專利名稱：：化學(xué)修飾的祖細(xì)胞生成素連接物的制作方法化學(xué)修飾的祖細(xì)胞生成素連接物發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及重組蛋白家族的祖細(xì)胞生成素(progenipoietin)(ProGP)的化學(xué)修飾，祖細(xì)胞生成素是一個家族的重組蛋白，它們是fU3配體和其它造血生長因子受體，包括但不限制于G-CSF的多功能激動劑，通過〗務(wù)飾可改變ProGP的化學(xué)和/或生理性質(zhì)。PEG化的ProGP可以具有降低的清除率，提高的穩(wěn)定性，降低的抗原性，或其組合。ProGP蛋白家族被定義為多功能蛋白，它含有flt3受體激動劑和在WO98/17810中描述的笫二種造血生長因子或集落刺激因子受體激動劑，該專利文獻(xiàn)整體引入此處作為參考。本發(fā)明還涉及修飾的ProGP的過程。此外，本發(fā)明還涉及含有修飾的ProGP的藥物組合物。另一個實施方案是修飾的ProGP治療造血疾病的用途。
背景技術(shù)：
：祖細(xì)胞生成素可用于治療常見的造血疾病，包括由于化療或放療引起的那些(MacVittie，T.J.等，Exp.Hematol.(1999),27(10)，1557-1568)。ProGP還可用于骨髓移植，創(chuàng)傷愈合，燒傷的處理，和寄生蟲，細(xì)菌或病毒感染的治療。通常我們觀察到給予機(jī)體的生理活性蛋白由于它們在機(jī)體內(nèi)的高清除率而只能短期顯示它們的藥理活性。此外，這些蛋白的相對親水性會限制它們的穩(wěn)定性。為降低治療性蛋白的清除率，提高它們的穩(wěn)定性或消除它們的抗原性，人們已經(jīng)提出了一些方法，其中用水溶性聚合物對蛋白進(jìn)行化學(xué)修飾。這種類型的化學(xué)修飾可有效阻斷蛋白水解酶與蛋白主鏈自身的物理接觸，從而防止降解。化學(xué)連接可有效降低腎清除率。其它優(yōu)點包括，在特定情況下，增加治療性蛋白的穩(wěn)定性和循環(huán)時間，增加溶解度，并降低免疫原性。描述蛋白修飾和融合蛋白的綜述是Francis,FocusonGrowthFactors3:4_10(1992年5月)(Mediscript，MountviewCourt，F(xiàn)riernBarnetLane，LondonN20，OLD,UK出版)。6聚(環(huán)氧烷)，特別是聚(乙二醇)(PEG)就是這樣一種化學(xué)部分，它可用于制備治療性蛋白產(chǎn)品(動詞"聚乙二醇化"是指與至少一個PEG分子連接)。聚(乙二醇)的連接已經(jīng)顯示出可防止蛋白水解，Sada等，J".FermentationBioengineering71:137-139(1991)，且用于連接某些聚(乙二醇)部分的方法是可獲得的。見美國專利號US4，179，337，Davis等，"非免疫原性多肽，，，1979年12月18日發(fā)表；和美國專利號US4，002，531，Royer，"用聚乙二醇修飾酶以及由此產(chǎn)生的產(chǎn)物，，，1977年1月11日發(fā)表。綜述見，Abuchowski等，EnzymesasDrugs.(J.S.Holcerberg和J.Roberts編輯，第367-383頁(1981)。還使用過其它水溶性聚合物，如乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚(乙烯#)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(-l，3-二氧戊環(huán))，聚(-1,3,6-三噁烷)，乙烯/馬來酸酐共聚物，和聚-氨基酸(均聚物或無規(guī)共聚物)。人們已經(jīng)描述過很多聚乙二醇化治療性蛋白的例子。ADAGEN⑧，腺苷脫氨酶的聚乙二醇化制劑，已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療重度聯(lián)合免疫缺陷疾病。0NCASPAR⑧，一種聚乙二醇化的L-天門冬酰胺酶已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療過敏的ALL患者。聚乙二醇化的超氧化物歧化酶已經(jīng)在臨床試驗中用于治療頭部損傷。聚乙二醇化的ct-干擾素(US5，738，846,5，382，657)已經(jīng)處于III期臨床試驗階段，可與已被批準(zhǔn)用于治療慢性丙型肝炎的PEG-內(nèi)含子(pegitronct-2b)聯(lián)合治療肝炎，而其它分子，PEGASYSTM正在等待管理機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)；據(jù)報道，聚乙二醇化的葡糖腦苷脂酶和聚乙二醇化的血紅蛋白已經(jīng)處于臨床前期的試驗中。其它例子是聚乙二醇化的IL-6，EF0442724，名稱為'1務(wù)飾的hIL-6"，其中公開了將聚(乙二醇)分子添加到IL-6上。已被化學(xué)修飾的其它具體的治療性蛋白是粒細(xì)胞集落刺激因子，(G-CSF)。G-CSF可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞迅速增殖并向血流釋放，由此在抗感染方面提供治療作用。1990年12月12日公開，名稱為"化學(xué)修飾的粒細(xì)胞集落刺激因子，，的歐洲專利公開號EP0401384描述了用于制備與聚(乙二醇)分子連接的G-CSF的材料和方法。在1992年3月4日公開，名稱為"含有與水溶性聚合物共價連接的多肽的持續(xù)釋;故藥物組合物"的EP0473268中也凈艮道了^"飾的G-CSF及其類似物，其中還描述了與水溶性顆粒聚合物，如聚(乙二醇)共價連接的各種G-CSF和f汙生物的用途。在1989年10月4日/〉開的EP0335423中報道了具有人粒細(xì)胞集落刺激因子活性的修飾多肽。US5,824，784中提供了用于N-末端修飾蛋白的方法，包括N-末端化學(xué)修飾的G-CSF組合物。US5，824，778/^開了化學(xué)^務(wù)飾的G-CSF。日本專利申請Hei2(1990)-30555公開了抗原性降低的化學(xué)修飾的人IL-3。ProGP蛋白家族在W098/17810中/〉開。對于聚(乙二醇)而言，已經(jīng)使用了各種方法使聚(乙二醇)分子與蛋白連接。通常，聚(乙二醇)分子是通過蛋白上的反應(yīng)基團(tuán)與蛋白連接的。氨基，如賴氨酸殘基上或N-末端的那些適于這種連接。例如，Royer(美國專利號US4，002,531，上文)描述了利用還原烷基化連接聚(乙二醇)分子和酶。1993年4月28日/>開的EP0539167，Wright，"PegImidates及其蛋白衍生物"描述了PEG的imidate衍生物或相關(guān)水溶性有機(jī)聚合物修飾具有游離氨基的肽和有機(jī)化合物。Chamow等，BioconjugateChem.5:133-140(1994)凈艮道了通過還原烷基化，用一曱氧基聚(乙二醇)醛修飾CD4免疫粘附素。作者還報道了有50%的CD4-Ig是在控制聚乙二醇化程度的條件下經(jīng)MePEG修飾的。Ibid，第137頁。該作者還報道了修飾的CD4-Ig(與蛋白gp120)的體外結(jié)合能力的降低速率與MePEG化的程度有關(guān)。Ibid.美國專利號US4,904,584，Shaw,1990年2月27日發(fā)表，涉及對蛋白中的一些賴氨酸殘基進(jìn)行修飾，從而經(jīng)由反應(yīng)性胺基與聚(乙二醇)分子連接。連接聚合物與蛋白的很多方法都包括使用起連接基團(tuán)作用的部分。然而，這種部分可以是抗原性的。沒有連接基團(tuán)的tresyl氯化物方法也是可以使用的，但這種方法很難用于產(chǎn)生治療性產(chǎn)物，這是因為tresyl氯化物的使用可產(chǎn)生有毒的副產(chǎn)物。見Francis等，蛋白藥物的穩(wěn)定性用于蛋白穩(wěn)定的體內(nèi)降解途徑和策略(Eds.Ahern.T.和Manning,M.C.Plenum,NewYork,1991)。也見，Delgado等，"通過用tresyl氯化物活化而將PEG與蛋白偶聯(lián)，在免疫親和細(xì)胞制品中的應(yīng)用"，^使用水相系統(tǒng)分離，在細(xì)胞生物學(xué)和生物工程中的應(yīng)用，F(xiàn)isher等編輯，Ple謹(jǐn)Press，NewYork,N.Y.，1989，第211-213頁。還可見Rose等，BioconjugateChemistry2:154-159(1991)，其中報道了連接基團(tuán)卡巴肼與蛋白底物(胰島素)C-末端羧基的選擇性連接。本發(fā)明提供具有降低的清除率，增加的穩(wěn)定性，降低的抗原性，或其組合的化學(xué)《奮飾的ProGP分子。發(fā)明概述本發(fā)明涉及化學(xué)修飾的ProGP，它具有至少一種改進(jìn)的化學(xué)或生理性質(zhì)，所述化學(xué)或生理性質(zhì)選自但不限制于降低的清除率，增加的穩(wěn)定性，和降低的抗原性。因此，按照下面更詳細(xì)的描述，本發(fā)明涉及有關(guān)化學(xué)修飾ProGP的很多方面，以及使用各種聚(乙二醇)部分進(jìn)行的特定修飾。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)化學(xué)修飾的ProGP的方法。本發(fā)明還涉及含有化學(xué)修飾的ProGP的組合物。本發(fā)明的修飾ProGP可用于治療，但不限制于，嗜中性白細(xì)胞減少癥，血小板減少癥，造血祖細(xì)胞和干細(xì)胞向外周血中的動員，骨髓抑制或造血缺陷，以及免疫缺陷。附圖簡述圖1是30,000MWPEG-ALDProGP-4反應(yīng)的離子交換色譜洗脫圖的再現(xiàn)。圖2a是重組ProGP-4的SECHPLC圖。圖2b是30，000MWPEG-ALDProGP-4反應(yīng)混合物的SECHPLC圖。圖2c是離子交換純化的N-末端單-聚乙二醇化的30,000MWPEG-AU)ProGP-4的SECHPLC圖。圖3是30000MWPEG-ALDProGP-4的SDS-PAGE。第1道為MW蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；第2道為空白組；第3道為ProGP-4;第4道為30，000MWPEG-ALDProGP-4。圖4是離子交換純化的N-末端單-聚乙二醇化的30，000MWPEG-ALDProGP-4的SDS-SECHPIX圖。圖5表示N-末端單-PEG化的30，000MWPEG-ALDProGP-4的反圖6表示反相純化的單體單-PEG化的30,OOOMWPEG-ALDProGP-4單體的MALDI-T0F光譜。圖7表示單-PEG化的30,000MWPEG-ALDProGP-4胰蛋白酶消化的SECHPLC圖。圖8舉例說明在粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM)測定法中，flt3受體激動劑，G-CSF受體激動劑，flt3受體激動劑和G-CSF受體激動劑的共添加，未PEG化的ProGP-4和單-PEG化的30,000MWPEG-ALDProGP-4的反應(yīng)曲線的比較，該測定法測量了來源于人骨髓的CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增和分化。圖9舉例說明ProGP-4和單-PEG化的30,000MWPEG-ALDProGP-4的鼠血漿濃度曲線的比較。圖IO通過舉例說明給藥24小時后所獲得的外周血和脾臟中的總白細(xì)胞(WBC)和樹突細(xì)胞(DC)計數(shù)而比較了每天給予小鼠的未PEG化的ProGP-4和每三天給藥的N-末端單-PEG化的30,000MWPEG-ALDProGP-4的體內(nèi)生物活性。圖11通過舉例說明給藥24，48和72小時后所獲得的外周血和脾臟中的總白細(xì)胞(WBC)和樹突細(xì)胞(DC)數(shù)而比較了每天給予小鼠的未PEG化的ProGP-4和每三天給藥的N-末端單-PEG化的30，000MWPEG-AU)ProGP-4的體內(nèi)DC反應(yīng)動力學(xué)。圖12表示ProGP-4的氨基酸序列。發(fā)明詳述祖細(xì)胞生成素(ProGP)蛋白是重組蛋白家族的成員，它們是flt3配體和其它造血生長因子的多功能激動劑。它們的重組產(chǎn)生和使用方法在W098/17810中詳細(xì)描述。祖細(xì)胞生成素蛋白的通式為R廣L「R2，R廣L廣L，R廣R2，R2—R!其中R!是含有下式的經(jīng)修飾的fit-3配體氨基酸序列的多肽10130SEQ工DNO:1其中N-末端與C-末端直接連接，或通過能夠連接N-末端和C-末端并分別在下列氨基酸位置具有新的C-和N-末端的連接體(LO連接28-2942-4393-9429-3064-6594-9530-3165-6695-9631-3266-6796-9732-3386-8797-9834-3587-8898-9936-3788-8999-10037-3889-90100-10138-3990-91101-10239-4091-92102-10340-4192-9341—42其中R2是選自集落刺激因子，細(xì)胞因子，淋巴因子，白介素和造血生長因子的因子；其中L是能夠連接R!和R2的連接體?？扇芜x直接在所述祖細(xì)胞生成素蛋白前面加上(曱硫氨酸—')，(丙氨酸—1)或(曱硫氨酸—2，丙氨酸爿)。在優(yōu)選實施方案中，祖細(xì)胞生成素蛋白的通式為Ri一L廣R2,R廣L1-R1，R廣R2，或R2—其中R,是含有下式的經(jīng)修飾的fit-3配體氨基酸序列的多肽:102030405060LysThrValAlaGlySerLysMetGlnGlyLeuIjeuGluArgValAsnThrGluIleHis7080PheValThrLysCysAlaPheGlnProProProSerCysIieuArgPheValGlnThrAsn90100110120ArgGlnAsnPheSerArgCysLeuGluLeuGlnCysGlnProAsrSerSerThrlieu130SEQ工DNO:l其中N-末端與C-末端直接連接，或通過能夠連接N-末端和C-末端并分別在下列氨基酸位置具有新的C-和N-末端的連接體(LO連接28-2942-4393-9429-3064-6594-9530-3165-6695-9631-3266-6796-9732-3386-8797-9834-3587-8898-9936-3788-8999-10037-3889_90100-10138-3990_91101-10239_4091-92102-10340-4192-9341—42其中R2是含有下式的修飾的人G-CSF氨基酸序列的多肽:110XaaXaaXaaGlyProAlaSerSerLeuProGinSerXaa20LeuLeuXaaXaaXaaGluGinValXaaLysXaaGinGlyXaaGly3040AlaXaaLeuGinGluXaaLeuXaaAlaThrTyrLysLeuXaaXaa50XaaGluXaaXaaValXaaXaaGlyHisSerXaaGlylieProTrp6070AlaProLeuSerSerXaaProSerXaaAlaLeuXaaLeuAlaGly80XaaLeuSerGinI>euHisSerGlyLeuPheLeuTyrGinGlyLeu90100LeuGinAlaLeuGluGly工leSerProGluLeuGlyProThrLeu110XaaThrLeuGinXaaAspValAlaAspPheAlaXaaThrlieTrp120130GinGinMetGluXaaXaaGlyMetAlaProAlaLeuGinProThr140GinGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAlaXaaGinXaaXaaAla150160GlyGlyValLeuValAlaSerXaaLeuGinXaaPheLeuXaaXaa170SerTyrArgValLeuXaaXaaLeuAlaGl:nProSEQIDN〇260l位的Xaa是Thr，Ser，Arg，Tyr或Gly;2位的Xaa是Pro或Leu;3位的Xaa是Leu,Arg，Tyr或Serj13位的Xaa是Phe，Ser，His,Thr或Proj16位的Xaa是Lys，Pro，Ser，Thr或Hisj17位的Xaa是Cys，Ser,Gly，Ala,Ile，Tyr或Argj18位的Xaa是Leu，Thr，Pro,His，Ile或Cys;22位的Xaa是Arg，Tyr，Ser，Thr或Alaj24位的Xaa是Ile，Pro,Tyr或Leuj27位的Xaa是Asp或Gly;30位的Xaa是Ala，lie,34位的Xaa是Lys或Ser36位的Xaa是Cys或Ser42位的Xaa是Cys或Ser43位的Xaa是His，Thr，或Leuj44位的Xaa是Pro，Gly，或Thr;46位的Xaa是Glu，Arg，47位的Xaa是Leu或Thr49位的Xaa是Leu，Phe，50位的Xaa是Leu，Ile，54位的Xaa是Leu或His64位的Xaa是Cys或Ser67位的Xaa是Gln，Lys，70位的Xaa是Gln，Pro,Leu或GlyjGly，Val，Lys，Trp，Ala，Arg，CysArg，Asp，Val，Ala,His,Trp，GlnPhe，Arg，Ile或Ala;Arg或Ser;His，Pro或TyrjLeu或CysjLeu，Arg或Ser;74位的Xaa是Cys或Ser;104位的Xaa是Asp,Gly或Val;108位的Xaa是Leu，Ala，Val，Arg，Trp，115位的Xaa是Thr，His,Leu或Ala'，120位的Xaa是Gln，Gly，Arg，I>ys或His123位的Xaa是Glu，Arg，Phe或Thr'，144位的Xaa是Phe，His,Arg，Pro,Leu，Gin或Gly;Gln或Glu;146位的Xaa是Arg或Gin;147位的Xaa是Arg或Gin;156位的Xaa是His，Gly或Ser;159位的Xaa是Ser，Arg，Thr，Tyr，Val或Glyj162位的Xaa是Glu，Leu，Gly或Trp;163位的Xaa是Val，Gly，Arg或Ala;169位的Xaa是Arg，Ser，Leu，Arg或Cysj170位的Xaa是His，Arg或Ser;其中N-末端l-ll位的氨基酸和/或C-末端1-5位的氨基酸任選從所述修飾的人G-CSF氨基酸序列中缺失；且其中N-末端與C-末端直接連接，或通過能夠連接N-末端和C-末端并分別在下列氨基酸位置具有新的C-和N-末端的連接體(LO連接38-3962-63123-12439-4063-64124-12540-4164-65125-12641-4265-66126-12742-4366-67128-12943-4467-68128-12945-4668-69129-13048-4969-70130-13149-5070-71131-13252-5371-72132-13353-5491-92133-13454-5592-93134-13555-5693-94135-13656-5794-95136-13757-5895-96137-13858-5996-97138-13959-6097-98139-14060-6198-99140-14161-6299-100141-142或142-143;其中，Li是能夠連接Ri和R2的連接體。在另一實施方案中，可任選直接在所述祖細(xì)胞生成素前面加上(甲硫氨酸")，(丙氨酸—')或(曱硫氨酸"，丙氨酸—1)。在優(yōu)選實施方案中，R,選自SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7,SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10，SEQIDNO:11，SEQIDNO:12，SEQIDNO:13，SEQIDNO:14，SEQIDNO:15，SEQIDNO:16，SEQIDNO:17，SEQIDNO:18，SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDNO:21,SEQID歐22,SEQIDNO:23，SEQIDNO:24，SEQID歐25，SEQIDNO:26，SEQIDNO:27，SEQIDNO:28，SEQIDNO:29，SEQIDNO:30，SEQIDNO:31，SEQIDNO:169，SEQIDNO:170，SEQIDNO:171，SEQIDNO:172，SEQIDNO:173，SEQIDNO:174，和SEQIDNO:175。在優(yōu)選實施方案中，IL是GM-CSF，G-CSF，G-CSFSer17，c-mpl配體(TPO)，M-CSF，紅細(xì)胞生成素(EPO)，IL-1，IL-4，IL-2，IL-3，IL-3變體，IL-5，IL-6，IL—7，IL—8，IL—9，IL-IO，IL—11，IL-12，IL-13，IL-15，LIF，flt3/flk2配體，人生長激素，B-細(xì)胞生長因子，B-細(xì)胞分化因子，嗜酸性細(xì)胞分化因子和干細(xì)胞因子(SCF)。在優(yōu)選實施方案中，祖細(xì)胞生成素蛋白選自SEQIDNO:32，SEQIDNO:33，SEQIDNO:34，SEQIDNO:35，SEQIDNO:36，SEQIDNO:37，SEQIDNO:38，SEQIDNO:39，SEQIDNO:40，SEQIDNO:41，SEQSEQIDNO:44,SEQIDNO:45，SEQIDNO:46，NO:48，SEQIDNO:49，SEQIDNO:50，SEQSEQIDNO:53，SEQIDNO:54，SEQIDNO:55，NO:57，SEQIDNO:58，SEQIDN0r59，SEQSEQIDNO:62，SEQIDNO:63，SEQIDNO:64，歐66，SEQIDNO:67，SEQIDNO:68，SEQSEQIDNO:71,SEQIDNO:72，SEQIDNO:73，NO:75,SEQIDNO:76，SEQIDNO:77，SEQSEQIDNO:80，SEQIDNO:81，SEQIDNO:82，NO:84，SEQIDNO:85，SEQIDNO:86，SEQSEQIDNO:89，SEQIDNO:90，SEQIDNO:91，歐93，SEQIDNO:94，SEQIDNO:95，SEQSEQID歐98，SEQIDNO:99，SEQIDNO:100,101，SEQIDNO:102，SEQIDNO:103，SEQIDNO:104，105,SEQIDNO:106,SEQIDNO:107,SEQIDNO:108,109，SEQIDNO:110，SEQIDNO:111，SEQIDNO:112，113，SEQIDNO:114，SEQIDNO:115，SEQIDNO:116，117,SEQIDNO:118，SEQIDNO:119，SEQIDNO:120，16IDNO:42，SEQIDNOSEQIDNO:47，SEQIDNO:51，SEQIDNOSEQIDNO:56，S&QIDNO:60，SEQIDNOSEQID麼65，SEQIDNO:69，SEQIDNOSEQIDNO:74，SEQIDNO:78，SEQIDNOSEQIDNOr83，SEQIDNO:87，SEQIDNOSEQIDNO:92，SEQIDNO:96，SEQIDNO:97SEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNO43,ID52:ID61:IDID79:ID88，ID<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>在優(yōu)選實施方案中，連接體(LO選自Gly,'Thr;GlySer,'AlaAla;GlySerGly,'GlyGlyGlyGlyAsnGly,.GlyAlaGly;GlyThrGly,'AlaSerAla,'AlaAlaAla,-GlyGlyGlySerSEQIDNO:231,'GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerSEQ工DNO:232,-GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerSEQIDNO:233;SerGlyGlySerGlyGlySerSEQ工DNO:234;GluPheGlyAsnMetSEQIDNO:235/GluPheGlyGlyAsnMetSEQ工DNO:236;GluPheGlyGlyAsnGlyGlyAsnMetS:SQ工DNO:237,-GlyGlySerAspMetAlaGlySEQIDNO:238;SerGlyGlyAsnGlySEQIDNO:239;SerGlyGlyAsnGlySerGlyGlyAsnGlySEQIDNO:240;SerGlyGlyAsnGlySerGlyGlyAsnGlySerGlyGlyAsnGlySEQIDNO:241,SerGlyGlySerGlySerGlyGlySerGlySEQIDNO:242;SerGlyGlySerGlySerGlyGlySerGlySerGlyGlySerGlySEQIDNO:243;GlyGlyGlySerGlyGlySEQ工DNO:244;GlyGlyGlySerGlyGlyGlySEQIDNO:245/GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlySEQIDNO:246/GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlySEQIDNO:247/GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySEQIDNO:248/GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlySEQIDNO:249,'ProP:roPt:oTrpSerProAxgPiroIjeuGlyAlaTh:rAlaP:roThrAlaGlyGlnProProLeuSEQIDNO:250;ProProProTrpSerProArgProIjeuGlyAlaThrAlaProThrSEG工DNO:251;SEQ工DNO:252;GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlyGlyGlyGlySerSEQIDNO:253;SerLysGluSerHisIiysSerPro,-SEQ工DN〇254,和工leGluGlyArg工leSei:GluProSerGlyPro工leSei:Thr工leAsnProSerProProSerliysGluSerHisLysSerProSEQ工DN〇255.通過使用重組基因技術(shù)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，如大腸埃希氏菌和動物細(xì)胞產(chǎn)生的任何純化和分離的ProGP都可用于本發(fā)明中。在它們之中，通過轉(zhuǎn)化的大腸埃希氏菌產(chǎn)生的ProGP是特別優(yōu)選的。這種ProGP可以較高的純度和均質(zhì)性大量獲得。例如，上述ProGP可按照W098/17810中公開的方法制備。術(shù)語"基本上具有下列氨基酸序列"是指上述氨基酸序列可包括一個或多個氨基酸改變(缺失，加成，插入或置換)，只要這種改變不會對ProGP的功能造成任何不利的非相似性。更優(yōu)選使用基本上所含氨基酸序列具有至少一個賴氨酸，天門冬氨酸，谷氨酸，或不成對的半胱氨酸殘基的ProGP。根據(jù)本發(fā)明，聚(乙二醇)是通過ProGP的氨基酸殘基共價連接的。所述氨基酸殘基可以是任何反應(yīng)基團(tuán)，例如，具有可與活化的聚(乙二醇)的末端反應(yīng)基團(tuán)結(jié)合的游離氨基，羧基或巰基(硫醇)。具有游離氨基的氨基酸殘基可以包括賴氨酸殘基和/或N-末端氨基酸殘基，具有游離羧基的那些可以包括天門冬氨酸，谷氨酸和/或C-末端氨基酸殘基，和具有巰基(硫醇)，如半胱氨酸的那些。在另一實施方案中，8-羥基全啉化學(xué)(Lemieux&BertozziTibTech16:506-513，1998)可用于導(dǎo)向N-末端的絲氨酸殘基。本發(fā)明所用的聚(乙二醇)不限制于任何特定的形式或分子量范圍。通常，使用500-60，000，優(yōu)選1,000-40，G00的分子量。所述聚(乙二醇)還可以是US5，932，462，US5,342,940，US5，643，575，US5,919,455，US6，113，906和US5，183，660中描述的支化PEG。聚(環(huán)氧烷)，特別是聚(乙二醇)是通過末端反應(yīng)基團(tuán)與ProGP結(jié)合的，它在PEG和蛋白之間可以留有或沒有連接部分(間隔基團(tuán))。為了形成本發(fā)明的ProGP連接物，聚合物如聚(環(huán)氧烷)轉(zhuǎn)化成"活化"形式。所述反應(yīng)基團(tuán)例如是末端反應(yīng)基團(tuán)，它可調(diào)節(jié)蛋白上的化學(xué)部分，如氨基，羧基或巰基，與聚(乙二醇)之間的鍵。通常，末端聚合物的羥基端基(即，ct和co末端鞋基)的其中一個或兩個都轉(zhuǎn)化成反應(yīng)官能團(tuán)，從而進(jìn)行共價連接。該過程常常被稱作"活化"，具有反應(yīng)基團(tuán)的聚(乙二醇)產(chǎn)物在下文中被稱作"活化的聚(乙二醇)"。含有oc和co連接基團(tuán)的聚合物被稱作"雙活化的聚(環(huán)氧烷)"及"雙官能的"。在ct和co末端羥基上含有相同反應(yīng)基團(tuán)的聚合物有時被稱作"同雙官能的"或"同雙活化的，，。在a和co末端羥基上含有不同反應(yīng)基團(tuán)的聚合物有時被稱作"異雙官能的，，或"異雙活化的，，。含有單一反應(yīng)基團(tuán)的聚合物被稱作"單活化的"聚環(huán)氧烷或"單官能的"。其它基本非抗原性的聚合物是類似"活化的"或"官能化的"。因此，活化的聚合物適于介導(dǎo)蛋白上的化學(xué)部分，如a-氨基，羧基或巰基，與聚(乙二醇)之間的鍵。在另一實施方案中，雙活化的聚合物以這種方式，通過交聯(lián)，與兩個蛋白分子或一個蛋白分子以及反應(yīng)性小分子反應(yīng)，從而有效形成蛋白聚合物或蛋白-小分子連接物。能夠與ProGP上的賴氨酸氨基末端的a-氨基或e-氨基反應(yīng)的官能團(tuán)包括碳酸酯，如對-硝基苯基，或琥珀酰亞胺基，羰基咪唑，氮雜內(nèi)酯，環(huán)狀亞胺硫酮，異氰酸酯，異硫氰酸酯和醛。能夠與ProGP上的羧酸基團(tuán)，反應(yīng)性羰基和氧化的碳水化合物部分反應(yīng)的官能團(tuán)包括伯胺，以及肼和酰肼官能團(tuán)，如酰肼，肼基曱酸酯，氨基甲酸酯(semicarbamate)，硫代肼基甲酸酯等。如果ProGP上存在巰基，那么它也可用作適當(dāng)活化的聚合物與反應(yīng)基團(tuán)的連接位點，所述反應(yīng)基團(tuán)如硫醇，馬來酰亞胺，砜，和苯甲酰曱醛。見，例如，美國專利號US5，093,531，它公開的內(nèi)容引入此處作為參考。其它能夠與親電中心反應(yīng)的親核物質(zhì)包括，但不限制于，例如羥基，氨基，羧基，巰基，活性亞曱基等。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，仲胺或酰胺鍵是使用ProGP中賴氨酸的N-末端氨基或s-氨基與活化PEG形成的。在本發(fā)明另一優(yōu)選方面，仲胺鍵是通過用適宜的還原劑，如NaCNBHs，NaBIL，吡咬硼烷等還原劑，在ProGP的N-末端伯氨基和單鏈或支鏈的PEG醛之間形成的，20如Chamow等，BioconjugateChem.5:133-140(1994)和美國專利號US5，824，784所述。在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，用形成酰胺的連接體，如琥珀酰亞胺酯，環(huán)狀亞胺硫酮等活化的聚合物可用于實現(xiàn)ProGP與聚合物之間的連接，見，例如，美國專利號US5,349,001;美國專利號US5,405,877;和Gree難ld等，Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.17:101-161，2000，其引入此處作為參考。優(yōu)選的，可與ProGP的游離氨基結(jié)合的活化聚(乙二醇)包括單鏈或支鏈的N-羥基琥珀酰亞胺聚(乙二醇)，它是通過用N-羥基琥珀酰亞胺活化聚(乙二醇)的琥珀酸酯而制備的。本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案包括使用其它活化聚合物，通過s-氨基或其它基團(tuán)與ProGP形成聚合物的共價連接。例如，末端活化的聚合物的異氰酸酯或異硫氰酸酯形式可用于與賴氨酸的氨基形成以脲或基于硫脲的鍵。在本發(fā)明另一優(yōu)選方面，氨基甲酸酯(尿烷)鍵是用蛋白的氨基形成的，如美國專利號US5，122，614，5，324，844，和5,612，640所述，它們都引入此處作為參考。例子包括N-琥珀酰亞胺基碳酸酯，對-硝基苯基碳酸酯，和羰基咪唑活化的聚合物。在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，PEG的苯并三唑碳酸酯衍生物與ProGP上的氨基連接。本發(fā)明另一方面提供ProGP的前體藥物或持續(xù)釋放形式，它含有通過功能連接體與ProGP分子連接的水溶性聚合物，如聚(乙二醇)，該連接體可通過酶或pH直接水解預(yù)先斷裂，從而釋放游離ProGP或其它ProGP衍生物。所述前體藥物還可以是涉及級聯(lián)latentiation使用的"雙前體藥物，，(BundgaardinAdvancedDrugDeliveryReviews3:39-65，1989)。在這種系統(tǒng)中，水解反應(yīng)包括最初的限速(緩慢的)酶或pH定向步驟，第二步包括快速的非-酶水解，它僅在第一步發(fā)生后出現(xiàn)。這種可釋放聚合物提供的蛋白連接物是暫時的，可作為貯器持續(xù)釋;^文ProGP。這種功能連接體在US5,614,549;US5,840,900;US5,880,131;US5，965，119;US6,011,042;US6,180,095Bl;Gree腿ldR.B.等，J.Med.Chem.42:3657-3667，1999;Lee，S.等，BioconjugateCheml2:163-169，2001;Ga簡nA.J.等，F(xiàn)EBSLett.223:361—365，1987;WoghirenC.等，BioconjugateChem.4:314—318，1993;RobertsM.J.等，J.Pharm.Sci.87:1440-1445，1998;ZhaoX-，NinthInt.Symp-RecentAdv.DrugDeliverySyst.199;Gree謹(jǐn)ldR.B.等，J.Med.Chem.43:475-487，2000;和Gree腿ldR.B.Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.l7:101-161，2000中描述。本發(fā)明另一實施方案是將PEG與親核物質(zhì)連接的方法，其中連接是在有無機(jī)溶劑存在的條件下進(jìn)行的。"親核物質(zhì)，，被定義為蛋白，它包括但不限制于抗體和造血生長因子，肽，酶，醫(yī)用化學(xué)品或有機(jī)部分。優(yōu)選的無機(jī)溶劑是乙腈，曱醇，或乙醇。更優(yōu)選的無機(jī)溶劑是乙腈。優(yōu)選無機(jī)溶劑的濃度約為1%_25%，更優(yōu)選約為3%-13%，更優(yōu)選約8%。連接反應(yīng)，也稱作聚乙二醇化反應(yīng)，通常是在有摩爾過量聚合物存在的溶夜中進(jìn)行的，而不考慮聚合物在何處與蛋白連接。然而，這種通用技術(shù)一般已經(jīng)被證實不足以在使生物活性蛋白與非抗原性聚合物連接的同時，又保留充足的生物活性。維持ProGP生物活性的其中一個方法是基本上避免那些與聚合物偶聯(lián)過程中的受體結(jié)合位點有關(guān)的ProGP反應(yīng)基團(tuán)的連接。本發(fā)明另一方面提供一種使聚(乙二醇)與ProGP連接，同時又維持高水平的保留活性的方法。通過共價鍵進(jìn)行的化學(xué)修飾可在通常生物活性物質(zhì)與活化聚(乙二醇)的反應(yīng)中所采用的任何適宜的條件下進(jìn)行。所述連接反應(yīng)是在相對溫和的條件下進(jìn)4亍的，從而避免將ProGP滅活。溫和的條件包括維持反應(yīng)溶液的pH值在3-10，維持反應(yīng)溫度在約0-37°C。在ProGP中的反應(yīng)氨基酸殘基具有游離氨基的情況下，上述修飾優(yōu)選在4-37°C下，在下列非限制性的適宜緩沖液(pH3-10),包括磷酸鹽，檸檬酸鹽，醋酸鹽，琥珀酸鹽或HEPES中進(jìn)行1-48小時。在使用試劑，如PEG醛導(dǎo)向于N-末端氨基的情況下，優(yōu)選維持pH值在4-7。所用活化聚(乙二醇)的摩爾量為ProGP的游離氨基數(shù)的0.05-100倍，優(yōu)選0.05-0.5倍。另一方面，在ProGP中的反應(yīng)氨基酸殘基具有游離羧基的情況下，上述修飾優(yōu)選在約pH3.5-5.5的條件下進(jìn)行的，例如，使用聚(氧化乙烯二胺)進(jìn)行的修飾是于4-37°C，在有碳二亞胺(pH4-5)存在的條件下進(jìn)行1-24小時。所用活化聚(乙二醇)的摩爾量為ProGP的游離羧基數(shù)的0.05-300倍。22在獨立的實施方案中，連接反應(yīng)中所用聚合物量的上限超過約1:1，從而使活化聚合物與ProGP反應(yīng)，且不會形成大量高分子量種類，即，有超過約20。/。的連接物在每分子ProGP中含有不止約一條鏈的聚合物。例如，預(yù)期在本發(fā)明這方面，可使用多至約6:1的比例，從而形成大量所需連接物，然后將它們從高分子量種類中分離出來。在本發(fā)明另一方面中，雙官能活化的PEG衍生物可用于產(chǎn)生聚合的ProGP-PEG分子，其中有多個ProGP分子經(jīng)由PEG交聯(lián)。雖然這里所述的反應(yīng)條件可導(dǎo)致產(chǎn)生大量未修飾的ProGP，但未修飾的ProGP可很容易再循環(huán)到下一批中，用于進(jìn)行另外的連接反應(yīng)。令人驚奇的是，本發(fā)明的過程產(chǎn)生出非常少量的，即少于約30%，更優(yōu)選少于約10%的高分子量種類以及每個ProGP含有不止一個聚合物鏈的種類。這些反應(yīng)條件與聚合連接反應(yīng)通常所用的那些相反，通常所用的條件下活化聚合物以超過目標(biāo)若干倍的摩爾量存在。在本發(fā)明其它方面中，所存在聚合物的量約為ProGP的0.l-50倍。在本發(fā)明其它方面中，所存在聚合物的量約為每當(dāng)量ProGP約1-10當(dāng)量。本發(fā)明的連接反應(yīng)最初提供一種反應(yīng)混合物或合并物，其中含有單-和二-PEG-ProGP連接物，未反應(yīng)的ProGP,未反應(yīng)的聚合物和通常少于約20%的高分子量種類。所述高分子量種類包括含有不止一個聚合物鏈的連接物和/或聚合的PEG-ProGP種類。除去未反應(yīng)的種類和高分子量種類后，回收主要含有單-和二-聚合物-ProGP連接物的組合物。已知絕大部分連接物都含有單一的聚合物鏈，因此所述連接物基本上是均勻的。通過使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞增殖測定法，如AML，TF1和集落形成單位測定法(美國專利US6，030，812，其引入此處作為參考)測量可知，這些修飾的ProGP具有至少約5%的體外生物活性，這種體外生物活性與天然或未修飾的ProGP有關(guān)。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，修飾的ProGP具有約25%的體外生物活性，更優(yōu)選^f奮飾的ProGP具有約50%的體外生物活性，更優(yōu)選修飾的ProGP具有約75%的體外生物活性，最優(yōu)選修飾的ProGP具有相等或提高的體外生物活性。本發(fā)明的過程優(yōu)選包括更有限的聚合物與ProGP比。因此，所述ProGP連接物主要被限制在僅含有一條聚合物鏈的種類。此外，當(dāng)使用更高摩爾過量的聚合物連接體時，聚合物與ProGP反應(yīng)基團(tuán)的連接基本上不是隨機(jī)的。在連接反應(yīng)已經(jīng)猝滅后，反應(yīng)混合物中的未修飾ProGP可通過使用離子交換或大小排阻層析或類似的分離技術(shù)而再循環(huán)到后面的反應(yīng)中。本發(fā)明聚(乙二醇)-修飾的ProGP，即化學(xué)修飾蛋白可通過用于純化蛋白的常規(guī)方法，如透析，鹽析，超濾，離子交換層析，凝膠層析和電泳而從反應(yīng)混合物中純化出來。離子交換層析對于除去未反應(yīng)的聚(乙二醇)和ProGP特別有效。在本發(fā)明另一實施方案中，分離反應(yīng)混合物中的單-和二-聚合物-ProGP種類，從而除去高分子量種類和未修飾的ProGP。分離是通過將混合的種類放在含有約0.5-10mg/mLProGP-聚合物連接物的緩沖溶液中進(jìn)行的。適宜的溶液pH值約為4-10。該溶液優(yōu)選含有選自KC1，NaCl，K2HP04，KH2P04，Na2HP04，NaEbPO"NaHC03，NaB04,CH3C02H和NaOH的一種或多種緩沖鹽。根據(jù)反應(yīng)緩沖液的不同，ProGP聚合物的連接物溶液可能首先必須經(jīng)過緩沖液交換/超濾，從而除去所有未反應(yīng)的聚合物。例如，可通過低分子量截止(10，000-30，000道爾頓)薄膜將PEG-ProGP連接物溶液超濾，從而除去絕大部分不需要的物質(zhì)(如果存在)，如未反應(yīng)的聚合物，表面活性劑等。連接物到含有所需種類的合并物的分級分離優(yōu)選使用離子交換層析介質(zhì)進(jìn)行。這種介質(zhì)能夠通過電荷差異選擇性結(jié)合PEG-ProGP連接物，而且它可以一定程度上可預(yù)測的形式改變。例如，ProGP的表面電荷是由蛋白表面上可獲得的帶電基團(tuán)數(shù)決定的。這些帶電基團(tuán)通?？善鸬骄?環(huán)氧烷)連接物的潛在連接點的作用。因此，ProGP連接物具有與其它種類不同的電荷，從而可以進(jìn)行選擇性分離。本發(fā)明的方法可分別使用強(qiáng)極性的陰離子或陽離子交換樹脂，如季胺或磺丙基樹脂。特別優(yōu)選陽離子交換樹脂。適合本發(fā)明使用的市售陽離子交換樹脂的非限制性例子是SP-hitrap，SPSepharoseHP和SPSepharosefastflow。其它適合的陽離子交換樹脂，如S和CM樹脂也可使用。適合本發(fā)明使用的陰離子交換樹脂，包括市售陰離子交換樹脂的非限制性例子是Q-hitrap,Q-SepharoseHP，和Qsepharosefastflow。其它適合的陰離子交換樹脂，例如，DEAE樹脂也可使用。例如，優(yōu)選將陽離子交換樹脂填充到柱子中，并用常規(guī)方法平衡。使用與聚合物連接的ProGP溶液具有相同pH值和相同重量克分子滲透濃度的緩沖液。所述洗脫緩沖液優(yōu)選含有一種或多種選自KC1，NaCl，L訓(xùn)4，KH2P04，Na2HP04，NaH2P04，NaHC03，NaB(h，和(NHO2C03的鹽。然后，使含有連接物的溶液吸附到具有未反應(yīng)聚合物，但沒有保留某些高分子量種類的柱上。上樣完成后，在柱上施加鹽濃度逐漸增加的洗脫緩沖液梯度，從而將聚環(huán)氧烷連接的ProGP的所需級分洗脫下來。在陽離子交換分離步驟之后，優(yōu)選洗脫下來的合并級分限制在均勻的聚合物連接物。然后，可通過常規(guī)技術(shù)將所有未連接的ProGP種類從柱子上洗脫下來。如果需要，可通過其它離子交換層析或大小排阻層析進(jìn)一步將單和多聚乙二醇化的種類彼此分離開。也可利用逐漸增加濃度的多次恒溶劑洗脫步驟的技術(shù)。逐漸增加濃度的多次恒溶劑洗脫步驟可導(dǎo)致二-和單-ProGP-聚合物連接物的順序洗脫。進(jìn)行洗脫的溫度范圍約為4°C-25°C。優(yōu)選洗脫是在約6'C-22r進(jìn)行的。例如，PEG-ProGP級分的洗脫是通過280nm處的UV吸光度檢測的。各級分的收集可通過簡單的時間洗脫圖獲得。在使聚(乙二醇)聚合物與ProGP部分連接的過程中，可使用表面活性劑。適宜的表面活性劑包括離子型表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉(SDS)。其它離子型表面活性劑，如十二烷基硫酸鋰，季銨化合物，?；悄懰?，辛酸，癸烷磺酸等也可使用。還可使用非離子型表面活性劑。例如，可使用聚(氧乙烯)脫水山梨糖醇(吐溫)，聚(氧乙烯)醚(Tritons)等物質(zhì)。還可見Neugebauer,生物學(xué)和生物化學(xué)中洗滌劑的性質(zhì)和用途的指南(1992)CalbiochemCorp.。本發(fā)明的過程所用表面活性劑的唯一限制是在不會引起ProGP的大量不可合物中的表面活性劑的量約為0.01-0.5%;優(yōu)選0.05-0.5%;最優(yōu)選約0.075-0.25%。還考慮了表面活性劑的混合物。在聚合物連接過程中，表面活性劑提供臨時、可逆的保護(hù)系統(tǒng)。表面活性劑已經(jīng)顯示出可有效地選擇性阻礙聚合物連接，同時使基于賴氨酸或氨基末端的連接繼續(xù)進(jìn)行。本發(fā)明的聚(乙二醇)修飾的ProGP具有更持久的藥理學(xué)作用，這很可能歸因于其在體內(nèi)較長的半衰期。本發(fā)明PEG-ProGP的預(yù)期用途是從前體產(chǎn)生大量樹突細(xì)胞，從而用作免疫的佐劑。樹突細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用。它們25是在激活靜息T細(xì)胞方面最有效的專門的抗原-呈遞細(xì)胞，而且是用于激活體內(nèi)天然T細(xì)胞的主要抗原-呈遞細(xì)胞，因此，可用于引發(fā)初次免疫應(yīng)答。它們可有效使可溶性腫瘤特異性抗原(Ag)內(nèi)化，并進(jìn)行加工和呈遞。樹突細(xì)胞具有使天然T細(xì)胞聚集，并通過快速上調(diào)主要組織相容性復(fù)合物(匪C)和共刺激分子的表達(dá)，細(xì)胞因子的產(chǎn)生，和向淋巴器官的遷移而應(yīng)答Ag沖擊的獨特能力。因為樹突細(xì)胞對于使宿主對CD4-依賴性免疫應(yīng)答的新抗原敏感非常重要，因此它們還可在腫瘤免疫性的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要的作用。樹突細(xì)胞來源于粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞常見的骨髓CD34+前體，并且已經(jīng)在人類中確立了可產(chǎn)生純樹突細(xì)胞集落的獨立樹突細(xì)胞集落形成單位(CFU-DC)的存在。此外，已經(jīng)描述過CFU后CD14+中間體具有在不同細(xì)胞因子條件下，沿著樹突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞途徑分化的潛能。這種雙潛能前體存在于骨髓，臍帶血，和外周血中。樹突細(xì)胞還可基于特異的細(xì)胞表面標(biāo)記，如CDla+，CD3-，CD4-，CD20-，CD40+，CD80+和CD83+而被分離，從而確定所培養(yǎng)樹突細(xì)胞的成熟?；跇渫患?xì)胞的策略提供了一種用于增強(qiáng)對腫瘤和感染劑的免疫應(yīng)答的方法。AIDS是另外一種可使用基于樹突細(xì)胞的療法的疾病，這是因為樹突細(xì)胞可在促進(jìn)HIV-1復(fù)制方面發(fā)揮重要作用。免疫療法需要從癌癥患者產(chǎn)生樹突細(xì)胞，并使它們和來源于外科手術(shù)除去的腫瘤塊的肺瘤Ag體外接觸，然后將這些細(xì)胞再次注射到腫瘤患者中。腫瘤細(xì)胞膜的相對粗制劑有能力作為肺瘤抗原的來源，避免分子鑒定肺瘤抗原的必要性。所述腫瘤抗原還可以是合成的肽，碳水化合物，或核酸序列。此外，細(xì)胞因子，如本發(fā)明PEG-ProGP的伴隨給藥可進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤免疫性的誘導(dǎo)。可以預(yù)見到，免疫療法可在體內(nèi)進(jìn)行，其中將本發(fā)明的PEG-ProGP單獨或與其它造血生長因子一起給予腫瘤患者，從而增加樹突細(xì)胞數(shù)，并使內(nèi)源性肺瘤抗原呈遞在樹突細(xì)胞上。還預(yù)測到，體內(nèi)免疫療法可以與外源抗原一起使用。還預(yù)測到，免疫療法可以包括動員樹突細(xì)胞前體或成熟的樹突細(xì)胞，即將本發(fā)明的PEG-ProGP單獨或與其它造血生長因子一起給予患者，除去患者中的樹突細(xì)胞前體或成熟的樹突細(xì)胞，使樹突細(xì)胞與抗原接觸，并將該樹突細(xì)胞返回給患者。此外，還可單獨使用本發(fā)明的PEG-ProGP或與其它造血生長因子一起離體培養(yǎng)已經(jīng)除去的樹突細(xì)胞，從而在與抗原接觸之前增加樹突細(xì)胞數(shù)?；跇渫患?xì)胞的策略還提供一種減少自身免疫疾病中的免疫應(yīng)答的方法。因為在制備充足數(shù)量和相當(dāng)純形式的細(xì)胞時遇到了困難，從而大大阻礙了對樹突細(xì)胞的研究。在來自體內(nèi)的細(xì)胞擴(kuò)增方面，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子-a(TNF-a)配合，從造血祖細(xì)胞(CD34+細(xì)胞)離體產(chǎn)生樹突細(xì)胞，所述造血祖細(xì)胞來源于骨髓，臍帶血，或外周血，而flk-2/flt-3配體和c-kit配體(干細(xì)胞因子[SCF])則可協(xié)同提高GM-CSF加TNF-a誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞產(chǎn)生(Siena，S.等，ExperimentalHematology23:1463-1471，1995)。還提供了一種使用本發(fā)明的PEG-ProGP離體擴(kuò)增樹突細(xì)胞前體或成熟樹突細(xì)胞，從而提供足量樹突細(xì)胞，進(jìn)行免疫治療的方法。此外，還觀察到本發(fā)明的聚(乙二醇)修飾的ProGP可促進(jìn)從嗜中性白細(xì)胞減少癥恢復(fù)。本發(fā)明的聚(乙二醇)修飾的ProGP可以具有與完整的ProGP基本上相同的生物活性，并因此可用于相同的應(yīng)用中。聚(乙二醇)修飾的ProGP具有增加嗜中性白細(xì)胞數(shù)的活性，并因此可用于治療常見的造血疾病，包括由化療或》iL療引起的那些。它還可用于感染的治療和骨髓移植。本發(fā)明的修飾的ProGP可用于治療特征在于造血系統(tǒng)中的骨髓細(xì)胞，紅細(xì)胞樣細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，或巨核細(xì)胞水平降低，或其組合的疾病。此外，它們可用于激活成熟的骨髓細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞。在這些疾病之中，對使用本發(fā)明多肽進(jìn)行治療比較敏感的是白細(xì)胞減少癥，即一種外周血中的循環(huán)白細(xì)胞數(shù)減少的疾病。白細(xì)胞減少癥可能是由于與某些病毒或放射線接觸而誘導(dǎo)的。它常是各種形式的癌癥療法，如與化療藥物、放射線接觸，以及感染或出血的副作用。用本發(fā)明這些^f奮飾的ProGP治療白細(xì)胞減少癥可避免使用目前獲得的藥物進(jìn)行治療所引起的不良副作用。本發(fā)明的^f奮飾的ProGP可用于治療或預(yù)防嗜中性白細(xì)胞減少癥并，例如，用于治療如再生障礙性貧血，周期性嗜中性白細(xì)胞減少癥，特發(fā)性嗜中性白細(xì)胞減少癥，Chediak-Higashi綜合征，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，白血病，骨髓發(fā)育不良綜合癥及骨髓纖維化的疾病。本發(fā)明的^f務(wù)飾的ProGP可用于治療或預(yù)防血小板減少癥。目前，血小板減少癥的唯一治療方法是血小板輸注，這種方法花費較高，而且有感染(HIV，HBV)和異體免疫的巨大危險，IL-11(Neumega"')已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療某些血小板減少癥。所述修飾的ProGP可緩和或減少對血小板輸注的需要。嚴(yán)重的血小板減少癥可由遺傳缺陷，如Fan函i，s貧血癥，Wiscott-Aldrich，或May-Hegglin綜合征導(dǎo)致。獲得性血小板減少癥可能是由自體抗體或同種異體抗體導(dǎo)致，如免疫血小板減少性紫癜，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，溶血性貧血，或胎兒-母親不相容。此外，巨脾，播散性血管內(nèi)凝固，血栓形成性血小板減少性紫癜，感染，或修復(fù)心臟瓣膜可導(dǎo)致血小板減少癥。嚴(yán)重的血小板減少癥還可由化療和/或放療或癌癥引起。血小板減少癥還可由癌，淋巴瘤，白血病，或纖維化而侵入骨髓而引起。本發(fā)明的修飾的ProGP可用于動員造血祖細(xì)胞和干細(xì)胞進(jìn)入外周血中。外周血衍生的祖細(xì)胞已經(jīng)顯示出可有效使自體骨髓移植的患者重構(gòu)。造血生長因子，包括G-CSF和GM-CSF已經(jīng)顯示出可提高外周血中的循環(huán)祖細(xì)胞和干細(xì)胞數(shù)。這樣一來，可使外周干細(xì)胞聚集的過程簡化，并且通過降低所需的提取次數(shù)而顯著降低了過程的成本。所述修飾的ProGP可用于動員干細(xì)胞，并進(jìn)一步提高外周干細(xì)胞移植術(shù)的效率。生長因子的其它預(yù)計臨床用途是體外激活造血祖細(xì)胞和干細(xì)胞，用于進(jìn)行基因治療。為了具有摻入到造血祖細(xì)胞或干細(xì)胞基因組中的目標(biāo)基因，需要刺激細(xì)胞分化和DM復(fù)制。造血干細(xì)胞的循環(huán)頻率非常低，這意味著生長因子可用于促進(jìn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，并由此提高基因治療的臨床前景。很多藥物都可引起骨髓抑制或造血缺陷。這種藥物的例子是化療中使用的AZT，DDI，烷化劑和抗代謝物，抗生素如氯霉素，青霉素，更昔洛韋，柔紅霉素，和磺胺類藥物，phenothiazone，鎮(zhèn)靜劑，如曱丙氨酯，止痛劑，如氨基比林和安乃近，抗-驚厥劑，如苯妥英或卡馬西平，抗曱狀腺藥，如丙基硫尿嗜啶和甲巰咪唑及利尿劑。本發(fā)明的修飾ProGP可用于預(yù)防或治療骨髓抑制或造血缺陷，而骨髓抑制或造血缺陷常常出現(xiàn)于用這些藥物治療的患者中。造血缺陷還可因為病毒，細(xì)菌，或寄生蟲感染而產(chǎn)生，而且可由腎病或腎衰竭的治療，例如透析所導(dǎo)致。本發(fā)明的修飾ProGP可用于治療這種造血缺陷。造血缺陷的治療可以包括給予患者含有修飾的ProGP的藥物組合物。本發(fā)明的修飾的ProGP還可用于在將所述細(xì)胞注射到患者中之前，通過用本發(fā)明的〗奮飾的ProGP體外處理這些細(xì)胞而激活并擴(kuò)增造血前體細(xì)胞。各種免疫缺陷，例如，T和/或B-淋巴細(xì)胞缺陷，或免疫疾病，例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎也可通過用本發(fā)明的修飾ProGP治療而受到有益的影響。免疫缺陷可能是病毒感染，例如，HTLV-I，HTLV-II，HTLV-III，與放射線嚴(yán)重接觸，癌癥治療或其它醫(yī)學(xué)療法的結(jié)果。本發(fā)明的修飾的ProGP可單獨使用，或與其它紅細(xì)胞生成素聯(lián)合使用，治療其它血細(xì)胞缺陷，包括血小板減少癥(血小板缺陷)，或貧血。這些新多肽的其它用途是治療從體內(nèi)和離體骨髓移植恢復(fù)的患者，以及開發(fā)利用標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生的單克隆和多克隆抗體，用于診斷或治療用途。本發(fā)明的聚(乙二醇)-修飾的ProGP可被配制成含有藥學(xué)上可接受的稀釋劑，制備等滲溶液的試劑，pH-調(diào)節(jié)劑等的藥物，從而將它們給予患者。上述藥物可皮下，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，或口服給藥，這取決于治療的目的。給藥劑量也是以所治療患者的疾病種類和狀況而改變，對于成人而言，通常是注射給予0.lmg-50mg，口服給予0.lmg-5g。所含有的聚合物質(zhì)優(yōu)選室溫時是水溶性的。這種聚合物的非限制性例子包括聚(環(huán)氧烷)均聚物，如聚(乙二醇)或聚(丙二醇)，聚(氧乙烯化多元醇)，其共聚物及其嵌段共聚物，只要能夠維持嵌段共聚物的水溶性。作為基于PEG的聚合物的替換物，也可使用有效的非抗原性物質(zhì)如葡聚糖，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(丙烯酰胺)，聚(乙烯醇)，基于碳水化合物的聚合物等。事實上，這些聚合物質(zhì)的ot-和co-末端基團(tuán)的活化可按與轉(zhuǎn)化聚(環(huán)氧烷)所用相似的方式進(jìn)行，這對于本領(lǐng)域那些普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。本領(lǐng)域那些普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，上述列表僅為舉例說明，并考慮了具有這里所述性質(zhì)的所有聚合物。在本發(fā)明中，"有效的非-抗原性，，是指本領(lǐng)域已知的所有物質(zhì)，它是無毒的，而且不會引起哺乳動物明顯的免疫原性應(yīng)答。定義下列是可在這里可互換使用的縮寫詞及其相應(yīng)含義的列表g克mg毫克ml或mL亳升RT室溫PEG聚(乙二醇)本說明書中引證的所有公開出版物，專利和專利申請的全部內(nèi)容都引入此處作為參考，就如同每篇獨立的出版物，專利，或?qū)＠暾執(zhí)囟ㄇ覇为氁氪颂幾鳛閰⒖肌ｋm然已經(jīng)通過舉例說明和實施例描述了前述發(fā)明，以便更清楚地理解它，但在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，對發(fā)明進(jìn)行變化和改進(jìn)對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。提供下列實施例僅僅是為了舉例說明，而不是對本發(fā)明范圍的限制，其已經(jīng)在上面寬泛的術(shù)語中描述。在下列實施例中，ProGP多肽是ProGP-4的多肽，其氨基酸序列在圖12中給出。應(yīng)當(dāng)理解，ProGP家族多肽的其它成員也可按照與下列實施例中舉例說明的類似方式聚乙二醇化。實施例實施例1直鏈、30,000MW的PEG-ProGP""^^^^^^-^/^^^QCH2CH2dHPEG-醛5,20和30,000MW該實施例證實了一種通過還原烷基化生產(chǎn)N-末端單聚乙二醇化ProGP的基本均勻制劑的方法。大約30,000MW的甲氧基-線性PEG-丙醛試劑(ShearwaterPolymersInc.)是通過還原氨基化與ProGP的N-末端選擇性偶聯(lián)的，其中利用了賴氨酸殘基的N-末端伯胺相對pKa值與s-氨基位置的伯胺pKa值的差異。將ProGP蛋白以l-5mg/mL30的濃度溶解在pH5.0的10mM琥珀酸鈉中，或pH5.0的10mM琥珀酸鈉(J.T.Baker，Phi11ipsburg)，8%乙腈(Burdick和Jackson,Muskegon,MI)中，通過加入固體M-PEG-ALD與曱氧基-PEG-丙醛，M-PEG-ALD(ShearwaterPolymersInc.,Huntsville，AL)反應(yīng)，產(chǎn)生相對摩爾比為2-12:1的PEG:ProGP(二聚物)。反應(yīng)是通過加入溶解在H20中的lMNaC腦"SigmaChemical,St.Louis,MO)至10mM的終濃度而催化的。反應(yīng)于4。C時，在暗處進(jìn)行18-24小時。加入1MTris堿(SigmaChemical,St.Louis,MO)到50mM的終Tris濃度和8.5的終pH值而終止反應(yīng)。實施例2直鏈、20,000MW的PEG-ProGP甲氧基-線性、20，000MW的PEG-丙醛試劑(ShearwaterPolymersInc.)是按照實施例1描述的過程與ProGP的N-末端偶聯(lián)的。實施例3直鏈、5,000MW的PEG-ProGP曱氧基-線性、5，000MW的PEG-丙醛試劑(Fluka)是按照實施例1描述的過程與ProGP的N-末端偶聯(lián)的。實施例4支鏈、40,000MW的PEG—ProGP<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>曱氧基-支鏈、40,000MW的PEG-丙醛(PEG2-ALD)試劑(ShearwaterPolymersInc.)是按照實施例1描述的過程與ProGP的N-末端偶聯(lián)的。實施例5直鏈、20,000MW的PEG-ProGP<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>SPA-PEG5和20,000MW該實施例證實了一種使用N-羥基琥珀酰亞胺基(NHS)活性酯生產(chǎn)單聚乙二醇化祖細(xì)胞生成素(ProGP)的基本均勻制劑的方法。將ProGP蛋白原液以l-5mg/mL的濃度溶解在pH5.0的10mM琥珀酸鈉中，通過加入0.25MHEPES緩沖液而將pH滴定到7.2。然后通過加入固體SPA-PEG使該溶液與甲氧基-PEG-琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA-PEG)反應(yīng)，產(chǎn)生相對摩爾比為6.5:1的PEG:祖細(xì)胞生成素。反應(yīng)于4"C進(jìn)行1小時。通過使用0.IN醋酸降低pH值到4.0或通過加入5倍摩爾過量的TrisHC1而終止反應(yīng)。MPEG-雙西旨<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>II實施例6直鏈、3,400MW的生物素-PEG-ProGP3,400MW的生物素-PEG-CO廣NHS試劑(ShearwaterPolymerslnc.)是按照實施例5描述的過程與ProGP偶聯(lián)的。實施例7分支的、10，000MW的PEG-ProGPPEG2-NHS10,20和40,000MW10,000MW、分支的PEG2-NHS(ShearwaterPolymersInc.)是按照實施例5描述的過程與ProGP偶聯(lián)的。實施例8分支的、20,000MW的PEG-ProGP20,000MW、分支的PEG2—SPA(ShearwaterPolymersInc.)是按照實施例5描述的過程與ProGP偶聯(lián)的。實施例9分支的、40,000MW的PEG-ProGP40，000MW、分支的PEG2-SPA(ShearwaterPolymersInc.)是按照實施例5描述的過程與ProGP偶聯(lián)的。實施例10直鏈、20,000MW的PEG—ProGP<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>BTC-PEG20，000MW20,000MW的PEG-BTC(ShearwaterPolymersInc.)是按照實施例4描述的過程與ProGP偶聯(lián)的。該實施例證實了一種使用PEG的苯并三唑碳酸酯衍生物生產(chǎn)聚乙二醇化祖細(xì)胞生成素(ProGP)的基本均勻制劑的方法。實施例11直鏈、5,000MW的PEG—ProGP<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>5,000MW的琥珀酰亞胺基琥珀酸酯-PEG(SS-PEG)(ShearwaterPolymersInc.)是按照實施例5描述的過程與ProGP偶聯(lián)的。該實施例證實了一種使用可水解鍵生產(chǎn)聚乙二醇化祖細(xì)胞生成素(ProGP)的基本均勻制劑的方法。實施例12直鏈、20，000MW的PEG-ProGPPEG-酰肼20，000MW該實施例證實了一種使用20，000MW甲氧基-PEG-酰肼，HZ-PEG(ShearwaterPolymersInc.)生產(chǎn)聚乙二醇化祖細(xì)胞生成素(ProGP)的基本均勻制劑的方法。將ProGP蛋白原液以l-5mg/mL的濃度溶解在pH5.0的10mM琥珀酸鈉中。然后通過加入固體4吏該溶液與HZ-PEG反應(yīng)，產(chǎn)生相對摩爾比為6.5-26:1的PEG:祖細(xì)胞生成素。反應(yīng)是用終濃度2mM的碳二亞胺(EDC，EOAC)催化的。反應(yīng)于4"C進(jìn)行2小時。通過用0.IN醋酸降低pH值到4而終止反應(yīng)。實施例13多-聚乙二醇化的種類連接兩個或多個PEG的修飾ProGP(多-聚乙二醇化)也是按照實施例1-4獲得的，并利用陰離子交換色譜將其從單-聚乙二醇化的種類中分離出來。連接兩個或多個PEG的修飾的ProGP(多-聚乙二醇化)也可用陽離子交換色譜從單-PEG化的種類中分離出來。連接兩個或多個PEG的修飾的ProGP(多-聚乙二醇化)也可按照實施例5-13獲得，并按照與實施例l-4相似的方式純化。實施例14聚乙二醇化ProGP的純化聚乙二醇化ProGP的種類是使用單一的離子交換色譜步驟從反應(yīng)混合物純化至〉95%(SEC分析)的。離子交換色譜單-聚乙二醇化的30K20K和5K的PEG酪ProGP種類是利用單一的離子交換色譜步驟從反應(yīng)混合物純化至>95%(SEC分析)的。單-聚乙二醇化的ProGP是利用陰離子交換色譜從未修飾的ProGP和多-聚乙二醇化的ProGP純化的(圖1)。上述典型的30K醛ProGP反應(yīng)混合物(50-350mg蛋白)是在Q-Sepharose高性能柱(XK26/20，70ml床體積，AmershamPharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)上純化的，該柱在50mMTris,pH8.5(緩沖液A)中平衡。將所述反應(yīng)混合物用50mMTris，8%乙腈，pH8.5稀釋5倍，并以10mL/分鐘的流速上樣到柱上。用5倍柱體積的緩沖液A洗滌該柱子，接著用5倍柱體積的含30mMNaCl的緩沖液A洗滌。隨后，用20倍柱體積的緩沖液A和30-130mM的線性NaCl梯度從柱上將各種ProGP種類洗脫下來。通過280nm()處的吸光度監(jiān)測洗脫液，并收集到12mL級分。將各級分合并至聚乙二醇化的程度，例如，單，二，三等(如在實施例15中評估的)。使用1MHC1降低合并物的pH值到7.5，然后將合并物在10KOmegacell攪拌式細(xì)胞濃縮器(FiltronTechnologyCorporation,Northborough，MA)中濃縮至1-5mg/mL。合并物的蛋白濃度是使用0.97%的消光系數(shù)通過Am測定的。該過程的純單30KPEG-醛ProGP的總產(chǎn)率為25-30%。陽離子交換色譜P曰離子交換色鐠是在SPSepharose高性能柱(PharmaciaXK26/20,70ml床體積)上進(jìn)行的，該柱在10mM醋酸鈉，pH4.5(緩沖液C)中平衡。將反應(yīng)混合物用緩沖液C稀釋10倍，然后以5mL/分鐘的流速上樣到柱子上。接下來，用5倍柱體積的緩沖液洗滌該柱子，然后用5倍柱體積的12。/。緩沖液D(10mM醋酸鹽，pH4.5，1MNaCl)洗滌該柱子。隨后，用20倍柱體積、線性梯度的12-27。/。緩沖液D將PEG-ProGP種類從柱上洗脫下來。洗脫液是在280nm處監(jiān)測的，收集到10mL級分。根據(jù)聚乙二醇化的程度(單，二，三等)合并各級分，交換到pH4.5、lOmM的醋酸鹽緩沖液中，然后在裝有AmiconYM10薄膜的攪拌式細(xì)胞濃縮器中濃縮至l-5mg/mL。蛋白濃度是用0.71的消光系數(shù)通過A280nm測定的。該過程單聚乙二醇化ProGP的總產(chǎn)率為10-50、實施例15生化表征純的聚乙二醇化ProGP合并物是利用SDS-PAGE(圖3)，非變性和變性大小排阻色譜(圖2，4)，RPHPLC(圖5)，胰蛋白酶繪圖(圖7)，和MALDI-TOF6)描述的。大小排阻高效液相色譜(SEC-HPLC)非-變性SEC-HPLC30K甲氧基-PEG丙醛與ProGP的反應(yīng)，陰離子交換純化，和最終的純化產(chǎn)物是使用非-變性SEC-HPLC(圖2a，2b)評估的。分析型非-變性SEC-HPLC是使用Superdex200HR10/30柱(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway,NJ)，在流速為0.4mL/分鐘的50mMTrispH7.5，150mMNaCl中進(jìn)4亍的。PEG化可大大增加導(dǎo)致早期存留時間改變的蛋白流體力學(xué)體積。在30KPEG醛ProGP反應(yīng)混合物連同未修飾的ProGP中，觀察到兩個PEG化種類。這些PEG化和非-PEG化的種類是在Q-Sepharose色譜柱上分離的(圖l)，所得的純化的單30KPEG醛ProGP隨后在非-變性SEC上被洗脫為單峰(>95%純度，圖2c)。Q-Sepharose色諳步驟可有效除去單-聚乙二醇化ProGP中的游離PEG,非-PEG化的ProGP二聚物和多PEG化的種類。變性SDSSEC-HPLC用非共價pr0GP二聚物解離的變性SDSSEC證實單30KPEG醛ProGP僅在ProGP二聚物的一個亞單位(單體)上PEG化(圖4)。變性SEC-HPLC是按照與非-變性SEC-HPLC所述相同的方式進(jìn)4亍的，區(qū)別在于流動緩沖液中含有0.1%SDS。蛋白洗脫后，監(jiān)測220nm處的吸光度。在非-變性SEC中洗脫為單峰的純化的單30KPEG醛ProGP在變性條件下，被分離成PEG化的亞單位和非-PEG化的亞單位(如下面鑒定的)。SDSPAGE解離非-共價ProGP二聚物的SDS-PAGE可用于證實純度，以及單30KPEG醛ProGP僅在ProGP二聚物的一個亞單位(單體)上PEG化37(圖3)。SDS-PAGE是在還原和非還原條件下，在lmm厚的12%Tris甘氨酸凝膠(Invitrogen，Carlsbad,CA)上進(jìn)行的，并用NovexColloidalCoomassieTMG-250染色試劑盒凝膠(Invitrogen,Carlsbad，CA)染色。在非-變性SEC中洗脫為單峰的純化的單-30KPEG醛ProGP被分離成PEG化的亞單位和非-PEG化的亞單位。反相肌C(RPHPLC)RPHPLC是在50。C的Phe麵e親JupiterCu柱(4.6X250mm,5nm粒度)上進(jìn)行的，樣品以lmL/分鐘上樣到在40%乙腈，0.1°/。TFA中平衡的柱子上。用3mL58%乙腈洗滌該柱子。隨后，用58-63%的乙腈梯度洗脫該蛋白27分鐘。制備型和分析型RP-HPLC是5(TC時，在JupiterCis柱，4.6X250mm，5mm粒徑，(Phenomenex，Torrance，CA)上進(jìn)^f亍的。以lmL/分鐘的速率將樣品上樣到在40%乙腈，0.1%TFA中平衡的柱子上。用3mL58%乙腈洗滌該柱子。隨后，用58-63%的乙腈梯度洗脫該蛋白27分鐘。監(jiān)測洗脫液在214nm處的吸光度。在非-變性SEC中洗脫為單峰的純化的PEG-ProGP在變性條件下被分離(圖5)成PEG化的亞單位和未PEG化的亞單位(如下面鑒定的)。為了證實各種類的同一性，收集RP-HPLC的洗脫峰(圖5)，進(jìn)行MALDI-TOFMS和N-末端測序?qū)嶒?。N-末端序列和肽的繪圖用自動埃德曼降解化學(xué)過程測定NH2-末端蛋白序列(SOP400.324)。應(yīng)用生物系統(tǒng)模型494Procise測序4義(PerkinElmer，Wellesley,MA)用于降解。各PTH-AA衍生物是通過在線形式的RP-HPLC分析鑒定的，其中使用了裝有PerkinElmer/Brownlee2.1mmi.d.PTH-C18柱的應(yīng)用生物系統(tǒng)模型140CPTH分才;H義。與PEG-ProGP的正確質(zhì)量相對應(yīng)的RP-HPLC峰(圖5)的N-末端測序產(chǎn)生了兩個信號。除了缺少N-末端氨基酸外，主信號(大約75%的產(chǎn)率)具有PEG-ProGP的預(yù)期序列。這一結(jié)果是N-末端PEG化蛋白預(yù)期的。由于連接的PEG部分，第一次循環(huán)的殘基是不可恢復(fù)的。微弱的信號(大約25%的產(chǎn)率)具有正確的N-末端氨基酸序列。由于從RP-HPLC收集的峰是100。/。PEG化的，因此這些數(shù)據(jù)表明，75%的PEG修飾是在具有剩余部分的N-末端進(jìn)行的，所述殘余部分明顯與若干可能的賴氨酸殘基中的一個連接。38胰蛋白酶消化PEG化的ProGP是用濃度為lmg/mL、50:1的胰蛋白酶(Promega)Dulbecco's修飾PBS(Pierce):10mMTris，pH7.5(Sigma)消化的，然后在40°MCN(B&J)，0.1%TFA(Pierce)中重構(gòu)。37。C過夜消化后，加入胰蛋白酶的第二份等分試樣，并于37。C再次過夜消化該溶液。消化是用5°/。1.ONHC1(Fisher)終止的，且，當(dāng)需要時，將消化物4。C貯存直到使用。以0.5mL/分鐘的速率將175pg注射到在35°MCN，0.1%TFA中平衡的TosoHaas3000PW柱上，洗脫50分鐘(圖7)。人工收集第0-25分鐘的級分。利用埃德曼化學(xué)對含有PEG化片段的級分進(jìn)行測序。結(jié)果表明，大約77%的PEG連接都發(fā)生在N-末端丙氨酸的ct-氨基上，其余23°/。的分布為K284為14°/。，K201為5%，K252為4%。飛行質(zhì)譜的基質(zhì)輔助的激光解吸離子化時間(MALDI-TOFMS)將RP-HPLC純化的、ProGP化的PEG，非PEG化的單體濃縮，把大約1jliL的濃縮物點在用3，5-二甲氧基-4-羥基-肉桂酸作為基質(zhì)的MALDI耙上。光鐠是通過使用PerseptiveBiosystemsVoyagerMALDI-TOF(PerseptiveBiosystems)，以線性模式監(jiān)測正離子而獲得的。匯集123次掃描并求平均值。質(zhì)量是使用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)計算的。MALDI-TOFMS證實了單-30KPEG化-ProGP-4(PEG-ProGP)單體(圖6)和非PEG化ProGP-4單體(數(shù)據(jù)沒有給出)各亞單位的正確質(zhì)量。較早的洗脫峰具有71,000kDa的分子量，與32，000kDa的PEG加39，000kDa的ProGP-4相對應(yīng)。較晚的洗脫峰校正了ProGP-4的分子量(39，000kDa)。實施例16BAF3/G-CSFR細(xì)胞增殖測定用編碼人G-CSF受體的基因轉(zhuǎn)染的小鼠BaF3細(xì)胞系(mBaF3/hG-CSFR)可用于檢測hG-CSF激動劑的活性。將mBaF3/hG-CSFR細(xì)胞以2.5X104個細(xì)胞/孔接種在含有連續(xù)稀釋的ProGP和PEG化ProGP的96孔微量滴定平板中。在T"小時，用[曱基-3H]-胸腺嘧啶核苷以0.5mCi/孔對細(xì)胞進(jìn)行18小時脈沖。在玻璃纖維濾墊上采集平板，并通過閃爍光譜測量摻入的放射性。該細(xì)胞系的測定培養(yǎng)基由以下成分組成補(bǔ)充了胎牛血清白蛋白(BSA)(BoehringerMannheim,Indianapolis,IN)的IMDM，500pg/ml人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma，St.Louis,MO)，100pg/ml由2.5mg磷月旨酰膽堿/mlBSA和50mM2-巰基乙醇組成的脂類替代物。與ProGP-4相比，PEG-ProGP的G-CSF受體激動劑活性提高了(表1)。PEG-ProGP的EC"值(.005nM)比ProGP-4的測定值(021nM)大約低4倍(p<0.05)。實施例17BAF3/Flt3細(xì)胞增殖測定嵌合Flt3/G-CSF受體分子是用人Flt3的胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域，一種人IL-3前導(dǎo)序列，和人G-CSF受體的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的。所得構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)染小鼠淋巴細(xì)胞系Baf/3。所述方案產(chǎn)生Baf/3的穩(wěn)定克隆，該克隆在應(yīng)答人FL時增殖，但在應(yīng)答所試驗的其它人細(xì)胞因子時不增殖。這種無性繁殖系可用于分析ProGP和聚乙二醇化ProGP的Flt3激動劑活性。將細(xì)胞以2.5X104個/孔接種在96孔微量滴定平板中，該平板含有在沒有血清的IMDM中連續(xù)稀釋的每種生長因子，人轉(zhuǎn)鐵蛋白(100jug/ml)，由2.5mg磷脂酰膽堿/ml胎牛血清白蛋白(500yg/ml)和2-巰基乙醇(50jiM)組成的脂類替代物。56小時后，用[甲基」H]-胸腺嘧啶核苷以0.5juCi/孔對細(xì)胞進(jìn)行14-18小時的脈沖，采集并通過閃爍光譜測量摻入的放射性。ProGP的PEG化形式可維持ProGP-4的生物活性(表1)。40表1.ProGP-4和30KPEGALDProGP-4(實施例1)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>實施例18CFU-GM集落發(fā)生測定造血祖細(xì)胞的擴(kuò)增是使用來源于人骨髓的CD34+細(xì)胞，在集落形成單位粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(CFU-GM)測定中證實的，其中集落發(fā)生祖細(xì)胞在半-固體培養(yǎng)基中應(yīng)答于生長因子而分裂并分化。新鮮骨髓(BM)抽出物是與St.LouisUniversityMedicalSchool合作獲得的。在用Ficoll-Hypaque進(jìn)行密度梯度離心之后，回收單核細(xì)胞部分。CD34+(干和祖)細(xì)胞隨后是4吏用Isolex50干細(xì)胞試劑盒(BaxterHealthcareCorporation,Deerfield，IU通過P曰性選擇而分離的。該過程產(chǎn)生一種富集細(xì)胞產(chǎn)物，其中>90%的細(xì)胞都表達(dá)CD34+細(xì)胞的表面抗原。將這些CD34+細(xì)胞接種在MethoCultH4230(StemCellTechnologies,Vancouver,BC)中的35mm組織培養(yǎng)平板(10，000個細(xì)胞/個培養(yǎng)皿)中，所述MethoCultH4230含有在Iscove's修飾Dulbecco's培養(yǎng)基(IMDM)中的0.9%甲基纖維素，30%FBS，1%BSA,ImM2-Si基乙醇和2mML-谷酰胺。37。C時，在含有5"/。C02的濕潤空氣中，用生長因子溫育所述培養(yǎng)物10-12天。在共同加入實驗中，各受體激動劑的濃度在指定濃度值下是等摩爾的。造血集落(>50個細(xì)胞)是使用反相顯微鏡計數(shù)的。PegProGP誘導(dǎo)的造血祖細(xì)胞向集落形成單位粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(CFU-GM)的分化和擴(kuò)增與ProGP-4或人flt3配體與hG-CSF的共同給藥所引起的應(yīng)答相等(圖8)。實施例19生長因子給藥的藥代動力學(xué)(PK)雌性C57BIV6(8-12周齡，CharlesRiver，Raleigh，NC)小鼠是在Pharmacia動物實驗室中飼養(yǎng)的。ProGP和聚乙二醇化ProGP是在PBS(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)中稀釋的，并以100jug/次注射的給藥劑量給予小鼠。小鼠是以單一皮下(SC)劑量注射的。ProGP的ELISA小鼠血漿中的ProGP和聚乙二醇化ProGP蛋白的濃度水平是使用夾層ELISA測定的。用在lOOmMNaHC03，pH8.2中稀釋到1pg/ml的、親和純化的山羊-抗-Flt3配體多克隆抗體，以150ml/孔包被96-孔微量滴定平板。在潮濕的腔室內(nèi)，室溫過夜溫育該平板1小時，37。C時，用含有3BSA和0.05%聚氧乙烯-脫水山梨糖醇單月桂酸酯(吐溫20)，pH7.4的磷酸鹽緩沖生理鹽水封閉該平板1小時。用含0.05%吐溫20的150mMNaCl(洗滌緩沖液)洗滌平板4次。血漿PK樣品是在pH7.4的測定緩沖液(PBS,0.1%BSA，0.01%吐溫20)中稀釋的，并在小鼠合并血漿的測定基質(zhì)中滴定為1:2?；|(zhì)和樣品的血漿濃度在百分比上相匹配。將平板在37。C的濕潤腔室中溫育2.5小時，然后用洗滌緩沖液洗4次。將與辣根過氧化物酶連接的親和純化的山羊-抗人G-CSF受體激動劑多克隆抗體在測定緩沖液中稀釋為1:10000(0.25-.05ng/mL)，然后向每個孔中加入150nl。將平板在37。C的濕潤腔室中溫育1.5小時。將孔倒空，用洗滌緩沖液再次洗滌每個孔4次。然后，向各孔中加入150mL的TMB過氧化物酶底物溶液。將平板在室溫溫育約10分鐘，在孩i量滴定平板讀數(shù)器(MolecularDevicesCorporation)上在650nm的試驗波長下讀數(shù)。未知PK樣品中，免疫-反應(yīng)性ProGP的濃度是根據(jù)ProGP-4或PEG-ProGP的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的，其中4吏用了由MolecularDevices提供的4個參數(shù)的曲線擬合程序。藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)分析表2中報告的PK參數(shù)是使用WinNonlin(3.G版本，Pharsight，ChapelHill,NC)通過非分段分析測定的。求血漿濃度數(shù)據(jù)(n=3)的平均值，單一的PK分析是在平均值基礎(chǔ)上進(jìn)行的。表現(xiàn)終末半衰期(twO是在非分段分析過程中，通過血漿濃度對時間的對數(shù)線性圖人工目測選擇的。ProGP-4和PEG-ProGP的藥代動力學(xué)比較在圖9和表2中給出。該數(shù)據(jù)顯示，與ProGP-4相比，皮下給予小鼠的單一的100jug劑量PEG-ProG具有延長了的血漿存留時間。第48小時的時候，血漿中PEG-ProGP的濃度大約比ProGP-4高70倍?？蓹z測水平的PEG-ProGP是在給藥96小時后觀察到的，而ProGP-4在第72小時的時候仍然檢測不到。PEG-ProGP和ProGP-4的PK值，如終末半衰期(t1/2)，清除率(C1)，達(dá)到最大濃度的時間(Tmax)和最大濃度(Cmax)沒有顯著性差異?？傊?，PEG化可延長蛋白在小鼠血液中循環(huán)的時間。表2.ProGP-4和PEGProGP-4(實施例1)在小鼠中的藥動學(xué)比較小鼠(n)給藥劑量(Hg/小鼠)T*maxG*nmxAUCa)CL/FVd/Ftl/2(%8小時ProGP3100828,0005290.1890.9443.4672PEGProGP-43100(8)24a19，5007200.1390.9774.874744PEGProGP-43100840,50010800.09260.6574.924181生長因子給藥的藥效學(xué)(PD)雌性C57BL/6(8-12周齡，CharlesRiver,Raleigh,NC)小鼠是在Pharmacia動物實驗室中祠養(yǎng)的。ProGP-4和PEG-ProGP是在PBS"ifeTechnologies,GrandIsland,NY)中稀釋的，并以100-500Hg/次注射的劑量給予小鼠。小鼠是如下皮下(SC)注射的在第0-6天或第0-9天，每天給予ProGP-4(0.lmg/次注射)；在第0，3和6天或第0,3，6和9天給予PEG-ProGP(0.3mg/次注射)；在第0天或第0和5天給予PEG-ProGP(0.5mg/次注射)。在第0-9天每天給予PBS賦形劑對照(0.lml/次注射)。43外周血和脾臟的處理外周血是通過心臟穿刺從co廣麻醉小鼠中采集到肝素包被的試管中的。脾臟是在釆集血液之后，立即從無痛處死動物中采集的?？偘准?xì)胞(WBC)數(shù)是使用細(xì)胞計數(shù)器(CoulterZM，MiamiLakes,FL)對全血進(jìn)行的。紅細(xì)胞是使用0.15M低滲氯化銨溶液(StemCellTechnology,Vancouver,BC)溶解的。離心(300xg，10分鐘)收集細(xì)胞，并用含2%FBS(IMDM-FBS，BioproductsforScience,Indianapolis,IN)的冷IMDM(LifeTechnologies，GrandIsland,NY)洗滌。采集脾臟，并在冷的IMDM-FBS中處理，均化成細(xì)胞混懸液，并通過70jum的尼龍薄膜過濾。紅細(xì)胞是使用低滲氯化銨溶液溶解的，脾細(xì)胞是使用冷的IMDM-FBS洗滌的，并通過70jum的篩網(wǎng)過濾。將脾細(xì)胞重懸浮在25ml含2%BSA的IMDM緩沖液中，計數(shù)以確定脾細(xì)胞/脾臟的總數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)的試劑熒光染料-或生物素-連接的單克隆抗體是從Pharmingen(SanDiego，CA)購買的。CD16/CD32(FcII/I11受體，F(xiàn)cBlock)，F(xiàn)ITC-連接的抗體CDllc/HL3和PE-連接的抗體II類MHC(I-Ab//AF6-120.l)是以1-5jug/ml使用的。不同的抗體組合使用同型匹配的對照組。每三天給藥的ProGP-4與每天給藥的PEG-ProGP相比，脾臟中的總白細(xì)胞(WBC)和樹突細(xì)胞(DC)應(yīng)答是類似的(圖10)。第IO天時，在外周血中的相對DC應(yīng)答方面，每三天給藥的PEG-ProGP比每天給藥的ProGP-4要強(qiáng)。ProGP-4和PEG-ProGP-4(實施例1)在脾臟中的DC動員動力學(xué)相似(圖11);而，在外周血中，與每天給藥的ProGP-4相比，每三天給藥的PEG-ProGP-4(實施例1)的DC動員動力學(xué)發(fā)生了改變。權(quán)利要求1.一種祖細(xì)胞生成素連接物，它具有至少一個與生物活性祖細(xì)胞生成素多肽的至少一個氨基酸殘基共價連接的水溶性聚合物分子。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的祖細(xì)胞生成素連接物，其中所述聚合物是聚(環(huán)氧乙烷)分子。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的祖細(xì)胞生成素連接物，其中所述聚(環(huán)氧乙烷)分子是聚(乙二醇)分子。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的祖細(xì)胞生成素連接物，其中所述聚(乙二醇)連接在具有游離氨基，羧基或巰基的氨基酸殘基上。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的祖細(xì)胞生成素連接物，其中所述聚(乙二醇)是通過活化的聚(乙二醇)連接的。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的祖細(xì)胞生成素連接物，其中所述活化的聚(乙二醇)選自對硝基苯基，琥珀酰亞胺基，羰基咪唑，氮雜內(nèi)酯，環(huán)狀亞胺硫酮，異氰酸酯，異硫氰酸酯，窿，伯胺，肼，酰肼，肼基甲酸酯，氨基甲酸酯，硫代肼基甲酸酯，硫醇，馬來酰亞胺，砜，和苯甲酰曱醛。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的祖細(xì)胞生成素連接物，其中所述活化的聚(乙二醇)選自琥珀酰亞胺基，羰基咪唑，醛，酰肼，肼基甲酸酯，氨基甲酸酯，和馬來酰亞胺。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的祖細(xì)胞生成素連接物，其中所述聚(乙二醇)的分子量約為0,5kDa-100kDa。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的祖細(xì)胞生成素連接物，其中所述聚(乙二醇)的分子量約為3.4kDa-40kDa。10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的祖細(xì)胞生成素連接物，其中所述聚(乙二醇)是支化聚合物。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的祖細(xì)胞生成素連接物，其中支化聚(乙二醇)聚合物的分子量約為10kDa-40kDa。12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的祖細(xì)胞生成素連接物，其中所述聚(乙二醇)是雙官能聚合物。13.才艮據(jù)權(quán)利要求l，2，3，4,5，6，7，8，9，10，11，或12所述的祖細(xì)胞生成素連接物，其中所述祖細(xì)胞生成素多肽的通式為Ri一L「R2，R廣L!-R!，R廣R2，或R廣R!其中R!是含有下式的經(jīng)修飾的flt-3配體氨基酸序列的多肽:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中N-末端與C-末端直接連接，或通過能夠連接N-末端和C-末端并分別在下列氨基酸位置具有新的C-末端和N-末端的連接體(L2)連接<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中Ib是選自集落刺激因子，細(xì)胞因子，淋巴因子，白介素和造血生長因子的因子；其中L是能夠連接Ri和R2的連接體；且可任選直接在所述祖細(xì)胞生成素蛋白前面加上(甲硫氨酸—1)，(丙氨酸—J或(甲硫氨酸—2，丙氨酸—')。14.一種含有權(quán)利要求1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，或12所述的祖細(xì)胞生成素蛋白和至少一種藥學(xué)上可接受的載體的組合物。15.—種治療患有造血疾病的患者的方法，包括給予所述患者治療有效量的權(quán)利要求l，2，3，4，5，6，7，8,9，10，11，或12所述的祖細(xì)胞生成素連接物。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述造血疾病是嗜中性白細(xì)胞減少癥，白細(xì)胞減少癥，血小板減少癥，或貧血癥。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述造血疾病是由化療，放療，或骨髓抑制藥物導(dǎo)致的。18.—種治療正在從骨髓移植，燒傷，創(chuàng)傷，寄生蟲，細(xì)菌或病毒感染恢復(fù)和/或經(jīng)受骨髓移植，燒傷，創(chuàng)傷，寄生蟲，細(xì)菌或病毒感染的患者的方法，包括給予所述患者治療有效量的權(quán)利要求1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11,或12所述的祖細(xì)胞生成素連接物。19.一種動員造血祖細(xì)胞和干細(xì)胞進(jìn)入外周血中的方法，包括給予所述患者治療有效量的權(quán)利要求1，2，3，4，5，6，7，8，9，10,11，或12所述的祖細(xì)胞生成素連接物。20.—種產(chǎn)生樹突細(xì)胞的方法，包括下列步驟a)從其它細(xì)胞中分離造血祖細(xì)胞或CD34+細(xì)胞；并b)在含有權(quán)利要求l，2，3，4,5，6，7，8，9，10，11，或12所述的造血蛋白的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述造血祖細(xì)胞或CD34+細(xì)胞。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，進(jìn)一步包括下列步驟c)用抗原對所述培養(yǎng)的造血祖細(xì)胞或CD34+細(xì)胞進(jìn)行脈沖。22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述生長培養(yǎng)基進(jìn)一步含有選自GM-CSF，IL-4，TNF-a，干細(xì)胞因子(SCF)，flt-3配體，IL-3，IL-3變體，IL-3變體融合蛋白，和多功能受體激動劑的一種或多種因子。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述生長培養(yǎng)基進(jìn)一步含有選自GM-CSF，IL-4，TNF-cc，干細(xì)胞因子(SCF)，fit-3配體，IL-3，IL-3變體，IL-3變體融合蛋白，和多功能受體激動劑的一種或多種因子。24.—種治療患有腫瘤，感染或自身免疫疾病的人的方法，包括給予該人權(quán)利要求l，2,3，4，5，6，7，8，9，10，11,或12所述的造血蛋白的步驟。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，進(jìn)一步包括給予選自GM-CSF，IL-4，TNF-ct，干細(xì)胞因子(SCF)，fit-3配體，IL-3，IL-3變體，IL-3變體融合蛋白，和多功能受體激動劑的一種或多種因子。26.—種使聚(乙二醇)與親核物質(zhì)連接的方法，其中所述連接是在無機(jī)溶劑存在的條件下進(jìn)行的。全文摘要本發(fā)明提供一種通過使水溶性聚合物與蛋白結(jié)合而制備的化學(xué)修飾的祖細(xì)胞生成素(ProGP)。本發(fā)明的化學(xué)修飾蛋白具有比未修飾ProGP更持久的增加嗜中性白細(xì)胞的活性，能夠減少劑量并確定時機(jī)。文檔編號A61P7/08GK101426511SQ02816517公開日2009年5月6日申請日期2002年6月14日優(yōu)先權(quán)日2001年6月22日發(fā)明者N·R·西格爾,R·F·芬恩,R·L·希爾斯申請人:法馬西亞公司