專利名稱：腫瘤學(xué)藥物革新的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定癌細(xì)胞的細(xì)胞表面分子的方法，還涉及鑒定癌癥特異性啟動子的方法，單獨(dú)或聯(lián)合使用所述啟動子可以傳遞和表達(dá)治療基因以治療癌癥。
背景技術(shù)：
約一半的癌癥患者在確診時(shí)癌癥已擴(kuò)散?，F(xiàn)有的癌癥療法僅能治愈這些患者中的5-7％。所以，非常需要更有效的藥物，所述藥物能單獨(dú)或與現(xiàn)有療法聯(lián)合進(jìn)行全身性給藥。因此，利用基因治療傳遞有效且特異性強(qiáng)的治療癌細(xì)胞的方法是一種很有前途的策略。然而，迄今為止所用策略的成功率有限，需要進(jìn)一步開發(fā)適當(dāng)?shù)膫鬟f系統(tǒng)。
傳遞載體對基因治療所用傳遞載體的選擇是主要問題。已檢測多種載體系統(tǒng)對基因轉(zhuǎn)移的適應(yīng)性，包括病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺-伴隨病毒、慢病毒，以及非病毒載體，如與脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)或聚陽離子混合。然而，所有這些載體都具有特別的優(yōu)點(diǎn)和局限性。逆轉(zhuǎn)錄病毒需要有絲分裂以進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，但當(dāng)其整合至基因組中時(shí)能介導(dǎo)長期表達(dá)。腺病毒能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂和非-分裂細(xì)胞，但當(dāng)其保持為游離狀態(tài)時(shí)，僅能進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，腺病毒的免疫原性高，逆轉(zhuǎn)錄病毒能被人補(bǔ)體系統(tǒng)快速滅活。慢病毒不能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，但由于它是免疫缺損病毒的成員，因此涉及特殊的安全問題。盡管病毒載體的制備較為困難和昂貴，所插入治療基因的大小有限，而且還有很多安全性問題需要考慮，但迄今為止，所有方法中有75％以上使用了這些載體。因此，腺病毒載體所用的大多數(shù)方法是通過局部傳遞(注射至腫瘤中)施用治療基因，以增加病毒的局部滴度并避免免疫原性反應(yīng)，但甚至最高滴度的系統(tǒng)仍不足以治愈局部腫瘤。病毒載體系統(tǒng)的主要缺點(diǎn)是其攝取是非特異性的，不能靶向癌細(xì)胞。然而，腺病毒因其傳遞效率而仍是優(yōu)選的載體，因此，正在開發(fā)降低免疫應(yīng)答和將病毒靶向特定細(xì)胞的方法。另一方面，脂質(zhì)體和聚陽離子復(fù)合物的免疫原性較低，且易于制備，無需考慮病毒載體的安全性，但是與病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)相比，其轉(zhuǎn)染效率要低得多，而且還缺乏細(xì)胞特異性。然而，聚陽離子能密集和中和所傳遞DNA的電荷，PEI復(fù)合物在血液系統(tǒng)中相對穩(wěn)定(Goula等，1998；評述于Mountain，2000)。
為了確保治療的高特異性并限制治療所帶來的不良副作用，重要的是要設(shè)計(jì)一種能將所需治療基因有效、高特異性地靶向和傳遞至癌細(xì)胞的載體。然而，如下文所述，這包括裝配多個組分載體。
受體靶向可以使用能通過癌細(xì)胞表面的配體或抗體結(jié)合而內(nèi)化的功能性受體或其它細(xì)胞表面分子使基因傳遞靶向細(xì)胞。利用與受體的配體偶聯(lián)的DNA而進(jìn)行的受體靶向基因傳遞提供了一種有前途的方法。靶向基因傳遞的主要優(yōu)點(diǎn)是進(jìn)行受體靶向無需病毒，因此消除了現(xiàn)行基因治療策略中存在的很多障礙。據(jù)報(bào)道，對于多種不同的表面受體，已成功使用受體靶向?qū)⒒騻鬟f至癌細(xì)胞，所述受體包括表皮生長因子(Cristano and Roth，1996，F(xiàn)rederiksen等，2000)，葉酸(Gottschalk等，1994)，運(yùn)鐵蛋白(Wagner等，1990)的受體。特異性受體的高表達(dá)不總是受體介導(dǎo)的有效攝取的先決條件，這一點(diǎn)已在表皮生長因子受體中得到闡明(Frederiksen等，2000)。然而，癌細(xì)胞表達(dá)的很多受體在某種程度上也能由正常細(xì)胞表達(dá)，這意味著正常細(xì)胞經(jīng)常也能被靶向。這一問題強(qiáng)調(diào)了對表達(dá)特異性或治療基因特性的更加嚴(yán)格的要求。
分子偶聯(lián)物為了進(jìn)行靶向基因治療，必須使被內(nèi)化的配體和表達(dá)治療基因的DNA物理結(jié)合以進(jìn)行受體介導(dǎo)的攝取。有幾種方法可用于通過使陽離子聚合物，如聚-L-賴氨酸(Frederiksen等，2000)或聚乙烯亞胺(PEI)(Kircheis等，1997)(polyplexes)與配體和DNA結(jié)合來制備靶向DNA分子偶聯(lián)物的非病毒合成載體。已報(bào)道了多種分子偶聯(lián)物的成功基因靶向。配體與聚陽離子共價(jià)相連，或者生物素化的配體和聚賴氨酸經(jīng)由鏈霉親和素復(fù)合以與DNA形成縮合偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物可被配體的受體內(nèi)化。這些系統(tǒng)優(yōu)于病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移的一個優(yōu)點(diǎn)是對DNA的大小沒有限制。另外，PEI復(fù)合物似乎能穿過肺中的毛細(xì)血管屏障，使得該化合物成為一種能用于分子偶聯(lián)物的試劑。
分子偶聯(lián)物的內(nèi)體釋放
DNA/配體偶聯(lián)物被受體胞吞之后，正常途徑會導(dǎo)致DNA的降解和損失。因此，已證實(shí)分子偶聯(lián)物中必須包括內(nèi)體裂解劑。已證實(shí)當(dāng)將腺病毒、復(fù)制缺損的腺病毒和病毒衣殼包括在分子偶聯(lián)物中時(shí)，它們對于內(nèi)體裂解都很有效。然而，使用腺病毒作為載體所帶來的非特異性攝取、安全性和免疫原性反應(yīng)問題也都會在此系統(tǒng)中出現(xiàn)。已檢測了在分子偶聯(lián)物中包括其它融合肽后的胞質(zhì)釋放，所述融合肽含有例如流感病毒、毒素或合成肽的氨基酸序列。這些偶聯(lián)物具有免疫原性較弱、花費(fèi)較低的優(yōu)點(diǎn)，但已證實(shí)它們的內(nèi)體裂解效力比腺病毒差。然而，如果使用聚陽離子PEI形成分子偶聯(lián)物，就不必包含內(nèi)體裂解劑，因?yàn)镻EI具有內(nèi)在的內(nèi)體-緩沖能力，能導(dǎo)致內(nèi)體膨脹和破裂。
癌癥特異性啟動子如果能使用可控制表達(dá)的腫瘤特異性啟動子，即可使治療基因靶向癌細(xì)胞的特異性增加(評述于Nettelbeck等，2000)。已使用了某些基因(例如端粒酶)的啟動子，所述基因的表達(dá)特異于惡性表型，但未顯示出組織特異性。另外還發(fā)現(xiàn)能調(diào)節(jié)一般不在成人中表達(dá)的癌胚抗原，如癌胚抗原(CEA)的啟動子在腫瘤細(xì)胞中也有活性。然而，已證實(shí)這些啟動子的活性(與強(qiáng)的組成型病毒啟動子相比)經(jīng)常不能介導(dǎo)治療基因的充分表達(dá)，因此，需使用腫瘤特異性基因來活化另一個控制治療基因的較強(qiáng)啟動子。癌胚啟動子的另一個缺點(diǎn)是這些啟動子僅在腫瘤類型亞群中具有活性，具體取決于腫瘤的組織來源。或者，利用在癌細(xì)胞中過量表達(dá)的很多癌基因是轉(zhuǎn)錄因子這一事實(shí)來設(shè)計(jì)合成的啟動子，所述啟動子能介導(dǎo)由其各自的DNA識別序列起的高轉(zhuǎn)錄活性。
治療基因治療基因的產(chǎn)物必須能有效誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。癌癥治療所用的基因治療策略已使用了很多種不同的方法。這些方法包括免疫基因治療，如用細(xì)胞因子刺激免疫系統(tǒng)(增強(qiáng)針對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答)，選擇性前體藥物活化，自殺基因，恢復(fù)腫瘤抑制基因和抑制活化的癌基因(評述于Frederiksen等，1999；Gunji等，2000)。實(shí)際上，目前針對癌癥的臨床試驗(yàn)中使用的大多數(shù)治療方法都涉及免疫療法。然而，由于多種癌癥的分子表型與癌基因和腫瘤抑制基因的異常表達(dá)或突變有關(guān)，這些基因顯然是靶向的候選目標(biāo)。已嘗試使用能降低癌基因的表達(dá)或活性的治療基因產(chǎn)物，如反義RNA或中和抗體片段，經(jīng)證實(shí)它們能抑制增殖。然而，滅活癌基因不必殺死細(xì)胞，因此，可能不適于短期治療。目前較有前途的策略之一是重新導(dǎo)入腫瘤抑制基因，因?yàn)榇蠖鄶?shù)癌細(xì)胞表現(xiàn)出一種或多種這些基因的功能喪失。其中一個特別令人感興趣的基因是編碼p53的腫瘤抑制基因TP53，該基因是轉(zhuǎn)錄因子，能激活已知參與細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的基因。已證實(shí)在體外和體內(nèi)系統(tǒng)中重新導(dǎo)入野生型p53能顯著減緩腫瘤細(xì)胞生長或誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡(Roth等，1996；Nielsen and Maneval，1998)。
然而，使細(xì)胞變得對其它無害藥物敏感的基因產(chǎn)物也被廣泛用于基因治療試驗(yàn)。特別是，已使用了單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)與核苷類似物藥物9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤的組合物。然而，通過酶將藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸镜暮塑疹愃莆飪H會殺死正在分裂的細(xì)胞。然而，所謂的“旁觀者”效應(yīng)可將有毒產(chǎn)物傳遞給周圍的細(xì)胞，使得該方法可潛在用于靶向效率低的系統(tǒng)。
發(fā)明簡述因此，本發(fā)明的第一個目的是提供鑒定多種細(xì)胞表面分子的方法，所述分子在正常細(xì)胞和惡性細(xì)胞中的表達(dá)水平有所不同，所述方法包括以下步驟i)提供至少3個選自下列的惡性細(xì)胞系CPH54A，CPH54B，GLC2，GLC3，GLC14，GLC16，GLC19，GLC26，GLC28，DMS53，DMS79，DMS92，DMS114，DMS153，DMS273，DMS406，DMS456，NCI H69，NCI N417，MAR H24，MAR86MI，SHP-77，NCI-H2171，NCI-H2195，NCI-H2196，NCI-H2198，NCI-H2227，NCI-H2286，NCI-H2330，NCI-H735，NCI-H1339，NCI-H1963，NCI-H2107，NCI-H2108，NCI-H1304，NCI-H1341，NCI-H1417，NCI-H1436，NCI-H1522，NCI-H1618，NCI-H1672，NCI-H1694，NCI-H1836，NCI-H1870，NCI-H1876，NCI-H1882，NCI-H1926，NCI-H1930，NCI-H1994，NCI-H2029，NCI-H2059，NCI-H2066，NCI-H2081，NCI-H2141，NCI-H211，NCI-H220，NCI-H250，NCI-H524，NCI-H592，NCI-H711，NCI-H719，NCI-H740，NCI-H748，NCI-H774，NCI-H841，NCI-H847，NCI-H865，NCI-H1048，NCI-H1059，NCI-H1092，NCI-H1105，NCI-H1184，NCI-H1238，NCI-H1284，NCI-H1688，NCI-H187，NCI-H378，NCI-H526，NCI-H660，NCI-H889，NCI-H60，NCI-H196，NCI-H446，NCI-H209，NCI-H146，NCI-H82，NCI-H460，NCI-H345，NCI-H510A，NCI-128，NCI-446，SW1271；ii)提供至少3份得自正常組織的總RNA樣品，所述組織選自肝臟、心臟、腎臟、肺、腎上腺、結(jié)腸、胰腺、小腸、脾臟、骨骼肌、氣管、前列腺、胎盤、唾液腺、睪丸、白細(xì)胞、腦、脂肪組織、膀胱、乳腺、子宮頸、食管、喉、卵巢、直腸、皮膚、脊髓、胃、胸腺、甲狀腺和子宮；iii)比較根據(jù)步驟i)的細(xì)胞系和根據(jù)步驟ii)的組織樣品的mRNA表達(dá)；iv)鑒定核酸序列，其中a)根據(jù)i)的一個或多個細(xì)胞系中表達(dá)的mRNA量與根據(jù)ii)的一個或多個組織中表達(dá)的mRNA量之間有差別；和/或b)根據(jù)i)的至少2個細(xì)胞系中表達(dá)的mRNA量基本上無差別；和/或c)根據(jù)ii)的至少2個組織樣品中表達(dá)的mRNA量基本上無差別；和v)在根據(jù)iv)的核酸序列中選擇編碼潛在細(xì)胞表面分子的核酸序列。
本發(fā)明的第二個目的是提供鑒定第一核酸序列的方法，所述核酸序列能介導(dǎo)與之可操作相連的第二核酸序列的表達(dá)，其中正常細(xì)胞與惡性細(xì)胞中的所述表達(dá)水平有所不同，所述方法包括以下步驟i)提供至少3個選自下列的惡性細(xì)胞系CPH54A，CPH54B，GLC2，GLC3，GLC14，GLC16，GLC19，GLC26，GLC28，DMS53，DMS79，DMS92，DMS114，DMS153，DMS273，DMS406，DMS456，NCI H69，NCI N417，MAR H24，MAR86MI，SHP-77，NCI-H2171，NCI-H2195，NCI-H2196，NCI-H2198，NCI-H2227，NCI-H2286，NCI-H2330，NCI-H735，NCI-H1339，NCI-H1963，NCI-H2107，NCI-H2108，NCI-H1304，NCI-H1341，NCI-H1417，NCI-H1436，NCI-H1522，NCI-H1618，NCI-H1672，NCI-H1694，NCI-H1836，NCI-H1870，NCI-H1876，NCI-H1882，NCI-H1926，NCI-H1930，NCI-H1994，NCI-H2029，NCI-H2059，NCI-H2066，NCI-H2081，NCI-H2141，NCI-H211，NCI-H220，NCI-H250，NCI-H524，NCI-H592，NCI-H711，NCI-H719，NCI-H740，NCI-H748，NCI-H774，NCI-H841，NCI-H847，NCI-H865，NCI-H1048，NCI-H1059，NCI-H1092，NCI-H1105，NCI-H1184，NCI-H1238，NCI-H1284，NCI-H1688，NCI-H187，NCI-H378，NCI-H526，NCI-H660，NCI-H889，NCI-H60，NCI-H196，NCI-H446，NCI-H209，NCI-H146，NCI-H82，NCI-H460，NCI-H345，NCI-H510A，NCI-128，NCI-446，SW1271；
ii)提供至少3份得自正常組織樣品的RNA樣品，所述組織選自肝臟、心臟、腎臟、肺、腎上腺、結(jié)腸、胰腺、小腸、脾臟、骨骼肌、氣管、前列腺、胎盤、唾液腺、睪丸、白細(xì)胞、腦、脂肪組織、膀胱、乳腺、子宮頸、食管、喉、卵巢、直腸、皮膚、脊髓、胃、胸腺、甲狀腺和子宮；iii)比較根據(jù)i)的細(xì)胞系和根據(jù)ii)的組織樣品的mRNA表達(dá)；iv)鑒定第二核酸序列，其中a)根據(jù)i)的一個或多個細(xì)胞系中表達(dá)的mRNA量與根據(jù)ii)的一個或多個組織中表達(dá)的mRNA量之間有差別；和/或b)根據(jù)i)的至少2個細(xì)胞系中表達(dá)的mRNA量基本上無差別；和/或c)根據(jù)ii)的至少2個組織樣品中表達(dá)的mRNA量基本上無差別；和v)鑒定與步驟iv)中鑒定的第二核苷酸序列可操作相連的第一核酸序列。
本發(fā)明的第三個目的是提供藥物有效量的、本發(fā)明中鑒定的細(xì)胞表面分子用于制備疫苗的用途。另外，本發(fā)明提供了藥物有效量的、編碼根據(jù)本發(fā)明方法鑒定的細(xì)胞表面分子的核酸序列用于制備疫苗的用途。本發(fā)明還提供了藥物有效量的細(xì)胞表面分子和/或編碼所述細(xì)胞表面分子的核酸序列用于制備疫苗的用途，其中所述細(xì)胞表面分子優(yōu)選含有下述物質(zhì)或基本上由下述物質(zhì)組成，或例如是GRIA2，如LPR8，例如是CHRNA5，如TMEFF，例如是NPTXR，如運(yùn)鐵蛋白受體；如II型膜蛋白克隆例如是HP10481；如II型膜蛋白克隆如HP10390；例如是PG40；如TRC8；例如是TR2-11；如OA3抗原表面決定簇；例如是整聯(lián)蛋白α6，例如GPIIb；如玻連蛋白受體α亞單位；例如是整聯(lián)蛋白α-7；如整聯(lián)蛋白αE前體；例如是整聯(lián)蛋白α6B；如整聯(lián)蛋白α5亞單位；例如是整聯(lián)蛋白β-5亞單位；如整聯(lián)蛋白α-3鏈；例如是RYK；如淀粉樣前體蛋白-結(jié)合蛋白1；例如是推定的跨膜GTP酶；如膜輔因子蛋白；例如GLVR1；例如是Mr110,000抗原，例如是多配體聚糖-1；如推定的有7個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)；例如是LCA-同系物/LAR蛋白；如M6抗原；例如是Me491/CD63抗原；如多跨越膜蛋白；例如是DDR；如自泌活動因子受體；例如是胰島素受體前體；如IGF1R，例如是胰島素-樣生長因子II受體；如SAS；例如是TAPA-1；如MICB；例如是MHC II類HLA-DR7-相關(guān)糖蛋白β-鏈；如HLA-DP；例如是骨小蛋白聚糖I雙糖鏈蛋白聚糖；如CAR；例如是MEA11；如γ-干擾素受體α鏈；例如是多聚免疫球蛋白受體；如metabotropic谷氨酸受體4型；例如是metabotropic谷氨酸受體8；如CLPTM1，例如是MAGE-4b；如MAGE5a；例如是MAGE-3；例如MAGE-1；例如是MAGE6；如MAGE-9；例如是MAGE11；如CD24；例如是CD59；如CD44；例如是低密度脂蛋白受體；如極低密度脂蛋白受體；例如是N-CAM；如核纖層蛋白B受體同系物TM7SF2；例如是推定的T1/ST2受體結(jié)合蛋白前體；如NTR2受體；例如是RAGE-4；如HLA-G1；例如是MOAT-C；如α2δ鈣通道亞單位同種型I；例如是LFA-3；如L1-CAM；例如是AVPR2；如C1 p115C1；例如是TE2；如RbP；例如是HCF1；如IRAK；例如是CD151；如表面抗原；例如是MAG；如GPR19；例如是pcta-1；如PRAME；例如是加壓素活化的鈣質(zhì)轉(zhuǎn)移受體-樣蛋白；如5-羥色胺受體5-HT4B；例如是5-羥色胺1D受體(5-HT1D～)；如CD9；例如是LDL受體成員LR3；如DR6；例如是腫瘤壞死因子受體；如HG38；例如是尿激酶型纖溶酶受體；如FGF受體；例如是神經(jīng)生長因子受體；如胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；例如是CB1大麻素(cannabinoid)受體(CNR1)；如PSG；例如是PSG13’；如CPE-受體；例如是CRH2R；如OCI5；例如是TRAIL受體2；如HNMP-1；例如是腎α-2-腎上腺素能受體；如紅細(xì)胞生成素受體；例如是硫酸軟骨素蛋白聚糖多能聚糖V1；例如是mGluR1β；如CD97；例如是L6；如NY-ESO-1；例如是T-細(xì)胞受體αδ；如ror1；例如是ror2；如SSTR2；例如是VESPR；如IgG Fc受體；例如是谷氨酸受體亞單位GluRC；如HEK2；例如是PVR；如CEA；例如是CC-趨化因子-結(jié)合受體JAB61；如HER2；例如是HER3；如類似于表皮生長因子受體-相關(guān)蛋白的假擬蛋白FLJ22357；例如是推定的B-型內(nèi)皮肽受體-樣蛋白；如GLVR2；例如是P2X4嘌呤受體(purinoreceptor)；如FPRL1；例如是心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide)清除受體；例如是胃泌素/CCK-B受體；如神經(jīng)調(diào)節(jié)肽B受體；例如是GFRA3；如GRPR；例如是CDH1；如CDH2；例如是TGFBR1；如TGFBR2；例如是TGFBR3；如表皮生長因子受體的前體。
本發(fā)明的第四個目的是提供根據(jù)本發(fā)明所述方法鑒定的細(xì)胞表面分子作為藥物靶的用途，其中所述藥物靶能結(jié)合結(jié)合配對物，并將所述結(jié)合配對物內(nèi)化至表達(dá)所述細(xì)胞表面分子的細(xì)胞中。另外，本發(fā)明提供了細(xì)胞表面分子作為藥物靶的用途，其中所述藥物靶能結(jié)合結(jié)合配對物，并將所述結(jié)合配對物內(nèi)化至表達(dá)所述細(xì)胞表面分子的細(xì)胞中，所述細(xì)胞表面分子優(yōu)選含有下述物質(zhì)或基本上由下述物質(zhì)組成，或例如是GRIA2，如LPR8，例如是CHNA5，如TMEFF，例如是NPTXR，如運(yùn)鐵蛋白受體；如II型膜蛋白克隆例如是HP10481；如II型膜蛋白克隆如HP 10390；例如是PG40；如TRC8；例如是TR2-11；如OA3抗原表面決定簇；例如是整聯(lián)蛋白α6，例如GPIIb；如玻連蛋白受體α亞單位；例如是整聯(lián)蛋白α-7；如整聯(lián)蛋白αE前體；例如是整聯(lián)蛋白α6B；如整聯(lián)蛋白α5亞單位；例如是整聯(lián)蛋白β-5亞單位；如整聯(lián)蛋白α-3鏈；例如是RYK；如淀粉樣前體蛋白-結(jié)合蛋白1；例如是推定的跨膜GTP酶；如膜輔因子蛋白；例如GLVR1；例如是Mr110,000抗原，例如是多配體聚糖-1；如推定的有7個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)；例如是LCA-同系物/LAR蛋白；如M6抗原；例如是Me491/CD63抗原；如多跨越膜蛋白；例如是DDR；如自泌活動因子受體；例如是胰島素受體前體；如IGF1R，例如是胰島素-樣生長因子II受體；如SAS；例如是TAPA-1；如MICB；例如是MHC II類HLA-DR7-相關(guān)糖蛋白β-鏈；如HLA-DP；例如是骨小蛋白聚糖I雙糖鏈蛋白聚糖；如CAR；例如是MEA11；如γ-干擾素受體α鏈；例如是多聚免疫球蛋白受體；如metabotropic谷氨酸受體4型；例如是metabotropic谷氨酸受體8；如CLPTM1，例如是MAGE-4b；如MAGE5a；例如是MAGE-3；例如MAGE-1；例如是MAGE6；如MAGE-9；例如是MAGE11；如CD24；例如是CD59；如CD44；例如是低密度脂蛋白受體；如極低密度脂蛋白受體；例如是N-CAM；如核纖層蛋白B受體同系物TM7SF2；例如是推定的T1/ST2受體結(jié)合蛋白前體；如NTR2受體；例如是RAGE-4；如HLA-G1；例如是MOAT-C；如α2δ鈣通道亞單位同種型I；例如是LFA-3；如L1-CAM；例如是AVPR2；如C1 p115 C1；例如是TE2；如RbP；例如是HCF1；如IRAK；例如是CD151；如表面抗原；例如是MAG；如GPR19；例如是pcta-1；如PRAME；例如是加壓素活化的鈣質(zhì)轉(zhuǎn)移受體-樣蛋白；如5-羥色胺受體5-HT4B；例如是5-羥色胺1D受體(5-HT1D～)；如CD9；例如是LDL受體成員LR3；如DR6；例如是腫瘤壞死因子受體；如HG38；例如是尿激酶型纖溶酶受體；如FGF受體；例如是神經(jīng)生長因子受體；如胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；例如是CB1大麻素受體(CNR1)；如PSG；例如是PSG13’；如CPE-受體；例如是CRH2R；如OCI5；例如是TRAIL受體2；如HNMP-1；例如是腎α-2-腎上腺素能受體；如紅細(xì)胞生成素受體；例如是硫酸軟骨素蛋白聚糖多能聚糖V1；例如是mGluR1β；如CD97；例如是L6；如NY-ESO-1；例如是T-細(xì)胞受體αδ；如ror1；例如是ror2；如SSTR2；例如是VESPR；如IgG Fc受體；例如是谷氨酸受體亞單位GluRC；如HEK2；例如是PVR；如CEA；例如是CC-趨化因子-結(jié)合受體JAB61；如HER2；例如是HER3；如類似于表皮生長因子受體-相關(guān)蛋白的假擬蛋白FLJ22357；例如是推定的B-型內(nèi)皮肽受體-樣蛋白；如GLVR2；例如是P2X4嘌呤受體；如FPRL1；例如是心房利鈉肽清除受體；例如是胃泌素/CCK-B受體；如神經(jīng)調(diào)節(jié)肽B受體；例如是GFRA3；如GRPR；例如是CDH1；如CDH2；例如是TGFBR1；如TGFBR2；例如是TGFBR3；如表皮生長因子受體的前體。
本發(fā)明的第五個目的是提供鑒定和/或制備特異性的結(jié)合配對物的方法，所述方法包括以下步驟i)提供通過本發(fā)明所述方法鑒定的細(xì)胞表面分子；ii)鑒定和/或制備能與所述細(xì)胞表面分子結(jié)合的結(jié)合配對物。
本發(fā)明的另一個目的是提供鑒定和/或制備特異性的結(jié)合配對物的方法，所述方法包括以下步驟i)提供細(xì)胞表面分子，所述分子優(yōu)選含有下述物質(zhì)或基本上由下述物質(zhì)組成，或例如是運(yùn)鐵蛋白受體；如II型膜蛋白克隆例如是HP10481；如II型膜蛋白克隆如HP10390；例如是PG40；如TRC8；例如是TR2-11；如OA3抗原表面決定簇；例如是整聯(lián)蛋白α6，例如GPIIb；如玻連蛋白受體α亞單位；例如是整聯(lián)蛋白α-7；如整聯(lián)蛋白αE前體；例如是整聯(lián)蛋白α6B；如整聯(lián)蛋白α5亞單位；例如是整聯(lián)蛋白β-5亞單位；如整聯(lián)蛋白α-3鏈；例如是RYK；如淀粉樣前體蛋白-結(jié)合蛋白1；例如是推定的跨膜GTP酶；如膜輔因子蛋白；例如GLVR1；例如是Mr110,000抗原，例如是多配體聚糖-1；如推定的有7個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)；例如是LCA-同系物/LAR蛋白；如M6抗原；例如是Me491/CD63抗原；如多跨越膜蛋白；例如是DDR；如自泌活動因子受體；例如是胰島素受體前體；如IGF1R，例如是胰島素-樣生長因子II受體；如SAS；例如是TAPA-1；如MICB；例如是MHC II類HLA-DR7-相關(guān)糖蛋白β-鏈；如HLA-DP；例如是骨小蛋白聚糖I雙糖鏈蛋白聚糖；如CAR；例如是MEA11；如γ-干擾素受體α鏈；例如是多聚免疫球蛋白受體；如metabotropic谷氨酸受體4型；例如是metabotropic谷氨酸受體8；如CLPTM1，例如是MAGE-4b；如MAGE5a；例如是MAGE-3；例如MAGE-1；例如是MAGE6；如MAGE-9；例如是MAGE11；如CD24；例如是CD59；如CD44；例如是低密度脂蛋白受體；如極低密度脂蛋白受體；例如是N-CAM；如核纖層蛋白B受體同系物TM7SF2；例如是推定的T1/ST2受體結(jié)合蛋白前體；如NTR2受體；例如是RAGE-4；如HLA-G1；例如是MOAT-C；如α2δ鈣通道亞單位同種型I；例如是LFA-3；如L1-CAM；例如是AVPR2；如C1 p115 C1；例如是TE2；如RbP；例如是HCF1；如IRAK；例如是CD151；如表面抗原；例如是MAG；如GPR19；例如是pcta-1；如PRAME；例如是加壓素活化的鈣質(zhì)轉(zhuǎn)移受體-樣蛋白；如5-羥色胺受體5-HT4B；例如是5-羥色胺1D受體(5-HT1D～)；如CD9；例如是LDL受體成員LR3；如DR6；例如是腫瘤壞死因子受體；如HG38；例如是尿激酶型纖溶酶受體；如FGF受體；例如是神經(jīng)生長因子受體；如胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；例如是CB1大麻素受體(CNR1)；如PSG；例如是PSG13’；如CPE-受體；例如是CRH2R；如OCI5；例如是TRAIL受體2；如HNMP-1；例如是腎α-2-腎上腺素能受體；如紅細(xì)胞生成素受體；例如是硫酸軟骨素蛋白聚糖多能聚糖V1；例如是mGluR1β；如CD97；例如是L6；如NY-ESO-1；例如是T-細(xì)胞受體αδ；如ror1；例如是ror2；如SSTR2；例如是VESPR；如IgG Fc受體；例如是谷氨酸受體亞單位GluRC；如HEK2；例如是PVR；如CEA；例如是CC-趨化因子-結(jié)合受體JAB61；如HER2；例如是HER3；如類似于表皮生長因子受體-相關(guān)蛋白的假擬蛋白FLJ22357；例如是推定的B-型內(nèi)皮肽受體-樣蛋白；如GLVR2；例如是P2X4嘌呤受體；如FPRL1；例如是心房利鈉肽清除受體；例如是胃泌素/CCK-B受體；如神經(jīng)調(diào)節(jié)肽B受體；例如是GFRA3；如GRPR；例如是CDH1；如CDH2；例如是TGFBR1；如TGFBR2；例如是TGFBR3；如表皮生長因子受體的前體；ii)鑒定和/或制備能與所述細(xì)胞表面分子結(jié)合的結(jié)合配對物。
本發(fā)明的另一個目的是提供通過本發(fā)明所提供的方法鑒定出的、分離和/或純化的特異性結(jié)合配對物，該配對物能與細(xì)胞表面分子結(jié)合，所述細(xì)胞表面分子在惡性細(xì)胞和正常細(xì)胞中的表達(dá)水平有所不同。本發(fā)明還提供了能與細(xì)胞表面分子結(jié)合的、分離和/或純化的特異性結(jié)合配對物，所述細(xì)胞表面分子優(yōu)選含有下述物質(zhì)或基本上由下述物質(zhì)組成，或例如是GRIA2，如LPR8，例如是CHRNA5，如TMEFF，例如是NPTXR，如運(yùn)鐵蛋白受體；如II型膜蛋白克隆例如是HP10481；如II型膜蛋白克隆如HP10390；例如是PG40；如TRC8；例如是TR2-11；如OA3抗原表面決定簇；例如是整聯(lián)蛋白α6，例如GPIIb；如玻連蛋白受體α亞單位；例如是整聯(lián)蛋白α-7；如整聯(lián)蛋白αE前體；例如是整聯(lián)蛋白α6B；如整聯(lián)蛋白α5亞單位；例如是整聯(lián)蛋白β-5亞單位；如整聯(lián)蛋白α-3鏈；例如是RYK；如淀粉樣前體蛋白-結(jié)合蛋白1；例如是推定的跨膜GTP酶；如膜輔因子蛋白；例如GLVR1；例如是Mr110,000抗原，例如是多配體聚糖-1；如推定的有7個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)；例如是LCA-同系物/LAR蛋白；如M6抗原；例如是Me491/CD63抗原；如多跨越膜蛋白；例如是DDR；如自泌活動因子受體；例如是胰島素受體前體；如IGF1R，例如是胰島素-樣生長因子II受體；如SAS；例如是TAPA-1；如MICB；例如是MHC II類HLA-DR7-相關(guān)糖蛋白β-鏈；如HLA-DP；例如是骨小蛋白聚糖I雙糖鏈蛋白聚糖；如CAR；例如是MEA11；如γ-干擾素受體α鏈；例如是多聚免疫球蛋白受體；如metabotropic谷氨酸受體4型；例如是metabotropic谷氨酸受體8；如CLPTM1，例如是MAGE-4b；如MAGE5a；例如是MAGE-3；例如MAGE-1；例如是MAGE6；如MAGE-9；例如是MAGE11；如CD24；例如是CD59；如CD44；例如是低密度脂蛋白受體；如極低密度脂蛋白受體；例如是N-CAM；如核纖層蛋白B受體同系物TM7SF2；例如是推定的T1/ST2受體結(jié)合蛋白前體；如NTR2受體；例如是RAGE-4；如HLA-G1；例如是MOAT-C；如α2δ鈣通道亞單位同種型I；例如是LFA-3；如L1-CAM；例如是AVPR2；如C1 p115 C1；例如是TE2；如RbP；例如是HCF1；如IRAK；例如是CD151；如表面抗原；例如是MAG；如GPR19；例如是pcta-1；如PRAME；例如是加壓素活化的鈣質(zhì)轉(zhuǎn)移受體-樣蛋白；如5-羥色胺受體5-HT4B；例如是5-羥色胺1D受體(5-HT1D～)；如CD9；例如是LDL受體成員LR3；如DR6；例如是腫瘤壞死因子受體；如HG38；例如是尿激酶型纖溶酶受體；如FGF受體；例如是神經(jīng)生長因子受體；如胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；例如是CB1大麻素受體(CNR1)；如PSG；例如是PSG13’；如CPE-受體；例如是CRH2R；如OCI5；例如是TRAIL受體2；如HNMP-1；例如是腎α-2-腎上腺素能受體；如紅細(xì)胞生成素受體；例如是硫酸軟骨素蛋白聚糖多能聚糖V1；例如是mGluR1β；如CD97；例如是L6；如NY-ESO-1；例如是T-細(xì)胞受體αδ；如ror1；例如是ror2；如SSTR2；例如是VESPR；如IgG Fc受體；例如是谷氨酸受體亞單位GluRC；如HEK2；例如是PVR；如CEA；例如是CC-趨化因子-結(jié)合受體JAB61；如HER2；例如是HER3；如類似于表皮生長因子受體-相關(guān)蛋白的假擬蛋白FLJ22357；例如是推定的B-型內(nèi)皮肽受體-樣蛋白；如GLVR2；例如是P2X4嘌呤受體；如FPRL1；例如是心房利鈉肽清除受體；例如是胃泌素/CCK-B受體；如神經(jīng)調(diào)節(jié)肽B受體；例如是GFRA3；如GRPR；例如是CDH1；如CDH2；例如是TGFBR1；如TGFBR2；例如是TGFBR3；如表皮生長因子受體的前體。
本發(fā)明的另一個目的是提供鑒定新藥物靶的方法，所述方法包括以下步驟i)提供如本發(fā)明所述的結(jié)合配對物；ii)鑒定能與所述結(jié)合配對物結(jié)合的潛在藥物靶。
本發(fā)明的另一個目的是提供通過本發(fā)明所述的方法鑒定的藥物靶。
另外，本發(fā)明的目的是提供靶向復(fù)合物，其含有i)如本發(fā)明所述的結(jié)合配對物；和ii)生物反應(yīng)物質(zhì)。
其中靶向復(fù)合物能結(jié)合根據(jù)本發(fā)明所述方法鑒定的細(xì)胞表面分子，并能被內(nèi)化至攜有所述細(xì)胞表面分子的細(xì)胞中。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的結(jié)合配對物用于制備本發(fā)明的靶向復(fù)合物的用途。
本發(fā)明的另一個目的是提供藥物組合物，其含有本發(fā)明所述的靶向復(fù)合物以及藥物可接受載體。
本發(fā)明的另一個目的是為需要治療的個體提供治療前惡性和/或惡性疾病的方法，所述方法包括給所述個體施用藥物有效量的本發(fā)明所述的靶向復(fù)合物。
另外，本發(fā)明的目的是提供本發(fā)明所述的靶向復(fù)合物用于制備藥物的用途，所述藥物可用于為需要治療的個體治療前惡性和/或惡性疾病。


圖1闡明了靶向基因治療的原理。
圖2闡明了通過芯片分析(CHIP Analysis)和RT-PCR測定的基因表達(dá)之間的比較結(jié)果。圖中通過對甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)進(jìn)行RT-PCR，顯示出用于經(jīng)RT-PCR證實(shí)芯片分析結(jié)果的cDNA定性試驗(yàn)。
圖3闡明了通過芯片分析和RT-PCR測定的Pro221(IA-1)基因表達(dá)之間的比較結(jié)果。
圖4闡明了通過芯片分析和RT-PCR測定的Pro30(KIA0042)基因表達(dá)之間的比較結(jié)果。
圖5闡明了通過芯片分析和RT-PCR測定的Pro41(MAD2)基因表達(dá)之間的比較結(jié)果。
圖6闡明了通過芯片分析和RT-PCR測定的Pro210(核纖層蛋白B1)基因表達(dá)之間的比較結(jié)果。
圖7闡明了通過芯片分析和RT-PCR測定的Pro71(CDKN2A)基因表達(dá)之間的比較結(jié)果。
圖8闡明了通過芯片分析和RT-PCR測定的細(xì)胞表面分子DR6基因表達(dá)之間的比較結(jié)果。
圖9闡明了通過芯片分析和RT-PCR測定的細(xì)胞表面分子LRP8基因表達(dá)之間的比較結(jié)果。
圖10闡明了通過芯片分析和RT-PCR測定的細(xì)胞表面分子NTPXR基因表達(dá)之間的比較結(jié)果。
圖11闡明了通過芯片分析和RT-PCR測定的細(xì)胞表面分子NCAM1基因表達(dá)之間的比較結(jié)果。
圖12A闡明了通過芯片分析和RT-PCR測定的細(xì)胞表面分子GluR2(GRIA2)基因表達(dá)之間的比較結(jié)果。
圖12B闡明了通過芯片分析和RT-PCR測定的細(xì)胞表面分子ITGAV基因表達(dá)之間的比較結(jié)果。
圖13闡明了通過芯片分析和Western印跡測定的mGluR8基因表達(dá)之間的比較結(jié)果。
圖14闡明了通過芯片分析和Western印跡分析測定的NPTXR基因表達(dá)之間的比較結(jié)果。
圖15闡明了通過芯片分析和Western印跡分析測定的NCAM1基因表達(dá)之間的比較結(jié)果。
圖16闡明了通過芯片分析和Western印跡分析測定的GluR2(GRIA2)基因表達(dá)之間的比較結(jié)果。
圖17闡明了通過芯片分析和Western印跡分析測定的ITGAE基因表達(dá)之間的比較結(jié)果。
發(fā)明詳述定義結(jié)合配對物參見“細(xì)胞表面分子結(jié)合配對物”。
生物反應(yīng)物質(zhì)任何可直接或間接對靶細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)作用的物質(zhì)。
Bp堿基對。
細(xì)胞表面分子與細(xì)胞表面天然結(jié)合的分子。
細(xì)胞表面分子結(jié)合配對物任何可與細(xì)胞表面分子特異性結(jié)合的分子。本文中的術(shù)語“細(xì)胞表面分子結(jié)合配對物”和短語“結(jié)合配對物”可以互換使用，在本文中，這兩個術(shù)語的意義相同。
增強(qiáng)子核酸序列，它可增強(qiáng)與之可操作相連的第二核酸序列的轉(zhuǎn)錄。
第一核酸序列核酸序列，它能介導(dǎo)與之可操作相連的第二核酸序列的表達(dá)。
正常細(xì)胞非-惡性來源的非-惡性細(xì)胞。
正常組織非-惡性組織。
啟動子第一核酸序列，它能介導(dǎo)與之可操作相連的第二核酸序列的表達(dá)。
第二核酸序列當(dāng)與第一核酸序列可操作相連時(shí)能被表達(dá)的核酸序列，如可由所述核酸序列轉(zhuǎn)錄的mRNA。
沉默子核酸序列，它能阻抑與之可操作相連的第二核酸序列的轉(zhuǎn)錄。
靶向復(fù)合物含有至少一種結(jié)合配對物和生物反應(yīng)物質(zhì)、且能被內(nèi)化至細(xì)胞中的復(fù)合物。
具體實(shí)施例方式
越來越明顯的是如果癌癥的基因治療欲成為癌癥，特別是多處擴(kuò)散的癌癥的有效的、可供選擇的或輔助的療法，必須滿足幾個需求。這些需求包括例如i)復(fù)合物的靶向必須有效，且是癌癥特異性的；ii)治療基因的表達(dá)必須有效，且是癌癥特異性的；和iii)分子偶聯(lián)物必須是非-免疫原性的，且在全身性給藥后具有高穩(wěn)定性，能跨越毛細(xì)血管屏障。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及新的高流通量篩選方法用于鑒定癌細(xì)胞特異性表達(dá)的基因的用途，以及所述方法用于治療基因的雙-靶向基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)以治療癌癥的用途。圖1舉例概述了雙-靶向基因轉(zhuǎn)移的原理。本發(fā)明的篩選方法能鑒定出癌細(xì)胞表達(dá)的新分子。
在一個實(shí)施方案中，使用所述方法鑒定小細(xì)胞肺癌(SCLC)細(xì)胞所表達(dá)的適當(dāng)分子的基因表達(dá)。小細(xì)胞肺癌是高侵略性腫瘤，占所有肺癌病例的約25％。在診斷時(shí)該病幾乎總已經(jīng)擴(kuò)散。單獨(dú)使用不同的化學(xué)治療藥物或與放射療法聯(lián)合可以治療SCLC。盡管人們積極嘗試改善治療，且大多數(shù)患者在治療初期對治療反應(yīng)較好，但死亡率仍然很高?，F(xiàn)有的癌癥治療僅能治愈這些患者中的5-7％，5-年存活率極低(5-15％)。因此，SCLC患者非常需要新療法的出現(xiàn)。
已徹底鑒定出該疾病的分子表型，已發(fā)現(xiàn)在80％以上的SCLC腫瘤中，除了幾種腫瘤抑制基因(如p53和Rb)的功能喪失外，還存在癌基因(特別是myc-家族)的異常表達(dá)。在得自SCLC腫瘤的大多數(shù)細(xì)胞系中也可發(fā)現(xiàn)這些表型(評述于Frederiksen等，1999)，使得這些細(xì)胞系可用作體外檢測潛在抗癌藥物的實(shí)驗(yàn)工具。另外，可在裸鼠體內(nèi)增殖這些細(xì)胞系，因此可以在活體內(nèi)檢驗(yàn)所開發(fā)的藥物。因此，可將得自SCLC的細(xì)胞系用于初步篩選基因表達(dá)，以鑒定出SCLC細(xì)胞中的癌癥特異性(或高表達(dá)的)表面分子和具有特異性轉(zhuǎn)錄活性的區(qū)域(啟動子)。
為了鑒定出在多種SCLC中表達(dá)的基因，本發(fā)明優(yōu)選使用由不同實(shí)驗(yàn)室建立的和得自不同患者的多種不同SCLC細(xì)胞系。另外，優(yōu)選這些SCLC細(xì)胞系中的表達(dá)與多種正常組織中的表達(dá)差不多，優(yōu)選其為來源于內(nèi)胚層、外胚層和中胚層的不同組織的代表。
本發(fā)明中可以使用雙相策略，然而，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，也可以使用其它策略。本發(fā)明的雙相策略可以是例如基因治療藥物，所述藥物經(jīng)過全身性給藥，可通過與細(xì)胞表面有轉(zhuǎn)運(yùn)能力的功能性受體結(jié)合而有效靶向癌細(xì)胞，隨后，通過在癌細(xì)胞中具有特別活性或高活性的啟動子，在癌細(xì)胞中有效表達(dá)基因。
氨基酸和核酸在說明書和權(quán)利要求書中，使用了天然氨基酸的單字母密碼或三字母密碼。其中未特別指出L或D型，應(yīng)理解所述氨基酸具有天然的L型(參見Pure& Appl.Chem.Vol.56(5)pp595-624(1984))或D型，使得所形成的肽可由L型、D型氨基酸或L型和D型的混合序列構(gòu)成。
如未特別指明，應(yīng)理解本發(fā)明多肽的C-末端氨基酸以游離羧酸的形式存在，這也可被特別指明為“-OH”。多肽的N-末端氨基酸含有游離的氨基-基團(tuán)，這也可被特別指明為“H-”。
如未特別指明，氨基酸可選自任何氨基酸，天然或非天然皆可，如α氨基酸、β氨基酸和/或γ氨基酸。因此，氨基酸組包括但不限于Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Phe，Trp，Met，Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn，Gln，Asp，Glu，Lys，Arg，His，Aib，Nal，Sar，Orn，賴氨酸類似物DAP和DAPA。
本文中的術(shù)語“核酸”意味著包括DNA和RNA及其衍生物，如肽核酸(PNA)或鎖定核酸(LNA)。
鑒定細(xì)胞表面分子和啟動子的方法用于鑒定細(xì)胞表面分子和/或第一核酸序列的方法優(yōu)選包括比較惡性細(xì)胞系中的mRNA水平與正常組織中的mRNA水平，其中所述第一核酸序列能介導(dǎo)與之可操作相連的本發(fā)明第二核酸序列的表達(dá)。
優(yōu)選本發(fā)明的惡性細(xì)胞系是哺乳動物細(xì)胞系，更優(yōu)選為人細(xì)胞系。更優(yōu)選細(xì)胞系得自小細(xì)胞肺癌(SCLC)。甚至更優(yōu)選細(xì)胞系選自CPH54A，CPH54B，GLC2，GLC3，GLC14，GLC16，GLC19，GLC26，GLC28，DMS53，DMS79，DMS92，DMS114，DMS153，DMS273，DMS406，DMS456，NCI H69，NCI N417，MAR H24和MAR 86MI，SHP-77，NCI-H2171，NCI-H2195，NCI-H2196，NCI-H2198，NCI-H2227，NCI-H2286，NCI-H2330，NCI-H735，NCI-H1339，NCI-H1963，NCI-H2107，NCI-H2108，NCI-H1304，NCI-H1341，NCI-H1417，NCI-H1436，NCI-H1522，NCI-H1618，NCI-H1672，NCI-H1694，NCI-H1836，NCI-H1870，NCI-H1876，NCI-H1882，NCI-H1926，NCI-H1930，NCI-H1994，NCI-H2029，NCI-H2059，NCI-H2066，NCI-H2081，NCI-H2141，NCI-H211，NCI-H220，NCI-H250，NCI-H524，NCI-H592，NCI-H711，NCI-H719，NCI-H740，NCI-H748，NCI-H774，NCI-H841，NCI-H847，NCI-H865，NCI-H1048，NCI-H1059，NCI-H1092，NCI-H1105，NCI-H1184，NCI-H1238，NCI-H1284，NCI-H1688，NCI-H187，NCI-H378，NCI-H526，NCI-H660，NCI-H889，NCI-H60，NCI-H196，NCI-H446，NCI-H209，NCI-H146，NCI-H82，NCI-H460，NCI-H345，NCI-H510A，NCI-128，NCI-44和SW1271。更優(yōu)選細(xì)胞系選自CPH54A，CPH54B，GLC 2，GLC3，GLC14，GLC16，GLC19，GLC26，GLC28，DMS53，DMS79，DMS92，DMS114，DMS153，DMS273，DMS406，DMS456，NCI H69，NCI N417，MAR H24和MAR 86MI。
甚至更優(yōu)選細(xì)胞系選自CPH54A，CPH54B，CHP136A，GLC 2，GLC3，GLC14，GLC16，GLC19，GLC26，GLC28，DMS53，DMS79，DMS92，DMS114，DMS153，DMS273，DMS406，DMS456，NCI H69，NCI N417，MAR H24和MAR 86MI。
最優(yōu)選細(xì)胞系選自DMS53，DMS70，DMS92，DMS114，DMS153，DMS273，NCI417和NCI H69。
表1列出了本發(fā)明的優(yōu)選細(xì)胞系以及它們的保藏號。
表1小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的保藏登錄號



例如，該方法包括至少4個，如至少5個，如至少6個，如至少8個，如至少10個，如至少12個，如至少14個，如至少16個，如至少18個，如至少20個，如至少21個，如至少25個，如至少30個，如至少40個，如至少50個，如至少60個，如至少70個，如約79個選自下列的惡性細(xì)胞系CPH54A，CPH54B，GLC2，GLC3，GLC14，GLC16，GLC19，GLC26，GLC28，DMS53，DMS79，DMS92，DMS114，DMS153，DMS273，DMS406，DMS456，NCI H69，NCI N417，MAR H24和MAR 86MI，SHP-77，NCI-H2171，NCI-H2195，NCI-H2196，NCI-H2198，NCI-H2227，NCI-H2286，NCI-H2330，NCI-H735，NCI-H1339，NCI-H1963，NCI-H2107，NCI-H2108，NCI-H1304，NCI-H1341，NCI-H1417，NCI-H1436，NCI-H1522，NCI-H1618，NCI-H1672，NCI-H1694，NCI-H1836，NCI-H1870，NCI-H1876，NCI-H1882，NCI-H1926，NCI-H1930，NCI-H1994，NCI-H2029，NCI-H2059，NCI-H2066，NCI-H2081，NCI-H2141，NCI-H211，NCI-H220，NCI-H250，NCI-H524，NCI-H592，NCI-H711，NCI-H719，NCI-H740，NCI-H748，NCI-H774，NCI-H841，NCI-H847，NCI-H865，NCI-H1048，NCI-H1059，NCI-H1092，NCI-H1105，NCI-H1184，NCI-H1238，NCI-H1284，NCI-H1688，NCI-H187，NCI-H378，NCI-H526，NCI-H660，NCI-H889，NCI-H60，NCI-H196，NCI-H446，NCI-H209，NCI-H146，NCI-H82，NCI-H460，NCI-H345，NCI-H510A，NCI-128，NCI-446和SW1271。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法包括下列所有細(xì)胞系DMS53，DMS70，DMS92，DMS114，DMS153，DMS273，NCI 417和NCI H69。
可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄅ囵B(yǎng)細(xì)胞系，例如可在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)條件下，在體外細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)細(xì)胞系。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，以異種移植的方式在動物體內(nèi)培養(yǎng)一個或多個細(xì)胞系。動物可以是任何適當(dāng)?shù)膭游铮瑑?yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選為嚙齒類動物，最優(yōu)選為小鼠。實(shí)施例1中給出了如何以異種移植的方式體內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞系的例子。
本發(fā)明還包括相同細(xì)胞系可以在體外細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)，也可在體內(nèi)培養(yǎng)。
一般說來，體內(nèi)培養(yǎng)條件，即以異種移植的方式在動物中培養(yǎng)與天然腫瘤或癌癥更加類似，因此該條件通常優(yōu)選在體內(nèi)培養(yǎng)至少1個，如至少2個，如至少3個，如至少4個，如至少5個，如至少6個，如至少7個，如至少8個細(xì)胞系。更優(yōu)選在體內(nèi)培養(yǎng)1至79，如2至70，如3至60，如4至50，如5至40，如6至30，如7至20個細(xì)胞系。甚至更優(yōu)選在體內(nèi)培養(yǎng)約8個細(xì)胞系。
優(yōu)選體內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞系選自表1所述的細(xì)胞系，甚至更優(yōu)選體內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞系選自CPH54A，CHP136A，GLC3，GLC14，DMS273，NCI-H69，NCI-N417和MAR H24。
正常組織是非惡性組織。優(yōu)選所述組織得自未患前惡性和/或惡性疾病的個體。更優(yōu)選正常組織是哺乳動物組織，甚至更優(yōu)選組織是人組織。更優(yōu)選組織選自肝臟、心臟、腎臟、肺、腎上腺、結(jié)腸、胰腺、小腸、脾臟、骨骼肌、氣管、前列腺、胎盤、唾液腺、睪丸、白細(xì)胞、腦、脂肪組織、膀胱、乳腺、子宮頸、食管、喉、卵巢、直腸、皮膚、脊髓、胃、胸腺、甲狀腺和子宮。甚至更優(yōu)選組織選自腦、腎上腺、肺、腎臟、心臟、氣管、前列腺、唾液腺、甲狀腺、肝臟、胰腺、脾臟、小腸、骨骼肌、結(jié)腸、胃和睪丸。最優(yōu)選組織選自肺、肝臟、心臟和腎臟。
優(yōu)選該方法包括至少3個，如至少4個，如至少5個，如至少6個，如至少8個，如至少10個總RNA樣品。
該方法可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的、任何適于比較惡性細(xì)胞系中的mRNA水平與正常組織中的mRNA水平的方法。一般說來，該方法包括純化mRNA或總RNA?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法，如Sambrook等，1989或下文實(shí)施例中所述的方法進(jìn)行RNA純化。
可通過多種不同的技術(shù)比較RNA樣品。本發(fā)明可以使用任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)。例如可通過示差展示或扣除雜交比較RNA樣品。另外，包括使經(jīng)標(biāo)記的RNA或cDNA庫與已知核酸序列雜交的技術(shù)也適用于本發(fā)明。例如，可先將已知核酸固定于固體支持物上，然后再在例如膜(如硝酸纖維素膜)上進(jìn)行雜交，或者固體支持物也可以是塑料或玻璃。
可用任何直接或間接可測的標(biāo)記，例如酶、放射性同位素、生色團(tuán)、熒光基團(tuán)或重金屬標(biāo)記經(jīng)標(biāo)記的RNA或cDNA。另外，標(biāo)記可以是一對結(jié)合配對物的一部分，其中第二部分是直接或間接可測的。為了檢測間接可測的標(biāo)記，可以使用“夾心”系統(tǒng)，如一對結(jié)合配對物的一部分由第二部分識別，所述第二部分反過來由第一部分識別，所述第一部分再由第二部分識別。在每一步中，可以標(biāo)記第一和/或第二部分。成對結(jié)合配對物的例子是抗原/抗體或生物素/鏈霉親和素。然而，本發(fā)明也可使用任何其它適當(dāng)?shù)某蓪Y(jié)合配對物。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟i)從惡性細(xì)胞系中分離含有mRNA的RNA；ii)由所述RNA制備cDNA群體，其中由分離自一個細(xì)胞系或一個組織樣品的RNA制備一個cDNA群體；iii)用可測標(biāo)記標(biāo)記每個cDNA群體；iv)提供其上已固定有已知核酸序列陣列的固體支持物；v)在允許雜交的條件下保溫每個cDNA群體與固體支持物；vi)檢測固體支持物上的所述可測標(biāo)記。
優(yōu)選所述可測標(biāo)記是間接可測標(biāo)記，更優(yōu)選標(biāo)記是一對結(jié)合配對物的一部分，其中第二部分是直接或間接可測的。最優(yōu)選標(biāo)記是生物素。可用經(jīng)標(biāo)記的鏈霉親和素類物質(zhì)，優(yōu)選用經(jīng)熒光標(biāo)記的鏈霉親和素來檢測生物素。更優(yōu)選鏈霉親和素進(jìn)一步與經(jīng)生物素標(biāo)記的抗-鏈霉親和素抗體結(jié)合，它反過來可被經(jīng)標(biāo)記的、優(yōu)選經(jīng)熒光標(biāo)記的鏈霉親和素檢測。熒光標(biāo)記可以是例如藻紅蛋白或任何其它適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)記。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，固體支持物是玻璃板。優(yōu)選在固體支持物上固定至少1000，如至少5000，如至少10,000，如至少50,000，如至少100,000，如至少150,000，如至少200,000，如約240,000個不同的已知核酸序列。這些核酸序列全部得自不同的基因。然而，更優(yōu)選每個基因由1個以上，如2個以上，如4個以上，如7個以上，如10個以上，如15個以上，如20個以上，優(yōu)選約20個不同的核酸序列來描述。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，可通過CHIPS分析或GeneChips分析來比較RNA樣品。在本文中，術(shù)語CHIPS分析和GeneChips分析可以互換使用。實(shí)施例1中給出了如何進(jìn)行CHIPS分析的例子。
根據(jù)幾個標(biāo)準(zhǔn)選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞表面分子。優(yōu)選本發(fā)明方法所用的一個或多個細(xì)胞系中表達(dá)的mRNA量與本發(fā)明的一個或多個組織中表達(dá)的mRNA量之間有差別。優(yōu)選mRNA表達(dá)相差至少1.1倍，如1.2倍，如1.5倍，如1.75倍，如2倍，如2.5倍，如至少3倍，如至少4倍，如至少5倍，如至少7.5倍，如至少10倍。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，相差的倍數(shù)在理論上不受限制，如一個或多個細(xì)胞系中未表達(dá)出可測的mRNA，但一個或多個正常組織中有可測的mRNA，或者在一個或多個正常組織中未表達(dá)出可測的mRNA，但在一個或多個細(xì)胞系中有可測的mRNA。
另外，優(yōu)選本發(fā)明方法中使用的至少2個，如至少3個，如至少4個，如至少5個，如至少6個，如至少8個，如至少10個，如至少12個，如至少14個，如至少16個，如至少18個，如至少20個，如至少21個，如至少25個，如至少30個，如至少40個，如至少50個，如至少60個，如至少70個，如約79個惡性細(xì)胞系中表達(dá)的mRNA量基本上沒有差別。
另外，優(yōu)選本發(fā)明方法所用總RNA所來源的組織樣品中，至少2個，如至少3個，如至少4個，如至少5個，如至少6個，如至少8個，如至少10個組織樣品中表達(dá)的mRNA量基本上沒有差別。
從完全符合上述標(biāo)準(zhǔn)的核酸序列中選擇編碼潛在細(xì)胞表面分子的核酸序列。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，如實(shí)施例1所述鑒定潛在的細(xì)胞表面分子，并根據(jù)該實(shí)施例中所述的標(biāo)準(zhǔn)選擇這些分子。
為了測定何種核酸序列編碼潛在的細(xì)胞表面分子，可以使用不同的策略。例如，可根據(jù)在通常可進(jìn)入的數(shù)據(jù)庫中可以得到的信息選擇潛在的細(xì)胞表面分子。例如，所述數(shù)據(jù)庫可選自PubMed(NCBI)，Nucleotide(NCBI)，Protein(NCBI)，Structure(NCBI)，OMIM(NCBI)和LocusLink(NCBI)。NCBI是國立生物技術(shù)信息中心的簡稱。另外，可根據(jù)潛在細(xì)胞表面分子的名稱中一個或多個選定術(shù)語的存在來選擇潛在的細(xì)胞表面分子。例如，所述術(shù)語可選自受體、膜、粘附、整聯(lián)蛋白、表面、抗原、多配體聚糖、轉(zhuǎn)運(yùn)、通道、激素、結(jié)合、糖蛋白、基質(zhì)、CAM、橋粒、間隙連接、δ、免疫球蛋白、MHC、CD、HSPG、CSPG、完整的和有凹槽的(notch)。
或者，根據(jù)與已知細(xì)胞表面分子的序列同源性來選擇編碼潛在細(xì)胞表面分子的核酸序列。編碼潛在細(xì)胞表面分子的核酸序列應(yīng)該與編碼已知細(xì)胞表面分子的核酸序列具有至少20％，如至少22.5％，如至少25％，如至少27.5％，如至少30％的序列同一性。
也可以根據(jù)與已知細(xì)胞表面分子內(nèi)所含結(jié)構(gòu)域的序列同源性來選擇編碼潛在細(xì)胞表面分子的核酸序列。優(yōu)選編碼潛在細(xì)胞表面分子的核酸結(jié)構(gòu)域和編碼已知細(xì)胞表面分子結(jié)構(gòu)域的核酸序列之間有至少20％，如至少22.5％，如至少25％，如至少27.5％，如至少30％，如至少32.5％，如至少35％，如至少37.5％，如至少40％，如至少42.5％，如至少45％，如至少47.5％，如至少50％的序列同一性。
也可根據(jù)潛在細(xì)胞表面分子含有經(jīng)常與細(xì)胞表面結(jié)合的結(jié)構(gòu)域來選擇編碼潛在細(xì)胞表面分子的核酸序列。所述結(jié)構(gòu)域可以選自例如疏水區(qū)域和潛在的糖基化位點(diǎn)。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，通過芯片分析(CHIP Analysis)鑒定出候選細(xì)胞表面分子。然后根據(jù)幾個標(biāo)準(zhǔn)選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞表面分子。例如，可以包括經(jīng)評價(jià)以絕對信號和平均差為例如＞10，如＞20，如＞40，如＞50存在(P)的細(xì)胞表面分子。另外，可以建立點(diǎn)系統(tǒng)以鑒定適當(dāng)?shù)募?xì)胞表面分子。例如，可以安排編碼細(xì)胞表面分子的基因以評價(jià)多個點(diǎn)，例如一個點(diǎn)對應(yīng)一個表達(dá)該基因的細(xì)胞系或組織。分別計(jì)算出正常組織和SCLC細(xì)胞系中各個基因的總評分。然后選擇基因，經(jīng)評價(jià)所述基因在至少3個，如4個，5個，6個，7個，8個，9個，10個，10個以上SCLC細(xì)胞系中存在。實(shí)施例1描述了選擇細(xì)胞表面分子的優(yōu)選方法。
本發(fā)明還提供了鑒定第一核酸序列的方法，所述核酸序列能介導(dǎo)與之可操作相連的第二核酸序列的表達(dá)。這些方法包括鑒定第二核酸序列，在惡性細(xì)胞和正常細(xì)胞中，所述第二核酸序列的表達(dá)水平有所不同。
因此，優(yōu)選一個或多個細(xì)胞系中表達(dá)的第二核酸序列mRNA量與一個或多個組織中表達(dá)的第二核酸序列mRNA量之間有差別。更優(yōu)選mRNA表達(dá)相差至少1.1倍，如1.2倍，1.5倍，1.75倍，2倍，2.5倍，如至少3倍，如至少4倍，如至少5倍，如至少7.5倍，如至少10倍。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，相差的倍數(shù)在理論上不受限制，如一個或多個細(xì)胞系中未表達(dá)出可測的第二核酸序列mRNA，但一個或多個正常組織中有可測的所述mRNA，或者在一個或多個正常組織中未表達(dá)出可測的第二核酸序列mRNA，但在一個或多個細(xì)胞系中有可測的所述mRNA。
另外，優(yōu)選本發(fā)明方法中使用的至少2個，如至少3個，如至少4個，如至少5個，如至少6個，如至少8個，如至少10個，如至少12個，如至少14個，如至少16個，如至少18個，如至少20個，如至少21個，如至少25個，如至少30個，如至少40個，如至少50個，如至少60個，如至少70個，如約79個惡性細(xì)胞系中表達(dá)的第二核酸序列mRNA量基本上沒有差別。
另外，優(yōu)選至少2個，如至少3個，如至少4個，如至少5個，如至少6個，如至少8個，如至少10個組織樣品中表達(dá)的第二核酸序列mRNA量基本上沒有差別。
在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)實(shí)施例1所述方法鑒定第二核酸序列。最優(yōu)選將該實(shí)施例中所述的標(biāo)準(zhǔn)用于選擇有用的第二核酸序列。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，通過芯片分析鑒定出候選啟動子。然后根據(jù)幾個基于啟動子所控制基因的表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)，來選擇適當(dāng)?shù)膯幼印＠?，僅可包括經(jīng)評價(jià)以絕對信號和平均差為＞10，如＞20，如＞30，如＞40，如＞50(表達(dá)水平)存在(P)的基因?？梢允褂蒙衔乃龅狞c(diǎn)評價(jià)系統(tǒng)。例如，可選擇經(jīng)評價(jià)在至少3個，如至少4個，如至少5個，如至少6個，如至少7個，如至少8個，如至少9個，如至少10個，如至少11個，如至少12個SCLC細(xì)胞系中存在的基因。如果一個或多個正常組織中存在基因評分，SCLC細(xì)胞系的平均差中間值應(yīng)該優(yōu)選為正常組織的平均差中間值的4倍或更高。優(yōu)選對正常組織而言的表達(dá)平均差＜50，而對SCLC而言＞100的啟動子。更優(yōu)選對正常組織而言的表達(dá)平均差＜50，而對SCLC而言＞200的啟動子。最優(yōu)選對正常組織而言的表達(dá)平均差＜50，而對SCLC而言＞400的啟動子?；蛘?，可以選擇在SCLC中的表達(dá)平均差比正常組織中的高＞8倍的啟動子。實(shí)施例1描述了選擇細(xì)胞表面分子的優(yōu)選方法。
一旦根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)鑒定出第二核酸序列，即可鑒定出與第二核苷酸序列可操作相連的第一核酸序列?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法達(dá)到此目的。例如，可以利用已知的人基因組序列。
細(xì)胞表面分子本發(fā)明的細(xì)胞表面分子是任何與細(xì)胞表面天然結(jié)合的分子。在其整個生命期內(nèi)，細(xì)胞表面分子不總是與細(xì)胞表面結(jié)合，而僅在特定的時(shí)間與細(xì)胞表面結(jié)合。本發(fā)明范圍內(nèi)的細(xì)胞表面分子可以是任何與細(xì)胞表面結(jié)合的分子類型，然而，本發(fā)明的細(xì)胞表面分子優(yōu)選含有多肽。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子不與細(xì)胞表面結(jié)合，而是細(xì)胞內(nèi)受體。細(xì)胞內(nèi)受體包括例如核類固醇激素受體。
然而，在本發(fā)明其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子包括例如經(jīng)由跨膜結(jié)構(gòu)域、膜錨著結(jié)構(gòu)域或與膜結(jié)合的共價(jià)連接基團(tuán)，如親脂基團(tuán)直接與細(xì)胞表面結(jié)合的分子。親脂基團(tuán)可以是例如糖基磷脂酰肌醇基團(tuán)(GPI)。然而，細(xì)胞表面分子也包括與細(xì)胞表面間接結(jié)合的分子，例如，能夠與同細(xì)胞表面直接或間接結(jié)合的其它細(xì)胞表面分子結(jié)合的分子。
通常，細(xì)胞表面分子含有至少一個胞外結(jié)構(gòu)域，然而，細(xì)胞表面分子也可含有一個以上的胞外結(jié)構(gòu)域，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、10個以上的胞外結(jié)構(gòu)域。
細(xì)胞表面分子經(jīng)常是糖基化的多肽。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子能與特異性結(jié)合配對物結(jié)合，并能通過結(jié)合內(nèi)化所述的特異性結(jié)合配對物，即在結(jié)合配對物與細(xì)胞表面分子結(jié)合之后，結(jié)合配對物被轉(zhuǎn)移至表達(dá)細(xì)胞表面分子的細(xì)胞的內(nèi)部。通常，通過受體介導(dǎo)的胞吞來內(nèi)化結(jié)合配對物，但其它機(jī)理也是可以的，并且也落入本發(fā)明的范圍。能內(nèi)化結(jié)合配對物的細(xì)胞表面分子可用于例如放射-，毒素-或基因治療或癌癥疫苗。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子能在細(xì)胞表面與特異性結(jié)合配對物結(jié)合，但不能內(nèi)化所述的特異性結(jié)合配對物。未被內(nèi)化的細(xì)胞表面分子可用于例如放射-療法和癌癥疫苗。
表2列出了優(yōu)選細(xì)胞表面分子的GenBank登錄號和名稱。
表2







甚至更優(yōu)選本發(fā)明的細(xì)胞表面分子是屬于下列組之一的受體受體酪氨酸激酶成員整聯(lián)蛋白家族成員免疫球蛋白超家族粘附分子成員硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族成員硫酸軟骨素蛋白聚糖家族成員MAGE家族成員RAGE家族成員低密度脂蛋白受體家族成員鈣粘蛋白粘附分子成員metabotropic谷氨酸受體成員類固醇激素家族成員7跨膜受體家族成員心房利鈉肽清除受體GFRA3運(yùn)鐵蛋白受體絲氨酸/蘇氨酸激酶受體成員本發(fā)明更優(yōu)選的細(xì)胞表面分子是選自NCAM1，NPTXR，LRP8，CHRNA5，GRIA2，GRM8，ITGAV，ITGAE，TNFRSF12，L1CAM，GPR49和TMEFF1的細(xì)胞表面分子。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子能通過結(jié)合內(nèi)化特異性結(jié)合配對物(參見上文)。本發(fā)明優(yōu)選的、能內(nèi)化結(jié)合配對物的細(xì)胞表面分子選自NCAM1，NPTXR，LRP8和CHRNA5。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子不能內(nèi)化其特異性結(jié)合配對物。本發(fā)明優(yōu)選的、不能內(nèi)化結(jié)合配對物的細(xì)胞表面分子可選自GRIA2，GRM8，ITGAV和ITGAE。
本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的細(xì)胞表面分子是NCAM1(NCAM，神經(jīng)細(xì)胞粘附分子，N-CAM，CD56)。NCAM1在大多數(shù)SCLC中被高表達(dá)。通過例如芯片分析，RT-PCR和Western印跡已證實(shí)NCAM1的表達(dá)(見實(shí)施例1，圖11和圖15)。NCAM1能內(nèi)化結(jié)合配對物。下文將描述能與NCAM1結(jié)合的結(jié)合配對物。已證實(shí)NCAM1能被內(nèi)化至星形細(xì)胞(Minana等，2001)，并能很有效地內(nèi)化由抗-NCAM1抗體-A蛋白-鏈霉親和素-生物素-β-半乳糖苷酶組成的很大的分子復(fù)合物(Yu等，2000)。
本發(fā)明另一個優(yōu)選細(xì)胞表面分子是NPTXR(神經(jīng)元正五聚蛋白(pentraxin)受體，NPR)。大多數(shù)SCLC都表達(dá)NPTXR。已通過例如芯片分析，RT-PCR和Western印跡證實(shí)NPTXR的表達(dá)(見實(shí)施例1，圖10和圖14)。NPTXR是高內(nèi)化受體。下文將描述能與NPTXR結(jié)合的結(jié)合配對物。
本發(fā)明另一個優(yōu)選細(xì)胞表面分子是LRP8(低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白，載脂蛋白E受體2)。所有被檢測的SCLC中都表達(dá)LRP8。已通過例如芯片分析和RT-PCR闡明LRP8的表達(dá)(見實(shí)施例1和圖9)。LRP8是高內(nèi)化受體。下文將描述能與LRP8結(jié)合的結(jié)合配對物。
本發(fā)明另一個優(yōu)選細(xì)胞表面分子是CHRNA5(煙堿乙酰膽堿受體α5亞單位)。下文將描述能與CHRNA5結(jié)合的結(jié)合配對物。
另一個可用于本發(fā)明的細(xì)胞表面分子是L1CAM(神經(jīng)細(xì)胞粘附分子L1)。已知L1能內(nèi)化結(jié)合配對物。下文將描述能與L1CAM結(jié)合的結(jié)合配對物。
本發(fā)明另一個優(yōu)選細(xì)胞表面分子是TNFRSF12(DR6，腫瘤壞死因子受體超家族成員21)。大多數(shù)SCLC中都表達(dá)TNFRSF12。已通過例如芯片分析和RT-PCR闡明TNFRSF12的表達(dá)(見實(shí)施例1和圖8)。TNFRSF12所屬家族的其它成員能內(nèi)化結(jié)合配對物。
本發(fā)明特別優(yōu)選的細(xì)胞表面分子是GRIA2(離子化谷氨酸受體2，GLUR2，GLURB，HBGR2，AMPA2)。所有被檢測的SCLC和腦中表達(dá)GRIA2。GRIA2是腦外部的高特異性SCLC受體。已通過例如芯片分析，RT-PCR和Western印跡闡明GRIA2的表達(dá)(見實(shí)施例1，圖12A和圖16)。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的細(xì)胞表面分子是GRM8(metabotropic谷氨酸8受體，GLUR8，mGlu8，GPRC1H)。GRM8在除腦以外的SCLC中高度特異性表達(dá)，并在大多數(shù)SCLC中表達(dá)。已通過例如芯片分析，RT-PCR和Western印跡闡明GRM8的表達(dá)(見實(shí)施例1和圖13)。下文將描述能與GRM8結(jié)合的結(jié)合配對物。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的細(xì)胞表面分子是ITGAV(整聯(lián)蛋白亞單位αv，玻連蛋白受體，CD51)。SCLC高表達(dá)ITGAV。已通過例如芯片分析和RT-PCR闡明表達(dá)(見實(shí)施例1和圖12B)。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的細(xì)胞表面分子是ITGAE(整聯(lián)蛋白αE亞單位-前體，人粘膜淋巴細(xì)胞-1’抗原，CD103)。所有被檢測的SCLC都表達(dá)ITGAE，SCLC高特異性表達(dá)ITGAE。已通過例如芯片分析和Western印跡闡明表達(dá)(見實(shí)施例1和圖17)。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的細(xì)胞表面分子是GPR49(孤獨(dú)G蛋白-結(jié)合受體67，GPR67，HG38)。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的細(xì)胞表面分子是TMEFF1(具有EGF-樣和2個follastatin-樣結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白)。
然而，本發(fā)明還涉及含有片段的細(xì)胞表面分子，所述片段由表2所示核苷酸序列的片段編碼。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由這些序列的剪接變體編碼的細(xì)胞表面分子，所述序列由相同基因編碼。表2所示細(xì)胞表面分子的剪接變體可編碼與所述細(xì)胞表面分子共享片段的多肽序列；然而，剪接變體可利用可選擇的閱讀框，使得盡管兩個剪接變體的產(chǎn)物由享有共同片段的核苷酸序列編碼，但多肽序列卻不相關(guān)。
另外，本發(fā)明涉及編碼表2所示細(xì)胞表面分子的核苷酸序列的片段。特別是，本發(fā)明的結(jié)合配對物(見下文)僅與本發(fā)明細(xì)胞表面分子的一個或多個片段結(jié)合，但優(yōu)選不與細(xì)胞表面分子的所有片段結(jié)合。因此，可以使用細(xì)胞表面分子的片段來鑒定潛在的結(jié)合配對物(見下文)。
例如，所述片段含有5’方向上的一半序列或3’方向上的一半序列。另外，片段可含有5’方向上的一半序列的片段或3’方向上的一半序列的片段。優(yōu)選所述片段短于5000bp，如短于4000bp，如短于3000bp，如短于2500bp，如短于2000bp，如短于1750bp，如短于1500bp，如短于1250bp，如短于1000bp，如短于900bp，如短于800bp，如短于700bp，如短于600bp，如短于500bp，如短于400bp，如短于300bp，如短于200bp，如短于100bp，如短于75bp，如短于50bp，如短于40bp，如短于30bp，如短于25bp，如短于20bp，如短于18bp。
所述片段可以是內(nèi)部片段，或可含有5’或3’末端。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，片段含有多個預(yù)定長度的構(gòu)件(building block)，其中構(gòu)件被連接起來，使得片段與天然基因序列，優(yōu)選為表2所示序列的一部分相同。因此，片段可含有多個預(yù)定長度和預(yù)定起點(diǎn)的構(gòu)件。
所述構(gòu)件是核酸序列，它們具有預(yù)定的長度和起點(diǎn)，使得第一個構(gòu)件在核酸序列中的給定位置起始，隨后的構(gòu)件在前一個構(gòu)件起始位置之后的位置處起始。
優(yōu)選構(gòu)件衍生自下述任一個序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ IDNO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ IDNO15，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21，SEQ ID NO23，SEQID NO25，SEQ ID NO27，29，SEQ ID NO31，SEQ ID NO33，SEQ ID NO35，SEQ ID NO37，SEQ ID NO39，SEQ ID NO41，SEQ ID NO42，SEQ IDNO44，SEQ ID NO48，SEQ ID NO50，SEQ ID NO52，SEQ ID NO54，SEQID NO56，SEQ ID NO58，SEQ ID NO60，SEQ ID NO62，SEQ ID NO64，SEQ ID NO66，SEQ ID NO68，SEQ ID NO70，SEQ ID NO72，SEQ IDNO74，SEQ ID NO76，SEQ ID NO78，SEQ ID NO80，SEQ ID NO82，SEQID NO84，SEQ ID NO86，SEQ ID NO88，SEQ ID NO90，SEQ ID NO92，SEQ ID NO94，SEQ ID NO96，SEQ ID NO98，SEQ ID NO100，SEQ IDNO102，SEQ ID NO104，SEQ ID NO106，SEQ ID NO108，SEQ ID NO110，SEQ ID NO112，SEQ ID NO114，SEQ ID NO116，SEQ ID NO118，SEQ IDNO126，SEQ ID NO128，SEQ ID NO130，SEQ ID NO132，SEQ ID NO134，SEQ ID NO136，SEQ ID NO138，SEQ ID NO140，SEQ ID NO142，SEQ IDNO144，SEQ ID NO146，SEQ ID NO148，SEQ ID NO150，SEQ ID NO152，SEQ ID NO154，SEQ ID NO156，SEQ ID NO158，SEQ ID NO160，SEQ IDNO162，SEQ ID NO164，SEQ ID NO166，SEQ ID NO168，SEQ ID NO170，SEQ ID NO172，SEQ ID NO174，SEQ ID NO176，SEQ ID NO178，SEQ IDNO180，SEQ ID NO182，SEQ ID NO184，SEQ ID NO186，SEQ ID NO188，SEQ ID NO190，SEQ ID NO192，SEQ ID NO194，SEQ ID NO196，SEQ IDNO198，SEQ ID NO200，SEQ ID NO202，SEQ ID NO204，SEQ ID NO206，SEQ ID NO223，SEQ ID NO225，SEQ ID NO227，SEQ ID NO229，SEQ IDNO231，SEQ ID NO233，SEQ ID NO235，SEQ ID NO237，SEQ ID NO241，SEQ ID NO243，SEQ ID NO245，SEQ ID NO247，SEQ ID NO249，SEQ IDNO251，SEQ ID NO253，SEQ ID NO255，SEQ ID NO257，SEQ ID NO261，SEQ ID NO259，SEQ ID NO263，SEQ ID NO265，SEQ ID NO267，SEQ IDNO269，SEQ ID NO271，SEQ ID NO273，SEQ ID NO275，SEQ ID NO277，SEQ ID NO279，SEQ ID NO281，SEQ ID NO283，SEQ ID NO285，SEQ IDNO287，SEQ ID NO289，SEQ ID NO291，SEQ ID NO293，SEQ ID NO295，SEQ ID NO297，SEQ ID NO299，SEQ ID NO301和SEQ ID NO303。
優(yōu)選每個構(gòu)件短于1000bp，如短于900bp，如短于800bp，如短于700bp，如短于600bp，如短于500bp，如短于400bp，如短于300bp，如短于200bp，如短于100bp，如短于75bp，如短于50bp，如短于40bp，如短于30bp，如短于25bp，如短于20bp，如短于18bp。在一個實(shí)施方案中，構(gòu)件約為18bp。
構(gòu)件可起始于第1位，如第2位，第3位，第4位，第5位，第6位，第7位，第8位，第9位，第10位，第11位，第12位，第13位，第14位，第15位，第16位，第17位，第18位，第19位，第20位，如第20至100位中的任一位置，如表2所示任一序列中的第100位。
優(yōu)選片段含有多個構(gòu)件，如2個，3個，4個，5個，5至10個，10至20個，20至30個，30至40個，40至50個，50至75個，75至100個，100以上構(gòu)件。
在一個實(shí)施方案中，片段含有100個堿基對長，且在第1位起始的構(gòu)件。
另外，本發(fā)明細(xì)胞表面分子的片段可以是嵌合片段，該嵌合片段含有一個以上彼此不結(jié)合的根據(jù)表2所示序列的片段。所述嵌合片段可含有得自相同細(xì)胞表面分子的片段，或者它們可含有得自一個以上本發(fā)明細(xì)胞表面分子的片段。
另外，本發(fā)明涉及根據(jù)表2的細(xì)胞表面分子多肽序列的片段。特別是，本發(fā)明的結(jié)合配對物(見下文)僅與本發(fā)明細(xì)胞表面分子的一個或多個片段結(jié)合，但優(yōu)選不與細(xì)胞表面分子的所有片段結(jié)合。因此，可以使用細(xì)胞表面分子的片段來鑒定潛在的結(jié)合配對物(見下文)。
多肽序列的片段可短于3000個氨基酸，如短于2500個氨基酸，如短于2000個氨基酸，如短于1750個氨基酸，如短于1500個氨基酸，如短于1250個氨基酸，如短于1000個氨基酸，如短于900個氨基酸，如短于800個氨基酸，如短于700個氨基酸，如短于600個氨基酸，如短于500個氨基酸，如短于400個氨基酸，如短于300個氨基酸，如短于200個氨基酸，如短于100個氨基酸，如短于75個氨基酸，如短于50個氨基酸，如短于40個氨基酸，如短于30個氨基酸，如短于25個氨基酸，如短于20個氨基酸，如短于15個氨基酸，如短于10個氨基酸。
優(yōu)選片段是下述多肽序列的片段SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ IDNO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ IDNO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，SEQ ID NO22，SEQ ID NO24，SEQID NO26，SEQ ID NO28，SEQ ID NO30，SEQ ID NO32，SEQ ID NO34，SEQ ID NO36，SEQ ID NO38，SEQ ID NO40，SEQ ID NO43，SEQ IDNO45，SEQ ID NO47，SEQ ID NO49，SEQ ID NO51，SEQ ID NO53，SEQID NO55，SEQ ID NO57，SEQ ID NO59，SEQ ID NO61，SEQ ID NO63，SEQ ID NO65，SEQ ID NO67，SEQ ID NO69，SEQ ID NO71，SEQ IDNO73，SEQ ID NO75，SEQ ID NO77，SEQ ID NO79，SEQ ID NO81，SEQID NO83，SEQ ID NO85，SEQ ID NO87，SEQ ID NO89，SEQ ID NO91，SEQ ID NO93，SEQ ID NO95，SEQ ID NO97，SEQ ID NO99，SEQ IDNO101，SEQ ID NO103，SEQ ID NO105，SEQ ID NO107，SEQ ID NO109，SEQ ID NO111，SEQ ID NO113，SEQ ID NO115，SEQ ID NO117，SEQ IDNO119，SEQ ID NO120，SEQ ID NO121，SEQ ID NO122，SEQ ID NO123，SEQ ID NO124，SEQ ID NO125，SEQ ID NO126，SEQ ID NO127，SEQ IDNO129，SEQ ID NO131，SEQ ID NO133，SEQ ID NO135，SEQ ID NO137，SEQ ID NO139，SEQ ID NO141，SEQ ID NO143，SEQ ID NO145，SEQ IDNO147，SEQ ID NO149，SEQ ID NO151，SEQ ID NO153，SEQ ID NO155，SEQ ID NO157，SEQ ID NO159，SEQ ID NO161，SEQ ID NO163，SEQ IDNO165，SEQ ID NO167，SEQ ID NO169，SEQ ID NO171，SEQ ID NO173，SEQ ID NO175，SEQ ID NO177，SEQ ID NO179，SEQ ID NO181，SEQ IDNO183，SEQ ID NO185，SEQ ID NO187，SEQ ID NO189，SEQ ID NO191，SEQ ID NO193，SEQ ID NO195，SEQ ID NO197，SEQ ID NO199，SEQ IDNO201，SEQ ID NO203，SEQ ID NO205，SEQ ID NO207，SEQ ID NO208，SEQ ID NO209，SEQ ID NO210，SEQ ID NO211，SEQ ID NO212，SEQ IDNO213，SEQ ID NO214，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ IDNO222，SEQ ID NO224，SEQ ID NO226，SEQ ID NO228，SEQ ID NO230，SEQ ID NO232，SEQ ID NO234，SEQ ID NO236，SEQ ID NO238，SEQ IDNO240，SEQ ID NO242和SEQ ID NO244，SEQ ID NO246，SEQ ID NO248，SEQ ID NO250，SEQ ID NO252，SEQ ID NO254，SEQ ID NO256，SEQ IDNO258，SEQ ID NO260，SEQ ID NO262，SEQ ID NO264，SEQ ID NO266，SEQ ID NO268，SEQ ID NO270，SEQ ID NO272，SEQ ID NO274，SEQ IDNO276，SEQ ID NO278，SEQ ID NO280，SEQ ID NO282，SEQ ID NO284，SEQ ID NO286，SEQ ID NO288，SEQ ID NO290，SEQ ID NO292，SEQ IDNO294，SEQ ID NO296，SEQ ID NO298，SEQ ID NO300，SEQ ID NO302和SEQ ID NO304。另外，本發(fā)明細(xì)胞表面分子內(nèi)也可包含多肽序列片段的功能同系物，或者細(xì)胞表面分子可由多肽序列片段的功能同系物組成。下文將定義功能同系物。
本發(fā)明特別優(yōu)選的細(xì)胞表面分子片段是含有一個或多個細(xì)胞表面分子胞外結(jié)構(gòu)域的片段。另外，含有胞外結(jié)構(gòu)域的一部分的片段也是本發(fā)明范圍內(nèi)的優(yōu)選片段。最優(yōu)選本發(fā)明細(xì)胞表面分子的片段是含有一個或多個胞外結(jié)構(gòu)域，且能內(nèi)化對所述片段具有親和性的結(jié)合配對物的片段。
在一個實(shí)施方案中，片段含有胞外結(jié)構(gòu)域或其片段或其衍生物，其中所述胞外結(jié)構(gòu)域選自由下述核苷酸序列編碼的多肽序列SEQ ID NO3的核苷酸1014至2450，SEQ ID NO15的核苷酸216至3179，SEQ ID NO31的核苷酸147至2999，SEQ ID NO52的核苷酸419至4120，SEQ ID NO66的核苷酸268至7059，SEQ ID NO82的核苷酸235至2094，SEQ ID NO104的核苷酸160至663，SEQ ID NO204的核苷酸301至2250，SEQ ID NO229的核苷酸130至2880，SEQ ID NO281的核苷酸569至2152，SEQ ID NO283的核苷酸585至1901，SEQ ID NO291的核苷酸121至2836和SEQ ID NO293的核苷酸259至2127。
上文所述的細(xì)胞表面分子和細(xì)胞表面分子片段可進(jìn)一步含有翻譯后修飾。翻譯后修飾的例子是磷酸化、糖基化、乙?；?、甲基化、硫酸酯化、多聚唾液酸化、法尼基化、豆蔻?；蜃貦盎?br> 本發(fā)明還包括表2所述細(xì)胞表面分子的功能同系物。表2也列出了編碼本發(fā)明優(yōu)選細(xì)胞表面分子的多肽序列的SEQ ID NO。本發(fā)明細(xì)胞表面分子的功能同系物是能與本發(fā)明的結(jié)合配對物結(jié)合，且優(yōu)選能內(nèi)化所述結(jié)合配對物的細(xì)胞表面分子。
啟動子本發(fā)明范圍內(nèi)的啟動子是第一核酸序列，它能介導(dǎo)與之可操作相連的第二核酸序列的表達(dá)。所述第一核酸序列一般位于被轉(zhuǎn)錄核酸序列的染色體上游。
在一個實(shí)施方案中，與第二核酸序列可操作相連的第一核酸序列優(yōu)選含有至少15,000個堿基對，所述堿基對在染色體上位于所述第二核酸序列的翻譯起始密碼子上游。然而，與第二核酸序列可操作相連的所述第一核酸序列也可含有在染色體上位于所述第二核酸序列的翻譯起始密碼子上游的至少12,500，如至少10,000，如至少8,000，如至少6,000，如至少5,000，如至少4,000，如至少3,000，如至少2,500，如至少2,000，如至少1,500，如至少1,000，如至少500，如至少400，如至少300，如至少200，如至少150，如至少100，如至少50，如至少25，如至少10個堿基對，或者含有任何所述序列的能介導(dǎo)基因表達(dá)的片段。
另外，在另一個實(shí)施方案中，與第二核酸序列可操作相連的第一核酸序列優(yōu)選含有在染色體上位于所述第二核酸序列的翻譯起始密碼子上游的高達(dá)10個，如高達(dá)100個，如高達(dá)500個，如高達(dá)1000個，如高達(dá)2500個，如高達(dá)5000個堿基對，或其能介導(dǎo)基因表達(dá)的片段。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，與第二核酸序列可操作相連的第一核酸序列可含有一個或多個在染色體上位于所述第二核酸序列的翻譯起始密碼子上游的內(nèi)含子序列或其片段。另外，與第二核酸序列可操作相連的第一核酸序列可含有一個或多個在染色體上位于所述第二核酸序列的翻譯起始密碼子下游的內(nèi)含子序列或其片段。
與第二核酸序列可操作相連的第一核酸序列可進(jìn)一步含有增強(qiáng)子序列，所述序列在染色體上位于所述第二核酸序列的翻譯起始密碼子上游或下游15,000個堿基對以外的位置。
上述與第二核酸序列可操作相連的第一核酸序列也可含有核酸缺失和/或添加。缺失和/或添加可以發(fā)生在核酸序列內(nèi)部或末端。
因此，從含有在染色體上位于所述第二核酸序列的翻譯起始密碼子上游的例如高達(dá)1000，如高達(dá)2500，如高達(dá)5000，如高達(dá)7500，如高達(dá)10,000，如高達(dá)15,000，如高達(dá)20,000個堿基對的第一核酸序列中，可缺失至少10個內(nèi)部堿基對(bp)，如至少25個內(nèi)部bp，如至少50個內(nèi)部bp，如至少100個內(nèi)部bp，如200個內(nèi)部bp，如至少300個內(nèi)部bp，如至少400個內(nèi)部bp，如至少500個內(nèi)部bp，如至少750個內(nèi)部bp，如至少1000個內(nèi)部bp，如至少1250，如至少1500，如至少1750，如至少2000，如至少2500，如至少3000，如至少3500，如至少4000，如至少4500個內(nèi)部堿基對。
特定的核酸序列比其它核酸序列更適于缺失。例如，可以缺失抑制表達(dá)的序列或不會改變與之可操作相連的第二核酸序列表達(dá)的序列。因此，本發(fā)明還包括缺失了至少一個沉默子的、與第二核酸序列可操作相連的第一核酸序列，所述第一核酸序列含有在染色體上位于所述第二核酸序列的翻譯起始密碼子上游的高達(dá)1000，如高達(dá)2500，如高達(dá)5000，如高達(dá)7500，如高達(dá)10,000，如高達(dá)15,000，如高達(dá)20,000個堿基對。
第一核酸序列也可以含有一個以上的缺失，如2個，3個，4個，5個，5個以上的缺失。
另外，從含有在染色體上位于所述第二核酸序列的翻譯起始密碼子上游的例如高達(dá)20,000，如高達(dá)15,000，如高達(dá)10,000，如高達(dá)7500，如高達(dá)5000，如高達(dá)2500，如高達(dá)1000個堿基對的第一核酸序列中，可在任一末端缺失至少10，如至少25，如至少50，如至少100，如200，如至少300，如至少400，如至少500，如至少750，如至少1000，如至少1250，如至少1500，如至少1750，如至少2000，如至少2500，如至少3000，如至少3500，如至少4000，如至少4500個堿基對。
也可在末端或內(nèi)部添加核酸序列。第一核酸序列可含有一個以上的添加，例如2個，如3個，4個，5個，5個以上的添加。可以添加至少10，如至少25，如至少50，如至少100，如200，如至少300，如至少400，如至少500，如至少750，如至少1000，如至少1250，如至少1500，如至少1750，如至少2000，如至少2500，如至少3000，如至少3500，如至少4000，如至少4500，如4500個以上的堿基對。
例如，可以添加能改變第一核酸序列功能的核酸序列。例如，可以添加能被特定轉(zhuǎn)錄因子識別的核酸序列。例如，能被核類固醇激素受體識別的核酸序列。
表3和4給出了優(yōu)選的第一核酸序列的例子。本發(fā)明還包括這些核酸序列的如下文所述的功能同系物以及如上文所述的缺失和/或添加突變體。
表3以2001年5月10日版Blast數(shù)據(jù)庫中登錄號表示的第一核酸序列(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgi？F＝HsBlast.html&&ORG＝Hs)






表4以2000年12月12日組裝的人類基因組瀏覽器中的登錄號表示的第一核酸序列








優(yōu)選第一核酸序列選自pro1，pro2，pro3，pro4，pro5，pro6，pro7，pro8，pro9，pro10，pro12，pro13，pro14，pro15，pro16，pro17，pro18，pro19，pro20，pro21，pro22，pro23，pro24，pro25，pro26，pro27，pro28，pro29，pro30，pro31，pro32，pro34，pro36，pro37，pro38，pro39，pro40，pro41，pro42，pro43，pro44，pro45，pro46，pro47，pro48，pro49，pro50，pro51，pro52，pro53，pro54，pro55，pro56，pro57，pro58，pro59，pro60，pro61，pro62，pro63，pro64，pro65，pro66，pro67，pro68，pro69，pro70，pro71，pro72，pro73，pro74，pro75，pro76，pro77，pro78，pro79，pro80，pro81，pro82，pro83，pro84，pro85，pro86，pro87，pro88，pro89，pro90，pro91，pro92，pro93，pro94，pro95，pro96，pro97，pro98，pro99，pro100，pro101，pro103，pro104，pro105，pro106，pro107，pro108，pro109，pro110，pro111，pro112，pro113，pro114，pro115，pro116，pro117，pro118，pro119，pro120，pro121，pro122，pro123，pro124，pro125，pro126，pro127，pro128，pro129，pro130，pro131，pro133，pro134，pro135，pro136，pro137，pro138，pro139，pro140，pro141，pro142，pro143，pro144，pro145，pro146，pro147，pro148，pro149，pro150，pro152，pro153，pro154，pro155，pro156，pro157，pro158，pro159，pro160，pro161，pro162，pro163，pro164，pro165，pro166，pro167，pro168，pro169，pro171，pro172，pro173，pro174，pro175，pro176，pro177，pro178，pro179，pro180，pro181，pro182，pro183，pro184，pro185，pro187，pro189，pro191，pro193，pro194，pro195，pro196，pro197，pro198，pro199，pro201，pro202，pro203，pro204，pro205，pro206，pro207，pro208，pro209，pro210，pro211，pro212，pro213，pro215，pro216，pro217，pro219，pro220，pro221，pro222，pro223，pro224，pro225，pro226，pro227，pro228，pro229，pro230，pro231，pro232，pro233，pro234，pro235，pro236，pro237，pro238，pro239，pro240，pro241，pro242，pro243，pro244，pro245，pro246，pro247，pro248，pro249，pro250，pro251，pro253，pro254，pro255，pro256，pro257，pro258，pro259，pro260，pro262，pro263，pro264，pro267，pro268，pro269，pro270，pro271，pro272，pro273，pro275，pro277，pro278，pro279，pro280，pro282，pro283，pro284，pro285，pro286，pro287，pro289，pro290，pro291，pro292，pro293，pro294，pro295，pro296，pro297，pro298，pro299，pro300，pro301，pro302，pro303，pro304，pro305，pro306，pro307，pro308，pro309，pro310，pro311，pro312，pro313，pro315，pro316，pro317，pro318，pro319，pro320，pro321，pro322，pro323，pro324，pro326，pro327，pro328，pro329，pro330，pro331，pro332，pro333，pro334，pro335，pro336，pro337，pro338，pro339，pro340，pro341，pro344，pro346，pro347，pro348，pro349，pro352，pro353，pro354，pro355，pro356，pro358，pro359和pro361。
更優(yōu)選第一核酸序列選自pro1，pro2，pro3，pro4，pro5，pro6，pro7，pro8，pro9，pro10，pro12，pro13，pro14，pro15，pro16，pro17，pro18，pro19，pro21，pro22，pro23，pro24，pro25，pro26，pro27，pro28，pro29，pro30，pro31，pro32，pro34，pro36，pro37，pro38，pro39，pro40，pro41，pro42，pro43，pro44，pro45，pro46，pro47，pro48，pro49，pro50，pro51，pro52，pro53，pro54，pro56，pro58，pro59，pro62，pro64，pro65，pro66，pro68，pro69，pro70，pro71，pro72，pro73，pro74，pro75，pro77，pro78，pro81，pro82，pro85，pro86，pro87，pro89，pro90，pro92，pro98，pro103，pro105，pro108，pro120，pro125，pro128，pro130，pro133，pro135，pro136，pro137，pro157，pro184，pro205，pro206，pro207，pro209，pro210，pro211，pro212，pro216，pro217，pro219，pro221，pro227，pro231，pro233，pro241，pro246，pro248，pro249，pro253和pro256。
更優(yōu)選第一核酸序列選自pro1，pro2，pro3，pro4，pro5，pro6，pro7，pro8，pro14，pro15，pro16，pro22，pro23，pro24，pro26，pro27，pro29，pro34，pro37，pro38，pro39，pro40，pro45，pro46，pro48，pro49，pro50，pro52，pro59，pro69，pro71，pro74，pro77，pro86，pro87，pro89，pro184，pro205，pro206，pro207，pro209，pro210，pro211，pro221，pro241，pro246，pro248和pro256。
甚至更優(yōu)選第一核酸序列選自pro2，pro4，pro8，pro14，pro15，pro16，pro22，pro49，pro74，pro86，pro87，pro89，pro205，pro221，pro246。
最優(yōu)選第一核酸序列選自pro221，pro210，pro71，pro41，pro30，pro2，pro209，pro14，pro4，pro8，pro246，pro16，pro27，pro5，pro49，pro19，pro140，pro139，pro207，pro81，pro273和pro362。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列選自pro1，pro2，pro3，pro4，pro5，pro6，pro7，pro8，pro9，pro10，pro12，pro13，pro14，pro15，pro16，pro17，pro18，pro19，pro20，pro21，pro22，pro23，pro24，pro25，pro26，pro27，pro28，pro29，pro30，pro31，pro32，pro34，pro36，pro37，pro38，pro39，pro40，pro41，pro42，pro43，pro44，pro45，pro46，pro47，pro48，pro49，pro50，pro51，pro52，pro53，pro54，pro55，pro56，pro57，pro58，pro59，pro60，pro61，pro62，pro63，pro64，pro65，pro66，pro67，pro68，pro69，pro70，pro71，pro72，pro73，pro74，pro75，pro76，pro77，pro78，pro79，pro80，pro81，pro82，pro83，pro84，pro85，pro86，pro87，pro88，pro89，pro90，pro91，pro92，pro93，pro94，pro95，pro96，pro97，pro98，pro99，pro100，pro101，pro103，pro104，pro105，pro106，pro107，pro108，pro109，pro110，pro111，pro112，pro113，pro114，pro115，pro116，pro117，pro118，pro119，pro120，pro121，pro122，pro123，pro124，pro125，pro126，pro127，pro128，pro129，pro130，pro131，pro133，pro134，pro135，pro136，pro137，pro138，pro139，pro140，pro141，pro142，pro143，pro144，pro145，pro146，pro147，pro148，pro149，pro150，pro152，pro153，pro154，pro155，pro156，pro157，pro158，pro159，pro160，pro161，pro162，pro163，pro164，pro165，pro166，pro167，pro168，pro169，pro171，pro172，pro173，pro174，pro175，pro176，pro177，pro178，pro179，pro180，pro181，pro182，pro183，pro184，pro185，pro187，pro189，pro191，pro193，pro194，pro195，pro196，pro197，pro198，pro199，pro201，pro202，pro203，pro204，pro205，pro206，pro207，pro209，pro210，pro211，pro212，pro213，pro216，pro217，pro219，pro220，pro221，pro222，pro223，pro224，pro225，pro227，pro228，pro229，pro230，pro231，pro233，pro234，pro235，pro236，pro237，pro238，pro239，pro240，pro241，pro242，pro243，pro244，pro245，pro246，pro248，pro249，pro250，pro251，pro253，pro254，pro255，pro256，pro257，pro258，pro259，pro260，pro269，pro278，pro282，pro283，pro284，pro285，pro297，pro315，pro326，pro327，pro328和pro329。
在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro221或其片段或其功能同系物。Pro221是編碼胰島瘤-相關(guān)抗原IA-1，INSM1基因的啟動子。胰島瘤-相關(guān)抗原mRNA以很高水平被所有經(jīng)檢測的SCLC表達(dá)，在腦和腎上腺中僅以很低的水平被表達(dá)。已通過例如芯片分析和RT-PCR闡明表達(dá)(見實(shí)施例1和圖3)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro210或其片段或其功能同系物。Pro210是編碼核纖層蛋白B，LMNB1基因的啟動子。LMNB1 mRNA以很高水平被所有經(jīng)檢測的SCLC表達(dá)，在脾臟、結(jié)腸和肺中僅以很低的水平被表達(dá)。已通過例如芯片分析和RT-PCR闡明LMNB1的表達(dá)(見實(shí)施例1和圖6)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro71或其片段或其功能同系物。Pro71是編碼p16INK4/MTS1，MTS1，細(xì)胞周期蛋白-依賴型激酶抑制劑2A，CDKN2A基因的啟動子。p16INK4/MTS1 mRNA以很高水平被大多數(shù)SCLC表達(dá)，在正常組織中僅以很低的水平被表達(dá)，或根本不表達(dá)。已通過例如芯片分析和RT-PCR闡明LMNB1的表達(dá)(見實(shí)施例1和圖7)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro41或其片段或其功能同系物。Pro41是編碼人MAD2L1，有絲分裂停滯缺損的酵母同系物-樣1基因的啟動子。MAD2L1 mRNA以很高水平被SCLC表達(dá)，以高水平被睪丸表達(dá)，但在其它正常組織中僅以低水平被表達(dá)。已通過例如芯片分析和RT-PCR闡明MAD2L1的表達(dá)(見實(shí)施例1和圖5)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro30或其片段或其功能同系物。Pro30是人KIAA0042基因的啟動子。KIAA0042 RNA以很高水平被大多數(shù)SCLC和正常組織表達(dá)，但在睪丸中僅以低水平被表達(dá)。已通過例如芯片分析和RT-PCR闡明KIAA0042的表達(dá)(見實(shí)施例1和圖4)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro2或其片段或其功能同系物。Pro2是編碼人細(xì)胞周期蛋白-選擇性遍在蛋白載體蛋白UBE2C的人基因的啟動子。UBE2C mRNA以很高水平被大多數(shù)SCLC和正常組織表達(dá)，但在脾臟和睪丸中僅以低水平被表達(dá)。已通過例如芯片分析闡明UBE2C的表達(dá)(見實(shí)施例1)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro209或其片段或其功能同系物。Pro209是編碼核分裂激素，CENPF，著絲粒蛋白F的人基因的啟動子。CENPF mRNA以高水平被大多數(shù)SCLC和正常組織表達(dá)，但在睪丸中僅以低水平被表達(dá)。已通過例如芯片分析闡明CENPF的表達(dá)(見實(shí)施例1)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro14或其片段或其功能同系物。Pro14是人KIAA0101基因的啟動子。KIAA0101 RNA以高水平被大多數(shù)SCLC和正常組織表達(dá)，但在7個組織中僅以低水平被表達(dá)。已通過例如芯片分析闡明KIAA0101的表達(dá)(見實(shí)施例1)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro4或其片段或其功能同系物。Pro4是編碼細(xì)胞周期蛋白基因，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的人基因的啟動子。PCNA mRNA以高水平被大多數(shù)SCLC和正常組織表達(dá)，但在結(jié)腸、脾臟和睪丸中僅以低水平被表達(dá)。已通過例如芯片分析闡明PCNA的表達(dá)(見實(shí)施例1)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro8或其片段或其功能同系物。Pro8是編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶，STK-1，STK12，fms-相關(guān)酪氨酸激酶3的人基因的啟動子。STK-1 mRNA以高水平被SCLC和正常組織表達(dá)，但在結(jié)腸、脾臟和睪丸中僅以低水平被表達(dá)。已通過例如芯片分析闡明STK-1的表達(dá)(見實(shí)施例1)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro246或其片段或其功能同系物。Pro246是編碼Achaete scute同源蛋白，ASH1，ASCL1的人基因的啟動子。ASH1 mRNA以高水平被很多SCLC和正常組織表達(dá)，但在腦中僅以低水平被表達(dá)。已通過例如芯片分析闡明ASH1的表達(dá)(見實(shí)施例1)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro16或其片段或其功能同系物。Pro16是編碼DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα(170kD)，TOP2A的人基因的啟動子。TOP2A mRNA以高水平被SCLC和正常組織表達(dá)，但在9個組織中僅以低水平被表達(dá)，在睪丸中被高水平表達(dá)。已通過例如芯片分析闡明TOP2A的表達(dá)(見實(shí)施例1)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro27或其片段或其功能同系物。Pro27是編碼細(xì)胞周期蛋白B2，CCNB2的人基因的啟動子。細(xì)胞周期蛋白B2 mRNA以高水平被SCLC和正常組織表達(dá)，但在脾臟和氣管中僅以低水平被表達(dá)，在睪丸中被高水平表達(dá)。已通過例如芯片分析闡明細(xì)胞周期蛋白B2的表達(dá)(見實(shí)施例1)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro5或其片段或其功能同系物。Pro5是編碼細(xì)胞周期蛋白B1，CCNB1的人基因的啟動子。細(xì)胞周期蛋白B1 mRNA以高水平被SCLC和正常組織表達(dá)，但在結(jié)腸、脾臟和氣管中僅以低水平被表達(dá)，在睪丸中被高水平表達(dá)。已通過例如芯片分析闡明細(xì)胞周期蛋白B1的表達(dá)(見實(shí)施例1)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro49或其片段或其功能同系物。Pro49是編碼腦垂體腫瘤-轉(zhuǎn)化1，PTTG1的人基因的啟動子。PTTG1 mRNA以高水平被SCLC和正常組織表達(dá)，但在甲狀腺、脾臟和氣管中僅以低水平被表達(dá)，在睪丸中被高水平表達(dá)。已通過例如芯片分析闡明PTTG1的表達(dá)(見實(shí)施例1)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro19或其片段或其功能同系物。Pro19是編碼驅(qū)動蛋白-樣紡錘體蛋白HKSP，KNSL1的人基因的啟動子。KNSL1 mRNA以高水平被SCLC和正常組織表達(dá)，但在結(jié)腸、小腸和睪丸中僅以低水平被表達(dá)。已通過例如芯片分析闡明KNSL1的表達(dá)(見實(shí)施例1)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro140或其片段或其功能同系物。Pro140是編碼cdc2-相關(guān)蛋白激酶，CDK2的人基因的啟動子。CDK2 mRNA以高水平被SCLC和正常組織表達(dá)，以高水平被脾臟表達(dá)。已通過例如芯片分析闡明CDK2的表達(dá)(見實(shí)施例1)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro139或其片段或其功能同系物。Pro139是編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶SAK的人基因的啟動子。SAK mRNA以高水平被大多數(shù)SCLC和正常組織表達(dá)，并以高水平被睪丸表達(dá)。已通過例如芯片分析闡明SAK的表達(dá)(見實(shí)施例1)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro207或其片段或其功能同系物。Pro207是編碼zeste同系物2的增強(qiáng)子(EZH2)的人基因的啟動子。EZH2 mRNA以高水平被SCLC和正常組織表達(dá)，并以高水平被睪丸表達(dá)。已通過例如芯片分析闡明EZH2的表達(dá)(見實(shí)施例1)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro81或其片段或其功能同系物。Pro81是人HSU79266基因的啟動子。HSU79266 RNA以高水平被大多數(shù)SCLC和正常組織表達(dá)，并可被睪丸和脾臟表達(dá)。已通過例如芯片分析闡明HSU79266的表達(dá)(見實(shí)施例1)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro273或其片段或其功能同系物。Pro273是編碼Rad2，瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)-特異性內(nèi)切核酸酶1，F(xiàn)EN1的人基因的啟動子。Rad2 mRNA以高水平被大多數(shù)SCLC和正常組織表達(dá)，但在12個組織中以低水平表達(dá)。已通過例如芯片分析闡明Rad2的表達(dá)(見實(shí)施例1)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列是pro362或其片段或其功能同系物。Pro362是編碼蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物PGP，遍在蛋白羧基末端酯酶L1，遍在蛋白巰基酯酶的人基因的啟動子。PGP mRNA以高水平被大多數(shù)SCLC和正常組織表達(dá)，在腎臟中以低水平表達(dá)，在腦中以高水平表達(dá)。已通過例如芯片分析闡明PGP的表達(dá)(見實(shí)施例1)。
功能同系物本發(fā)明多肽的功能同系物欲包括任何功能相同的多肽序列。例如，細(xì)胞表面分子的功能同系物是與細(xì)胞表面結(jié)合的分子，它能與結(jié)合配對物結(jié)合，優(yōu)選能內(nèi)化結(jié)合配對物。結(jié)合配對物的功能同系物是能與細(xì)胞表面分子結(jié)合，且優(yōu)選能被內(nèi)化至表達(dá)細(xì)胞表面分子的細(xì)胞中的分子。
本發(fā)明的功能同系物包括多肽，其具有的氨基酸序列至少與上文所述的預(yù)定多肽序列共享一些同源性。例如，所述多肽與本文所述的任何預(yù)定多肽序列的同源性至少約為40％，如至少約為50％，如至少約為60％，如至少約為70％，如至少約為75％，如至少約為80％，如至少約為85％，如至少約為90％，如至少約為92％，如至少約為94％，如至少約為95％，如至少約為96％，如至少約為97％，如至少約為98％，如至少約為99％。
可使用眾所周知的算法，例如BLOSUM30，BLOSUM40，BLOSUM45，BLOSUM50，BLOSUM55，BLOSUM60，BLOSUM62，BLOSUM65，BLOSUM70，BLOSUM75，BLOSUM80，BLOSUM85和BLOSUM90中的任一種，來計(jì)算氨基酸序列之間的同源性。
功能同系物可含有用一個氨基酸對任何其它氨基酸進(jìn)行至少一次取代而獲得的氨基酸序列。例如所述取代可以是保守的氨基酸取代，或者是非保守的取代。
保守的氨基酸取代是用預(yù)定氨基酸組內(nèi)的一個氨基酸取代相同組內(nèi)的另一個氨基酸，其中預(yù)定組內(nèi)的氨基酸表現(xiàn)出類似的或基本上類似的特性。在本文所用術(shù)語“保守氨基酸取代”的意思中，具有下列特征的氨基酸組內(nèi)的一個氨基酸可被另一個氨基酸取代i)極性側(cè)鏈(Asp，Glu，Lys，Arg，His，Asn，Gln，Ser，Thr，Tyr和Cys)ii)非-極性側(cè)鏈(Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Trp，Pro和Met)iii)脂肪族側(cè)鏈(Gly，Ala，Val，Leu，Ile)iv)環(huán)側(cè)鏈(Phe，Tyr，Trp，His，Pro)
v)芳香族側(cè)鏈(Phe，Tyr，Trp)vi)酸性側(cè)鏈(Asp，Glu)vii)堿性側(cè)鏈(Lys，Arg，His)viii)酰胺側(cè)鏈(Asn，Gln)ix)羥基側(cè)鏈(Ser，Thr)x)含硫側(cè)鏈(Cys，Met)，和xi)為一氨基-二羧酸或一氨基-一羧基-一酰胺羧酸的氨基酸(Asp，Glu，Asn，Gln)。
非保守取代可以是任何其它取代。導(dǎo)致功能同系物形成的非保守取代可以是例如i)疏水性有實(shí)質(zhì)性差別，如用疏水殘基(Val，Ile，Leu，Phe或Met)取代親水殘基，如Arg，Lys，Trp或Asn，或用親水殘基，如Thr，Ser，His，Gln，Asn，Lys，Asp，Glu或Trp取代疏水殘基；和/或ii)對多肽主鏈方向的作用有實(shí)質(zhì)性差別，如用另一個殘基取代Pro或Gly，或反之；和/或iii)電荷有實(shí)質(zhì)性差別，例如用帶負(fù)電的殘基，如Glu或Asp取代帶正電的殘基，如Lys，His或Arg(以及反之)；和/或iv)空間體積有實(shí)質(zhì)性差別，例如用體積大的殘基，如His，Trp，Phe或Tyr取代具有小側(cè)鏈的殘基，如Ala，Gly或Ser(以及反之)。
本發(fā)明的功能同系物可含有一個以上所述取代，例如2個氨基酸取代，如3或4個氨基酸取代，如5或6個氨基酸取代，如7或8個氨基酸取代，如10至15個氨基酸取代，如15至25個氨基酸取代，如25至30個氨基酸取代，如30至40個氨基酸取代，如40至50個氨基酸取代，如50至75個氨基酸取代，如75至100個氨基酸取代，如100個以上的氨基酸取代。
添加或缺失氨基酸可以是添加或缺失2至5個氨基酸，如5至10個氨基酸，如10至20個氨基酸，如20至50個氨基酸。然而，本發(fā)明還包括添加或缺失50個以上的氨基酸，例如添加50至200個氨基酸。
在一個實(shí)施方案中，包括其任何變體和功能同系物的本發(fā)明多肽含有5個以上氨基酸殘基，如10個以上氨基酸殘基，如20個以上氨基酸殘基，如25個以上氨基酸殘基，如50個以上氨基酸殘基，如75個以上氨基酸殘基，如100個以上氨基酸殘基，如150個以上氨基酸殘基，如200個以上氨基酸殘基。
當(dāng)確定根據(jù)本文所用定義的功能同系物時(shí)，可考慮其它因素。例如，功能同系物應(yīng)能與特異性針對本發(fā)明多肽的抗血清結(jié)合。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有取代氨基酸的功能等同物，所述氨基酸具有的親水指數(shù)為它所取代的氨基酸值的+/-2.5，如+/-2.3，如+/-2.1，如+/-2.0，如+/-1.8，如+/-1.6，如+/-1.5，如+/-1.4，如+/-1.3，如+/-1.2，如+/-1.1，如+/-1.0，如+/-0.9，如+/-0.8，如+/-0.7，如+/-0.6，如+/-0.5，如+/-0.4，如+/-0.3，如+/-0.25，如+/-0.2。
親/疏水氨基酸指數(shù)對賦予蛋白質(zhì)以活性生物學(xué)功能的重要性是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(Kyte & Doolittle，1982和Hopp，美國專利4554101，皆列入本文作為參考)。
本文所用的氨基酸親/疏水指數(shù)值為異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)(Kyte & Doolittle，1982)。
氨基酸親/疏水值為精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)(美國專利4,554,101)。
因此，在一個實(shí)施方案中，可根據(jù)氨基酸的疏水和親水值以及氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性，包括電荷、大小等來進(jìn)行氨基酸取代?？紤]到上述多個不同特征的氨基酸取代的例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
除了本文所述的多肽化合物以外，也可配制空間結(jié)構(gòu)類似的化合物以模擬肽結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵部分，也可以按照與本發(fā)明肽相同的方式使用所述化合物。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的模型建立和化學(xué)設(shè)計(jì)技術(shù)即可完成此目的。例如，可利用酯化和其它烷基化來修飾例如二-精氨酸肽主鏈的氨基末端以模擬四肽結(jié)構(gòu)。應(yīng)懂得所有這些空間結(jié)構(gòu)類似的構(gòu)建體都落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括N-末端被烷基化和C-末端被酯化的肽。功能等同物還包括糖基化的和共價(jià)或聚集的偶聯(lián)物，包括二聚體或不相關(guān)的化學(xué)組成成分。通過利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)連接官能團(tuán)與片段中的基團(tuán)，包括位于N-和C-末端中的任一端或兩端的基團(tuán)，可以制備所述功能等同物。
因此，功能等同物可含有與脂肪族或?；セ螋然┒说孽０?，烷基胺或含有羧基側(cè)鏈的殘基偶聯(lián)的片段，例如與天冬氨酸殘基上的烷基胺的偶聯(lián)物；含羥基殘基的O-?；苌锖桶被┒税被峄蚝被鶜埢腘-酰基衍生物，例如與Met-Leu-Phe的偶聯(lián)物。?；苌镞x自烷基-組成成分的基團(tuán)(包括C3至C10常見烷基)，從而形成多種烷?；?，以及碳環(huán)或雜環(huán)化合物，從而形成多種芳?；??；钚曰鶊F(tuán)優(yōu)選為本來已知可用于通過活性側(cè)鏈基團(tuán)使蛋白質(zhì)與不溶性基質(zhì)交聯(lián)的雙功能化合物。
本發(fā)明范圍內(nèi)的核酸序列同系物是核酸序列，其i)編碼具有類似生物學(xué)功能的RNA和/或蛋白質(zhì)；或ii)能發(fā)揮類似的生物學(xué)作用；且所述核酸序列a)至少50％相同，如至少60％相同，如至少70％相同，如至少75％相同，如至少80％相同，如至少85％相同，如至少90％相同，如至少95％相同；b)或能在嚴(yán)緊條件下與所述核酸序列的互補(bǔ)鏈雜交。
本上下文中的類似生物學(xué)作用是例如核酸序列能以類似于其功能同系物的方式影響與之可操作相連的第二核酸序列的轉(zhuǎn)錄。
本文所用的嚴(yán)緊條件應(yīng)表示如Southern E.M.，1975，J.Mol.Biol.98503-517中描述的Southern印跡和雜交通常使用的嚴(yán)緊度。為了達(dá)到此目的，常規(guī)操作包括預(yù)雜交和雜交步驟。如Sambrook等，1989，“MolecularCloning/A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor(列入本文作為參考)所述，該步驟一般使用含有6×SSPE，5％Denhardt’s，0.5％SDS，50％甲酰胺，100μg/ml變性的鮭睪丸DNA的溶液進(jìn)行(42℃保溫18小時(shí))，接著用2×SSC和0.5％SDS洗滌(室溫和37℃)，并用0.1×SSC和0.5％SDS洗滌(68℃保溫30分鐘)。
核酸序列的同系物還包括含有添加和/或缺失的核酸序列。所述添加和/或缺失可以是內(nèi)部的或位于末端。添加和/或缺失可以是1-5個核苷酸，如5至10個核苷酸，如10至50個核苷酸，如50至100個核苷酸，如至少100個核苷酸。
疫苗在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子可用于制備疫苗。優(yōu)選所述疫苗能產(chǎn)生抗細(xì)胞表面分子的免疫應(yīng)答。所述免疫應(yīng)答優(yōu)選導(dǎo)致特異性殺死表達(dá)所述細(xì)胞表面分子的細(xì)胞。最優(yōu)選表達(dá)細(xì)胞表面分子的細(xì)胞是惡性細(xì)胞，例如疫苗導(dǎo)致特異性殺死惡性細(xì)胞。
因此，疫苗優(yōu)選適用于改善和/或治療和/或預(yù)防性治療前惡性和/或惡性疾病。因此，應(yīng)該優(yōu)選給患有前惡性和/或惡性疾病，優(yōu)選為癌癥的個體施用疫苗。個體可以是任何動物，然而，優(yōu)選個體為人類。
可以使用細(xì)胞表面分子或其片段或其衍生物，以及編碼細(xì)胞表面分子或其片段或其衍生物的核酸。疫苗所使用的優(yōu)選細(xì)胞表面分子是相對于正常組織而言，在體內(nèi)惡性細(xì)胞和/或惡性細(xì)胞系中以較高水平表達(dá)的細(xì)胞表面分子。例如，可根據(jù)上文所述的方法鑒定細(xì)胞表面分子。然而，也可以使用其它適當(dāng)?shù)募?xì)胞表面分子。
優(yōu)選細(xì)胞表面分子含有下述物質(zhì)或基本上由下述物質(zhì)組成，或例如是GRIA2，如LPR8，例如是CHRNA5，如TMEFF，例如是NPTXR，如運(yùn)鐵蛋白受體；如II型膜蛋白克隆例如是HP10481；如II型膜蛋白克隆如HP10390；例如是PG40；如TRC8；例如是TR2-11；如OA3抗原表面決定簇；例如是整聯(lián)蛋白α6，例如GPIIb；如玻連蛋白受體α亞單位；例如是整聯(lián)蛋白α-7；如整聯(lián)蛋白αE前體；例如是整聯(lián)蛋白α6B；如整聯(lián)蛋白α5亞單位；例如是整聯(lián)蛋白β-5亞單位；如整聯(lián)蛋白α-3鏈；例如是RYK；如淀粉樣前體蛋白-結(jié)合蛋白1；例如是推定的跨膜GTP酶；如膜輔因子蛋白；例如GLVR1；例如是Mr110,000抗原，例如是多配體聚糖-1；如推定的有7個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)；例如是LCA-同系物/LAR蛋白；如M6抗原；例如是Me491/CD63抗原；如多跨越膜蛋白；例如是DDR；如自泌活動因子受體；例如是胰島素受體前體；如IGF1R，例如是胰島素-樣生長因子II受體；如SAS；例如是TAPA-1；如MICB；例如是MHC II類HLA-DR7-相關(guān)糖蛋白β-鏈；如HLA-DP；例如是骨小蛋白聚糖I雙糖鏈蛋白聚糖；如CAR；例如是MEA11；如γ-干擾素受體α鏈；例如是多聚免疫球蛋白受體；如metabotropic谷氨酸受體4型；例如是metabotropic谷氨酸受體8；如CLPTM1，例如是MAGE-4b；如MAGE5a；例如是MAGE-3；例如MAGE-1；例如是MAGE6；如MAGE-9；例如是MAGE11；如CD24；例如是CD59；如CD44；例如是低密度脂蛋白受體；如極低密度脂蛋白受體；例如是N-CAM；如核纖層蛋白B受體同系物TM7SF2；例如是推定的T1/ST2受體結(jié)合蛋白前體；如NTR2受體；例如是RAGE-4；如HLA-G1；例如是MOAT-C；如α2δ鈣通道亞單位同種型I；例如是LFA-3；如L1-CAM；例如是AVPR2；如C1 p115 C1；例如是TE2；如RbP；例如是HCF1；如IRAK；例如是CD151；如表面抗原；例如是MAG；如GPR19；例如是pcta-1；如PRAME；例如是加壓素活化的鈣質(zhì)轉(zhuǎn)移受體-樣蛋白；如5-羥色胺受體5-HT4B；例如是5-羥色胺1D受體(5-HT1D～)；如CD9；例如是LDL受體成員LR3；如DR6；例如是腫瘤壞死因子受體；如HG38；例如是尿激酶型纖溶酶受體；如FGF受體；例如是神經(jīng)生長因子受體；如胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；例如是CB1大麻素受體(CNR1)；如PSG；例如是PSG13’；如CPE-受體；例如是CRH2R；如OCI5；例如是TRAIL受體2；如HNMP-1；例如是腎α-2-腎上腺素能受體；如紅細(xì)胞生成素受體；例如是硫酸軟骨素蛋白聚糖多能聚糖V1；例如是mGluR1β；如CD97；例如是L6；如NY-ESO-1；例如是T-細(xì)胞受體αδ；如ror1；例如是ror2；如SSTR2；例如是VESPR；如IgG Fc受體；例如是谷氨酸受體亞單位GluRC；如HEK2；例如是PVR；如CEA；例如是CC-趨化因子-結(jié)合受體JAB61；如HER2；例如是HER3；如類似于表皮生長因子受體-相關(guān)蛋白的假擬蛋白FLJ22357；例如是推定的B-型內(nèi)皮肽受體-樣蛋白；如GLVR2；例如是P2X4嘌呤受體；如FPRL1；例如是心房利鈉肽清除受體；例如是胃泌素/CCK-B受體；如神經(jīng)調(diào)節(jié)肽B受體；例如是GFRA3；如GRPR；例如是CDH1；如CDH2；例如是TGFBR1；如TGFBR2；例如是TGFBR3；如表皮生長因子受體的前體。
更優(yōu)選細(xì)胞表面分子選自NCAM1，NPTXR，LRP8，CHRNA5，GRIA2，GRM8，ITGAV，ITGAE，TNFRSF12，L1CAM，GPR49和TMEFF1。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，疫苗還含有與所述細(xì)胞表面分子共價(jià)連接的非-自身抗原?；蛘?，當(dāng)使用編碼細(xì)胞表面分子的核酸序列時(shí)，疫苗可含有與該核酸序列連接的、編碼非-自身抗原的第二核酸序列。
可用于本發(fā)明的非-自身抗原的例子是T-細(xì)胞表位，優(yōu)選為多肽或肽。
疫苗也可以含有一種以上的抗原，如2種，3種，4種，5種，5種以上不同的抗原。抗原可以是自身抗原或非-自身抗原。
本發(fā)明的疫苗可進(jìn)一步含有佐劑和/或載體。載體或佐劑可以是本領(lǐng)域已知的任何載體或佐劑，包括其功能等同物。當(dāng)在類似的條件下使用時(shí)，功能等同的載體能以基本上相同的空間構(gòu)象呈遞相同的抗原。當(dāng)在類似的條件下使用時(shí)，功能等同的佐劑能使組合物的效力有類似的增加。
優(yōu)選所述組合物含有有效的無毒佐劑作為一組優(yōu)選佐劑，所述佐劑可增強(qiáng)和/或調(diào)制免疫原決定簇，包括抗原決定簇，包括半抗原決定簇的免疫原性。另外，優(yōu)選所述佐劑能引發(fā)較早的、更有效的、或時(shí)間更長的免疫應(yīng)答。在抗原供給有限或抗原制備花費(fèi)較大時(shí)，所述佐劑也是有用的。
可根據(jù)其來源將與本發(fā)明有關(guān)的佐劑分組，它可以是礦物質(zhì)、細(xì)菌、植物、合成的或宿主產(chǎn)物。根據(jù)此分類的第一組是礦物佐劑，如鋁化合物。被鋁鹽沉淀的抗原，或混合或吸附于所施用的鋁化合物的抗原被廣泛用于在動物和人中增強(qiáng)免疫應(yīng)答。已闡明在免疫7天后，兔的局部淋巴結(jié)中仍有鋁顆粒，這一類佐劑的另一個顯著功能是將抗原導(dǎo)向淋巴結(jié)自身含T細(xì)胞的區(qū)域。已證實(shí)佐劑效力與引流淋巴結(jié)的暗示有關(guān)。盡管很多研究已證實(shí)與鋁鹽一起施用的抗原能導(dǎo)致體液免疫增加，但通過延遲型超敏反應(yīng)測定，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫僅略有增加。據(jù)報(bào)道氫氧化鋁可以活化補(bǔ)體途徑。該機(jī)制在局部炎癥反應(yīng)以及免疫球蛋白產(chǎn)生和B細(xì)胞記憶方面起作用。另外，氫氧化鋁可保護(hù)抗原，使其免被分解代謝。主要由于其極佳的安全性記錄，鋁化合物是目前唯一用于人的佐劑。
另一大組佐劑是來源于細(xì)菌的佐劑?？梢约兓秃铣蓙碓从诩?xì)菌的佐劑(如胞壁酰二肽，脂質(zhì)A)，已克隆出宿主介質(zhì)(白細(xì)胞介素1和2)。最近十年來，在化學(xué)純化以下幾種細(xì)菌來源的活性組分佐劑方面取得了顯著進(jìn)步百日咳桿菌、結(jié)核分枝桿菌、脂多糖、弗氏完全佐劑(FCA)和弗氏不完全佐劑(Difco Laboratories，Detroit，Mich.)和Merck佐劑65(Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.)。本發(fā)明的其它適當(dāng)佐劑是例如Titermax Classical佐劑(SIGMA-ALDRICH)、ISCOMS、Quil A、ALUN(參見美國專利58767和5554372)、脂質(zhì)A衍生物、霍亂毒素衍生物、HSP衍生物、LPS衍生物、合成肽基質(zhì)、GMDP等，以及與免疫刺激劑混合(美國專利5876735)。
百日咳桿菌能通過對T-淋巴細(xì)胞群體發(fā)揮作用來調(diào)制細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫力，因此，在本發(fā)明的上下文中，它是一種令人感興趣的佐劑。對于脂多糖和弗氏完全佐劑而言，已鑒定和合成出佐劑的活性組成成分，可借此研究結(jié)構(gòu)-功能之間的關(guān)系。本發(fā)明的免疫原性組合物中也包括這些組成成分。
已發(fā)現(xiàn)脂多糖及其多種衍生物(包括脂質(zhì)A)與脂質(zhì)體或其它脂質(zhì)乳劑混合，成為強(qiáng)有力的佐劑。仍不能確定是否可制備出一般可用于人的、毒性足夠低的衍生物。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室研究的標(biāo)準(zhǔn)是弗氏完全佐劑。
為了保護(hù)抗原使其免遭分解代謝，可以在疫苗制劑中添加礦物油。
在本發(fā)明的免疫原性組合物中，可將多種其它類型的物質(zhì)用作佐劑。它們包括如皂苷等植物產(chǎn)物，如殼多糖等動物產(chǎn)物和多種合成化合物。
也可通過其打算采用的作用機(jī)制對本發(fā)明的佐劑進(jìn)行分類。這種類型的分類必須有點(diǎn)隨意，因?yàn)榇蠖鄶?shù)佐劑似乎通過一種以上的機(jī)制在起作用。佐劑可通過抗原定位和傳遞，或通過對構(gòu)成免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞直接起作用來發(fā)揮作用。本發(fā)明的佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答所用的其它機(jī)制是通過產(chǎn)生抗原倉庫(depot)。這似乎對鋁化合物、油乳劑、脂質(zhì)體和合成聚合物的佐劑活性有貢獻(xiàn)。脂多糖和胞壁酰二肽的佐劑活性似乎主要是通過激活巨噬細(xì)胞來介導(dǎo)的，而百日咳桿菌對巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞都有影響。美國專利5554372舉例描述了當(dāng)摻入本發(fā)明的免疫原性組合物中時(shí)可發(fā)揮作用的其它佐劑。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的佐劑選自鋁化合物、弗氏不完全佐劑、Titermax經(jīng)典佐劑和油乳劑。
本發(fā)明還提供了一個實(shí)施方案，其中免疫原性組合物進(jìn)一步含有載體。載體可獨(dú)立于佐劑存在。偶聯(lián)和/或共-免疫抗原和載體的目的是例如增加抗原的分子量以增加抗原的活性或免疫原性，賦予抗原穩(wěn)定性，增加決定簇的生物活性，或增加其血清半壽期。載體蛋白可以是任何常規(guī)的載體，包括任何適用于呈遞抗原的蛋白質(zhì)。常規(guī)的載體蛋白包括但不限于匙孔嘁血藍(lán)蛋白，血清蛋白，如運(yùn)鐵蛋白，牛血清白蛋白或人血清白蛋白，卵白蛋白，免疫球蛋白或激素，如胰島素。
盡管本發(fā)明的疫苗可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)藥物載體，但藥物載體的類型將根據(jù)給藥模式和是否需要持續(xù)釋放給藥而改變。對于非腸道給藥，如皮下注射而言，藥物載體可以含有例如水、鹽水、乙醇、脂肪、蠟或緩沖液。生物可降解的微球體(如polylactic galactide)也可用作本發(fā)明藥物組合物的藥物載體。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，疫苗包括使用樹突狀細(xì)胞。所述實(shí)施方案優(yōu)選含有下述步驟i)提供樹突狀細(xì)胞；和ii)將編碼本發(fā)明的細(xì)胞表面分子、且與介導(dǎo)其表達(dá)的第二核酸序列可操作相連的核酸序列轉(zhuǎn)移至樹突狀細(xì)胞，或?qū)⒓?xì)胞表面分子或其片段轉(zhuǎn)移至樹突狀細(xì)胞；和iii)在樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞表面展示所述細(xì)胞表面分子或其片段；和iv)將所述樹突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)移至待治療的個體。
優(yōu)選樹突狀細(xì)胞是得自待治療個體的細(xì)胞，然而，樹突狀細(xì)胞也可以得自另一個個體。當(dāng)樹突狀細(xì)胞得自另一個個體時(shí)，優(yōu)選細(xì)胞得自與待治療的個體相同的物種。例如，如果待治療的個體是人，優(yōu)選樹突狀細(xì)胞也得自人。
優(yōu)選以片段的形式在細(xì)胞表面展示細(xì)胞表面分子，對MHC分子而言，所述片段為肽片段。
藥物靶也可將細(xì)胞表面分子用作藥物靶，所述細(xì)胞表面分子能與結(jié)合配對物結(jié)合，并將所述結(jié)合配對物內(nèi)化至表達(dá)所述細(xì)胞表面分子的細(xì)胞中。優(yōu)選所述細(xì)胞表面分子以不同的水平在惡性細(xì)胞系和正常組織中表達(dá)。更優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明所述方法鑒定細(xì)胞表面分子。
更優(yōu)選細(xì)胞表面分子含有下述物質(zhì)或基本上由下述物質(zhì)組成，或例如是GRIA2，如LPR8，例如是CHRNA5，如TMEFF，例如是NPTXR，如運(yùn)鐵蛋白受體；如II型膜蛋白克隆例如是HP10481；如II型膜蛋白克隆如HP10390；例如是PG40；如TRC8；例如是TR2-11；如OA3抗原表面決定簇；例如是整聯(lián)蛋白α6，例如GPIIb；如玻連蛋白受體α亞單位；例如是整聯(lián)蛋白α-7；如整聯(lián)蛋白αE前體；例如是整聯(lián)蛋白α6B；如整聯(lián)蛋白α5亞單位；例如是整聯(lián)蛋白β-5亞單位；如整聯(lián)蛋白α-3鏈；例如是RYK；如淀粉樣前體蛋白-結(jié)合蛋白1；例如是推定的跨膜GTP酶；如膜輔因子蛋白；例如GLVR1；例如是Mr110,000抗原，例如是多配體聚糖-1；如推定的有7個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)；例如是LCA-同系物/LAR蛋白；如M6抗原；例如是Me491/CD63抗原；如多跨越膜蛋白；例如是DDR；如自泌活動因子受體；例如是胰島素受體前體；如IGF1R，例如是胰島素-樣生長因子II受體；如SAS；例如是TAPA-1；如MICB；例如是MHC II類HLA-DR7-相關(guān)糖蛋白β-鏈；如HLA-DP；例如是骨小蛋白聚糖I雙糖鏈蛋白聚糖；如CAR；例如是MEA11；如γ-干擾素受體α鏈；例如是多聚免疫球蛋白受體；如metabotropic谷氨酸受體4型；例如是metabotropic谷氨酸受體8；如CLPTM1，例如是MAGE-4b；如MAGE5a；例如是MAGE-3；例如MAGE-1；例如是MAGE6；如MAGE-9；例如是MAGE11；如CD24；例如是CD59；如CD44；例如是低密度脂蛋白受體；如極低密度脂蛋白受體；例如是N-CAM；如核纖層蛋白B受體同系物TM7SF2；例如是推定的T1/ST2受體結(jié)合蛋白前體；如NTR2受體；例如是RAGE-4；如HLA-G1；例如是MOAT-C；如α2δ鈣通道亞單位同種型I；例如是LFA-3；如L1-CAM；例如是AVPR2；如C1 p115 C1；例如是TE2；如RbP；例如是HCF1；如IRAK；例如是CD151；如表面抗原；例如是MAG；如GPR19；例如是pcta-1；如PRAME；例如是加壓素活化的鈣質(zhì)轉(zhuǎn)移受體-樣蛋白；如5-羥色胺受體5-HT4B；例如是5-羥色胺1D受體(5-HT1D～)；如CD9；例如是LDL受體成員LR3；如DR6；例如是腫瘤壞死因子受體；如HG38；例如是尿激酶型纖溶酶受體；如FGF受體；例如是神經(jīng)生長因子受體；如胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；例如是CB1大麻素受體(CNR1)；如PSG；例如是PSG13’；如CPE-受體；例如是CRH2R；如OCI5；例如是TRAIL受體2；如HNMP-1；例如是腎α-2-腎上腺素能受體；如紅細(xì)胞生成素受體；例如是硫酸軟骨素蛋白聚糖多能聚糖V1；例如是mGluR1β；如CD97；例如是L6；如NY-ESO-1；例如是T-細(xì)胞受體αδ；如ror1；例如是ror2；如SSTR2；例如是VESPR；如IgG Fc受體；例如是谷氨酸受體亞單位GluRC；如HEK2；例如是PVR；如CEA；例如是CC-趨化因子-結(jié)合受體JAB61；如HER2；例如是HER3；如類似于表皮生長因子受體-相關(guān)蛋白的假擬蛋白FLJ22357；例如是推定的B-型內(nèi)皮肽受體-樣蛋白；如GLVR2；例如是P2X4嘌呤受體；如FPRL1；例如是心房利鈉肽清除受體；例如是胃泌素/CCK-B受體；如神經(jīng)調(diào)節(jié)肽B受體；例如是GFRA3；如GRPR；例如是CDH1；如CDH2；例如是TGFBR1；如TGFBR2；例如是TGFBR3；如表皮生長因子受體的前體。
更優(yōu)選細(xì)胞表面分子選自NCAM1，NPTXR，LRP8，CHRNA5，GRIA2，GRM8，ITGAV，ITGAE，TNFRSF12，L1CAM，GPR49和TMEFF1。
本發(fā)明范圍內(nèi)的藥物靶是分子，它可用作誘餌以鑒定與藥物靶結(jié)合的分子，因此是潛在的候選藥物。當(dāng)相應(yīng)配制時(shí)，所述藥物可特別用于治療前惡性和/或惡性疾病。
本發(fā)明還涉及鑒定新藥物靶的方法，所述藥物靶可與本發(fā)明的結(jié)合配對物相互作用(見下文)。
優(yōu)選所述新藥物靶含有多肽，該多肽是以不同水平在惡性細(xì)胞和正常細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞表面分子。
另外，本發(fā)明還涉及通過上述方法鑒定的新藥物靶。
鑒定結(jié)合配對物的方法本發(fā)明還提供了鑒定特異性結(jié)合配對物的方法。另外，本發(fā)明提供了制備特異性結(jié)合配對物的方法。
可通過多種不同的方法鑒定/制備特異性結(jié)合配對物。根據(jù)特定的實(shí)施方案，本發(fā)明可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)方法。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，通過制備特異性抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法來制備結(jié)合配對物。例如，所述方法包括下述步驟i)用所述細(xì)胞表面分子或所述細(xì)胞表面分子的片段免疫動物；和ii)從所述動物中獲得抗體；或iii)從所述動物中獲得產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，并從所述細(xì)胞中獲得抗體。
被免疫的動物可以是任何動物，優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選動物選自兔、小鼠、大鼠、驢、山羊和綿羊。
抗體優(yōu)選得自免疫動物的血清?？赏ㄟ^任何標(biāo)準(zhǔn)方法，例如通過親和層析純化抗體。如此獲得的抗體優(yōu)選為多克隆抗體。
產(chǎn)生抗體的細(xì)胞優(yōu)選得自免疫動物的脾臟，優(yōu)選細(xì)胞是B-細(xì)胞。從動物中純化出產(chǎn)生抗體的細(xì)胞之后，可使該細(xì)胞與其它細(xì)胞融合以獲得無限增殖化細(xì)胞?？稍隗w外培養(yǎng)細(xì)胞，通過任何標(biāo)準(zhǔn)方法，如親和層析或A蛋白或G蛋白層析，從組織培養(yǎng)上清液中回收抗體。這些抗體通常是單克隆抗體。
隨后，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)方法使抗體人源化。
然而，也可通過其它方法制備或鑒定抗體。例如，可從包括人的任何適當(dāng)動物中純化天然抗體?？贵w也可得自表達(dá)文庫(見下文)。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，結(jié)合配對物由多肽組成，或含有多肽，通過篩選表達(dá)文庫可鑒定所述多肽。本發(fā)明可以使用任何適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)文庫。
文庫可包含在任何適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，例如，宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。文庫可含有編碼得自任何物種，例如病毒、細(xì)菌、酵母、真菌、植物或動物的多肽和/或寡肽的核酸序列。動物可以是任何動物，優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選為人。文庫也可含有編碼合成和非天然多肽和/或寡肽的核酸序列。核酸序列可包含在任何適當(dāng)?shù)妮d體中，所述載體如質(zhì)粒、病毒、病毒衍生的載體、噬菌體、人工染色體或粘粒。
例如，結(jié)合配對物可選自表達(dá)多肽和/或寡肽的表達(dá)文庫。它們也可選自表達(dá)多肽和/或寡肽的合成組合文庫。
通過篩選抗體的噬菌體展示文庫，可進(jìn)一步鑒定結(jié)合配對物。優(yōu)選噬菌體展示文庫是人抗體文庫。
在另一個實(shí)施方案中，結(jié)合配對物選自小化合物文庫。所述文庫可含有任何數(shù)目的、可通過多種不同反應(yīng)制備的不同化合物。適當(dāng)?shù)奈膸欤缃M合文庫是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
一旦鑒定/制備出可與細(xì)胞表面分子或細(xì)胞表面分子的片段結(jié)合的特異性結(jié)合配對物，應(yīng)優(yōu)選檢測該結(jié)合配對物被內(nèi)化的能力。根據(jù)結(jié)合配對物的性質(zhì)，可以使用多種適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行所述檢測。
例如，可使結(jié)合配對物與表達(dá)能同結(jié)合配對物結(jié)合的細(xì)胞表面分子或其片段的細(xì)胞一起保溫。保溫之后，可檢測細(xì)胞內(nèi)部結(jié)合配對物的存在和/或缺乏。例如，可利用結(jié)合配對物可能已被直接或間接可測的標(biāo)記物標(biāo)記來進(jìn)行檢測。或者，使用可與結(jié)合配對物特異性相互作用的第一類物質(zhì)來測定結(jié)合配對物的存在。所述物質(zhì)可被直接或間接標(biāo)記，或者可使用第二類物質(zhì)檢測第一類物質(zhì)，所述第二類物質(zhì)可與第一類物質(zhì)特異性相互作用，并且可被標(biāo)記。可以使用能與第二類物質(zhì)相互作用的第三類物質(zhì)，能與第三類物質(zhì)相互作用的第四類物質(zhì)，依此類推。
結(jié)合配對物本發(fā)明的特異性結(jié)合配對物能與至少一種細(xì)胞表面分子相互作用。然而，特異性結(jié)合配對物能與一種以上不同的細(xì)胞表面分子結(jié)合。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，結(jié)合配對物優(yōu)選為在與細(xì)胞表面分子結(jié)合之后，能被內(nèi)化至表達(dá)細(xì)胞表面分子的細(xì)胞中的結(jié)合配對物。
可通過上文所述的任何方法鑒定本發(fā)明的結(jié)合配對物。然而，也可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它方法來鑒定結(jié)合配對物。
優(yōu)選本發(fā)明的結(jié)合配對物能與一種或多種細(xì)胞表面分子結(jié)合，所述分子選自屬于下列組之一的受體受體酪氨酸激酶成員整聯(lián)蛋白家族成員免疫球蛋白超家族粘附分子成員硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族成員硫酸軟骨素蛋白聚糖家族成員MAGE家族成員RAGE家族成員低密度脂蛋白受體家族成員鈣粘蛋白粘附分子成員metabotropic谷氨酸受體成員類固醇激素家族成員7跨膜受體家族成員心房利鈉肽清除受體GFRA3運(yùn)鐵蛋白受體絲氨酸/蘇氨酸激酶受體成員更優(yōu)選本發(fā)明的結(jié)合配對物能與一種或多種選自下列的細(xì)胞表面分子結(jié)合NCAM1，NPTXR，LRP8，CHRNA5，GRIA2，GRM8，ITGAV，ITGAE，TNFRSF12，L1CAM，GPR49和TMEFF1。
更優(yōu)選結(jié)合配對物可與細(xì)胞表面分子的一個或多個片段結(jié)合。上文列出了細(xì)胞表面分子的優(yōu)選片段。最優(yōu)選細(xì)胞表面分子的片段得自細(xì)胞表面分子的胞外部分。
優(yōu)選將本發(fā)明的結(jié)合配對物用于藥物組合物以治療前惡性和/或惡性疾病。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，結(jié)合配對物含有多肽或寡肽，或基本上由多肽或寡肽組成。本發(fā)明的多肽和/或寡肽可以是天然的，或者是合成的多肽。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)合配對物是抗體或抗體的片段。抗體可以是多克隆抗體或其結(jié)合片段，或者是單克隆抗體或其結(jié)合片段。
抗體可以得自動物，優(yōu)選得自哺乳動物，更優(yōu)選得自選自大鼠、兔、小鼠、人、驢、山羊和綿羊等哺乳動物。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合配對物是得自小鼠或大鼠的單克隆抗體，例如結(jié)合配對物是鼠單克隆抗體。
然而，抗體也可以是組合抗體，例如抗體的一部分可得自一個物種，其它部分可得自另一個物種。另外，抗體可以是非天然產(chǎn)生的合成抗體。
為了多個目的，優(yōu)選抗體是人源化抗體。特別是，如果結(jié)合配對物應(yīng)被用于治療人的前惡性和/或惡性疾病，則需要抗體是人源化抗體。
抗體也可以是人抗體。人抗體可以是天然產(chǎn)生的人抗體，或者是從噬菌體展示文庫中鑒定出的抗體。另外，抗體可以是還含有人抗體部分的組合抗體，例如從組合文庫中鑒定出的抗體。所述抗體無需進(jìn)一步人源化。
抗體優(yōu)選與細(xì)胞表面分子的胞外部分(見下文)相互作用?？贵w也可與細(xì)胞表面分子胞外部分的翻譯后修飾產(chǎn)物結(jié)合?；蛘撸贵w可與上文所述的細(xì)胞表面分子的任何片段相互作用。
最優(yōu)選抗體能通過與所述細(xì)胞表面分子結(jié)合而被內(nèi)化。很多種與細(xì)胞表面分子結(jié)合的抗體不能通過結(jié)合而被內(nèi)化至表達(dá)細(xì)胞表面分子的細(xì)胞中。本發(fā)明范圍內(nèi)的優(yōu)選抗體是在結(jié)合之后能被內(nèi)化至表達(dá)細(xì)胞表面分子的細(xì)胞中的抗體。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，結(jié)合配對物是所述細(xì)胞表面分子的天然配體。天然配體是化合物，它在天然條件下可與細(xì)胞表面分子結(jié)合。天然配體可以選自例如多肽、寡肽、激素、脂質(zhì)、糖類、氨基酸、神經(jīng)遞質(zhì)、核苷酸、核苷以及它們的組合。
激素可以是例如類固醇激素。類固醇激素可選自雄激素、雌激素、孕激素和腎上腺皮質(zhì)素。
雄激素可以選自例如睪酮、雙氫睪酮、雄烯二醇、雄烯二酮、脫氫表雄酮(DHEA)、脫氫表雄酮硫酸酯(DHEA-S)及其衍生物。
雌激素可以選自例如estrion、雌二醇、雌三醇及其衍生物。
可通過適用于本實(shí)施方案之配體的任何常規(guī)技術(shù)，從包括人的動物中純化天然配體。然而，也可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，在體外產(chǎn)生天然配體。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，結(jié)合配對物是重組產(chǎn)生的、所述細(xì)胞表面分子的配體。如果配體是多肽或寡肽，通過用編碼配體的核酸序列轉(zhuǎn)化適當(dāng)宿主，如細(xì)菌、酵母、原生動物、哺乳動物等動物、植物、動物細(xì)胞或植物細(xì)胞即可產(chǎn)生配體，所述核酸序列與介導(dǎo)該核酸序列在特定宿主中轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的核酸序列可操作相連。根據(jù)任何常規(guī)技術(shù)可進(jìn)行轉(zhuǎn)化。隨后，可根據(jù)任何常規(guī)方法純化配體。
在另一個實(shí)施方案中，結(jié)合配對物是病毒蛋白質(zhì)，或者含有病毒蛋白質(zhì)或其片段。多種病毒蛋白質(zhì)能與細(xì)胞表面分子結(jié)合。所述結(jié)合經(jīng)常導(dǎo)致病毒顆粒的內(nèi)化，因此，病毒蛋白質(zhì)是本發(fā)明的適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合配對物。
優(yōu)選病毒蛋白質(zhì)是病毒衣殼蛋白，更優(yōu)選病毒衣殼蛋白能被內(nèi)化至表達(dá)細(xì)胞表面分子的細(xì)胞中。
病毒蛋白質(zhì)可得自任何病毒，優(yōu)選為能感染天然表達(dá)細(xì)胞表面分子的細(xì)胞的病毒。病毒可以選自例如腺病毒、單純皰疹病毒、流感病毒和慢病毒家族的成員。
結(jié)合配對物可以重組產(chǎn)生(見上文)，并含有病毒衣殼蛋白序列。優(yōu)選病毒衣殼蛋白序列是能與細(xì)胞表面分子結(jié)合并導(dǎo)致內(nèi)化的病毒蛋白質(zhì)的序列。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，結(jié)合配對物是小化合物。所述小化合物通常是合成產(chǎn)生的?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法或方法的組合來制備所述化合物。
優(yōu)選的小化合物可與上文所述的細(xì)胞表面分子和/或細(xì)胞表面分子片段相互作用。更優(yōu)選小化合物能被內(nèi)化至表達(dá)所述細(xì)胞表面分子的細(xì)胞中。
在一個實(shí)施方案中，結(jié)合配對物可以是選自下列的多肽EGF，TGF-α，TGF-β，雙調(diào)蛋白，HB-EGF，epiregulin，β-動物纖維素，IGF-1，IGF-2，膠原，纖連蛋白，玻連蛋白，層粘連蛋白，淀粉樣β-蛋白前體，γ干擾素，運(yùn)鐵蛋白，自泌活動因子，L1，NCAM，鈣粘蛋白，鈴蟾肽，神經(jīng)調(diào)節(jié)肽B，TNF，紅細(xì)胞生成素，白介素和縮膽囊肽B。另外，結(jié)合配對物可以是例如選自大麻素，乙酰膽堿，多巴胺，皮質(zhì)去甲腎上腺素(norepihrine)，5-羥色胺和GABA的有機(jī)化合物。另外，結(jié)合配對物可以是例如選自甲?；暮托姆坷c肽的寡肽。另外，結(jié)合配對物可以是例如氨基酸，結(jié)合配對物可以是任何氨基酸，優(yōu)選氨基酸選自谷氨酸，甘氨酸和組胺。另外，結(jié)合配對物可以是例如選自ATP和GTP的核苷酸。另外，結(jié)合配對物可以是激素，如雌激素，脂質(zhì)或糖類。
另外，本發(fā)明的結(jié)合配對物可選自EGF，TGF-α，遺傳調(diào)節(jié)蛋白(heregulin)，胰島素，IGF-1，PDGF，CSF-1，SCF，F(xiàn)lt-3L，VEGF，F(xiàn)GFs1-9，NGF，BDNF，NT-3，NT-4，HGF，MSP，Gas6，血管生成素-1，ephrinA1-5，ephrinB1-3，GDNF，PEPHC1，TGF-β，血管緊張肽，凝血酶，腺嘌呤核苷，腎上腺素，5-羥色胺，δ啡肽，多巴胺，PTH，促胰液素，VIP，PACAP，胰高血糖素，CRF，鈴蟾肽，緩激肽，NPY，谷氨酸，Ca2+，GABA，趨化因子和阿片樣物質(zhì)。
更優(yōu)選結(jié)合配對物選自L-谷氨酸，紅藻氨酸鹽(kainite)，5-(溴甲基)-4-異噁唑丙酸()，谷氨酸類似物，取代的喹喔啉2，3二酮，GYKI52466，5-I-尿嘧啶丙氨酸(Willardine)，5-F-尿嘧啶丙氨酸，AMPA((RS)-α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸)的激動劑和拮抗劑配體，NBQX，CNQX，DNQX，GYKI52466，6-氯代犬尿喹啉酸，JSTX，L-APA，L-SOP，ACPT，(R，S)-PPG，CPPG，MAP4，(S)-3，4-DCPG，玻連蛋白，cytactin，纖連蛋白，血纖蛋白原，層粘連蛋白，MMP-2，骨橋蛋白，凝血酶原，血小板反應(yīng)蛋白，vonWillebrandts因子，L1CAM的重組片段，青霉素N(salmosin)，E-鈣粘蛋白及其肽，包括肽NRDKETKV，NCAM1結(jié)構(gòu)域IgI+II，NCAM1結(jié)構(gòu)域IgIII及其肽，肽C3ASKKPKRNIKA(SEQ ID NO305)，D3AKKERQRKD TU(SEQID NO306)，D4ARALNWGAKP(SEQ ID NO307)，單克隆抗體123C3，NPTX1，NPTX2，泰攀蛇毒素，TCBP49，Oxynor，ApoE2，ApoE3，ApoE4，ApoE的肽(E(141；-155)2；LRKLRKRLLRDADDL(SEQ ID NO308)及其串聯(lián)序列E(141；-155)2；LRKLRKRLLRDADDL-LRKLRKRLLRDADDL(SEQ ID NO308串聯(lián)序列))，reelin，煙堿，乙酰膽堿，α-銀環(huán)蛇毒素和卡巴膽堿(carbachol)。
應(yīng)根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方案中使用的細(xì)胞表面分子選擇本發(fā)明的結(jié)合配對物。
因此，在細(xì)胞表面分子能內(nèi)化結(jié)合配對物或靶向復(fù)合物的本發(fā)明實(shí)施方案中，優(yōu)選結(jié)合配對物選自NCAM1結(jié)構(gòu)域IgI+II，NCAM1結(jié)構(gòu)域IgIII及其肽，肽C3ASKKPKRNIKA(SEQ ID NO305)，D3AKKERQRKDTU(SEQID NO306)，D4ARALNWGAKP(SEQ ID NO307)，單克隆抗體123C3，NPTX1，NPTX2，泰攀蛇毒素，TCBP49，Oxynor，ApoE2，ApoE3，ApoE4，ApoE的肽(E(141；-155)2；LRKLRKRLLRDADDL(SEQ ID NO308)及其串聯(lián)序列E(141；-155)2；LRKLRKRLLRDADDL-LRKLRKRLLRDADDL(SEQ ID NO308串聯(lián)序列))，reelin，煙堿，乙酰膽堿，α-銀環(huán)蛇毒素，卡巴膽堿和抗所述細(xì)胞表面分子的特異性內(nèi)化抗體。
在細(xì)胞表面分子不能內(nèi)化結(jié)合配對物或靶向復(fù)合物的本發(fā)明實(shí)施方案中，優(yōu)選結(jié)合配對物選自L-谷氨酸，紅藻氨酸鹽，5-(溴甲基)-4-異噁唑丙酸()，谷氨酸類似物，取代的喹喔啉2，3二酮，GYKI52466，5-I-尿嘧啶丙氨酸，5-F-尿嘧啶丙氨酸，AMPA((RS)-α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸)的激動劑和拮抗劑配體，NBQX，CNQX，DNQX，GYKI 52466，6-氯代犬尿喹啉酸，JSTX，L-APA，L-SOP，ACPT，(R，S)-PPG，CPPG，MAP4，(S)-3，4-DCPG，玻連蛋白，cytactin，纖連蛋白，血纖蛋白原，層粘連蛋白，MMP-2，骨橋蛋白，凝血酶原，血小板反應(yīng)蛋白，von Willebrandts因子，L1CAM的重組片段，青霉素N，E-鈣粘蛋白及其肽，包括肽NRDKETKV(SEQ ID NO309)和抗所述細(xì)胞表面分子的特異性抗體。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的一個實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子是NCAM1。當(dāng)細(xì)胞表面分子是NCAM1時(shí)，優(yōu)選結(jié)合配對物選自NCAM1的第一和第二免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(Ig)(Kiselyov等，1997)，NCAM1的第三Ig結(jié)構(gòu)域，粘附分子L1和蛋白聚糖。另外，優(yōu)選結(jié)合配對物選自能與NCAM結(jié)合的合成結(jié)合配對物，包括例如從組合肽文庫中鑒定出的多種肽(11個氨基酸)(Rφnn等，1999)，包括例如C3ASKKPKRNIKA(SEQ ID NO305)，D3AKKERQRKDTU(SEQID NO306)和D4ARALNWGAKP(SEQ ID NO307)(Rφnn等，1999)。另外，優(yōu)選結(jié)合配對物選自抗NCAM1的抗體，優(yōu)選為抗NCAM1的單克隆抗體，例如導(dǎo)致內(nèi)化的抗體(123C3)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子是NPTXR。當(dāng)細(xì)胞表面分子是NPTXR時(shí)，優(yōu)選結(jié)合配對物選自神經(jīng)元正五聚蛋白1(NP1，NPTX1)和神經(jīng)元正五聚蛋白2(NP2，NPTX2)(Kirkpatrick等，2000；Dodds等，1997)。另外，優(yōu)選結(jié)合配對物選自蛇毒液泰攀蛇毒素和泰攀蛇毒素相關(guān)的鈣-結(jié)合蛋白49(TCBP49)以及泰攀蛇毒素類似物Oxynor。另外，優(yōu)選結(jié)合配對物選自抗NPTXR抗體，優(yōu)選為抗NPTXR的單克隆抗體。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子是LRP8。當(dāng)細(xì)胞表面分子是LRP8時(shí)，優(yōu)選結(jié)合配對物選自ApoE2，ApoE3，ApoE4和reelin。另外，優(yōu)選結(jié)合配對物選自多種重組的ApoE同種型，其中的一些可以購買得到。然而，天然ApoE同種型能與幾種受體結(jié)合。另外，優(yōu)選結(jié)合配對物選自ApoE的肽，例如(E(141；-155)2；LRKLRKRLLRDADDL(SEQ ID NO308)及其串聯(lián)序列E(141；-155)2；LRKLRKRLLRDADDL-LRKLRKRLLRDADDL)，已證實(shí)這兩種肽可抑制受體功能(Riddel等，1999)。另外，優(yōu)選結(jié)合配對物選自抗LRP8抗體，優(yōu)選為抗LRP8的單克隆抗體。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子是CHRNA5。當(dāng)細(xì)胞表面分子是CHRNA5時(shí)，優(yōu)選結(jié)合配對物選自煙堿，乙酰膽堿和毒素α-銀環(huán)蛇毒素。另外，結(jié)合配對物可選自CHRNA5的合成激動劑，例如卡巴膽堿。另外，優(yōu)選結(jié)合配對物選自抗CHRNA5抗體，優(yōu)選為抗CHRNA5的單克隆抗體。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子是L1CAM。當(dāng)細(xì)胞表面分子是L1CAM時(shí)，結(jié)合配對物含有例如整聯(lián)蛋白家族的粘附分子或其片段。已知L1CAM可通過RGD序列結(jié)合整聯(lián)蛋白家族的幾種粘附分子，通過寡甘露糖苷糖類結(jié)合免疫球蛋白家族的幾種粘附分子。另外，優(yōu)選結(jié)合配對物選自抗L1CAM抗體，優(yōu)選為抗L1CAM的單克隆抗體。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子是TNFRSF12。當(dāng)細(xì)胞表面分子是TNFRSF12時(shí)，結(jié)合配對物是例如抗TNFRSF12抗體，優(yōu)選為抗TNFRSF12的單克隆抗體，例如抗TNFRSF12胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體。
在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子是GRIA2。當(dāng)細(xì)胞表面分子是GRIA2時(shí)，優(yōu)選結(jié)合配對物選自L-谷氨酸和紅藻氨酸鹽。另外，優(yōu)選結(jié)合配對物選自GRIA2的合成配體，例如AMPA((RS)-α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸)受體的激動劑和拮抗劑配體。AMPA受體配體一般是谷氨酸類似物或取代的喹喔啉2，3二酮。拮抗劑被分為競爭和調(diào)制位點(diǎn)拮抗劑(評述于(Brauner-Osborne等，2000；Madsen等，2001))。另外，已證實(shí)一種AMPA拮抗劑GYKI52466可抑制表達(dá)GRIA2受體之細(xì)胞上的腫瘤細(xì)胞生長(Cavalheiro and Olney，2001)。由于配體的受體結(jié)合涉及到配體主要部分的結(jié)合，因此，僅可在很少的幾個位點(diǎn)處進(jìn)行取代(如鹵素)。已證實(shí)AMPA的溴取代形式(ABPA)可用作AMPA受體的強(qiáng)激動劑(Krogsgaard-Larsen等，1985)。激動劑也可以是鹵素化形式的激動劑，例如williardiine及其具有不同AMPA受體親和性的類似物(Jane.D，2001)。它們中有很多表現(xiàn)出比AMPA本身高很多倍的對AMPA受體的親和性。williardiine及6-azowillardiine鹵素化類似物的合成詳細(xì)描述于Jane等，1997。5-I-尿嘧啶丙氨酸和5-F-尿嘧啶丙氨酸可以商購，它們皆為3H-型。另外，結(jié)合配對物可選自小分子拮抗劑，如可商購的NBQX，CNQX，DNQX，GYKI 52466和6-氯代犬尿喹啉酸，以及與蜘蛛毒素JSTX-3有關(guān)的AMPA受體通道的較大聚胺拮抗劑(Yoneda等，2001)。另外，優(yōu)選結(jié)合配對物選自抗GRIA2抗體，優(yōu)選為抗GRIA2單克隆抗體。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子是GRM8。當(dāng)細(xì)胞表面分子是GRM8時(shí)，優(yōu)選結(jié)合配對物為L-谷氨酸。另外，優(yōu)選結(jié)合配對物選自激動劑和拮抗劑，例如可商購的L-APA，L-SOP，ACPT，(R，S)-PPG，CPPG，MAP4，(S)-3，4-DCPG和MSOP及其3H標(biāo)記形式。其中一個激動劑(R，S)-PPG對GRM8的偏好性為25倍(Gasparini等，1999)，激動劑(S)-3，4-DCPG對GRM8的選擇性為100倍以上(Bruno等，2001；Thomas等，2001；Turner and Salt，1999)。另外，優(yōu)選結(jié)合配對物選自抗GRM8抗體，優(yōu)選為抗GRM8單克隆抗體。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子是ITGAV。當(dāng)細(xì)胞表面分子是ITGAV時(shí)，優(yōu)選結(jié)合配對物選自玻連蛋白，cytactin，纖連蛋白，血纖蛋白原，層粘連蛋白，MMP-2，骨橋蛋白，凝血酶原，血小板反應(yīng)蛋白，von Willebrandts因子和αvβ3。已證實(shí)αvβ3可通過αv亞單位結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞粘附分子L1的重組片段(Montgomery等，1996)。如玻連蛋白的天然配體也是多種其它的、遍在表達(dá)的整聯(lián)蛋白的配體，因此不適于特異性靶向。另外，優(yōu)選結(jié)合配對物選自disintegrin和ADAM，例如青霉素N或contortrostatin。Disintegrin和ADAM(一種Disintegrin和一種金屬蛋白酶)是多種得自蛇毒液的蛋白質(zhì)，它們以不同的特異性與不同的整聯(lián)蛋白結(jié)合(Evans，2001；Huang，1998)。已鑒定出幾種特異于αvβ3和αvβ5的disintegrin，包括重組產(chǎn)生的青霉素N(Kang等，1999)和contortrostatin(Mercer等，1998)。另外，優(yōu)選結(jié)合配對物選自身為αvβ3結(jié)合的拮抗劑的小環(huán)形肽和非-肽化合物(Boger等，2001；Hartman and Duggan，2000；Kerr等，2000；Batt等，2000)。另外，優(yōu)選結(jié)合配對物選自抗ITGAV抗體，優(yōu)選為抗ITGAV單克隆抗體。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子是ITGAE。當(dāng)細(xì)胞表面分子是ITGAE時(shí)，優(yōu)選結(jié)合配對物是細(xì)胞粘附分子E-鈣粘蛋白或其片段。E-鈣粘蛋白上針對αEβ7的異嗜性結(jié)合位點(diǎn)與E-鈣粘蛋白同另一種E-鈣粘蛋白的同嗜性結(jié)合位點(diǎn)有所不同(Karecla等，1996；Taraszka等，2000)。優(yōu)選片段含有得自E-鈣粘蛋白第一結(jié)構(gòu)域的短肽序列(氨基酸27-34NRDKETKV(SEQ ID NO309))，或甚至更優(yōu)選所述片段由所述短肽序列組成，所述短肽序列能干擾αEβ7與E-鈣粘蛋白的結(jié)合。另外，結(jié)合配對物可選自特異性的αEβ7特異性肽(Brenner and Cepek，2001)。另外，優(yōu)選結(jié)合配對物選自抗ITGAE抗體，優(yōu)選為抗ITGAE單克隆抗體，如可用作拮抗劑的αE特異性抗體。
復(fù)合物在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有細(xì)胞表面分子和結(jié)合配對物的復(fù)合物。優(yōu)選細(xì)胞表面分子是通過本發(fā)明所述方法鑒定出的細(xì)胞表面分子。優(yōu)選細(xì)胞表面分子含有下述物質(zhì)或基本上由下述物質(zhì)組成，或例如是GRIA2，如LPR8，例如是CHRNA5，如TMEFF，例如是NPTXR，如運(yùn)鐵蛋白受體；如II型膜蛋白克隆例如是HP10481；如II型膜蛋白克隆如HP10390；例如是PG40；如TRC8；例如是TR2-11；如OA3抗原表面決定簇；例如是整聯(lián)蛋白α6，例如GPIIb；如玻連蛋白受體α亞單位；例如是整聯(lián)蛋白α-7；如整聯(lián)蛋白αE前體；例如是整聯(lián)蛋白α6B；如整聯(lián)蛋白α5亞單位；例如是整聯(lián)蛋白β-5亞單位；如整聯(lián)蛋白α-3鏈；例如是RYK；如淀粉樣前體蛋白-結(jié)合蛋白1；例如是推定的跨膜GTP酶；如膜輔因子蛋白；例如GLVR1；例如是Mr110,000抗原，例如是多配體聚糖-1；如推定的有7個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)；例如是LCA-同系物/LAR蛋白；如M6抗原；例如是Me491/CD63抗原；如多跨越膜蛋白；例如是DDR；如自泌活動因子受體；例如是胰島素受體前體；如IGF1R，例如是胰島素-樣生長因子II受體；如SAS；例如是TAPA-1；如MICB；例如是MHC II類HLA-DR7-相關(guān)糖蛋白β-鏈；如HLA-DP；例如是骨小蛋白聚糖I雙糖鏈蛋白聚糖；如CAR；例如是MEA11；如γ-干擾素受體α鏈；例如是多聚免疫球蛋白受體；如metabotropic谷氨酸受體4型；例如是metabotropic谷氨酸受體8；如CLPTM1，例如是MAGE-4b；如MAGE5a；例如是MAGE-3；例如MAGE-1；例如是MAGE6；如MAGE-9；例如是MAGE11；如CD24；例如是CD59；如CD44；例如是低密度脂蛋白受體；如極低密度脂蛋白受體；例如是N-CAM；如核纖層蛋白B受體同系物TM7SF2；例如是推定的T1/ST2受體結(jié)合蛋白前體；如NTR2受體；例如是RAGE-4；如HLA-G1；例如是MOAT-C；如α2δ鈣通道亞單位同種型I；例如是LFA-3；如L1-CAM；例如是AVPR2；如C1 p115 C1；例如是TE2；如RbP；例如是HCF1；如IRAK；例如是CD151；如表面抗原；例如是MAG；如GPR19；例如是pcta-1；如PRAME；例如是加壓素活化的鈣質(zhì)轉(zhuǎn)移受體-樣蛋白；如5-羥色胺受體5-HT4B；例如是5-羥色胺1D受體(5-HT1D～)；如CD9；例如是LDL受體成員LR3；如DR6；例如是腫瘤壞死因子受體；如HG38；例如是尿激酶型纖溶酶受體；如FGF受體；例如是神經(jīng)生長因子受體；如胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；例如是CB1大麻素受體(CNR1)；如PSG；例如是PSG13’；如CPE-受體；例如是CRH2R；如OCI5；例如是TRAIL受體2；如HNMP-1；例如是腎α-2-腎上腺素能受體；如紅細(xì)胞生成素受體；例如是硫酸軟骨素蛋白聚糖多能聚糖V1；例如是mGluR1β；如CD97；例如是L6；如NY-ESO-1；例如是T-細(xì)胞受體αδ；如ror1；例如是ror2；如SSTR2；例如是VESPR；如IgG Fc受體；例如是谷氨酸受體亞單位GluRC；如HEK2；例如是PVR；如CEA；例如是CC-趨化因子-結(jié)合受體JAB61；如HER2；例如是HER3；如類似于表皮生長因子受體-相關(guān)蛋白的假擬蛋白FLJ22357；例如是推定的B-型內(nèi)皮肽受體-樣蛋白；如GLVR2；例如是P2X4嘌呤受體；如FPRL1；例如是心房利鈉肽清除受體；例如是胃泌素/CCK-B受體；如神經(jīng)調(diào)節(jié)肽B受體；例如是GFRA3；如GRPR；例如是CDH1；如CDH2；例如是TGFBR1；如TGFBR2；例如是TGFBR3；如表皮生長因子受體的前體。
更優(yōu)選細(xì)胞表面分子選自受體酪氨酸激酶成員整聯(lián)蛋白家族成員免疫球蛋白超家族粘附分子成員硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族成員硫酸軟骨素蛋白聚糖家族成員MAGE家族成員RAGE家族成員低密度脂蛋白受體家族成員鈣粘蛋白粘附分子成員metabotropic谷氨酸受體成員類固醇激素家族成員7跨膜受體家族成員心房利鈉肽清除受體GFRA3運(yùn)鐵蛋白受體絲氨酸/蘇氨酸激酶受體成員更優(yōu)選細(xì)胞表面分子選自NCAM1，NPTXR，LRP8，CHRNA5，GRIA2，GRM8，ITGAV，ITGAE，TNFRSF12，L1CAM，GPR49和TMEFF1。
靶向復(fù)合物本發(fā)明提供了靶向復(fù)合物，其含有結(jié)合配對物和生物反應(yīng)物質(zhì)。結(jié)合配對物應(yīng)能與上文所述的一種或多種細(xì)胞表面分子或其片段結(jié)合。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，能與靶向復(fù)合物的結(jié)合配對物結(jié)合的細(xì)胞表面分子能內(nèi)化靶向復(fù)合物。然而，在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子不能內(nèi)化靶向復(fù)合物，而僅能與靶向復(fù)合物結(jié)合。
更優(yōu)選細(xì)胞表面分子含有下述物質(zhì)或基本上由下述物質(zhì)組成，或例如是運(yùn)鐵蛋白受體；如II型膜蛋白克隆例如是HP10481；如II型膜蛋白克隆如HP10390；例如是PG40；如TRC8；例如是TR2-11；如OA3抗原表面決定簇；例如是整聯(lián)蛋白α6，例如GPIIb；如玻連蛋白受體α亞單位；例如是整聯(lián)蛋白α-7；如整聯(lián)蛋白αE前體；例如是整聯(lián)蛋白α6B；如整聯(lián)蛋白α5亞單位；例如是整聯(lián)蛋白β-5亞單位；如整聯(lián)蛋白α-3鏈；例如是RYK；如淀粉樣前體蛋白-結(jié)合蛋白1；例如是推定的跨膜GTP酶；如膜輔因子蛋白；例如GLVR1；例如是Mr110,000抗原，例如是多配體聚糖-1；如推定的有7個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)；例如是LCA-同系物/LAR蛋白；如M6抗原；例如是Me491/CD63抗原；如多跨越膜蛋白；例如是DDR；如自泌活動因子受體；例如是胰島素受體前體；如IGF1R，例如是胰島素-樣生長因子II受體；如SAS；例如是TAPA-1；如MICB；例如是MHC II類HLA-DR7-相關(guān)糖蛋白β-鏈；如HLA-DP；例如是骨小蛋白聚糖I雙糖鏈蛋白聚糖；如CAR；例如是MEA11；如γ-干擾素受體α鏈；例如是多聚免疫球蛋白受體；如metabotropic谷氨酸受體4型；例如是metabotropic谷氨酸受體8；如CLPTM1，例如是MAGE-4b；如MAGE5a；例如是MAGE-3；例如MAGE-1；例如是MAGE6；如MAGE-9；例如是MAGE11；如CD24；例如是CD59；如CD44；例如是低密度脂蛋白受體；如極低密度脂蛋白受體；例如是N-CAM；如核纖層蛋白B受體同系物TM7SF2；例如是推定的T1/ST2受體結(jié)合蛋白前體；如NTR2受體；例如是RAGE-4；如HLA-G1；例如是MOAT-C；如α2δ鈣通道亞單位同種型I；例如是LFA-3；如L1-CAM；例如是AVPR2；如C1 p115 C1；例如是TE2；如RbP；例如是HCF1；如IRAK；例如是CD151；如表面抗原；例如是MAG；如GPR19；例如是pcta-1；如PRAME；例如是加壓素活化的鈣質(zhì)轉(zhuǎn)移受體-樣蛋白；如5-羥色胺受體5-HT4B；例如是5-羥色胺1D受體(5-HT1D～)；如CD9；例如是LDL受體成員LR3；如DR6；例如是腫瘤壞死因子受體；如HG38；例如是尿激酶型纖溶酶受體；如FGF受體；例如是神經(jīng)生長因子受體；如胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；例如是CB1大麻素受體(CNR1)；如PSG；例如是PSG13’；如CPE-受體；例如是CRH2R；如OCI5；例如是TRAIL受體2；如HNMP-1；例如是腎α-2-腎上腺素能受體；如紅細(xì)胞生成素受體；例如是硫酸軟骨素蛋白聚糖多能聚糖V1；例如是mGluR1β；如CD97；例如是L6；如NY-ESO-1；例如是T-細(xì)胞受體αδ；如ror1；例如是ror2；如SSTR2；例如是VESPR；如IgG Fc受體；例如是谷氨酸受體亞單位GluRC；如HEK2；例如是PVR；如CEA；例如是CC-趨化因子-結(jié)合受體JAB61；如HER2；例如是HER3；如類似于表皮生長因子受體-相關(guān)蛋白的假擬蛋白FLJ22357；例如是推定的B-型內(nèi)皮肽受體-樣蛋白；如GLVR2；例如是P2X4嘌呤受體；如FPRL1；例如是心房利鈉肽清除受體；例如是胃泌素/CCK-B受體；如神經(jīng)調(diào)節(jié)肽B受體；例如是GFRA3；如GRPR；例如是CDH1；如CDH2；例如是TGFBR1；如TGFBR2；例如是TGFBR3；如表皮生長因子受體的前體，更優(yōu)選細(xì)胞表面分子選自屬于下列組之一的受體受體酪氨酸激酶成員整聯(lián)蛋白家族成員免疫球蛋白超家族粘附分子成員硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族成員硫酸軟骨素蛋白聚糖家族成員MAGE家族成員RAGE家族成員低密度脂蛋白受體家族成員鈣粘蛋白粘附分子成員metabotropic谷氨酸受體成員類固醇激素家族成員
7跨膜受體家族成員心房利鈉肽清除受體GFRA3運(yùn)鐵蛋白受體絲氨酸/蘇氨酸激酶受體成員甚至更優(yōu)選細(xì)胞表面分子選自NCAM1，NPTXR，LRP8，CHRNA5，GRIA2，GRM8，ITGAV，ITGAE，TNFRSF12，L1CAM，GPR49和TMEFF1。
本發(fā)明的生物反應(yīng)物質(zhì)可以是任何能直接或間接對靶細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)作用，并能內(nèi)化靶向構(gòu)建體的物質(zhì)，其中靶細(xì)胞是任何表達(dá)細(xì)胞表面分子的細(xì)胞。本發(fā)明的生物學(xué)作用可選自例如細(xì)胞周期停滯，保護(hù)細(xì)胞以對抗毒素和細(xì)胞死亡。
生物反應(yīng)物質(zhì)可以是任何化合物，例如可以是核酸序列，多肽，寡肽，毒素，小化合物或放射性同位素。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，生物反應(yīng)物質(zhì)是核酸序列。優(yōu)選核酸序列含有與含表達(dá)信號的第一核酸序列可操作相連的第二核酸序列。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，第二核酸序列編碼治療蛋白質(zhì)(見下文)。編碼治療蛋白質(zhì)的核酸序列可含有互補(bǔ)的DNA(cDNA)。本文所用術(shù)語“cDNA”欲指使用信使RNA(mRNA)作為模板制備的DNA。使用cDNA，而不是基因組DNA或由基因組DNA聚合得到的DNA或未-加工或部分-加工的RNA模板的優(yōu)點(diǎn)是cDNA不含任何非-編碼的內(nèi)含子序列，但含有相應(yīng)蛋白質(zhì)的不間斷的編碼區(qū)。然而，有時(shí)常會優(yōu)選完整或部分基因組序列，例如當(dāng)需要非-編碼區(qū)才能進(jìn)行最適表達(dá)時(shí)。
在另一個實(shí)施方案中，第二核酸序列編碼反義RNA或反義RNA的一部分。或者，第二核酸序列可含有反義RNA或反義RNA的一部分，或者基本上由反義RNA或反義RNA的一部分組成。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“反義RNA”欲包括由基因的非-編碼DNA鏈轉(zhuǎn)錄的RNA序列，或能在嚴(yán)緊條件下與mRNA或其片段雜交的RNA序列。
優(yōu)選本發(fā)明上下文中的反義RNA是蛋白質(zhì)編碼基因的反義RNA，所述蛋白質(zhì)能促進(jìn)細(xì)胞存活，細(xì)胞生長和/或細(xì)胞移動。更優(yōu)選反義RNA是癌基因或生長因子的反義RNA。
在另一個實(shí)施方案中，第二核酸序列編碼或含有核酶。本發(fā)明上下文中的核酶是含有酶活性的分子，其含有至少一種RNA。優(yōu)選本發(fā)明的核酶被靶向癌基因或原癌基因或生長因子的RNA。
因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，反義RNA或核酶被靶向癌基因或原癌基因或生長因子的RNA。生長因子的例子如下文所述。
癌基因是一類多種多樣的基因，其產(chǎn)物可導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和/或發(fā)展。原癌基因在某種情況下，或在突變之后，會導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和/或發(fā)展。癌基因或原癌基因可選自例如Ras，Raf，Myc，Syn，Pim，BMI-1，F(xiàn)OP，Sis，KGF，F(xiàn)ms，F(xiàn)lg，Neu，Trk，Kit，Met，Src，F(xiàn)yn，Mas，F(xiàn)es/Fps，Tre，Mer，ABL，BCL3，int-2，Cym，Ets，Elk，RhoA，Ski，Wnt-5a，Spi-1，Rap2，p55和c-tyr。以上僅是舉例，而并未窮舉可用于本發(fā)明的癌基因和原癌基因。
第二核酸序列也可編碼腫瘤抑制基因，所述基因可被導(dǎo)入表達(dá)細(xì)胞表面分子的細(xì)胞，以校正細(xì)胞內(nèi)所述腫瘤抑制基因的任何內(nèi)源性突變。腫瘤抑制基因可以是任何腫瘤抑制基因，例如下文所述的任何腫瘤抑制基因。
本發(fā)明的第一核酸序列優(yōu)選含有表達(dá)信號。所述表達(dá)信號應(yīng)優(yōu)選影響與之可操作相連的第二核酸序列的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選本發(fā)明的第一核酸序列影響轉(zhuǎn)錄，例如它們能在特定情況下增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，第一核酸序列含有表達(dá)信號，該信號能介導(dǎo)第二核酸序列在惡性細(xì)胞中以相對于非-惡性細(xì)胞而言較低的水平表達(dá)。在另一個實(shí)施方案中，第一核酸序列含有表達(dá)信號，所述信號能介導(dǎo)第二核酸序列在惡性細(xì)胞中以與非-惡性細(xì)胞差不多相同的水平表達(dá)。
然而，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列介導(dǎo)第二核酸序列在惡性細(xì)胞中以相對于非-惡性細(xì)胞而言較高的水平表達(dá)。特別是第一核酸序列可選自根據(jù)上文所述方法鑒定出的第一核酸序列。
優(yōu)選第一核酸序列選自pro1，pro2，pro3，pro4，pro5，pro6，pro7，pro8，pro9，pro10，pro12，pro13，pro14，pro15，pro16，pro17，pro18，pro19，pro20，pro21，pro22，pro23，pro24，pro25，pro26，pro27，pro28，pro29，pro30，pro31，pro32，pro34，pro36，pro37，pro38，pro39，pro40，pro41，pro42，pro43，pro44，pro45，pro46，pro47，pro48，pro49，pro50，pro51，pro52，pro53，pro54，pro55，pro56，pro57，pro58，pro59，pro60，pro61，pro62，pro63，pro64，pro65，pro66，pro67，pro68，pro69，pro70，pro71，pro72，pro73，pro74，pro75，pro76，pro77，pro78，pro79，pro80，pro81，pro82，pro83，pro84，pro85，pro86，pro87，pro88，pro89，pro90，pro91，pro92，pro93，pro94，pro95，pro96，pro97，pro98，pro99，pro100，pro101，pro103，pro104，pro105，pro106，pro107，pro108，pro109，pro110，pro111，pro112，pro113，pro114，pro115，pro116，pro117，pro118，pro119，pro120，pro121，pro122，pro123，pro124，pro125，pro126，pro127，pro128，pro129，pro130，pro131，pro133，pro134，pro135，pro136，pro137，pro138，pro139，pro140，pro141，pro142，pro143，pro144，pro145，pro146，pro147，pro148，pro149，pro150，pro152，pro153，pro154，pro155，pro156，pro157，pro158，pro159，pro160，pro161，pro162，pro163，pro164，pro165，pro166，pro167，pro168，pro169，pro171，pro172，pro173，pro174，pro175，pro176，pro177，pro178，pro179，pro180，pro181，pro182，pro183，pro184，pro185，pro187，pro189，pro191，pro193，pro194，pro195，pro196，pro197，pro198，pro199，pro201，pro202，pro203，pro204，pro205，pro206，pro207，pro208，pro209，pro210，pro211，pro212，pro213，pro215，pro216，pro217，pro219，pro220，pro221，pro222，pro223，pro224，pro225，pro226，pro227，pro228，pro229，pro230，pro231，pro232，pro233，pro234，pro235，pro236，pro237，pro238，pro239，pro240，pro241，pro242，pro243，pro244，pro245，pro246，pro247，pro248，pro249，pro250，pro251，pro253，pro254，pro255，pro256，pro257，pro258，pro259，pro260，pro262，pro263，pro264，pro267，pro268，pro269，pro270，pro271，pro272，pro273，pro275，pro277，pro278，pro279，pro280，pro282，pro283，pro284，pro285，pro286，pro287，pro289，pro290，pro291，pro292，pro293，pro294，pro295，pro296，pro297，pro298，pro299，pro300，pro301，pro302，pro303，pro304，pro305，pro306，pro307，pro308，pro309，pro310，pro311，pro312，pro313，pro315，pro316，pro317，pro318，pro319，pro320，pro321，pro322，pro323，pro324，pro326，pro327，pro328，pro329，pro330，pro331，pro332，pro333，pro334，pro335，pro336，pro337，pro338，pro339，pro340，pro341，pro344，pro346，pro347，pro348，pro349，pro352，pro353，pro354，pro355，pro356，pro358，pro359和pro361。
第一核酸序列可進(jìn)一步含有選自下列的核酸序列片段和/或基本上由所述片段組成pro1，pro2，pro3，pro4，pro5，pro6，pro7，pro8，pro9，pro10，pro12，pro13，pro14，pro15，pro16，pro17，pro18，pro19，pro20，pro21，pro22，pro23，pro24，pro25，pro26，pro27，pro28，pro29，pro30，pro31，pro32，pro34，pro36，pro37，pro38，pro39，pro40，pro41，pro42，pro43，pro44，pro45，pro46，pro47，pro48，pro49，pro50，pro51，pro52，pro53，pro54，pro55，pro56，pro57，pro58，pro59，pro60，pro61，pro62，pro63，pro64，pro65，pro66，pro67，pro68，pro69，pro70，pro71，pro72，pro73，pro74，pro75，pro76，pro77，pro78，pro79，pro80，pro81，pro82，pro83，pro84，pro85，pro86，pro87，pro88，pro89，pro90，pro91，pro92，pro93，pro94，pro95，pro96，pro97，pro98，pro99，pro100，pro101，pro103，pro104，pro105，pro106，pro107，pro108，pro109，pro110，pro111，pro112，pro113，pro114，pro115，pro116，pro117，pro118，pro119，pro120，pro121，pro122，pro123，pro124，pro125，pro126，pro127，pro128，pro129，pro130，pro131，pro133，pro134，pro135，pro136，pro137，pro138，pro139，pro140，pro141，pro142，pro143，pro144，pro145，pro146，pro147，pro148，pro149，pro150，pro152，pro153，pro154，pro155，pro156，pro157，pro158，pro159，pro160，pro161，pro162，pro163，pro164，pro165，pro166，pro167，pro168，pro169，pro171，pro172，pro173，pro174，pro175，pro176，pro177，pro178，pro179，pro180，pro181，pro182，pro183，pro184，pro185，pro187，pro189，pro191，pro193，pro194，pro195，pro196，pro197，pro198，pro199，pro201，pro202，pro203，pro204，pro205，pro206，pro207，pro208，pro209，pro210，pro211，pro212，pro213，pro215，pro216，pro217，pro219，pro220，pro221，pro222，pro223，pro224，pro225，pro226，pro227，pro228，pro229，pro230，pro231，pro232，pro233，pro234，pro235，pro236，pro237，pro238，pro239，pro240，pro241，pro242，pro243，pro244，pro245，pro246，pro247，pro248，pro249，pro250，pro251，pro253，pro254，pro255，pro256，pro257，pro258，pro259，pro260，pro262，pro263，pro264，pro267，pro268，pro269，pro270，pro271，pro272，pro273，pro275，pro277，pro278，pro279，pro280，pro282，pro283，pro284，pro285，pro286，pro287，pro289，pro290，pro291，pro292，pro293，pro294，pro295，pro296，pro297，pro298，pro299，pro300，pro301，pro302，pro303，pro304，pro305，pro306，pro307，pro308，pro309，pro310，pro311，pro312，pro313，pro315，pro316，pro317，pro318，pro319，pro320，pro321，pro322，pro323，pro324，pro326，pro327，pro328，pro329，pro330，pro331，pro332，pro333，pro334，pro335，pro336，pro337，pro338，pro339，pro340，pro341，pro344，pro346，pro347，pro348，pro349，pro352，pro353，pro354，pro355，pro356，pro358，pro359和pro361。
甚至更優(yōu)選第一核酸序列選自pro221，pro210，pro71，pro41，pro30，pro2，pro209，pro14，pro4，pro8，pro246，pro16，pro27，pro5，pro49，pro19，pro140，pro139，pro207，pro81，pro273和pro362及其片段。
第一核酸序列還含有一個以上選自上述組的核苷酸序列片段。
本發(fā)明還包括第一核酸序列進(jìn)一步含有與其非天然相連的核酸序列。與其非天然相連的核酸序列可以是例如轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，優(yōu)選為一個或多個類固醇激素受體結(jié)合位點(diǎn)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，第一核酸序列可以是任何如上所述的第一核酸序列。
在某些實(shí)施方案中，核酸序列穩(wěn)定整合至細(xì)胞的基因組中。可通過同源重組在關(guān)聯(lián)的位置和方向上進(jìn)行整合(基因置換)，或者也可以在隨機(jī)的非-特異性位置進(jìn)行整合(基因增大)。在其它實(shí)施方案中，核酸序列作為獨(dú)立的附加型DNA區(qū)段在細(xì)胞中穩(wěn)定維持。所述核酸區(qū)段或“附加體”編碼的序列足以允許獨(dú)立于宿主細(xì)胞周期或與所述周期同步進(jìn)行維持和復(fù)制。
除了結(jié)合配對物和生物反應(yīng)物質(zhì)以外，靶向復(fù)合物還含有其它組分。其它組分可以是例如保護(hù)性成分。
當(dāng)生物反應(yīng)物質(zhì)是核酸時(shí)，靶向復(fù)合物還可含有保護(hù)性加帽，其中所述保護(hù)性加帽由與第一和/或第二核酸序列結(jié)合的核酸序列組成。具有保護(hù)特性的核酸序列可含有例如經(jīng)修飾的核苷酸。例如，經(jīng)修飾的核苷酸可以被一個或多個氨基酸，胺基或生物素基團(tuán)修飾。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，生物反應(yīng)物質(zhì)是毒素。毒素是任何對表達(dá)細(xì)胞表面分子的細(xì)胞有毒的物質(zhì)。例如，毒素可選自蓖麻毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素、鏈脲菌素或霍亂毒素。然而，所列出的毒素是不完全的，本發(fā)明所用毒素不限于此。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，生物反應(yīng)物質(zhì)是細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物。在本發(fā)明的意義上，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物就是任何能直接或間接誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞表面分子的細(xì)胞發(fā)生凋亡的化合物。
細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物可以是多肽(見下文)，或者可以是任何其它類型的化合物。例如，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物可選自視黃酸、A23187、岡田酸、嘌呤霉素、星形孢菌素、毒胡蘿卜素、放線菌素D、喜樹堿、放線菌酮、地塞米松、依托泊苷(etoposide)和糖皮質(zhì)素。然而，本發(fā)明還包括任何其它的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，生物反應(yīng)物質(zhì)是放射性同位素。放射性同位素可選自(125)I、(131)I、(123)I、(111)In、(205)Bi、(206)Bi、(213)Bi、(186)Re、(188)Re、(225)Ac、99mTc、(68)Ga、(62)Cu、(90)Y、(64)Cu、(211)At、(212)Bi、(177)Lu、(153)Sm和(157)Gd。在一個實(shí)施方案中，放射性活性物質(zhì)可與另一種物質(zhì)共價(jià)連接，例如，放射性物質(zhì)可與結(jié)合配對物共價(jià)連接。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，生物反應(yīng)物質(zhì)是細(xì)胞靜止劑。細(xì)胞靜止劑可以是例如能用于化學(xué)療法的藥物。下文將提及適用于化學(xué)療法的藥物。
本發(fā)明的生物反應(yīng)物質(zhì)可以是激素的拮抗劑，優(yōu)選為選自雌激素、雄激素、孕酮、LH和RH的激素的拮抗劑。
雄激素可選自例如睪酮、雙氫睪酮、雄烯二醇、雄烯二酮、脫氫表雄酮(DHEA)、脫氫表雄酮硫酸酯(DHEA-S)及其衍生物。
雌激素可以選自例如estrion、雌二醇、雌三醇及其衍生物。
或者，生物反應(yīng)物質(zhì)可以是aromitase抑制劑。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，生物反應(yīng)物質(zhì)含有多肽或基本上由多肽組成。特別是，所述多肽可以是治療蛋白質(zhì)。
術(shù)語“治療蛋白質(zhì)”欲指任何為了細(xì)胞的潛在利益而導(dǎo)入細(xì)胞或含有所述細(xì)胞的生物體的多肽。治療蛋白質(zhì)可屬于多個不同的類別。例如，治療蛋白質(zhì)可以是腫瘤抑制因子、毒性物質(zhì)或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物。本發(fā)明的治療蛋白質(zhì)可以是對細(xì)胞周期停滯起作用的蛋白質(zhì)。
在癌癥治療形式中，特別有用的基因是腫瘤抑制基因。在將正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為致瘤性細(xì)胞的過程中，據(jù)認(rèn)為腫瘤抑制基因的突變起著重要作用。腫瘤抑制基因的一個最重要的功能是減弱細(xì)胞分裂和介導(dǎo)突變細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。腫瘤抑制基因是高效的，以致于需要突變腫瘤抑制基因的兩個等位基因才能消除其功能。因此，將功能性腫瘤抑制基因?qū)刖哂型蛔儽硇偷陌┘?xì)胞經(jīng)常足以誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。p53、p73和p16是肺癌中經(jīng)常突變的腫瘤抑制基因。使用治療基因-傳遞載體將這些基因的野生型形式導(dǎo)入癌細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是一種可以使用的、選擇性殺死癌細(xì)胞的方法。有多種腫瘤抑制基因是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，優(yōu)選的例子包括p53、p73、p16、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、FCC和MCC。所列的例子并未窮舉本領(lǐng)域已知的多種腫瘤抑制基因，而只是更常用的腫瘤抑制基因的例子。
優(yōu)選治療蛋白質(zhì)是選自下列的腫瘤抑制基因p73、p16、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-1、MEN-II、BRCA1、VHL、FCC、MCC、MSH2、PTCH、DPCH、TSC2、CDKN2A和ARF。更優(yōu)選治療蛋白質(zhì)是p53。
癌癥療法的重要終點(diǎn)是殺死或清除癌細(xì)胞。誘發(fā)此事件的常用方法之一是將野生型p53導(dǎo)入具有突變p53的癌細(xì)胞中，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。使用p53作為治療基因取決于癌細(xì)胞中內(nèi)源性p53的狀況。野生型過表達(dá)經(jīng)常是有效的，然而，p53和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因，如p16同時(shí)過表達(dá)可增強(qiáng)效果。其它細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因，如p15，p17，p18或p19與p53或p53家族的其它基因，如p73聯(lián)合使用也是有效的。與化學(xué)治療藥物或電離輻射的聯(lián)合療法也可以顯著增加對p53基因療法的治療反應(yīng)。
Bcl-2家族蛋白質(zhì)是細(xì)胞死亡的重要調(diào)節(jié)劑。它們由兩個對立的組分(前細(xì)胞凋亡與抗細(xì)胞凋亡成員)構(gòu)成。所有bcl-2家族成員共享4個高度保守的結(jié)構(gòu)域，BH1，BH2，BH3和BH4中的一個或多個。Bc1-2家族成員包括但不限于A1，mcl-1，bcl-2，bcl-w，bcl-x，bax，bad和bak。A1，bcl-2，mcl-1，bcl-w和bcl-xl(長型bcl-x)基因編碼胞內(nèi)膜蛋白，已證實(shí)所述蛋白可阻斷或延遲細(xì)胞凋亡。已證實(shí)這些基因的過表達(dá)可賦予細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的抗性，包括對化學(xué)療法誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抗性。在治療中可以使用抗這些基因的反義寡核苷酸或核酶以及它們的蛋白質(zhì)以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
相反，目前已知bax，bad，bak和bcl-xs(短型bcl-x)可通過抑制抗細(xì)胞凋亡bcl-2家族成員的保護(hù)作用來促進(jìn)細(xì)胞死亡。在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法可以是導(dǎo)入和過表達(dá)這些基因。
Caspase(半胱氨酸-天冬氨酸-蛋白酶)是一類對細(xì)胞凋亡程序至關(guān)重要的蛋白質(zhì)。這些蛋白酶主要負(fù)責(zé)降解正經(jīng)受細(xì)胞凋亡的細(xì)胞中出現(xiàn)的導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變的細(xì)胞蛋白質(zhì)。Caspase以無活性的酶原形式存在，通過蛋白酶裂解可活化所述酶原。已鑒定出至少12種人caspase。Caspase8，9和3位于細(xì)胞凋亡途徑的關(guān)鍵性連接處。Caspase8和caspase9通過蛋白酶裂解激活caspase3，caspase3再去裂解極其重要的細(xì)胞蛋白質(zhì)或其它c(diǎn)aspase。預(yù)期導(dǎo)入和過表達(dá)這些caspase中的一種會導(dǎo)致癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
優(yōu)選治療蛋白質(zhì)是細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物，所述誘導(dǎo)物選自Fas/Apol，TNF，TRAIL，TGF-β，caspase，Bak，Bax，Bid，Bik和GZMB。
本發(fā)明的生物反應(yīng)物質(zhì)還可以是能與致癌蛋白質(zhì)或和癌癥形成有關(guān)的其它蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。上文列出了致癌蛋白質(zhì)。
癌細(xì)胞經(jīng)常產(chǎn)生生長因子和生長因子受體以維持自泌或旁泌環(huán)，所述環(huán)可介導(dǎo)免疫系統(tǒng)的增殖、血管生成和逃避。因此，生物反應(yīng)物質(zhì)可以是抗體，例如胞內(nèi)單鏈抗體，所述抗體能抑制一種或多種選自TGF-β，VEGF，IGF的生長因子和如EGFR的生長因子受體。
另外，治療蛋白質(zhì)可以是能保護(hù)細(xì)胞免受毒性劑侵害的蛋白質(zhì)，或是能催化毒性物質(zhì)合成的蛋白質(zhì)。
已開發(fā)出不同的系統(tǒng)，其中導(dǎo)入了能介導(dǎo)原藥轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性化合物的蛋白質(zhì)。單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因?qū)⑻禺愋缘那岸拘院塑疹愃莆?，如無環(huán)鳥苷和9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)效DNA合成抑制劑。能表達(dá)HSV-tk的細(xì)胞對藥物變得十分敏感，而不表達(dá)HSV-tk的細(xì)胞相對不敏感。不僅在HSV-tk轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中，在周圍的細(xì)胞中也能觀察到原藥轉(zhuǎn)變效應(yīng)。這種效應(yīng)被稱為旁觀者效應(yīng)，它對治療有好處，因?yàn)樗鼰o需用HSV-tk基因轉(zhuǎn)導(dǎo)100％的腫瘤細(xì)胞。
另一種藥物敏感性治療蛋白質(zhì)是胞嘧啶脫氨酶(CD)。CD蛋白催化原藥5-氟胞嘧啶(5FC)轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟尿嘧啶(5FU)；在CD-陽性腫瘤細(xì)胞中，用5FC處理CD轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞導(dǎo)致5FC轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤藥物5FU。
治療蛋白質(zhì)還可以是導(dǎo)入后能干擾癌基因表達(dá)，因此可抑制腫瘤細(xì)胞生長的毒性蛋白質(zhì)，如細(xì)胞因子。
本發(fā)明的靶向復(fù)合物可含有一種以上不同的生物反應(yīng)物質(zhì)，如2種、3種、4種、5種、5種以上不同的生物反應(yīng)物質(zhì)。例如，靶向復(fù)合物可含有一種以上編碼一種或一種以上治療蛋白質(zhì)的第一核苷酸序列，例如2種、3種、4種、5種、5種以上編碼一種和/或多種治療蛋白質(zhì)的第一核苷酸序列。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，靶向復(fù)合物還含有核靶向信號。核靶向信號介導(dǎo)到達(dá)核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。某些生物反應(yīng)物質(zhì)必須進(jìn)入核內(nèi)才具有活性，因此，它們與核定位信號結(jié)合較為有利。例如，DNA序列必須進(jìn)入核內(nèi)才能被轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明的核靶向信號可以是任何能定位于核的核靶向信號。核靶向信號可以是例如寡肽，優(yōu)選核靶向信號選自具有下列序列的寡肽RRMKWKK PDX(SEQ ID 310)RVHPYQR QKI(SEQ ID NO 311)KRPACTLKPECVQQLLVCSQEAKK HCDA(SEQ ID NO 312)PKKKRKV(SEQ ID NO 313)(SV40 LrgT)GKKRSKA(SEQ ID NO 314)(H2B)KAKRQR(SEQ ID NO 315)(v-Rel)RGRRRRQR(SEQ ID NO 316)RKRRR(SEQ ID NO 317)PPVKRERTS(SEQ ID NO 318)(RanBP3)PYLNKRKGKP(SEQ ID NO 319)(Pho4p)CYGSKNTGAKKRKIDDA(SEQ ID NO 320)(DNAhelicaseQ1)KKKKRKREK(SEQ ID NO 321)(LEF-1)KKKRRSREK(SEQ ID NO 322)(TCF-1)Krx{7，9}PQPKKKP(SEQ ID NO 323)(p53)KVTKRKHDNEGSGSKRPK(SEQ ID NO 324)(Hum-Ku70)RLKKLKCSKx{19}KTKR(SEQ ID NO 325)(GAL4)RKRIREDRKx{18}RKRKR TCPTP(SEQ ID NO 326)RRERx{4}RPRKIPR(SEQ ID NO 327)(BDV-P)KKKKKEEEGEGKKK(SE QID NO 328)(act/inh betaA)PRPRKIPR(SEQ ID NO 329)(BDV-P)PPRIYPQLPSAPT(SEQ ID NO 330)(BDV-P)
KDCVINKHHRNRCQYCRLQR(SEQ ID NO 331)(TR2)Krx{9}KTKK(SEQ ID NO 332)(THOV NP)APKRKSGVSKC(SEQ ID NO 333)(PolyomaVP1)RKKRRQRRR(SEQ ID NO 334)(HIV-1 Tat)RQARRNRRRRWR(SEQID NO 335)(HIV-1 Rev)MPKTRRRPRRSQRKRPPT(SEQ ID NO 336)(Rex)KRPMNAFIVWSRDQRRK(SEQ ID NO 337)(SRY)PRRRK(SEQ ID NO 338)(SRY)KRPMNAFMVWAQAARRK(SEQ ID NO 339)(SOX9)PRRRK(SEQ ID NO 338)(SOX9)[KAR]TPIQKHWRPTVLTEGPPVKIRIETGEWE[KA](SEQ ID NO 340)PPRKKRTVV(SEQ ID NO 341)YKRPCKRSFIRFI(SEQ ID NO 342)LKDVRKRKLGPGH(SEQ ID NO 343)KRPRP(SEQ ID NO 344)RKRKK(SEQ ID NO 345)RRSMKRK hVDR(SEQ ID NO 346)PAKRARRGYK(SEQ ID NO 347)RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO 348)RRERNKMAAAKCRNRRR(SEQ ID NO 349)KRMRNRIAASKCRKRKL(SEQ ID NO 350)KKSKKGRQEALERLKKA(SEQ ID NO 351)RKEWLTNFMEDRRQRKL(SEQ ID NO 352)KKQTTLAFKPIKKGKKR(SEQ ID NO 353)RKRKKMPASQRSKRRKT(SEQ ID NO 354)RAIKRRPGLDFDDDGEGNSKFLR(SEQ ID NO 355)SxGTKRSYxxM(SEQ ID NO 356)TKRSxxxM(SEQ ID NO 357)RIRKKLR(SEQ ID NO 358)KRAAEDDEDDDVDTKKQK(SEQ ID NO 359)GRKRKKRT(SEQ ID NO 360)
KKKQKK(SEQ ID NO 361)REKKEKEQKEKCA(SEQ ID NO 362)LEKKVKKKFDWCA(SEQ ID NO 363)TEKK[QG]KSILYDCA(SEQ ID NO 364)SDKKVRSRLIECA(SEQ ID NO 365)LKRKLQR(SEQ ID NO 366)RRKGKEK(SEQ ID NO 367)CKRKTTNADRRKA(SEQ ID NO 368)VNEAFETLKRC(SEQ ID NO 369)MPTEERVRKRKESNRESARRSRYRKAAHLK(SEQ ID NO 370)KVNSRKRRKEVPGPNGATEED(SEQ ID NO 371)PRRGPR HCV(SEQ ID NO 372)PRGRRQPIPKARQP(SEQ ID NO 373)KRSAEGGNPPKPLKKLR(SEQ ID NO 374)KRKx{11}KKKSKK(SEQ ID NO 375)EYLSRKGKLEL(SEQ ID NO 376)PKRPRDRHDGELGGRKRARG(SEQ ID NO 377)KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO 378)KRKKEMANKSAPEAKKKK(SEQ ID NO 379)RKRAFHGDDPFGEGPPDKK(SEQ ID NO 380)GGGx{3}KNRRx{6}RGGRN(SEQ ID NO 381)YNNQSSNFGPMKGGN(SEQ ID NO 382)PAAKRVKLD(SEQ ID NO 383)KRPAEDMEEEQAFKRSR SxGTKRSYxxM(SEQ ID NO 384)MNKIPIKDLLNPG(SEQ ID NO 385)PKKARED(SEQ ID NO 386)VSRKRPR(SEQ ID NO 387)APTKRKGS(SEQ ID NO 388)PNKKKRK(SEQ ID NO 389)EEDGPQKKKRRL(SEQ ID NO 390)PLLKKIKQ(SEQ ID NO 391)
PPQKKIKS(SEQ ID NO 392)PQPKKKP(SEQ ID NO 393)SKRVAKRKL(SEQ ID NO 394)IKYFKKFPKD(SEQ ID NO 395)KTRKHRG(SEQ ID NO 396)KHRKHPG(SEQ ID NO 397)PQSRKKLR(SEQ ID NO 398)HRKYEAPRHx{6}PRKR(SEQ ID NO 399)KKEKKKSKK(SEQ ID NO 400)其中括號內(nèi)的內(nèi)容表示寡肽所源自的蛋白質(zhì)的名稱，其中“[KR]”表示“K或R”，即在該位置有效的任何兩個氨基酸，“x”表示“任何氨基酸”，“x{9}”表示“9倍的x”，“x{7，9}”表示“至少7倍，至多9倍的x”。氨基酸以其單字母代碼表示。
另外，本發(fā)明的核定位信號也可以是上述序列的突變體，如其中的1個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個，10個氨基酸被任何一種其它氨基酸取代的突變體，優(yōu)選突變是保守的氨基酸取代(見上文)。本發(fā)明的核定位信號是缺失了例如1個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個，10個氨基酸的突變體。
更優(yōu)選核靶向信號是猴病毒40大腫瘤抗原的核定位信號。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，靶向復(fù)合物還含有內(nèi)體裂解劑。靶向復(fù)合物經(jīng)常通過已知為受體介導(dǎo)的胞吞的過程被攝入表達(dá)細(xì)胞表面分子的細(xì)胞內(nèi)，因此，靶向復(fù)合物被包含在內(nèi)體中進(jìn)入細(xì)胞，而靶向復(fù)合物卻需要躲避內(nèi)體以避免被降解。因此，靶向復(fù)合物經(jīng)常含有內(nèi)體裂解劑。
很多病毒有辦法躲避內(nèi)體，因此，減毒病毒或病毒的一部分可以是有用的內(nèi)體裂解劑。優(yōu)選內(nèi)體裂解劑選自聚乙烯亞胺(PEI)，復(fù)制缺損病毒和病毒蛋白衣殼。更優(yōu)選內(nèi)體裂解劑含有膜去穩(wěn)定多肽。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，靶向復(fù)合物還含有氯喹。氯喹可起到保護(hù)作用，以對抗內(nèi)體降解，因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，必須存在氯喹。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，生物反應(yīng)物質(zhì)與結(jié)合配對物直接或間接互相結(jié)合。如果生物反應(yīng)物質(zhì)是核酸序列，結(jié)合配對物可通過例如與所述結(jié)合配對物共價(jià)結(jié)合的核酸結(jié)合劑與生物反應(yīng)物質(zhì)結(jié)合。
核酸結(jié)合劑包括蛋白質(zhì)、多肽、肽、抗體、核苷酸、糖類、脂肪酸、有機(jī)或無機(jī)化合物及其組合。
核酸結(jié)合劑可以通過化學(xué)或物理力或這兩者的合力結(jié)合單鏈或雙鏈DNA以及單鏈或雙鏈RNA。核酸結(jié)合劑可以(i)僅對核酸本身有親和性，(ii)對核酸和另一種分子都有親和性，從而在兩者之間形成橋連，或(iii)通過與另一種對核酸有親和性的分子的親和性而對核酸具有間接親和性。
根據(jù)本發(fā)明，核酸結(jié)合劑與結(jié)合配對物的偶聯(lián)必須以不會干擾結(jié)合配對物與細(xì)胞表面分子結(jié)合的方式發(fā)生。優(yōu)選還能夠保持經(jīng)由受體-介導(dǎo)的胞吞的靶向復(fù)合物內(nèi)化過程。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種識別和內(nèi)化以適合表達(dá)內(nèi)源性靶核酸或適合與所述靶核酸相互作用的形式將核酸序列傳遞至靶細(xì)胞中。
在一個實(shí)施方案中，核酸結(jié)合劑以嵌入的方式將其自身插入雙鏈核酸的堿基對之間，或結(jié)合于雙鏈核酸的次要或主要的溝中。
這種結(jié)合可以是序列-特異性的，或者與序列完全無關(guān)。在其它實(shí)施方案中，核酸可以與其它具有化學(xué)或光化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)的分子交聯(lián)。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，核酸結(jié)合劑使核酸與另一種分子共價(jià)連接。在一個實(shí)施方案中，核酸結(jié)合劑是一種偶聯(lián)劑，例如碳二亞胺。然而，核酸的共價(jià)偶聯(lián)可改變其特異性，阻礙適當(dāng)?shù)幕虮磉_(dá)或靶核酸識別。另外，核酸與結(jié)合配對物的共價(jià)偶聯(lián)需要線性或單鏈核酸。最終，核酸是帶負(fù)電的分子，這意味著它們會被細(xì)胞表面排斥，使得經(jīng)由內(nèi)體裂解途徑的轉(zhuǎn)移變得困難。因此，有效傳遞與結(jié)合配對物直接結(jié)合的核酸必需限制大小和類型。
核酸結(jié)合劑的例子是類似于WO96/30536中描述的DNA-結(jié)合劑的聚陽離子試劑，該試劑依靠的是靜電-起決定作用的結(jié)合，所述結(jié)合涉及陽離子基團(tuán)和核酸上帶負(fù)電的磷酸之間的序列-中性相互作用。
聚陽離子試劑與DNA牢固結(jié)合，導(dǎo)致形成復(fù)曲面復(fù)合物，其中核酸分子的負(fù)電被完全中和。通過正常的受體-介導(dǎo)的胞吞可以內(nèi)化這種可溶性的復(fù)曲面復(fù)合物。
可以使用任何類型的核酸，從單鏈mRNA到雙鏈環(huán)形質(zhì)粒皆可。
另外，可以使用任意大小的核酸，只要它可以提供負(fù)電與聚陽離子試劑結(jié)合即可。在某些實(shí)施方案中，這些聚陽離子組成成分可包括天然的多胺，例如精胺和/或亞精胺。在優(yōu)選實(shí)施方案中，聚陽離子試劑可以是人工制備的試劑，如聚賴氨酸或聚乙烯亞胺。
本發(fā)明為了適當(dāng)發(fā)揮作用，需要滿足與核酸結(jié)合劑有關(guān)的某些標(biāo)準(zhǔn)。首先，被傳遞至細(xì)胞中的核酸必須與核酸結(jié)合劑結(jié)合，而不會以任何方式喪失其完整性。
第二，由配體、核酸結(jié)合劑和核酸組成的復(fù)合物必須為可溶性的，從而使復(fù)合物在體外和體內(nèi)更容易進(jìn)入細(xì)胞。第三，一旦復(fù)合物被內(nèi)化至宿主細(xì)胞中，核酸必須能接近其靶序列而不會被降解。
核酸結(jié)合劑可包括如下試劑碳二亞胺、N-琥珀酰亞胺基，3(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、琥珀酰亞胺基，4(N-馬來酰亞氨甲基)環(huán)己烷-I-羧酸酯、二異氰酸酯、戊二醛、苯重氮酸和六亞甲基二胺。上文列出的結(jié)合劑并未窮舉本領(lǐng)域已知的多種偶聯(lián)劑，而只是例舉了可以使用的更常用的連接劑。
優(yōu)選核酸結(jié)合劑選自聚-L-賴氨酸(PLL)、精胺、亞精胺和組蛋白蛋白質(zhì)。
當(dāng)核酸結(jié)合劑是PLL時(shí)，PLL可以含有15至1000、如50至750、100至500、200至400個殘基。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，結(jié)合配對物通過一對特異性相互作用的組分間接與生物反應(yīng)物質(zhì)結(jié)合，其中一個組分與生物反應(yīng)物質(zhì)共價(jià)結(jié)合，另一個組分與結(jié)合配對物共價(jià)結(jié)合。
所述的一對特異性相互作用的組分的一個例子是生物素和鏈霉親和素，然而，也可以使用其它對相互作用的組分。
含有細(xì)胞表面分子和靶向復(fù)合物的復(fù)合物本發(fā)明的一個目的是提供含有細(xì)胞表面分子、結(jié)合配對物和生物反應(yīng)物質(zhì)的復(fù)合物。上文給出了細(xì)胞表面分子、結(jié)合配對物和生物反應(yīng)物質(zhì)的例子。
優(yōu)選復(fù)合物含有根據(jù)本發(fā)明的任何方法鑒定出的細(xì)胞表面分子和如上文所述的靶向復(fù)合物。
或者，復(fù)合物可含有如上文所述的細(xì)胞表面分子和靶向復(fù)合物，其中所述細(xì)胞表面分子優(yōu)選含有下述物質(zhì)或基本上由下述物質(zhì)組成，或例如是GRIA2，如LPR8，例如是CHRNA5，如TMEFF，例如是NPTXR，如運(yùn)鐵蛋白受體；如II型膜蛋白克隆例如是HP10481；如II型膜蛋白克隆如HP10390；例如是PG40；如TRC8；例如是TR2-11；如OA3抗原表面決定簇；例如是整聯(lián)蛋白α6，例如GPIIb；如玻連蛋白受體α亞單位；例如是整聯(lián)蛋白α-7；如整聯(lián)蛋白αE前體；例如是整聯(lián)蛋白α6B；如整聯(lián)蛋白α5亞單位；例如是整聯(lián)蛋白β-5亞單位；如整聯(lián)蛋白α-3鏈；例如是RYK；如淀粉樣前體蛋白-結(jié)合蛋白1；例如是推定的跨膜GTP酶；如膜輔因子蛋白；例如GLVR1；例如是Mr110,000抗原，例如是多配體聚糖-1；如推定的有7個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)；例如是LCA-同系物/LAR蛋白；如M6抗原；例如是Me491/CD63抗原；如多跨越膜蛋白；例如是DDR；如自泌活動因子受體；例如是胰島素受體前體；如IGF1R，例如是胰島素-樣生長因子II受體；如SAS；例如是TAPA-1；如MICB；例如是MHC II類HLA-DR7-相關(guān)糖蛋白β-鏈；如HLA-DP；例如是骨小蛋白聚糖I雙糖鏈蛋白聚糖；如CAR；例如是MEA11；如γ-干擾素受體α鏈；例如是多聚免疫球蛋白受體；如metabotropic谷氨酸受體4型；例如是metabotropic谷氨酸受體8；如CLPTM1，例如是MAGE-4b；如MAGE5a；例如是MAGE-3；例如MAGE-1；例如是MAGE6；如MAGE-9；例如是MAGE11；如CD24；例如是CD59；如CD44；例如是低密度脂蛋白受體；如極低密度脂蛋白受體；例如是N-CAM；如核纖層蛋白B受體同系物TM7SF2；例如是推定的T1/ST2受體結(jié)合蛋白前體；如NTR2受體；例如是RAGE-4；如HLA-G1；例如是MOAT-C；如α2δ鈣通道亞單位同種型I；例如是LFA-3；如L1-CAM；例如是AVPR2；如C1 p115 C1；例如是TE2；如RbP；例如是HCF1；如IRAK；例如是CD151；如表面抗原；例如是MAG；如GPR19；例如是pcta-1；如PRAME；例如是加壓素活化的鈣質(zhì)轉(zhuǎn)移受體-樣蛋白；如5-羥色胺受體5-HT4B；例如是5-羥色胺1D受體(5-HT1D～)；如CD9；例如是LDL受體成員LR3；如DR6；例如是腫瘤壞死因子受體；如HG38；例如是尿激酶型纖溶酶受體；如FGF受體；例如是神經(jīng)生長因子受體；如胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；例如是CB1大麻素受體(CNR1)；如PSG；例如是PSG13’；如CPE-受體；例如是CRH2R；如OCI5；例如是TRAIL受體2；如HNMP-1；例如是腎α-2-腎上腺素能受體；如紅細(xì)胞生成素受體；例如是硫酸軟骨素蛋白聚糖多能聚糖V1；例如是mGluR1β；如CD97；例如是L6；如NY-ESO-1；例如是T-細(xì)胞受體αδ；如ror1；例如是ror2；如SSTR2；例如是VESPR；如IgGFc受體；例如是谷氨酸受體亞單位GluRC；如HEK2；例如是PVR；如CEA；例如是CC-趨化因子-結(jié)合受體JAB61；如HER2；例如是HER3；如類似于表皮生長因子受體-相關(guān)蛋白的假擬蛋白FLJ22357；例如是推定的B-型內(nèi)皮肽受體-樣蛋白；如GLVR2；例如是P2X4嘌呤受體；如FPRL1；例如是心房利鈉肽清除受體；例如是胃泌素/CCK-B受體；如神經(jīng)調(diào)節(jié)肽B受體；例如是GFRA3；如GRPR；例如是CDH1；如CDH2；例如是TGFBR1；如TGFBR2；例如是TGFBR3；如表皮生長因子受體的前體。
更優(yōu)選細(xì)胞表面分子選自NCAM1，NPTXR，LRP8，CHRNA5，GRIA2，GRM8，ITGAV，ITGAE，TNFRSF12，L1CAM，GPR49和TMEFF1。
疾病(conditions)前惡性和/或惡性疾病可以是例如癌癥或可發(fā)展為癌癥的疾病。本發(fā)明范圍內(nèi)的術(shù)語癌癥覆蓋了惡性和良性腫瘤以及白血病。
癌癥可以是例如腺瘤、癌或肉瘤。癌癥可選自例如黑素瘤、腦瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、白血病、結(jié)腸癌、直腸癌、睪丸癌、腎癌、肝癌、唇癌、舌癌、胃癌、皮膚癌、肉瘤、間皮瘤、膀胱癌、骨瘤、惡性胸膜滲漏、腹水、腦膜癌病、頭頸癌和內(nèi)分泌器官的癌癥，如甲狀腺、腦垂體和腎上腺癌。
肺癌可以是例如選自小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非-小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的癌癥。優(yōu)選前惡性和/或惡性疾病是小細(xì)胞肺癌。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，前惡性和/或惡性疾病是乳腺癌。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，前惡性和/或惡性疾病是腦瘤。腦瘤可選自例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、神經(jīng)元瘤、室管膜瘤、顱咽管瘤(craniopharingioma)、松果體腫瘤、生殖細(xì)胞腫瘤和神經(jīng)鞘瘤。
給藥和藥物組合物接受治療的個體可以是任何動物，然而，優(yōu)選個體是人。
本發(fā)明的治療可以是改善性治療，可以是治愈性治療和/或預(yù)防性治療。
本發(fā)明藥物傳遞的主要途徑是靜脈內(nèi)，口服和皮下，下文將要描述這些途徑。也可以使用其它能將藥物有效傳遞至靶位點(diǎn)或?qū)⑺幬镉行?dǎo)入血流的給藥方法，如局部傳遞。也可以通過吸入，即鼻內(nèi)吸入和經(jīng)口吸入施用化合物。
可施用本發(fā)明的藥物制品的粘膜可以是欲施用生物活性物質(zhì)的哺乳動物的任何粘膜，例如鼻、陰道、眼、口腔、生殖道、肺、胃腸道或直腸。
本發(fā)明的化合物優(yōu)選被非腸道給藥，即通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。一般優(yōu)選非腸道給藥的皮下和肌內(nèi)形式。通過常規(guī)技術(shù)即可制備適當(dāng)?shù)慕o藥劑量形式。
優(yōu)選非腸道施用本發(fā)明的靶向復(fù)合物，更優(yōu)選通過靜脈內(nèi)注射和/或皮下注射施用靶向復(fù)合物。
本發(fā)明的化合物可與至少一種其它化合物一起被施用。可以以獨(dú)立的制劑，或單位劑量形式的混合制劑同時(shí)施用化合物，或依次施用化合物。
劑量要求將隨著所用的特定藥物組合物、給藥途徑和欲治療的特定個體的不同而改變。理想狀態(tài)下，本發(fā)明方法治療的個體將以最大耐受劑量接受藥物有效量的化合物，所述劑量一般不高于產(chǎn)生藥物抗性前所需的劑量。
根據(jù)欲治療疾病的特性和程度、給藥的形式，途徑和位點(diǎn)、以及接受治療的特定患者可以確定靶向復(fù)合物的個體劑量，通過常規(guī)技術(shù)可確定最適劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)懂得本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)的療程確定試驗(yàn)即可確定最佳療程，即在限定的天數(shù)內(nèi)每天施用的化合物或其藥物可接受鹽的劑量次數(shù)。
本文所用術(shù)語“單位劑量形式”指的是適于用作人和動物個體的單一劑量的物理分離單位，每個單位含有預(yù)定量的、單獨(dú)或與其它試劑混合的化合物，其含量足以產(chǎn)生與藥物可接受的稀釋劑或載體相關(guān)的所需效果。有關(guān)本發(fā)明單位劑量形式的特別說明取決于所用的一種或多種特定化合物和欲達(dá)到的效果，以及宿主中與每種化合物有關(guān)的藥物動力學(xué)。給藥劑量應(yīng)為“有效量”或在各個患者中獲得“有效水平”所需的量。
由于“有效水平”被用作給藥劑量的優(yōu)選終點(diǎn)，實(shí)際的劑量和安排將根據(jù)個體間在藥物動力學(xué)、藥物分布和代謝方面的差異而改變?！坝行健笨杀欢x為例如對應(yīng)于本發(fā)明的一種或多種化合物的濃度的個體所需血液或組織水平。
可通過常規(guī)技術(shù)，如RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy1995，E.W.Martin編，Mack Publishing Company，第19版，Easton，Pa所述的技術(shù)制備含有本發(fā)明化合物的藥物組合物。組合物可以是常規(guī)形式，例如膠囊、片劑、煙霧劑、溶液、懸浮劑或局部應(yīng)用劑。
本發(fā)明化合物的藥物可接受鹽也落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。可以標(biāo)準(zhǔn)方式制備藥物可接受鹽。如果母體化合物是堿，可在適當(dāng)溶劑中用過量的有機(jī)或無機(jī)酸處理該化合物。如果母體化合物是酸，可在適當(dāng)溶劑中用無機(jī)或有機(jī)堿處理該化合物。
可以通過口服、直腸或非腸道(包括皮下)途徑，以堿金屬或其堿土金屬鹽的形式同時(shí)或與藥物可接受載體或稀釋劑一起，特別優(yōu)選以其藥物組合物的形式施用有效量的本發(fā)明的化合物。
用于本發(fā)明藥物組合物的藥物可接受的酸加成鹽的例子包括衍生自無機(jī)酸和有機(jī)酸的鹽，所述無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸，所述有機(jī)酸如酒石酸、乙酸、檸檬酸、馬來酸、乳酸、富馬酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸、p-甲苯磺酸和芳基磺酸。
盡管待施用的本發(fā)明化合物或其鹽可以是粗(raw)化合物，但優(yōu)選以藥物制劑的形式給藥。因此，本發(fā)明還提供了藥用的藥物制劑，其含有本發(fā)明的化合物或其如本文所定義的藥物可接受的鹽，以及藥物可接受載體。
可以多種口服給藥的劑量形式配制本發(fā)明的化合物。藥物組合物和劑量形式可含有本發(fā)明的化合物或其藥物可接受鹽或其晶體形式作為活性成分。藥物可接受載體可以是固體或液體。固體形式的制品包括粉末、片劑、丸劑、膠囊、扁囊劑、栓劑和分散顆粒。固體載體可以是一種或多種也可用作稀釋劑、調(diào)味劑、增溶劑、潤滑劑、懸浮劑、結(jié)合劑、防腐劑、潤濕劑、片劑崩解劑或膠囊包裹材料的物質(zhì)。
優(yōu)選組合物含有一種或多種占重量0.5％至75％的本發(fā)明化合物，其余部分由適當(dāng)?shù)乃幬镔x形劑組成。對于口服給藥而言，所述賦形劑包括藥物級的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、明膠、蔗糖、碳酸鎂等。
在粉末中，載體是被細(xì)分的固體，所述載體與被細(xì)分的活性成分混合。在片劑中，活性成分以適當(dāng)比例與具有必需的結(jié)合能力的載體混合，并被壓制成所需的形狀和大小。粉末和片劑優(yōu)選含有1％至約70％活性化合物。適當(dāng)?shù)妮d體是碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、果膠、糊精、淀粉、明膠、龍須膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點(diǎn)蠟、可可脂等。術(shù)語“制品”欲包括含包裹材料作為載體的活性化合物制品，所述包裹材料可提供膠囊，其中含或不含載體的活性成分被與之相關(guān)的載體包圍。類似地，還包括扁囊劑和錠劑。片劑、粉末、膠囊、丸劑、扁囊劑和錠劑可以是適于口服的固體形式。
本發(fā)明的滴劑可含有無菌或非-無菌含水或油溶液或懸浮液，通過將活性成分溶解于適當(dāng)水溶液中即可制備所述滴劑，所述水溶液中任選包括殺細(xì)菌和/或殺真菌藥劑和/或任何其它適當(dāng)?shù)姆栏瘎?，并任選包括表面活性劑。然后通過過濾澄清所得溶液，轉(zhuǎn)移至適當(dāng)容器中密封，通過高壓滅菌或在98-100℃維持半小時(shí)以進(jìn)行消毒?；蛘撸ㄟ^過濾對溶液進(jìn)行消毒，并在無菌狀態(tài)下將溶液轉(zhuǎn)移至容器中。適于包含在滴劑中的殺細(xì)菌和殺真菌劑的例子是硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002％)，苯扎氯銨(0.01％)和醋酸氯己定(chlorhexidine acetate，0.01％)。油性溶液制品的適當(dāng)溶劑包括甘油、稀釋乙醇和丙二醇。
本發(fā)明還包括固體形式的制品，在使用前將其轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w形式的制品供口服。所述液體形式包括溶液、懸浮液和乳劑。除了活性成分外，這些制品可含有著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、緩沖液、人工和天然甜味劑、分散劑、增稠劑、增溶劑等。
其它適于口服的形式包括液體形式的制品，其包括乳劑、糖漿、酏劑、水溶液、含水懸浮液、牙膏、凝膠牙粉、咀嚼樹膠，還包括在使用前轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w形式制品的固體形式的制品。可以在含水丙二醇溶液中制備乳劑，或者乳劑可含有乳化劑，如卵磷脂、山梨聚糖一油酸或金合歡。通過將活性成分溶解于水中并添加適當(dāng)?shù)闹珓?、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑和增稠劑即可制備水溶液。通過將被細(xì)分的活性成分分散于含粘性物質(zhì)的水中即可制備含水懸浮液，所述粘性物質(zhì)如天然或合成的樹膠、樹脂、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和其它眾所周知的懸浮劑。液體形式的制品包括溶液、懸浮液和乳劑，除了活性成分外，所述制品還含有著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、緩沖液、人工和天然甜味劑、分散劑、增稠劑、增溶劑等。
可配制本發(fā)明的化合物供非腸道給藥(例如通過注射，如巨丸劑注射或連續(xù)灌注)，可以在添加有防腐劑的安瓿、預(yù)先-充滿的注射器、小體積灌注液或多-劑量容器中以單位劑量形式提供所述化合物。例如，組合物可在油性或含水載體中采取懸浮液、溶液或乳劑的形式，例如溶于含水聚乙二醇的溶液形式。油性或不含水的載體、稀釋劑或溶劑的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)和可注射的有機(jī)酯(如油酸乙酯)，并且可含有配制劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑或懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，活性成分可以是通過在無菌狀態(tài)下分離無菌固體或通過凍干溶液而獲得的粉末形式，使用前再用適當(dāng)載體，如無菌、無熱原的水將所述粉末重建為溶液。
可用于非腸道制劑的油包括石油、動物油、植物油或合成的油?？捎糜谶@種制劑的油的具體例子包括花生、大豆、芝麻、棉籽、玉米、橄欖、礦脂和礦物油?？捎糜诜悄c道制劑的適當(dāng)脂肪酸包括油酸、硬脂酸和異硬脂酸。油酸乙酯和異丙基肉豆蔻酸酯是適當(dāng)脂肪酸酯的例子。
可用于非腸道制劑的適當(dāng)皂類包括脂肪堿金屬、銨和三乙醇胺鹽，適當(dāng)?shù)娜ノ蹌┌?a)陽離子去污劑，如二甲基二烷基銨鹵化物和烷基吡啶鎓鹵化物；(b)陰離子去污劑，如烷基、芳基和烯屬磺酸酯，烷基、烯烴、醚和甘油一硫酸酯鹽以及磺基丁二酸酯；(c)非離子型去污劑，如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物；(d)兼性去污劑，如烷基-β-氨基丙酸酯和2-烷基-咪唑啉季銨鹽；和(e)它們的混合物。
非腸道制劑溶液中一般含有占重量約0.5％至約25％的活性成分?？梢允褂梅栏瘎┖途彌_液。為了使注射位點(diǎn)的發(fā)炎現(xiàn)象最小化或消除發(fā)炎現(xiàn)象，所述組合物可含有一種或多種親水-親脂平衡(HLB)值約為12至17的非離子型表面活性劑。所述制劑中的表面活性劑量一般約占重量的5％至15％。適當(dāng)表面活性劑包括聚乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，如山梨聚糖一油酸以及環(huán)氧乙烷與疏水基通過氧化丙烯與丙二醇縮合形成的高分子量加合物?？梢栽趩挝?劑量或多-劑量密封的容器(如安瓿和小管)中提供非腸道制劑，也可以在凍干條件下儲存所述制劑，使用前僅需要加入無菌的液體賦形劑，如水來配制注射液。臨時(shí)注射溶液和懸浮液可制備自上述類型的無菌粉末、顆粒和片劑。
也可以局部施用本發(fā)明的化合物。局部給藥的區(qū)域包括皮膚表面以及陰道、直腸、鼻腔、口腔和喉的粘膜組織。經(jīng)由皮膚和粘膜局部給藥的組合物應(yīng)該不產(chǎn)生發(fā)炎的跡象，如腫脹或發(fā)紅。
局部組合物可包括適于局部給藥的藥物可接受載體。因此，組合物可采取例如下述形式懸浮液、溶液、軟膏、洗液、性潤滑劑、乳劑、泡沫劑、煙霧劑、噴涂劑、栓劑、植入劑、吸入劑、片劑、膠囊、干粉、糖漿、藥膏或錠劑。制備所述組合物的方法是制藥業(yè)眾所周知的。
可將本發(fā)明的化合物配制成軟膏、乳劑或洗液，或配制成經(jīng)皮的膏藥供表皮局部給藥。本發(fā)明的乳劑、軟膏或膏藥是供外部使用的半固體狀活性成分制劑。通過借助于適當(dāng)?shù)臋C(jī)器，將經(jīng)細(xì)分或粉末形式的活性成分單獨(dú)、或在含有水或非水液體的溶液或懸浮液中與油脂或非-油脂基混合，即可制備上述制劑。油脂或非油脂基可含有烴，如硬、軟或液體石蠟，甘油，蜂蠟，金屬皂；膠水；源自天然的油，如杏仁、玉米、花生、蓖麻或橄欖油；羊毛脂或其衍生物或脂肪酸，如硬脂酸或油酸以及醇，如丙二醇或大粒凝膠。制劑中可摻入任何適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣?，如陰離子、陽離子或非離子型表面活性劑，如山梨聚糖酯或其聚氧乙烯衍生物。制劑中還可包含懸浮劑，如天然樹膠、纖維素衍生物或無機(jī)物，如silicaceous硅石和其它成分，如羊毛脂。
本發(fā)明的洗液包括適用于皮膚或眼睛的洗液。眼洗液可含有無菌水溶液，其任選含有殺菌劑，通過類似于制備滴劑的方法可以制備眼洗液。用于皮膚的洗液或涂抹劑可包括促進(jìn)皮膚干燥和使皮膚變涼的藥劑，如乙醇或丙酮，和/或水份增加劑，如甘油或如海貍油或花生油的油類。
本文所述的藥物活性化合物可以經(jīng)皮給藥。經(jīng)皮給藥一般包括經(jīng)藥物的經(jīng)皮通道將藥劑傳遞至患者的全身循環(huán)。皮膚位點(diǎn)包括經(jīng)皮給藥的解剖學(xué)區(qū)域，包括前臂、腹部、胸部、背部、臀部、乳突區(qū)等。
通過將活性化合物源暴露于患者皮膚達(dá)一段時(shí)間即可完成經(jīng)皮傳遞。經(jīng)皮膏藥有附加的優(yōu)點(diǎn)，即能為身體提供藥劑-化學(xué)修飾劑復(fù)合物的受控傳遞。參見Transdermal Drug DeliveryDevelopmental Issues and ResearchInitiatives，Hadgraft and Guy(編)，Marcel Dekker，Inc.，(1989)；Controlled DrugDeliveryFundamentals and Applications，Robinson and Lee(編)，Marcel Dekker，Inc.，(1987)；和Transdermal Delivery of Drags，Vols.1-3，Kydonieus andBerner(編)，CRC Press，(1987)。通過將藥物活性化合物溶解、分散或要不然摻入適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)，如彈性體基質(zhì)材料中，即可制備所述劑量形式。也可使用吸收增強(qiáng)劑來增加化合物穿過皮膚的流動性。通過提供速率-控制膜或?qū)⒒衔锓稚⒂诰酆衔锘|(zhì)或凝膠中，即可控制所述流動的速率。
可將本發(fā)明的化合物配制成栓劑來進(jìn)行給藥。首先融化低熔點(diǎn)蠟，如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物，接著通過例如攪拌均勻分散活性成分。然后將熔化的均勻混合物倒入合適大小的模具中，使其冷卻并固化。
可將活性化合物配制成栓劑，所述栓劑含有例如分散在聚乙二醇(PEG)(如PEG1000[96％]和PEG4000[4％])載體中的約0.5％至約50％的本發(fā)明化合物。
可將本發(fā)明的化合物配制成陰道給藥的制劑。除了活性成分外，還含有上述載體的陰道藥栓、棉塞、乳劑、凝膠、膏藥、泡沫劑或噴涂劑是本領(lǐng)域已知的適當(dāng)制劑。
必要時(shí)，可用適于活性成分的緩釋或控釋給藥的腸涂層制備制劑。
藥物組合物通常含有載體。說明性的固體載體包括乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石、明膠、瓊脂、果膠、金合歡、硬脂酸鎂、硬脂酸等。固體載體可包括一種或多種也可用作調(diào)味劑、潤滑劑、增溶劑、懸浮劑、填充劑、滑動劑、壓縮助劑、結(jié)合劑或片劑-崩解劑的物質(zhì)；載體也可以是膠囊包裹材料。在粉末中，載體是被細(xì)分的固體，所述載體與被細(xì)分的活性成分混合。在片劑中，活性成分以適當(dāng)比例與具有必需的壓縮特性的載體混合，并被壓制成所需形狀和大小。粉末和片劑優(yōu)選含有高達(dá)99％的活性成分。適當(dāng)?shù)墓腆w載體包括例如磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明膠、纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl-pyrrolidine)，低熔點(diǎn)蠟和離子交換樹脂。
液體載體實(shí)例包括糖漿、花生油、橄欖油、水等。液體載體被用于制備溶液、懸浮液、乳劑、糖漿、酏劑和加壓組合物?；钚猿煞挚扇芙饣驊腋∮谒幬锟山邮艿囊后w載體，如水、有機(jī)溶劑、兩者的混合物或藥物可接受的油或脂肪。液體載體可含有其它適當(dāng)?shù)乃幬锾砑觿?，如增溶劑、乳化劑、緩沖液、防腐劑、甜味劑、調(diào)味劑、懸浮劑、增稠劑、著色劑、粘度調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑或滲透-調(diào)節(jié)劑?？诜头悄c道給藥的液體載體的適當(dāng)例子包括水(部分含有上述添加劑，如纖維素衍生物，優(yōu)選為羧甲基纖維素鈉溶液)，醇(包括一元醇和多元醇，如二醇)及其衍生物，以及油(如經(jīng)分級分離的椰子油和花生油)。為了進(jìn)行非腸道給藥，載體也可以是油性酯，如油酸乙酯和異丙基肉豆蔻酸酯。無菌的液體載體可用于無菌液體形式的組合物供非腸道給藥。加壓組合物所用的液體載體可以是鹵化烴或其它藥物可接受的推進(jìn)劑。肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下注射可以利用例如無菌溶液或懸浮液形式的液體藥物組合物。也可以靜脈內(nèi)施用無菌溶液。也可以口服液體或固體組合物形式的化合物。
載體或賦形劑可包括本領(lǐng)域眾所周知的延時(shí)物質(zhì)，如硬脂酸甘油酯或甘油二硬脂酸酯與蠟，乙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，甲基異丁烯酸酯等。當(dāng)配制成口服給藥的制劑時(shí)，據(jù)認(rèn)為含0.01％吐溫80的PHOSALPG-50(含1，2-丙二醇的磷脂濃縮物，A.Natterman & Cie，GmbH)可提供其它化合物的可接受口服制劑，它適用于本發(fā)明多種化合物的制劑。
聯(lián)合療法本發(fā)明的靶向復(fù)合物可與一種或多種第二療法，例如目前用于治療癌癥的療法聯(lián)合使用。
例如，所述第二療法可選自手術(shù)療法、化學(xué)療法、放射療法、細(xì)胞因子療法、激素療法、基因治療、免疫療法和激光療法。
化學(xué)療法包括施用化學(xué)治療劑，如細(xì)胞靜止劑。本發(fā)明的細(xì)胞靜止劑可選自例如carboplatin、順式鉑氨、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、六甲密胺、阿霉素、表阿霉素、依托泊苷(VP-16)、表鬼臼毒噻吩糖苷(VM-26)、長春花新堿、長春地辛、taxans、irinotecan、酪氨酸激酶抑制劑、嘧啶亞硝脲、環(huán)己亞硝脲、BCNU、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、抗血管生成化合物、抗轉(zhuǎn)移化合物、5-氟尿嘧啶±甲酰四氫葉酸、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑I和II以及Temozolamide。
另外，化學(xué)療法可包括例如施用抗-雌激素、抗-孕激素、抗-雄激素、LH-RH拮抗劑或aromatase抑制劑。
實(shí)施例以下是本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)施例，不應(yīng)將其看成是對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1培養(yǎng)小細(xì)胞肺癌(SCLC)細(xì)胞系使用下列小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系進(jìn)行分析


在37℃、含5％CO2的潮濕氣氛中，在不含抗生素的培養(yǎng)基內(nèi)維持所有細(xì)胞，每周傳代2次。所有培養(yǎng)基和血清都得自Life Technologies。
異種移植將0.5-1.2×107個細(xì)胞接種于12-13周齡Balb/c裸鼠肋腹兩側(cè)的皮下。當(dāng)異種移植的腫瘤中有一個的最大直徑達(dá)1cm時(shí)，處死小鼠，收集這些腫瘤。除去壞死的組織。通過接種2mm腫瘤塊，僅在裸鼠中增殖細(xì)胞系CPH 136A。立即處理分離RNA所用的腫瘤，或者將其儲存于RNA later(Ambion)中放置24小時(shí)，然后儲存于-70℃并按下述方法進(jìn)行加工。立即按下文所述加工裂解用的腫瘤以進(jìn)行Western印跡分析。
正常組織的RNA從Clontech(胎腦、腦、肺、腎臟、心臟、氣管、腎上腺、前列腺、唾液腺、甲狀腺)或Ambion(肺、肝臟、腦、胰腺、脾臟、小腸、骨骼肌、結(jié)腸、胃、睪丸)獲得正常人組織的總RNA。僅對一種樣品分析平行雙份(Clontech和Ambion的肺RNA)，對一種樣品分析平行三份(Clontech的2個不同批次樣品以及Ambion的一個批次樣品的腦RNA)。胎腦是胚胎神經(jīng)內(nèi)分泌組織的參照。
從細(xì)胞系中分離RNA(通過胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞)收集半-鋪滿培養(yǎng)物的細(xì)胞，使用RNeasy試劑盒(Qiagen)，根據(jù)廠商說明分離約107個細(xì)胞的總RNA。在TRlzol(LifeTechnologies)中勻漿異種移植的(新鮮的或儲存于RNA later之后的)腫瘤，并根據(jù)廠商說明純化RNA。使用RNAeasy試劑盒(Qiagen)進(jìn)一步純化腈TRlzol分離的RNA。
通過260nm下的光吸收值(A260)估計(jì)RNA的濃度。通過測定A260/280的比例為1.9或更高，并通過經(jīng)甲醛(變性)凝膠分析估計(jì)28S rRNA與18S rRNA的比例約為2，可以證實(shí)RNA的完整性。
制備cDNA70℃變性10分鐘之后，使溶于10μl H2O的10μg總RNA與100pmolT7-(dT)24引物(經(jīng)HPLC純化的5′-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG(T)24(SEQ ID NO401)，得自GENSET)雜交。使用得自Gibco BRL，Life Technologies的試劑進(jìn)行下述反應(yīng)。于42℃，使用400U Super-Script RnaseH-Reverse Transcriptase試劑盒，在20μl含第一鏈緩沖液(50mM Tris-HCl(pH 8.3)，75mM KCl，3mM MgCl2)，10mM DTT，0.5mM每種dNTP的反應(yīng)中，進(jìn)行第一鏈合成達(dá)1小時(shí)。通過于16℃保溫2小時(shí)，在150μl含0.26mM dNTP，0.07U/μl大腸桿菌DNA連接酶，0.27U/μl大腸桿菌DNA聚合酶，0.013U/μl大腸桿菌Rnase H的第二鏈緩沖液(20mM Tris-Cl(pH 6.9)，5mMMgCl2，100mM KCl，0.15mM β-NAD+，10mM(NH4)2SO4)中進(jìn)行第二鏈合成。通過加入0.07U/μl T4 DNA聚合酶并于16℃保溫5分鐘以填平DNA末端。通過加入EDTA至終濃度為33μM以終止反應(yīng)。通過用1倍體積的預(yù)先用10mMTris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA飽和的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提取，接著用含2.5M NH4Ac的63％乙醇進(jìn)行沉淀，同時(shí)添加2μl Pellet Paint(Novagen)以肉眼觀察沉淀物，即可純化出cDNA。用80％乙醇連續(xù)沖洗沉淀物2次，風(fēng)干沉淀物，將其溶解于12μl水中。通過瓊脂糖凝膠電泳分析等分試樣以確保cDNA長度范圍為0.1-＞10kb。
制備經(jīng)生物素標(biāo)記的cRNA(IVT-cRNA)用得自Enzo Diagnostics，NY，USA的BioArrayTM，High YieldTMRNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記試劑盒，根據(jù)廠商說明，在40μl反應(yīng)中，使用6μl cDNA(估計(jì)約含有1μgcDNA)進(jìn)行使用生物素標(biāo)記的核糖核苷酸，用T7 RNA聚合酶進(jìn)行的能產(chǎn)生生物素標(biāo)記的cRNA(互補(bǔ)RNA)的體外轉(zhuǎn)錄。使用RNeasy自旋柱試劑盒(Qiagen)，根據(jù)廠商特別說明的RNA清除法，純化經(jīng)生物素標(biāo)記的cRNA。通過變性的瓊脂糖凝膠電泳分析IVT-cRNA等分試樣以確保全長轉(zhuǎn)錄物(.1-＞10kb)。通過260nm下的光吸收值估計(jì)cRNA的濃度，校正所述濃度以提供最初用于cDNA反應(yīng)的總RNA。得率為每個反應(yīng)25-100μg。
IVT-cRNA的片段化通過于94℃，在20μl含有0.04M Tris-乙酸(pH 8.1)，0.03M MgAc，0.1MKAc的反應(yīng)中保溫35分鐘，使22μg IVT-cRNA片段化。通過瓊脂糖凝膠電泳分析片段化IVT-cRNA的等分試樣以確保獲得大小為30-200個堿基的片段。
與Affymetrix GeneChipTM雜交并分析數(shù)據(jù)(芯片分析)在400μl含有0.1M MES，0.75，[Na+]，0.1mg/ml鯡精DNA，0.1mg/ml乙酰基化BSA，0.05nM生物素化對照寡B2(5′-GTCGTCAAGATGCTACCGTTCAGGA(SEQ ID NO402)和供摻加用的對照生物素標(biāo)記的IVT-cRNA的體積中，含有20μg片段化IVT-cRNA的雜交混合物制備自質(zhì)粒pglks-bioB(150pM)，pglks-bioC(500pM)，pglks-bioD(2.5nM)和pglks-cre(10nM)(美國組織培養(yǎng)物保藏中心)。對照寡核苷酸和對照cRNA得自Affymetrix。使100μl與Affymetrix test2芯片雜交，接著用鏈霉親和素-藻紅蛋白偶聯(lián)物染色，并用生物素化的抗-鏈霉親和素山羊抗體標(biāo)記，最后用鏈霉親和素-藻紅蛋白偶聯(lián)物染色(根據(jù)廠商的方法Mini-euk1)，或使300μl與Affymetrix U95A基因芯片雜交，并根據(jù)廠商的方法EukGE-WS2，在Affymetrix Fluidics站進(jìn)行染色，并在聚焦激光掃描儀(Hewlett Packard GeneArray Scanner G2500A)上，在560nm處進(jìn)行掃描。首先使用4.0版本的Affymetrix Microarray SuiteTM加工數(shù)字化圖像數(shù)據(jù)，以評價(jià)RNA和雜交的質(zhì)量，并使用Affymetrix Data Mining Tool(2.0版本)加工所述圖像數(shù)據(jù)以選擇候選基因。預(yù)先使用第5版本的AffymetrixMicroarray SuiteTM分析數(shù)據(jù)(見結(jié)果)以選擇表面分子。僅分析下述數(shù)據(jù)，其中對照寡核苷酸BioB，BioC，BioD和Cre皆按所描述的方法進(jìn)行檢測；成比例的噪聲(Q)低于10；相對于甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和β-肌動蛋白的3’末端而言，5’末端mRNA水平檢測的比例低于2；按所描述的方法鑒定所有探針套中的至少40％。為了在樣品之間進(jìn)行比較，將總強(qiáng)度設(shè)置為100。
RT-PCR對選定基因進(jìn)行半-定量RT-PCR以證實(shí)芯片分析。將按上文所述制備的cDNA作為獨(dú)立的制品用于RT-PCR，而不是用于芯片分析。在25μl含有200nM引物(DNA Technology A/S)，1.5mM MgCl2，0.2mM每種dNTP，0.1U/μlPlatinum Taq Polymerase(Life Technologies)的、由酶提供的緩沖液中，以0.008％甲酚紅和12％蔗糖為上樣緩沖液，使用得自350ng總RNA的cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。
所有反應(yīng)為94℃2分鐘1輪循環(huán)；94℃，30秒，退火溫度如每個引物套所示，30秒，72℃，30秒25輪循環(huán)，最后在72℃延伸10分鐘。僅使用25輪循環(huán)使得反應(yīng)為半定量。
所用引物套為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)512bp跨越GenBank登錄號NM_002046bp.608-1119的PCR產(chǎn)物，有義5′-TCCATGCCATCACTGCCACCCA(SEQ ID NO403)反義5′-TCTTGTGCTCTTGCTGGGGCTG(SEQ ID NO404)退火溫度56℃，進(jìn)行了1輪RT-PCR反應(yīng)。
Pro30(KIAA0042)
432bp跨越GenBank登錄號D26361bp.5181-5612的PCR產(chǎn)物，有義5′-GTTTTGAATCTGAAGAAAGCCC(SEQ ID NO405)反義5′-TCAAACTCCTGACCTTGTGATCT(SEQ ID NO406)退火溫度49℃，進(jìn)行了2輪獨(dú)立的RT-PCR反應(yīng)。
Pro41(MAD2)525bp跨越GenBank登錄號AJ000186 bp.643-1167的PCR產(chǎn)物，有義5′-GTAAATAGCATGGTGGCCTACA(SEQ ID NO407)反義5′-GGTCCAAAGGAGCTATACAGCA(SEQ ID NO408)退火溫度45℃，進(jìn)行了2輪獨(dú)立的RT-PCR反應(yīng)。
Pro 221(胰島瘤-相關(guān)抗原，IA-1)532bp跨越GenBank登錄號M93119 bp.1549-2080的PCR產(chǎn)物，有義5′-GTGTTCCCCTGCAAGTACTGCCC(SEQ ID NO409)反義5′-CAGAGATTGGTAGGCGAGGCGA(SEQ ID NO410)退火溫度52℃，進(jìn)行了2輪獨(dú)立的RT-PCR反應(yīng)。
Pro 210(核纖層蛋白B1)439bp跨越GenBank登錄號L37747bp.424-862的PCR產(chǎn)物，有義5′-ACTGTGTACTGTTCGGAAGGG(SEQ ID NO411)反義5′-TAGAGAAACCCTTCCCTCCC(SEQ ID NO412)退火溫度46℃，僅進(jìn)行了1輪RT-PCR反應(yīng)，未對睪丸進(jìn)行RT-PCR。
Pro71(p161NK4/MTS 1，CDKN2A)437bp跨越GenBank登錄號U26727bp.176-612的PCR產(chǎn)物，有義5′-TGAGGAGCCAGCGTCTAGGG(SEQ ID NO413)反義5′-GTGGCCCTGTAGGACCTTCG(SEQ ID NO414)
退火溫度57℃，僅進(jìn)行了1輪RT-PCR反應(yīng)，未對睪丸進(jìn)行RT-PCR。
DR6(TNFRS12，腫瘤壞死因子受體超家族成員21)559bp跨越GenBank登錄號AF068868bp.1081-1639的PCR產(chǎn)物，有義5′-GTGCTTGTGGTGATTGTGGTGTG(SEQ ID NO415)反義5′-TGTTCTTGTCCTGTGGGGAAGG(SEQ ID NO416)退火溫度56℃，進(jìn)行了2輪獨(dú)立的RT-PCR反應(yīng)。
NCAM1(神經(jīng)細(xì)胞粘附分子)456bp跨越GenBank登錄號HSU63041bp 2045-2500的PCR產(chǎn)物，有義5′-TATGAGGTCTACGTGGTGGC(SEQ ID NO417)反義5′-CTCCTGGCACTCTGGCTTTG(SEQ ID NO418)退火溫度53℃，僅進(jìn)行了1輪RT-PCR反應(yīng)，未對睪丸進(jìn)行RT-PCR。
NPTXR(神經(jīng)元正五聚蛋白受體)482bp跨越GenBank登錄號HS327J16bp.46012-46493的PCR產(chǎn)物，有義5′-CACACGCACACATGTTGCAGC(SEQ ID NO419)反義5′-GCTCTGAGAGGCCAAAGCC(SEQ ID NO420)退火溫度55℃，僅進(jìn)行了1輪RT-PCR反應(yīng)，未對睪丸進(jìn)行RT-PCR。
GLUR2(離子化谷氨酸受體2；GRIA2)522bp跨越GenBank登錄號L20814bp.2449-2970的PCR產(chǎn)物，有義5′-AGGAACCCCAGTAAATCTTGCAG(SEQ ID NO421)反義5′-TCAGTCACACTGACATTCATTCCC(SEQ ID NO422)退火溫度51℃，僅進(jìn)行了1輪RT-PCR反應(yīng)，未對睪丸進(jìn)行RT-PCR。
ITGAV(整聯(lián)蛋白αV亞單位)533bp跨越GenBank登錄號M14648bp.3867-4399的PCR產(chǎn)物，有義5′-AATTTTAGGTCAAATCCTTCAAGCCAAC(SEQ ID NO423)反義5′-TGACAGCCGAGACTGATTTTACACATTA(SEQ ID NO424)退火溫度50℃，僅進(jìn)行了1輪RT-PCR反應(yīng)，未對睪丸進(jìn)行RT-PCR。
LRP8(載脂蛋白E受體2)459bp跨越GenBank登錄號HSZ75190bp.2016-2474的PCR產(chǎn)物，有義5′-GCTCCATATAGGGAGAACTGCTCAG(SEQ ID NO425)反義5′-CCCCAGCAACCAAACATCTTCT(SEQ ID NO426)退火溫度50℃，僅進(jìn)行了1輪RT-PCR反應(yīng)，未對睪丸進(jìn)行RT-PCR。
Western印跡蛋白質(zhì)樣品從細(xì)胞系和異種移植的腫瘤中提取全細(xì)胞裂解物，以證實(shí)選定基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。通過用橡膠刮棒刮擦(對貼壁細(xì)胞而言)，并用冰冷的20mMTris-Cl pH7.5洗滌，由半-鋪滿的細(xì)胞系培養(yǎng)物制備裂解物。在含有按1∶100稀釋的Protease Inhibitor Cocktail Set II和III(Calbiochem)的冰冷的20mMTris-Cl pH7.5，2％TritonX-100中裂解細(xì)胞沉淀物。旋渦振蕩后，于4℃，以15,000×g離心5分鐘以澄清裂解液。收集腫瘤后，立即制備異種移植腫瘤的裂解物，按類似的方法處理成年大鼠腦的裂解物。給腫瘤秤重，在5倍體積(w/w)含有按1∶100稀釋的Protease Inhibitor Cocktail Set II和III(Calbiochem)的冰冷的20mM Tris-Cl pH7.5，2％TritonX-100中，使用Heindolph DIAX 900勻漿器使腫瘤成為勻漿物，于4℃，以15,000×g離心5分鐘以澄清裂解液。按照廠商推薦的方法，使用BCA Protein Assay(Pierce)測定裂解液的蛋白質(zhì)濃度。
在一些western印跡中，將商購的Jurkat(Santa Cruz)和A431(Neomarkers)細(xì)胞裂解液用作陽性對照。
SDS-PAGE和印跡在含有還原劑的LDS樣品緩沖液(Nu-PAGE)中，將5-15μg裂解物上樣于每個泳道，在3-8％Tris Acetate SDS凝膠上進(jìn)行分離，在Tris Acetate SDS遷移緩沖液(NuPAGE)中，150V電泳1小時(shí)，轉(zhuǎn)移至浸于Transfer Buffer(NuPAGE)的PVDF LC 2002(Novex)膜。蛋白質(zhì)大小標(biāo)記是ProSieve有色蛋白質(zhì)標(biāo)記。為了用抗-NCAM1抗體進(jìn)行探測，于37℃用40ng/μl重組EndoN-HIS(E.Bock惠贈)預(yù)處理裂解物5分鐘以消除聚唾液酸化(polysialylation)。
室溫下，用含有5％低脂奶的洗滌緩沖液(10mM Tris-Cl pH 7.5，100mMNaCl，0.1％吐溫20)封閉膜60分鐘(對于抗整聯(lián)蛋白αE抗體(CD103)而言)，對于ITGAE而言，全部保溫和洗滌程序都使用Tris-Cl緩沖液pH 10.2。在如下所述的封閉緩沖液中，使印跡與第一抗體和第二抗體保溫，按照廠商的推薦，通過ECL(Amersham)或使用NBT/BCIP片劑(Roche)的堿性磷酸酶肉眼觀察結(jié)合的抗體。
NCAM1(神經(jīng)細(xì)胞粘附分子)第一抗體按1∶100稀釋的小鼠單克隆抗-NCAM1克隆123C3(SantaCruz)。4℃保溫16小時(shí)。第二抗體按1∶500稀釋的與堿性磷酸酶偶聯(lián)的兔抗-小鼠Ig(DAKO)。室溫下保溫1小時(shí)。通過堿性磷酸酶顯色。
GluR2(離子化谷氨酸受體2)第一抗體按1∶500稀釋的小鼠單克隆抗-GluR2和4(克隆3A11)(Pharmingen)。4℃保溫16小時(shí)。第二抗體按1∶500稀釋的與堿性磷酸酶偶聯(lián)的兔抗-小鼠Ig(DAKO)。室溫下保溫1小時(shí)。通過堿性磷酸酶顯色。
GRM8(GluR8(metabotropic谷氨酸受體8))第一抗體按1∶500稀釋的兔多克隆抗-mGluR8(Upstate Biotechnology，TriChem)。4℃保溫16小時(shí)。第二抗體按1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶豬抗兔Ig(DAKO)。室溫下保溫1小時(shí)。通過ECL顯色。
NPTXR(神經(jīng)元正五聚蛋白受體)
第一抗體按1∶500稀釋的山羊多克隆抗NPTXR(C-17)(Santa Cruz)。4℃保溫16小時(shí)。第二抗體按1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶兔抗山羊Ig(DAKO)。室溫下保溫1小時(shí)。通過ECL顯色。
ITGAE(整聯(lián)蛋白αE亞單位)第一抗體按1∶1000稀釋的山羊多克隆抗整聯(lián)蛋白αE(N-19)(SantaCruz)。4℃保溫16小時(shí)。第二抗體按1∶500稀釋的堿性磷酸酶兔抗山羊Ig(sc-2771)(Santa Cruz)。室溫下保溫1小時(shí)。通過堿性磷酸酶顯色。
所得芯片分析數(shù)據(jù)的群(cluster)分析為了闡明所分析的正常組織和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系之間表達(dá)模式的差異，我們利用了SOM(自-組織圖譜)和等級群集(hierarchical clustering)的特性。連續(xù)使用這些特性，從而在表達(dá)模式相似性的基礎(chǔ)上對基因進(jìn)行分組。分析所使用的基因是平均差大于50的基因，經(jīng)評價(jià)，所述基因存在于任何一個樣品中。
SOMSOM(自-組織圖譜)是一種群分析方法，它在某種程度上與k-中值群有關(guān)。SOM算法背后的基本原理是在重復(fù)輸入數(shù)據(jù)的過程中，最初被隨機(jī)初始化的神經(jīng)元加權(quán)矢量能表示大量初始測量矢量(Toronen等，1999)。計(jì)算中使用了下述參數(shù)基因Xdim1，Ydim10，重復(fù)100000，樣品Xdim1，Ydim10，重復(fù)20000。
等級群集等級群集背后的基本概念是將一套項(xiàng)目(基因或數(shù)組)裝配成樹形，如果項(xiàng)目彼此非常相似，則通過很短的分支將它們連接起來，隨著相似性的降低，分支逐漸變長。將SOM群集的輸出文件夾用于等級群集，這意味著通過SOM群集發(fā)出的命令被用于指導(dǎo)等級樹中結(jié)點(diǎn)的反彈(Eisen等，1998)。計(jì)算時(shí)使用了下述參數(shù)基因群Yes，計(jì)算加權(quán)Yes，相似性矩陣對射變換不在一點(diǎn)，樣品群Yes，計(jì)算加權(quán)Yes，相似性矩陣對射變換不在一點(diǎn)。隨后進(jìn)行Average Linkage群分析。
群集分析的結(jié)果X-軸(樣品)群集(圖2)如預(yù)期的那樣顯示出群集在一起的SCLC細(xì)胞系，Mar86MI和CPH54A離得最遠(yuǎn)。CPH54A和B群集得非常近(B是A的克隆變體)，GLC14，GLC16和GLC19(得自相同患者)也是如此。在正常組織中，得自Ambion的肺RNA和得自CLONTECH的肺RNA的表達(dá)群集得很近，得自CLONTECH的2個不同批次的腦RNA與得自Ambion的腦RNA的表達(dá)也群集得很近。類似地，胎腦與成熟腦RNA的表達(dá)也群集得很近，在所有正常組織中，胎腦與SCLC細(xì)胞系最近。這證實(shí)了SCLC細(xì)胞系為神經(jīng)-內(nèi)分泌來源。Y-軸(基因)的群集清楚顯示了4個非常不同的在SCLC細(xì)胞系中高表達(dá)的基因群。最小的含有19個基因，第二和第三個各含有65個基因，第四個和最大的基因群含有268個基因。
候選啟動子(第一核酸序列)的選擇標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)啟動子所控制的基因的表達(dá)水平來選擇候選啟動子。對所有21個SCLC細(xì)胞系而不是異種移植物，并對7個正常組織(腦、腎上腺、肺、腎臟、心臟、前列腺、胰腺)進(jìn)行選擇。
根據(jù)幾個標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選擇。僅包括經(jīng)評價(jià)以絕對信號和平均差＞50(表達(dá)水平)存在(P)的基因。在Microsoft Excel 2000中進(jìn)一步處理這些輸出數(shù)據(jù)。選擇經(jīng)評價(jià)在21個SCLC細(xì)胞系中的至少11個中存在的基因，如果經(jīng)評價(jià)，基因存在于一個或多個正常組織中，SCLC細(xì)胞系的平均差中間值必須為正常組織平均差中間值的4倍或4倍以上。使用得自更多個正常組織的RNA進(jìn)行第二次篩選之后，選定的候選啟動子也要滿足與上述相同的標(biāo)準(zhǔn)，如果它們不滿足上述要求，則需放棄。
通過RT-PCR證實(shí)芯片分析通過半-定量RT-PCR分析選定的基因以證實(shí)通過芯片分析鑒定的表達(dá)。使用GADPH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)的引物檢測cDNA的質(zhì)量(圖2)。所有cDNA樣品都明確顯示出供進(jìn)一步分析用的cDNA的質(zhì)量良好。
用Pro221(IA-1，胰島瘤相關(guān)抗原1)的引物進(jìn)行的RT-PCR(圖3)顯示出在正常組織中，腎上腺，腦和胎腦在芯片和RT-PCR分析中都呈弱陽性。4個SCLC細(xì)胞系或異種移植物在兩種分析中都為陰性。所有其它樣品為弱至很強(qiáng)的陽性。RT-PCR和芯片分析的相關(guān)性很好。
用Pro30(KIA0042)的引物進(jìn)行的RT-PCR(圖4)顯示出在正常組織中，睪丸在芯片和RT-PCR分析中都呈陽性。其它正常組織在兩種分析方法中為低或陰性。所有SCLC細(xì)胞和異種移植物在芯片和RT-PCR分析中都為陽性。有幾個樣品在芯片和RT-PCR中的相對量不相關(guān)(如在一個分析中高，而在另一個分析中低)。
用Pro41(MAD2)的引物進(jìn)行的RT-PCR(圖5)顯示出通過芯片分析和RT-PCR測定的大多數(shù)正常組織中的低表達(dá)和睪丸中的高表達(dá)。芯片和RT-PCR分析都顯示出所有SCLC細(xì)胞系和異種移植物的極高表達(dá)。
用Pro210(核纖層蛋白B1)的引物進(jìn)行的RT-PCR(圖6)顯示出正常組織的極低表達(dá)或不表達(dá)(兩種分析中結(jié)腸都為陽性)。芯片分析顯示出所有SCLC和異種移植物的高表達(dá)，RT-PCR表明除了2個外，其它都為強(qiáng)陽性。任意選擇RT-PCR值以匹配芯片信號。
用Pro71(CDKN2A)的引物進(jìn)行的RT-PCR(圖7)顯示出正常組織的極低表達(dá)或不表達(dá)，除4個外，所有SCLC的高表達(dá)。除了一個樣品在RT-PCR中為陰性，在芯片分析中為陽性外，RT-PCR和芯片數(shù)據(jù)的相關(guān)性很好。
通過RT-PCR證實(shí)芯片分析的結(jié)論芯片數(shù)據(jù)和RT-PCR數(shù)據(jù)的相關(guān)性很好。半-定量RT-PCR反應(yīng)證實(shí)了通過芯片分析觀察到的大多數(shù)正常組織中的低表達(dá)至不表達(dá)。SCLC細(xì)胞系和異種移植物中，以及所有或大多數(shù)細(xì)胞系中選定基因的表達(dá)很高。因此，使用芯片分析鑒定高表達(dá)和特異性表達(dá)的啟動子是可取的方法。
通過芯片分析鑒定的候選細(xì)胞表面分子的選擇標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)幾個標(biāo)準(zhǔn)選擇第一代候選細(xì)胞表面分子。對所有21個SCLC細(xì)胞系而不是異種移植物，并對7個正常組織(腦、腎上腺、肺、腎臟、心臟、前列腺、胰腺)進(jìn)行選擇。僅包括經(jīng)評價(jià)以絕對信號和平均差＞50(表達(dá)水平)存在(P)的基因。在Microsoft Excel 2000中進(jìn)一步處理這些輸出數(shù)據(jù)。對每個細(xì)胞系或組織而言，一個基因被記為1分。分別對正常組織和SCLC細(xì)胞系求出每個基因的總分。選擇經(jīng)評價(jià)在21個SCLC細(xì)胞系中的至少5個中存在的基因。如果基因名稱中出現(xiàn)下述的一個詞語，就在這些和選定的候選基因中進(jìn)行檢索“受體、膜、粘附、整聯(lián)蛋白、表面、抗原、多配體聚糖、轉(zhuǎn)運(yùn)、通道、激素、結(jié)合、糖蛋白、基質(zhì)、CAM、橋粒、間隙連接、δ、免疫球蛋白、MHC、CD、(HSPG、CSPG、完整的和具缺刻的)”。根據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索(NCBINucleotide，Protein，Nucleotide，OMIM，PubMed，LocusLink)結(jié)果闡明蛋白質(zhì)的功能和細(xì)胞定位。然后根據(jù)這些信息，著重看功能、細(xì)胞定位和表達(dá)評價(jià)(即SCLC的“表達(dá)評分”高于正常組織)，籍此選擇最佳的候選基因。另外，根據(jù)特定的組織評價(jià)不同正常組織中的表達(dá)，從而估計(jì)出理論上的副作用。使用第5版本的Affymetrix Microarray SuiteTM，對得自21個SCLC細(xì)胞系、8個以異種移植物形式生長的細(xì)胞系和17個正常組織(腦、肺、腎臟、心臟、氣管、腎上腺、前列腺、唾液腺、甲狀腺、肝臟、胰腺、脾臟、小腸、骨骼肌、結(jié)腸、胃、睪丸)的RNA進(jìn)行第二次選擇。僅包括經(jīng)評價(jià)以絕對信號和信號＞20存在(P)于至少6個SCLC細(xì)胞系或異種移植物中的表達(dá)基因。如上所述進(jìn)行進(jìn)一步選擇。
通過RT-PCR證實(shí)芯片分析通過半-定量RT-PCR分析選定基因以證實(shí)通過芯片分析鑒定的表達(dá)。用DR6(TNFR相關(guān)死亡受體6)的引物進(jìn)行的RT-PCR(圖8)顯示出大多數(shù)正常組織中的中度表達(dá)，以及除了一個外，所有SCLC細(xì)胞系或異種移植物中的中度表達(dá)至高表達(dá)。芯片分析顯示出2個正常組織中的高表達(dá)，和8個SCLC細(xì)胞系或異種移植物中的高表達(dá)。芯片分析的所有陽性結(jié)果在RT-PCR中也為陽性。
用LRP8(載脂蛋白E受體2)的引物進(jìn)行的RT-PCR(圖9)顯示出6個正常組織中的低表達(dá)以及所有SCLC細(xì)胞系和異種移植物中的高表達(dá)在RT-PCR中皆為陽性。芯片分析的所有陽性結(jié)果在RT-PCR中也為陽性。任意選擇RT-PCR值以匹配芯片信號。
用NTPXR(神經(jīng)元正五聚蛋白受體)的引物進(jìn)行的RT-PCR(圖10)顯示出芯片分析的所有陽性結(jié)果在RT-PCR中也為陽性。RT-PCR測定出有更多的組織和SCLC具有陽性表達(dá)，但SCLC中的表達(dá)平均較高。兩個SCLC樣品為陰性。任意選擇RT-PCR值以匹配芯片信號。
用NCAM1(神經(jīng)細(xì)胞粘附分子)的引物進(jìn)行的RT-PCR(圖11)顯示出芯片分析的所有陽性結(jié)果在RT-PCR中也為陽性。僅在RT-PCR中，幾個組織和除一個以外的所有SCLC為陽性。在RT-PCR和芯片分析中，一個SCLC細(xì)胞系皆為陰性。任意選擇RT-PCR值以匹配芯片信號。
用GluR2(離子化谷氨酸受體2)的引物進(jìn)行的RT-PCR(圖12A)顯示出芯片分析的所有陽性結(jié)果在RT-PCR中也為陽性。兩種分析都顯示出腦中很高的表達(dá)，RT-PCR顯示出腎上腺中的低表達(dá)。在RT-PCR和芯片分析中，4個SCLC細(xì)胞系皆為陰性。任意選擇RT-PCR值以匹配芯片信號。
用ITGAV(整聯(lián)蛋白αv亞單位)的引物進(jìn)行的RT-PCR(圖12B)顯示出5個樣品在芯片分析中為陽性，但在RT-PCR中為陰性。除此之外，芯片分析和RT-PCR分析之間有良好的相關(guān)性。高表達(dá)出現(xiàn)在SCLC中，也出現(xiàn)在很多組織中。
任意選擇RT-PCR值以匹配芯片信號。
通過RT-PCR證實(shí)表面分子表達(dá)的芯片分析的結(jié)論除了ITGAV外，通過芯片分析鑒定為表達(dá)的所有基因在RT-PCR分析中也被證實(shí)為表達(dá)。當(dāng)通過RT-PCR進(jìn)行測定時(shí)，更多的樣品為陽性。SCLC細(xì)胞系和異種移植物中，以及很多細(xì)胞系中選定基因的表達(dá)高。因此，使用芯片分析鑒定SCLC表達(dá)的表面分子的mRNA是可取的方法。
通過Western印跡證實(shí)芯片分析通過使用特異性抗體的Western印跡分析選定基因產(chǎn)物的表達(dá)，以與通過芯片分析鑒定的mRNA的表達(dá)進(jìn)行比較。僅對SCLC細(xì)胞系和異種移植物進(jìn)行Western印跡分析。使用抗mGluR8(metabotropic谷氨酸受體8)抗體的Western印跡分析(圖13)顯示出所有SCLC細(xì)胞系和異種移植物中的mGluR8蛋白表達(dá)，而芯片分析僅檢測到8個樣品中的表達(dá)。Western印跡的強(qiáng)度與芯片值不相關(guān)，但清楚地顯示出mGluR8的表達(dá)。將大鼠腦勻漿物用作陽性對照。
使用抗NPTXR(神經(jīng)元正五聚蛋白受體)抗體的Western印跡分析(圖14)顯示出所有SCLC樣品中的蛋白質(zhì)表達(dá)，而芯片分析已鑒定出所述表達(dá)。除了GLC 28外，所有樣品為弱至強(qiáng)陽性。DMS153具有顯著的高分子量帶，此帶也存在于大鼠腦中，它可能是未經(jīng)加工的或二聚體化的受體。蛋白質(zhì)的量不與芯片數(shù)據(jù)直接相關(guān)，但清楚顯示出大多數(shù)SCLC中的表達(dá)。將大鼠腦勻漿物用作陽性對照。
使用抗NCAM1(神經(jīng)細(xì)胞粘附分子)抗體的Western印跡分析(圖15)顯示出所有SCLC細(xì)胞系和除一個以外的所有異種移植物中，兩個NCAM1同種型的表達(dá)，而芯片分析僅鑒定出14個樣品中的表達(dá)。芯片分析中的所有陽性樣品在Western印跡中也為陽性。
在芯片分析和Western印跡中，相對量之間沒有明顯的相關(guān)性。
使用抗GluR2(離子化谷氨酸受體2)抗體的Western印跡分析(圖16)顯示出9個樣品中的表達(dá)。6個樣品在芯片分析中為陽性，但在Western印跡中為陰性。然而，抗體的敏感性不高。其它陽性樣品與芯片分析的相關(guān)性較好。
使用抗ITGAE(整聯(lián)蛋白αE亞單位)抗體的Western印跡分析(圖17)顯示出大多數(shù)SCLC樣品中的表達(dá)。1個樣品在芯片分析中為陽性，但在Western印跡中為陰性。對很多樣品而言，芯片分析和Western印跡之間表達(dá)的相對強(qiáng)度不相關(guān)。將A431細(xì)胞裂解物用作陽性對照。
Western印跡證實(shí)表面分子的芯片分析的結(jié)論對選定的表面分子而言，通過芯片分析鑒定為表達(dá)的所有基因在Western印跡中也被證實(shí)為表達(dá)，這表明芯片分析測定的基因表達(dá)在蛋白質(zhì)合成中有所反映。對于幾個基因而言，Western印跡相對于芯片分析而言能在更多樣品中鑒定出表達(dá)。因此，芯片分析是可用于鑒定SCLC表達(dá)的表面分子的方法。
實(shí)施例2通過RT-PCR鑒定SCLC細(xì)胞系表達(dá)的表面分子通過RT-PCR方法鑒定其它表達(dá)的細(xì)胞表面分子。使用Quick-PrepmRNA純化試劑盒(Pharmacia)，根據(jù)廠商說明，從上文列出的所有21個細(xì)胞系中制備mRNA。29個不同組織的mRNA或總RNA得自CLONTECH。RNA得自下列組織全腦、脊髓、小腸、腎臟、心臟、肺、睪丸、視網(wǎng)膜、膀胱、胃、子宮、肝臟、脾臟、白細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、腦垂體、卵巢、乳腺、前列腺、氣管、胸腺、腎上腺、結(jié)腸、胰腺、唾液腺、骨髓、甲狀腺、淋巴結(jié)和骨骼肌。
使用RT-PCR用的第一鏈cDNA合成試劑盒(Boehringer Mannheim)，根據(jù)廠商說明，使用寡-(dT)15引物進(jìn)行單鏈cDNA合成。
隨后，在10mM Tris-Cl(pH 8.3)，50mM KCl，1mM MgCl2，0.8mM dNTP，0.4μM引物和0.12U/μl Thermoprime加DNA聚合酶(AdvancedBiotechnologies)中，以cDNA為模板進(jìn)行PCR，95℃30秒，62℃30秒和72℃1分鐘擴(kuò)增35或40個循環(huán)。對所有cDNA進(jìn)行使用GADPH引物的對照反應(yīng)。通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。下文列出的是所分析的基因產(chǎn)物，引物序列，它們在GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列中的位置，相應(yīng)基因mRNA為陽性的細(xì)胞系或組織的百分比。


#對7個正常組織的RNA進(jìn)行分析RT-PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)清楚地暗示metabotropic谷氨酸受體8是候選受體，因?yàn)樗?5.2％的SCLC細(xì)胞系中被表達(dá)，而僅在21.1％的正常組織中表達(dá)。其它受體也是候選的，因?yàn)樗鼈冊?5％以上的細(xì)胞系中表達(dá)。通過快速RT-PCR或Northern印跡定量RNA表達(dá)的相對水平將進(jìn)一步鑒定適當(dāng)?shù)氖荏w。
實(shí)施例3通過Western印跡鑒定的由SCLC細(xì)胞系表達(dá)的表面分子來自與上述相同的實(shí)驗(yàn)組的19個受試SCLC細(xì)胞系中有18個能表達(dá)表面分子神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM1)和鈣粘蛋白(Rygaard等，1992)。利用多克隆抗體對體外增殖和作為異種移植物在裸鼠中增殖的細(xì)胞系的蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行Western印跡，以測定SCLC細(xì)胞系中的表達(dá)。通過免疫組化法在全部20個經(jīng)手術(shù)切除的SCLC腫瘤中檢測到NCAM1，這表明SCLC細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)NCAM1(Kibbelaar等，1991)。在胚胎發(fā)育過程中，NCAM1被廣泛表達(dá)，但在成年時(shí)，NCAM1卻被大幅度下調(diào)(評述于Gegelashvili and Bock，1996)，因此，在SCLC患者的正常組織中低水平地表達(dá)。已闡明NCAM1的表達(dá)部分受胞吞作用調(diào)節(jié)(Minana等，2001)，通過抗體結(jié)合可使NCAM1內(nèi)化(Michalides等，1994)。已發(fā)現(xiàn)在正常(Kamei等，1999；Le等，1999)和病理?xiàng)l件下(評述于Parkes and Hart，2000)，鈣粘蛋白可被胞吞。因此，這些分子是基因轉(zhuǎn)移用表面受體的潛在候選分子。
實(shí)施例4通過其它方法鑒定的由SCLC細(xì)胞系表達(dá)的表面分子已證實(shí)很多SCLC細(xì)胞系可表達(dá)幾種其它的細(xì)胞表面受體，因此，它們也是基因轉(zhuǎn)移用表面受體的潛在候選分子。
通過化學(xué)交聯(lián)闡明了上述實(shí)驗(yàn)組的幾個細(xì)胞系中的高親和性轉(zhuǎn)化生長因子-β受體(TGF-βR)的表達(dá)(Damstrup等，1993)。通過Northern印跡分析，在全部9個SCLC中發(fā)現(xiàn)了TGF-βRI mRNA的存在，在9個SCLC細(xì)胞系中的6個中發(fā)現(xiàn)了TGF-βRII mRNA的存在，在全部9個SCLC中發(fā)現(xiàn)了TGF-βRIII(β聚糖)mRNA的存在(Norgaard等，1996)。配體與這些受體的結(jié)合導(dǎo)致受體內(nèi)化(Anders等，1997，Dore等，2001)。
通過RT-PCR測定出胰島素-樣生長因子受體(IGF-R)mRNA的存在，發(fā)現(xiàn)它存在于全部14個被檢查的SCLC細(xì)胞系中(Quinn等，1996)。Northern印跡、競爭性結(jié)合試驗(yàn)和化學(xué)交聯(lián)闡明了全部11個SCLC細(xì)胞系中IGF-R1(Rotsch等，1992)和IGF-RII(Schardt等，1993)的存在。已知這兩種受體在與配體結(jié)合之后都能內(nèi)化(Dore等，1997)。
在多個癌癥細(xì)胞系和腫瘤上觀察到表皮生長因子受體(EGF-R)和多種同系物、變體或突變體(v-erb-B，HER2/neu(c-erb-2)，ErbB3，ErbB4和EGF-RvIII)的表達(dá)，在與配體結(jié)合之后，幾種形式發(fā)生內(nèi)化(評述于Wells，1999；Huang and Harari，1999)。通過Northern印跡分析，上述實(shí)驗(yàn)組中21個SCLC細(xì)胞系中有11個能表達(dá)EGF-R。通過放射性受體和親和標(biāo)記分析，在10個細(xì)胞系中證實(shí)了表達(dá)(Damstrup等，1992)。實(shí)際上，已在幾個SCLC細(xì)胞系中闡明EGF-R可介導(dǎo)靶向基因傳遞(Cristano and Roth，1996，F(xiàn)rederiksen等，2000)。
實(shí)施例5比較SCLC細(xì)胞系與其它類型的正常人組織和其它腫瘤細(xì)胞系的基因表達(dá)為了進(jìn)一步比較SCLC細(xì)胞系和正常組織間的基因表達(dá)分布圖，得自正常組織和白細(xì)胞的總RNA得自商業(yè)來源(CLONTECH，Stratagene，Ambion或ResGen)。按上述方法制備經(jīng)生物素標(biāo)記的cRNA。
重要的是確定相對于正常組織而言，基因在SCLC細(xì)胞中高表達(dá)是癌癥細(xì)胞的一個普通現(xiàn)象，還是SCLC所特有的現(xiàn)象。因此，需從其它類型人癌癥的細(xì)胞系(如可商購的、得自乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌(NCLC)、結(jié)腸癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤的細(xì)胞系)中分離總RNA，并按上文所述進(jìn)行分析。
比較SCLC細(xì)胞系的體外基因表達(dá)與SCLC細(xì)胞的體內(nèi)基因表達(dá)分析體內(nèi)增殖的SCLC細(xì)胞系的基因表達(dá)根據(jù)Rygaard等，1992的方法，在BALB/c裸鼠的兩肋以異種移植物的方式體內(nèi)增殖選定的細(xì)胞系。當(dāng)一個腫瘤的大小達(dá)1cm×1cm時(shí)，處死小鼠，取出腫瘤。為了從腫瘤中分離總RNA，將腫瘤儲存于RNA laterTM(Ambion)中放置24-48小時(shí)，然后從儲存溶液中取出，儲存于-70℃直至制備RNA。通過根據(jù)廠商說明用Trizol(Life Technologies)提取，從腫瘤中制備總RNA。根據(jù)廠商所述的RNA清除法，在Rneasy柱(Qiagen)上進(jìn)一步純化總RNA。按上述分析分離的總RNA，制備cDNA和經(jīng)生物素標(biāo)記的cRNA，并用Affymetrix芯片分析基因表達(dá)。通過在冰上，在5倍體積(w/v)添加有蛋白酶和磷酸酶抑制劑(得自Calbiochem的Protease Inhibitor Cocktail Set III和Phosphatase InhibitorCocktail Set II)的20mM Tris-Cl(pH7.5)，2％TritonX-100中用特氟龍研杵勻漿新鮮取出的腫瘤，隨后通過高速離心(13,000×g)進(jìn)行清除，即可制備Western印跡分析所用的蛋白質(zhì)提取物。
分析小細(xì)胞肺癌患者活檢樣品的基因表達(dá)將被診斷為小細(xì)胞肺癌的患者的活檢樣品(得自Herlev醫(yī)院)儲存于RNA laterTM(Ambion)中放置24-72小時(shí)，然后從儲存溶液中取出，儲存于-70℃。有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)家將腫瘤切成小塊，按上述從腫瘤中分離RNA。集中幾個腫瘤的RNA。所得總RNA的量應(yīng)不足以直接制備經(jīng)生物素標(biāo)記的cDNA，按Ohyama等，2000所述修改標(biāo)記方法，以包括2個進(jìn)一步的擴(kuò)增步驟。
實(shí)施例6鑒定細(xì)胞表面分子的實(shí)驗(yàn)方法通過基因芯片分析、Northern印跡、RT-PCR或Western印跡鑒定SCLC細(xì)胞表達(dá)的候選細(xì)胞表面分子(受體)。通過RT-PCR和/或通過測序(在GATCBiotech AG，Germany)測定SCLC細(xì)胞表達(dá)的特定剪接形式。必須通過其它方法證實(shí)僅在mRNA水平上鑒定的分子的蛋白質(zhì)表達(dá)和亞細(xì)胞定位。如果可以獲得商購抗體，可使用廠商推薦的方法進(jìn)行Western印跡鑒定(按上述使用由體外和體內(nèi)增殖的上述實(shí)驗(yàn)組的SCLC細(xì)胞系制備的蛋白質(zhì)提取物)和SCLC細(xì)胞系的免疫染色。
對于具有已知配體(可商購或按下文所述重組制備)的分子而言，另外，或者可通過結(jié)合或交聯(lián)研究完成上述目的。也可以使用經(jīng)標(biāo)記的配體(如放射性-、生物素-或熒光標(biāo)記的配體)來測定受體的親和性、每個細(xì)胞受體分子的數(shù)目及其內(nèi)化配體的能力。
對于不具有已知配體的細(xì)胞表面分子而言，必須測定表面分子的表達(dá)和配體的鑒定。由于編碼細(xì)胞表面分子的mRNA能容易地得自SCLC細(xì)胞系，可通過標(biāo)準(zhǔn)的RT-PCR法將編碼胞外部分的cDNA克隆至表達(dá)載體中，以表達(dá)出重組蛋白質(zhì)用于免疫。優(yōu)選在細(xì)菌系統(tǒng)(如Qiagen pQE載體)中，以與適當(dāng)標(biāo)記(如6×HIS)融合的形式進(jìn)行表達(dá)，從而能容易地純化出重組蛋白質(zhì)。在哥本哈根大學(xué)Panum研究所的實(shí)驗(yàn)藥學(xué)系進(jìn)行免疫，以使兔產(chǎn)生多克隆抗體。在哥本哈根血清研究所產(chǎn)生小鼠單克隆雜交瘤。使用重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)作為固定抗原(在微滴孔內(nèi)或膜上)，篩選經(jīng)免疫動物的血清和雜交瘤的條件培養(yǎng)基的抗原結(jié)合。另外，當(dāng)由哺乳動物細(xì)胞表達(dá)表面分子時(shí)，必須測定抗體對表面分子的特異性。通過使用RT-PCR將編碼全長分子的cDNA克隆至真核表達(dá)載體(如Invitrogen的pcDNA3.1或CLONETCH的pCMV-Tag)即可完成此目的。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不能內(nèi)源性表達(dá)所述分子的細(xì)胞系之后，使用間接免疫熒光染色即可測定抗體的特異性。
當(dāng)鑒定出適當(dāng)?shù)目贵w或血清時(shí)，通過對體外和體內(nèi)生長的SCLC細(xì)胞系以及SCLC活檢樣品進(jìn)行免疫染色，分析蛋白質(zhì)的表達(dá)以證實(shí)體外和體內(nèi)表達(dá)。使用在載玻片上點(diǎn)有200個不同組織樣品的人組織列陣(GenRes的VastArray)評價(jià)正常組織中的表達(dá)。
或者，可利用分離自噬菌體展示文庫的人單鏈抗體(見下文)。
實(shí)施例7鑒定細(xì)胞表面分子的配體并測定其內(nèi)化能力的實(shí)驗(yàn)方法可能的話，以經(jīng)放射性-、生物素-或熒光標(biāo)記的形式獲得可商購的已知配體。為了分析候選表面分子整聯(lián)蛋白，首先必須測定在細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的特定整聯(lián)蛋白α和β亞單位組合以鑒定出胞外基質(zhì)配體。由于很多抗特定整聯(lián)蛋白組合的抗體可以商購，因此通過免疫染色即可完成此目的。
如果配體可以商購，但不是以經(jīng)標(biāo)記的形式存在，可用125T(如使用氯胺-T法)或用熒光染料或生物素(如使用Molecular Probes的FluoReporter試劑盒)標(biāo)記配體。進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)以測定配體與表面分子結(jié)合的特異性和能力。在剝離外部結(jié)合的配體(例如通過酸或蛋白酶處理)，測定經(jīng)放射性-標(biāo)記的配體的內(nèi)化放射活性；用酶或經(jīng)熒光標(biāo)記的鏈霉親和素染色經(jīng)生物素標(biāo)記的配體，或直接通過顯微鏡評價(jià)經(jīng)熒光標(biāo)記的配體之后，使用經(jīng)標(biāo)記的配體即可監(jiān)測37℃時(shí)表面分子的內(nèi)化能力(0-4℃保溫以用作對照)。
如果配體已知，但不能商購，可使用RT-PCR將編碼配體的基因克隆至表達(dá)載體，或由適當(dāng)?shù)慕M織或細(xì)胞系獲得cDNA文庫，或者(當(dāng)可以獲得時(shí))從商業(yè)來源獲得克隆(Invitrogen的GeneStorm克隆或CLONTECH的GeneConnectionTM)重組配體中應(yīng)包括適當(dāng)?shù)臉?biāo)記(如6×HIS)以易于純化。優(yōu)選細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)。重組表達(dá)也可以將配體表達(dá)成與EGFP的融合蛋白，以便于分析結(jié)合和內(nèi)化?；蛘撸梢允褂每箻?biāo)記的抗體來分析結(jié)合和內(nèi)化。然而，配體與其受體的結(jié)合必需翻譯后修飾，如糖基化或硫酸化(sulfatation)，可在酵母系統(tǒng)(巴斯德畢赤氏酵母)、昆蟲系統(tǒng)(桿狀病毒)或哺乳動物細(xì)胞(如HEK293，COS-7或CHO)中表達(dá)成分泌蛋白。
如果細(xì)胞表面分子的配體是未知的，基于受體基因組序列或氨基酸序列的同源性研究可鑒定出特定受體所屬的受體超家族。然后可使用上述方法檢測一組特異于此超家族的配體?；蛘?，使用細(xì)菌肽表達(dá)文庫(如Invitrogen的FliTrx隨機(jī)肽展示文庫)進(jìn)行的篩選可鑒定出一個或多個肽配體。隨后，可克隆這些肽配體以進(jìn)行重組表達(dá)，或者商購得到這些肽配體。為了進(jìn)行篩選，最好使用不表達(dá)候選表面分子的細(xì)胞系以篩選非特異性結(jié)合，而使用被表面分子的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的相同細(xì)胞系來鑒定特異性的肽配體。
如果已產(chǎn)生抗細(xì)胞表面分子的小鼠單克隆抗體，另一種可選擇的方法是通過用經(jīng)熒光標(biāo)記的抗-小鼠抗體檢測胞吞抗體，來篩選這些抗體內(nèi)化的能力。還檢測了克隆自產(chǎn)生抗體的雜交瘤的重組表達(dá)的單鏈抗體。為了進(jìn)行臨床試驗(yàn)，必須通過例如Losman等，1999所述的方法，使這些抗體人源化。如果不能獲得內(nèi)化的單克隆抗體，可以使用表達(dá)人單鏈抗體片段的噬菌體文庫來分離內(nèi)化抗體。通過與不含所述細(xì)胞表面分子的細(xì)胞系保溫，以去除噬菌體展示抗體的非特異性結(jié)合，用表達(dá)分子(如上所述)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系進(jìn)行選擇，可以鑒定出特異性的內(nèi)化抗體，隨后由胞吞后細(xì)胞所攝入的噬粒DNA克隆所述抗體(Nielsen and Marks，2000；Heitner等，2001)(與丹麥皇家藥學(xué)院的J，Engberg教授合作)。
實(shí)施例8鑒定表達(dá)治療基因用的啟動子通過基因芯片(GeneChip)分析發(fā)現(xiàn)某基因在SCLC細(xì)胞系和異種移植物中高表達(dá)，但在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)，該基因的啟動子區(qū)域是靶向基因治療中控制和介導(dǎo)治療基因表達(dá)的潛在候選啟動子。首先，通過使用幾種覆蓋整個分子的不同引物套或探針，對基因芯片分析所用的RNA(得自SCLC細(xì)胞和正常組織)進(jìn)行RT-PCR或Northern印跡，證實(shí)經(jīng)基因芯片分析測定的候選啟動子所介導(dǎo)的表達(dá)，從而確保啟動子的癌細(xì)胞特異性(因?yàn)樵谡＝M織中由相同啟動子表達(dá)的另一種剪接變體不能被Affymetrix芯片識別)。由于啟動子的活性和特異性可由很大一部分DNA編碼，因此必需限定足以在SCLC細(xì)胞中進(jìn)行特異性表達(dá)和高表達(dá)的啟動子區(qū)域，以限制編碼治療基因的DNA的大小，從而增強(qiáng)表面分子的傳遞。我們將其限定為15kb，這處于PCR克隆所允許的大小范圍之內(nèi)。起初，使用能以基因組DNA為模板延伸大PCR產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性聚合酶(如Stratagene的Herculase)進(jìn)行PCR，以克隆出位于候選基因編碼區(qū)上游的約15kb區(qū)域，所述區(qū)域包括編碼mRNA 5’非翻譯部分的區(qū)域。由HUGO數(shù)據(jù)庫中的基因組序列設(shè)計(jì)PCR所用的引物，所述引物被設(shè)計(jì)成含有稀有的限制性位點(diǎn)以通過限制性裂解進(jìn)行克隆，或者含有l(wèi)oxP位點(diǎn)以通過加入Cre重組酶直接克隆，而無需進(jìn)行限制性裂解。檢測啟動子區(qū)域所用的載體被構(gòu)建成含有得自CLONTECH的無啟動子基因，所述基因編碼增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)，所述基因的前面是多克隆位點(diǎn)中的稀有限制性位點(diǎn)(如得自CLONTECH的pd2EGFP-1)和/或loxP位點(diǎn)。(例如，使用Life Technologies的Lipfectamine PlusTM)轉(zhuǎn)染至SCLC細(xì)胞系之后，使用熒光顯微鏡以半定量的方式，或使用熒光計(jì)(如Wallac的Victor 1420)定量地估計(jì)啟動子的活性。將少量編碼受CMV啟動子控制的紅色熒光蛋白的質(zhì)粒(如CLONTECH的pDsRed2-N1)用作轉(zhuǎn)染效力的對照。
將在上述試驗(yàn)中有活性的啟動子亞克隆為較小的片段(通過按上文所述進(jìn)行PCR或通過標(biāo)準(zhǔn)的限制性酶消化)，并按上述檢測啟動子活性。通過重新克隆至編碼螢火蟲螢光素酶的無啟動子載體，定量測定啟動子及其亞克隆的相對活性，用編碼表達(dá)自SV40啟動子的renilla螢光素酶的質(zhì)粒共-轉(zhuǎn)染以用作轉(zhuǎn)染對照。使用Promega的Dual-LuciferaseReporter Assay System，用發(fā)光計(jì)(EG&G的Lumat LB9507)定量測定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的提取物中兩種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄。按照類似的方法，檢測不同SCLC特異性強(qiáng)啟動子的活性部分嵌合體的最佳表達(dá)和調(diào)節(jié)?；蛘?，可插入其它基因的增強(qiáng)子序列(如病毒增強(qiáng)子)。為了確保在多個構(gòu)建過程中不丟失選定啟動子區(qū)域相對于正常組織而言對SCLC細(xì)胞的特異性，還需通過轉(zhuǎn)染至得自正常組織不同來源的商購細(xì)胞系中，以對所述啟動子區(qū)域進(jìn)行檢測。如果需要較高的特異性，可在此系統(tǒng)中額外摻入對p53基因有突變的癌細(xì)胞的特異性。通過將loxP位點(diǎn)插入與治療基因啟動子相鄰的位置，并插入編碼Cre重組酶的基因，使其處于p53活化啟動子的控制之下，表達(dá)wt p53的正常細(xì)胞將表達(dá)Cre重組酶，所述酶能切除治療基因的啟動子，因此所述酶不能表達(dá)。
如果腫瘤特異性啟動子的轉(zhuǎn)錄活性不足以獲得足夠高水平的編碼治療基因的轉(zhuǎn)錄物，可以利用特異性啟動子來活化第二個組織-非特異性的高活性啟動子，如CMV。該系統(tǒng)的一個例子是由特異性啟動子編碼Cre重組酶，所述啟動子在腫瘤組織中表達(dá)之后能通過重組除去側(cè)翼于loxP序列的沉默元件來活化CMV啟動子(Kijama等，1999)。
另外，需測定內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子(如類固醇激素受體結(jié)合區(qū)域和受體)的存在。在添加類固醇激素(如視黃酸、雌激素、孕酮或糖皮質(zhì)素)之后，按上文所述，通過用控制EGFP或螢光素酶表達(dá)的啟動子轉(zhuǎn)染對其進(jìn)行分析。如果存在，它們將有機(jī)會通過佐以激素來增強(qiáng)治療基因的表達(dá)。或者，如果相應(yīng)受體由SCLC細(xì)胞表達(dá)，可將這些序列插入啟動子以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性。
實(shí)施例9DNA與配體復(fù)合的最優(yōu)化為了進(jìn)行特異性內(nèi)化，必需在編碼控制治療基因表達(dá)的組織特異性啟動子的DNA與配體之間形成復(fù)合物。試驗(yàn)了幾種不同的可能性。經(jīng)由鏈霉親和素與經(jīng)生物素標(biāo)記的聚-陽離子聚-L-賴氨酸(PLL)結(jié)合的經(jīng)生物素標(biāo)記的配體會與帶負(fù)電的DNA復(fù)合，從而形成可被配體內(nèi)化的、緊密的配體/DNA polyplex(Frederiksen等，2000)。按Cristiano等，1996或Wagner等，1990所述進(jìn)行配體和不同大小的聚-L-賴氨酸的生物素化。
或者，可使用商購的支化陽離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI)來形成配體/DNA復(fù)合物。PEI/DNA復(fù)合物本身的基因轉(zhuǎn)移活性較低。然而，通過使配體與PEI共價(jià)交聯(lián)，可以大大提高活性和特異性(Kircheis等，1997)。另一個可能性是按上文對PLL所描述的那樣，檢測與經(jīng)生物素標(biāo)記的配體和鏈霉親和素混合的經(jīng)生物素標(biāo)記的PEI。
相對于使用PLL而言，該系統(tǒng)的另一個優(yōu)點(diǎn)是不必在復(fù)合物中包含內(nèi)體裂解劑(見下文)。
如果配體是重組產(chǎn)生的，也可以試驗(yàn)不同的方法。通過在重組配體中包括可與含有治療基因的DNA中編碼的特定DNA序列強(qiáng)結(jié)合的肽序列，可以獲得DNA/配體復(fù)合物，然后通過PLL使所述復(fù)合物被中和，并且變得密集。按照此方法，使用DNA檢測與配體形成重組融合物的酵母轉(zhuǎn)錄激活物GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中在DNA中摻入GAL4識別序列的串聯(lián)重復(fù)。
最初使用編碼受CMV啟動子控制的EGFP的DNA檢測上述復(fù)合物，所述DNA與已知能結(jié)合可內(nèi)化細(xì)胞表面受體的配體復(fù)合。給表達(dá)和不表達(dá)配體的受體的細(xì)胞施用之后，通過熒光顯微鏡肉眼評價(jià)和/或通過熒光計(jì)定量測定上述復(fù)合物的效力和特異性。
實(shí)施例10復(fù)合物的內(nèi)體裂解的最優(yōu)化為了避免被胞吞的復(fù)合物的溶酶體降解，必需使復(fù)合物中包含內(nèi)體裂解劑以將DNA釋放至胞質(zhì)中，或者包含如氯喹的試劑，這種試劑能提高內(nèi)體pH，從而抑制溶酶體降解(評述于Guy等，1995)。已證實(shí)當(dāng)復(fù)制缺損的腺病毒與配體/DNA polyplex直接偶聯(lián)時(shí)，是一種有效的內(nèi)體裂解劑(Yoshimura等，1993)。然而，使用缺損腺病毒或病毒衣殼的缺點(diǎn)是不必要的免疫應(yīng)答、經(jīng)由病毒受體非特異性攝入復(fù)合物，安全性預(yù)警、制備困難和穩(wěn)定性差。因此，為了避免這些缺點(diǎn)以及為了降低復(fù)合物的大小，將試驗(yàn)較小的，優(yōu)選為非病毒的內(nèi)體裂解劑。已發(fā)現(xiàn)流感病毒血凝素HA-2 N-末端融合肽(Wagner等，1992)、N-末端鼻病毒肽、假單胞菌外毒素A轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域(Fominayaand Wels，1996)和合成肽(Gottschalk等，1996)能介導(dǎo)內(nèi)體裂解或內(nèi)體逃逸。當(dāng)通過與鏈霉親和素偶聯(lián)的經(jīng)生物素標(biāo)記的聚-L-賴氨酸(PLL)產(chǎn)生時(shí)，經(jīng)生物素標(biāo)記的內(nèi)體裂解肽可包括在配體/DNA復(fù)合物中?；蛘?，當(dāng)重組產(chǎn)生配體時(shí)，可在配體的N-或C-末端部分包括肽序列。使用編碼受CMV啟動子控制的報(bào)道基因(EGFP或螢光素酶)的DNA檢測這些肽(單獨(dú)加入或摻入重組配體中)的效力，其中所述DNA與已知能內(nèi)化的配體復(fù)合，通過評價(jià)報(bào)道基因的表達(dá)來監(jiān)測內(nèi)體裂解。如果配體/DNA復(fù)合物由PEI裝配，該試劑可獨(dú)立介導(dǎo)內(nèi)體膨脹，隨后裂解并釋放出復(fù)合物(Boussif等，1995)。
實(shí)施例11治療基因的保護(hù)和核靶向方法的最優(yōu)化為了增強(qiáng)內(nèi)體釋放的編碼治療基因的DNA對核的轉(zhuǎn)運(yùn)，需將DNA與編碼核靶向序列(NLS-核定位序列)的肽共價(jià)連接。通過用限制性酶切除治療基因以及啟動子，并通過與寡核苷酸雜交和與寡核苷酸連接，可保護(hù)DNA末端使其免受外切核酸酶的消化，所述寡核苷酸能在雙鏈DNA末端產(chǎn)生保護(hù)性的莖-環(huán)帽。通過在寡核苷酸中包含氨基-修飾的核苷酸，該殘基可用于與編碼核定位信號的C-末端酰胺化肽共價(jià)交聯(lián)(Zanta等，1999)(所述肽可商購自例如Genosys，TX，USA)。上文提及了多種潛在有效的序列。最初，使用具有CMV啟動子的、編碼EGFP的DNA片段檢測通過使猴病毒40大腫瘤抗原的NLS肽與DNA偶聯(lián)而導(dǎo)致的表達(dá)增強(qiáng)作用，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SCLC細(xì)胞系分析表達(dá)。檢測其它蛋白質(zhì)(見上文)中其它編碼NLS的肽，以測定最有效的核轉(zhuǎn)運(yùn)。
實(shí)施例12選擇治療基因的實(shí)驗(yàn)方法潛在的治療基因選自細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因產(chǎn)物、有毒基因產(chǎn)物、導(dǎo)入對無害藥物的敏感性的基因產(chǎn)物、癌基因的反義RNA、靶向癌基因的核酶或編碼抗癌基因抗體的基因。編碼基因產(chǎn)物以表達(dá)蛋白質(zhì)或反義RNA的cDNA可通過RT-PCR克隆獲得，對cDNA文庫進(jìn)行PCR獲得或得自商業(yè)來源。為了評價(jià)治療基因促進(jìn)細(xì)胞死亡的效力，將這些基因插入載體，使其處于CMV啟動子的控制之下，(例如使用LipofectaminePlus，Life Technologies)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(使用表達(dá)EGFP的共-轉(zhuǎn)染質(zhì)粒以鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞)上述實(shí)驗(yàn)組中的SCLC細(xì)胞系之后，檢測表達(dá)效果。對于細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因而言，通過特異性染色監(jiān)測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)效果(例如使用Molecular Probes的Vybrant細(xì)胞凋亡檢測試劑盒)。另外，通過使用熒光“活染色”監(jiān)測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞死亡(例如Molecular Probes的LIVE/DEAD生存力/細(xì)胞毒性試劑盒)。隨后，將從上述實(shí)驗(yàn)中選擇的治療基因重新克隆，以在一個或多個SCLC特異性啟動子的控制下表達(dá)，按上述通過轉(zhuǎn)染分析表達(dá)效力。
實(shí)施例13
體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)一旦選定潛在的表面分子及其配體，并開發(fā)出DNA/配體復(fù)合法，該方法包括內(nèi)體裂解劑和基因的核靶向，通過給在裸鼠中增殖的、上文所列選定細(xì)胞系的SCLC腫瘤異種移植物施用復(fù)合物，在體內(nèi)檢測傳遞系統(tǒng)的特異性和效力。通過在尾靜脈中靜脈內(nèi)注射，給經(jīng)腫瘤異種移植的小鼠施用在適當(dāng)藥物制劑中含有具有CMV啟動子的報(bào)道基因(如β-半乳糖苷酶或EGFP)的復(fù)合物。24，48或72小時(shí)之后，處死小鼠，切除肺、肝臟、心臟、腦、脾臟、腎臟和骨骼肌的腫瘤和組織，染色或分析報(bào)道基因的產(chǎn)物(如β-半乳糖苷酶)。
使用治療基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)為了檢測DNA/配體體內(nèi)傳遞治療基因的能力，按上述進(jìn)行使用通過體外實(shí)驗(yàn)選定的治療基因和通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)選定的DNA/配體復(fù)合物的轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。如果治療基因編碼胸苷激酶，需同時(shí)施用核苷酸類似物(如9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤)。通過大小測定、活檢樣品細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測腫瘤的發(fā)展，處死小鼠之后，分析腫瘤的細(xì)胞凋亡和壞死。
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權(quán)利要求
1.鑒定多種細(xì)胞表面分子的方法，所述分子在正常細(xì)胞和惡性細(xì)胞中的表達(dá)水平有所不同，所述方法包括以下步驟i)提供至少3個選自下列的惡性細(xì)胞系CPH54A，CPH54B，GLC2，GLC3，GLC14，GLC16，GLC19，GLC26，GLC28，DMS53，DMS79，DMS92，DMS114，DMS153，DMS273，DMS406，DMS456，NCI H69，NCI N417，MAR H24，MAR86MI，SHP-77，NCI-H2171，NCI-H2195，NCI-H2196，NCI-H2198，NCI-H2227，NCI-H2286，NCI-H2330，NCI-H735，NCI-H1339，NCI-H1963，NCI-H2107，NCI-H2108，NCI-H1304，NCI-H1341，NCI-H1417，NCI-H1436，NCI-H1522，NCI-H1618，NCI-H1672，NCI-H1694，NCI-H1836，NCI-H1870，NCI-H1876，NCI-H1882，NCI-H1926，NCI-H1930，NCI-H1994，NCI-H2029，NCI-H2059，NCI-H2066，NCI-H2081，NCI-H2141，NCI-H211，NCI-H220，NCI-H250，NCI-H524，NCI-H592，NCI-H711，NCI-H719，NCI-H740，NCI-H748，NCI-H774，NCI-H841，NCI-H847，NCI-H865，NCI-H1048，NCI-H1059，NCI-H1092，NCI-H1105，NCI-H1184，NCI-H1238，NCI-H1284，NCI-H1688，NCI-H187，NCI-H378，NCI-H526，NCI-H660，NCI-H889，NCI-H60，NCI-H196，NCI-H446，NCI-H209，NCI-H146，NCI-H82，NCI-H460，NCI-H345，NCI-H510A，NCI-128，NCI-446，SW1271；和ii)提供至少3份得自正常組織的總RNA樣品，所述組織選自肝臟、心臟、腎臟、肺、腎上腺、結(jié)腸、胰腺、小腸、脾臟、骨骼肌、氣管、前列腺、胎盤、唾液腺、睪丸、白細(xì)胞、腦、脂肪組織、膀胱、乳腺、子宮頸、食管、喉、卵巢、直腸、皮膚、脊髓、胃、胸腺、甲狀腺和子宮；和iii)比較根據(jù)i)的細(xì)胞系和根據(jù)ii)的組織樣品的mRNA表達(dá)；和iv)鑒定核酸序列，其中a)根據(jù)i)的一個或多個細(xì)胞系中表達(dá)的mRNA量與根據(jù)ii)的一個或多個組織中表達(dá)的mRNA量之間有差別；和/或b)根據(jù)i)的至少2個細(xì)胞系中表達(dá)的mRNA量基本上無差別；和/或c)根據(jù)ii)的至少2個組織樣品中表達(dá)的mRNA量基本上無差別；和v)在根據(jù)iv)的核酸序列中選擇編碼潛在細(xì)胞表面分子的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟i)包括提供至少5個惡性細(xì)胞系。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟ii)包括得自肺、肝臟、心臟和腎臟的組織樣品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟ii)包括提供至少5份總RNA樣品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟iii)包括以下步驟i)從惡性細(xì)胞系中分離含有mRNA的RNA；和ii)由所述RNA制備cDNA群體，其中由分離自一個細(xì)胞系或一個組織樣品的RNA制備一個cDNA群體；和iii)用可測標(biāo)記物使每個cDNA群體被標(biāo)記；和iv)提供固體支持物，其上已固定有已知核酸序列的陣列；和v)在允許雜交的條件下使每個cDNA群體與固體支持物一起保溫；和vi)檢測固體支持物上的所述可測標(biāo)記物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述可測標(biāo)記物是熒光標(biāo)記。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中固體支持物是玻璃板。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中至少1000個已知核酸序列被固定在固體支持物上。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟iv)，a)中的差異是至少2倍的mRNA表達(dá)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟iv)，a)中的差異理論上是不受限制的倍數(shù)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟iv)，b)包括至少3個惡性細(xì)胞系。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟iv)，c)包括至少3個RNA樣品。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中可根據(jù)在通?？蛇M(jìn)入的數(shù)據(jù)庫中可以得到的信息選擇編碼步驟v)的潛在細(xì)胞表面分子的核酸序列，所述數(shù)據(jù)庫選自PubMed(NCBI)，Nucleotide(NCBI)，Protein(NCBI)，Structure(NCBI)，OMIM(NCBI)和LocusLink(NCBI)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中根據(jù)與已知細(xì)胞表面分子的序列同源性選擇編碼步驟v)的潛在細(xì)胞表面分子的核酸序列，有至少20％的序列同一性。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中根據(jù)與已知細(xì)胞表面分子內(nèi)所含結(jié)構(gòu)域的序列同源性來選擇編碼步驟v)的潛在細(xì)胞表面分子的核酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中根據(jù)諸如潛在細(xì)胞表面分子含有選自疏水區(qū)域和潛在糖基化位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域來選擇編碼步驟v)的潛在細(xì)胞表面分子的核酸序列。
17.鑒定第一核酸序列的方法，所述核酸序列能介導(dǎo)與之可操作相連的第二核酸序列的表達(dá)，其中所述表達(dá)在正常細(xì)胞與惡性細(xì)胞中的水平有所不同，所述方法包括以下步驟i)提供至少3個選自下列的惡性細(xì)胞系CPH54A，CPH54B，GLC2，GLC3，GLC14，GLC16，GLC19，GLC26，GLC28，DMS53，DMS79，DMS92，DMS114，DMS153，DMS273，DMS406，DMS456，NCI H69，NCI N417，MAR H24，MAR86MI，SHP-77，NCI-H2171，NCI-H2195，NCI-H2196，NCI-H2198，NCI-H2227，NCI-H2286，NCI-H2330，NCI-H735，NCI-H1339，NCI-H1963，NCI-H2107，NCI-H2108，NCI-H1304，NCI-H1341，NCI-H1417，NCI-H1436，NCI-H1522，NCI-H1618，NCI-H1672，NCI-H1694，NCI-H1836，NCI-H1870，NCI-H1876，NCI-H1882，NCI-H1926，NCI-H1930，NCI-H1994，NCI-H2029，NCI-H2059，NCI-H2066，NCI-H2081，NCI-H2141，NCI-H211，NCI-H220，NCI-H250，NCI-H524，NCI-H592，NCI-H711，NCI-H719，NCI-H740，NCI-H748，NCI-H774，NCI-H841，NCI-H847，NCI-H865，NCI-H1048，NCI-H1059，NCI-H1092，NCI-H1105，NCI-H1184，NCI-H1238，NCI-H1284，NCI-H1688，NCI-H187，NCI-H378，NCI-H526，NCI-H660，NCI-H889，NCI-H60，NCI-H196，NCI-H446，NCI-H209，NCI-H146，NCI-H82，NCI-H460，NCI-H345，NCI-H510A，NCI-128，NCI-446，SW1271；和ii)提供至少3份得自正常組織樣品的RNA樣品，所述組織選自肝臟、心臟、腎臟、肺、腎上腺、結(jié)腸、胰腺、小腸、脾臟、骨骼肌、氣管、前列腺、胎盤、唾液腺、睪丸、白細(xì)胞、腦、脂肪組織、膀胱、乳腺、子宮頸、食管、喉、卵巢、直腸、皮膚、脊髓、胃、胸腺、甲狀腺和子宮；和iii)比較根據(jù)i)的細(xì)胞系和根據(jù)ii)的組織樣品的mRNA表達(dá)；和iv)鑒定第二核酸序列，其中a)根據(jù)i)的一個或多個細(xì)胞系中表達(dá)的mRNA量與根據(jù)ii)的一個或多個組織中表達(dá)的mRNA量之間有差別；和/或b)根據(jù)i)的至少2個細(xì)胞系中表達(dá)的mRNA量基本上無差別；和/或c)根據(jù)ii)的至少2個組織樣品中表達(dá)的mRNA量基本上無差別；和v)鑒定與步驟iv)中鑒定的第二核苷酸序列可操作相連的第一核酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中步驟i)包括提供至少5個惡性細(xì)胞系。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中步驟ii)包括得自肺、肝臟、心臟和腎臟的組織樣品。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中步驟ii)包括提供至少5份總RNA樣品。
21.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中步驟iii)包括以下步驟i)從惡性細(xì)胞系中分離含有mRNA的RNA；和ii)由所述RNA制備cDNA群體，其中由分離自一個細(xì)胞系或一個組織樣品的RNA制備一個cDNA群體；和iii)用可測標(biāo)記物使每個cDNA群體被標(biāo)記；和iv)提供固體支持物，其上已固定有已知核酸序列的陣列；和v)在允許雜交的條件下使每個cDNA群體與固體支持物一起保溫；和vi)檢測固體支持物上的所述可測標(biāo)記物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述可測標(biāo)記物是熒光標(biāo)記。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中固體支持物是玻璃板。
24根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中至少1000個不同的已知核酸序列被固定在固體支持物上。
25.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中步驟iv)，a)中的差異是至少2倍的mRNA表達(dá)。
26.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中步驟iv)，a)中的差異理論上是不受限制的倍數(shù)。
27.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中步驟iv)，b)包括至少3種惡性細(xì)胞系。
28.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中步驟iv)，c)包括至少3種RNA樣品。
29.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中與第二核酸序列可操作相連的任何第一核酸序列含有在染色體上位于所述第二核酸序列的翻譯起始密碼子上游的至少15,000個堿基對。
30.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中與第二核酸序列可操作相連的任何第一核酸序列含有在染色體上位于所述第二核酸序列的翻譯起始密碼子上游的至少5,000個堿基對。
31.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中與第二核酸序列可操作相連的任何第一核酸序列含有在染色體上位于所述第二核酸序列的翻譯起始密碼子上游的多達(dá)5,000個堿基對。
32.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中與第二核酸序列可操作相連的任何第一核酸序列含有在染色體上位于所述第二核酸序列的翻譯起始密碼子上游的內(nèi)含子序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中與第二核酸序列可操作相連的任何第一核酸序列含有在染色體上位于所述第二核酸序列的翻譯起始密碼子下游的內(nèi)含子序列。
34.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中與第二核酸序列可操作相連的任何第一核酸序列含有在染色體上位于所述第二核酸序列的翻譯起始密碼子上游或下游10,000個堿基對以外的增強(qiáng)子序列。
35.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中與第二核酸序列可操作相連的任何第一核酸序列含有在染色體上位于所述第二核酸序列的翻譯起始密碼子上游的多達(dá)5000個堿基對，從中缺失了至少10個內(nèi)部堿基對。
36.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中與第二核酸序列可操作相連的任何第一核酸序列含有在染色體上位于所述第二核酸序列的翻譯起始密碼子上游的多達(dá)5000個堿基對，從中缺失了至少一個沉默子。
37.靶向復(fù)合物，其含有i)能結(jié)合通過權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法鑒定的細(xì)胞表面分子的結(jié)合配對物，其中所述細(xì)胞表面分子選自GRIA2，GRM8，ITGAV，ITGAE，NCAM1，NPTXR，LRP8和CHRNA5；和ii)生物反應(yīng)物質(zhì)。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的靶向復(fù)合物，其中細(xì)胞表面分子含有GRIA2或基本上由GRIA2組成。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的靶向復(fù)合物，其中細(xì)胞表面分子含有GRM8或基本上由GRM8組成。
40.根據(jù)權(quán)利要求37的靶向復(fù)合物，其中細(xì)胞表面分子含有ITGAV或基本上由ITGAV組成。
41.根據(jù)權(quán)利要求37的靶向復(fù)合物，其中細(xì)胞表面分子含有ITGAE或基本上由ITGAE組成。
42.根據(jù)權(quán)利要求37的靶向復(fù)合物，其中結(jié)合配對物選自L-谷氨酸，紅藻氨酸鹽，5-(溴甲基)-4-異噁唑丙酸，谷氨酸類似物，取代的喹喔啉2，3二酮，GYKI52466，5-I-尿嘧啶丙氨酸，5-F-尿嘧啶丙氨酸，AMPA((RS)-α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸)的激動劑和拮抗劑配體，NBQX，CNQX，DNQX，GYKI 52466，6-氯代犬尿喹啉酸，JSTX，L-APA，L-SOP，ACPT，(R，S)-PPG，CPPG，MAP4，(S)-3，4-DCPG，玻連蛋白，cytactin，纖連蛋白，血纖蛋白原，層粘連蛋白，MMP-2，骨橋蛋白，凝血酶原，血小板反應(yīng)蛋白，von Willebrandts因子，L1CAM的重組片段，青霉素N，E-鈣粘蛋白及其肽，包括肽NRDKETKV，NCAM1結(jié)構(gòu)域IgI+II，NCAM1結(jié)構(gòu)域IgIII及其肽，肽C3ASKKPKRNIKA，D3AKKERQRKDTU，D4ARALNWGAKP，單克隆抗體123C3，NPTX1，NPTX2，泰攀蛇毒素，TCBP49，Oxynor，ApoE2，ApoE3，ApoE4，來自ApoE的肽(E141；-155；LRKLRKRLLRDADDL及其串聯(lián)序列E(141；-155)2；LRKLRKRLLRDADDL-LRKLRKRLLRDADDL)，reelin，煙堿，乙酰膽堿，α-銀環(huán)蛇毒素，氨甲酰膽堿以及抗所述任一種表面分子的特異性抗體。
43.根據(jù)權(quán)利要求37的靶向復(fù)合物，其中所述細(xì)胞表面分子能內(nèi)化該靶向復(fù)合物。
44.根據(jù)權(quán)利要求37的靶向復(fù)合物，其中所述生物反應(yīng)物質(zhì)含有核酸。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的靶向復(fù)合物，其中核酸含有與含表達(dá)信號的第一核酸序列可操作相連的第二核酸序列。
46.靶向復(fù)合物，其含有i)能結(jié)合通過權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法鑒定的細(xì)胞表面分子的結(jié)合配對物，其中所述細(xì)胞表面分子能內(nèi)化該靶向復(fù)合物；和ii)含有核酸序列的生物反應(yīng)物質(zhì)，所述核酸序列含有與含表達(dá)信號的第一核酸序列可操作相連的第二核酸序列，其中通過根據(jù)權(quán)利要求17至36中任一項(xiàng)的方法鑒定出所述第一核酸序列。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的靶向復(fù)合物，其中細(xì)胞表面分子含有選自下列的細(xì)胞表面分子或基本上由它們組成NCAM1，NPTXR，LRP8和CHRNA5。
48.根據(jù)權(quán)利要求46的靶向復(fù)合物，其中細(xì)胞表面分子含有NCAM1或基本上由NCAM1組成。
49.根據(jù)權(quán)利要求46的靶向復(fù)合物，其中細(xì)胞表面分子含有NPTXR或基本上由NPTXR組成。
50.根據(jù)權(quán)利要求46的靶向復(fù)合物，其中細(xì)胞表面分子含有LRP8或基本上由LRP8組成。
51.根據(jù)權(quán)利要求46的靶向復(fù)合物，其中細(xì)胞表面分子含有CHRNA5或基本上由CHRNA5組成。
52.根據(jù)權(quán)利要求46的靶向復(fù)合物，其中結(jié)合配對物選自NCAM1結(jié)構(gòu)域IgI+II，NCAM1結(jié)構(gòu)域IgIII及其肽，肽C3ASKKPKRNIKA，D3AKKERQRKDTU，D4ARALNWGAKP，單克隆抗體123C3，NPTX1，NPTX2，泰攀蛇毒素，TCBP49，Oxynor，ApoE2，ApoE3，ApoE4，來自ApoE的肽(E141；-155；LRKLRKRLLRDADDL及其串聯(lián)序列E(141；-155)2；LRKLRKRLLRDADDL-LRKLRKRLLRDADDL)，reelin，煙堿，乙酰膽堿，α-銀環(huán)蛇毒素，卡巴膽堿和抗所述細(xì)胞表面分子的特異性抗體。
53.根據(jù)權(quán)利要求46的靶向復(fù)合物，其中所述第一核酸序列含有表達(dá)信號，該信號能介導(dǎo)所述第二核酸序列在惡性細(xì)胞中以相對于非-惡性細(xì)胞而言較高的水平表達(dá)。
54.根據(jù)權(quán)利要求46的靶向復(fù)合物，其中所述第一核酸序列含有表達(dá)信號，所述信號能介導(dǎo)所述第二核酸序列在惡性細(xì)胞中以與非-惡性細(xì)胞而言較低的水平表達(dá)。
55.根據(jù)權(quán)利要求46至47中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述第一核酸序列選自pro221，pro210，pro71，pro41，pro30，pro2，pro209，pro14，pro4，pro8，pro246，pro16，pro27，pro5，pro49，pro19，pro140，pro139，pro207，pro81，pro273和pro362。
56.根據(jù)權(quán)利要求46至47中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述第一核酸序列含有選自下列的核苷酸序列的片段pro221，pro210，pro71，pro41，pro30，pro2，pro209，pro14，pro4，pro8，pro246，pro16，pro27，pro5，pro49，pro19，pro140，pro139，pro207，pro81，pro273和pro362。
57.根據(jù)權(quán)利要求46至47中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述第一核酸序列含有一個以上選自下列的核苷酸序列的片段pro221，pro210，pro71，pro41，pro30，pro2，pro209，pro14，pro4，pro8，pro246，pro16，pro27，pro5，pro49，pro19，pro140，pro139，pro207，pro81，pro273和pro362。
58.根據(jù)權(quán)利要求46至47中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述第一核酸序列含有pro221或其一個或多個片段。
59.根據(jù)權(quán)利要求46至47中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述第一核酸序列含有pro210或其一個或多個片段。
60.根據(jù)權(quán)利要求46至47中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述第一核酸序列含有pro71或其一個或多個片段。
61.根據(jù)權(quán)利要求46的靶向復(fù)合物，其中所述第一核酸序列還含有與其非天然相關(guān)的核酸序列。
62.根據(jù)權(quán)利要求61的靶向復(fù)合物，其中所述與其非天然相關(guān)的核酸序列是類固醇激素受體結(jié)合位點(diǎn)。
63.根據(jù)權(quán)利要求44至46中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述第二核酸序列編碼治療蛋白質(zhì)。
64.根據(jù)權(quán)利要求44至46中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述第二核酸序列編碼或含有反義RNA或反義RNA的一部分。
65.根據(jù)權(quán)利要求44至46中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述第二核酸序列編碼或含有核酶。
66.根據(jù)權(quán)利要求44至46中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述反義RNA或所述核酶被靶向癌基因或原癌基因的RNA。
67.根據(jù)權(quán)利要求66的靶向復(fù)合物，其中所述癌基因或原癌基因選自Ras，Raf，Myc，Syn，Pim，BMI-1，F(xiàn)OP，Sis，KGF，F(xiàn)ms，F(xiàn)lg，Neu，Trk，Kit，Met，Src，F(xiàn)yn，Mas，F(xiàn)es/Fps，Tre，Mer，ABL，BCL3，int-2，Cym，Ets，Elk，RhoA，Ski，Wnt-5a，Spi-1，Rap2，p55和c-tyr。
68.根據(jù)權(quán)利要求37至46中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中復(fù)合物還含有保護(hù)性加帽，其中所述保護(hù)性加帽由與第一和/或第二核酸序列結(jié)合的核酸序列組成。
69.根據(jù)權(quán)利要求68的靶向復(fù)合物，其中保護(hù)性加帽含有經(jīng)修飾的核苷酸。
70.根據(jù)權(quán)利要求37的靶向復(fù)合物，其中所述生物反應(yīng)物質(zhì)是毒素。
71.根據(jù)權(quán)利要求70的靶向復(fù)合物，其中所述毒素選自蓖麻毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素、鏈脲菌素或霍亂毒素。
72.根據(jù)權(quán)利要求37的靶向復(fù)合物，其中所述生物反應(yīng)物質(zhì)是細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。
73.根據(jù)權(quán)利要求72的靶向復(fù)合物，其中所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑選自視黃酸、A23187、岡田酸、嘌呤霉素、星形孢菌素、毒胡蘿卜素、放線菌素D、喜樹堿、放線菌酮、地塞米松、依托泊苷和糖皮質(zhì)素。
74.根據(jù)權(quán)利要求37的靶向復(fù)合物，其中所述生物反應(yīng)物質(zhì)是放射性同位素。
75.根據(jù)權(quán)利要求37的靶向復(fù)合物，其中所述生物反應(yīng)物質(zhì)含有細(xì)胞靜止劑。
76.根據(jù)權(quán)利要求37的靶向復(fù)合物，其中所述生物反應(yīng)物質(zhì)含有多肽或基本上由多肽組成。
77.根據(jù)權(quán)利要求76的靶向復(fù)合物，其中所述多肽是治療蛋白質(zhì)。
78.根據(jù)權(quán)利要求63至77中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述治療蛋白質(zhì)是腫瘤抑制因子。
79.根據(jù)權(quán)利要求63至77中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述治療蛋白質(zhì)是細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。
80.根據(jù)權(quán)利要求63至77中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述治療蛋白質(zhì)是可使細(xì)胞周期停滯的蛋白質(zhì)。
81.根據(jù)權(quán)利要求63至77中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述治療蛋白質(zhì)是能保護(hù)細(xì)胞免受毒性劑侵害的蛋白質(zhì)。
82.根據(jù)權(quán)利要求63至77中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述治療蛋白質(zhì)是能催化毒性物質(zhì)合成的蛋白質(zhì)。
83.根據(jù)權(quán)利要求63至77中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述治療蛋白質(zhì)是p53。
84.根據(jù)權(quán)利要求63至77中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述治療蛋白質(zhì)是選自下列的腫瘤抑制因子p73、p16、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-1、MEN-II、BRCA1、VHL、FCC、MCC、MSH2、PTCH、DPCH、TSC2、CDKN2A和ARF。
85.根據(jù)權(quán)利要求63至77中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中所述治療蛋白質(zhì)是選自下列的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑Fas/Apol，TNF，TRAIL，TGF-β，caspase，Bak，Bax，Bid，Bik和GZMB。
86.根據(jù)權(quán)利要求63至77中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其含有一種以上編碼一種或一種以上，如2，3，4種治療蛋白質(zhì)的第一核苷酸序列。
87.根據(jù)權(quán)利要求37至86中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中復(fù)合物還含有核靶向信號。
88.根據(jù)權(quán)利要求87的靶向復(fù)合物，其中核靶向信號是寡肽。
89.根據(jù)權(quán)利要求87的靶向復(fù)合物，其中核靶向信號是猴病毒40大腫瘤抗原的核定位信號。
90.根據(jù)權(quán)利要求37至89中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中復(fù)合物還含有內(nèi)體裂解劑。
91.根據(jù)權(quán)利要求90的靶向復(fù)合物，其中內(nèi)體裂解劑選自聚乙烯亞胺(PEI)，復(fù)制缺損病毒和病毒蛋白衣殼。
92.根據(jù)權(quán)利要求37至89中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中靶向復(fù)合物還含有氯喹。
93.根據(jù)權(quán)利要求90的靶向復(fù)合物，其中內(nèi)體裂解劑含有膜去穩(wěn)定多肽。
94.根據(jù)權(quán)利要求37至93中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中結(jié)合配對物可通過與所述結(jié)合配對物共價(jià)結(jié)合的核酸結(jié)合劑與生物反應(yīng)物質(zhì)結(jié)合。
95.根據(jù)權(quán)利要求94的靶向復(fù)合物，其中核酸結(jié)合劑選自聚-L-賴氨酸(PLL)，精胺、亞精胺和組蛋白蛋白質(zhì)。
96.根據(jù)權(quán)利要求94的靶向復(fù)合物，其中核酸結(jié)合劑是含有15至1000個殘基的PLL。
97.根據(jù)權(quán)利要求37至93中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中結(jié)合配對物通過一對特異性相互作用的組分間接與生物反應(yīng)物質(zhì)結(jié)合，其中一個組分與生物反應(yīng)物質(zhì)共價(jià)結(jié)合，另一個組分與結(jié)合配對物共價(jià)結(jié)合。
98.根據(jù)權(quán)利要求97的靶向復(fù)合物，其中所述相互作用的組分是生物素和鏈霉親和素。
99.由根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法鑒定的細(xì)胞表面分子作為藥物靶的用途，其中所述藥物靶能與結(jié)合配對物結(jié)合，并將所述結(jié)合配對物內(nèi)化至表達(dá)所述細(xì)胞表面分子的細(xì)胞中。
100.根據(jù)權(quán)利要求99的用途，其中細(xì)胞表面分子選自NCAM1，NPTXR，LRP8，CHRNA5，GRIA2，GRM8，ITGAV，ITGAE，TNFRSF12，L1CAM，GPR49和TMEFF1。
101.鑒定和/或制備特異性結(jié)合配對物的方法，其包括以下步驟i)提供通過根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法鑒定的細(xì)胞表面分子，其中細(xì)胞表面分子選自TNFRSF12，L1CAM，GPR49和TMEFF1；ii)鑒定和/或制備能與所述細(xì)胞表面分子結(jié)合的結(jié)合配對物。
102.根據(jù)權(quán)利要求101的方法，其中所述結(jié)合配對物可用于藥物組合物中，以治療前惡性和/或惡性疾病。
103.根據(jù)權(quán)利要求101的方法，其中通過下述步驟制備所述結(jié)合配對物i)用所述細(xì)胞表面分子或其一部分免疫動物；和ii)從所述動物中獲得抗體；或iii)從所述動物中獲得產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，并從所述細(xì)胞中獲得抗體。
104.根據(jù)權(quán)利要求101的方法，其中所述結(jié)合配對物選自表達(dá)多肽和/或寡肽的表達(dá)文庫。
105.根據(jù)權(quán)利要求101的方法，其中所述結(jié)合配對物選自表達(dá)多肽和/或寡肽的合成組合文庫。
106.根據(jù)權(quán)利要求101的方法，其中通過篩選抗體的噬菌體展示文庫以鑒定所述結(jié)合配對物。
107.根據(jù)權(quán)利要求101的方法，其中通過篩選人抗體的噬菌體展示文庫以鑒定所述結(jié)合配對物。
108.根據(jù)權(quán)利要求101的方法，其中所述結(jié)合配對物選自小化合物文庫。
109.通過根據(jù)權(quán)利要求101至108中任一項(xiàng)的方法鑒定的、分離和/或純化的特異性結(jié)合配對物，該配對物能與細(xì)胞表面分子結(jié)合，所述細(xì)胞表面分子在惡性細(xì)胞和正常細(xì)胞中的表達(dá)水平有所不同。
110.根據(jù)權(quán)利要求109的結(jié)合配對物，其中所述結(jié)合配對物含有多肽或基本上由多肽組成。
111.根據(jù)權(quán)利要求109的結(jié)合配對物，其中所述結(jié)合配對物是抗體或抗體片段。
112.根據(jù)權(quán)利要求109的結(jié)合配對物，其中所述結(jié)合配對物是多克隆抗體或其片段。
113.根據(jù)權(quán)利要求109的結(jié)合配對物，其中所述結(jié)合配對物是單克隆抗體或其結(jié)合片段。
114.根據(jù)權(quán)利要求109的結(jié)合配對物，其中所述結(jié)合配對物是鼠單克隆抗體。
115.根據(jù)權(quán)利要求109的結(jié)合配對物，其中所述結(jié)合配對物是人源化抗體。
116.根據(jù)權(quán)利要求109的結(jié)合配對物，其中所述結(jié)合配對物是由噬菌體展示文庫鑒定的人抗體。
117.根據(jù)權(quán)利要求111至116中任一項(xiàng)的結(jié)合配對物，其中所述抗體可與細(xì)胞表面分子的胞外部分相互作用。
118.根據(jù)權(quán)利要求111至116中任一項(xiàng)的結(jié)合配對物，其中所述抗體可與細(xì)胞表面分子胞外部分的翻譯后修飾物相互作用。
119.根據(jù)權(quán)利要求111至118中任一項(xiàng)的結(jié)合配對物，其中所述抗體能通過與所述細(xì)胞表面分子結(jié)合而被內(nèi)化。
120.根據(jù)權(quán)利要求109的結(jié)合配對物，其中所述結(jié)合配對物是所述細(xì)胞表面分子的天然配體。
121.根據(jù)權(quán)利要求109的結(jié)合配對物，其中所述結(jié)合配對物是重組產(chǎn)生的、針對所述細(xì)胞表面分子的配體。
122.根據(jù)權(quán)利要求109的結(jié)合配對物，其中所述結(jié)合配對物是病毒蛋白質(zhì)。
123.根據(jù)權(quán)利要求109的結(jié)合配對物，其中所述結(jié)合配對物是病毒衣殼蛋白。
124.根據(jù)權(quán)利要求109的結(jié)合配對物，其中所述結(jié)合配對物是重組產(chǎn)生的，并含有病毒衣殼蛋白序列。
125.根據(jù)權(quán)利要求109的結(jié)合配對物，其中所述結(jié)合配對物是小化合物。
126.根據(jù)權(quán)利要求37至98中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物，其中結(jié)合配對物是根據(jù)權(quán)利要求109至125中任一項(xiàng)的結(jié)合配對物。
127.鑒定新藥物靶的方法，其包括以下步驟i)提供根據(jù)權(quán)利要求109至125中任一項(xiàng)的結(jié)合配對物；ii)鑒定能與所述結(jié)合配對物結(jié)合的潛在藥物靶。
128.根據(jù)權(quán)利要求127的方法，其中所述藥物靶含有多肽，所述多肽是在惡性細(xì)胞和正常細(xì)胞中以不同水平表達(dá)的細(xì)胞表面分子。
129.通過權(quán)利要求127至128中任一項(xiàng)的方法鑒定的藥物靶。
130.復(fù)合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法鑒定的細(xì)胞表面分子和根據(jù)權(quán)利要求37至98中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物。
131.根據(jù)權(quán)利要求130的復(fù)合物，其中細(xì)胞表面分子選自NCAM1，NPTXR，LRP8，CHRNA5，GRIA2，GRM8，ITGAV，ITGAE，TNFRSF12，L1CAM，GPR49和TMEFF。
132.根據(jù)權(quán)利要求109至125中任一項(xiàng)的結(jié)合配對物用于制備根據(jù)權(quán)利要求37至98中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物的用途。
133.藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求37至98中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物以及藥物可接受載體。
134.給需要治療的個體治療前惡性和/或惡性疾病的方法，包括給所述個體施用藥物有效量的根據(jù)權(quán)利要求37至98中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物。
135.根據(jù)權(quán)利要求134的方法，其中所述治療是改善性治療。
136.根據(jù)權(quán)利要求134的方法，其中所述治療是治愈性治療。
137.根據(jù)權(quán)利要求134的方法，其中所述治療是預(yù)防性治療。
138.根據(jù)權(quán)利要求134的方法，其中所述疾病是選自下列的癌癥黑素瘤、腦瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、白血病、結(jié)腸癌、直腸癌和膀胱癌。
139.根據(jù)權(quán)利要求134的方法，其中所述疾病是選自小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的肺癌。
140.根據(jù)權(quán)利要求134的方法，其中所述疾病是小細(xì)胞肺癌。
141.根據(jù)權(quán)利要求134的方法，其中所述疾病是乳腺癌。
142.根據(jù)權(quán)利要求134的方法，其中所述臨床疾病是選自下列的腦瘤成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、神經(jīng)元瘤、室管膜瘤、顱咽管瘤、松果體腫瘤、生殖細(xì)胞腫瘤和神經(jīng)鞘瘤。
143.根據(jù)權(quán)利要求134的方法，其中非腸道施用所述靶向復(fù)合物。
144.根據(jù)權(quán)利要求134的方法，其中靜脈內(nèi)注射所述靶向復(fù)合物。
145.根據(jù)權(quán)利要求134的方法，其中皮下注射所述靶向復(fù)合物。
146.根據(jù)權(quán)利要求134的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括一種或多種第二治療。
147.根據(jù)權(quán)利要求146的方法，其中所述第二治療選自手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療、細(xì)胞因子治療、激素治療、基因治療、免疫治療和激光治療。
148.根據(jù)權(quán)利要求37至98中任一項(xiàng)的靶向復(fù)合物用于制備藥物的用途，所述藥物可以治療需要治療的個體的前惡性和/或惡性疾病。
149.根據(jù)權(quán)利要求148的用途，其中所述治療是改善性治療。
150.根據(jù)權(quán)利要求148的用途，其中所述治療是治愈性治療。
151.根據(jù)權(quán)利要求148的用途，其中所述治療是預(yù)防性治療。
152.根據(jù)權(quán)利要求148的用途，其中所述疾病是選自下列的癌癥黑素瘤、腦瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、白血病、結(jié)腸癌、直腸癌和膀胱癌。
153.根據(jù)權(quán)利要求148的用途，其中所述疾病是選自小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的肺癌。
154.根據(jù)權(quán)利要求148的用途，其中所述疾病是小細(xì)胞肺癌。
155.根據(jù)權(quán)利要求148的用途，其中所述疾病是乳腺癌。
156.根據(jù)權(quán)利要求148的用途，其中所述疾病是選自下列的腦瘤成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、神經(jīng)元瘤、室管膜瘤、顱咽管瘤、松果體腫瘤、生殖細(xì)胞腫瘤和神經(jīng)鞘瘤。
157.根據(jù)權(quán)利要求148的用途，其中所述藥物適于非腸道施用。
158.根據(jù)權(quán)利要求148的用途，其中所述藥物適于靜脈內(nèi)注射。
159.根據(jù)權(quán)利要求148的用途，其中所述藥物適于皮下注射。
160.藥物有效量的、根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法鑒定的細(xì)胞表面分子用于制備疫苗的用途。
161.藥物有效量的、編碼根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法鑒定的細(xì)胞表面分子的核酸序列用于制備疫苗的用途。
162.根據(jù)權(quán)利要求160和161中任一項(xiàng)的用途，其中細(xì)胞表面分子選自NCAM1，NPTXR，LRP8，CHRNA5，GRIA2，GRM8，ITGAV，ITGAE，TNFRSF12，L1CAM，GPR49和TMEFF1。
163.根據(jù)權(quán)利要求160和161中任一項(xiàng)的用途，其中所述疫苗還含有與所述細(xì)胞表面分子共價(jià)連接的非-自身抗原。
164.根據(jù)權(quán)利要求160和161中任一項(xiàng)的用途，其中所述疫苗還含有編碼與核酸序列連接的非-自身抗原的第二核酸序列。
165.根據(jù)權(quán)利要求160和161中任一項(xiàng)的用途，其中所述疫苗還含有一種以上的抗原。
166.根據(jù)權(quán)利要求160和161中任一項(xiàng)的用途，其中所述疫苗還含有佐劑。
167.根據(jù)權(quán)利要求160和161中任一項(xiàng)的用途，其中所述疫苗適于改善性和/或治愈性和/或預(yù)防性治療前惡性和/或惡性疾病。
全文摘要
本發(fā)明描述了鑒定以不同水平在癌細(xì)胞和非－惡性細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá)的分子的方法，以及鑒定癌癥特異性啟動子的方法，單獨(dú)或聯(lián)合使用所述啟動子可以傳遞和表達(dá)治療基因以治療癌癥。本發(fā)明還描述了能靶向通過本發(fā)明方法鑒定的細(xì)胞表面分子的靶向復(fù)合物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述靶向復(fù)合物含有通過本發(fā)明方法鑒定的啟動子。另外，本發(fā)明還描述了鑒定細(xì)胞表面分子的結(jié)合配對物的方法以及結(jié)合配對物本身。本發(fā)明還公開了使用靶向復(fù)合物的治療方法以及靶向復(fù)合物用于制備藥物的用途。另外，本發(fā)明還描述了細(xì)胞表面分子或其片斷用于制備疫苗的用途。
文檔編號A61K48/00GK1547617SQ02816658
公開日2004年11月17日 申請日期2002年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月25日
發(fā)明者漢斯·S·波爾森, 尼娜·佩德森, 希拉·莫滕森, 蘇珊·B·索倫森, 米凱爾·W·佩德森, 亨里克·I·埃爾斯納, I 埃爾斯納, W 佩德森, B 索倫森, 佩德森, 漢斯 S 波爾森, 莫滕森 申請人:布阿德博公司