MAGE、BAGE、前列腺腫瘤抗原、癌基因等。這些抗原的氨基酸序列本身已知，并可以通過重組技術(shù)或通過合成來生產(chǎn)。本發(fā)明中被定位或呈遞的特定的抗原包括可溶性抗原和受體的胞外結(jié)構(gòu)域。
其它目的多肽的例子包括淋巴因子(IL-2、IL-4、IL-13)、營養(yǎng)因子(TNF、INF、GM-CSF、G-CSF等)、酶、凝集因子、激素、脂蛋白等。
另一種類型的目的多肽是具有至少一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，更優(yōu)選為GPCR或其部分的受體。事實(shí)上，本發(fā)明現(xiàn)在允許使用定位多肽將跨膜多肽在特定的囊泡中定位和表達(dá)。GPCR在囊泡中的表達(dá)允許它們對(duì)配體(無論是合成的還是天然的)、生產(chǎn)抗體等進(jìn)行純化、研究性質(zhì)、篩選。GPCR的一個(gè)具體的例子是例如CCR7，盡管本發(fā)明也可以與其它受體一起使用。
其它的特定的例子是免疫球蛋白和其片段，例如免疫球蛋白的Fc片段。這樣的Fc片段當(dāng)在胞外體表面中表達(dá)時(shí)，可以將胞外體導(dǎo)向表達(dá)這些Fc片段的受體的細(xì)胞，例如抗原呈遞細(xì)胞。這樣的Fc片段的表達(dá)，不論是單獨(dú)表達(dá)還是與抗原結(jié)合表達(dá)，都有利于并增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞，特別是樹突狀細(xì)胞對(duì)胞外體的識(shí)別，并增加了這些抗原的交叉引發(fā)。
本發(fā)明也明顯地適合于投送治療用蛋白或多肽?？梢允褂霉δ芑闹亟M胞外體或脂質(zhì)體，任選與在它們表面上的組織特異性配體一起，將這樣的蛋白投送到特定的細(xì)胞。藉此，治療用蛋白可以被表達(dá)在缺少內(nèi)源蛋白，或表達(dá)了非功能性的內(nèi)源蛋白從而產(chǎn)生了病理狀態(tài)的細(xì)胞的表面。在這一方面，本發(fā)明的一個(gè)特定的目的是將治療用蛋白投送到受試對(duì)象中的方法，包括(a)提供一種嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼與Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的片段或使用上面公開的方法所鑒定的一種定位多肽相融合的該蛋白；(b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞，以在其表面產(chǎn)生帶有該嵌合蛋白的重組胞外體；(c)收集該重組胞外體，并將該胞外體或其部分注射到該病人中。
此外，因?yàn)楸景l(fā)明也允許將分子化學(xué)偶聯(lián)到Lactadherin或其功能等價(jià)物上，本發(fā)明還擴(kuò)展到非多肽化合物例如小分子、核酸、脂、多糖、糖脂等。
正如所指出的，本發(fā)明現(xiàn)在使通過利用Lactadherin或其功能等價(jià)物定位而將多種分子結(jié)合起來表達(dá)在胞外體中，以重構(gòu)具有增強(qiáng)的免疫原性的人工微粒成為可能。一個(gè)典型的例子是將抗原、Lactadherin、定位多肽(例如Fc片段)和/或佐劑(例如細(xì)胞因子、包括GM-CSF等)組合在一起。
融合嵌合的多肽或化合物可以通過遺傳或化學(xué)融合來制備。
對(duì)于遺傳融合，編碼目的多肽的嵌合基因區(qū)域可以被融合在Lactadherin或定位多肽的上游、下游或任何內(nèi)部的結(jié)構(gòu)域連接處。在這一點(diǎn)上，實(shí)施例證明與Lactadherin的上游融合以及與定位多肽的N-端和C-端融合是有功能的。此外，結(jié)構(gòu)域彼此之間可以直接融合，也可以被不改變嵌合多肽的性質(zhì)的間隔區(qū)域所分隔開。這樣的間隔區(qū)域包括克隆位點(diǎn)、切割位點(diǎn)、撓性結(jié)構(gòu)域等。此外，嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)還可以包含一個(gè)前導(dǎo)的信號(hào)序列以有利于將編碼的嵌合多肽分泌到胞外體產(chǎn)生細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。一般來說，嵌合基因包含Lactadherin的前導(dǎo)序列。然而，也可以插入異源的前導(dǎo)序列，特別是如果利用Lactadherin的部分。此外，嵌合基因還可以含有一個(gè)標(biāo)記以便于純化或監(jiān)測(cè)，例如一個(gè)myc標(biāo)記、一個(gè)多聚組氨酸標(biāo)記等。
對(duì)于化學(xué)融合，可以對(duì)部分或全長的Lactadherin序列進(jìn)行選擇或修飾，以使其末端出現(xiàn)一個(gè)游離的活性基團(tuán)，例如巰基、氨基、羧基以交聯(lián)一個(gè)可溶性的多肽、糖脂或任何小分子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Lactadherin結(jié)構(gòu)編碼了SEQ ID NO7的至少1到230位氨基酸，其中C1結(jié)構(gòu)域(60到225位氨基酸)提供了定位到胞外體的基序，230位的半胱氨酸提供了與其它分子進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)的游離巰基殘基。將肽和化學(xué)物質(zhì)交聯(lián)到SH基團(tuán)可以通過已經(jīng)建立好的方法來進(jìn)行(參見G.T Hermanson(1996)生物結(jié)合技術(shù)，San Diego科學(xué)出版社，785頁)。本方法的優(yōu)點(diǎn)是將本發(fā)明的范圍擴(kuò)展到了可以制備針對(duì)多肽以外的化合物，如糖脂、藥物和有機(jī)化合物的抗體。它還提供了無需引入假定的新的表位就將多肽和化合物定位到胞外體的方法。所選的交聯(lián)試劑已顯示是免疫原性沉默的(上面引用的G.T Hermanson(1996))。新的表位有時(shí)在嵌合基因連接處出現(xiàn)，并可能會(huì)限制嵌合基因產(chǎn)物在特定的預(yù)防和治療人類應(yīng)用中的使用。
因此，修飾的胞外體或脂囊泡(例如脂質(zhì)體)可以通過產(chǎn)生呈遞相關(guān)的Lactadherin結(jié)構(gòu)如SEQ ID NO7的胞外體(脂質(zhì)體)，然后將它們與將要連接的產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)來制備。另外，交聯(lián)到產(chǎn)物上的Lactadherin片段也可以先被制備，然后加入到純化的胞外體或脂質(zhì)體中。
載體本發(fā)明還包括了含有上述的嵌合遺傳結(jié)構(gòu)的載體以及含有如上所述的嵌合遺傳結(jié)構(gòu)或載體的重組細(xì)胞。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體、病毒、人工染色體等。典型的例子包括質(zhì)粒，例如那些從商業(yè)可獲得的質(zhì)粒，特別是pUC、pcDNA、pBR等衍生的質(zhì)粒。其它的優(yōu)選載體從病毒衍生，例如復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、AAV、桿狀病毒或痘苗病毒。對(duì)載體的選擇可以由專業(yè)技術(shù)人員根據(jù)將要使用該載體的重組宿主細(xì)胞進(jìn)行調(diào)整。在這一點(diǎn)上，優(yōu)選使用能夠轉(zhuǎn)染或感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的載體。事實(shí)上，優(yōu)選的重組宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。它們可以是原始的細(xì)胞或建立的細(xì)胞系。說明性例子包括成纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞、免疫細(xì)胞等以及它們的先祖細(xì)胞或前體細(xì)胞。最優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是產(chǎn)生胞外體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這些細(xì)胞包括例如腫瘤細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞或肥大細(xì)胞。
胞外體產(chǎn)生細(xì)胞胞外體產(chǎn)生細(xì)胞包括任何生產(chǎn)和分泌胞內(nèi)體源的膜囊泡的細(xì)胞，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物源的細(xì)胞，其中的膜囊泡是由后期的胞內(nèi)體多囊泡體與質(zhì)膜融合產(chǎn)生的(4)。來自多種組織類型的細(xì)胞已經(jīng)表明能夠分泌胞外體，例如樹突狀細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞。生產(chǎn)、純化胞外體的方法或使用胞外體用于治療目的或作為研究工具已經(jīng)有所描述，例如在WO99/03499、WO00/44389和WO97/05900中，在此引為參考。本發(fā)明的優(yōu)選胞外體產(chǎn)生細(xì)胞是哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞、哺乳動(dòng)物T淋巴細(xì)胞和哺乳動(dòng)物樹突狀細(xì)胞，一般為鼠或人來源的。在這一方面，細(xì)胞優(yōu)選為永生化的樹突狀細(xì)胞(WO94/28113)、幼樹突狀細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞(WO99/03499)。此外，為了生產(chǎn)抗體，使用B淋巴細(xì)胞作為胞外體產(chǎn)生細(xì)胞可能是有優(yōu)勢(shì)的，因?yàn)楫a(chǎn)生的胞外體含有附加的功能和分子，例如促進(jìn)抗體產(chǎn)生的MHCII類分子。此外，已經(jīng)表明B細(xì)胞衍生的胞外體能夠結(jié)合到濾泡樹突狀細(xì)胞，這是抗體誘導(dǎo)的另一個(gè)重要特點(diǎn)(10)。
細(xì)胞可以在任何合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)和維持，例如RPMI、DMEM等。培養(yǎng)可以在任何合適的裝置中進(jìn)行，例如平板、碟子、試管、搖瓶等。
可以使用任何常規(guī)的方法將遺傳結(jié)構(gòu)(或載體)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞，例如通過裸露DNA技術(shù)、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、肽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、物理或化學(xué)試劑或處理、電穿孔等。在這一方面，應(yīng)該注意到短暫的轉(zhuǎn)染足以表達(dá)相關(guān)的嵌合基因，因此不需要產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系或優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。由這樣的細(xì)胞產(chǎn)生的胞外體可以按照本領(lǐng)域熟知的技術(shù)收集和/或純化，例如通過離心、層析等。優(yōu)選的技術(shù)已經(jīng)在WO00/44389和US09/780748中描述，在此引為參考。
本發(fā)明重組的功能化的胞外體可以用于生產(chǎn)抗體、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、投送生物活性和/或作為篩選工具以及選擇任何選定的多肽的配體。
抗體的制備在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用上述的重組胞外體生產(chǎn)特異性針對(duì)任何多肽或其它抗原的抗體。
本發(fā)明的一個(gè)值得考慮的優(yōu)點(diǎn)是在重組胞外體上抗原與免疫刺激成分相結(jié)合，這就允許針對(duì)免疫原性弱的抗原產(chǎn)生抗體，在這種情況下經(jīng)典的制備抗體的方法都是失敗的。具體來說，從B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的胞外體含有MHC II類分子，可以刺激抗體的產(chǎn)生。此外，不需要純化大量的抗原就可以制備抗體。事實(shí)上，不論在其表面上表達(dá)的外源抗原的本質(zhì)是什么，都可以使用單一的小規(guī)模的純化方法分離胞外體(US09/780748)。因此，可以非?？斓赝瓿煽乖苽洳襟E，即一般可以在少于12個(gè)小時(shí)之內(nèi)。這種方法快速，可以平行處理許多樣品，允許同時(shí)制備多種抗原用于免疫。在天然存在的囊泡中表達(dá)抗原，再結(jié)合溫和的純化步驟，可以幫助保護(hù)抗原的天然構(gòu)象，能夠產(chǎn)生具有潛在的治療用途的相關(guān)抗體。此外，本發(fā)明產(chǎn)生在其表面含有高密度嵌合分子(例如抗原)的脂質(zhì)囊泡。這樣的高密度可以與聚合狀態(tài)相比，通過增加抗原的親合力極為有利于抗體的生產(chǎn)。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是多肽可以被胞外體產(chǎn)生細(xì)胞表達(dá)，因而易于進(jìn)行天然的加工和翻譯后修飾(糖基化等)途徑。
因此本發(fā)明還涉及產(chǎn)生結(jié)合了多肽的抗體的方法，該方法包括用上述的表達(dá)了該多肽或其一個(gè)表位的功能化胞外體免疫非人類的哺乳動(dòng)物，然后從該哺乳動(dòng)物收集抗體或抗體產(chǎn)生細(xì)胞。該方法特別適合于生產(chǎn)針對(duì)上述的與Lactadherin融合的抗原的抗體，或者與定位多肽融合的跨膜受體的抗體。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)與多肽結(jié)合的抗體的方法，包括(a)提供一種嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼與Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的部分融合的該多肽或其一種表位；(b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生在其表面上呈遞該多肽或表位的重組胞外體；(c)收集該重組胞外體并將該胞外體或其一部分注射到非人類的哺乳動(dòng)物中以產(chǎn)生結(jié)合了該多肽或表位的抗體；以及(d)從該哺乳動(dòng)物收集抗體或抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)與受體例如GPCR結(jié)合的抗體的方法，包括(a)提供一種嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼與定位多肽融合的該受體或其一種表位；(b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生在其表面上呈遞該受體或表位的重組胞外體；(c)收集該重組胞外體并將該胞外體或其一部分注射到非人類的哺乳動(dòng)物中以產(chǎn)生結(jié)合了該受體或表位的抗體；以及(d)從該哺乳動(dòng)物收集抗體或抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
抗體可以是多克隆的也可以是單克隆的。從不同的物種，包括小鼠、嚙齒動(dòng)物、靈長動(dòng)物、馬、豬、兔、禽類等生產(chǎn)多克隆抗體的方法可以在例如Vaitukaitis等1971年的文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)。簡(jiǎn)單來說，抗原(在本發(fā)明中為重組胞外體)可以在含或不含佐劑(完全或不完全佐劑，例如弗氏佐劑)的情況下注射，并一般通過皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射的方式給藥到動(dòng)物?？梢赃M(jìn)行重復(fù)注射。收集血液樣品，分離免疫球蛋白或血清。
生產(chǎn)單克隆抗體的方法可以在例如Harlow等(抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，CSH出版社，1988)或Kohler等(Nature 256(1975)495)的文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，在此引為參考。簡(jiǎn)單來說，這些方法包括用抗原(在本發(fā)明中為重組胞外體)免疫動(dòng)物，接著回收脾或淋巴結(jié)細(xì)胞，然后與永生的細(xì)胞如骨髓瘤細(xì)胞融合。得到的雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體，并可以通過有限的稀釋分離單獨(dú)的克隆加以選擇。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，胞外體產(chǎn)生細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞。
在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，胞外體產(chǎn)生細(xì)胞和/或Lactadherin和/或定位多肽來自與被免疫接種的哺乳動(dòng)物相同的物種。事實(shí)上，在這樣的系統(tǒng)中，胞外體和Lactadherin不具有免疫原性，產(chǎn)生的抗體基本上只針對(duì)選定的抗原。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，胞外體產(chǎn)生細(xì)胞是鼠細(xì)胞，Lactadherin是鼠Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的部分或變體，非人類的哺乳動(dòng)物是小鼠，抗原或表位來自不同的物種，例如是人類來源的。更為優(yōu)選的情況下，小鼠是人源化小鼠，允許產(chǎn)生人源化的抗體。
為此，蛋白(抗原或表位)的核苷酸序列可以融合到小鼠Lactadherin的C1和/或C2結(jié)構(gòu)域，將得到的嵌合序列使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)克隆到一個(gè)真核表達(dá)載體中。編碼嵌合蛋白的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染進(jìn)一個(gè)產(chǎn)生胞外體的小鼠細(xì)胞系中，并在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)幾天后收獲重組胞外體，然后通過蔗糖密度梯度離心純化重組胞外體(US09/780748)。嵌合蛋白在重組胞外體上的存在使用抗C1/C2結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體通過Western印跡分析來建立。然后將帶有嵌合蛋白的重組胞外體注射到同源的小鼠中產(chǎn)生抗體。就此而論，只有包含在用于產(chǎn)生嵌合蛋白的蛋白序列中的表位才代表被免疫小鼠中的外源抗原。抗體的產(chǎn)生在根據(jù)抗原的本質(zhì)所設(shè)計(jì)的篩選分析中被證實(shí)。如果將重組胞外體應(yīng)用在篩選分析中，則需要制備第二個(gè)嵌合蛋白，其中相同的蛋白抗原序列與Lactadherin序列的擴(kuò)展的C1/C2結(jié)構(gòu)域融合。此外，也可以使用表達(dá)與來自不同物種的Lactadherin C1/C2結(jié)構(gòu)域融合的蛋白抗原的重組胞外體。這些新的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生具有新的連接序列的嵌合蛋白，因此避免了檢測(cè)/選擇針對(duì)用于免疫的嵌合蛋白的連接處的抗體。
正如上面指出的，本方法非常具有優(yōu)勢(shì)，可以用于在各種不同的物種中產(chǎn)生針對(duì)任何選定的抗原或表位，包括腫瘤抗原、細(xì)菌抗原或病毒抗原的抗體。
展示新的生物活性的重組胞外體的制備本發(fā)明可用于生產(chǎn)能夠表現(xiàn)任何選定的生物活性的重組胞外體。它們可以通過將一個(gè)(或幾個(gè))具有特定生物學(xué)活性的多肽定位到胞外體的表面而產(chǎn)生，如上所述。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，在重組胞外體上生物活性成分可以達(dá)到高的局部濃度，這就能夠使胞外體獲得潛在的新的生物活性，具有在靶細(xì)胞上交聯(lián)受體的可能性。這種高的局部濃度也允許增加被運(yùn)送分子的親和性，因此改善了胞外體的潛力。此外，本發(fā)明還允許在胞外體上重建生物活性多組分的實(shí)體，由此將重組胞外體的應(yīng)用領(lǐng)域擴(kuò)展到多鏈的蛋白，而經(jīng)典的方法操作這樣的蛋白是困難的。
可以使用的生物活性蛋白的一個(gè)例子是白細(xì)胞介素-2(IL-2)，其是一種激活T細(xì)胞的細(xì)胞因子，用在癌癥的免疫治療中以刺激T細(xì)胞針對(duì)腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)。這種免疫學(xué)確定的佐劑與腫瘤抗原同時(shí)出現(xiàn)在胞外體上可以改善胞外體的效率。在這種情況下，證實(shí)重組胞外體上的IL-2是有生物活性的功能性分析需要使用一種IL-2依賴性細(xì)胞系。
另一個(gè)生物活性蛋白的例子是CD40配體(CD40L)，它誘導(dǎo)輔助信號(hào)，而這是DC啟動(dòng)針對(duì)被捕獲抗原的免疫反應(yīng)所需要的。輔助信號(hào)與腫瘤抗原同時(shí)出現(xiàn)在胞外體上可以改善胞外體的效率。在這種情況下，監(jiān)測(cè)在DC上誘導(dǎo)活化標(biāo)記的功能性分析將被用來證實(shí)重組胞外體上的CD40L是有生物活性的。
其它的例子包括其它的淋巴因子(IL-4、IL-13)、營養(yǎng)因子(TNF、IFN、GM-CSF、G-CSF等)、酶、凝集因子、激素、脂蛋白等。
其它的特定的例子是能夠促進(jìn)胞外體定位或與特定細(xì)胞，優(yōu)選為與樹突狀細(xì)胞相互作用的多肽。這樣的定位多肽包括例如免疫球蛋白的Fc片段。這樣的Fc片段當(dāng)在胞外體表面表達(dá)時(shí)，可以用于將胞外體導(dǎo)向抗原呈遞細(xì)胞。這樣的Fc片段的表達(dá)與抗原(和任選上面公開的佐劑分子)的表達(dá)相結(jié)合，促進(jìn)并增強(qiáng)了抗原呈遞細(xì)胞、特別是樹突狀細(xì)胞對(duì)胞外體的識(shí)別，并增加了這些抗原的交叉引發(fā)。
為了生產(chǎn)這樣的功能化的胞外體，生物活性蛋白的全長或部分cDNA序列可以融合在編碼定位多肽的序列的上游或下游，將得到的嵌合序列使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)克隆到一個(gè)真核表達(dá)載體中。定位多肽可以選自或來自人類Lactadherin序列的C1和/或C2結(jié)構(gòu)域或其等價(jià)物，也可以來自使用上面公開的篩選方法鑒定的定位多肽，例如MART1/MelanA或其片段。編碼嵌合蛋白的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到一個(gè)胞外體產(chǎn)生細(xì)胞系中，在對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)幾天后收獲重組胞外體。然后通過蔗糖密度梯度離心純化重組胞外體。嵌合蛋白在重組胞外體上的存在使用抗原特異性抗體(如果可以得到)和/或抗定位多肽的抗體通過Western印跡分析來建立。然后進(jìn)行功能分析以證實(shí)與定位多肽融合的蛋白的生物活性得到保留。接著可以將功能化胞外體體內(nèi)給藥到任何需要它的哺乳動(dòng)物受試對(duì)象，特別是人類受試對(duì)象。給藥可以采取各種不同的途徑，例如通過全身性注射，如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腫瘤內(nèi)、皮下等。
使用重組胞外體將全長抗原投送到DC除了由重組胞外體誘導(dǎo)的體液或抗體反應(yīng)外，也可以產(chǎn)生針對(duì)在胞外體上表達(dá)的抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)。如上所述制備包括編碼腫瘤或微生物抗原和定位多肽的全長cDNA的嵌合序列。然后可以使用重組胞外體直接接種個(gè)體或者在體外間接脈沖DC。將全長抗原投送到DC中緩和了疫苗使用的單倍型限制。此外，通過抗原吸收和轉(zhuǎn)移到DC的自然的途徑投送，會(huì)使抗原得到有效的加工，并對(duì)I類和II類表位均能夠呈遞。因此，表達(dá)全長的腫瘤或微生物抗原的重組胞外體可以有助于改進(jìn)針對(duì)癌癥和傳染病的疫苗。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種將抗原投送到受試對(duì)象的方法，包括(a)提供一種嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼融合了Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分的該抗原；(b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生在它們的表面上帶有該抗原的重組胞外體；(c)收集該重組胞外體，并將該胞外體或其一部分注射到該受試對(duì)象中。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種將抗原投送到受試對(duì)象的方法，包括(a)提供一種嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼融合了Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分的該抗原；(b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生在它們的表面上帶有該抗原的重組胞外體；(c)收集該重組胞外體，并將其離體與來自該受試對(duì)象的樹突狀細(xì)胞接觸；以及(d)將該接觸過的樹突狀細(xì)胞或其一部分注射到該受試對(duì)象中。
樹突狀細(xì)胞的一“部分”是指可以將所有接觸過的DC都注射，或者如果需要，也可以注射一部分，而將其余的保留以備進(jìn)一步注射或使用。此外，術(shù)語“部分”還表明盡管完整的細(xì)胞可以施用，但其中衍生的制劑也可以注射，例如由這樣的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的膜提取物或胞外體。
樹突狀細(xì)胞或其部分可以通過幾種途徑注射，例如通過靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腫瘤內(nèi)、肌肉內(nèi)等，例如在WO99/03499中所描述的，在此引為參考。
正如上面指出的，在特定的實(shí)施方案中，胞外體產(chǎn)生細(xì)胞可以與其它的嵌合遺傳結(jié)構(gòu)接觸，這些嵌合遺傳結(jié)構(gòu)編碼了與Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分融合的其它(附加的)分子，從而產(chǎn)生在其表面上帶有除了抗原外的該分子的重組胞外體。該分子可以是佐劑、定位多肽、Lactadherin等。具體的例子包括免疫球蛋白的Fc片段、CD40配體、細(xì)胞因子和GM-CSF。多種遺傳結(jié)構(gòu)可以被包含在一個(gè)載體中或在幾個(gè)分開的載體中，它們可以同時(shí)或連續(xù)地與胞外體產(chǎn)生細(xì)胞接觸。
功能化合成脂質(zhì)囊泡的生產(chǎn)此外，正如上面指出的，本發(fā)明可以與多種膜囊泡一起使用，包括天然的囊泡(例如胞外體)或合成的囊泡，例如脂質(zhì)體。脂質(zhì)體在研究和醫(yī)藥中是有廣泛用途的工具。它們是從天然的磷脂和膽固醇生產(chǎn)的小人工囊泡。這種囊泡現(xiàn)在正被用作藥物載體，運(yùn)載各種分子，包括小藥物分子、蛋白、核苷酸和質(zhì)粒。因此，脂質(zhì)體可以有大量的應(yīng)用。在本發(fā)明中，有可能通過上述的嵌合分子將分子(例如多肽、抗原、小分子等)定位到脂質(zhì)體，并在受試對(duì)象中給藥這樣的功能化囊泡。
一般來說，脂質(zhì)體應(yīng)含有磷脂酰絲氨酸或其它在胞外體中天然含有的脂類，以利于對(duì)Lactadherin嵌合多肽的定位。
關(guān)于這一點(diǎn)，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)抗體的方法，包括●提供一種嵌合分子，它包含融合了Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分的抗原；●將該嵌合分子與含有磷脂酰絲氨酸或其它在胞外體中天然存在的脂類的脂質(zhì)囊泡接觸，以產(chǎn)生在它們的表面上呈遞該抗原的功能化脂質(zhì)囊泡；●用這種功能化脂質(zhì)囊泡免疫非人類的哺乳動(dòng)物以產(chǎn)生結(jié)合了該抗原的抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是一種將抗原投送到受試對(duì)象的方法，包括●提供一種嵌合分子，它包含融合了Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分的抗原；●將該嵌合分子與含有磷脂酰絲氨酸或其它在胞外體中天然存在的脂類的脂質(zhì)囊泡接觸，以產(chǎn)生在它們的表面上呈遞該抗原的功能化脂質(zhì)囊泡；以及●在存在Lactadherin的情況下，離體將該功能化脂質(zhì)囊泡與來自該受試對(duì)象的樹突狀細(xì)胞接觸；以及●將該接觸過的樹突狀細(xì)胞或其部分注射到該受試對(duì)象。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是一種將抗原投送到受試對(duì)象的方法，包括●提供一種嵌合分子，它包含融合了Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分的抗原；●將該嵌合分子與含有磷脂酰絲氨酸或其它在胞外體中天然存在的脂類的脂質(zhì)囊泡接觸，以產(chǎn)生在它們的表面上呈遞該抗原的功能化脂質(zhì)囊泡；以及●在存在Lactadherin的情況下將該功能化脂質(zhì)囊泡或其一部分注射到該受試對(duì)象中。
本發(fā)明還涉及一種含有上述的功能化脂質(zhì)囊泡和Lactadherin的組合物。
脂質(zhì)囊泡優(yōu)選為脂質(zhì)體。脂質(zhì)體可以按照常規(guī)的技術(shù)生產(chǎn)，在優(yōu)選情況下，對(duì)磷脂酰絲氨酸或其它在胞外體中天然含有的脂類進(jìn)行富集?？乖梢允侨魏斡袡C(jī)化合物，例如多肽、核酸、脂類、多糖、糖脂等。嵌合分子可以含有遺傳(當(dāng)抗原是多肽時(shí))或化學(xué)偶聯(lián)到Lactadherin的抗原，如上所述。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)功能化脂質(zhì)囊泡的方法，包括●提供含有磷脂酰絲氨酸或其它在胞外體中天然含有的脂類的脂質(zhì)囊泡，該囊泡帶有一個(gè)活化的Lactadherin，其包括Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分，被一個(gè)反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)所活化；●將該脂質(zhì)囊泡與同該反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)相互作用的化合物接觸以產(chǎn)生功能化的脂質(zhì)囊泡，以及●任選純化該功能化的脂質(zhì)囊泡。
如上所述，活化的Lactadherin可以是在其一端具有半胱氨酸殘基的Lactadherin的一部分，因此產(chǎn)生了反應(yīng)性的SH基團(tuán)。這樣一種活化的Lactadherin可以含有，例如SEQ ID NO7的1-230位氨基酸。此外，活化的Lactadherin可以通過化學(xué)方法在Lactadherin的一端加上一個(gè)活性基團(tuán)如巰基、氨基或羧基來制備。帶有該活化Lactadherin的脂質(zhì)囊泡可以是胞外體或合成的囊泡例如脂質(zhì)體。關(guān)于這一點(diǎn)，在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一個(gè)呈遞上述的活化Lactadherin的脂質(zhì)體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及帶有如上所述的活化Lactadherin的脂質(zhì)體。這樣的胞外體或合成脂質(zhì)囊泡可以如上所述生產(chǎn)。化合物可以是任何有機(jī)分子，例如多肽、核酸、脂類、糖脂、多糖、小分子、藥物(例如醫(yī)藥)、毒素等。此外，如上所述，脂質(zhì)囊泡可以用各種多肽功能化，例如采用抗體、定位部分和/或佐劑和/或Lactadherin。典型的例子包括含有與Lactadherin或其C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域融合的各種多肽的脂質(zhì)囊泡，該多肽從抗原、定位多肽(例如免疫球蛋白的Fc片段)和佐劑(例如CD40配體、細(xì)胞因子、GM-CSF等)中選擇。
基因和DNA疫苗接種本發(fā)明也可用于在體內(nèi)直接進(jìn)行DNA或基因疫苗接種，使用上面公開的編碼嵌合抗原分子的遺傳結(jié)構(gòu)。
針對(duì)基因和DNA免疫的抗原可以產(chǎn)生體液或抗體反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。包括編碼腫瘤或微生物抗原和定位多肽的部分或全長cDNA的嵌合序列如上所述制備。然后編碼這些嵌合蛋白的病毒、非病毒載體或DNA可以被用于直接接種個(gè)體或動(dòng)物。已經(jīng)表明基因和DNA免疫可以誘導(dǎo)潛在的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致宿主針對(duì)微生物感染產(chǎn)生保護(hù)和腫瘤消退(參見Hasan等，J.Immunol.Methods 229，1-22，1999)。最近的發(fā)現(xiàn)表明，抗原呈遞細(xì)胞(APC)的交叉引發(fā)，即APC吸收由DNA轉(zhuǎn)染的非APC產(chǎn)生的外源抗原，是在基因和DNA接種中誘導(dǎo)強(qiáng)烈免疫反應(yīng)的主導(dǎo)機(jī)制(Jae Ho Cho等，J.Immunol.167，5549-5557，2001)。此外，也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞相關(guān)的抗原交叉呈遞比可溶性抗原的交叉呈遞要有效得多(Ming Li等，J.Immunol.166，6099-6103，2001)。從這些發(fā)現(xiàn)出發(fā)，相信在體內(nèi)將抗原從DNA轉(zhuǎn)染的非APC轉(zhuǎn)移到APC的適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ窃O(shè)計(jì)最適的基因和DNA疫苗的關(guān)鍵。在這一方面，根據(jù)本發(fā)明的基因疫苗接種方法為直接闡明這個(gè)判據(jù)提供了相當(dāng)多的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗梢栽隗w內(nèi)產(chǎn)生與胞外體結(jié)合的抗原，然后被轉(zhuǎn)移到APC。
因此本發(fā)明的另一個(gè)目的在于一種將抗原投送到受試對(duì)象的方法，包括給該受試對(duì)象注射一種編碼了與上述的定位多肽，特別是與Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分融合的該抗原的遺傳結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種在受試對(duì)象中產(chǎn)生針對(duì)特定抗原的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給該受試對(duì)象注射一種編碼了與上述的定位多肽，特別是與Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分融合的該抗原的遺傳結(jié)構(gòu)。
基因疫苗接種可以使用多種病毒載體，例如痘苗病毒、痘病毒、腺病毒、腺伴隨病毒等，非病毒載體，例如與各種脂或肽成分結(jié)合的DNA，或使用純的(例如裸露的)DNA來進(jìn)行。接種可以通過多種注射途徑進(jìn)行，包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或皮內(nèi)。多種多樣載體投送裝置或技術(shù)可用于基因疫苗接種，包括基因槍或電穿孔。動(dòng)物和個(gè)體也可以使用在體外用載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系來免疫。選擇能夠釋放大量胞外體的細(xì)胞系將特別有利。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，該方法包括直接注射編碼了嵌合多肽的裸露的DNA或RNA。裸露意味著注射的成分中不含任何幫助轉(zhuǎn)染的試劑。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，遺傳結(jié)構(gòu)以裸露的形式通過肌肉內(nèi)注射給藥，更優(yōu)選使用基因槍。
該方法允許通過胞外體交叉呈遞非可溶形式的抗原，胞外體的功能是從APC周圍的細(xì)胞轉(zhuǎn)移抗原(交叉引發(fā))(Wolfers等，NatureMedicine 7，297-303，2001)。圖6顯示了該方法的示意圖。用編碼含有Lactadherin的C1/C2結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白的病毒、非病毒或裸露DNA載體免疫使得嵌合蛋白被多種多樣的細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)，包括胞外體產(chǎn)生細(xì)胞(步驟1)。然后重組蛋白被釋放到細(xì)胞外與胞外體相關(guān)的環(huán)境(步驟2)。當(dāng)帶有嵌合蛋白的胞外體結(jié)合到APC時(shí)，APC的交叉引發(fā)發(fā)生(步驟3)。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，抗原到APC的交叉呈遞(步驟3)還可以通過與編碼嵌合蛋白的遺傳結(jié)構(gòu)(例如DNA)、編碼Lactadherin的遺傳結(jié)構(gòu)(例如DNA)一起給藥來增強(qiáng)，因?yàn)榻Y(jié)合到DC的胞外體含有Lactadherin。此外，遺傳結(jié)構(gòu)還可以制備成抗原的序列被插入在全長的Lactadherin序列中介于EGF結(jié)構(gòu)域和C1/C2結(jié)構(gòu)域之間。因此，注射一種單一的結(jié)構(gòu)就可以產(chǎn)生通過Lactadherin的C1/C2結(jié)構(gòu)域定位到胞外體的抗原，并且其中含有Lactadherin的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以指導(dǎo)胞外體特異性投送到DC。
此外，為了進(jìn)一步增強(qiáng)免疫反應(yīng)，編碼抗原以及任選Lactadherin的遺傳結(jié)構(gòu)可以與編碼佐劑，例如促進(jìn)免疫反應(yīng)的因子或分子的遺傳結(jié)構(gòu)共同給藥。這樣的佐劑的例子包括CD40配體、GM-CSF、細(xì)胞因子等。
此外，為了進(jìn)一步增強(qiáng)免疫反應(yīng)，編碼抗原、Lactadherin和/或佐劑的遺傳結(jié)構(gòu)可以與編碼定位多肽，例如指導(dǎo)胞外體到抗原呈遞細(xì)胞的因子或分子的遺傳結(jié)構(gòu)一起給藥。這樣的定位多肽的例子包括免疫球蛋白的Fc片段。
在這一方面，在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，該方法包含了給受試對(duì)象注射編碼嵌合抗原的遺傳結(jié)構(gòu)和編碼Lactadherin或與Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分融合的輔助分子的遺傳結(jié)構(gòu)。編碼Lactadherin或嵌合輔助分子的結(jié)構(gòu)可以與編碼嵌合抗原的結(jié)構(gòu)同時(shí)注射，也可以分開注射。當(dāng)進(jìn)行分開注射時(shí)，它們可以在幾乎同樣的時(shí)間進(jìn)行，也可以不這樣。具體來說，可以首先注射編碼嵌合抗原的結(jié)構(gòu)，然后注射編碼Lactadherin或嵌合輔助分子的結(jié)構(gòu)。但是優(yōu)選的是各種各樣嵌合蛋白同時(shí)在體內(nèi)出現(xiàn)并被同樣的胞外體表達(dá)。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，蛋白從包含在單個(gè)載體如病毒載體(如痘苗病毒)的遺傳結(jié)構(gòu)上表達(dá)。
在這一方面，本發(fā)明還包含了一種組合物，它含有一種編碼與定位多肽融合的抗原的遺傳結(jié)構(gòu)，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；以及(2)通過上述方法鑒定的定位多肽，和(a)一種編碼與定位多肽融合的免疫輔助分子(例如一個(gè)佐劑或細(xì)胞定位多肽)的遺傳結(jié)構(gòu)，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；和(2)通過上述方法鑒定的定位多肽，和/或(b)一種編碼Lactadherin的遺傳結(jié)構(gòu)。事實(shí)上，本發(fā)明允許在直接體內(nèi)表達(dá)與Lactadherin或其部分融合的各種功能分子的基礎(chǔ)上，在胞外體的表面有效地組合這些功能分子。這種組合的表達(dá)使得免疫反應(yīng)得到增強(qiáng)，它模擬了抗原微粒或免疫復(fù)合物。
優(yōu)選的例子是包含下列成分的組合物(a)一種編碼與定位多肽融合的抗原的遺傳結(jié)構(gòu)，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；和(2)通過上述方法鑒定的定位多肽，(b)一種編碼與定位多肽融合的輔助多肽的遺傳結(jié)構(gòu)，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；和(2)通過上述方法鑒定的定位多肽，該輔助多肽是一個(gè)細(xì)胞因子，如GM-CSF或IL-2或CD40L，和/或(c)一種編碼與定位多肽融合的免疫球蛋白的Fc片段的遺傳結(jié)構(gòu)，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；和(2)通過上述方法鑒定的定位多肽，和/或(d)一種編碼Lactadherin的遺傳結(jié)構(gòu)如上所述，遺傳結(jié)構(gòu)可以是任何DNA或RNA分子，一般為質(zhì)粒、病毒載體、病毒粒子、裸露的DNA或任何含有它們的細(xì)胞。不同的遺傳結(jié)構(gòu)可以被包含在單個(gè)載體中，也可以在分別的載體中或其任意的組合。組合物一般還含有可藥用的賦形劑或載體，例如稀釋劑、緩沖劑、等滲溶液等。組合物還可以包括協(xié)助轉(zhuǎn)染的試劑，如上所述。
按照本發(fā)明將全長或部分的抗原投送到DC緩和了疫苗使用的單倍型限制。此外，通過抗原吸收和轉(zhuǎn)移到DC的自然的生理途徑投送，會(huì)使抗原得到有效的加工，并對(duì)I類和II類表位均能夠呈遞。因此，使用編碼定位到胞外體的腫瘤或微生物抗原的載體進(jìn)行基因和DNA疫苗接種有助于改進(jìn)針對(duì)癌癥和傳染病的基因和DNA疫苗。
一個(gè)具體的針對(duì)HIV的DNA疫苗組合物的例子包括了一種遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼了與Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分融合的抗原，該抗原從逆轉(zhuǎn)錄酶、gag、env、nef和tat多肽或其部分中選擇。
此外，除了基因疫苗之外，蛋白疫苗也可以以同樣的方式使用。在這一方面，可以使用純化形式的重組嵌合抗原給藥到病人。在給藥之后，具有Lactadherin的C1和/或C2結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原將在體內(nèi)被裝載進(jìn)病人自己的循環(huán)胞外體中，從而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
因此本發(fā)明的另一個(gè)目的包括了一種在受試對(duì)象中產(chǎn)生針對(duì)一個(gè)特定抗原的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給該受試對(duì)象注射含有與定位多肽融合的該抗原的嵌合多肽，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；和(2)通過上述方法鑒定的定位多肽。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種將抗原投送到受試對(duì)象中的方法，包括(a)提供一種編碼了與Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分融合的該抗原的嵌合遺傳結(jié)構(gòu)；(b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生在其表面上帶有該嵌合抗原的重組胞外體；(c)收集該重組胞外體并純化該嵌合抗原；以及(d)給該病人注射純化的嵌合抗原。
重組胞外體作為蛋白-蛋白相互作用研究的工具隨著基因組測(cè)序計(jì)劃提供的信息的豐富，正在開發(fā)基因組范圍內(nèi)的基因發(fā)現(xiàn)和功能確定的方法。重組胞外體構(gòu)成了一種新的研究蛋白-蛋白相互作用的技術(shù)，可以允許對(duì)文庫進(jìn)行高通量的篩選以鑒定每一種蛋白-蛋白相互作用的對(duì)應(yīng)物。
對(duì)于這樣的應(yīng)用，蛋白被表達(dá)在兩個(gè)具有不同蛋白圖譜的重組胞外體物種中。來自每個(gè)重組胞外體物種的嵌合蛋白彼此間的相互作用可以使用重組胞外體上的特殊標(biāo)記通過標(biāo)準(zhǔn)的基于ELISA的分析方法來檢測(cè)。該方法可以用于鑒定一個(gè)已知的配體或受體的對(duì)應(yīng)物。
因此，在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種選擇或鑒定一個(gè)多肽的配體或結(jié)合配偶體的方法，包括(a)提供一種嵌合遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼與上述的定位多肽，特別是與Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分融合的該多肽；(b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生在其表面上呈遞該多肽的重組胞外體；(c)將(b)中的重組胞外體與侯選化合物接觸，并測(cè)定該侯選化合物與該胞外體上的該多肽結(jié)合的能力。
侯選化合物可以是一個(gè)被分離的產(chǎn)物、產(chǎn)物的混合物或化合物的文庫。侯選化合物的例子包括小分子(例如有機(jī)產(chǎn)物)及其文庫、DNA文庫、蛋白文庫、可以被噬菌體或其它展示系統(tǒng)展示的抗體(或其片段)文庫等，但不限于此。侯選化合物可以平行方式或作為復(fù)合混合物測(cè)試。
測(cè)定侯選化合物結(jié)合該多肽(或抗原)的能力的方法包括，例如分離胞外體并用其免疫非人類的哺乳動(dòng)物。在該哺乳動(dòng)物中抗體的產(chǎn)生表明侯選化合物與胞外體復(fù)合，并允許對(duì)該分子進(jìn)行鑒定。
該技術(shù)可用于產(chǎn)生針對(duì)一個(gè)分子的配體的抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明，將需要抗體的受體的配體表達(dá)在脂質(zhì)囊泡的表面。這樣的囊泡與含有該受體的制劑(例如生物樣品)接觸。對(duì)胞外體進(jìn)行清洗和純化，然后注射到非人類的哺乳動(dòng)物中。可以從該哺乳動(dòng)物中分離出針對(duì)受體的抗體。這種策略對(duì)于生產(chǎn)針對(duì)復(fù)合分子、不穩(wěn)定的分子或甚至那些不能得到分離形式的分子的抗體是非常有利的。
重組多肽的純化本發(fā)明還提供了一種從上述的功能化胞外體中生產(chǎn)多肽的方法。該方法是源于Lactadherin令人意外地在胞外體中選擇性表達(dá)或定位多肽的性質(zhì)。因此，胞外體構(gòu)成了一個(gè)重要的Lactadherin或各種含有Lactadherin片段的嵌合多肽的來源，從中可以回收和/或純化這些蛋白。這種方法的一個(gè)特別的優(yōu)勢(shì)是胞外體的制備為相對(duì)富集和濃縮需要純化的蛋白提供了一種快速的手段，允許從大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)物中以小的樣品體積純化蛋白。在這種方法中，可以生產(chǎn)Lactadherin或含有Lactadherin的C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的嵌合多肽，它們可以使用標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)方法從胞外體中直接提取出來，例如包括用去污劑或鹽裂解胞外體以及用脂類或肽特異性釋放蛋白。此外，當(dāng)在蛋白合C1-C2結(jié)構(gòu)域間插入了特異性位點(diǎn)時(shí)，在對(duì)嵌合多肽進(jìn)行蛋白水解切割后可以從胞外體中直接釋放(天然的)蛋白。將這樣的位點(diǎn)加以充分表征，包括例如furin、腸激酶、因子X等的切割位點(diǎn)。然后可以使用標(biāo)準(zhǔn)的層析方法，包括陰離子或疏水層析和/或在共價(jià)結(jié)合了凝集素、特異性抗體、受體或配體和標(biāo)記對(duì)應(yīng)物的柱上進(jìn)行親和層析來純化提取出的蛋白。該技術(shù)也適合于純化與上述方法鑒定的定位多肽融合的多肽。
因此本發(fā)明的另一個(gè)目的在于一種生產(chǎn)含有Lactadherin或其一部分的多肽的方法，該方法包括a)提供一種編碼了該多肽的遺傳結(jié)構(gòu)；b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生在其表面上呈遞該多肽的功能化胞外體；c)任選收集和/或純化該功能化胞外體，以及d)從該功能化胞外體中回收和/或純化該多肽或其片段。
正如已經(jīng)指出的，多肽可以是Lactadherin，例如野生型的Lactadherin或其片段。在這一方面，本發(fā)明提供了一種有效的生產(chǎn)(和純化)Lactadherin的方法，包括將編碼Lactadherin的遺傳結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生在其表面上呈遞該多肽的功能化胞外體，任選收集和/或純化該功能化胞外體，以及從該功能化胞外體中回收和/或純化Lactadherin。
多肽可以是一種由嵌合遺傳結(jié)構(gòu)編碼的嵌合多肽，其中嵌合多肽含有一種與Lactadherin的C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域融合的多肽。在這種情況下，可以從胞外體中回收整個(gè)的嵌合多肽或僅僅是其一部分，例如多肽與Lactadherin的C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域分開后被釋放。在這一方面，本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種生產(chǎn)多肽的方法，包括a)提供一種遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼了與定位多肽融合的該多肽，其中該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；和(2)通過上述公開的方法鑒定的定位多肽，其中該多肽通過一種含有切割位點(diǎn)的間隔序列融合到該定位多肽上；b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生在其表面上呈遞該多肽的功能化胞外體；c)任選收集和/或純化該功能化胞外體；d)用一種切割該切割位點(diǎn)的試劑處理該功能化胞外體，以及e)回收和/或純化該多肽。
下面提供的實(shí)施例作為說明而不是作為任何限制。
實(shí)施例1腫瘤細(xì)胞系表達(dá)的人類Lactadherin幾乎專一地在胞外體中被發(fā)現(xiàn)人源的腫瘤細(xì)胞以大約80％匯合被接種到175cm2的三角瓶中，然后在完全培養(yǎng)基(添加了2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素、1mM丙酮酸鈉和10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640)中于37℃ 5％CO2氣氛下培養(yǎng)4天。在培養(yǎng)的第4天，對(duì)于每個(gè)培養(yǎng)物如下制備胞外體裂解液和細(xì)胞裂解液收獲培養(yǎng)上清液，依次以200g離心和通過0.2μm的濾器過濾以除去細(xì)胞碎片。然后將澄清的上清液在4℃以100000g離心90分鐘以使胞外體沉淀。將沉淀重新懸浮在100μl冰冷的PBS中，獲得的組分被留做胞外體(E)。
腫瘤細(xì)胞在10ml Versene(Invitrogen)中于室溫保溫10分鐘后從培養(yǎng)平板上分離下來。然后在4℃以200g離心10分鐘以使細(xì)胞沉淀。沉淀在由50mM磷酸鈉pH8.0、200mM NaCl、10mM咪唑和0.5％Tween20以及混合蛋白酶抑制劑(Sigma)組成的100μl冰冷的裂解緩沖液(LB)中重新懸浮和裂解。裂解液在冰上保溫10分鐘，然后通過在4℃以10000g離心10分鐘來除去不溶物質(zhì)。得到的上清液被留做細(xì)胞裂解液(CL)。
在32μl E和CL中加入8μl 5X SDS-PAGE樣品緩沖液(SB)，在100℃保溫5分鐘，然后通過SDS-PAGE進(jìn)行分析。通過半干電轉(zhuǎn)移后膠上的蛋白被轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后使用稀釋2500倍的針對(duì)人Lactadherin的RGD基元的多克隆抗體(Sebastian Amigorena博士饋贈(zèng))通過免疫檢測(cè)來證實(shí)樣品中人Lactadherin的存在。與Lactadherin結(jié)合的抗體使用稀釋5000倍的與辣根過氧化物酶(JacksonImmunoResearch)結(jié)合的第二個(gè)抗兔IgG抗體和生色底物(CN/DAB，Pierce)來檢測(cè)。
CL和E樣品的分析分別顯示在圖1的板A和板B中。在這個(gè)分析中，來自胚胎的腎細(xì)胞293(第1道)、黑素瘤細(xì)胞FON-T1(第2道)和M10(第3道)、肺癌細(xì)胞NCI-N226(第4道)和NCI-H520(第5道)、黑素瘤細(xì)胞FM3(第6道)、B類淋巴母細(xì)胞Raji(第7道)的CL和E被試驗(yàn)。
來自乳汁的部分純化的人Lactadherin被用做陽性對(duì)照(第9道)，而來自CHO(倉鼠卵巢細(xì)胞系)的E和CL被用做陰性對(duì)照(分別為板A和板B中的第8道)。
結(jié)果來自293(第1道)、FON-T1(第2道)、M10(第3道)、NCI-H520(第5道)和FM3(第6道)的E中檢測(cè)到了Lactadherin(板B)，但是在來自同樣細(xì)胞系的CL中沒有檢測(cè)到特異的帶(板A)。在來自NCI-N226(第4道)、Raji(第7道)和陰性對(duì)照CHO(第9道)的E和CL中均沒有檢測(cè)到Lactadherin。
結(jié)論來自多種不同腫瘤組織的細(xì)胞系能表達(dá)Lactadherin。這些細(xì)胞系表達(dá)的Lactadherin主要被發(fā)現(xiàn)在胞外體中。
實(shí)施例2重組人Lactadherin幾乎專一地表達(dá)在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的胞外體中，并且這種高度特異性的定位加密在C1/C2結(jié)構(gòu)域中從來自血液的總cDNA，分別使用引物對(duì)LTDNf15/LTDNr8和LTDNf2/LTDNr13(分別為SEQ ID NO1-4)擴(kuò)增了兩個(gè)重疊的人LactadherincDNA片段。LTDNf15和LTDNr13從它們的5’端延伸，包括了一個(gè)HindIII和一個(gè)AgeI限制性位點(diǎn)。用LTDNf2/LTDNr13擴(kuò)增Lactadherin cDNA的3’端產(chǎn)生了多個(gè)產(chǎn)物，其中最長的對(duì)應(yīng)于已知的Lactadherin cDNA(Lactlf，SEQ ID NO5)。較短的形式的序列(Lactsf，SEQ ID NO6)缺少一段153個(gè)核苷酸，導(dǎo)致在Lactadherin的C2結(jié)構(gòu)域缺失了51個(gè)氨基酸。5’端cDNA用HindIII和EcoRI消化，Lactlf和Lactsf cDNA都用EcoRI和AgeI消化。將5’端和3’端cDNA一起連接到事先用HindIII和AgeI酶切的pcDNA6A-His(Invitrogen)。得到的質(zhì)粒(pcDNA6hLactlf/His和pcDNA6hLactsf/His)編碼與(His)6標(biāo)記融合的全長重組人Lactadherin(分別為SEQ ID NO7和8)。使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(Invitrogen)將它們轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞，一株人類胚胎腎細(xì)胞系(ATCC)。在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)的第4天(培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基的描述參見實(shí)施例1)，如實(shí)施例1描述的那樣從每個(gè)培養(yǎng)物中制備EL和CL(EL是通過將胞外體重新懸浮于LB而不是PBS中而制備的)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在100000g離心沉淀胞外體的步驟后獲得的上清液(S)也被保留。Ni-NTA瓊脂糖珠(Qiagen)被加到所有的組分中以僅分離含有組氨酸標(biāo)記的重組蛋白。在搖動(dòng)平臺(tái)上于4℃保溫2小時(shí)后，在4℃以200g下離心沉淀珠子。用調(diào)整到20mM咪唑的LB清洗3次后，珠子被重新懸浮在40μl 1X SB中，并在100℃保溫5分鐘。收集SB，用圖1描述的SDS-PAGE和免疫印跡來分析。
CL、S和EL樣品分別分析在圖2的板A、B和C中。來自用pcDNA6hLactsf/His和pcDNA6hLactlf/His轉(zhuǎn)染的293的CL、S和EL分別被顯示在每個(gè)板的第1和2道。
來自乳汁的部分純化的人Lactadherin被用做陽性對(duì)照(第4道)，而來自用空的pcDNA6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的CL、S和EL被用做陰性對(duì)照(每個(gè)板的第3道)。
結(jié)果在EL中檢測(cè)到了Lactadherin的長形式(板C的第2道)，但是在從同樣培養(yǎng)物中獲得的S和CL中只檢測(cè)到背景水平(分別為板A和B的第2道)。相反，只在CL中檢測(cè)到了在其C2結(jié)構(gòu)域中缺失了51個(gè)氨基酸的Lactadherin的短形式(板A第1道)，而在S和EL中沒有檢測(cè)到(分別為板B和C的第1道)。
結(jié)論在293細(xì)胞中表達(dá)的重組Lactadherin幾乎專一地被發(fā)現(xiàn)在胞外體中。重組Lactadherin到胞外體的這種高度特異性定位可能是由這個(gè)蛋白的C2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的，因?yàn)樵贑2結(jié)構(gòu)域中的缺失廢止了胞外體定位，并且可能也影響了C1結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象。事實(shí)上，缺少功能性胞外體定位信號(hào)的重組短形式的Lactadherin被發(fā)現(xiàn)在不同的細(xì)胞區(qū)室中。
實(shí)施例3Lactadherin的C2結(jié)構(gòu)域中的胞外體定位信號(hào)在多種哺乳動(dòng)物物種之間是保守的以小鼠Lactadherin cDNA(Sebastian Amigorena博士饋贈(zèng))為模板，使用引物L(fēng)TDNf20(SEQ ID NO9)和LTDNr13(SEQ ID NO4)擴(kuò)增了小鼠Lactadherin的全長cDNA。這些引物在它們的5’端延伸，對(duì)于LTDNf20和LTDNr13引物分別包括了一個(gè)HindIII和一個(gè)AgeI限制性位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物用HindIII和AgeI消化，然后連入事先用HindIII和AgeI酶切的pcDNA6A-His(Invitrogen)。得到的質(zhì)粒(pcDNA6mLact/His)編碼與(His)6標(biāo)記融合的重組小鼠Lactadherin(SEQ ID NO10)。完全按照實(shí)施例2中描述的方法將該質(zhì)粒和pcDNA6hLactlf/His(按照實(shí)施例2中的描述制備)轉(zhuǎn)染到293、CHO和WEHI(小鼠纖維肉瘤)細(xì)胞中，并從每個(gè)培養(yǎng)物中制備EL。樣品的制備和Lactadherin表達(dá)的監(jiān)測(cè)如實(shí)施例1中所述。來自表達(dá)小鼠Lactadherin的人293細(xì)胞的EL表示在圖2的板A中，來自表達(dá)人Lactadherin的小鼠WEHI細(xì)胞的EL表示在板B中，以及來自表達(dá)人Lactadherin的倉鼠CHO細(xì)胞的EL表示在板C中。來自用編碼Lactadherin的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的EL表示在每個(gè)板的第2道。來自用空的pcDNA6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的EL被用做陰性對(duì)照(每個(gè)板的第1道)。來自乳汁的部分純化的人Lactadherin被用做陽性對(duì)照(板C第3道)。
結(jié)果在小鼠細(xì)胞和倉鼠細(xì)胞中表達(dá)的人Lactadherin被發(fā)現(xiàn)于由這些細(xì)胞產(chǎn)生的胞外體中(分別為板B和C的第2道)。小鼠Lactadherin也被發(fā)現(xiàn)在由來自不同的物種即人類細(xì)胞產(chǎn)生的胞外體中(板A，第2道)。
結(jié)論在幾種哺乳動(dòng)物種間胞外體定位信號(hào)是保守的。
實(shí)施例4嵌合蛋白的制備嵌合蛋白是通過將一個(gè)蛋白的核苷酸序列與Lactadherin的全長或部分序列融合而產(chǎn)生的。
Lactadherin的全長序列一般被融合在蛋白序列的上游。只包含C1結(jié)構(gòu)域、只包含C2結(jié)構(gòu)域或同時(shí)包含C1和C2結(jié)構(gòu)域的部分Lactadherin序列一般被融合在蛋白序列的下游。不含有內(nèi)在前導(dǎo)序列的蛋白可以被插入到Lactadherin的前導(dǎo)序列和C1/C2結(jié)構(gòu)域之間。
通過將一個(gè)蛋白的核苷酸序列與一個(gè)C結(jié)構(gòu)域和在其N端至少延伸了10個(gè)氨基酸的匹配的C結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列進(jìn)行融合，可以制備具有不同連接的嵌合蛋白。或者，也可以使用Lactadherin的C1和C2結(jié)構(gòu)域或使用來自兩個(gè)物種的C結(jié)構(gòu)域來制備具有不同連接的嵌合蛋白。例如，含有蛋白X和人源的C1、或人源的延伸的C1、或人源的C2、或鼠源的C1作為融合配偶體的嵌合蛋白具有不同的連接。
C1/C2片段的制備以pcDNA6-hLaclf/His為模板，使用引物對(duì)LTDNf24(SEQ IDNO13)/LTDNr26(SEQ ID NO15)、LTDNf22(SEQ ID NO11)/LTDNr26、LTDNf25(SEQ ID NO14)/LTDNr13、LTDNf23(SEQ IDNO12)/LTDNr13、LTDNf24/LTDNr13和LTDNf22/LTDNr13分別擴(kuò)增了編碼C1、延伸的C1、C2、延伸的C2、C1/C2和延伸的C1/C2結(jié)構(gòu)域的Lactadherin DNA片段。以pcDNA6-mLact/His為模板，使用引物對(duì)LTDNf30(SEQ ID NO16)/LTDNr26、LTDNf31(SEQ ID NO17)/LTDNr26、LTDNf33(SEQ ID NO19)/LTDNr13、LTDNf32(SEQ IDNO18)/LTDNr13、LTDNf30/LTDNr13和LTDNf31/LTDNr13擴(kuò)增了來自小鼠Lactadherin的匹配的C1/C2片段。所有的正向引物(LTDNf)在其5’端被磷酸化，而所有的反向引物(LTDNr)在其5’端延伸以包含一個(gè)AgeI限制性位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物在與融合配偶體連接(見下)前用AgeI消化。
白細(xì)胞介素-2-C1/C2嵌合體的制備以人活化的T細(xì)胞cDNA為模板，使用引物IL2f1(SEQ IDNO20)和IL2r2(SEQ ID NO21)擴(kuò)增了全長的IL-2 cDNA。IL2f1在其5’端延伸以包括一個(gè)HindIII限制性位點(diǎn)，而IL2r2在其5’端被磷酸化。擴(kuò)增產(chǎn)物用HindIII消化，并與上述制備的每種C1/C2 DNA片段一起連入事先用HindIII和AgeI酶切的pcDNA6A-His(Invitrogen)。IL2片段的磷酸化的3’端和C1/C2片段的磷酸化的5’端之間的平末端連接產(chǎn)生了IL2-C1/C2嵌合序列。IL2片段5’端的HindIII位點(diǎn)和C1/C2片段3’端的AgeI位點(diǎn)使得嵌合序列可以插入到pcDNA6His中，得到的質(zhì)粒(pcDNA6-His/IL2-C1、IL2-延伸的C1、IL2-C2、IL2-延伸的C2、IL2-C1/C2和IL2-延伸的C1/C2)編碼了與(His)6標(biāo)記融合的重組嵌合蛋白(含有人源的C1/C2結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白序列為SEQ ID NO22-27)。在SEQ ID NO22-27中，1-153位的殘基對(duì)應(yīng)于嵌合多肽的hIL2部分的氨基酸序列，嵌合多肽的C端最后8個(gè)氨基酸殘基(TGHHHHHH)對(duì)應(yīng)于組氨酸標(biāo)記。其余的殘基對(duì)應(yīng)于來自Lactadherin的序列。
在胞外體中表達(dá)生物活性的IL-2將上述編碼SEQ ID NO22-27的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到WEHI細(xì)胞。如實(shí)施例1所述制備EL、CL和S組分。重組蛋白的表達(dá)通過實(shí)施例1中所述的Western印跡進(jìn)行評(píng)估，只是在此所用的檢測(cè)抗體是兔抗IL2抗體。
CL、S和EL樣品分別分析在圖4的板A、B和C中。來自用pcDNA6IL2-延伸的C1/His、pcDNA6IL2-延伸的C2/His、pcDNA6IL2-延伸的C1/C2/His、pcDNA6IL2-C1/His、pcDNA6IL2-C2/His和pcDNA6IL2-C1/C2/His轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的CL、S和EL分別被顯示在每個(gè)板的第1到6道。
重組IL2被用做陽性對(duì)照(板C的第8道)，而來自未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的CL、S和EL被用做陰性對(duì)照(每個(gè)板的第7道)。
結(jié)果所有制備的嵌合IL-2-C1/C2基因都表達(dá)了能夠與抗IL-2抗體反應(yīng)的重組蛋白(板C的第1到6道)。此外，這些蛋白幾乎被專一地發(fā)現(xiàn)在EL中，而在S和CL中只檢測(cè)到低的表達(dá)或背景表達(dá)(分別為板A和B的第1到6道)。為了確定在胞外體中檢測(cè)到的IL2-C1/C2嵌合蛋白是否表現(xiàn)IL-2活性，將CTLL-2(一株IL-2依賴性細(xì)胞系)與帶有IL2-C1/C2嵌合蛋白的重組胞外體或來自未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胞外體一起保溫。我們發(fā)現(xiàn)與重組胞外體保溫的細(xì)胞摻入了3H-胸腺嘧啶，而與來自未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胞外體保溫的細(xì)胞則沒有摻入(數(shù)據(jù)未顯示)。
結(jié)論將IL-2與Lactadherin的C1/C2結(jié)構(gòu)域融合導(dǎo)致了IL-2在胞外體中的表達(dá)，這表明這些結(jié)構(gòu)域能夠特異性地指導(dǎo)抗原表達(dá)到胞外體中。C1和C2結(jié)構(gòu)域在功能上是獨(dú)立的。含有單個(gè)C結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白的產(chǎn)量高于同時(shí)含有C1和C2結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白。最后，融合產(chǎn)生了含有生物活性的IL2的嵌合蛋白，表明IL2維持了天然的構(gòu)象。因此，使用Lactadherin的C1/C2結(jié)構(gòu)域?qū)⒌鞍锥ㄎ坏桨怏w，事實(shí)上可以導(dǎo)致產(chǎn)生具有新的生物功能的重組胞外體。
實(shí)施例5重組人Lactadherin的純化按照實(shí)施例2中的描述制備編碼了與(His)6標(biāo)記融合的全長人重組Lactadherin的質(zhì)粒pcDNA6hLactlf/His(SEQ ID NO7)。使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(Invitrogen)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞(一株倉鼠卵巢細(xì)胞系)(ATCC)。在完全培養(yǎng)基(添加了2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素和2％胎牛血清(FBS)的CHO-SFM)中于37℃ 5％CO2氣氛下培養(yǎng)的第1天，在添加2μg/ml滅瘟素的培養(yǎng)基中選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在培養(yǎng)4天后，通過有限稀釋技術(shù)分離出穩(wěn)定的克隆。通過使用實(shí)施例2中描述的Western印跡方法分析在胞外體中表達(dá)的重組Lactadherin以選擇能夠大量生產(chǎn)Lactadherin的克隆。將克隆CHO-3.2在1升旋轉(zhuǎn)搖瓶中擴(kuò)培，并在不含F(xiàn)BS的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)以大量生產(chǎn)Lactadherin。細(xì)胞培養(yǎng)7天后，上清液被轉(zhuǎn)移到250ml離心瓶中，2000rpm離心5分鐘以沉淀細(xì)胞。然后將上清液通過0.2μm的抽濾瓶過濾，使用截留分子量為500K的纖維芯將其濃縮到100ml。然后將濃縮的上清液于4℃在100000xg下離心1小時(shí)15分鐘。含有胞外體的沉淀被重新懸浮在1ml MLBII(50mM NaPO4pH8/300mM NaCl/10mM咪唑/0.5％Tween)中，然后轉(zhuǎn)移到含有2ml Ni-NTA漿液(預(yù)先離心以除去乙醇)的試管中。在4℃在搖床上保溫2到3小時(shí)后，將樣品注入一根BioRad的柱子，并在4℃放置。柱子先用10ml MWBI(50mM NaPO4pH8/300mM NaCl/20mM咪唑/0.5％Tween)，然后用20ml MWBII(50mM NaPO4pH8/500mM NaCl/10mM咪唑)清洗。結(jié)合在柱子上的蛋白用8ml MEBII(50mM NaPO4pH8/300mM NaCl/250mM咪唑)洗脫。使用截留分子量為10000的MilliporeUltrafree-4裝置將洗脫蛋白濃縮并將緩沖液更換為pH7.4的PBS。蛋白樣品分成等份保存在-20℃。對(duì)SDS-PAGE進(jìn)行考馬斯染色以分析純度。圖5顯示了兩個(gè)重組Lactadherin制備液(分別為A和B)在濃縮前和濃縮后的分析(分別為第1道50μl和第2道1μg)。
總而言之，在此描述的步驟產(chǎn)生了高純度的重組Lactadherin。
實(shí)施例6篩選用于將抗原定位到胞外體的胞外體蛋白使用MelanA/MART1、CD40L和CD81評(píng)估了胞外體定位結(jié)構(gòu)域在其它蛋白中的存在及它們?cè)趯⒖乖ㄎ坏桨怏w中的應(yīng)用。
在第一組實(shí)驗(yàn)中，使用特異的引物，從FM3細(xì)胞cDNA(MelanA/MART1)和小鼠脾細(xì)胞cDNA(Clonetech；CD40L，CD81)上擴(kuò)增了編碼MelanA/MART1、CD40L和CD81的cDNA。為了克隆的目的，引物在其5’端延伸至包含一個(gè)限制性位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性酶消化，分別連入預(yù)先用匹配的酶消化過的pCDNA6A-His(Invitrogen)。得到的質(zhì)粒(分別為pcDNA6-MART1、pcDNA6-CD40L和pcDNA6-CD81)編碼重組的MelanA/MART1(SEQ ID NO28)、CD40L(SEQ ID NO29)和CD81(SEQ ID NO30)。重組的MelanA/MART1和CD81被融合到Myc標(biāo)記上，其后是載體上所提供的His標(biāo)記。更具體來說，在SEQ ID NO28中，1-118位的殘基對(duì)應(yīng)于MelanA/MART1，120-129位的殘基對(duì)應(yīng)于Myc標(biāo)記，以及133-140位的殘基對(duì)應(yīng)于His標(biāo)記。同樣，在SEQ ID NO30中，1-236位的殘基對(duì)應(yīng)于CD81，238-247位的殘基對(duì)應(yīng)于Myc標(biāo)記，以及251-258位的殘基對(duì)應(yīng)于His標(biāo)記。
分別用編碼SEQ ID NO28-30的質(zhì)粒通過電穿孔(對(duì)于EL4用220V、950μF；對(duì)293F用400V、200μF)轉(zhuǎn)染EL4和293F細(xì)胞。按照實(shí)施例1中的方法制備EL和CL組分，除了將胞外體和細(xì)胞沉淀直接重懸浮于1X SB中用于SDS-PAGE。也按照實(shí)施例1中描述的Western印跡方法評(píng)估重組蛋白的表達(dá)，除了這里用的檢測(cè)抗體對(duì)MelanA/MART1和CD81來說是鼠抗Myc標(biāo)記的抗體，而對(duì)CD40L來說是抗CD40L抗體。MelanA/MART1、CD40L和CD81樣品分別分析在圖7的板A、B和C中。轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的EL和轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的CL分別顯示在每個(gè)板的第1到4道。
在第二組實(shí)驗(yàn)中，使用特異引物，從活化的樹突狀細(xì)胞中擴(kuò)增了編碼7-跨膜受體CCR7的cDNA。兩個(gè)引物都在其5’端延伸至包含一個(gè)AgeI限制性位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物用AgeI消化，并連入預(yù)先用AgeI消化過的編碼SEQ ID NO29的質(zhì)粒。AgeI消化的產(chǎn)物也被連接到一個(gè)編碼CD81的截短形式的質(zhì)粒中(pcDNA6-CD81E，SEQ ID NO31)，它使用特定引物制備而來，象SEQ ID NO30一樣。SEQ ID NO31中CD81的C端跨膜區(qū)域被截短是維持CCR7在細(xì)胞膜脂雙層中的適當(dāng)定向所需要的。在SEQ ID NO31中，1-200位的殘基對(duì)應(yīng)于CD81E，202-211位的殘基對(duì)應(yīng)于Myc標(biāo)記，以及215-222位的殘基對(duì)應(yīng)于His標(biāo)記。將編碼SEQ ID NO28和31的質(zhì)粒連接導(dǎo)致CCR7 cDNA插入到受體質(zhì)粒的Myc標(biāo)記和His標(biāo)記之間。通過PCR篩選方法選擇出其中CCR7插入方向?yàn)?’到3’的質(zhì)粒。選定的質(zhì)粒(pcDNA6-MART1/CCR7和pcDNA6-CD81E/CCR7)編碼與His標(biāo)記融合的重組嵌合蛋白(分別為SEQ ID NO32和33)。在SEQ ID NO32中，1-118位的殘基對(duì)應(yīng)于MelanA/MART1，120-129位的殘基對(duì)應(yīng)于Myc標(biāo)記，135-488位的殘基對(duì)應(yīng)于CCR7，以及489-496位的殘基對(duì)應(yīng)于His標(biāo)記。在SEQ ID NO33中，1-200位的殘基對(duì)應(yīng)于CD81E，202-211位的殘基對(duì)應(yīng)于Myc標(biāo)記，217-570位的殘基對(duì)應(yīng)于CCR7，以及571-578位的殘基對(duì)應(yīng)于His標(biāo)記。
分別用編碼SEQ ID NO32和33的質(zhì)粒通過電穿孔轉(zhuǎn)染EL4細(xì)胞，并按照上述的方法制備EL和CL組分。也按照上述的Western印跡方法評(píng)估重組蛋白的表達(dá)。EL和CL樣品分別分析在圖8的板A和B中。來自用pcDNA6-MART1/CCR7和pcDNA6-CD81E/CCR7轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的樣品分別顯示在每個(gè)板的第1到3道。
結(jié)果在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胞外體和細(xì)胞裂解液(分別為每個(gè)板的第1到3道)中檢測(cè)到了重組的MelanA/MART1(圖7板A)、CD41L(圖7板B)和CD81(圖7板C)。值得注意的是，預(yù)期的長形式的CD40L(跨膜形式)在CL中被檢測(cè)到(板B的第3道)，而大多數(shù)的短形式(可溶形式)在胞外體中被檢測(cè)到(板B的第1道)。在板B的第3道中檢測(cè)到分子量較小的產(chǎn)物，極可能是由于在細(xì)胞裂解液中CD81的未被控制的蛋白水解作用。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胞外體中檢測(cè)到了重組的嵌合MelanA/MART1-CCR7，但是在其細(xì)胞裂解液中沒有檢測(cè)到(分別為圖8的板A和B的第1道)。使用FACS分析，我們證實(shí)了僅僅編碼CCR7的對(duì)照結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了預(yù)期的能夠在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表面但不能在其胞外體中檢測(cè)到的重組受體(數(shù)據(jù)未顯示)。最后，編碼嵌合蛋白CD81E/CCR7的質(zhì)粒在任何測(cè)試的組分中均不能產(chǎn)生可檢測(cè)到的蛋白水平(圖8板A和B的第2道)。在來自未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的組分中沒有檢測(cè)到蛋白(圖7板A到C的第2和4道，圖8板A和B的第3道)。
結(jié)論如同使用Lactadherin所證明的，其它的胞外體蛋白也可以被鑒定并用于定位抗原和重要的受體。事實(shí)上，MelanA/MART1被鑒定為主要表達(dá)在胞外體中，它與7-跨膜受體CCR7的融合觸發(fā)了CCR7在胞外體中的表達(dá)。這種現(xiàn)象是融合配偶體特異性的，因?yàn)槭褂闷渌陌怏w蛋白如CD81E作為融合配偶體時(shí)不能檢測(cè)到CCR7。因此，對(duì)胞外體蛋白將其它蛋白定位到胞外體中的能力進(jìn)行篩選，將導(dǎo)致鑒定出新的象MelanA/MART1那樣的候選物，可用于與使用Lactadherin的C1C2結(jié)構(gòu)域相同的應(yīng)用。應(yīng)該注意到，盡管事實(shí)上沒有檢測(cè)到CD81E/CCR7，CD81仍然可能適合于將CCR7之外的其它抗原定位到胞外體中。
實(shí)施例7展示在胞外體上的重組蛋白的免疫原性按照實(shí)施例3中的描述制備來自用pcDNA6hLactlf/His轉(zhuǎn)染的WEHI細(xì)胞的小鼠胞外體。按照實(shí)施例5中的描述制備純化的人重組Lactadherin。9只Balb/C小鼠被安排成3個(gè)免疫組，每組3只。對(duì)每只小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射免疫，使用大約20ng重組人Lactadherin的PBS(第1組)、大約20ng重組人Lactadherin的1∶1的PBS/完全弗氏完全佐劑混合物(第2組)或含有大約20ng的人Lactadherin的重組WEHI胞外體的PBS(第3組)。在第一次注射后兩個(gè)星期對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，使用同樣的樣品，除了在第2組中抗原被懸浮于1∶1的PBS/不完全弗氏佐劑混合物中。第二次免疫后對(duì)動(dòng)物取血，通過ELISA測(cè)試抗人Lactadherin抗體。在ELISA中，50ng人Lactadherin的PBS被包被在微量滴定板的孔中，于37℃保溫1小時(shí)。含有0.05％Tween-20和6％脫脂奶粉的PBS的封閉緩沖液被加到孔中，室溫放置1小時(shí)以飽和剩余的游離結(jié)合位點(diǎn)。然后在孔中加入用封閉緩沖液稀釋1000倍的免疫小鼠的血清，室溫保溫1小時(shí)。用封閉緩沖液清洗孔3次后，使用稀釋10000倍的與辣根過氧化物酶(Jackson ImmunoResearch)偶聯(lián)的第二個(gè)抗小鼠IgG抗體和化學(xué)發(fā)光底物(Amersham)檢測(cè)結(jié)合的抗體。結(jié)果顯示在圖9中。
結(jié)果在用含Lactadherin的胞外體免疫的小鼠的血清中檢測(cè)到了抗Lactadherin抗體，但是當(dāng)Lactadherin單獨(dú)或作為弗氏佐劑乳液中給藥時(shí)沒有產(chǎn)生抗體反應(yīng)。當(dāng)使用弗氏佐劑時(shí)即使在4次注射接種后也沒有檢測(cè)到抗體，但是在接受帶有Lactadherin的胞外體的小鼠的血清中抗體的滴度隨著連續(xù)的注射而增加(數(shù)據(jù)未顯示)。
結(jié)論帶有抗原的胞外體在不存在任何佐劑的情況下是強(qiáng)有力的免疫原，可以使用非常低的抗原量誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，所述量對(duì)經(jīng)典和已經(jīng)潛在的佐劑如弗氏佐劑是無效的。
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<400>3gccctggata tctgttcc 18<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增人Lactadherin cDNA的反向引物<400>4ataaccggta cagcccagca gctccaggcg30<210>5<211>1164<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5atgccgcgcc cccgcctgct ggccgcgctg tgcggcgcgc tgctctgcgc ccccagcctc 60ctcgtcgccc tggatatctg ttccaaaaac ccctgccaca acggtggttt atgcgaggag 120atttcccaag aagtgcgagg agatgtcttc ccctcgtaca cctgcacgtg ccttaagggc 180tacgcgggca accactgtga gacgaaatgt gtcgagccac tgggcatgga gaatgggaac 240attgccaact cacagatcgc cgcctcatct gtgcgtgtga ccttcttggg tttgcagcat 300tgggtcccgg agctggcccg cctgaaccgc gcaggcatgg tcaatgcctg gacacccagc 360agcaatgacg ataacccctg gatccaggtg aacctgctgc ggaggatgtg ggtaacaggt 420gtggtgacgc agggtgccag ccgcttggcc agtcatgagt acctgaaggc cttcaaggtg 480gcctacagcc ttaatggaca cgaattcgat ttcatccatg atgttaataa aaaacacaag 540gagtttgtgg gtaactggaa caaaaacgcg gtgcatgtca acctgtttga gacccctgtg 600gaggctcagt acgtgagatt gtaccccacg agctgccaca cggcctgcac tctgcgcttt 660
gagctactgg gctgtgagct gaacggatgc gccaatcccc tgggcctgaa gaataacagc 720atccctgaca agcagatcac ggcctccagc agctacaaga cctggggctt gcatctcttc 780agctggaacc cctcctatgc acggctggac aagcagggca acttcaacgc ctgggttgcg 840gggagctacg gtaacgatca gtggctgcag gtggacctgg gctcctcgaa ggaggtgaca 900ggcatcatca cccagggggc ccgtaacttt ggctctgtcc agtttgtggc atcctacaag 960gttgcctaca gtaatgacag tgcgaactgg actgagtacc aggaccccag gactggcagc 1020agtaagatct tccctggcaa ctgggacaac cactcccaca agaagaactt gtttgagacg 1080cccatcctgg ctcgctatgt gcgcatcctg cctgtagcct ggcacaaccg catcgccctg 1140cgcctggagc tgctgggctg ttag 1164<210>6<211>1008<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>6atgccgcgcc cccgcctgct ggccgcgctg tgcggcgcgc tgctctgcgc ccccagcctc 60ctcgtcgccc tggatatctg ttccaaaaac ccctgccaca acggtggttt atgcgaggag 120atttcccaag aagtgcgagg agatgtcttc ccctcgtaca cctgcacgtg ccttaagggc 180tacgcgggca accactgtga gacgaaatgt gtcgagccac tgggcatgga gaatgggaac 240attgccaact cacagatcgc cgcctcatct gtgcgtgtga ccttcttggg tttgcagcat 300tgggtcccgg agctggcccg cctgaaccgc gcaggcatgg tcaatgcctg gacacccagc 360agcaatgacg ataacccctg gatccaggtg aacctgctgc ggaggatgtg ggtaacaggt 420gtggtgacgc agggtgccag ccgcttggcc agtcatgagt acctgaaggc cttcaaggtg 480gcctacagcc ttaatggaca cgaattcgat ttcatccatg atgttaataa aaaacacaag 540
gagtttgtgg gtaactggaa caaaaacgcg gtgcatgtca acctgtttga gacccctgtg 600gaggctcagt acgtgagatt gtaccccacg agctgccaca cggcctgcac tctgcgcttt 660gagctactgg gctgtgagct gaacggatgc gccaatcccc tgggcctgaa gaataacagc 720atccctgaca agcagatcac ggcctccagc agctacaaga cctggggctt gcatctcttc 780agctggaacc cctcctatgc acggctggac aagcagggca acttcaacgc ctgggttgcg 840gggagctacg gtaacgatca gtggctgcag atcttccctg gcaactggga caaccactcc 900cacaagaaga acttgtttga gacgcccatc ctggctcgct atgtgcgcat cctgcctgta 960gcctggcaca accgcatcgc cctgcgcctg gagctgctgg gctgttag 1008<210>7<211>395<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>7Met Pro Arg Pro Arg Leu Leu Ala Ala Leu Cys Gly Ala Leu Leu Cys1 5 10 15Ala Pro Ser Leu Leu Val Ala Leu Asp Ile Cys Ser Lys Asn Pro Cys20 25 30His Asn Gly Gly Leu Cys Glu Glu Ile Ser Gln Glu Val Arg Gly Asp35 40 45Val Phe Pro Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Asn50 55 60His Cys Glu Thr Lys Cys Val Glu Pro Leu Gly Met Glu Asn Gly Asn65 70 75 80
Ile Ala Asn Ser Gln Ile Ala Ala Ser Ser Val Arg Val Thr Phe Leu85 90 95Gly Leu Gln His Trp Val Pro Glu Leu Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly100 105 110Met Val Asn Ala Trp Thr Pro Ser Ser Asn Asp Asp Asn Pro Trp Ile115 120 125Gln Val Asn Leu Leu Arg Arg Met Trp Val Thr Gly Val Val Thr Gln130 135 140Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser His Glu Tyr Leu Lys Ala Phe Lys Val145 150 155 160Ala Tyr Ser Leu Asn Gly His Glu Phe Asp Phe Ile His Asp Val Asn165 170 175Lys Lys His Lys Glu Phe Val Gly Asn Trp Asn Lys Asn Ala Val His180 185 190Val Asn Leu Phe Glu Thr Pro Val Glu Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr195 200 205Pro Thr Ser Cys His Thr Ala Cys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly210 215 220Cys Glu Leu Asn Gly Cys Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys Asn Asn Ser225 230 235 240Ile Pro Asp Lys Gln Ile Thr Ala Ser Ser Ser Tyr Lys Thr Trp Gly245 250 255
Leu His Leu Phe Ser Trp Asn Pro Ser Tyr Ala Arg Leu Asp Lys Gln260 265 270Gly Asn Phe Asn Ala Trp Val Ala Gly Ser Tyr Gly Asn Asp Gln Trp275 280 285Leu Gln Val Asp Leu Gly Ser Ser Lys Glu Val Thr Gly Ile Ile Thr290 295 300Gln Gly Ala Arg Asn Phe Gly Ser Val Gln Phe Val Ala Ser Tyr Lys305 310 315 320Val Ala Tyr Ser Asn Asp Ser Ala Asn Trp Thr Glu Tyr Gln Asp Pro325 330 335Arg Thr Gly Ser Ser Lys Ile Phe Pro Gly Asn Trp Asp Asn His Ser340 345 350His Lys Lys Asn Leu Phe Glu Thr Pro Ile Leu Ala Arg Tyr Val Arg355 360 365Ile Leu Pro Val Ala Trp His Asn Arg Ile Ala Leu Arg Leu Glu Leu370 375 380Leu Gly Cys Thr Gly His His His His His His385 390 395<210>8<211>343<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>8Met Pro Arg Pro Arg Leu Leu Ala Ala Leu Cys Gly Ala Leu Leu Cys
1 5 10 15Ala Pro Ser Leu Leu Val Ala Leu Asp Ile Cys Ser Lys Asn Pro Cys20 25 30His Asn Gly Gly Leu Cys Glu Glu Ile Ser Gln Glu Val Arg Gly Asp35 40 45Val Phe Pro Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Asn50 55 60His Cys Glu Thr Lys Cys Val Glu Pro Leu Gly Met Glu Asn Gly Asn65 70 75 80Ile Ala Asn Ser Gln Ile Ala Ala Ser Ser Val Arg Val Thr Phe Leu85 90 95Gly Leu Gln His Trp Val Pro Glu Leu Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly100 105 110Met Val Asn Ala Trp Thr Pro Ser Ser Asn Asp Asp Asn Pro Trp Ile115 120 125Gln Val Asn Leu Leu Arg Arg Met Trp Val Thr Gly Val Val Thr Gln130 135 140Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser His Glu Tyr Leu Lys Ala Phe Lys Val145 150 155 160Ala Tyr Ser Leu Asn Gly His Glu Phe Asp Phe Ile His Asp Val Asn165 170 175Lys Lys His Lys Glu Phe Val Gly Asn Trp Asn Lys Asn Ala Val His
180 185 190Val Asn Leu Phe Glu Thr Pro Val Glu Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr195 200 205Pro Thr Ser Cys His Thr Ala Cys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly210 215 220Cys Glu Leu Asn Gly Cys Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys Asn Asn Ser225 230 235 240Ile Pro Asp Lys Gln Ile Thr Ala Ser Ser Ser Tyr Lys Thr Trp Gly245 250 255Leu His Leu Phe Ser Trp Asn Pro Ser Tyr Ala Arg Leu Asp Lys Gln260 265 270Gly Asn Phe Asn Ala Trp Val Ala Gly Ser Tyr Gly Asn Asp Gln Trp275 280 285Leu Gln Ile Phe Pro Gly Asn Trp Asp Asn His Ser His Lys Lys Asn290 295 300Leu Phe Glu Thr Pro Ile Leu Ala Arg Tyr Val Arg Ile Leu Pro Val305 310 315 320Ala Trp His Asn Arg Ile Ala Leu Arg Leu Glu Leu Leu Gly Cys Thr325 330 335Gly His His His His His His340<210>9
<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增小鼠Lactadherin cDNA的正向引物<400>9ataaagctta gcatgcaggt ctcccgtgtg 30<210>10<211>434<212>PRT<213>Mus sp.
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<223>用于擴(kuò)增人Lactadherin C1/C2 cDNA的正向引物<400>11ccctcgtaca cctgcacgtg cc 22<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增人Lactadherin C2 cDNA的正向引物<400>12cccacgagct gccacacggc c21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增人Lactadherin C1/C2 cDNA的正向引物<400>13aaatgtgtcg agccactggg c21<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增人Lactadherin C2 cDNA的正向引物<400>14ggatgcgcca atcccctgg 19
<210>15<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增人Lactadherin C1 cDNA的反向引物<400>15gaaggaaccg gtacagccca gtagctcaaa gcg 33<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增小鼠Lactadherin C1/C2 cDNA的正向引物<400>16ggatgttcta cacagctggg ca 22<210>17<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增小鼠Lactadherin C1/C2 cDNA的正向引物<400>17accgaataca tctgcca 17<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增小鼠Lactadherin C2 cDNA的正向引物<400>18cctgtttcgt gccaccgcgg c 21<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增小鼠Lactadherin C2 cDNA的正向引物<400>19ggatgtctcg agcccctgg19<210>20<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增人白介素-2 cDNA的正向引物<400>20aggaggaagc ttatgtacag gatgcaactc c 31<210>21<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增人白介素-2 cDNA的反向引物<400>21agtcagtgtt gagatgatg19<210>22<211>318
<212>PRT<213>人工分子<220>
<221>MISC_特征<223>人IL2-人Lactadherin C1結(jié)構(gòu)域嵌合蛋白<400>22Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu1 5 10 15Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu20 25 30Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile35 40 45Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe50 55 60Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu65 70 75 80Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys85 90 95Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile100 105 110Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala115 120 125Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe130 135 140
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<221>MISC_特征<223>人IL2-人Lactadherin C2結(jié)構(gòu)域嵌合蛋白<400>24Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu1 5 10 15Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu20 25 30Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile35 40 45Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe50 55 60Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu65 70 75 80Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys85 90 95
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<221>MISC_特征<223>人IL2-人Lactadherin C2結(jié)構(gòu)域嵌合蛋白<400>25Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu1 5 10 15Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu20 25 30Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile35 40 45Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe50 55 60Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu65 70 75 80
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<221>MISC_特征<223>人IL2-人Lactadherin C1/C2結(jié)構(gòu)域嵌合蛋白<400>26Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu1 5 10 15Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu20 25 30
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Thr Gly Ile Ile Thr Gln Gly Ala Arg Asn Phe Gly Ser Val Gln Phe385 390 395 400Val Ala Ser Tyr Lys Val Ala Tyr Ser Asn Asp Ser Ala Asn Trp Thr405 410 415Glu Tyr Gln Asp Pro Arg Thr Gly Ser Ser Lys Ile Phe Pro Gly Asn420 425 430Trp Asp Asn His Ser His Lys Lys Asn Leu Phe Glu Thr Pro Ile Leu435 440 445Ala Arg Tyr Val Arg Ile Leu Pro Val Ala Trp His Asn Arg Ile Ala450 455 460Leu Arg Leu Glu Leu Leu Gly Cys Thr Gly His His His His His His465 470 475 480<210>27<211>498<212>PRT<213>人工分子<220>
<221>MISC_特征<223>人IL2-人Lactadherin C1/C2結(jié)構(gòu)域嵌合蛋白<400>27Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu1 5 10 15Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile35 40 45Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe50 55 60Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu65 70 75 80Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys85 90 95Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile100 105 110Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala115 120 125Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe130 135 140Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Pro Ser Tyr Thr Cys Thr Cys145 150 155 160Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Asn His Cys Glu Thr Lys Cys Val Glu Pro165 170 175Leu Gly Met Glu Asn Gly Asn Ile Ala Asn Ser Gln Ile Ala Ala Ser180 185 190Ser Val Arg Val Thr Phe Leu Gly Leu Gln His Trp Val Pro Glu Leu195 200 205
Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly Met Val Asn Ala Trp Thr Pro Ser Ser210 215 220Asn Asp Asp Asn Pro Trp Ile Gln Val Asn Leu Leu Arg Arg Met Trp225 230 235 240Val Thr Gly Val Val Thr Gln Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser His Glu245 250 255Tyr Leu Lys Ala Phe Lys Val Ala Tyr Ser Leu Asn Gly His Glu Phe260 265 270Asp Phe Ile His Asp Val Asn Lys Lys His Lys Glu Phe Val Gly Asn275 280 285Trp Asn Lys Asn Ala Val His Val Asn Leu Phe Glu Thr Pro Val Glu290 295 300Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr Pro Thr Ser Cys His Thr Ala Cys Thr305 310 315 320Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly Cys Glu Leu Asn Gly Cys Ala Asn Pro325 330 335Leu Gly Leu Lys Asn Asn Ser Ile Pro Asp Lys Gln Ile Thr Ala Ser340 345 350Ser Ser Tyr Lys Thr Trp Gly Leu His Leu Phe Ser Trp Asn Pro Ser355 360 365Tyr Ala Arg Leu Asp Lys Gln Gly Asn Phe Asn Ala Trp Val Ala Gly370 375 380
Ser Tyr Gly Asn Asp Gln Trp Leu Gln Val Asp Leu Gly Ser Ser Lys385 390 395 400Glu Val Thr Gly Ile Ile Thr Gln Gly Ala Arg Asn Phe Gly Ser Val405 410 415Gln Phe Val Ala Ser Tyr Lys Val Ala Tyr Ser Asn Asp Ser Ala Asn420 425 430Trp Thr Glu Tyr Gln Asp Pro Arg Thr Gly Ser Ser Lys Ile Phe Pro435 440 445Gly Asn Trp Asp Asn His Ser His Lys Lys Asn Leu Phe Glu Thr Pro450 455 460Ile Leu Ala Arg Tyr Val Arg Ile Leu Pro Val Ala Trp His Asn Arg465 470 475 480Ile Ala Leu Arg Leu Glu Leu Leu Gly Cys Thr Gly His His His His485 490 495His His<210>28<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增人CD40L cDNA的正向引物<400>28ggaaggaccg gtcatagaag gttggacaag 30
<210>29<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于擴(kuò)增人CD40L cDNA的反向引物<400>29ggaaggaccg gtgagtttga gtaagccaaa gg32<210>30<211>612<212>PRT<213>人工分子<220>
<221>MISC_特征<223>人Lactadherin-人CD40L嵌合蛋白<400>30Met Pro Arg Pro Arg Leu Leu Ala Ala Leu Cys Gly Ala Leu Leu Cys1 5 10 15Ala Pro Ser Leu Leu Val Ala Leu Asp Ile Cys Ser Lys Asn Pro Cys20 25 30His Asn Gly Gly Leu Cys Glu Glu Ile Ser Gln Glu Val Arg Gly Asp35 40 45Val Phe Pro Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Asn50 55 60His Cys Glu Thr Lys Cys Val Glu Pro Leu Gly Met Glu Asn Gly Asn65 70 75 80
Ile Ala Asn Ser Gln Ile Ala Ala Ser Ser Val Arg Val Thr Phe Leu85 90 95Gly Leu Gln His Trp Val Pro Glu Leu Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly100 105 110Met Val Asn Ala Trp Thr Pro Ser Ser Asn Asp Asp Asn Pro Trp Ile115 120 125Gln Val Asn Leu Leu Arg Arg Met Trp Val Thr Gly Val Val Thr Gln130 135 140Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser His Glu Tyr Leu Lys Ala Phe Lys Val145 150 155 160Ala Tyr Ser Leu Asn Gly His Glu Phe Asp Phe Ile His Asp Val Asn165 170 175Lys Lys His Lys Glu Phe Val Gly Asn Trp Asn Lys Asn Ala Val His180 185 190Val Asn Leu Phe Glu Thr Pro Val Glu Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr195 200 205Pro Thr Ser Cys His Thr Ala Cys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly210 215 220Cys Glu Leu Asn Gly Cys Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys Asn Asn Ser225 230 235 240Ile Pro Asp Lys Gln Ile Thr Ala Ser Ser Ser Tyr Lys Thr Trp Gly245 250 255
Leu His Leu Phe Ser Trp Asn Pro Ser Tyr Ala Arg Leu Asp Lys Gln260 265 270Gly Asn Phe Asn Ala Trp Val Ala Gly Ser Tyr Gly Asn Asp Gln Trp275 280 285Leu Gln Val Asp Leu Gly Ser Ser Lys Glu Val Thr Gly Ile Ile Thr290 295 300Gln Gly Ala Arg Asn Phe Gly Ser Val Gln Phe Val Ala Ser Tyr Lys305 310 315 320Val Ala Tyr Ser Asn Asp Ser Ala Asn Trp Thr Glu Tyr Gln Asp Pro325 330 335Arg Thr Gly Ser Ser Lys Ile Phe Pro Gly Asn Trp Asp Asn His Ser340 345 350His Lys Lys Asn Leu Phe Glu Thr Pro Ile Leu Ala Arg Tyr Val Arg355 360 365Ile Leu Pro Val Ala Trp His Asn Arg Ile Ala Leu Arg Leu Glu Leu370 375 380Leu Gly Cys Thr Gly His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg385 390 395 400Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn405 410 415Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser420 425 430
Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr435 440 445Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln450 455460Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val465 470 475 480Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val485 490 495Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr500 505 510Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser515 520 525Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe530 535 540Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro545 550 555 560Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro565 570 575Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His580 585 590Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Thr Gly His His595 600 605
His His His His610
權(quán)利要求
1.一種將多肽定位到胞外體的方法，包括(1)提供一種嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼與定位多肽融合的該多肽，該定位多肽包含Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；以及(2)在體內(nèi)或離體將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生重組胞外體。
2.一種在胞外體表面選擇性表達(dá)多肽的方法，包括a)提供一種嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼與定位多肽融合的該多肽，該定位多肽包含Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生重組胞外體；以及c)收集該重組胞外體，其中該胞外體在其表面上帶有由該嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)編碼的多肽。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中該Lactadherin或其部分是哺乳動(dòng)物的Lactadherin或其部分。
4.權(quán)利要求3的方法，其中Lactadherin或其部分選自(1)人的Lactadherin或鼠的Lactadherin，(2)人或鼠的Lactadherin的片段，其中含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域，以及(3)與(1)或(2)中的多肽具有至少50％一級(jí)結(jié)構(gòu)同一性的多肽。
5.權(quán)利要求1的方法，其中Lactadherin的氨基酸序列包含SEQ IDNO7、8、10或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的片段。
6.權(quán)利要求1的方法，其中Lactadherin的氨基酸序列包含SEQ IDNO7、8或10的C1/C2功能結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求5的方法，其中Lactadherin的氨基酸序列包含SEQ IDNO7的69-255、229-387或69-387位氨基酸殘基，或者包含SEQ IDNO10的111-266、109-266、271-426、111-426或109-426位氨基酸殘基。
8.權(quán)利要求1或2的方法，其中該定位多肽含有Del-1、Neuropilin-1、凝集因子5或凝集因子8的C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中嵌合遺傳結(jié)構(gòu)含有前導(dǎo)信號(hào)序列，以便將編碼的嵌合多肽分泌到該胞外體產(chǎn)生細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中該多肽被融合在定位多肽的上游、下游或任何內(nèi)部結(jié)構(gòu)域的連接處。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中該多肽從抗原、細(xì)胞因子、配體、受體、免疫球蛋白、標(biāo)記多肽、酶和離子通道或其部分中選擇。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中幾種編碼不同多肽的獨(dú)特嵌合遺傳結(jié)構(gòu)被引入到該胞外體產(chǎn)生細(xì)胞中。
13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中該胞外體產(chǎn)生細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
14.權(quán)利要求1或2的方法，其中胞外體產(chǎn)生細(xì)胞是鼠細(xì)胞，以及其中Lactadherin是鼠Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的部分。
15.一種篩選、鑒定或選擇胞外體定位多肽的方法，該方法包括●提供第一個(gè)遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼一種侯選多肽，優(yōu)選為侯選的跨膜多肽；●將第一個(gè)遺傳結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞，并測(cè)試侯選多肽在胞外體中的表達(dá)；●選擇一種在胞外體中表達(dá)的侯選多肽，并制備第二個(gè)遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼與定位多肽融合的該選定的侯選多肽；●將第二個(gè)遺傳結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞并測(cè)試融合多肽在胞外體中的表達(dá)；以及●選擇引起被定位多肽在胞外體中有效表達(dá)的侯選多肽。
16.一種制備功能化胞外體的方法，包括a)提供一種嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼了與定位多肽融合的多肽，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分和(2)通過權(quán)利要求15的方法鑒定的定位多肽；b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生在它們的表面上帶有該多肽的功能化胞外體，以及c)收集和/或純化該功能化胞外體。
17.一種生產(chǎn)表達(dá)選定的跨膜多肽的胞外體的方法，該方法包括●按照權(quán)利要求15選擇一種定位多肽，●提供一種編碼了與定位多肽融合的選定的跨膜多肽的遺傳結(jié)構(gòu)，●將該遺傳結(jié)構(gòu)在胞外體產(chǎn)生細(xì)胞中表達(dá)，以及●從該修飾細(xì)胞中生產(chǎn)和分離胞外體。
18.一種生產(chǎn)表達(dá)GPCR或其含有至少一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的部分的胞外體的方法，該方法包括●提供一種遺傳結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)編碼了與含有跨膜結(jié)構(gòu)域和/或通過權(quán)利要求15的方法鑒定的定位多肽融合的GPCR或其部分，●將該遺傳結(jié)構(gòu)在胞外體產(chǎn)生細(xì)胞中表達(dá)，以及●從該表達(dá)GPCR或其部分的修飾細(xì)胞中生產(chǎn)和分離胞外體。
19.一種功能化的胞外體，其由權(quán)利要求16到18中任一項(xiàng)的方法制備。
20.一種功能化的胞外體，其中該胞外體表達(dá)重組的GPCR或其一部分。
21.一種組合物，其含有權(quán)利要求19或20的功能化胞外體以及可藥用的賦形劑或載體。
22.一種生產(chǎn)與多肽結(jié)合的抗體的方法，包括(a)提供一種嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼與定位多肽融合的該多肽或其一種表位，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分和(2)通過權(quán)利要求15的方法鑒定的定位多肽；(b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生在其表面呈遞該多肽或表位的重組胞外體；(c)收集該重組胞外體并將該胞外體或其一部分注射到非人類的哺乳動(dòng)物中以產(chǎn)生可結(jié)合該多肽或表位的抗體；以及(d)從該哺乳動(dòng)物收集抗體或抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
23.一種將抗原投送到受試對(duì)象的方法，包括(a)提供一種嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼與定位多肽融合的該抗原，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分和(2)通過權(quán)利要求15的方法鑒定的定位多肽；(b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生在表面呈遞該抗原的重組胞外體；(c)收集該重組胞外體并將該胞外體或其一部分注射到該受試對(duì)象中。
24.權(quán)利要求23的方法，其中抗原是腫瘤、病毒或微生物抗原。
25.一種嵌合遺傳結(jié)構(gòu)，其中該結(jié)構(gòu)編碼了與定位多肽融合的目的多肽，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分和(2)通過權(quán)利要求15的方法鑒定的定位多肽。
26.權(quán)利要求25的遺傳結(jié)構(gòu)，其中定位多肽是MART1/MelanA、CD81或CD40L或其含有跨膜結(jié)構(gòu)域的片段。
27.權(quán)利要求25或26的嵌合遺傳結(jié)構(gòu)，其中目的多肽從抗原、細(xì)胞因子、配體、受體、免疫球蛋白、標(biāo)記多肽、酶和離子通道或其一部分中選擇。
28.一種嵌合遺傳結(jié)構(gòu)，其中該結(jié)構(gòu)編碼了從SEQ ID NO22-27、32和33中選擇的多肽或其除去C-端8個(gè)氨基酸殘基的片段。
29.一種載體，其含有權(quán)利要求28的嵌合遺傳結(jié)構(gòu)。
30.一種重組細(xì)胞，其含有權(quán)利要求28的嵌合遺傳結(jié)構(gòu)。
31.一種選擇或鑒定多肽的配體或結(jié)合配偶體的方法，包括(a)提供一種嵌合遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼與定位多肽融合的該多肽，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分和(2)通過權(quán)利要求15的方法鑒定的定位多肽；(b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生在其表面呈遞該多肽的重組胞外體；(c)將(b)中的重組胞外體與侯選化合物接觸，并測(cè)定該侯選化合物與該胞外體上的該多肽結(jié)合的能力。
32.一種將抗原投送到受試對(duì)象的方法，包括(a)提供一種嵌合的遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼與定位多肽融合的該抗原，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分和(2)通過權(quán)利要求15的方法鑒定的定位多肽；(b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生在它們的表面上帶有該抗原的重組胞外體；(c)收集該重組胞外體，并且任選將其與來自該受試對(duì)象的樹突狀細(xì)胞離體接觸；(d)將該重組胞外體或該接觸過的樹突狀細(xì)胞或其一部分，如由該接觸過的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的胞外體注射到該受試對(duì)象中。
33.一種生產(chǎn)抗體的方法，包括●提供一種嵌合分子，它包含融合了Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分的抗原；●將該嵌合分子與含有磷脂酰絲氨酸或其它在胞外體中天然存在的脂類的脂質(zhì)囊泡接觸，以產(chǎn)生在它們的表面上呈遞該抗原的功能化脂質(zhì)囊泡；●用這種功能化脂質(zhì)囊泡免疫非人類的哺乳動(dòng)物以產(chǎn)生可結(jié)合該抗原的抗體。
34.一種將抗原投送到受試對(duì)象的方法，包括●提供一種嵌合分子，它包含融合了Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分的抗原；●將該嵌合分子與含有磷脂酰絲氨酸或其它在胞外體中天然存在的脂類的脂質(zhì)囊泡接觸，以產(chǎn)生在它們的表面上呈遞該抗原的功能化脂質(zhì)囊泡；以及●在存在Lactadherin的情況下，將該功能化脂質(zhì)囊泡與來自該受試對(duì)象的樹突狀細(xì)胞離體接觸；以及●將該接觸過的樹突狀細(xì)胞或其部分，如由該接觸過的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的胞外體注射到該受試對(duì)象。
35.一種將抗原投送到受試對(duì)象的方法，包括●提供一種嵌合分子，它包含融合了Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分的抗原；●將該嵌合分子與含有磷脂酰絲氨酸或其它在胞外體中天然存在的脂類的脂質(zhì)囊泡接觸，以產(chǎn)生在它們的表面上呈遞該抗原的功能化脂質(zhì)囊泡；以及●在存在Lactadherin的情況下，將該功能化脂質(zhì)囊泡或其一部分注射到該受試對(duì)象中。
36.一種生產(chǎn)功能化脂質(zhì)囊泡的方法，包括●提供含有磷脂酰絲氨酸或其它在胞外體中天然存在的脂類的脂質(zhì)囊泡，該囊泡帶有一個(gè)活化的Lactadherin，其包括Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分，被一個(gè)反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)所活化；●將該脂質(zhì)囊泡與同該反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)相互作用的化合物接觸以產(chǎn)生功能化的脂質(zhì)囊泡，以及●任選純化該功能化的脂質(zhì)囊泡。
37.權(quán)利要求36的方法，其中脂質(zhì)囊泡是胞外體或脂質(zhì)體。
38.一種生產(chǎn)含有Lactadherin或其一部分的多肽的方法，該方法包括a)提供一種編碼該多肽的遺傳結(jié)構(gòu)；b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生在其表面呈遞該多肽的功能化胞外體；c)任選收集和/或純化該功能化胞外體，以及d)從該功能化胞外體中回收和/或純化該多肽或其片段。
39.權(quán)利要求38的方法，其用于生產(chǎn)Lactadherin，包括將編碼Lactadherin的遺傳結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生在其表面呈遞Lactadherin的功能化胞外體，任選收集和/或純化該功能化胞外體，以及從該功能化胞外體中回收和/或純化Lactadherin。
40.權(quán)利要求38的方法，包括a)提供一種遺傳結(jié)構(gòu)，它編碼與定位多肽融合的該多肽，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；以及(2)通過權(quán)利要求15的方法鑒定的定位多肽；其中將該多肽通過一個(gè)含有切割位點(diǎn)的間隔序列融合到該定位多肽上；b)將該結(jié)構(gòu)引入胞外體產(chǎn)生細(xì)胞以產(chǎn)生在其表面呈遞該多肽的功能化胞外體；c)任選收集和/或純化該功能化胞外體；d)用一種切割該切割位點(diǎn)的試劑處理該功能化胞外體，以及e)回收和/或純化該多肽。
41.一種將抗原投送到受試對(duì)象的方法，包括給該受試對(duì)象注射一種編碼與定位多肽融合的該抗原的遺傳結(jié)構(gòu)，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；以及(2)通過權(quán)利要求15的方法鑒定的定位多肽。
42.一種在受試對(duì)象中產(chǎn)生針對(duì)特定抗原的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給該受試對(duì)象注射一種編碼與定位多肽融合的該抗原的遺傳結(jié)構(gòu)，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分以及(2)通過權(quán)利要求15的方法鑒定的定位多肽。
43.權(quán)利要求41或42的方法，其中該遺傳結(jié)構(gòu)是裸露的DNA或RNA，以及其中該遺傳結(jié)構(gòu)以裸露的形式通過直接肌內(nèi)注射給藥。
44.權(quán)利要求41或42的方法，還包括給受試對(duì)象注射編碼Lactadherin或輔助分子的遺傳結(jié)構(gòu)，所述輔助分子與Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分融合。
45.權(quán)利要求42的方法，其中該遺傳結(jié)構(gòu)以裸露的形式用基因槍注射。
46.權(quán)利要求44的方法，其中該輔助分子是佐劑。
47.權(quán)利要求44的方法，其中該輔助分子是細(xì)胞定位多肽。
48.權(quán)利要求42的方法，其中Lactadherin的氨基酸序列包含SEQID NO7的69-225、229-387或69-387位的氨基酸殘基或SEQ ID NO10的111-266、109-266、271-426、111-426或109-426位的氨基酸殘基。
49.權(quán)利要求46的方法，其中佐劑是多肽細(xì)胞因子，例如GM-CSF和IL-2或CD40L。
50.權(quán)利要求47的方法，其中定位多肽是免疫球蛋白的Fc片段。
51.權(quán)利要求41或42的方法，其中遺傳結(jié)構(gòu)以病毒的形式給藥。
52.權(quán)利要求41或42的方法，其中遺傳結(jié)構(gòu)以質(zhì)粒的形式給藥。
53.權(quán)利要求41或42的方法，其中遺傳結(jié)構(gòu)通過電穿孔給藥。
54.一種在受試對(duì)象體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)特異性抗原的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給該受試對(duì)象注射含有與定位多肽融合的該抗原的嵌合多肽，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；以及(2)通過權(quán)利要求15的方法鑒定的定位多肽。
55.一種組合物，它含有一種編碼與定位多肽融合的抗原的遺傳結(jié)構(gòu)，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；以及(2)通過權(quán)利要求15的方法鑒定的定位多肽，和含有(a)一種編碼與定位多肽融合的免疫輔助分子的遺傳結(jié)構(gòu)，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；以及(2)通過權(quán)利要求15的方法鑒定的定位多肽，或(b)一種編碼Lactadherin的遺傳結(jié)構(gòu)。
56.權(quán)利要求55的組合物，含有(a)一種編碼與定位多肽融合的抗原的遺傳結(jié)構(gòu)，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；以及(2)通過權(quán)利要求15的方法鑒定的定位多肽，以及(b)一種編碼與定位多肽融合的輔助多肽的遺傳結(jié)構(gòu)，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；以及(2)通過權(quán)利要求15的方法鑒定的定位多肽，該輔助多肽是細(xì)胞因子，如GM-CSF或IL-2或CD40L，或(c)一種編碼與定位多肽融合的免疫球蛋白的Fc片段的遺傳結(jié)構(gòu)，該定位多肽選自(1)Lactadherin或其含有C1和/或C2功能結(jié)構(gòu)域的一部分；以及(2)通過權(quán)利要求15的方法鑒定的定位多肽，或(d)一種編碼Lactadherin的遺傳結(jié)構(gòu)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于將多肽在膜囊泡中進(jìn)行選擇性表達(dá)的組合物和方法。本發(fā)明還涉及了適合于生產(chǎn)這種膜囊泡的遺傳結(jié)構(gòu)和重組細(xì)胞。本發(fā)明還涉及了這樣的功能化膜囊泡以及生產(chǎn)抗體的方法、產(chǎn)生或調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法、以及使用它們篩選或鑒定結(jié)合配偶體的方法。更具體來說，本發(fā)明使用了天然或合成來源的lactadherin或其部分用于在膜囊泡中選擇性表達(dá)多肽。本發(fā)明可用于實(shí)驗(yàn)、研究、治療、預(yù)防或診斷領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1543476SQ02816094
公開日2004年11月3日 申請(qǐng)日期2002年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月17日
發(fā)明者阿蘭·德爾凱爾, 珍-柏納德·萊佩克, 傻隆だ撐蹇, 阿蘭 德爾凱爾 申請(qǐng)人:阿諾塞斯公司