專利名稱：化療栓塞用紫杉醇的油性組合物、制劑及它們的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)溶解紫杉醇而可用于動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(transcatheterarterial chemoemboliztion；TACE)的紫杉醇油性組合物、制劑及它們的制造方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明還涉及如下所述的紫杉醇的油性組合物、制劑及它們的制造方法該組合物和制劑中含有為了可以長(zhǎng)期保存而添加的防止紫杉醇沉淀的化學(xué)物質(zhì)。
背景技術(shù)：
動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(TACE)是治療癌癥的方法，其在使用造影劑使手術(shù)過(guò)程顯像的同時(shí)，通過(guò)將抗癌劑和栓塞物質(zhì)經(jīng)腫瘤的營(yíng)養(yǎng)動(dòng)脈注入，從而阻斷向癌組織供給營(yíng)養(yǎng)。本發(fā)明的組合物通過(guò)有效地使紫杉醇溶解，從而可以用于治療肝癌及其他實(shí)體腫瘤的TACE操作。
應(yīng)用最廣泛的動(dòng)脈化療栓塞術(shù)是治療肝癌的肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)。造影劑作為顯像工具在手術(shù)期間或手術(shù)后使用，并進(jìn)一步在腫瘤內(nèi)誘發(fā)栓塞。像多柔比星(阿霉素)、順鉑、卡鉑這樣的抗癌劑溶解或分散在油性造影劑中使用。
動(dòng)脈化療栓塞術(shù)最頻繁使用的造影劑之一是超液化碘油Lipiodol這樣的碘化油。但是，含有超液化碘油與抗癌劑的懸濁體系的物理性質(zhì)不穩(wěn)定，所以，手術(shù)時(shí)存在很多問(wèn)題。以往，放射診斷中治療肝癌時(shí)廣泛使用的抗癌劑是阿霉素、表阿霉素等。但是，這些抗癌劑大部分是水溶性的，而TACE手術(shù)中一直使用懸濁型制劑，而不是油性溶液(YoshihiroKatagiri等、Cancer Chemother.Pharmacol 1989，23，238-242)。但是，這樣的懸濁型制劑的顆粒保存時(shí)發(fā)生聚集，所以不能長(zhǎng)期保存。
為了克服這樣的穩(wěn)定性問(wèn)題，采用將抗癌劑溶解在水性造影劑中后，將該水相分散到像超液化碘油那樣的油性造影劑中的方法。即，就在施用于患者前，將抗癌劑溶解在水性造影劑中，然后通過(guò)泵送法將其與油性造影劑混合。為了使乳液的穩(wěn)定性最大化，使用比重與超液化碘油比重(1.275至1.290)相近的水性造影劑，如泛影葡胺(Urografin，1.328-1.332)或碘必樂(lè)(Iopamiro，1.17-1.41)(Takashi Kanematsu等，Journal of surgicaloncology 1984，25，218-226，Takafumi Ichida等，Cancer Chemother.Pharmacol 1994 33，74-78)。
但是，通過(guò)所述方法只能形成暫時(shí)性乳液，該乳液制成后幾分鐘內(nèi)就再次發(fā)生相分離。而不穩(wěn)定的乳液不能提供充分的栓塞效果。實(shí)際上，在手術(shù)期間就能觀察到導(dǎo)管內(nèi)發(fā)生了相分離。施用該不穩(wěn)定乳液時(shí)，阿霉素被組織立即吸收，不能提供抗癌劑持續(xù)輸送的效果。
理想的肝癌治療方法之一是使用合成高分子抗癌劑，也就是使用凈司他丁[與苯乙烯-馬來(lái)酸共聚物結(jié)合的新制癌菌素(SMANCS)]。SMANCS兼具親水性和親油性，可以直接溶解在超液化碘油中(Konno，T.和Maeda，H.，Targetting chemotherapy of hepatocellular carcinoma.Neoplasms of the liver，Eds.Okuda，K.，和Ishak，K.G.，Springger-Verlag，柏林，P343-352)，但是，SMANCS/超液化碘油制劑雖然解決了阿霉素/超液化碘油制劑中存在的穩(wěn)定性問(wèn)題，但因?yàn)槠鋬r(jià)格高，并且具有嚴(yán)重的毒副作用，所以沒(méi)有被普遍使用。
另外，抗癌劑紫杉醇作為對(duì)卵巢癌、乳腺癌、食道癌、黑素瘤、白血病有顯著細(xì)胞毒性的物質(zhì)被人們所熟知。作為百時(shí)美施貴寶公司出品的商標(biāo)為泰素(Taxol)的靜脈注射劑，紫杉醇已得到商品化。
紫杉醇是一種非水溶性藥物，所以從開發(fā)階段就同時(shí)開始了增溶技術(shù)的開發(fā)。作為這樣的增溶技術(shù)的一個(gè)例子，可以舉出為了在靜脈注射等全身給藥中應(yīng)用而使用增溶劑。所述泰素使用聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL聚氧乙烯35-蓖麻油)和乙醇作為增溶劑。泰素是一種預(yù)濃縮型乳液制劑，該乳液制劑在過(guò)量的水中分散時(shí)就會(huì)自發(fā)地形成微乳液(美國(guó)專利第5438072號(hào))。但是，我們知道泰素中所使用的增溶劑會(huì)引起毒副作用。所以，為了開發(fā)具有高抗癌活性和低毒性的新型紫杉醇制劑，進(jìn)行了多種研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過(guò)使紫杉醇溶解而使其可用于動(dòng)脈化療栓塞術(shù)。
所以，本發(fā)明的目的之一是提供可溶解紫杉醇的新型紫杉醇組合物。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明的目的是提供一種油性的紫杉醇制劑，該制劑可以在通過(guò)動(dòng)脈化療栓塞術(shù)治療實(shí)體腫瘤時(shí)使用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供在動(dòng)脈化療栓塞術(shù)實(shí)施期間，可以穩(wěn)定地維持原始組成的油性的紫杉醇制劑。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供上述紫杉醇組合物的制造方法。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供含有防止紫杉醇沉淀的附加成分的動(dòng)脈化療栓塞用紫杉醇組合物。


圖1是通過(guò)動(dòng)脈化療栓塞術(shù)選擇性地向家兔肝癌組織施用0.3cc本發(fā)明的紫杉醇/超液化碘油制劑1周后的計(jì)算機(jī)控制斷層掃描(CT)照片。施用的紫杉醇量分別為A)1mg，B)3mg和C)0mg。
圖2是表示通過(guò)動(dòng)脈化療栓塞術(shù)選擇性地向家兔肝癌組織施用0.3cc本發(fā)明的紫杉醇/超液化碘油制劑1周后肝癌組織內(nèi)和其周圍正常肝組織內(nèi)的紫杉醇濃度的圖。紫杉醇的定量分析是通過(guò)高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行的。施用的紫杉醇的量分別為A)1mg和B)3mg。
圖3是表示通過(guò)動(dòng)脈化療栓塞術(shù)選擇性地向家兔肝癌組織施用0.3cc(1mg紫杉醇給藥組和3mg紫杉醇給藥組)和0.4cc(紫杉醇4mg給藥組)本發(fā)明的紫杉醇/超液化碘油制劑1周后，存活腫瘤占全部肝癌組織的百分比的圖。陰性對(duì)照組只施用0.3cc超液化碘油。
圖4是表示通過(guò)動(dòng)脈化療栓塞術(shù)選擇性地向家兔肝癌組織施用0.4cc(4mg紫杉醇給藥組)1周后肝癌組織、左葉和右葉中紫杉醇的濃度的圖。
-●-肝癌組織中紫杉醇的濃度.
-○-左葉中紫杉醇的濃度.
--右葉中紫杉醇的濃度.
圖5是本發(fā)明紫杉醇/超液化碘油制劑和紫杉醇/超液化碘油/三辛酸甘油酯制劑在常溫保存200天后的照片。
A紫杉醇/超液化碘油制劑的照片B紫杉醇/超液化碘油制劑在偏光顯微鏡下的照片C紫杉醇/超液化碘油/三辛酸甘油酯制劑的照片D紫杉醇/超液化碘油/三辛酸甘油酯制劑的偏光顯微鏡下的照片圖6是接種黑素瘤細(xì)胞5天后注射20μl紫杉醇/超液化碘油/三辛酸甘油酯制劑(紫杉醇200μg給藥組)之后測(cè)定的小鼠足底厚度的曲線圖。對(duì)照組為施用20μl超液化碘油/三辛酸甘油酯組，陰性對(duì)照組為不作任何處理組。
-●-施用20μl紫杉醇/超液化碘油/三辛酸甘油酯制劑(紫杉醇200μg)組。
-○-施用20μl超液化碘油/三辛酸甘油酯制劑組。
--未處理組.
圖7是表示接種黑素瘤細(xì)胞5天后注射20μl紫杉醇/超液化碘油/三辛酸甘油酯制劑(紫杉醇200μg組)后存活小鼠只數(shù)的曲線圖。將未處理組作為陰性對(duì)照組。
-●-施用20μl紫杉醇/超液化碘油/三辛酸甘油酯制劑(紫杉醇200μg)組。
-○-未處理組。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人在為達(dá)到上述提到的要求而對(duì)可以用于動(dòng)脈化療栓塞術(shù)的紫杉醇制劑進(jìn)行研究中意外地發(fā)現(xiàn)，紫杉醇可以很好地溶解在油性造影劑中，形成粘度范圍為40～180cP(厘泊)均質(zhì)的、單相的、粘性的油性液體。
還發(fā)現(xiàn)，所述的紫杉醇/油性造影劑組合物的化學(xué)和物理性質(zhì)穩(wěn)定，可以長(zhǎng)期保存而無(wú)組成變化。該紫杉醇/油性造影劑組合物的物性比使用像多柔比星那樣的水溶性抗癌劑的現(xiàn)有超液化碘油制劑有很大的改善，本發(fā)明的紫杉醇/油性造影劑組合物的物性類似于SMANCS/超液化碘油制劑的物性。但是，SMANCS/超液化碘油制劑的成本過(guò)高，并且具有毒副作用，與之相反，本發(fā)明的紫杉醇/油性造影劑組合物使用兩種較廉價(jià)的原料物質(zhì)，成本低并且容易制造。而且得到的制劑儲(chǔ)存穩(wěn)定性優(yōu)異。
現(xiàn)有的超液化碘油/碘必樂(lè)/多柔比星制劑在混合后很快就發(fā)生相分離，而本發(fā)明油性的紫杉醇制劑在實(shí)施動(dòng)脈化療栓塞術(shù)期間可以穩(wěn)定地維持原始組成。所以，本發(fā)明的紫杉醇/油性造影劑組合物制劑可以以持續(xù)釋放的方式向腫瘤釋放抗癌劑。另外，所述制劑具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，所以可以長(zhǎng)期保存。由下述在動(dòng)物模型中實(shí)施肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)的結(jié)果可以看出，本發(fā)明的制劑顯示了優(yōu)異的栓塞效果和抗癌活性。所以可以相信本發(fā)明的制劑可廣泛用于動(dòng)脈化療栓塞術(shù)。
動(dòng)脈化療栓塞術(shù)中，肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)最具代表性，除肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)以外，動(dòng)脈化療栓塞術(shù)還可以用于多種實(shí)體腫瘤。例如，通過(guò)在腎動(dòng)脈實(shí)施動(dòng)脈化療栓塞術(shù)，可將SMANCS/超液化碘油制劑用于腎癌的靶向治療(K.Tsuchiya.Tumor-targeted chemotherapy with SMANCS inLipiodol for renal cell carcinomalonger survival with larger size tumors.Urology.2000 Apr；55(4)495-500)。
本發(fā)明的目的是通過(guò)增溶紫杉醇而在動(dòng)脈化療栓塞術(shù)中使用紫杉醇。
作為本發(fā)明在制造紫杉醇/油性造影劑組合物時(shí)使用的油性造影劑的例子有碘化油。所述碘化油包括超液化碘油(Laboratoire Guerbet，F(xiàn)rance)、乙碘油(EthiodolSavage Laboratories，Melville，NY)等的碘化罌粟種子油和碘化大豆油。Ma Tai已對(duì)所述碘化大豆油作了詳細(xì)說(shuō)明(Theeffect of oral iodized oil on prevention and treatment of endemic goiter.Chinese Med.J.61(9)533，1981)。
本發(fā)明中，作為油性造影劑使用的碘化油中的含碘量?jī)?yōu)選為30-50重量％。更優(yōu)選所述含碘量為35-45重量％。最優(yōu)選使用超液化碘油作為所述油性造影劑。
本發(fā)明的紫杉醇/油性造影劑組合物含有油性造影劑和紫杉醇，相對(duì)于1ml所述油性造影劑，所述紫杉醇的含量為0.0001mg～10mg。此時(shí)，如果相對(duì)于1ml油性造影劑的紫杉醇的量超過(guò)10mg，過(guò)量的紫杉醇將沉淀出來(lái)，所以不是優(yōu)選的。而當(dāng)相對(duì)于1ml油性造影劑的紫杉醇的量少于0.0001mg時(shí)，抗癌活性過(guò)低，也不是優(yōu)選的。
在本發(fā)明的紫杉醇/油性造影劑組合物中還可以添加動(dòng)物油如角鯊烯或者植物油如大豆油。通過(guò)用動(dòng)物油、植物油或它們的混合物代替部分的所述油性造影劑，可以減少制造制劑的成本而不降低藥效或穩(wěn)定性。油性造影劑與動(dòng)物油和/或植物油的比率為體積比1∶0.01～1。更優(yōu)選所述比率為1∶0.01～0.5。
通過(guò)按所述組成范圍向所述油性造影劑中添加紫杉醇并在常溫下通過(guò)攪拌使紫杉醇溶解，可以簡(jiǎn)單制造本發(fā)明的紫杉醇/油性造影劑組合物。此時(shí)，為了加速溶解，可以把溫度升高到35～45℃，或者用槽式超聲波儀進(jìn)行超聲處理。將這樣制造的紫杉醇/油性造影劑組合物滅菌后保存。也可以使用滅菌后的原料并將其在無(wú)菌條件下混合。或者，將所述紫杉醇/油性造影劑組合物注射通過(guò)滅菌的注射過(guò)濾器(孔徑為200μm，PVDF滅菌濾膜)進(jìn)行滅菌。還可以通過(guò)γ射線或EO氣滅菌方法對(duì)所述的油性造影劑和紫杉醇進(jìn)行滅菌，然后進(jìn)行混合，也可以通過(guò)γ射線或EO氣滅菌方法對(duì)混合后的組合物進(jìn)行滅菌。
如上述這樣制造的本發(fā)明的紫杉醇/油性造影劑組合物至少可在室溫穩(wěn)定60天。
所述油性組合物中，紫杉醇雖然在大約2個(gè)月的時(shí)間內(nèi)是穩(wěn)定的溶解狀態(tài)，但最終紫杉醇仍然會(huì)從該油性溶液中沉淀析出。所述沉淀是由紫杉醇分子中的分子內(nèi)氫鍵或分子間氫鍵形成的。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)添加與紫杉醇形成氫鍵的化學(xué)物質(zhì)，或者添加阻礙紫杉醇分子內(nèi)或分子間形成氫鍵的化學(xué)物質(zhì)，可以有效防止所述沉淀的產(chǎn)生。當(dāng)所述紫杉醇的油性組合物中的油性造影劑本身可以和紫杉醇形成氫鍵時(shí)，即使經(jīng)過(guò)2個(gè)月，所述的組合物也沒(méi)有產(chǎn)生沉淀。
但是，使用最常用的油性造影劑超液化碘油時(shí)，受超液化碘油分子結(jié)構(gòu)所限，其不可能與紫杉醇形成氫鍵。在這種情況下，可以在超液化碘油溶液中與紫杉醇形成氫鍵的物質(zhì)可以防止紫杉醇的沉淀。例如，在所述紫杉醇的油性組合物中添加三辛酸甘油酯時(shí)，不形成紫杉醇分子間的氫鍵，而是形成紫杉醇與三辛酸甘油酯之間的氫鍵，從而防止紫杉醇的沉淀。
在所述紫杉醇的油性組合物中，紫杉醇和油性造影劑經(jīng)長(zhǎng)期保存后的含量依賴于制造過(guò)程。如果該組合物在制造過(guò)程中沒(méi)有接觸水分或氧并且無(wú)需加熱的話，可以最大程度的降低組成成分等的氧化和水解，所以該組合物穩(wěn)定的時(shí)間可以更長(zhǎng)。但是，所述的沉淀過(guò)程與其他的失穩(wěn)過(guò)程不同，該沉淀過(guò)程是熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)的過(guò)程。所以，無(wú)論制造期間或制造后如何注意，也無(wú)法避免所述紫杉醇的油性組合物形成沉淀。沉淀形成速度依賴于該油性組合物內(nèi)紫杉醇的濃度。該油性組合物內(nèi)紫杉醇的濃度為10mg/ml和5mg/ml的情況下，在常溫分別經(jīng)過(guò)約60天和120天后，產(chǎn)生沉淀。因此，只有在向該組合物中另外添加阻礙紫杉醇沉淀的物質(zhì)的情況下，所述油性的紫杉醇制劑才能穩(wěn)定1年以上。
所以，本發(fā)明的紫杉醇油性組合物可以含有另外添加的阻礙紫杉醇沉淀的組分。此時(shí)，該油性組合物內(nèi)紫杉醇的溶解度增加到13mg/ml。
也就是說(shuō)，本發(fā)明的紫杉醇/油性造影劑組合物內(nèi)每1ml油性造影劑中紫杉醇的含量為0.0001～13mg，同時(shí)阻礙紫杉醇沉淀的物質(zhì)的含量為0.01～1ml。
此時(shí)，所用的油性造影劑的例子與上述相同。
制造紫杉醇/油性造影劑組合物過(guò)程中，作為阻礙紫杉醇沉淀的物質(zhì)包括可與紫杉醇形成氫鍵的物質(zhì)或者干擾紫杉醇分子之間形成氫鍵的促溶劑。
所述可與以上紫杉醇分子形成氫鍵的物質(zhì)有醇、多元醇、油、脂質(zhì)、高分子或肽等。所述醇包括甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇和脂肪醇。所述多元醇包括乙二醇、丙二醇和聚乙二醇。所述油包括甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯、生育酚以及作為這些甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯與其他少量成分的混合物的動(dòng)物油或植物油。所述脂質(zhì)包括磷脂、中性脂質(zhì)、陽(yáng)離子性脂質(zhì)、陰離子性脂質(zhì)和脂肪酸。所述高分子包括聚乳酸、聚羥基乙酸以及它們的共聚物、殼聚糖、藻酸鹽、透明質(zhì)酸鹽(酯)、糊精、聚ε-己內(nèi)酯。所述促溶劑包括二甲亞砜(DMSO)或酰胺。
如上所述，添加了阻礙紫杉醇沉淀的物質(zhì)的情況下，本發(fā)明的紫杉醇/油性造影劑組合物可在常溫穩(wěn)定保存200天以上。
本發(fā)明的紫杉醇/油性造影劑組合物的粘度為45～180cP，可有效用于治療實(shí)體腫瘤的動(dòng)脈化療栓塞術(shù)。
另外，對(duì)于本發(fā)明的紫杉醇/油性造影劑組合物的施用量和施用方法，醫(yī)生可根據(jù)患者的年齢、性別、體重、癥狀嚴(yán)重程度等進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。通常，動(dòng)脈化療栓塞術(shù)可以在1～4個(gè)月內(nèi)進(jìn)行一次，也可重復(fù)進(jìn)行。將2～15ml所述制劑沿實(shí)體腫瘤的營(yíng)養(yǎng)動(dòng)脈注入，例如就肝癌而言是沿肝動(dòng)脈注入。
以下根據(jù)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。但是下述的實(shí)施例僅用于解釋，而本發(fā)明不受這些實(shí)施例中的條件、原料或裝置所限。
實(shí)施例實(shí)施例1.
紫杉醇/超液化碘油組合物的制造用1ml超液化碘油(Lipiodol Ultra-fluid(超液化Lipiodol)，LaboratoireGuerbet，F(xiàn)rance，含碘量為38重量％)作為油性造影劑。將所述超液化碘油和2、4、6、8、10或11mg的紫杉醇(韓國(guó)三養(yǎng)-真耐克斯公司(SamyangGenex，Korea))裝入試管(帶有安全鎖的微量試管，聚乙烯制，1.5ml，德國(guó)Eppendorf AG出品)，在室溫?cái)嚢枞芙狻榱思铀偃芙饪梢约訜岬?5～45℃或者在槽式超聲波儀中進(jìn)行超聲處理。當(dāng)在1ml的超液化碘油中添加2～10mg的紫杉醇時(shí)，形成了透明單液相，證明紫杉醇在超液化碘油中完全溶解。但是向1ml的超液化碘油中添加11mg的紫杉醇時(shí)，雖然開始時(shí)形成了透明液體，但在室溫放置過(guò)夜后，該溶液的濁度增加。用顯微鏡觀察到了紫杉醇的沉淀。由此證明，超液化碘油內(nèi)紫杉醇在室溫(24～28℃)下的溶解度為約10mg/ml。用運(yùn)動(dòng)粘度計(jì)(Cannon-Fenske型，已校準(zhǔn)，Cat.No.13-617E，型號(hào)200，飛世爾科學(xué)世界公司(Fisher Scientific)，賓夕法尼亞州匹茲堡市)，測(cè)定該液體制劑的下降時(shí)間，從而測(cè)定紫杉醇/超液化碘油(10mg/1ml)制劑的粘性。25℃下測(cè)定的粘度為67cP。測(cè)定的粘度大于栓塞效果最大的粘度45cP，所以可以認(rèn)為紫杉醇/超液化碘油組合物的栓塞效果優(yōu)異。
實(shí)施例2紫杉醇/超液化碘油組合物的物理穩(wěn)定性將1ml超液化碘油(Lipiodol Ultra-fluid，Laboratoire Guerbet，法國(guó)，含碘量38重量％)和10mg紫杉醇(韓國(guó)三養(yǎng)-真耐克斯公司(SamyangGenex，Korea))裝入試管(帶有安全鎖的微量試管，聚乙烯制，1.5ml，德國(guó)Eppendorf AG出品)，在室溫?cái)嚢枞芙?。為了加速溶解可以加熱?0℃。形成了透明的單一液相，證明紫杉醇在超液化碘油中完全溶解。使制成的組合物通過(guò)注射過(guò)濾器(孔徑為200μm，PVDF濾膜)的注射進(jìn)行滅菌，然后在室溫和4℃保存60天，觀察物理穩(wěn)定性和紫杉醇是否降解。制劑沒(méi)有色澤或氣味的變化。也沒(méi)有發(fā)生相分離或沉淀現(xiàn)象。利用HPLC分析的結(jié)果表明紫杉醇完全沒(méi)有降解。HPLC條件如下。
泵SP8810精密均衡泵(Spectra-Physics Inc.，加利福尼亞州圣何塞市)柱Waters Bond pack C18柱(3.9mm×300mm，Waters Corp.，馬薩諸塞州米爾福德市)流動(dòng)相乙腈和水各50％(w/w)流速1毫升/分鐘檢測(cè)器Spectra 100可變波長(zhǎng)檢測(cè)器(Spectra-Physics)實(shí)施例3.
紫杉醇/乙碘油組合物的物理穩(wěn)定性使用乙碘油(Savage Laboratories，Melville，紐約)作為油性造影劑代替超液化碘油，此外，采用實(shí)施例2所述的方法制造油性的紫杉醇組合物。形成透明的單一液相，證明紫杉醇在乙碘油中完全溶解。通過(guò)實(shí)施例2所述的方法對(duì)制成的組合物的物理穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)。制成的組合物經(jīng)滅菌后，在室溫和4℃保存60天，觀察物理穩(wěn)定性和紫杉醇是否降解。該制劑沒(méi)有色澤或氣味的變化。也沒(méi)有發(fā)生相分離或沉淀現(xiàn)象。利用HPLC分析的結(jié)果表明紫杉醇沒(méi)有降解。
實(shí)驗(yàn)例1.
肝癌動(dòng)物模型的制作將德國(guó)癌癥研究中心(Deutsches Krebsforschungszentrum Tumorbank)提供的VX2腫瘤移植到家兔(新西蘭白兔)大腿部。2周后，對(duì)腫瘤直徑為1～2cm的家兔靜脈注射10ml硫噴妥鈉溶液(62.5mg/kg)致使其死亡。用碘溶液和乙醇對(duì)皮膚消毒，除去腫瘤部位的毛并切開該部位的皮膚，然后將腫瘤連同其周圍的組織一起切除。切開摘出的腫瘤，除去中心部壞死部分。將存活的周圍部的腫瘤組織與無(wú)鈣鎂的漢克氏平衡鹽溶液(HBSS；格蘭德島生物公司(Grand Island Biological Co.)，格蘭德島，紐約)混合，用剪子和手術(shù)刀將其切成小片。將該腫瘤溶液與5ml的RMPI-1640(Roswell Park Memorial Institute，Roswell Park，紐約)培養(yǎng)液混合。將該混合物稀釋成1×106個(gè)腫瘤細(xì)胞/mm3。
將腫瘤細(xì)胞溶液注入家兔肝臟首先，用23G的針通過(guò)耳靜脈注射500ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。將混合了500mg硫噴妥鈉的40ml磷酸鹽緩沖鹽水以每分鐘1ml的流速經(jīng)該家兔靜脈進(jìn)行注射，從而麻醉家兔。所述溶液的總劑量為1.5ml/kg。除去腹部的毛，用碘溶液和乙醇對(duì)皮膚消毒。超聲誘導(dǎo)下，用配有22G的針的1ml注射器將0.1ml腫瘤組織溶液注入左葉的肝實(shí)質(zhì)內(nèi)。將腫瘤組織溶液注入家兔肝臟的5個(gè)葉中最容易用超聲觀察的左葉中(圖1)。為了防止2次感染，靜脈注射抗生素(Penbrex，250mg)。將腫瘤組織溶液注入后，用正常的飼料在家兔飼養(yǎng)箱中飼喂這些家兔。腫瘤細(xì)胞移植后的2周內(nèi)通過(guò)超聲觀察和CT可以識(shí)別腫瘤。腫瘤的成長(zhǎng)速度可利用成長(zhǎng)曲線粗略地預(yù)測(cè)。在移植后的最初2周，每隔3天進(jìn)行超聲觀察，每隔1周實(shí)施CT，以便跟蹤腫瘤的位置和大小。
實(shí)施例4.
利用紫杉醇/超液化碘油組合物在肝癌動(dòng)物模型實(shí)施動(dòng)脈化療栓塞術(shù)將1ml的超液化碘油和3.33mg或10mg的紫杉醇(韓國(guó)三養(yǎng)-真耐克斯公司)裝入試管，在室溫?cái)嚢枞芙狻榱思铀偃芙饪梢约訜岬?0℃。形成了透明的單一液相，證明紫杉醇在超液化碘油中完全溶解。使制成的組合物通過(guò)注射過(guò)濾器(孔徑為200μm，PVDF濾膜)進(jìn)行注射以便滅菌。
對(duì)實(shí)驗(yàn)例1中準(zhǔn)備的肝癌動(dòng)物模型實(shí)施動(dòng)脈化療栓塞術(shù)，用導(dǎo)管插入腫瘤的營(yíng)養(yǎng)動(dòng)脈，將0.3ml本發(fā)明的紫杉醇/超液化碘油制劑注入。實(shí)驗(yàn)組的紫杉醇劑量分別相當(dāng)于1mg或3mg。作為陰性對(duì)照組，肝癌動(dòng)物模型中只注入0.33cc的超液化碘油，以便比較。手術(shù)1周后，如圖1中CT照片所見(jiàn)，超液化碘油被選擇性地吸收到肝癌組織內(nèi)。
實(shí)施例5.
以紫杉醇/超液化碘油組合物實(shí)施動(dòng)脈化療栓塞術(shù)后肝癌組織中紫杉醇濃度的分析實(shí)施例4中實(shí)施動(dòng)脈化療栓塞術(shù)1周后，處死家兔并摘除肝臟。分別在肉眼可以識(shí)別出超液化碘油的組織、肉眼不能識(shí)別出超液化碘油的組織和位于肝癌周圍的正常組織內(nèi)，測(cè)定組織內(nèi)紫杉醇的濃度。將各肝臟組織與溶解緩沖溶液[62.5mM Tris-HCl(pH6.8)、2％十二烷基磺酸鈉、5％β-巰基乙醇、10％甘油]混合，使其均質(zhì)化。均質(zhì)化的混合物經(jīng)離心分離后，取得上層液，然后利用HPLC測(cè)定紫杉醇的濃度。HPLC的條件與實(shí)施例2中的條件相同。如實(shí)施例4中說(shuō)明的那樣，施用了相當(dāng)于1mg或3mg紫杉醇的所述制劑的家兔肝臟組織中，其紫杉醇濃度分別如圖2A和2B所示。證實(shí)肉眼能識(shí)別出超液化碘油的肝癌組織中的紫杉醇的濃度最高。不能識(shí)別出超液化碘油的肝癌組織中也檢出了較高的紫杉醇濃度。
與此相反，該腫瘤旁邊的正常肝臟組織中基本沒(méi)有檢測(cè)到紫杉醇。由此證明，以本發(fā)明紫杉醇/超液化碘油制劑實(shí)施動(dòng)脈化療栓塞術(shù)1周后，紫杉醇只選擇性地分布在腫瘤中。
實(shí)施例6.
測(cè)定以超液化碘油/紫杉醇組合物實(shí)施動(dòng)脈化療栓塞術(shù)后存活的腫瘤將1ml的超液化碘油和3.33mg或10mg的紫杉醇(韓國(guó)三養(yǎng)-真耐克斯公司)裝入試管，在室溫?cái)嚢枞芙?。為了加速溶解可以加熱?0℃。形成了透明的單一液相，證明紫杉醇在超液化碘油中完全溶解。使制成的組合物通過(guò)注射過(guò)濾器(孔徑為200μm，PVDF濾膜)進(jìn)行注射以便滅菌。
對(duì)實(shí)驗(yàn)例1中準(zhǔn)備的肝癌動(dòng)物模型實(shí)施動(dòng)脈化療栓塞術(shù)，將導(dǎo)管插入腫瘤的營(yíng)養(yǎng)動(dòng)脈，將0.3ml(3.33或10mg/ml制劑)或0.4ml(10mg/ml制劑)本發(fā)明的紫杉醇/超液化碘油制劑注入。紫杉醇的劑量分別相當(dāng)于1mg、3mg或4mg。作為陰性對(duì)照組，肝癌動(dòng)物模型中只注入0.33cc的超液化碘油，以便比較。手術(shù)1周后，如圖1中的CT照片所見(jiàn)，超液化碘油選擇性地被吸收到肝癌組織中。實(shí)施動(dòng)脈化療栓塞術(shù)1周后，處死家兔并摘除肝臟。與只施用超液化碘油的陰性對(duì)照組相似，施用紫杉醇/超液化碘油制劑的實(shí)驗(yàn)組的腫瘤大小為32±5mm。為了區(qū)分腫瘤組織中壞死性腫瘤和存活腫瘤，進(jìn)行病理學(xué)檢查。全部腫瘤組織中存活腫瘤的百分率如圖3所示。陰性對(duì)照組中存活的腫瘤大于30％，而分別施用1mg、3mg和4mg紫杉醇的實(shí)驗(yàn)組中存活腫瘤分別為13.2％、10.4％和0.6％。
這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明的紫杉醇/超液化碘油制劑中的紫杉醇有效地破壞了腫瘤細(xì)胞。
實(shí)施例7超液化碘油/大豆油/紫杉醇組合物的制造將1ml的超液化碘油、0.2ml大豆油和10mg紫杉醇裝入試管，室溫下攪拌溶解。為了加速溶解，利用槽式超聲波儀進(jìn)行超聲處理。形成透明的單一液相，證明紫杉醇在超液化碘油/大豆油組成的混合油體系中完全溶解。
實(shí)施例8超液化碘油/角鯊烯/紫杉醇組合物的制造用角鯊烯代替大豆油，為了加速溶解，將混合物加熱到40℃，此外通過(guò)與實(shí)施例6同樣的制造方法制造超液化碘油/角鯊烯/紫杉醇組合物。形成透明的單一液相，證明紫杉醇在超液化碘油/大豆油組成的混合油體系中完全溶解。
實(shí)施例9.
紫杉醇/超液化碘油/三辛酸甘油酯組合物的制造及其物理穩(wěn)定性的測(cè)定將由1ml的超液化碘油(Lipiodol Ultra-fluid，Laboratoire Guerbet，法國(guó)，含碘量為38重量％)和0.01ml三辛酸甘油酯(Sigma化學(xué)公司)組成的油性混合物和10mg紫杉醇(韓國(guó)三養(yǎng)-真耐克斯公司)裝入試管，室溫下攪拌溶解。為了加速溶解，利用槽式超聲波儀進(jìn)行超聲處理。形成透明的單一液相，證明紫杉醇在超液化碘油/三辛酸甘油酯的油性混合物中完全溶解。使制成的組合物通過(guò)注射過(guò)濾器(孔徑為200μm，PVDF濾膜)進(jìn)行注射以便滅菌，然后在室溫和4℃保存200天，觀察物理穩(wěn)定性和紫杉醇是否降解。該制劑沒(méi)有色澤或氣味的變化。也沒(méi)有發(fā)生相分離或沉淀現(xiàn)象。利用HPLC分析的結(jié)果表明紫杉醇沒(méi)有降解。實(shí)施例1的紫杉醇/超液化碘油制劑在常溫保存200天后，觀察到因紫杉醇的沉淀產(chǎn)生的混濁(圖5A)，并且通過(guò)偏光顯微鏡也能觀察到紫杉醇的沉淀(圖5B)。相反，紫杉醇/超液化碘油/三辛酸甘油酯組合物中沒(méi)有產(chǎn)生紫杉醇的沉淀(圖5D)，仍然保持透明(圖5C)。因此，通過(guò)添加作為阻礙紫杉醇沉淀的成分的三辛酸甘油酯，紫杉醇/超液化碘油組合物可以長(zhǎng)期穩(wěn)定。
實(shí)施例10.
紫杉醇/超液化碘油/三辛酸甘油酯組合物的制造及其物理穩(wěn)定性的測(cè)定將由1ml的超液化碘油(Lipiodol Ultra-fluid，Laboratoire Guerbet，法國(guó)，含碘量為38重量％)和0.01ml三辛酸甘油酯(Sigma化學(xué)公司)組成的混合物和12mg紫杉醇(韓國(guó)三養(yǎng)-真耐克斯公司)裝入試管，室溫下攪拌溶解。為了加速溶解，利用槽式超聲波儀進(jìn)行超聲處理。形成透明的單一液相，證明紫杉醇在超液化碘油/三辛酸甘油酯油性混合物中完全溶解，證明紫杉醇在超液化碘油/三辛酸甘油酯混合油體系中的溶解度比在單獨(dú)的超液化碘油中高。
實(shí)驗(yàn)例2
黑素瘤動(dòng)物模型的制作從美國(guó)模式菌種收藏所(ATCC，美國(guó))獲得B16F10細(xì)胞，其是由C57BL/6J小鼠自發(fā)產(chǎn)生的黑素瘤細(xì)胞系。在補(bǔ)充了10％胎牛血清(FBS，Gibco)和1％青霉素/鏈霉素(Gibco)的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM，Gibco BRL/Life Technologies，紐約州紐約市)中培養(yǎng)所述細(xì)胞。將1×106個(gè)細(xì)胞分散到100μl DMEM中，然后接種在8周齡的C57BL/J小鼠(韓國(guó)Samtaco)的左后足的足底中，制成黑素瘤動(dòng)物模型。
實(shí)施例11注射紫杉醇/超液化碘油/三辛酸甘油酯組合物后測(cè)定黑素瘤的大小使實(shí)施例9制成的紫杉醇/超液化碘油/三辛酸甘油酯組合物通過(guò)注射過(guò)濾器(孔徑為200μm，PVDF濾膜)進(jìn)行注射以便滅菌。如實(shí)驗(yàn)例2那樣接種黑素瘤5天后，將20μl所述組合物注入到左后足足底的接種部位。使用只注入20μl的超液化碘油/三辛酸甘油酯(100∶1體積比)的組和未處理組作為陰性對(duì)照組。黑素瘤的大小通過(guò)測(cè)定足底厚度進(jìn)行定量，其結(jié)果示于圖6。未處理組中，接種18天后黑素瘤開始生長(zhǎng)，只用超液化碘油/三辛酸甘油酯處理的組中，經(jīng)22天后黑素瘤開始生長(zhǎng)，而用紫杉醇/超液化碘油/三辛酸甘油酯處理的組中，黑素瘤全然沒(méi)有生長(zhǎng)，由此證明本發(fā)明的組合物具有顯著的抗癌活性。
實(shí)施例12測(cè)定注射紫杉醇/超液化碘油/三辛酸甘油酯組合物后的存活時(shí)間使實(shí)施例9制成的紫杉醇/超液化碘油/三辛酸甘油酯組合物通過(guò)注射過(guò)濾器(孔徑為200μm，PVDF濾膜)進(jìn)行注射以便滅菌。如實(shí)驗(yàn)例2那樣接種黑素瘤5天后，將20μl所述組合物注入到左后足的足底的接種部位。使用未處理組作為陰性對(duì)照組。存活小鼠的個(gè)數(shù)與時(shí)間的關(guān)系如圖7所示。未處理組中，接種黑素瘤經(jīng)20天后，小鼠開始死亡，經(jīng)48天全部小鼠(n＝6)死亡。
而用紫杉醇/超液化碘油/三辛酸甘油酯處理的小鼠都健康地存活著，證明本發(fā)明的組合物具有顯著的抗癌活性。
本發(fā)明的紫杉醇/油性造影劑組合物是一種單相的高粘性液體。紫杉醇以往一直以靜脈注射為主，本發(fā)明的組合物為紫杉醇開辟了新的給藥途徑。本發(fā)明的組合物可通過(guò)動(dòng)脈化療栓塞術(shù)用于肝癌治療。本發(fā)明的紫杉醇/超液化碘油制劑易于制造和滅菌，與現(xiàn)有的多柔比星/超液化碘油制劑相比，物理和化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定。所以該組合物在用于治療實(shí)體腫瘤的動(dòng)脈化療栓塞術(shù)實(shí)施期間和實(shí)施后可保持穩(wěn)定，室溫下至少可以穩(wěn)定60天。并且，通過(guò)添加抑制紫杉醇沉淀的組分，可以增加紫杉醇/超液化碘油組合物中紫杉醇的溶解度，而且該組合物可至少穩(wěn)定200天。
權(quán)利要求
1.化療栓塞用組合物，其包含油性造影劑和紫杉醇，而且，相對(duì)于1ml所述的油性造影劑，所述紫杉醇的含量為0.0001mg～10mg。
2.如權(quán)利要求1所述的化療栓塞用組合物，其中所述油性造影劑是選自由碘化罌粟種子油和碘化大豆油組成的組中的碘化油，所述碘化罌粟種子油包括超液化碘油和乙碘油。
3.如權(quán)利要求2所述的化療栓塞用組合物，其中所述油性造影劑是含碘量為30～50重量％的碘化油。
4.如權(quán)利要求3所述的化療栓塞用組合物，其中所述油性造影劑是含碘量為35～48重量％的碘化油。
5.如權(quán)利要求1所述的化療栓塞用組合物，其中所述油性造影劑是含碘量為35～48重量％的碘化罌粟種子油。
6.如權(quán)利要求1所述的化療栓塞用組合物，其中相對(duì)于1ml的所述油性造影劑，所述組合物還含有0.01～1ml的動(dòng)物油、植物油或它們的混合物。
7.如權(quán)利要求6所述的化療栓塞用組合物，其中所述動(dòng)物油是角鯊烯。
8.如權(quán)利要求6所述的化療栓塞用組合物，其中所述植物油是大豆油。
9.如權(quán)利要求1～8任一項(xiàng)所述的化療栓塞用組合物，在室溫時(shí)其粘度為40～180厘泊。
10.如權(quán)利要求9所述的化療栓塞用組合物，其是治療實(shí)體腫瘤的動(dòng)脈化療栓塞用組合物。
11.如權(quán)利要求10所述的化療栓塞用組合物，其中所述實(shí)體腫瘤是肝癌。
12.用于化療栓塞的油性的紫杉醇制劑的制造方法，所述方法包括如下步驟以每1ml油性造影劑混合0.0001mg～10mg紫杉醇的比例混合所述油性造影劑和紫杉醇，得到由紫杉醇和所述油性造影劑組成的混合物；以及攪拌所述混合物，使紫杉醇溶解。
13.如權(quán)利要求12所述的制造方法，其中在無(wú)菌條件下，將滅菌后的油性
14.如權(quán)利要求12所述的制造方法，其還包括將制造后的所述混合物用EO氣或γ射線滅菌的步驟。
15.如權(quán)利要求12所述的制造方法，其中，將所述混合物升溫到35～45℃的溫度以使紫杉醇溶解。
16.如權(quán)利要求12所述的制造方法，其中，通過(guò)對(duì)所述混合物進(jìn)行超聲處理以使紫杉醇溶解。
17.化療栓塞用組合物，其含有油性造影劑、紫杉醇和防止紫杉醇沉淀的使組合物可長(zhǎng)期保存的添加劑，相對(duì)于1ml油性造影劑，紫杉醇為0.0001～13mg，添加劑為0.01ml～1ml。
18.如權(quán)利要求17所述的化療栓塞用組合物，其中所述油性造影劑是選自由碘化罌粟種子油和碘化大豆油組成的組中的碘化油，所述碘化罌粟種子油包括超液化碘油和乙碘油。
19.如權(quán)利要求18所述的化療栓塞用組合物，其中所述油性造影劑是含碘量為30～50重量％的碘化油。
20.如權(quán)利要求19所述的化療栓塞用組合物，其中所述油性造影劑是含碘量為35～48重量％的碘化油。
21.如權(quán)利要求17所述的化療栓塞用組合物，其中所述油性造影劑是含碘量為35～48重量％的碘化罌粟種子油。
22.如權(quán)利要求17所述的化療栓塞用組合物，相對(duì)于1ml所述的油性造影劑，所述組合物還含有0.01～1ml的動(dòng)物油、植物油或它們的混合物。
23.如權(quán)利要求22所述的化療栓塞用組合物，其中所述動(dòng)物油是角鯊烯。
24.如權(quán)利要求22所述的化療栓塞用組合物，其中所述植物油是大豆油。
25.如權(quán)利要求17～24任一項(xiàng)所述的化療栓塞用組合物，在室溫時(shí)其粘度為40～180厘泊。
26.如權(quán)利要求25所述的化療栓塞用組合物，其是治療實(shí)體腫瘤的動(dòng)脈化療栓塞用組合物。
27.如權(quán)利要求26所述的化療栓塞用組合物，其中所述實(shí)體腫瘤是肝癌。
28.如權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述防止紫杉醇沉淀的添加劑是可與所述紫杉醇分子形成氫鍵的化學(xué)物質(zhì)，或是可干擾紫杉醇分子之間形成分子間氫鍵的促溶劑。
29.如權(quán)利要求28所述的組合物，其中所述可與所述紫杉醇分子形成氫鍵的化學(xué)物質(zhì)選自由醇，多元醇、油、脂質(zhì)、高分子和肽組成的組。
30.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述醇選自由甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇和脂肪醇組成的組。
31.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述多元醇選自乙二醇、丙二醇和聚乙二醇組成的組。
32.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述油選自甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯、生育酚和它們的混合物組成的組，所述的混合物是從動(dòng)物油或植物油中天然提取得到的油混合物。
33.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述脂質(zhì)選自磷脂、中性脂質(zhì)、陽(yáng)離子性脂質(zhì)、陰離子性脂質(zhì)和脂肪酸組成的組。
34.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述高分子選自聚乳酸、聚羥基乙酸以及它們的共聚物、殼聚糖、藻酸鹽、透明質(zhì)酸酯、糊精、聚ε-己內(nèi)酯組成的組。
35.如權(quán)利要求28所述的組合物，其中所述干擾紫杉醇分子之間形成分子間氫鍵的促溶劑選自由二甲亞砜和酰胺組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及使紫杉醇溶解在油性造影劑中的化療栓塞用紫杉醇的油性組合物、制劑及其制造方法。本發(fā)明的組合物增溶了紫杉醇，由于施用化療栓塞術(shù)時(shí)可使血管顯影，因而該組合物的優(yōu)點(diǎn)在于可通過(guò)化療栓塞術(shù)將抗癌劑輸送到靶細(xì)胞。本發(fā)明還涉及可長(zhǎng)期保存的紫杉醇的油性組合物、制劑及其制造方法，該組合物和制劑中包含了可防止紫杉醇沉淀的化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明的組合物有效增溶了紫杉醇，而且在施用化療栓塞術(shù)時(shí)可以顯影，因而可以在治療肝癌及其他實(shí)體腫瘤的動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(TACE)中使用。
文檔編號(hào)A61K47/44GK1555253SQ02817967
公開日2004年12月15日 申請(qǐng)日期2002年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月13日
發(fā)明者鄭蕙嬋, 鄭曙榮, 權(quán)翊贊, 樸榮澤, 李仁鉉, 樸在亨, 鄭鎮(zhèn)旭, 金盈萬(wàn) 申請(qǐng)人:韓國(guó)科學(xué)技術(shù)研究院, 大化制藥株式會(huì)社