專利名稱：角蛋白基產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及源于角蛋白的新產(chǎn)品。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及源于天然存在的角蛋白和角蛋白纖維來(lái)源，如家禽羽毛的產(chǎn)品。本發(fā)明還涉及制備這些角蛋白源產(chǎn)品的方法以及這些角蛋白源產(chǎn)品的用途。
背景技術(shù)：
羽毛是家禽工業(yè)的重要廢產(chǎn)物，每年全世界約產(chǎn)生4百萬(wàn)噸。盡管其少量用于例如服裝、保溫材料和寢具，以及較大量用于制造用以生產(chǎn)動(dòng)物飼料的羽毛粉，但是對(duì)于如此大量的羽毛而言，目前的(在經(jīng)濟(jì)上有利益的)應(yīng)用不足。出于環(huán)境原因，燃燒或掩埋羽毛并不總是實(shí)用的選擇；這些量的廢羽毛給諸如家禽工業(yè)的工業(yè)帶來(lái)了困難的處理問(wèn)題。
因此，本發(fā)明的一般目的是提供一系列在經(jīng)濟(jì)上可行的廢羽毛的用途，并且提供將廢羽毛用于這種用途的方法。
羽毛主要由稱作角蛋白的纖維狀蛋白質(zhì)材料組成。角蛋白是分子量約為10kDa的水不溶性且耐蛋白酶的蛋白質(zhì)。如圖1所示，圖1中以(A)表示的每個(gè)角蛋白分子由形成晶質(zhì)β-折疊的中央部(β)和兩個(gè)分別以(N)和(C)表示的隨機(jī)排列鏈端組成。在羽毛中，多個(gè)角蛋白的中央部(β)連接形成直徑約30埃的所謂的微原纖維(B)。鏈端(C)和(N)含有二硫鍵連接的二聚氨基酸(胱氨酸)形式的鏈間和鏈內(nèi)交聯(lián)(C)，并且形成微原纖維被包埋其中的無(wú)定形基質(zhì)。羽毛中蛋白質(zhì)的二硫鍵(C)和分子團(tuán)體使之不溶并且耐受大多數(shù)蛋白水解酶。
已經(jīng)有很多涉及角蛋白、角蛋白水解產(chǎn)物和源于角蛋白的產(chǎn)品，以及它們的制備及用途的現(xiàn)有技術(shù)。尤其是化妝品和紡織工業(yè)對(duì)用以設(shè)計(jì)和修飾頭發(fā)和羊毛的角蛋白源產(chǎn)品感興趣。含有水解角蛋白的洗發(fā)劑和指甲油就是利用角蛋白的現(xiàn)有技術(shù)配方的實(shí)例。即使這些應(yīng)用有很多，但它們基本上是主要使用水解角蛋白作為組分之一的產(chǎn)品配方。這些產(chǎn)品具有低附加價(jià)值并且只有有限的用途。
從本發(fā)明的發(fā)明人之一的該領(lǐng)域綜述論文(P.Schrooyen“Feather keratinsmodification and film formation”，1999，ThesisUniversity of Twente，Enschede，The Netherlands)清楚地看出，使用角蛋白作為膜或涂層中的聚合物的現(xiàn)有技術(shù)少得多。一般而言，根據(jù)這些文獻(xiàn)中所描述的方法，將不溶性角蛋白從它們的天然源提取出并且，例如在含水介質(zhì)中溶解。通常，這種提取/溶解至少涉及二硫鍵(C)的斷裂，這破壞微原纖維(B)，產(chǎn)生分離的角蛋白分子(A)。取決于所使用的條件，該提取/溶解還可能涉及角蛋白分子(A)自身的水解/降解，即形成角蛋白分子(A)的氨基酸之間的肽鍵的裂解。已經(jīng)報(bào)道通過(guò)下列方法實(shí)現(xiàn)二硫鍵的斷裂用有機(jī)過(guò)酸氧化二硫鍵形成磺酸基；二硫鍵亞硫酸鹽解形成S-磺酸鹽基；或者用諸如2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)或二硫赤蘚糖醇的硫醇化合物還原二硫鍵；或者用諸如硫化鈉溶液的堿金屬硫化物處理。一般而言，現(xiàn)有技術(shù)方法的目的是提供在含水介質(zhì)中可溶的角蛋白源產(chǎn)品，例如角蛋白或角蛋白水解產(chǎn)物的溶液。為此目的，現(xiàn)有技術(shù)描述了對(duì)斷裂的二硫鍵進(jìn)行修飾，從而避免該鍵的重新形成，和/或使用特定的添加劑以使角蛋白保留在溶液中或者來(lái)穩(wěn)定角蛋白溶液，如堿金屬氫氧化物、脲、鹽酸胍、2-巰基乙醇或巰基乙酸鹽。
例如，US-A-3464825描述了使用堿金屬硫化物溶液，如Na2S溶液從羽毛提取角蛋白的方法。然后用諸如Na2SO3的堿金屬亞硫酸鹽處理這樣獲得的角蛋白溶液，之后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酸沉淀。然后在堿水溶液中溶解該沉淀的角蛋白，隨后用水溶性氧化劑，例如過(guò)氧化氫、高碘酸鈉、亞氯酸鈉或諸如過(guò)乙酸或過(guò)甲酸的有機(jī)過(guò)酸進(jìn)行氧化，相信它們將胱氨酸/半胱氨酸殘基氧化成磺基丙氨酸基。但是，這樣獲得的角蛋白是基本上完全修飾的，即所有自由胱氨酸/半胱氨酸殘基均被氧化成磺基丙氨酸基。結(jié)果是，該完全修飾的角蛋白通常是水溶性的，因此不太適于提供水不溶性的膜，例如在涂層中應(yīng)用和其它本文下述的應(yīng)用。另外，F(xiàn)R2522657描述了基本上完全的修飾，例如角蛋白的至少70％的自由-SH基的修飾。
相反，US-A-3642498描述了使用硫化鈉溶解角蛋白的方法，其中胱氨酸/半胱氨酸基基本上保持未被修飾。然后使用堿金屬硫化物溶液來(lái)提取角蛋白，用堿金屬亞硫酸鹽溶液處理，接著進(jìn)行酸沉淀。描述所得蛋白質(zhì)產(chǎn)品在水-醇混合物中可分散，并且可以用于制備膜和涂層。US-A-3642498還描述了用以提取并溶解羽毛角蛋白的另一方法，包括用巰基乙醇-醇-水混合物處理；或者用含堿金屬氫氧化物的堿性巰基乙醇-醇-水混合物處理。但是，根據(jù)US-A-3642498，胱氨酸/半胱氨酸殘基基本上保持未被修飾。具有基本上未被修飾的胱氨酸/半胱氨酸殘基的溶解的角蛋白的主要缺點(diǎn)是它們不能產(chǎn)生具有所需機(jī)械性質(zhì)的角蛋白基產(chǎn)品，特別是膜和涂層。具體地說(shuō)，這些膜是脆性的。
至此提到的大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)回溯至二十世紀(jì)六十年代末期和二十世紀(jì)七十年代早期。然而，在自此的三十年中，這些文獻(xiàn)沒(méi)有導(dǎo)致本文所公開(kāi)的角蛋白基產(chǎn)品的任何廣泛用途。這可能是因?yàn)樗枋龅漠a(chǎn)品和方法在經(jīng)濟(jì)上是不可行的，盡管它們采用廢羽毛作為原料，和/或因?yàn)樗@得的角蛋白產(chǎn)品沒(méi)有表現(xiàn)出實(shí)際的(商業(yè))用途所需的性質(zhì)。
這些問(wèn)題中的一些在本發(fā)明的發(fā)明人之一的論文(P.Schrooyen；“Feather keratinsmodification and film formation”，1999，ThesisUniversity of Twente，Enschede，The Netherlands)中提出，該論文描述了在濃脲水溶液中并在2-巰基乙醇的存在下通過(guò)使用一碘乙酰胺、一碘乙酸或一溴琥珀酸部分修飾(即烷基化)完整羽毛角蛋白而獲得的角蛋白源產(chǎn)品。以殘留自由-SH基的量來(lái)計(jì)算，將角蛋白修飾至25-87％的修飾度。這種部分修飾提供基本上完整(即未水解)的部分修飾的角蛋白的穩(wěn)定分散體，它能夠用于澆鑄具有所需熱和機(jī)械性質(zhì)的堅(jiān)固膜。但是，用于部分修飾的基本上完整的角蛋白的提取和溶解需要使用高濃度的化學(xué)藥品，如脲和2-巰基乙醇。在試驗(yàn)規(guī)模使用這些化學(xué)藥品是可接受的。但是，它們的大規(guī)模使用在經(jīng)濟(jì)上是不可行的，因?yàn)槭褂眠@些化學(xué)藥品是昂貴的，同時(shí)從與使用這些化學(xué)藥品相關(guān)的環(huán)境和職業(yè)危險(xiǎn)來(lái)看，需要昂貴的預(yù)防措施。
因此，仍然需要在經(jīng)濟(jì)上可行的方法來(lái)加工諸如羽毛的含角蛋白的(廢)材料，該方法可以用來(lái)提供一系列具有實(shí)際/商業(yè)應(yīng)用可接受的性質(zhì)的角蛋白基產(chǎn)品，特別是膜和涂層。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)一種方法獲得改善的角蛋白基產(chǎn)品，該方法涉及通常通過(guò)水解進(jìn)行的角蛋白分子的部分降解和自由-SH基，即得自二硫鍵(C)的裂解的自由-SH基的部分修飾的組合。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供這種部分降解且部分修飾的產(chǎn)品，該產(chǎn)品在水中可分散，并且可以在一系列應(yīng)用中使用，包括但不限于在下文中討論的應(yīng)用。這些水分散性的部分降解且部分修飾的角蛋白基產(chǎn)品在本領(lǐng)域中還沒(méi)有被描述過(guò)。
因此，在第一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)部分修飾且部分降解的角蛋白的方法。該方法包括以下步驟(a)在堿性pH下，在水溶液中，使用還原劑從含角蛋白纖維的原料溶解角蛋白；及(b)部分修飾該溶解的角蛋白的-SH基。優(yōu)選地，步驟(a)和/或(b)的條件使得該溶解的角蛋白被部分水解或部分降解至下文進(jìn)一步說(shuō)明的程度。任選地，可以使用另外的步驟(c)來(lái)將角蛋白水解至所需的程度。
對(duì)于含角蛋白纖維的原料，可以使用角蛋白纖維的任何適當(dāng)來(lái)源。具體地說(shuō)，可以使用角蛋白纖維的天然來(lái)源，例如毛發(fā)、羽毛、蹄、指甲、角等。優(yōu)選地，使用至少含有β-角蛋白的角蛋白纖維源。羽毛是尤其優(yōu)選的原料，特別是雞、火雞、鴨、鵝或其它家禽的羽毛，例如從家禽工業(yè)作為廢產(chǎn)物獲得的。這些角蛋白纖維源可能含有少量的其它蛋白質(zhì)和/或諸如脂肪或血的其它成分，例如通常小于總重量(基于干羽毛)的5％的量。一般而言，它們的存在是容許的，否則，可以在溶解步驟(a)之前將一些或所有這些非角蛋白成分除去。含角蛋白纖維的原料優(yōu)選接受一種或多種預(yù)處理，例如清洗、洗滌、分選、脫脂、切割、磨粉、研磨、干燥或它們的任何組合。這種預(yù)處理可以方便原料的處理，它可以改善諸如角蛋白的溶解的進(jìn)一步加工步驟的效率，和/或它可以改善最終角蛋白基產(chǎn)品的質(zhì)量?；蛘撸梢允褂靡呀?jīng)預(yù)處理的含角蛋白的原料，如羽毛粉；以及已經(jīng)分離的角蛋白或角蛋白纖維(但是出于經(jīng)濟(jì)原因這通常不太優(yōu)選)。在溶解步驟a)中直接使用角蛋白或角蛋白纖維的天然來(lái)源，例如羽毛，而沒(méi)有進(jìn)一步的預(yù)處理也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
用于在堿性pH下溶解的還原劑可以選自硫化物、硫醇、硼氫化物和膦，或它們的組合。優(yōu)選的硫化物是堿金屬硫化物，如硫化鈉。在更低的堿性pH下，例如在低于10、9.5或9.0的pH下，硫化銨也可以用作溶解的還原劑，其使用能在終產(chǎn)品中避免鹽殘留。優(yōu)選的硫醇是二硫蘇糖醇、2-巰基乙醇和巰基乙酸鹽，并且優(yōu)選的膦是三正丁基膦。
優(yōu)選地選擇溶解的條件，即含角蛋白纖維的原料、還原劑和緩沖劑的濃度，以及pH、溫度和溶解時(shí)間，從而獲得溶解的角蛋白的滿意的收率，優(yōu)選含角蛋白纖維的原料中的至少10、20、30、40、50或60％的角蛋白被溶解。進(jìn)一步優(yōu)選地選擇溶解條件，從而使溶解的角蛋白被部分水解或部分降解至下文進(jìn)一步說(shuō)明的程度。
優(yōu)選地，每升(含水)溶解介質(zhì)溶解至少10克含角蛋白纖維的原料，并且每升(含水)溶解介質(zhì)優(yōu)選溶解不超過(guò)100克含角蛋白纖維的原料。通常每升(含水)溶解介質(zhì)溶解20-60克含角蛋白纖維的原料。
(含水)溶解介質(zhì)中的還原劑，例如堿金屬硫化物或硫化銨的濃度優(yōu)選在0.05M至1.0M之間。或者，使用2-巰基乙醇和氫氧化鈉的組合以0.1M至1.5M濃度的2-巰基乙醇和0.1-1.0N的氫氧化鈉組合使用。
溶解角蛋白的pH是堿性的，即高于pH7.0。但是優(yōu)選地，溶解在至少pH8.0、8.5、9.0、9.5的堿性pH下進(jìn)行，但是更優(yōu)選pH至少為或高于pH10.0、10.5、11.0、11.5、12.0或12.5，因?yàn)樵谥辽贋榛蚋哂趐H10.0的pH下，硫化物的解離平衡向S2-移動(dòng)，S2-是比HS-更強(qiáng)的還原劑。優(yōu)選pH不高于13.5。
角蛋白溶解的溫度優(yōu)選至少為20℃。但是，優(yōu)選使用更高的溫度來(lái)溶解，如優(yōu)選至少為30、40、50、60、70或80℃的溫度，但優(yōu)選不高于100℃。
首先選擇角蛋白溶解步驟的時(shí)間，從而在給定的溶解條件下獲得溶解的角蛋白的所需水解程度。通常溶解將花費(fèi)10分鐘至24小時(shí)?？梢詾槿芙馐章识M(jìn)一步優(yōu)化角蛋白溶解的時(shí)間。因此，為了獲得至少所需的角蛋白水解程度和優(yōu)選地獲得溶解的角蛋白的最高收率，技術(shù)人員將以經(jīng)驗(yàn)為依據(jù)優(yōu)化角蛋白溶解的整套條件。
除了角蛋白的溶解外，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括部分修飾角蛋白中存在的-SH基的步驟。通常，這些-SH基將是來(lái)自角蛋白分子中的分子內(nèi)和分子間二硫鍵(C)的裂解的自由-SH基，裂解可以在來(lái)自含角蛋白纖維的原料的角蛋白的還原條件下在溶解期間發(fā)生。因此，一般而言，自由的-SH基將是半胱氨酸殘基。自由-SH基的部分修飾通常涉及-SH基化學(xué)轉(zhuǎn)化為另一種基團(tuán)，例如包括但不限于一種或多種下文所述的官能團(tuán)的官能團(tuán)。修飾的一個(gè)目的是其阻止修飾的-SH基在溶解的角蛋白分子之間(重新)形成分子內(nèi)和分子間二硫鍵，從而避免或者至少降低不溶性角蛋白聚集體的形成。另一方面，-SH基的部分修飾意味著殘留的自由半胱氨酸殘基可以進(jìn)一步反應(yīng)，例如(重新)形成二硫鍵，用以交聯(lián)和/或聚合，這些反應(yīng)可以用來(lái)賦予終產(chǎn)品所需的性質(zhì)，如機(jī)械強(qiáng)度和/或耐化學(xué)或物理影響。與基本上完全修飾相比，部分修飾的一些進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)包括這樣獲得的角蛋白(更)適于提供水不溶性膜，例如用于涂層應(yīng)用和用于下文所述的其它應(yīng)用。相比而言，完全修飾的角蛋白，如在上述US-A-3464825中所述的那些，通常是水溶性的。溶解的角蛋白的自由-SH基的部分修飾可以以本領(lǐng)域公知的許多方式來(lái)實(shí)現(xiàn)，這主要取決于所用的官能團(tuán)。通過(guò)非限制性實(shí)施例，一些適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)和用于部分轉(zhuǎn)化自由-SH基的條件將在下文中描述。
在本發(fā)明的方法中，溶解的角蛋白的部分修飾優(yōu)選使得該溶解的角蛋白中的全部自由-SH基的至少10％，優(yōu)選至少20％，更優(yōu)選至少30％，并且最優(yōu)選至少40％被修飾，并且同時(shí)使得該溶解的角蛋白中的少于全部自由-SH基的70％，優(yōu)選不超過(guò)65％，更優(yōu)選不超過(guò)60％，并且最優(yōu)選不超過(guò)57％被修飾。最優(yōu)選該溶解的角蛋白中的全部自由-SH基的修飾度約為50％，即在44-56％之間。該角蛋白中的其余-SH基將不被修飾，因此仍原樣存在于所得的部分修飾的產(chǎn)品中，或者以重新形成的二硫鍵存在(認(rèn)為這等價(jià)于兩個(gè)自由的-SH基，例如對(duì)于如下所述為了計(jì)算修飾度而言)。
修飾度可以通過(guò)適當(dāng)選擇修飾反應(yīng)的條件來(lái)控制，包括但不限于所用的官能化試劑、反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH、所用的溶劑、各反應(yīng)物的濃度以及角蛋白材料的濃度?？梢韵胂螽a(chǎn)生具有所需修飾度的終產(chǎn)品的具體條件的選擇可能需要一些初步實(shí)驗(yàn)和/或某種程度的反復(fù)試驗(yàn)。但是，基于本文的公開(kāi)，這將在技術(shù)人員容易達(dá)到的范圍內(nèi)，并且因此被認(rèn)為包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
修飾以本領(lǐng)域公知的方式進(jìn)行，該方式取決于用來(lái)修飾-SH基的一種或多種基團(tuán)，以及這種修飾是否與任何進(jìn)一步的加工步驟，例如溶解組合。適當(dāng)?shù)臈l件可能包括水或含水介質(zhì)的使用，官能化試劑的濃度為0.01M至1M，pH為7.0-10.0，溫度為4℃至20℃，時(shí)間為10分鐘至24小時(shí)，溶解的角蛋白的濃度為每100毫升含水解介質(zhì)2克至10克。在約50％的修飾度下，用一氯乙酸修飾的條件是，例如，在8.5-9.5的pH下，在10-20℃的溫度下，用0.5-5克一氯乙酸，在1升體積中將10-30克溶解的角蛋白保溫30-90分鐘。
修飾度可以通過(guò)比較修飾后殘留的自由-SH基的量(包括存在的二硫鍵的量)和修飾前的自由-SH基(包括二硫鍵)的量來(lái)確定，其中角蛋白制劑中自由-SH基/二硫鍵的量可以使用適當(dāng)?shù)臏y(cè)定法來(lái)確定，如Schrooyen等描述的DTNB/NTSB測(cè)定法(Joumal of Agricultural andFood Chemistry；2000；48(9)；4326-4334)?；蛘撸部梢员容^修飾后殘留的自由-SH基/二硫鍵的量和角蛋白中-SH基/二硫鍵的量的理論值。天然角蛋白中-SH基/二硫鍵的理論量(以存在的胱氨酸/半胱氨酸殘基的量計(jì))約為每克角蛋白700微摩爾半胱氨酸基(胱氨酸基的量為該量的一半)。
可以用任何所需的適于-SH基的官能化和/或角蛋白的官能化的官能團(tuán)修飾-SH基；或者用兩種或多種這些基團(tuán)的適當(dāng)組合修飾-SH基。所選擇的具體官能團(tuán)和它們各自的量通常將取決于終產(chǎn)品的所需性質(zhì)。
因此，本發(fā)明的角蛋白可以具有一個(gè)或多個(gè)帶負(fù)電的官能團(tuán)、一個(gè)或多個(gè)帶正電的官能團(tuán)，和/或一個(gè)或多個(gè)中性官能團(tuán)，或者它們的適當(dāng)組合。在這方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚帶“正”和/或“負(fù)”電荷的基團(tuán)可以分別與適當(dāng)?shù)姆春呻x子，即陰離子(基團(tuán))或陽(yáng)離子(基團(tuán))締合。還將清楚由本文所述的帶“正”或“負(fù)”電荷的官能團(tuán)所帶的實(shí)際電荷還可能取決于角蛋白存在/維持的條件，如pH、溶劑等。但是，一般而言，在6.0-8.0范圍內(nèi)的pH下，帶“正”電荷的基團(tuán)將具有凈正電荷，帶“負(fù)”電荷的基團(tuán)將具有凈負(fù)電荷，而“中性”基團(tuán)將具有基本上為零的凈電荷。
優(yōu)選地，使用至少含有允許該有機(jī)化合物與-SH基反應(yīng)的基團(tuán)或殘基的一種或多種飽和或不飽和有機(jī)化合物來(lái)引入所描述的官能團(tuán)。這些可以包括但不限于適當(dāng)?shù)碾x去基團(tuán)，如鹵素(氯、溴或碘)、環(huán)氧化物-或縮水甘油基，或諸如(甲基)丙烯?；?、乙烯基的不飽和基團(tuán)；而其它適當(dāng)?shù)幕鶊F(tuán)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是清楚的。除了可以與自由-SH基反應(yīng)的基團(tuán)外，這些有機(jī)化合物還可以含有一種或多種可以提供負(fù)電荷的其它基團(tuán)，如-COOH基；或者可以提供正電荷的基團(tuán)，如季銨基，包括但不限于烷基化的氨基。因此，舉例來(lái)說(shuō)，可以用帶負(fù)電的基團(tuán)，例如可以使用如下物質(zhì)引入的基團(tuán)來(lái)修飾角蛋白—鹵代酸，如氯乙酸、碘乙酸和溴乙酸；—過(guò)氧化物，如過(guò)氧化氫或有機(jī)過(guò)氧化物，包括但不限于用來(lái)形成磺酸鹽基的過(guò)甲酸或過(guò)乙酸；—含有帶負(fù)電荷的基團(tuán)的不飽和有機(jī)化合物，如含有-COOH基的乙烯基化合物；—縮水甘油基化合物；
或者它們的任何適當(dāng)組合。
通常，用這些帶負(fù)電的基團(tuán)部分修飾部分水解的角蛋白將增強(qiáng)角蛋白的可分散性。
舉例來(lái)說(shuō)，可以使用下列物質(zhì)引入帶正電的官能團(tuán)—鹵代有機(jī)胺，如鹵代烷基胺；—帶胺基的縮水甘油基化合物，如縮水甘油基三甲基氯化銨；或者它們的適當(dāng)組合。
舉例來(lái)說(shuō)，可以使用下列物質(zhì)引入中性官能團(tuán)—鹵代有機(jī)化合物，如鹵代烷和鹵代醚、酯或酰胺；—縮水甘油基化合物，如烷基縮水甘油基化合物；—乙烯基化合物，如烷基乙烯基化合物；或者它們的適當(dāng)組合。
其它適當(dāng)?shù)墓倌芑衔?，舉例來(lái)說(shuō)，在FR 2 522 657中有描述。還可以使用諸如亞硫酸鈉或偏亞硫酸氫鈉的亞硫酸鹽修飾角蛋白，形成S-磺酸鹽基，或者使用其它無(wú)機(jī)化合物修飾角蛋白。
可以例如通過(guò)向溶解混合物中添加官能化試劑而方便地將修飾步驟與溶解步驟組合。在溶解和修飾后，角蛋白源產(chǎn)品可能已經(jīng)適于其設(shè)計(jì)的最終用途，并且因此，舉例來(lái)說(shuō)，可以被銷售或者就這樣提供給最終消費(fèi)者。
在本發(fā)明的方法中，溶解和/或修飾的條件優(yōu)選使溶解的角蛋白被部分水解或部分降解。部分水解，也稱作部分“降解”，通常包括形成角蛋白分子的氨基酸之間(部分)肽鍵的裂解。部分水解可以在溶解和/或修飾期間實(shí)現(xiàn)。但是，如果溶解和/或修飾不產(chǎn)生溶解的角蛋白的所需程度的部分水解，可以通過(guò)本領(lǐng)域任何公知的方式實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的水解或降解，所述方式包括，例如化學(xué)水解、物理水解和/或酶水解。
溶解的角蛋白的水解程度使從溶解且部分水解的角蛋白生產(chǎn)的角蛋白基產(chǎn)品具有所需的物理和化學(xué)性質(zhì)。例如，從溶解且部分水解的角蛋白生產(chǎn)的膜或涂層優(yōu)選具有高于15MPa，更優(yōu)選高于16、17、18或20MPa的拉伸強(qiáng)度。該膜還優(yōu)選具有至少100Mpa，更優(yōu)選高于150、200、250或300Mpa的E-模量。該膜還優(yōu)選具有至少10％，更優(yōu)選高于20、30、40或50％的斷裂伸長(zhǎng)率?？梢援a(chǎn)生具有這些物理化學(xué)性質(zhì)的角蛋白基產(chǎn)品的溶解的角蛋白的水解程度可以通過(guò)在本發(fā)明的方法中所得的溶解且部分水解的角蛋白的分子量分布來(lái)定義。因此，該溶解且部分水解的角蛋白的分子量分布可以定義如下—該溶解且部分水解的角蛋白基本上具有1至10.4kDa之間的分子量，特別是3至10.4kDa之間，其中基本上被理解成意指在該部分水解的角蛋白部分中存在的所有角蛋白分子的至少50％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，最優(yōu)選至少99％具有所示范圍內(nèi)的分子量；—優(yōu)選地，至少1％的該溶解的角蛋白具有小于10kDa的分子量。另外，優(yōu)選至少50％的該溶解的角蛋白具有大于5kDa的分子量。更優(yōu)選地，至少3、5、7、10或15％的該溶解的角蛋白具有小于10kDa的分子量，其中至少60、70、80、90或95％的該溶解的角蛋白具有大于5kDa的分子量；和/或—該溶解且部分水解的角蛋白優(yōu)選具有基本上與如下獲得的溶解的角蛋白的分子量分布相同的分子量分布在40-80℃的溫度下，將40克清潔且干燥的家禽羽毛在pH為pH10.0至pH13.5之間的1升0.05-0.5M硫化鈉水溶液中溶解30-90分鐘。然后，優(yōu)選通過(guò)過(guò)濾分離該溶解的角蛋白和未溶解的原料。更優(yōu)選地，該分子量分布基本上與如下獲得的角蛋白的分子量分布相同在55-65℃的溫度下，將40克清潔且干燥的家禽羽毛在pH為pH11.0至pH13.0之間的1升0.075-0.15M硫化鈉水溶液中溶解45-75分鐘。最優(yōu)選地，該分子量分布基本上與如下獲得的角蛋白的分子量分布相同在60℃的溫度下，將40克清潔且干燥的家禽羽毛在pH12.5的1升0.1M硫化鈉水溶液中溶解45-75分鐘。
—該溶解且部分水解的角蛋白優(yōu)選具有這樣的分子量，其使該溶解的角蛋白的1％(w/v)溶液在25℃下具有1mPa·s至100mPa·s，優(yōu)選1mPa·s至100mPa·s之間的粘度。舉例來(lái)說(shuō)，可以在烏伯婁德粘度計(jì)中測(cè)量粘度。
—該溶解且部分水解的角蛋白優(yōu)選具有這樣的分子量分布，其使該溶解的角蛋白在水中的可分散性為1％至50％，優(yōu)選為10％至30％。本文中角蛋白的可分散性定義為，角蛋白能夠形成在制備24小時(shí)內(nèi)幾乎沒(méi)有或沒(méi)有沉淀的穩(wěn)定分散體。
可以通過(guò)適當(dāng)?shù)剡x擇水解反應(yīng)的條件來(lái)控制水解程度，所述條件包括但不限于所用的反應(yīng)物(如用于化學(xué)降解)、所用的力/設(shè)備(如用于物理降解)、所用的酶(如用于酶降解)、水解時(shí)間、溫度、pH、所用的溶劑、各反應(yīng)物的濃度、角蛋白材料的濃度、提供角蛋白材料的方式(如在本文下述的適當(dāng)預(yù)處理之后)、所用的任何攪拌或振蕩，和/或水解是否在溶解、修飾期間進(jìn)行和/或單獨(dú)進(jìn)行?？梢韵胂?，選擇提供所需水解程度并且因而與部分修飾和任何進(jìn)一步加工結(jié)合而產(chǎn)生具有諸如下述性質(zhì)的所需性質(zhì)的終產(chǎn)品可能需要一些初步實(shí)驗(yàn)和/或某種程度的反復(fù)試驗(yàn)。但是基于本文的公開(kāi)，這將在本領(lǐng)域技術(shù)人員容易達(dá)到的范圍內(nèi)，并且因此應(yīng)認(rèn)為其涵蓋于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
另外-或任選地-可以以幾種方式確定水解程度，包括例如通過(guò)例如尺寸排阻色譜法分析水解部分的分子量或其分布；測(cè)定制劑的粘度；測(cè)定制劑的可分散性；測(cè)定蛋白端基量；或者它們與其他適當(dāng)技術(shù)的任意組合。
取決于所使用的條件，作為部分水解的結(jié)果，可能直接獲得分子量基本上在上述范圍內(nèi)的部分水解的角蛋白的部分或制劑。但是，以下內(nèi)容也在本發(fā)明的范圍內(nèi)為了獲得這樣的部分或制劑，例如，作為水解和/或修飾后的任何進(jìn)一步加工的部分，可以從該水解的部分或制劑中除去仍存在的一定量的-達(dá)到約基本上全部的-更高分子量成分(如任何殘余且未溶解的原料)和/或一定量的-達(dá)到約基本上全部的-在水解反應(yīng)期間形成的更低分子量的降解產(chǎn)物。
另外，根據(jù)本發(fā)明，該溶解的角蛋白可能形成，例如分子量在上述范圍之上的聚集體。這種聚集以及所得的聚集體都在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要形成這些聚集體的角蛋白源分子具有基本上在所述范圍內(nèi)的分子量。
此外，該角蛋白源產(chǎn)品可能發(fā)生一定程度的聚合(例如在部分水解、部分修飾和/或進(jìn)一步加工之后)，其中又可能形成分子量在上述范圍之上的產(chǎn)品。這種聚合以及所獲得的聚合產(chǎn)物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，同樣條件是結(jié)合形成這些聚合結(jié)構(gòu)的角蛋白源分子的分子量基本上在上述范圍內(nèi)。
與現(xiàn)有技術(shù)中基本上完整的角蛋白相比，本發(fā)明的部分水解/修飾的角蛋白可以有利地用于特別是那些需要角蛋白具有更疏水特性和/或更低表面張力的應(yīng)用。當(dāng)將本發(fā)明的部分水解的角蛋白應(yīng)用于膜或涂層時(shí)，這可能是有利的。與基本上完整的角蛋白相比，本發(fā)明的部分水解的角蛋白還具有改善的粘著性。這些粘著性可以，例如有利地用于將紙粘到玻璃上，如可以用于將標(biāo)簽固定到(啤酒)瓶上。與現(xiàn)有技術(shù)中的基本上完整的角蛋白相比，本發(fā)明的部分水解的角蛋白具有改善的乳化性質(zhì)，因?yàn)樵摬糠炙獾慕堑鞍资歉觾捎H的。使用部分水解且部分修飾的角蛋白的進(jìn)一步的益處在于部分水解的蛋白的潛在增加的抗菌作用。這由乳清蛋白乳鐵蛋白的水解產(chǎn)物，lactoferricin表現(xiàn)出。通過(guò)部分修飾，仍可以通過(guò)二硫鍵形成將具有增加的抗菌作用的角蛋白肽引入機(jī)械強(qiáng)度良好的膜中，產(chǎn)生新一代抗菌涂層。
在本發(fā)明的另一任選的方面，溶解且部分水解的角蛋白可以接受進(jìn)一步的加工步驟，例如可以包括—進(jìn)一步的純化，例如從所得角蛋白產(chǎn)品中除去不需要的組分和/或物質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，它們可以包括殘留的角蛋白原料、更高分子量的角蛋白組分、更低分子量的角蛋白組分、反應(yīng)物和/或來(lái)自任何加工步驟的副產(chǎn)物，和/或其它雜質(zhì)或不需要的組分。用以除去這些組分或物質(zhì)的適當(dāng)技術(shù)包括例如洗滌、沉淀、滲析、過(guò)濾和離心；—角蛋白源產(chǎn)品，和/或其任何特定部分的分離。舉例來(lái)說(shuō)，這可以使用諸如沉淀、膜分離、色譜技術(shù)和溶劑萃取來(lái)實(shí)現(xiàn)；—干燥，包括例如冷凍干燥、噴霧干燥、多級(jí)干燥和使用滾筒干燥；—在所需溶劑或溶劑混合物中分散；—聚集或者甚至聚合；或者它們的任何適當(dāng)組合。
另外，根據(jù)所設(shè)計(jì)的用途，該角蛋白產(chǎn)品可以與一種或多種其它物質(zhì)、添加劑、組分等組合或混合。它們的一些非限制性實(shí)例包括顏料、鹽、抗菌劑、洗滌劑和增塑劑。
將清楚，這種進(jìn)一步的加工和/或其它組分的添加也可以由最終用戶進(jìn)行；并且這也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的另一方面涉及包含由或可由上述本發(fā)明的方法所獲得的角蛋白的組合物。這些組合物中的角蛋白的特征在于(a)其-SH基被部分修飾，優(yōu)選該角蛋白的至少10％且不超過(guò)70％的-SH基被修飾；和(b)其被部分水解，使得該組合物中的角蛋白具有文本上述的分子量分布。
在另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了包含角蛋白的組合物，該組合物可由(或由)至少包括下列步驟的方法獲得(a)在40-80℃的溫度下，將來(lái)自含角蛋白纖維的原料的角蛋白在pH為pH10.0至pH13.5的0.05-0.5M硫化鈉水溶液中溶解30-90分鐘；和(b)修飾該溶解的角蛋白的10-70％的-SH基，優(yōu)選通過(guò)烷基化進(jìn)行修飾。
一般而言，本發(fā)明的產(chǎn)品可以描述為角蛋白的(例如角蛋白基或角蛋白源)產(chǎn)品或制劑或組合物，其中部分水解且部分修飾的角蛋白分子形成主要組分，例如占該產(chǎn)品、制劑或組合物的總組分的至少50重量％，優(yōu)選至少80、90、95或99重量％。優(yōu)選該部分水解且部分修飾的角蛋白分子形成該產(chǎn)品、制劑或組合物的總蛋白的至少50重量％，優(yōu)選至少80、90、95或99重量％。因此，不排除本發(fā)明的蛋白質(zhì)產(chǎn)品可能含有一些其它組分，如其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)成分(例如水解和/或修飾的蛋白質(zhì))、未水解的角蛋白、(更)低分子量的水解產(chǎn)物，以及非蛋白組分，如表面活性劑、鹽和/或諸如灰塵的雜質(zhì)。但是，它們僅以少量存在，例如少于50重量％，優(yōu)選少于20重量％，更優(yōu)選少于10重量％，更優(yōu)選少于5重量％。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物中至少50、60、70、80或90％的角蛋白分子至少包含一個(gè)疏水部分或區(qū)，以及至少一個(gè)，且優(yōu)選兩個(gè)親水部分或區(qū)，如下面進(jìn)一步描述的。例如，這些角蛋白分子可以包含總共10-100個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選30-100個(gè)氨基酸殘基；其中疏水部分或區(qū)包含20-40個(gè)氨基酸殘基，其余氨基酸殘基構(gòu)成一個(gè)或多個(gè)親水部分或區(qū)。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，該組合物中的角蛋白被水解至一定程度，使得所得部分水解的角蛋白分子(仍)含有至少一個(gè)疏水部分或區(qū)-例如衍生自原角蛋白分子的原中央部(β)-以及至少一個(gè)親水部分或區(qū)，例如衍生自原鏈端(C)和/或(N)之一?？梢哉J(rèn)為這種部分水解的角蛋白分子具有“A-B”的示意結(jié)構(gòu)，其中A代表通常為5-30個(gè)氨基酸殘基的親水部分或區(qū)；而B(niǎo)代表通常為5-40個(gè)氨基酸殘基的疏水部分或區(qū)。更優(yōu)選地，在本發(fā)明中，角蛋白被水解至一定程度，使得所得部分水解的角蛋白分子(仍)含有至少一個(gè)疏水部分或區(qū)-例如衍生自原角蛋白分子的原中央部(β)的疏水部分或區(qū)-親水部分或區(qū)，例如衍生自原鏈端(C)的親水部分或區(qū)和衍生自原鏈端(N)的親水部分或區(qū)位于所述疏水部分或區(qū)的兩側(cè)。在該優(yōu)選的方面，認(rèn)為部分水解的角蛋白分子具有“A-B-A”的示意結(jié)構(gòu)，其中A’代表親水部分或區(qū)(例如如上定義的)，而B(niǎo)代表疏水部分或區(qū)(同樣例如如上定義的)。
因?yàn)檫@種優(yōu)選的結(jié)構(gòu)A-B或者更優(yōu)選的結(jié)構(gòu)A-B-A，本發(fā)明的部分水解的角蛋白可以有利地用于制備或提供多相系統(tǒng)，如分散體、乳濁液、凝膠、膠束、微球以及層或分層結(jié)構(gòu)(包括但不限于單層或雙層)。另外，本發(fā)明的部分水解的角蛋白可以用作穩(wěn)定劑、乳化劑或更通常地用于可以是含水或有機(jī)系統(tǒng)的這樣的多相系統(tǒng)的配方試劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚，本領(lǐng)域中描述的水溶性角蛋白或角蛋白制劑，包括但不限于(更)完全水解的制劑，通常將不適于這些應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的組合物將通常是部分修飾且部分水解的角蛋白的水溶液或分散體的形式。這些溶液或分散體將優(yōu)選含有每升至少10、20或40克角蛋白，優(yōu)選每升不超過(guò)60、75或90克角蛋白。一般而言，這些溶液或分散體將含有每升約50克角蛋白。優(yōu)選地，這些溶液或分散體在化學(xué)和物理意義上都是穩(wěn)定的。因此，在化學(xué)意義上說(shuō)，優(yōu)選地在至少一天、一周或一個(gè)月的時(shí)間內(nèi)沒(méi)可感知的，即優(yōu)選少于10、5、1％的角蛋白(進(jìn)一步)降解、修飾和/或氧化發(fā)生。在物理意義上說(shuō)，優(yōu)選地在至少一天、一周或一個(gè)月的時(shí)間內(nèi)沒(méi)有可感知的，即優(yōu)選少于10、5、1％的角蛋白沉積或沉淀發(fā)生。為了穩(wěn)定本發(fā)明的溶液或分散體，可以應(yīng)用本領(lǐng)域公知的添加劑。對(duì)于長(zhǎng)期貯存或更方便的運(yùn)輸而言，本發(fā)明的組合物可以是固體形式，優(yōu)選是分散性的無(wú)粉塵粉末或顆粒的形式?？梢詰?yīng)用常用的干燥和/或粒化技術(shù)，包括使用添加劑來(lái)輔助固體形式的配方。
本發(fā)明的另一方面涉及使用本發(fā)明的部分修飾且部分水解的角蛋白作為角蛋白源來(lái)生產(chǎn)角蛋白基產(chǎn)品的方法。本發(fā)明的優(yōu)選的角蛋白基產(chǎn)品通過(guò)澆鑄本發(fā)明的角蛋白溶液或分散體來(lái)生產(chǎn)。
本發(fā)明的另一方面涉及從本發(fā)明的部分修飾且部分水解的角蛋白生產(chǎn)的角蛋白基產(chǎn)品。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該角蛋白基產(chǎn)品是從本發(fā)明的角蛋白溶液或分散體澆鑄的膜或涂層。優(yōu)選地，該膜或涂層具有高于15MPa的拉伸強(qiáng)度。該膜或涂層優(yōu)選具有高于100MPa的E模量，并優(yōu)選具有大于10％的斷裂伸長(zhǎng)率。
本發(fā)明的部分修飾且部分水解的角蛋白可以用于本領(lǐng)域公知的角蛋白基產(chǎn)品的任何應(yīng)用，包括例如那些在上文給出的現(xiàn)有技術(shù)中提到的應(yīng)用。一般而言，在這些應(yīng)用中，本發(fā)明的角蛋白源產(chǎn)品將提供有利的性質(zhì)，包括但不限于諸如機(jī)械穩(wěn)定性的改善的機(jī)械性質(zhì)、改善的物理和化學(xué)穩(wěn)定性、低水溶性和良好的成膜性。另外，因?yàn)楸景l(fā)明的角蛋白源產(chǎn)品是水分散性的，而不是水溶性的，所以還可以將其用于例如分散體、乳濁液、膠束、凝膠、微球或其它多相系統(tǒng)(的制備)中。因此，本發(fā)明的角蛋白的一些非限制性實(shí)例包括—用作或用于膜、涂層等，或者用于它們的制備；—用作或用于(可生物降解的)包裝材料，或者用于它們的生產(chǎn)；—用作或用于諸如控釋系統(tǒng)的配方；諸如除草劑、殺蟲(chóng)劑或其它抗微生物劑的農(nóng)業(yè)化學(xué)藥品；調(diào)味料；香料等；所述控釋系統(tǒng)用于諸如藥物的活性物質(zhì)；—用作或用于乳濁液、分散體或其它多相含水系統(tǒng)的配方；—用作或用于填料、膠凝劑、粘合劑、填充劑、成粒劑、脫模劑、基質(zhì)材料、乳化劑、穩(wěn)定劑或其他配方試劑；—用作抗氧化劑；—用作抗微生物劑。
因此，舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的角蛋白通?？梢杂糜谑称坊蛘呤称芳夹g(shù)領(lǐng)域；藥物和獸醫(yī)產(chǎn)品；化妝品；農(nóng)業(yè)化學(xué)藥品領(lǐng)域；粘合劑；油漆或其它涂料；包裝材料；諸如洗滌劑的清潔試劑；農(nóng)業(yè)。本發(fā)明的角蛋白的可以想象的一些具體用途包括但不限于—用作顆粒、粉末，如洗衣粉或其它洗滌劑的涂層或粘結(jié)劑；—用于常規(guī)目的的粘合劑，用于工業(yè)及家庭使用；—用于木材、紙張、紙板或模制纖維(moulded fibre)的粘結(jié)劑或粘合劑；—在涂料-包括但不限于水致涂料系統(tǒng)-和/或墨水/墨汁系統(tǒng)中用作粘結(jié)劑；用于工業(yè)及家庭使用；—用作抗氧化劑；—用于封裝和/或涂布技術(shù)；—用作例如動(dòng)物飼料和化妝品中的抗菌劑。


圖1(A)角蛋白分子，(B)由聚合的角蛋白單元組成的微原纖維，和(C)微原纖維中分子內(nèi)和分子間二硫鍵的圖示。
圖2三種不同修飾的角蛋白制劑的摩爾質(zhì)量對(duì)尺寸排阻色譜中洗脫體積的曲線。
圖3未修飾的角蛋白在不同溶液中的溶解性(1)水，(2)50mMTris-緩沖液pH8.0，(3)pH8.5的8M脲，及(4)每升補(bǔ)加2.5克二硫蘇糖醇(DTT)的pH8.5的8M脲。
圖450％修飾的角蛋白在不同溶液中的溶解性(1)水，(2)50mM Tris-緩沖液pH8.0，(3)pH8.5的8M脲，及(4)每升補(bǔ)加2.5克二硫蘇糖醇(DTT)的pH8.5的8M脲。
圖590％修飾的角蛋白在不同溶液中的溶解性(1)水，(2)50mM Tris-緩沖液pH8.0，(3)pH8.5的8M脲，及(4)每升補(bǔ)加2.5克二硫蘇糖醇(DTT)的pH8.5的8M脲。
實(shí)施例實(shí)施例1部分降解和沒(méi)有部分降解的部分修飾的分散性角蛋白的制備在一個(gè)比較實(shí)驗(yàn)中，使用Schrooyen等描述的程序(Journal ofAgricultural and Food Chemistry；2000；48(9)；4326-4334)。使用水和洗滌劑清洗家禽羽毛。將清潔且干燥的羽毛(40克)與1升2-巰基乙醇(125mM)、脲(8M)和EDTA(3mM)在Tris-緩沖液(0.2M，pH9.0)中的水溶液混合，并攪拌1小時(shí)。使用粗濾布和Whatman 54濾器(孔徑10微米)分離未溶解的羽毛和溶解的角蛋白。過(guò)濾后，向?yàn)V液中加入2克一氯乙酸，并且將pH在9.0保持恒定。1小時(shí)后，對(duì)該水溶液進(jìn)行滲析并冷凍干燥?；?00％角蛋白原料(羽毛的重量)，干角蛋白產(chǎn)品的收率是45％。該產(chǎn)品將被稱作修飾的角蛋白-方法1。
在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用改進(jìn)的方法，方法2。與方法1相比，方法2在下列方面不同1)未使用脲；2)pH更堿性(12.5而非9.0)；3)使用更高的溫度(60℃而非20℃)。
這些條件導(dǎo)致角蛋白蛋白質(zhì)通過(guò)水解而部分降解。將清潔且干燥的羽毛(40克)與1升熱的Na2S水溶液(0.1M，pH12.5，60℃)混合并攪拌1小時(shí)。使用粗濾布和Whatman 54濾器(孔徑10微米)分離未溶解的羽毛和溶解的角蛋白。冷卻至20℃后，向?yàn)V液中加入2克一氯乙酸并且將pH調(diào)節(jié)為9.0(基本上實(shí)現(xiàn)50％的-SH修飾，稱作50％修飾的角蛋白)。1小時(shí)后，通過(guò)用鹽酸(2N)將pH調(diào)節(jié)為4.2而沉淀角蛋白。通過(guò)在Sorvall離心機(jī)中以20000xg離心30分鐘來(lái)分離沉淀。從上清液中取樣并冷凍干燥用以進(jìn)一步分析(進(jìn)一步稱為修飾的角蛋白上清液-方法2)。用乙酸(0.1N，pH4.2)洗滌角蛋白團(tuán)粒，并隨后節(jié)其重新懸浮于水中。使用NaOH(1N)將該重新懸浮的團(tuán)粒的pH調(diào)節(jié)為7.0并且冷凍干燥這些混合物?；?00％角蛋白原料(羽毛的重量)，干角蛋白產(chǎn)品的收率是40％。該產(chǎn)品將被稱作修飾的角蛋白-方法2。
修飾度.使用Schrooyen等描述的DTNB/NTSB測(cè)定法(Journal ofAgricultural and Food Chemistry；2000；48(9)；4326-4334)測(cè)量修飾度。對(duì)于修飾的角蛋白-方法1，54％的半胱氨酸殘基得到修飾；對(duì)于修飾的角蛋白-方法2，57％的半胱氨酸殘基得到修飾。
在圖2中顯示了修飾的角蛋白-方法1、修飾的角蛋白上清液-方法2和修飾的角蛋白-方法2的摩爾質(zhì)量對(duì)洗脫體積(TSK G 3000+TSK Guard PWH柱+UV檢測(cè)器)的曲線。洗脫液是脲(8M)和二硫蘇糖醇(15mM)的水溶液。流速為0.7ml/min。在這些洗脫條件下，所有殘留的二硫鍵均被還原，并且僅觀察到角蛋白(≈10400g/mol)或降解產(chǎn)物(少于10400g/mol)。可以看出，修飾的角蛋白-方法1和修飾的角蛋白-方法2都具有相似的摩爾質(zhì)量分布，盡管修飾的角蛋白-方法2含有比修飾的角蛋白-方法1更多的高和低摩爾質(zhì)量產(chǎn)物。高摩爾質(zhì)量產(chǎn)物可能是在高pH下能夠發(fā)生的交聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物，例如通過(guò)形成羊毛硫氨酸。低摩爾質(zhì)量產(chǎn)物是降解的結(jié)果。這在修飾的角蛋白上清液-方法2中甚至能夠更好地觀察到，角蛋白上清液-方法2仍含有大量的低摩爾質(zhì)量產(chǎn)品，主要在3000至10000g/mol之間。
因?yàn)榉椒?中使用的pH從沒(méi)有高于9.0，所以不可能發(fā)生多肽鏈的降解，這由SEC-MALLS分析的使用得到證實(shí)。在方法2中，高溫和強(qiáng)堿性pH引起角蛋白的部分降解。
實(shí)施例2具有不同修飾度的部分降解的角蛋白的制備使用水和洗滌劑清洗家禽羽毛。將清潔且干燥的羽毛(60克)與1.5升熱的(NH4)2S水溶液(0.1M，pH12.5，60℃)混合并攪拌1小時(shí)。使用粗濾布和Whatman 54濾器(孔徑10微米)分離未溶解的羽毛和溶解的角蛋白?；?00％角蛋白原料(羽毛)，濾液中的角蛋白收率是59.5％。冷卻至20℃后，將濾液分成3份，每份500毫升不向第一份中加入一氯乙酸，并且將pH調(diào)節(jié)為9.0(得到基本上未修飾的角蛋白，稱作未修飾的角蛋白)，向第二份中加入1克一氯乙酸，并且將pH調(diào)節(jié)為9.0(得到基本上50％的SH修飾，稱作50％修飾的角蛋白)，向第三份中加入5克一氯乙酸，并且將pH調(diào)節(jié)為9.0(得到基本上90％的SH修飾，稱作90％修飾的角蛋白)。1小時(shí)后，通過(guò)使用鹽酸(2N)將pH調(diào)節(jié)為4.2而沉淀角蛋白。在Sorvall離心機(jī)中以20000xg離心30分鐘來(lái)分離沉淀。從上清液中取樣用以進(jìn)一步分析。用乙酸(0.1N，pH4.2)洗滌角蛋白團(tuán)粒，并隨后將其重新懸浮于水中。使用NaOH(1N)將該重新懸浮的團(tuán)粒的pH調(diào)節(jié)為7.0，并且冷凍干燥這些混合物?；?00％角蛋白原料(羽毛的重量)，干角蛋白產(chǎn)品的收率對(duì)于未修飾的角蛋白是46.5％，對(duì)于50％修飾的角蛋白是48.9％，而對(duì)于90％修飾的角蛋白是20.8％。
修飾度.使用Schrooyen等描述的DTNB/NTSB測(cè)定法(Journal ofAgricultural and Food Chemistry；2000；48(9)；4326-4334)測(cè)量修飾度。對(duì)于未修飾的角蛋白1，0％的半胱氨酸殘基得到修飾，對(duì)于50％修飾的角蛋白，53％的半胱氨酸殘基得到修飾，對(duì)于90％修飾的角蛋白，89％的半胱氨酸殘基得到修飾。
溶解性將冷凍干燥的角蛋白產(chǎn)品在室溫下懸浮(5％)于4種緩沖液中1.水2.Tris-緩沖液(50mM)水溶液-pH8.0堿性pH有助于懸浮角蛋白3.脲(8M)-pH8.5加入脲以防止非共價(jià)結(jié)合的角蛋白聚集4.脲(8M)+2.5g/ltr二硫蘇糖醇(DTT)-pH8.5加入DTT以還原二硫鍵未修飾的角蛋白在緩沖液4中完全可溶(圖3)。它在其它緩沖液中形成白色凝膠。50％修飾的角蛋白在緩沖液3和4中可溶(圖4)。它在其它緩沖液中形成白色凝膠。當(dāng)將緩沖液2加熱到40℃時(shí)，得到混濁的分散體。90％修飾的角蛋白在所有緩沖液中都可溶或可分散；緩沖液1和2有些混濁(圖5)。
成膜為了通過(guò)溶液澆鑄產(chǎn)生膜，需要良好的水分散體或水溶液。從未修飾的角蛋白不可能產(chǎn)生膜。從50％修飾的角蛋白，將5％分散體與甘油混合(0.30g/g角蛋白)，并在培養(yǎng)皿中澆鑄。干燥后，得到強(qiáng)硬的膜(拉伸強(qiáng)度15MPa)，它在室溫下不溶于水。從90％修飾的角蛋白，相似的膜得到制備。該膜具有不良的機(jī)械性質(zhì)(拉伸強(qiáng)度＜5MPa)并且是水溶性的。
粘著性50％修飾的角蛋白具有良好的粘著性，并且尤其適于通常用于啤酒瓶的將紙粘到玻璃上。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)部分修飾且部分水解的角蛋白的方法，該方法包括以下步驟(a)在堿性pH下，在水溶液中，使用還原劑從含角蛋白纖維的原料溶解角蛋白；及(b)部分修飾該溶解的角蛋白的-SH基，其特征在于作為步驟(a)和(b)，以及任選的另外水解步驟(c)的條件的結(jié)果，該溶解的角蛋白被部分水解，其中該溶解的角蛋白被部分水解，使得至少50％的溶解的角蛋白分子具有高于1kDa且低于10,4kDa的分子量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該溶解的角蛋白被部分水解，使得至少1％的溶解的角蛋白具有低于10kDa的分子量，并且至少50％的溶解的角蛋白具有高于5kDa的分子量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該溶解的角蛋白具有基本上與如下獲得的角蛋白的分子量分布相同的分子量分布在40-80℃的溫度下，將40克清潔且干燥的家禽羽毛在pH為pH10.0至pH13.5之間的1升0.05-0.5M硫化鈉水溶液中溶解30-90分鐘。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的方法，其中該溶解的角蛋白的至少10％且不超過(guò)70％的-SH基被修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中-SH基的修飾包括-SH基的烷基化。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的方法，其中該還原劑包括硫化物，優(yōu)選是堿金屬硫化物或硫化銨。
7.包含角蛋白的組合物，其中該角蛋白的特征在于a)該角蛋白的至少10％且不超過(guò)70％的-SH基被修飾；和b)至少50％的溶解的角蛋白具有1-11kDa的分子量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中至少1％的角蛋白具有低于10kDa的分子量，并且至少50％的角蛋白具有高于5kDa的分子量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其中該角蛋白具有基本上與如下獲得的角蛋白的分子量分布相同的分子量分布在40-80℃的溫度下，將40克清潔且干燥的家禽羽毛在pH為pH10.0至pH13.5之間的1升0.05-0.5M硫化鈉水溶液中溶解30-90分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9之任一項(xiàng)的組合物，其中-SH基的修飾包括-SH基的烷基化。
11.包含角蛋白的組合物，其中該組合物可以在包括下列步驟的方法中獲得(a)在40-80℃的溫度下，將來(lái)自含角蛋白纖維的原料的角蛋白在pH為pH10.0至pH13.5之間的0.05-0.5M硫化鈉水溶液中溶解30-90分鐘；(b)修飾溶解的角蛋白的10％至70％的-SH基，優(yōu)選通過(guò)烷基化進(jìn)行修飾。
12.根據(jù)權(quán)利要求7-11之任一項(xiàng)的組合物，其中該組合物是水溶液或分散體的形式。
13.根據(jù)權(quán)利要求7-11之任一項(xiàng)的組合物，其中該組合物是固體形式，優(yōu)選是分散性的無(wú)粉塵粉末或顆粒。
14.生產(chǎn)角蛋白基產(chǎn)品的方法，該方法的特征在于將權(quán)利要求7-13之任一項(xiàng)的含角蛋白的組合物用作角蛋白源。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中通過(guò)澆鑄權(quán)利要求7-13之任一項(xiàng)的角蛋白溶液或分散體而生產(chǎn)該角蛋白基產(chǎn)品。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中該角蛋白基產(chǎn)品是膜或涂層。
17.從權(quán)利要求7-13之任一項(xiàng)的含角蛋白的組合物生產(chǎn)的角蛋白基產(chǎn)品，該產(chǎn)品是膜或涂層，具有a)高于15MPa的拉伸強(qiáng)度；b)高于100MPa的E模量；和c)高于10％的斷裂伸長(zhǎng)率。
18.權(quán)利要求7-13之任一項(xiàng)的角蛋白用于下列各項(xiàng)的用途-制備膜或涂層；-制備可生物降解的包裝材料；-配方用于活性物質(zhì)的控釋系統(tǒng)；-形成乳液、分散體或多相含水系統(tǒng)；-作為或用于填料、膠凝劑、粘結(jié)劑、填充劑、成粒劑、脫模劑、基質(zhì)材料、乳化劑或穩(wěn)定劑；-作為抗氧化劑；或者-作為抗微生物劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及從含角蛋白的原料，如家禽羽毛溶解角蛋白的方法。可以在堿性條件下使用硫化物溶解該角蛋白。在該方法中，例如通過(guò)烷基化而部分修飾溶解的角蛋白的半胱氨酸殘基。選擇溶解和部分修飾的條件，使得該角蛋白也被部分水解。該部分修飾且部分水解的角蛋白可以用作穩(wěn)定的分散體，例如通過(guò)澆鑄而用以生產(chǎn)膜和涂層。
文檔編號(hào)A61K47/42GK1555393SQ02818031
公開(kāi)日2004年12月15日 申請(qǐng)日期2002年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月13日
發(fā)明者彼得·馬塞爾·馬里亞姆·施羅伊恩, 拉杜爾夫·奧貝蒂爾, 夫 奧貝蒂爾, 彼得 馬塞爾 馬里亞姆 施羅伊恩 申請(qǐng)人:荷蘭奶制品基金研究所(Nizo)