專利名稱：將含有白蛋白的制劑滅菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于將含有白蛋白的制劑滅菌，以降低其中一種或多種活性生物污染物或病原體的含量的方法，所述活性生物污染物或病原體是例如病毒、細(xì)菌(包括細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，例如支原體屬、尿原體屬、nanobacteria、衣原體屬、立克次氏體)、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或單獨(dú)或聯(lián)合引起TSE的類似物和/或單細(xì)胞或多細(xì)胞寄生物。本發(fā)明特別涉及用輻射法將含有白蛋白的制劑例如血漿蛋白組分(PPF)產(chǎn)品滅菌的方法。
背景技術(shù)：
白蛋白是高度溶解的橢圓體狀蛋白質(zhì)(MW66,500)，其構(gòu)成血漿膠體滲透壓的70-80％。因此，白蛋白對(duì)于調(diào)節(jié)循環(huán)血液的容量相當(dāng)重要。當(dāng)靜脈內(nèi)注射時(shí)，5％的白蛋白將會(huì)使循環(huán)血漿容量增加約相當(dāng)于所輸注的體積。這種外加的液體降低了血濃度，并使血液粘度得以降低。容量擴(kuò)大的程度和持續(xù)時(shí)間取決于初始血容量。當(dāng)治療血容量減少的患者時(shí)，所輸注的白蛋白的作用可以持續(xù)多個(gè)小時(shí)。在具有正常血容量的個(gè)體中，血液稀釋持續(xù)很短的時(shí)間。
白蛋白還是一種輸送蛋白質(zhì)，并在循環(huán)中結(jié)合天然存在的、治療性的、和有毒的物質(zhì)。
白蛋白遍布于細(xì)胞外的水中，并且身體白蛋白總量的60％以上位于血管外流體隔室中。在一個(gè)體重70千克的人中，全部的白蛋白約是350克；其具有15-20天的循環(huán)生命期，每天約更新15克。
阻止或逆轉(zhuǎn)外周水腫所必需的最小血清白蛋白水平是未知的。雖然毫無(wú)疑問(wèn)它在患者之間是有差異的，有若干證據(jù)表明，其每分升減少接近2.5克。這種濃度造成了20mmHg的血漿膠體滲透壓(相當(dāng)于5.2g/dL的總蛋白質(zhì)濃度)。
治療上經(jīng)常將含有白蛋白，包括血漿蛋白組分的制劑提供給人和動(dòng)物。例如，將含有白蛋白的制劑頻繁給藥于患有一種或多種下列適應(yīng)癥的人伴隨或不伴隨休克的血容量減少；低白蛋白血癥，其可由下述原因引起白蛋白產(chǎn)生不足(起因于營(yíng)養(yǎng)不良、燒傷、嚴(yán)重?fù)p傷、先天性白蛋白缺乏血癥、肝病、感染、惡性腫瘤或內(nèi)分泌失調(diào))、過(guò)度分解代謝(起因于燒傷、嚴(yán)重?fù)p傷、胰腺炎、甲狀腺毒癥、天皰瘡或腎病)、身體白蛋白損失(起因于出血、腎排泄過(guò)度、燒傷滲出物、滲出性腸病或表皮脫落性皮膚病)和/或體內(nèi)白蛋白再分配(起因于嚴(yán)重?fù)p傷、腹水肝硬化或各種炎癥)；心肺旁路手術(shù)之前或期間；和用于燒傷或肝硬化的治療。
多種不同的用于治療的含有白蛋白的制劑可以或已經(jīng)可以從市場(chǎng)上買到，包括例如Albuminar(Centeon/Aventis Behring)、Buminate(Baxter Laboratories)、Plasbumin(BayerBiological)、Albutein(Alpha Therapeutic)、白蛋白(人)(Immuno-U.S.)、Albumarc(American Red Cross)和人血清白蛋白(Swiss Red Cross)。各種血漿蛋白組分產(chǎn)品也可以或已經(jīng)可以從市場(chǎng)上買到，包括，例如Plasma-Plex(Centeon/Aventis Behring)、Protenate(Baxter Laboratories)、Plasmanate(BayerBiological)和Plasmatein(Alpha Therapeutic)。
白蛋白也在治療用的天然或重組蛋白質(zhì)的制劑中用做穩(wěn)定劑。例如，最近，在含有用于血友病A的因子VIII(例如得自Baxter-Hyland/Immuno的Recombinate)、用于多發(fā)性硬化的β-1b干擾素(例如得自Berlex Laboratories的Betaseron)、用于貧血的紅細(xì)胞生成素(例如得自Amgen的Epogeng)、用于Gaucher’s病的阿糖腦苷酶—一種改性形式的β-葡糖腦苷脂酶(例如得自Genzyme的Ceredase)和用于遺傳缺陷的抗凝血酶III(例如得自Bayer的Thrombate或得自Pharmacia & UpJohn的Atnativ)的治療制劑中，白蛋白作為穩(wěn)定劑存在。在這樣的制劑中，白蛋白占全部蛋白質(zhì)含量的99％以上。
白蛋白也在疫苗制劑中用作穩(wěn)定劑，所述疫苗制劑是例如蜱傳腦炎(TBE)病毒疫苗和麻疹、流行性腮腺炎和風(fēng)疹病毒疫苗(例如得自Merck的MMRII)、狂犬病疫苗(例如得自Evans/Medeva的Evans PolioVaccine)。在這樣的制劑中，白蛋白也占全部蛋白質(zhì)含量的99％以上。
含有白蛋白的制劑也在細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基中用做營(yíng)養(yǎng)劑，包括細(xì)胞(重組等)培養(yǎng)物生產(chǎn)所要求的產(chǎn)品和疫苗生產(chǎn)。這樣的制劑可以例如從Sigma-Aldrich、Irvine Scientific、Intergen和ValleyBiomedical購(gòu)得。
很多為人、獸醫(yī)、診斷和/或試驗(yàn)使用而制備的含有白蛋白的制劑會(huì)含有有害的和具有潛在危險(xiǎn)的生物污染物或病原體，例如病毒、細(xì)菌(包括細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，例如支原體屬、尿原體屬、nanobacteria、衣原體屬、立克次氏體)、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或單獨(dú)或聯(lián)合引起TSE的類似物和/或單細(xì)胞或多細(xì)胞寄生物。所以，在產(chǎn)品使用前將任何生物污染物或病原體進(jìn)行滅活是極為重要的。當(dāng)將物質(zhì)直接給藥于患者，例如在輸血、血液因子替代治療、器官移植和通過(guò)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或其它形式的注射或輸注來(lái)進(jìn)行的人治療中，這是尤其關(guān)鍵的。對(duì)于含有各種血漿和/或血漿衍生物的在培養(yǎng)基中制備的或者經(jīng)由細(xì)胞或重組細(xì)胞培養(yǎng)制備的生物材料或可能遭受支原體菌屬、朊病毒、細(xì)菌、病毒和其它生物污染物或病原體污染的生物材料來(lái)說(shuō)，也是很關(guān)鍵的。
大多數(shù)生產(chǎn)生物材料的操作涉及將生物材料進(jìn)行關(guān)于一種或多種特定生物污染物或病原體的篩選或測(cè)試，而不是將污染物或病原體從材料中除去或?qū)⒅疁缁睢H不使用對(duì)生物污染物或病原體測(cè)試呈陽(yáng)性的材料。篩選操作的實(shí)例包括對(duì)來(lái)自獻(xiàn)血者的人血中的特定病毒進(jìn)行測(cè)試。然而，這樣的操作并不總是可靠的，并且不能探測(cè)到某些病毒的存在，特別是以非常低的數(shù)目存在的病毒。鑒于與假陰性結(jié)果所帶來(lái)的后果，這降低了測(cè)試的價(jià)值或確定性。在某些情況下，例如在獲得性免疫缺乏綜合癥(愛滋病)情況下，假陰性結(jié)果能夠?qū)ι鼧?gòu)成威脅。此外，在某些情況下，即使不需要數(shù)月，也需要數(shù)周才能確定物質(zhì)是否被污染。因此，在制備生物學(xué)材料的過(guò)程中或之后，需要使用一定的技術(shù)將污染物或病原體殺死或滅活。
而且，迄今為止，沒(méi)有用于鑒定生物學(xué)材料內(nèi)的朊病毒的、適于篩選出潛在供體或感染材料的可靠測(cè)試或測(cè)定。這使得對(duì)于將朊病毒消滅于生物學(xué)材料內(nèi)，同時(shí)仍然保持所要求的材料活性的有效方法的需要提高了。
在進(jìn)行測(cè)定滅活病毒的技術(shù)能力中，很少使用有關(guān)的確切病毒。這是由于對(duì)進(jìn)行試驗(yàn)的工作人員的安全考慮以及與容器設(shè)備和廢物的處理有關(guān)的困難和費(fèi)用。在此場(chǎng)所，使用相同科和綱的模型病毒。
一般說(shuō)來(lái)，最難滅活的病毒是那些具有由蛋白質(zhì)形成的外殼的病毒，而它們當(dāng)中最難滅活的又是那些具有最小尺寸的病毒，這是大家公認(rèn)的。這在γ輻射和大多數(shù)其它形式的輻射中已經(jīng)得到證明，之所以如此是因?yàn)檫@些病毒的極小尺寸與很小的基因組有關(guān)。輻射到分子上的直接效果的大小與分子大小成正比，就是說(shuō)，目標(biāo)分子越大，效果就越好。作為必然的結(jié)果，在γ輻射中已經(jīng)被證實(shí)，病毒的基因組越小，滅活病毒所需要的輻射劑量就越高。
在關(guān)系到得自人和動(dòng)物的生物學(xué)材料的病毒當(dāng)中，最小的因而也就是最難滅活的病毒屬于細(xì)小病毒(Parvoviruses)和稍大的包被蛋白質(zhì)的肝炎(Hepatitis)病毒。在人中，細(xì)小病毒屬B19和甲型肝炎病毒是所擔(dān)心的病毒。在得自豬的材料中，相應(yīng)的最小病毒是豬細(xì)小病毒。因?yàn)檫@種病毒對(duì)人無(wú)害，所以經(jīng)常被選擇作為人B19細(xì)小病毒的模型病毒。這種模型細(xì)小病毒病毒的滅活例證被看作這樣的充分證據(jù)，即所使用的方法也會(huì)殺死人B19病毒和甲型肝炎病毒，并且通過(guò)引申，該方法也會(huì)殺死較大的和硬度較弱的病毒如HIV、CMV、乙型和丙型肝炎病毒以及其它病毒。
最近的努力集中在將產(chǎn)品中的污染物除去或?qū)⒅疁缁畹姆椒ㄉ?。這樣的方法包括加熱處理、過(guò)濾和向產(chǎn)品中加入化學(xué)滅活劑或增敏劑。
目前的美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局的標(biāo)準(zhǔn)要求是，含有白蛋白的制劑的加熱處理應(yīng)當(dāng)在約60℃加熱最少10個(gè)小時(shí)，而這會(huì)對(duì)敏感的生物學(xué)材料造成損害。事實(shí)上，加熱滅活能夠破壞某些生物學(xué)材料的生物學(xué)活性的50％或更多。
過(guò)濾涉及對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行過(guò)濾以便用物理方式除去污染物。遺憾的是，這種方法也會(huì)將具有高分子量的產(chǎn)品除去。而且，在某些情況下，小的病毒用過(guò)濾器還是除不掉。
化學(xué)增敏操作涉及加入與病毒的DNA/RNA結(jié)合并通過(guò)UV或者其它輻射激活的有毒物質(zhì)。輻射產(chǎn)生反應(yīng)中間體和/或自由基，其與病毒的DNA/RNA結(jié)合，將DNA/RNA骨架中的化學(xué)鍵打破，和/或?qū)⑵浣宦?lián)或復(fù)合，使得病毒不再能夠復(fù)制。該操作需要將未結(jié)合的增敏劑從產(chǎn)品中洗出來(lái)，因?yàn)樵雒魟┦怯卸拘缘?，否則將由于誘變和致癌作用而不能施用給患者，用γ射線照射產(chǎn)品是將產(chǎn)品滅菌的另一種方法。當(dāng)給予高總劑量時(shí)，γ射線能夠有效地消滅病毒和細(xì)菌(Keathly等人，“輻射后還有生物嗎？第2部分”BioPharm 1993，七月至八月，和Leitman，“USeof Blood Cell Irradiation in the Prevention of Post TransfusionGraft-vs-Host Disease”，Transfusion Science 10219-239(1989))。然而，本領(lǐng)域發(fā)表的文獻(xiàn)告戒，γ輻射會(huì)損害對(duì)輻射敏感的產(chǎn)品，例如血液、血液產(chǎn)品、蛋白質(zhì)和含蛋白質(zhì)的產(chǎn)品。特別是，已經(jīng)證明，高輻射劑量對(duì)紅細(xì)胞、血小板和粒細(xì)胞是有害的(Leitman)。美國(guó)專利4,620,908揭示，為了保持蛋白質(zhì)產(chǎn)品的活力，輻射之前必須將蛋白質(zhì)產(chǎn)品冷凍。該專利認(rèn)為，“如果使用γ輻射而同時(shí)蛋白質(zhì)材料處于例如室溫，該材料也將會(huì)遭到徹底的破壞，就是說(shuō)，材料的活性會(huì)變得如此低以至于事實(shí)上是無(wú)效的”。遺憾的是，很多敏感的生物材料，例如單克隆抗體(Mab)，如果為了輻射目的而經(jīng)受冷凍然后在給藥患者之前融化，就會(huì)喪失活力和活性。
鑒于上述的困難，仍然需要能夠有效地降低活性生物污染物或病原體的水平而同時(shí)對(duì)制劑不造成不利影響的、將含有白蛋白的制劑滅菌的方法。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的目的是提供通過(guò)降低活性生物污染物或病原體的水平而同時(shí)對(duì)制劑不造成不利影響來(lái)將含有白蛋白的制劑滅菌的方法。本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述中加以闡明，并且通過(guò)該描述將會(huì)部分地顯而易見或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)施來(lái)獲悉。本發(fā)明的這些目的和優(yōu)點(diǎn)可通過(guò)說(shuō)明書和權(quán)利要求書中特別指出的組合物和方法來(lái)實(shí)現(xiàn)和達(dá)到。
根據(jù)這些和其它的目的，本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案涉及用于將含有對(duì)輻射敏感的白蛋白的制劑滅菌的方法，所述方法包括(i)將至少一種穩(wěn)定劑以有效保護(hù)所述含有白蛋白的制劑免受輻射損害的量加到含有白蛋白的制劑中；和(ii)用適宜的射線以有效速率將所述含有白蛋白的制劑照射能將含有白蛋白的制劑有效滅菌的時(shí)間。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于將含有對(duì)輻射敏感的白蛋白的制劑滅菌的方法，所述方法包括(i)將所述含有白蛋白的制劑的殘余溶劑含量降低到有效保護(hù)含有白蛋白的制劑免受輻射損害的水平；和(ii)用適宜的射線以有效速率將所述含有白蛋白的制劑照射能將含有白蛋白的制劑有效滅菌的時(shí)間。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于將含有對(duì)輻射敏感的白蛋白的制劑滅菌的方法，所述方法包括(i)將所述含有白蛋白的制劑的溫度降低到有效保護(hù)含有白蛋白的制劑免受輻射損害的水平；和(ii)用適宜的射線以有效速率將所述含有白蛋白的制劑照射能將含有白蛋白的制劑有效滅菌的時(shí)間。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于將含有對(duì)輻射敏感的白蛋白的制劑滅菌的方法，所述方法包括(i)給所述含有白蛋白的制劑施加至少一種選自下列的穩(wěn)定化處理(a)降低所述含有白蛋白的制劑的殘余溶劑含量，(b)將至少一種穩(wěn)定劑加到所述含有白蛋白的制劑中；和(c)降低所述含有白蛋白的制劑的溫度；和(ii)用適宜的射線以有效速率將所述含有白蛋白的制劑照射能將含有白蛋白的制劑有效滅菌的時(shí)間，其中所述穩(wěn)定化處理和輻射速率一起有效地保護(hù)所述含有白蛋白的制劑免受輻射損害。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于將含有對(duì)輻射敏感的白蛋白的制劑滅菌的方法，所述方法包括(i)給所述含有白蛋白的制劑施加至少兩種選自下列的穩(wěn)定化處理(a)降低所述含有白蛋白的制劑的殘余溶劑含量，(b)將至少一種穩(wěn)定劑加到所述含有白蛋白的制劑中；和(c)降低所述含有白蛋白的制劑的溫度；和(ii)用適宜的射線以有效速率將所述含有白蛋白的制劑輻射能將含有白蛋白的制劑有效滅菌的時(shí)間，其中所述至少兩種穩(wěn)定化處理可以以任何次序進(jìn)行，并且一起有效地保護(hù)所述含有白蛋白的制劑免受輻射損害。
本發(fā)明還提供了包含白蛋白和一定量的至少一種穩(wěn)定劑的含白蛋白制劑，其中所述量的穩(wěn)定劑能有效保護(hù)制劑在用輻射滅菌后仍可實(shí)現(xiàn)其預(yù)期應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了包含白蛋白的制劑，其中殘余溶劑含量已被降至能有效保護(hù)制劑在用輻射滅菌后仍可實(shí)現(xiàn)其預(yù)期應(yīng)用的水平。
本發(fā)明還提供了包含白蛋白和一定量的至少一種穩(wěn)定劑的含白蛋白制劑，其中殘余溶劑的含量已被降低，并且其中所述量的穩(wěn)定劑和所述水平的殘余溶劑含量一起有效保護(hù)制劑在用輻射滅菌后仍可實(shí)現(xiàn)其預(yù)期應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了包含白蛋白的制劑，其中制劑的總蛋白濃度能有效保護(hù)制劑在用輻射滅菌后仍可實(shí)現(xiàn)其預(yù)期應(yīng)用的水平。
附圖簡(jiǎn)述附

圖1A、1B和1C顯示了在不同水平的殘余溶劑含量以及在或不在揮發(fā)性穩(wěn)定劑存在下照射的血漿蛋白組分。
附圖2A-2F顯示了進(jìn)行了輻射和用于瘙癢病感染性分析的人白蛋白(25％)，所述白蛋白用得自具有改變瘙癢病的倉(cāng)鼠(263K株)的10％腦勻漿以1∶100比例感染。
附圖3A和3B顯示了以10或40kGy的總劑量照射的凍干白蛋白(含有5％尿激酶)。
附圖4A-4B顯示了預(yù)先用或未用氬氣吹掃的照射的白蛋白樣本。
附圖5A-5F顯示了以18.1、23和30.4kGy的總劑量照射，通過(guò)用于聚集和裂解的SDS-PAGE和用于二聚和聚合的HPLSEC進(jìn)行分析的白蛋白溶液(25％)樣本。
附圖6A是表明γ輻射后摻入PPV的血漿蛋白質(zhì)組分中病毒載量減少的圖。附圖6B-6C是表明照射的血漿蛋白組分的SDS-PAGE分析結(jié)果的凝膠。
附圖7是表明含有白蛋白和因子VIII的制劑在γ照射后因子VIII的活性的圖。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述A.定義除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的相同含義。
除非另有說(shuō)明，本文所用的單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)含義。
本文所用術(shù)語(yǔ)“含有白蛋白的制劑”意指任何由活的生物體衍生或獲得的制劑，其含有血液蛋白質(zhì)白蛋白、重組白蛋白或轉(zhuǎn)基因白蛋白，重組白蛋白和轉(zhuǎn)基因白蛋白都具有天然序列或改性序列，或其變型或衍生物。含有白蛋白的制劑的實(shí)例包括但不限于Albuminar(Centeon/Aventis Behring)、Buminate(Baxter Laboratories)、Plasbumin(Bayer Biological)、Albutein(Alpha Therapeutic)、白蛋白(人)(Immuno-U.S.)和Albumarc(American Red Cross)以及血漿蛋白組分產(chǎn)品，包括例如Plasma-Plex(Centeon/AventisBehring)、Protenate(Baxter Laboratories)、Plasmanate(Bayer Biological)和Plasmatein(Alpha Therapeutic)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“滅菌”意指將在依據(jù)本發(fā)明處理的含有白蛋白的制劑中發(fā)現(xiàn)的至少一種活性生物污染物或病原體的水平降低。
本文所用術(shù)語(yǔ)“生物材料”意指任何由活的生物體衍生或獲得的物質(zhì)。生物材料的實(shí)例包括但不限于下列細(xì)胞；組織；血液或血液組分；蛋白，包括重組蛋白或轉(zhuǎn)基因蛋白，以及蛋白質(zhì)性質(zhì)的材料；酶，包括消化酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶和艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；免疫球蛋白，包括單和多免疫球蛋白；植物藥材；食品等。優(yōu)選的生物材料包括但不限于下列韌帶；腱；神經(jīng)；骨，包括去除礦物質(zhì)的骨基質(zhì)、移植物、關(guān)節(jié)、股骨、股骨頭等；牙齒；皮移植片；完整或加工過(guò)的骨髓，包括骨髓細(xì)胞懸浮液；心臟瓣膜；軟骨；角膜；動(dòng)脈和靜脈；器官，包括移植器官，例如心臟、肝、肺、腎、腸、胰腺、肢和指；脂質(zhì)；碳水化合物；膠原，包括天然的、無(wú)纖維的(afibrillar)、atelomeric、可溶的和不可熔的、重組和轉(zhuǎn)基因的膠原，二者具有天然序列或改性序列；殼多糖及其衍生物，包括NO-羧基脫乙酰殼多糖(NOCC)；干細(xì)胞、朗罕氏細(xì)胞島以及其它移植細(xì)胞，包括基因改變的細(xì)胞；紅細(xì)胞；白細(xì)胞，包括單核細(xì)胞；和血小板。
本文所用術(shù)語(yǔ)“生物污染物或病原體”意指這樣的生物污染物或病原體，其在直接或間接與含有白蛋白的制劑接觸時(shí)，可以對(duì)含有白蛋白的制劑或其接受者產(chǎn)生有害的作用。這樣的其它的生物污染物或病原體包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的通常存在于或感染含白蛋白制劑的各種各樣的病毒、細(xì)菌(包括細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，例如支原體屬、尿原體屬、nanobacteria、衣原體屬、立克次氏體)、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或單獨(dú)或聯(lián)合引起TSEs的物質(zhì)和/或單細(xì)胞或多細(xì)胞寄生物。其它生物污染物或病原體的實(shí)例包括但不限于下列病毒，例如人免疫缺陷病毒和其它的逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、線狀病毒、circoviruses、副粘液病毒、巨細(xì)胞病毒、肝炎病毒(包括甲型、乙型和丙型肝炎病毒及其它們的變種)、痘病毒、披膜病毒、Ebstein-Barr病毒和細(xì)小病毒；細(xì)菌，例如埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、鏈球菌屬(Streptococcus)以及葡糖球菌屬(Staphalococcus)；nanobacteria；寄生蟲，例如錐蟲屬和瘧疾寄生蟲，包括瘧原蟲屬類；酵母；霉菌；真菌；支原體和尿原體屬、衣原體屬；立克氏體，例如Coxiella burnetti；和朊病毒以及已知在哺乳動(dòng)物中單獨(dú)或聯(lián)合引起傳播性海綿狀腦病(TSEs)，例如瘙癢病、傳播性貂腦病、慢性消耗病(通常見之于騾、鹿和麋鹿)、貓海綿狀腦病、牛海綿狀腦病(瘋牛病)、Creutzfeld-Jakob病(包括變異的CJD)、致命性家族失眠癥、Gerstmann-Straeussler-Scheinker綜合癥、kuru和Alpers綜合癥的類似物。本文所用術(shù)語(yǔ)“活性生物污染物或病原體”意指這樣的生物污染物或病原體，其能夠單獨(dú)或與另一種因子，例如另一種生物污染物或病原體或天然蛋白(野生型或突變型)、或抗體聯(lián)合在含有白蛋白制劑和/或其接受者中產(chǎn)生有害的作用。
本文所用術(shù)語(yǔ)“血液組分”意指可以從全血中分離出來(lái)的一種或多種組分，包括但不限于下列細(xì)胞血液組分，例如紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板；血液蛋白，例如血液凝固因子、酶、白蛋白、纖溶酶原、纖維蛋白原和免疫球蛋白；以及液態(tài)血液組分，例如血漿、血漿蛋白組分(PPF)、冷凝蛋白、血漿組分和含血漿組合物。
本文所用術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞血液組分”意指全血的一種或多種組分，包括細(xì)胞，例如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、干細(xì)胞和血小板。
本文所用術(shù)語(yǔ)“血液蛋白”意指通常在全血中發(fā)現(xiàn)的一種或多種蛋白。在哺乳動(dòng)物，包括人中發(fā)現(xiàn)的血液蛋白的實(shí)例包括但不限于下列凝血蛋白，包括維生素K依賴型，例如因子VII和因子IX，和非維生素K依賴型，例如因子VIII和von Willebrands因子；白蛋白；脂蛋白，包括高密度脂蛋白和低密度脂蛋白；補(bǔ)體蛋白；球蛋白，例如免疫球蛋白IgA、IgM、IgG和IgE；等。優(yōu)選的一組血液蛋白包括因子I(纖維蛋白原)、因子II(前凝血酶)、因子III(組織因子)、因子V(前促凝血球蛋白)、因子VI(促凝血球蛋白)、因子VII(轉(zhuǎn)變加速因子前體，血清凝血酶原轉(zhuǎn)變)、因子VIII(抗血友病因子A)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X(Stuart-Prower因子)、因子XI(血漿促凝血酶原激酶前體)、因子XII(哈格曼因子)、因子XIII(protransglutamidase)、yon Willebrands因子(vWF)、因子Ia、因子IIa、因子IIIa、因子Va、因子VIa、因子VIIa、因子VIIIa、因子Ixa、因子Xa、因子XIa、因子XIIa和因子XIIIa。另一組優(yōu)選的血液蛋白包括在紅細(xì)胞內(nèi)部發(fā)現(xiàn)的蛋白，例如血紅蛋白和各種各樣的生長(zhǎng)因子，以及這些蛋白的衍生物。還有一組優(yōu)選的血液蛋白類包括在市售的血漿蛋白組分產(chǎn)品例如Plasma-Plex(Centeon/AventisBehring)、Protenate(Baxter Laboratories)、Plasmanate(Bayer Biological)和Plasmatein(Alpha Therapeutic)中發(fā)現(xiàn)的蛋白。
本文所用術(shù)語(yǔ)“液態(tài)血液組分”意指全血的一種或多種液態(tài)非細(xì)胞組分，例如血漿(在凝固前發(fā)現(xiàn)的人或動(dòng)物全血的液態(tài)非細(xì)胞部分)和血清(在凝固后發(fā)現(xiàn)的人或動(dòng)物全血的液態(tài)非細(xì)胞部分)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“生物相容溶液”意指這樣的溶液，含有白蛋白的制劑可以暴露于其中，例如通過(guò)懸浮或溶解來(lái)暴露于其中，并保持活性，即保持其本質(zhì)的生物或生理特性。
本文所用術(shù)語(yǔ)“生物相容緩沖液”意指具有適于維持其中的材料完整性的pH和滲透特性(例如張力、重量摩爾滲透壓濃度和/或膠體滲透壓)的生物相容溶液。適宜的生物相容緩沖液具有4-8.5的pH值，并且是等滲的或僅僅適度低滲或高滲的。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，生物相容緩沖液是已知和容易獲得的。
本文所用術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定劑”意指將接受輻射的含有白蛋白的制劑的損害降低至不足以妨礙材料的安全和有效使用的水平。穩(wěn)定劑的實(shí)例包括但不限于下列抗氧化劑；自由基清除劑，包括自旋捕獲劑；聯(lián)合穩(wěn)定劑，即能有效猝滅I型和II型光動(dòng)力反應(yīng)的穩(wěn)定劑；和能夠穩(wěn)定結(jié)合于其上的分子的配體，例如肝素。穩(wěn)定劑的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于下列乙醇；丙酮；脂肪酸，包括6，8-二巰基-辛酸(硫辛酸)及其衍生物和類似物(α，β，二氫，二去甲和四去甲硫辛酸)，硫辛酸、6，8-二巰基-辛酸、二氫硫辛酸酯(DL-6，8-二巰基辛酸甲酯)、硫辛酰胺、二去甲甲酯和四去甲二氫硫辛酸、呋喃脂肪酸、油酸和亞油酸以及棕櫚酸及其鹽和衍生物；黃酮類、phenylpropaniods、和flavenols，例如櫟精、蕓香苷及其衍生物、芹黃素、氨基黃酮、兒茶素、橙皮苷和柚皮苷；胡蘿卜素，包括β-胡蘿卜素；Co-Q10；葉黃素；多元醇，例如甘油、甘露醇；糖，例如木糖、葡萄糖、核糖甘露糖、果糖和海藻糖；氨基酸及其衍生物，例如組氨酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、谷氨酸、色氨酸、辛酸鈉、N-乙酰色氨酸和蛋氨酸；疊氮化物，例如疊氮化鈉；酶，例如超氧化物岐化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶；尿酸及其衍生物，例如1，3-二甲基尿酸和二甲基硫脲；別嘌醇；硫醇，例如谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽和半胱氨酸；微量元素，例如硒；維生素，例如維生素A、維生素C(包括其衍生物和鹽，例如抗壞血酸納和棕櫚?？箟难?和維生素E(及其衍生物和鹽，例如生育酚乙酸酯和α-tocotrienol)；色滿醇-α-C6；6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸(Trolox)和衍生物；體外蛋白，例如明膠和白蛋白；三-3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(MCI-186)；西替沃酮；puercetin；柯因；二甲亞砜(DMSO)；哌嗪二乙磺酸(PIPES)；咪唑；甲氧沙林(MOPS)；1，2-二噻烷-4，5-二醇；還原物質(zhì)，例如丁化羥基茴香醚(BHA)和丁化羥基甲苯(BHT)；膽固醇；普羅布考；吲哚衍生物；硫汞撒；拉扎堿和甲磺酸替拉扎特；proanthenols；proanthocyanidins；硫酸銨；Pegorgotein(PEG-SOD)；N-叔丁基-α-苯基硝酮(PBN)；4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-醇(-oxyl)(Tempol)；抗壞血酸鹽、尿酸鹽和Trolox C的混合物(Asc/尿酸鹽/Trolox C)；蛋白質(zhì)和肽，例如甘氨?；拾彼岷图‰模渲忻恳话被峥梢猿蔇或L形式；地奧司明；pupurogalin；五倍子酸及其衍生物，包括但不限于五倍子酸丙酯、甲醛次硫酸鈉和水飛薊素。特別優(yōu)選的實(shí)例包括能有效猝滅I型和II型光動(dòng)力反應(yīng)的單一穩(wěn)定劑或穩(wěn)定劑的聯(lián)合，以及能夠被作為氣體施用和/或易于通過(guò)蒸發(fā)、低壓和類似的方法除去的揮發(fā)性穩(wěn)定劑。
本文所用術(shù)語(yǔ)“殘余溶劑含量”意指含有白蛋白的制劑中的可自由利用的液體的量或部分。可自由利用的液體意思是存在于被滅菌的含有白蛋白的制劑中的、沒(méi)有結(jié)合到或與含有白蛋白的制劑一種或多種非液體組分絡(luò)合的液體，例如水或有機(jī)溶劑(例如乙醇、異丙醇、丙酮、聚乙二醇等)?？勺杂衫玫囊后w包括細(xì)胞內(nèi)的水。本文中作為水提及的殘余溶劑含量是指通過(guò)FDA批準(zhǔn)、改進(jìn)的Karl Fischer方法(Meyer和Boyd，Analytical Chem.，31215-219，1959；May，等人，J.Biol.Standardization，10249-259，1982；Centers forBiologics Evaluation and Research，F(xiàn)DA，Docket No.89D-0140，83-93；1990)或近紅外線光譜法測(cè)定的水平。其它溶劑的殘余水平的定量測(cè)定可以用本領(lǐng)域眾所周知的方法來(lái)進(jìn)行，這取決于所使用的溶劑。殘余溶劑與溶質(zhì)的比例也可以看作是溶質(zhì)在溶劑內(nèi)濃度的反映。當(dāng)如此表示時(shí)，溶質(zhì)的濃度越高，則殘余溶劑的量就越低。
本文所用術(shù)語(yǔ)“增敏劑”意指這樣的物質(zhì)，其可以選擇性地針對(duì)病毒、細(xì)菌、朊病毒和/或寄生性污染物，使它們對(duì)于輻射滅活更加敏感，因此與沒(méi)有增敏劑相比，就使得有可能使用較低的輻射速度或較低的輻射劑量和/或較短的輻射時(shí)間。適宜的增敏劑的實(shí)例包括但不限于下列補(bǔ)骨脂素及其衍生物和類似物(包括3-乙氧羰基補(bǔ)骨脂素)；inactines及其衍生物和類似物；含有鹵素取代基和增加水溶性的基團(tuán)例如季銨離子或磷離子的當(dāng)歸根素、凱林和香豆素；結(jié)合核酸的化合物；溴化血卟啉；酞菁染料；紅紫素；卟啉；二血卟啉酯的鹵化或由金屬原子取代的衍生物、血卟啉衍生物；苯并卟啉衍生物、氫化二苯并卟啉二馬來(lái)酰胺、氫化二苯并卟啉、二氰基二砜、四乙酯基氫化二苯并卟啉和四乙酯基氫化二苯并卟啉二丙酰胺；阿霉素和柔紅霉素，其可以用鹵素或金屬原子進(jìn)行修飾；力確興；BD肽、S2肽；S-303(ALE化合物)；染料，例如金絲桃素、亞甲藍(lán)、曙紅、熒光素(及其衍生物)、黃素、份菁染料540；光敏化合物，例如佛手內(nèi)酯；和SE肽。另外，也可以使用結(jié)合到朊病毒并因此增加它們的輻射滅活的敏感性的原子。這樣的原子的實(shí)例是銅離子，其結(jié)合到朊病毒蛋白是，并且由于蛋白中Z數(shù)目高于其它原子，在輻射特別是γ輻射期間，增加了朊病毒蛋白吸收能量的概率。
本文所用術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)性質(zhì)的材料”意指，由活生物體產(chǎn)生或獲得的包含至少一種蛋白質(zhì)或肽的任何材料。蛋白質(zhì)性質(zhì)的材料可以是呈其自然狀態(tài)，或加工/純化和/或衍生化后的天然材料，或者是人工制得的材料，其由化學(xué)合成或重組/轉(zhuǎn)基因技術(shù)制得，并任選經(jīng)過(guò)加工/純化和/或衍生化。蛋白質(zhì)性質(zhì)的材料的實(shí)例包括但不限于下列從細(xì)胞培養(yǎng)物制得的蛋白質(zhì)和肽；奶和其它奶制品；腹水；激素；生長(zhǎng)因子；從動(dòng)物組織提取或分離的材料，包括藥物，例如肝素和胰島素，或植物物質(zhì)；血漿，包括新鮮的、冷凍的和凍干的血漿，以及血漿蛋白組分；纖維蛋白原及其衍生物、血纖蛋白、血纖蛋白I、血纖蛋白II、可溶性血纖蛋白和血纖蛋白單體、和/或血纖蛋白密封產(chǎn)品；全血；蛋白質(zhì)C；蛋白質(zhì)S；α-1抗-胰蛋白酶(α-1蛋白酶抑制劑)；丁基-膽堿酯酶；抗凝血?jiǎng)缦愣顾?華法林)；鏈激酶；組織血纖維蛋白溶酶原活化劑(tPA)；紅細(xì)胞生成素(EPO)；尿激酶；neupogen；抗-凝血酶-3；α-葡糖苷酶；(胎)牛血清/馬血清；肉；免疫球蛋白，包括抗血清、單克隆抗體、多克隆抗體和通過(guò)基因工程或制得的抗體；白蛋白；α-球蛋白；β-球蛋白；γ-球蛋白；凝血蛋白；補(bǔ)體蛋白；和干擾素。
本文所用術(shù)語(yǔ)“輻射”意指輻射足夠的能量，以將被輻射的含白蛋白制劑中的至少一些組分滅菌。輻射的類型包括但不限于下列(i)粒子輻射(亞原子粒子如中子、電子和/或質(zhì)子流)；(ii)電磁輻射(發(fā)生于各種電磁場(chǎng)，例如無(wú)線電波，可見(單色和多色)和不可見光，紅外線、紫外線，X-射線，以及γ射線及其混合物)；和(iii)聲音和壓力波。這樣的射線經(jīng)常被稱做電離(在被輻射的材料中能夠產(chǎn)生離子)射線，例如γ射線，和非離子射線，例如可見光。這樣的射線源可以是多種多樣的，通常，對(duì)具體的輻射源的選擇并沒(méi)有嚴(yán)格要求，只要在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間以適當(dāng)?shù)乃俣劝l(fā)出足夠的輻射來(lái)實(shí)現(xiàn)滅菌即可。在實(shí)踐中，γ射線通常由鈷和銫的同位素產(chǎn)生，而UV和X射線則分別由輻射UV和X-射線的機(jī)器產(chǎn)生，電子通常用于在經(jīng)由機(jī)器產(chǎn)生被稱做“E-射線”輻射的方法中滅菌材料。單色和多色的可見光都由機(jī)器產(chǎn)生，并且在實(shí)踐中與由相同或不同機(jī)器產(chǎn)生的不可見光，例如紅外線和UV聯(lián)合使用。
本文所用術(shù)語(yǔ)“保護(hù)”意指將接受照射的含有白蛋白的制劑的任何損害減至不足以妨礙在輻射后安全和有效使用材料的水平。也就是說(shuō)，與沒(méi)有存在該物質(zhì)或方法相比，如果存在的該物質(zhì)或進(jìn)行該方法使得材料受到較小的輻射損害，則該物質(zhì)或方法“保護(hù)”含有白蛋白的制劑免受輻射損害。因此，在“保護(hù)”材料的物質(zhì)存在或保護(hù)材料的方法被實(shí)施的情況下，在輻射后可以安全和有效地使用含有白蛋白的制劑，但是在同等情況下，如果沒(méi)有該物質(zhì)或未實(shí)施該方法，輻射后含有白蛋白的制劑就不能安全和有效地使用。
B.特別優(yōu)選的實(shí)施方案本發(fā)明的第一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及用于將含有對(duì)輻射敏感的白蛋白的制劑滅菌的方法，所述方法包括用適宜的射線以有效地滅菌材料和保護(hù)材料免受輻射損害的速率將含有白蛋白的制劑輻射能將材料有效滅菌的時(shí)間。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及用于將含有對(duì)輻射敏感的白蛋白的制劑滅菌的方法，所述方法包括(i)將至少一種穩(wěn)定劑以有效保護(hù)所述含有白蛋白的制劑免受輻射損害的量加到含有白蛋白的制劑中；和(ii)用射線以有效速率將所述含有白蛋白的制劑輻射能將材料有效滅菌的時(shí)間。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及用于將含有對(duì)輻射敏感的白蛋白的制劑滅菌的方法，所述方法包括(i)將所述含有白蛋白的制劑的殘余溶劑含量降低到有效保護(hù)含有白蛋白的制劑免受輻射損害的水平；和(ii)用射線以有效速率將所述含有白蛋白的制劑輻射能將含有白蛋白的制劑有效滅菌的時(shí)間。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及用于將含有對(duì)輻射敏感的白蛋白的制劑滅菌的方法，所述方法包括(i)將所述含有白蛋白的制劑的溫度降低到有效保護(hù)含有白蛋白的制劑免受輻射損害的水平；和(ii)用射線以有效速率將所述含有白蛋白的制劑輻射能將含有白蛋白的制劑有效滅菌的時(shí)間。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及用于將含有對(duì)輻射敏感的白蛋白的制劑滅菌的方法，所述方法包括(i)給所述含有白蛋白的制劑施加選自下列的穩(wěn)定化處理(a)降低所述含有白蛋白的制劑的殘余溶劑含量，(b)將至少一種穩(wěn)定劑加到所述含有白蛋白的制劑中；和(c)降低所述含有白蛋白的制劑的溫度；和(ii)用射線以有效速率將所述含有白蛋白的制劑輻射能將含有白蛋白的制劑有效滅菌的時(shí)間，其中所述穩(wěn)定化處理和輻射速率一起有效地保護(hù)所述含有白蛋白的制劑免受輻射損害。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及用于將含有對(duì)輻射敏感的白蛋白的制劑滅菌的方法，所述方法包括(i)給所述含有白蛋白的制劑施加至少兩種選自下列的穩(wěn)定化處理(a)降低所述含有白蛋白的制劑的殘余溶劑含量，(b)將至少一種穩(wěn)定劑加到所述含有白蛋白的制劑中；和(c)降低所述含有白蛋白的制劑的溫度；和(ii)用射線以有效速率將所述含有白蛋白的制劑輻射能將含有白蛋白的制劑有效滅菌的時(shí)間，其中所述至少兩種穩(wěn)定化處理可以以任何次序進(jìn)行，并且一起有效地保護(hù)所述含有白蛋白的制劑免受輻射損害。
按照本發(fā)明的一些方法，在用射線照射含有白蛋白的制劑之前將穩(wěn)定劑加入。優(yōu)選將該穩(wěn)定劑以有效保護(hù)含有白蛋白的制劑免受輻射損害的量加到含有白蛋白的制劑中。適宜的穩(wěn)定劑的量，可以根據(jù)所使用的本發(fā)明特定方法的某些特征而變化，例如根據(jù)所使用的特定的穩(wěn)定劑和/或接受輻射的特定含有白蛋白的制劑的性質(zhì)和特征和/或其預(yù)期應(yīng)用而變化，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員憑借經(jīng)驗(yàn)確定。
按照本發(fā)明的一些方法，在用射線照射含有白蛋白的制劑之前將含有白蛋白的制劑的殘余溶劑含量降低。優(yōu)選將殘余溶劑的含量降至能有效保護(hù)含有白蛋白的制劑免受輻射損害的水平。殘余溶劑的適宜的水平可以根據(jù)所使用的本發(fā)明特定方法的某些特征而變化，例如根據(jù)接受輻射的特定含有白蛋白的制劑的性質(zhì)和特征和/或其預(yù)期應(yīng)用而變化，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員憑借經(jīng)驗(yàn)確定。對(duì)于有些含有白蛋白的制劑，要求將殘余溶劑含量保持在一個(gè)特定范圍內(nèi)，而不是一個(gè)具體的值。
當(dāng)溶劑是水，特別是當(dāng)一種或多種消化酶的制劑是固相時(shí)，殘余溶劑含量一般小于約15％，典型地小于約10％，更典型地小于約9％，甚至更典型地小于約8％，通常小于約5％，優(yōu)選小于約3.0％，更優(yōu)選小于約2.0％，甚至更優(yōu)選小于約1.0％，還更優(yōu)選小于約0.5％，還甚至更優(yōu)選小于約0.2％，而最優(yōu)選小于約0.08％。
溶劑可以優(yōu)選為非水溶劑，更優(yōu)選在輻射下不易于形成自由基的非水溶劑，而最優(yōu)選為在輻射下不易于形成自由基，并且具有很少或沒(méi)有溶解氧或其它在輻射下易于形成自由基的氣體的非水溶劑。揮發(fā)性非水溶劑是特別優(yōu)選的，甚至更優(yōu)選的是其為穩(wěn)定劑的非水溶劑，例如乙醇和丙酮。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案里，溶劑可以是水與非水溶劑例如乙醇和/或丙酮的混合物。在這樣的實(shí)施方案中，非水溶劑優(yōu)選為在輻射下不易于形成自由基的非水溶劑，而最優(yōu)選為在輻射下不易于形成自由基，并且具有很少或沒(méi)有溶解氧或其它在輻射下易于形成自由基的氣體的非水溶劑。揮發(fā)性非水溶劑是特別優(yōu)選的，甚至更優(yōu)選的是其為穩(wěn)定劑的非水溶劑，例如乙醇和丙酮。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)殘余溶劑是水時(shí)，通過(guò)把含有白蛋白的制劑溶解或懸浮于能夠溶解水的非水溶劑中，來(lái)降低含有白蛋白的制劑的殘余溶劑的含量。優(yōu)選地，這樣的非水溶劑在輻射下不易于形成自由基，并且具有很少或沒(méi)有溶解氧或在輻射下易于形成自由基的其它氣體。
當(dāng)含有白蛋白的制劑是液相時(shí)，殘余溶劑的含量的降低可以通過(guò)多種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)增加溶質(zhì)的濃度。以這種方法，溶解于溶劑內(nèi)的含有白蛋白的制劑的蛋白質(zhì)濃度可以增加至一般至少約0.5％，典型地至少約1％，通常至少約5％，優(yōu)選至少約10％，更優(yōu)選至少約15％，甚至更優(yōu)選至少約20％，還甚至更優(yōu)選至少約25％，而最優(yōu)選至少約50％。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以發(fā)現(xiàn)，特定含有白蛋白的制劑的殘余溶劑含量是在一個(gè)范圍內(nèi)，而不是一個(gè)具體值。對(duì)于特定含有白蛋白的制劑的優(yōu)選殘余溶劑含量，這樣的范圍可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員憑借經(jīng)驗(yàn)確定。
雖然不想受敷于任何可操作性理論，但是據(jù)信，殘余溶劑含量的降低，降低了含有白蛋白的制劑的自由度，降低了用于自由基產(chǎn)生的目標(biāo)數(shù)目，并限制了這些自由基的溶解度。因此，通過(guò)將含有白蛋白的制劑溫度降至低于它的低共熔點(diǎn)或低于它的冰點(diǎn)，或通過(guò)玻璃化同樣降低含有白蛋白的制劑的自由度，也可以達(dá)到類似的結(jié)果。與其它可以接受的結(jié)果相比，這些結(jié)果可以容許使用更高的輻射速率和/或劑量。因此，本文所述方法可以在任何不導(dǎo)致含有白蛋白的制劑受到不可接受的損害，即會(huì)妨礙安全和有效使用含有白蛋白的制劑的溫度下實(shí)施。優(yōu)選地，本文所述方法在室溫或低于室溫，例如低于被輻射的含有白蛋白的制劑的低共熔點(diǎn)或冰點(diǎn)的溫度下進(jìn)行。
按照本發(fā)明的方法，損害的“可以接受的水平”可以根據(jù)所使用的本發(fā)明特定方法的某些特征，例如特定含有白蛋白的制劑的性質(zhì)和特征，和/或所使用的二肽類穩(wěn)定劑，和/或被照射的含有白蛋白的制劑的預(yù)期應(yīng)用而變化，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員憑借經(jīng)驗(yàn)確定。因此，損害的“不可接受的水平”是將會(huì)妨礙安全和有效使用被輻射的含有白蛋白的制劑的損害水平。在給定的含有白蛋白的制劑中，損害的特定水平可以用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和技術(shù)確定。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，用于從含有白蛋白的制劑中降低溶劑，不給含有白蛋白的制劑造成不可接受的損害水平的任何方法和技術(shù)，將含有白蛋白的制劑的殘余溶劑含量降低。這樣的方法包括但不限于蒸發(fā)、濃縮、離心濃縮、玻璃化和噴霧干燥。
特別優(yōu)選的降低含有白蛋白的制劑的殘余溶劑含量的方法是凍干法。
另一特別優(yōu)選的降低含有白蛋白的制劑中殘余溶劑的方法是玻璃化法，其可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和技術(shù)來(lái)進(jìn)行，包括添加溶質(zhì)和/或附加溶質(zhì)例如蔗糖，以提高含有白蛋白的制劑的低共熔點(diǎn)，然后逐漸降低含有白蛋白的制劑的壓力，以便除去殘余的溶劑例如水。所得玻璃狀材料將具有降低的殘余溶劑含量。
按照本發(fā)明的某些方法，可以用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且可采用的方法，將被滅菌的含有白蛋白的制劑固定于固體表面上。例如，可以將被滅菌的含有白蛋白的制劑作為生物或非生物基質(zhì)上的包衣或表面提供。
在本發(fā)明方法中，所使用的輻射可以是任何將被處理的含有白蛋白的制劑有效滅菌的輻射。該輻射可以是粒子輻射，包括E-射線輻射。優(yōu)選地，該輻射是電磁輻射，包括X-射線、紅外線、可見光、UV光和各種波長(zhǎng)電磁射線的混合物。特別優(yōu)選的射線形式是γ射線。
按照本發(fā)明方法，對(duì)含有白蛋白的制劑的輻射，是用有效滅菌含有白蛋白的制劑，而同時(shí)不產(chǎn)生對(duì)該材料造成不可接受的損害水平的速率的射線進(jìn)行的。射線的適宜速率可以根據(jù)所使用的本發(fā)明方法的某些特征而變化，例如根據(jù)被輻射的特定含有白蛋白的制劑的性質(zhì)和特征，有關(guān)射線的特定形式和/或被滅活的特定的生物污染物或病原體而變化。射線的適宜速率可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員憑借經(jīng)驗(yàn)確定。優(yōu)選地，輻射速率在滅菌過(guò)程中是恒定的。當(dāng)該速率不切實(shí)際或不符合要求時(shí)，可以使用變動(dòng)的或不連續(xù)的輻射。
按照本發(fā)明方法，可以將輻射速率進(jìn)行優(yōu)化以產(chǎn)生產(chǎn)品收率和完成操作所需時(shí)間的最有利組合。在本文所述方法中，使用低(＜3kGy/小時(shí))和高(＞3kGy/小時(shí))速率都可以達(dá)到這樣的結(jié)果。對(duì)輻射速率進(jìn)行優(yōu)選以優(yōu)化含有白蛋白的制劑的收率，而同時(shí)仍然使含有白蛋白的制劑得以滅菌。雖然降低輻射速率可減小對(duì)含有白蛋白的制劑的損害，但其也會(huì)導(dǎo)致為達(dá)到特定要求的總劑量而需要較長(zhǎng)的輻射時(shí)間。因此，在某些情況下可以優(yōu)選較高劑量的速率，以例如將后勤問(wèn)題和成本減到最小，并且當(dāng)按照本文所述方法使用時(shí)，可保護(hù)含有白蛋白的制劑免受輻射損害。
按照本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，輻射速率不高于約3.0kGy/小時(shí)，更優(yōu)選為約0.1kGy/小時(shí)-3.0kGy/小時(shí)，甚至更優(yōu)選為約0.25kGy/小時(shí)-2.0kGy/小時(shí)，還甚至更優(yōu)選為約0.5kGy/小時(shí)-1.5kGy/小時(shí)，最優(yōu)選為約0.5kGy/小時(shí)-1.0kGy/小時(shí)。
按照本發(fā)明另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，輻射速率為至少約3.0kGy/小時(shí)，更優(yōu)選為至少約6kGy/小時(shí)，甚至更優(yōu)選為至少約16kGy/小時(shí)，甚至更優(yōu)選為至少約30kGy/小時(shí)，而最優(yōu)選為至少約45kGy/小時(shí)或更高。
按照本發(fā)明方法，被滅菌的含有白蛋白的制劑是用射線對(duì)其輻射能有效將含有白蛋白的制劑滅菌的時(shí)間。與輻射速率相聯(lián)合，適宜的輻射時(shí)間產(chǎn)生施用于含有白蛋白的制劑的適當(dāng)輻射劑量。適宜的輻射時(shí)間可以根據(jù)有關(guān)輻射的特定形式和速率和/或特定含有白蛋白的制劑的性質(zhì)和特征而變化。適宜的輻射時(shí)間可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員憑借經(jīng)驗(yàn)確定。
按照本發(fā)明的方法，將被滅菌的含有白蛋白的制劑用射線照射至能有效地將含有白蛋白的制劑滅菌，而同時(shí)不給該材料造成不可接受水平的損害的總劑量。輻射的適宜總劑量可以根據(jù)所使用的本發(fā)明方法的某些特征而變化，例如根據(jù)被滅菌的特定含有白蛋白的制劑的性質(zhì)和特征，有關(guān)照射的特定形式和/或被滅活的特定生物污染物或病原體而變化。輻射的適宜總劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員憑借經(jīng)驗(yàn)確定。優(yōu)選地，輻射的總劑量為至少25kGy，更優(yōu)選為至少45kGy，甚至更優(yōu)選為至少75kGy，而還更優(yōu)選為至少100kGy或更高，例如150kGy或200kGy或更高。
被輻射的含有白蛋白的制劑的特定幾何形狀，例如厚度和離輻射源的距離可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員憑借經(jīng)驗(yàn)確定。
按照本發(fā)明的某些方法，在照射之前，可以任選將有效量的至少一種增敏劑加到含有白蛋白的制劑中，以例如提高輻射對(duì)含有白蛋白的制劑中的生物污染物和病原體的作用效果，同時(shí)用本文所述方法將輻射對(duì)含有白蛋白的制劑的有害作用降至最小。適宜的增敏劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括補(bǔ)骨脂素及其衍生物和inactines及其衍生物。
按照本發(fā)明的方法，含有白蛋白的制劑的輻射可以在對(duì)被輻射的含有白蛋白的制劑無(wú)害的任何溫度進(jìn)行。按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，將含有白蛋白的制劑在室溫下進(jìn)行照射。依據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，將含有白蛋白的制劑在低溫下，即低于室溫的溫度下，例如在0℃、-20℃、-40℃、-60℃、-78℃或-196℃溫度下進(jìn)行照射。按照本發(fā)明的該實(shí)施方案，優(yōu)選在含有白蛋白的制劑的冰點(diǎn)或低共熔點(diǎn)溫度下或低于所述冰點(diǎn)或低共熔點(diǎn)的溫度下對(duì)含有白蛋白的制劑進(jìn)行輻射。按照另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，在高溫下，即高于室溫的溫度下，例如在37℃、60℃、72℃或80℃下對(duì)含有白蛋白的制劑進(jìn)行輻射。雖然不希望受敷于任何理論，但是據(jù)信，使用高溫可以增強(qiáng)輻射對(duì)生物污染物或病原體的作用效果，并因此可以使用較低的輻射總劑量。
最優(yōu)選地，含有白蛋白的制劑的輻射在保護(hù)制劑免受輻射損害的溫度下進(jìn)行。適宜的溫度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員憑借經(jīng)驗(yàn)確定。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，進(jìn)行輻射的溫度可在一個(gè)范圍內(nèi)，而不是在一個(gè)具體值上。對(duì)于特定含有白蛋白的制劑的輻射來(lái)說(shuō)，這樣的優(yōu)選溫度范圍可由本領(lǐng)域技術(shù)人員憑借經(jīng)驗(yàn)確定。
按照本發(fā)明的方法，含有白蛋白的制劑的照射可以在不對(duì)被滅菌的含有白蛋白的制劑造成損害的任何壓力下進(jìn)行。按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，將一種或多種消化酶的制劑在高壓下進(jìn)行照射。更優(yōu)選地，將含有白蛋白的制劑在由于施用聲波或使用揮發(fā)物而造成的高壓力下進(jìn)行照射。雖然不希望受敷于任何理論，但是據(jù)信，使用高壓可增強(qiáng)輻射對(duì)生物污染物或病原體的作用效果和/或增強(qiáng)由一種或多種穩(wěn)定劑提供的保護(hù)作用，并因此可以使用較低總劑量的輻射。適宜的壓力可由本領(lǐng)域技術(shù)人員憑借經(jīng)驗(yàn)確定。
一般地，按照本發(fā)明方法，進(jìn)行滅菌的含有白蛋白的制劑的pH值為約7。然而，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，含有白蛋白的制劑可以具有小于7，優(yōu)選小于或等于6，更優(yōu)選小于或等于5，甚至更優(yōu)選小于或等于4，最優(yōu)選小于或等于3的pH值。在另外的本發(fā)明實(shí)施方案中，含有白蛋白的制劑可以具有大于7，優(yōu)選大于或等于8，更優(yōu)選大于或等于9，甚至更優(yōu)選大于或等于10，最優(yōu)選大于或等于11的pH值。按照本發(fā)明的某些實(shí)施方案，進(jìn)行滅菌的制劑的pH值在包含于制劑中的酶的等電點(diǎn)或接近等電點(diǎn)。適宜的pH水平可由本領(lǐng)域技術(shù)人員憑借經(jīng)驗(yàn)確定。
同樣地，按照本發(fā)明方法，含有白蛋白的制劑的輻射可以在不對(duì)被處理的含有白蛋白的制劑造成損害的任何氣氛下進(jìn)行。按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，將含有白蛋白的制劑置于低氧或惰性氣氛下。當(dāng)使用惰性氣氛時(shí)，該氣氛優(yōu)選由稀有氣體，例如氦或氬，更優(yōu)選高分子量稀有氣體，最優(yōu)選氬組成。按照另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，在輻射時(shí)將含有白蛋白的制劑置于真空下。按照本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，在照射之前將含有白蛋白的制劑(凍干的、液體的或冷凍的)貯藏在真空或惰性氣氛(優(yōu)選稀有氣體，例如氦或氬，更優(yōu)選高分子量稀有氣體，最優(yōu)選氬)下。按照本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案，在輻射前，將含有白蛋白的液體制劑置于低壓下，以減少溶于液體中的氣體特別是氧氣的量，同時(shí)采用或不采用減少溶劑的先前步驟例如凍干。這樣的除氣法可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)含有白蛋白的制劑包含有溶解于其中或與之結(jié)合的氧或其它氣體時(shí)，可以用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和技術(shù)，例如通過(guò)有控制地降低裝有被處理制劑的容器(剛性或柔性)內(nèi)的壓力，或者通過(guò)將制劑置于大致相等體積的容器中，將制劑內(nèi)的或與制劑結(jié)合的這些氣體的量降低。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，當(dāng)被處理的含有白蛋白的制劑是組織時(shí)，按照任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和技術(shù)，將至少一種穩(wěn)定劑引入其中，包括把組織在含有穩(wěn)定劑的溶液中浸泡，優(yōu)選在壓力、高溫和/或在滲透促進(jìn)劑例如二甲亞砜存在下進(jìn)行浸泡。將至少一種穩(wěn)定劑引入組織內(nèi)的其它方法包括但不限于施加含有穩(wěn)定劑的氣體，優(yōu)選在壓力和/或高溫度下施加；將穩(wěn)定劑或含有穩(wěn)定劑的溶液直接注射到組織中；把組織置于低壓下，然后引入含有穩(wěn)定劑的氣體或溶液；以及兩種或多種這些方法的組合。按照這樣的方法，可以將一種或多種穩(wěn)定劑引入到組織內(nèi)。
應(yīng)當(dāng)理解，本文所描述的一個(gè)或多個(gè)特征的組合的使用，會(huì)進(jìn)一步將由輻射所造成的對(duì)含有白蛋白的制劑的有害作用減至最小，而同時(shí)保持輻射操作對(duì)生物污染物或病原體的充分作用效果。例如，除了使用穩(wěn)定劑以外，在輻射之前，還可以把含有白蛋白的特定制劑凍干，置于降低的溫度下和貯存于真空中，以便進(jìn)一步使有害作用減至最小。
特定生物污染物或病原體對(duì)射線的敏感性一般是通過(guò)確定滅活或殺死樣本中約37％的目標(biāo)物所需的劑量來(lái)計(jì)算的，其稱為D37值。含有白蛋白的制劑的所需組分也可以被看作具有與消除約37％其所需生物和生理特征所需的輻射劑量相等的D37值。
按照本發(fā)明的某些優(yōu)選方法，含有白蛋白的制劑的滅菌，是在導(dǎo)致生物污染物或病原體的D37值下降，而同時(shí)不降低含有白蛋白的制劑的D37值的條件下進(jìn)行的。按照本發(fā)明的其它優(yōu)選方法，含有白蛋白的制劑的滅菌是在導(dǎo)致含有白蛋白的制劑的D37值增加的條件下進(jìn)行的。按照本發(fā)明的最優(yōu)選方法，含有白蛋白的制劑的滅菌是在導(dǎo)致生物污染物或病原體的D37值降低，而同時(shí)含有白蛋白的制劑的D37值增加的條件下進(jìn)行的。
實(shí)施例下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的舉例說(shuō)明而不是限制。其它適當(dāng)?shù)男拚透倪M(jìn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常遇見的變化，并完全在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)。除非另有說(shuō)明，否則全部輻射皆使用60Co源來(lái)實(shí)現(xiàn)。
實(shí)施例1在本試驗(yàn)中，在不同水平的殘余溶劑含量以及有或沒(méi)有揮發(fā)性穩(wěn)定劑存在下，將血漿蛋白組分照射(45kGy，1.9kGy/小時(shí)，室溫)。
方法在玻璃小瓶中，配制市售血漿蛋白組分(2mg/ml)樣本，其具有含少量乙醇和丙酮的9％的水，或基本上不含乙醇或丙酮的1％的水。將樣本用γ射線照射(45kGy總劑量，1.9kGy/小時(shí)和室溫)，然后進(jìn)行結(jié)構(gòu)完整性分析。用SDS-PAGE、HPLSEC和反相HPLC測(cè)定結(jié)構(gòu)完整性。
對(duì)于SDS-PAGE，按照以下方法制備三份12.5％凝膠將4.2ml丙烯酰胺；2.5ml 4X-Tris(pH8.8)；3.3ml水；100微升10％APS溶液；和10μl TEMED置于具有1×Running Buffer(15.1g Tris基質(zhì)；72.0g甘氨酸；在1升水中的5.0g SDS，稀釋5倍)的電泳裝置中。將被照射的和對(duì)照樣本(1mg/ml)在Eppindorf管中用樣本緩沖液(+/-β-ME)稀釋，然后離心數(shù)分鐘。分析20μl每一稀釋樣本(～10μg)。
對(duì)于反相HPLC，把每一樣本溶解在水中至10mg/ml的終濃度。然后把這些溶液連續(xù)稀釋到0.1％三氟乙酸中以達(dá)到所需要的濃度。將10μg每一樣本負(fù)載到Aquapore RP-300(C-8)2.1×30mm MicroboreHPLC上Applied Biosystems 130A Separation System，流速為0.2ml/分鐘。溶劑A0.1％三氟乙酸；溶劑B70％乙腈，30％水，0.085％三氟乙酸。
對(duì)于HPLSEC，將每一樣本稀釋至0.4μg/μl，將50μl負(fù)載到用于濃度分析的20μg Phenomenex-Biosep S3000(分子范圍5kDa-700kDa)上20μl 2mg/ml貯備液+80μl洗脫緩沖液(50mM NaPi+100mM NaCl pH6.7)；流速為1ml/分鐘。
結(jié)果在輻射至45kGy時(shí)，兩個(gè)樣本都顯示出了白蛋白的某些破壞，而與含有較少的水和基本上不含揮發(fā)性穩(wěn)定劑的樣本相比，具有含少量乙醇和丙酮的9％水的樣本顯示出較輕的破壞和較高的結(jié)構(gòu)復(fù)原率。然而，對(duì)于白蛋白的隨后使用來(lái)說(shuō)，兩個(gè)樣本的結(jié)構(gòu)復(fù)原率都是足夠的。
更具體來(lái)說(shuō)，如附圖1A所示，SDS-PAGE分析表明了具有含少量乙醇和丙酮的9％水的樣本具有較好的白蛋白單體復(fù)原率。同樣地，如附圖1B所示，HPLSEC也表明了具有含少量乙醇和丙酮的9％水的樣本具有較少的聚集。如附圖1C所示，反相HPLC顯示了輻射的樣本和對(duì)照樣本之間的并不顯著的差異。
實(shí)施例2將人白蛋白(25％)用得自具有改變瘙癢病的倉(cāng)鼠(263K株)的10％腦勻漿以1∶100比例感染。通過(guò)渦旋將該樣本混合，并把4份6-ml等份試樣的瘙癢病感染的白蛋白分配到10-ml血清小瓶中。將一個(gè)小瓶作為冷凍對(duì)照在-80℃貯藏。把三個(gè)小瓶放入市售輻射設(shè)備中。將一個(gè)小瓶(0kGy對(duì)照)冷藏以防止細(xì)菌生長(zhǎng)。將其余小瓶在室溫(20-25℃)以0.4kGy/小時(shí)的速率照射至總劑量為26或50kGy。輻射劑量用附在每一個(gè)小瓶上的輻射劑量計(jì)和置放于接近小瓶的外部輻射劑量計(jì)確定。測(cè)定被照射的樣本和0kGy對(duì)照樣本的瘙癢病感染性。
通過(guò)把0.05ml樣本接種到12只倉(cāng)鼠腦內(nèi)，然后將其喂養(yǎng)6個(gè)月加以觀察來(lái)測(cè)定感染性。評(píng)價(jià)三個(gè)臨床終點(diǎn)抖動(dòng)、不能飼養(yǎng)和死亡。與未輻射的對(duì)照組比較，在用以較高劑量處理的樣本接種的組中，每一臨床癥狀的出現(xiàn)遲延了至少8-10天。將數(shù)據(jù)與列線圖進(jìn)行比較，所述列線圖是用關(guān)于大量以極限稀釋系列方式感染的動(dòng)物的潛伏時(shí)間的劑量反應(yīng)建立的(R.Rowher，未出版數(shù)據(jù))。該列線圖表示了疾病開始的天數(shù)(通過(guò)抖動(dòng)表明的)與接種的log10LD50之間的關(guān)系。
輻射對(duì)生物材料(白蛋白)的作用效果通過(guò)如下所述的SDS-PAGE凝膠電泳和高效尺寸排阻色譜法測(cè)定。
在Mighty Small Mini-Vertical Unit SE250/SE260內(nèi)，在8％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE。將樣本在PBS中進(jìn)行1∶100稀釋，然后在含有或不含有5％β-巰基乙醇的Laemmli Sample Buffer(Bio-Rad)中進(jìn)行1∶1稀釋。樣本負(fù)載量是12.5μg/道。分子量標(biāo)志物是Low-Range Standard(Bio-Rad)。電泳在125伏特進(jìn)行30分鐘。在50％甲醇、10％乙酸中用0.1％Coomassie Brilliant Blue R-250將凝膠染色，然后用5％甲醇、9％乙酸脫色。
在130A Separation System(Applied Biosystems)內(nèi)，在7.8×300mm Biosep SEC柱(Phenomenex，Torrence，CA)上進(jìn)行HPSEC。在使用之前，用0.22μm濾器將0.05M磷酸鈉、0.1M氯化鈉的洗脫劑緩沖液(pH6.7)過(guò)濾。在洗脫劑緩沖液中，將白蛋白溶液稀釋至終濃度為1.25mg/ml，注射25μl(31.25μg蛋白)。流速1ml/分鐘。通過(guò)在280nm的吸收度進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果對(duì)于未被照射的對(duì)照樣本，疾病發(fā)作(抖動(dòng))的中值潛伏時(shí)間是75天。對(duì)于被輻射的樣本，將樣本輻射至總劑量25kGy和50kGy，疾病發(fā)作的中值潛伏時(shí)間分別是88天和90天。與列線圖比較給出的估計(jì)值是，對(duì)于未被照射的對(duì)照樣本，log10效價(jià)為6.5，而對(duì)于被照射至總劑量25kGy和50kGy的樣本，則分別是4.8和4.6。根據(jù)這些估計(jì)值，對(duì)于被照射至總劑量25kGy和50kGy的樣本，中值減少因數(shù)分別是1.7和1.9。這些數(shù)據(jù)給出了中值減少值的估計(jì)值，但是沒(méi)有給出通過(guò)該試驗(yàn)預(yù)測(cè)的最大可能減少。為了給出這種最大可能減少，應(yīng)當(dāng)將對(duì)照組的95％置信區(qū)間(CI)的最小值與輻射處理組的95％CI的最大值進(jìn)行比較。該計(jì)算將獲得位于95％CI內(nèi)的效價(jià)的最大減少因數(shù)。對(duì)于50kGy組，該值為3.5對(duì)數(shù)減少。
生物污染物或病原體對(duì)射線的敏感性通常用其D37值表示。這表示將活性生物污染物或病原體的數(shù)目降至其輻射前數(shù)目的37％所需的輻射劑量。因此，D37值越低，特定生物污染物或病原體對(duì)輻射作用的敏感性就越高。實(shí)驗(yàn)測(cè)定的瘙癢病朊病毒的D37值約為47kGy(Rohwer，Nature，308，5960，pp.658-662，1984)。利用本文所述方法，出乎意料的發(fā)現(xiàn)，瘙癢病朊病毒的D37僅為4.5kGy。因此，使用本實(shí)驗(yàn)中所采用的方法和制劑降低了朊病毒的D37值。這樣，就實(shí)現(xiàn)了增加對(duì)瘙癢病朊病毒的殺傷力，而同時(shí)保持了本實(shí)驗(yàn)使用的生物材料—一種市售治療用25％人白蛋白溶液的完整性。
實(shí)現(xiàn)了增加對(duì)瘙癢病朊病毒的殺傷力，而同時(shí)保持了被處理的、含有白蛋白的制劑的本質(zhì)生物和生理特征。在用γ射線照射至25、50和100kGy的總劑量之前和之后，對(duì)這種特定生物材料-25％人白蛋白溶液進(jìn)行檢查。如凝膠電泳(附圖2A-2B)所示，在最高達(dá)50kGy的輻射劑量下，白蛋白大部分是完整的，只有少量的裂解和聚集，以及單體形式白蛋白的量?jī)H有輕微減少。對(duì)于所有白蛋白樣本，都獲得了類似結(jié)果而與是否含有任何抗壞血酸鹽和/或倉(cāng)鼠無(wú)關(guān)。在較高劑量時(shí)，在白蛋白樣本中發(fā)現(xiàn)較小的變化，主要形式是白蛋白的聚合增加。
更為詳細(xì)的分析是用HPSEC進(jìn)行的。如附圖2C-2F所示，在照射時(shí)，白蛋白單體的量減少(在10.5分鐘為峰值)，二聚物的量增加(9分鐘)以及聚合物的量增加(7.2分鐘)。這些變化在抗壞血酸鹽存在的情況下都減小了。其余在12.6和15.3分鐘的峰值分別是抗壞血酸鹽和N-乙?；彼岱€(wěn)定劑的峰值。
實(shí)施例3在本試驗(yàn)中，在約4℃，以1.847kGy/小時(shí)的速率將凍干的白蛋白(含有5％尿激酶)照射至總劑量為10和40kGy。
使用TSK凝膠G4000SWx130cm×7.8mm柱通過(guò)凝膠過(guò)濾分析樣本，分離范圍是20kDa-7,000kDa，洗脫緩沖液是0.1M磷酸鈉/0.1M硫酸鈉(pH6.5)，流速是1ml/分鐘。
如附圖3A所示，當(dāng)凍干然后照射至10kGy或40kGy總劑量時(shí)，在白蛋白中沒(méi)有發(fā)生變化。相反，如附圖3B所示，當(dāng)照射至40kGy總劑量時(shí)，液體白蛋白樣本表示出顯著降解。
實(shí)施例4在該試驗(yàn)中，制備白蛋白溶液(25％)的樣本并將樣本的一半用氬氣噴霧。
將樣本以0.91、0.92或1.01kGy/小時(shí)的速率分別輻射至總劑量18.1、23和30.4kGy。用SDS-PAGE對(duì)被輻射的樣本進(jìn)行聚集和裂解分析，用HPLSEC對(duì)其進(jìn)行二聚作用和聚合作用分析。
如附圖4A-4B所示，即使對(duì)于被輻射至總劑量30.4kGy的樣本，SDS-PAGE也僅顯示了少量的裂解(在減少的凝膠上在66kDa譜帶下的雙峰)和聚集(在未減少的凝膠上的116kDa譜帶)。
HPLSEC顯示了如下峰值
如HPLSEC所示，在輻射前用氬氣噴霧的樣本中看到較輕的二聚作用。
實(shí)施例5本試驗(yàn)中，在-20℃將血漿蛋白組分輻射至不同總輻射劑量(10、30或50kGy)。
方法在玻璃小瓶中，配制市售血漿蛋白組分樣本，其具有含少量乙醇和丙酮的9％水的低溶劑水平。在-20℃以1.608kGy/小時(shí)的速率用γ射線將樣本輻射至10、30或50kGy的總劑量，然后進(jìn)行結(jié)構(gòu)完整性分析。結(jié)構(gòu)完整性用SDS-PAGE和HPLSEC確定。
對(duì)于SDS-PAGE，按照以下方法制備四份12.5％凝膠將4.2ml丙烯酰胺；2.5ml 4X-Tris(pH8.8)；3.3ml水；100μl 10％APS溶液；和10μl TEMED置于具有1×Running Buffer(15.1g Tris基質(zhì)；72.0g甘氨酸；在1升水中的5.0g SDS，稀釋5倍)的電泳裝置中。將被輻射的和對(duì)照樣本(1mg/ml)在Eppindorf管中用樣本緩沖液(+/-β-ME)稀釋，然后離心數(shù)分鐘。分析20μl每一稀釋樣本(～10μg)。
對(duì)于HPLSEC，在Applied Biosystems 130A Separation System內(nèi)，將31μl每一樣本負(fù)載到Biosep SECS3000 7.7×300mm柱，在50mM Na2HPO4(pH6.7)，100mM NaCl中，流速為1ml/分鐘。
結(jié)果如附圖5A-5B所示，SDS-PAGE分析表明了來(lái)自被輻射的樣本，甚至達(dá)到50kGy輻射總劑量的樣本的白蛋白單體的定量回收率。同樣地，如附圖5C-5F所示，HPLSEC表明，在任何被輻射的樣本，甚至達(dá)到50kGy射線總劑量的樣本中，聚集作用沒(méi)有增加。
實(shí)施例6在本試驗(yàn)中，讓得自American Type Culture Collection的幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞在含有20％(體積/體積)胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并讓它們慢慢地適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境，以最終能夠在僅具有0.25％FBS的情況下生長(zhǎng)(其為它們的正常FBS需要量的5％)。然后減少FBS，用未被輻射或在-20℃、以1.608kGy/小時(shí)輻射至50kGy總輻射劑量的市售血漿蛋白組分補(bǔ)充該培養(yǎng)基，以使血漿蛋白組分為培養(yǎng)基(600mg)的0.3％重量/體積。
結(jié)果在生長(zhǎng)于含有未被輻射的血漿蛋白組分的培養(yǎng)基上的BHK細(xì)胞與生長(zhǎng)于含有已被輻射至50kGy總劑量的血漿蛋白組分的培養(yǎng)基上的BHK細(xì)胞之間沒(méi)有可觀察到的差別。
實(shí)施例7在本試驗(yàn)中，將含有豬細(xì)小病毒(PPV)的血漿蛋白組分在-80℃溫度下輻射至不同的總輻射劑量。
方法使用20％PEG8000在2.5M NaCl中的溶液制備PPV貯備液#7。將用PEG沉淀的病毒團(tuán)重懸在PEG緩沖液(0.1M NaCl，0.01M Tris(pH7.4)，1mM EDTA)中。
方法1將50μl PK-13培養(yǎng)基或PPV貯備液#7加到2ml Wheaton小瓶中，并在40℃干燥過(guò)夜。一旦液體已被干燥，即加入50mg市售血漿蛋白組分，并把小瓶塞住，然后在-80℃、以5.202kGy/小時(shí)的速率將其輻射至10、30或45kGy的總劑量。
方法2將50mg市售血漿蛋白組分置于2ml Wheaton小瓶中，然后與150μl PK-13培養(yǎng)基或150μl稀釋的PPV貯備液#7(100μl PK-13培養(yǎng)基+50μl PPV)混合直到溶解。將小瓶塞住，然后在-80℃、以5.202kGy/小時(shí)的速率將其輻射至10、30或45kGy的總劑量。
TCID50分析將850μl PK-13培養(yǎng)基(DMEM ATCC#3020002，10％FBS Gibco#26140079，1％Pen/Step/L-Glutamine Gibco#10378016)加到每個(gè)小瓶中，使其體積達(dá)到1ml。用13mm濾器(Becton Dickenson#4454)和3ml注射器將樣本過(guò)濾滅菌。
在96-孔平板中感染的前一天，將PK-13細(xì)胞(ATCC#CRL-6489)保持在PK-13生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在40％鋪滿時(shí)接種。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70-80％鋪滿時(shí)，向4個(gè)孔中加入50μl所需的輻射過(guò)的樣本(含有PK-13培養(yǎng)基或稀釋的PPV貯備液#7)。
SDS-PAGE輻射后，在HPLC水中制備樣本的貯備液(10mg/ml)，然后稀釋(2mg/ml)。將樣本用2×樣本緩沖劑(含有或不含有DTT)進(jìn)行1∶1稀釋，然后負(fù)載到凝膠上5μg(10μl)用于得自方法1的樣本，10μg(10μl)用于得自方法2的樣本。
結(jié)果按照方法1在-80℃下用45kGy的總劑量輻射的PPV處理的血漿蛋白組分表現(xiàn)出3.9log的病毒殺滅(0.084log/kGy)。按照方法2在-80℃輻射的PPV處理的血漿蛋白組分表現(xiàn)出5.54log的病毒殺滅(0.123log/kGy)。這些結(jié)果以圖表形式顯示于附圖6。被輻射的血漿蛋白組分在PK-13細(xì)胞中沒(méi)有引起任何細(xì)胞病變效應(yīng)。
還使用SDS-PAGE測(cè)定在-80℃輻射的PPV處理的血漿蛋白組分。這些結(jié)果如附圖6B-6C所示。
實(shí)施例8在本試驗(yàn)中，將含有白蛋白和因子VIII的冷凍制劑進(jìn)行輻射。
方法將含有白蛋白和因子VIII的樣本冷凍，然后用γ射線輻射至45kGy的總劑量。
結(jié)果如附圖7所示，在對(duì)照(未被輻射的)樣本的FVIII活性與冷凍并用γ射線輻射至45kGy的樣本的FVIII活性之間沒(méi)有差別。
實(shí)施例9在本試驗(yàn)中，將血漿蛋白組分(含有95-98％人血清白蛋白)在不同的條件下進(jìn)行輻射。
方法使用差示掃描量熱法(DSC)對(duì)PPF結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性進(jìn)行分析，DSC是用于測(cè)定生物大分子的短期和長(zhǎng)期穩(wěn)定性的最為敏感和直接的方法。通過(guò)將被輻射的PPF與未被輻射的樣本(移動(dòng)對(duì)照)在等同溶劑條件/配方下進(jìn)行比較，來(lái)評(píng)價(jià)輻射對(duì)這些物理化學(xué)特性的影響。該結(jié)果為選擇對(duì)PPF產(chǎn)品造成最低損害的最理想γ輻射處理?xiàng)l件提供了熱動(dòng)力學(xué)和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)?？梢园凑赵诒惠椛涞暮臀幢惠椛涞腜PF之間的差別來(lái)選擇γ輻射的最佳條件(pH、離子強(qiáng)度、溫度、劑量、劑量速率)以獲得所需結(jié)果。
在穩(wěn)定劑(4mM N-乙酰基色氨酸(AT)或4mM辛酸鹽(CA)或4mM AT和4mM CA的組合)存在下，將5％PPF溶液在60℃進(jìn)行10小時(shí)加熱巴氏滅菌。在所需加熱期間，將穩(wěn)定劑加到未被輻射的和被輻射的PPF(在γ輻射后加入)中以提高PPF的穩(wěn)定性。在-80℃，用5kGy/小時(shí)的劑量速率將輻射進(jìn)行至50kGy的總劑量。被輻射的PPF含有約1％的水分。
通過(guò)下述方法監(jiān)測(cè)作為熱穩(wěn)定性指標(biāo)的白蛋白聚集體形成(i)在370nm進(jìn)行光散射；(ii)在減少和未減少的條件下進(jìn)行SDS PAGE；和(iii)HPLC。把PPF粉末溶解在1×PBS緩沖劑中，將pH值調(diào)節(jié)至7.0，并把蛋白濃度調(diào)節(jié)至50mg/ml。在恒溫水浴內(nèi)，將樣本在塞住的聚丙烯管里于60℃加熱。使用掃描量熱法，通過(guò)比較在巴氏滅菌之前和之后，被輻射與未被輻射的PPF的變性溫度(Tmax)和變性焓(ΔHcal)來(lái)確定PPF的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和完整性。
結(jié)果被輻射的與未被輻射的PPF的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的比較在降低(a)和未降低(b)的條件下被輻射的與未被輻射的PPF的SDS PAGE表明，就γ射線所導(dǎo)致的白蛋白降解和/或與聚合有關(guān)的巰基而言，在未被輻射的與被輻射至50kGy的材料之間沒(méi)有顯著不同(僅在PAGE譜帶強(qiáng)度方面有輕微改變)。
在得自DSC試驗(yàn)的量熱特性中觀察到的差別表明了被輻射樣本在第三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面的變化。應(yīng)當(dāng)提及的主要差別與同未輻射材料相比被輻射的PPF的變性躍遷的協(xié)同性降低及其變性焓下降有關(guān)。
被輻射和未被輻射的PPF的過(guò)度熱容量的解卷曲比較分析表明，最大變性躍遷的溫度下降與在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面與它們不同的另外的白蛋白分子群體有關(guān)。蛋白的高穩(wěn)定性和低穩(wěn)定性部分的產(chǎn)生似乎是由于變性躍遷的協(xié)同性下降所致，其通常是由于穩(wěn)定天然蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部相互作用網(wǎng)絡(luò)的減少而造成的。被輻射的PPF的變性躍遷的協(xié)同性下降改變了量熱性質(zhì)(相對(duì)于未輻射的PPF)，其不應(yīng)當(dāng)被視為全體天然分子的分子間損害，而是應(yīng)當(dāng)看作是輻射靶目標(biāo)的一些分子的穩(wěn)定性改變。雖然被輻射的PPF的變性躍遷的去協(xié)同不意味著分子的嚴(yán)重?fù)p害，但是白蛋白的去穩(wěn)定化在加熱巴氏滅菌方面變得重要，即必須保護(hù)熱穩(wěn)定性(Td)小于60℃的白蛋白分子的去穩(wěn)定化部分以不被熱處理變性。
γ輻射后PPF粉末中的水分含量對(duì)白蛋白復(fù)原率的影響在-20℃下，以45kG、1.8kGy/小時(shí)輻射的具有不同水分含量的PPF粉末的量熱掃描顯示，當(dāng)PPF粉末中的水分含量從8.6％增加至液體狀態(tài)時(shí)，量熱曲線下的面積減小，其被解釋為在γ輻射后具有天然結(jié)構(gòu)的白蛋白分子數(shù)目減少了。在液體狀態(tài)下被輻射的PPF表現(xiàn)出最嚴(yán)重的損害。
以不同的劑量速率(1.8kGy/小時(shí)或6.5kGy/小時(shí))和水分含量(9％或1％)進(jìn)行γ輻射后，白蛋白結(jié)構(gòu)的復(fù)原率作為輻射溫度(-80℃、-20℃或20℃)的函數(shù)而變化。白蛋白復(fù)原率的定量值可以計(jì)算為被輻射的與未被輻射的PPF的焓的比值。變性作用的整體焓的降低表明具有較高水分含量的PPF粉末的輻射降低了分子的復(fù)原率。這些結(jié)果表明，在這些條件下的γ輻射對(duì)PPF的損害可能與源自自由基生成的繼發(fā)效應(yīng)有關(guān)。
γ輻射后溫度對(duì)白蛋白復(fù)原率的影響白蛋白結(jié)構(gòu)的復(fù)原率強(qiáng)烈地取決于PPF輻射的溫度，其隨著輻射溫度的降低而增加。在-80℃時(shí)，低水分樣本的結(jié)構(gòu)復(fù)原率好于較高水分的樣本。
市售穩(wěn)定劑對(duì)PPF的影響用差示掃描量熱法、SDS PAGE和尺寸排阻色譜法來(lái)確定CA和AT對(duì)人PPF的熱穩(wěn)定性的影響。
在4mM AT存在下，發(fā)生白蛋白變性的溫度(Tm)從65.4℃增加至67.6℃。同樣地，在4mM CA存在下，最大熱容量的溫度(Tmax)從65.4℃增加至72.03℃。然而，在既有4mM AT也有4mM CA存在的情況下，白蛋白熱穩(wěn)定性僅有4.6℃的增加，其Tm從65.4℃變?yōu)?0.5℃。
CA和AT對(duì)被輻射的PPF具有類似穩(wěn)定作用，雖然在同等溶劑條件下幅度稍微偏低。CA和AT在4mM阻止了大量蛋白的變性，但對(duì)于被輻射的蛋白，當(dāng)加熱至最高達(dá)60℃時(shí)，卻不能夠避免帶來(lái)渾濁的高分子量聚集體的10-15％的低聚反應(yīng)。
把CA的濃度增加到8mM導(dǎo)致白蛋白熱穩(wěn)定性顯著增加，即在82℃變性，而在4mM CA濃度下，是在65.4℃變性。這表明，在高于4mM的濃度下，辛酸鹽具有顯著的穩(wěn)定白蛋白的能力，使白蛋白在60℃能夠抵抗變性，而60℃通常是抗病毒巴氏滅菌法所使用的溫度。
HPLC分析表明，巴氏滅菌之前，在CA存在下被輻射的和未被的PPF基本上是單體。對(duì)于被輻射的PPF，加熱后由加熱產(chǎn)生的高分子量聚集體的量高于未被輻射的材料。在既有CA又有AT存在的情況下，被輻射的PPF中所引起的聚集體的百分比比只有CA時(shí)低幾乎兩倍，這表明雖然在PPF中除了CA以外還有AT時(shí)不能夠顯著地增加它的熱穩(wěn)定性，但在60℃加熱10小時(shí)期間，卻能抑制白蛋白的聚集。PPF中由加熱引起的白蛋白的聚集在未緩沖的PPF溶液中比在PBS緩沖液中更為明顯。
為測(cè)試所產(chǎn)生的聚集體的降解和性質(zhì)而在減少的條件下進(jìn)行的SDS PAGE顯示，與高分子量聚集體相對(duì)應(yīng)的譜帶消失了。這表明將γ照射的白蛋白暴露在60℃熱處理10小時(shí)后，形成了分子間S-S鍵，從而產(chǎn)生了穩(wěn)定的蛋白復(fù)合物。通過(guò)讓其經(jīng)由0.22μm濾器過(guò)濾不能將聚集的分子與天然單體形式分離開。分子間聚集發(fā)生的程度取決于PPF溶液的pH值和離子強(qiáng)度以及它的濃度。
在巴氏滅菌之前，當(dāng)通過(guò)加入鹽酸使蛋白溶液降低pH值(6.5-4.5)時(shí)，或當(dāng)PPF溶液沒(méi)有被適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)至pH7.0時(shí)，蛋白溶液在暴露于60℃的第一個(gè)十分鐘期間逐漸聚合。雖然pH值從7.0降低到5.5時(shí)CA結(jié)合白蛋白的親和力稍微增加，但其在60℃的必需加熱期間，在給定的穩(wěn)定劑濃度下(4mM)，不足以將蛋白的變化減至最小。
在巴氏滅菌(在60℃)之前和之后進(jìn)行的，關(guān)于在-20℃和-80℃被輻射的樣本的PPF的溫度記錄圖顯示，當(dāng)PPF粉末在-80℃被輻射時(shí)，兩種處理(γ輻射和巴氏滅菌)后的白蛋白分子的損害都降低了。
實(shí)施例10在本試驗(yàn)中，將血漿蛋白組分(含有95-98％人血清白蛋白)在不同的條件下進(jìn)行輻射。
方法PPF凍干粉末的γ輻射條件是-80℃、50kGy、5.02kGy/小時(shí)。
結(jié)果在減少的和未減少的條件下的SDS PAGE顯示，與沒(méi)有抗壞血酸鹽的被輻射的材料相比，將抗壞血酸鹽以100mM的濃度加到PPF中，使被γ輻射的材料的譜帶強(qiáng)度得到顯著改善。這表明，在抗壞血酸鹽存在下，因γ輻射引起的蛋白降解比沒(méi)有抗壞血酸鹽時(shí)要輕。
在100mM抗壞血酸鹽存在下，在巴氏滅菌之前對(duì)被輻射的和未被輻射的材料所做的HPLC分析顯示，被輻射的和未被輻射的蛋白在多肽鏈的化學(xué)完整性以及單體和多體形式數(shù)量方面幾乎是相同的。
使用在有(a)和沒(méi)有(b)以及只有(c)抗壞血酸鹽存在的情況下，未被輻射和被輻射的PPF的量熱掃描來(lái)評(píng)價(jià)這些形式的熱穩(wěn)定性。PPF的量熱測(cè)定是在PBS緩沖液，pH7.0中進(jìn)行的，用于全部試驗(yàn)的蛋白濃度為4.4mg/ml。在100mM抗壞血酸鹽存在下，未被輻射的和被輻射的PPF的量熱掃描的比較顯示，在γ輻射后的其復(fù)原率方面得到了顯著改善。雖然在抗壞血酸鹽存在下由熱引起的變性作用的量熱特性與沒(méi)有抗壞血酸鹽存在下是不同的，但其對(duì)于被輻射的和未被輻射的PPF卻是非常地相似。
所得結(jié)果表明(a)濃度為100mM的抗壞血酸鹽在γ輻射期間保護(hù)白蛋白免于結(jié)構(gòu)損壞；(b)在加熱到70℃并有催化氧化反應(yīng)的金屬存在的情況下，抗壞血酸鹽表現(xiàn)出化學(xué)變化(假設(shè)是氧化)；和(c)在輻射期間抗壞血酸鹽發(fā)生了變化，這可能是與自由基的相互作用引起的，這種變化可通過(guò)量熱分析定量評(píng)價(jià)，并且使得可精確地確定保護(hù)蛋白免受自由基損害所需的最佳抗壞血酸鹽濃度。
在有和沒(méi)有抗壞血酸鹽存在下巴氏滅菌的γ輻射與未輻射的PPF的SDS-PAGE譜帶強(qiáng)度的比較表明，與沒(méi)有抗壞血酸鹽存在的情況相比，當(dāng)在100mM抗壞血酸鹽存在下進(jìn)行輻射和巴氏滅菌時(shí)，白蛋白發(fā)生較少的降解。
在含有100mM抗壞血酸鹽的100mM鈉同等物溶液，pH7.0中，對(duì)未加熱(a)和巴氏滅菌(b)的PPF進(jìn)行的量熱掃描表明，將被輻射的PPF在60℃加熱10小時(shí)沒(méi)有引起蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生任何改變，這與在加熱巴氏滅菌后未被輻射的白蛋白類似。對(duì)于這兩種蛋白，最大變性躍遷的溫度是相同的，這意味著它們具有類似的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。對(duì)于被輻射和未被輻射的白蛋白，它們?cè)诎褪蠝缇昂椭蟮睦缌繜釄D形狀都有小的差異，這是由于在抗壞血酸鹽存在下，蛋白在高溫下的穩(wěn)定性提高了所致。在抗壞血酸鹽存在下，蛋白抗熱變性的穩(wěn)定性提高了3.8℃。該穩(wěn)定性給蛋白結(jié)構(gòu)提供了抗在60℃長(zhǎng)時(shí)間加熱的另外的保護(hù)作用。
被輻射與未被輻射的材料之間的主要差別是熱容量的最大放熱峰的溫度。放熱效應(yīng)與在γ輻射作用下抗壞血酸鹽轉(zhuǎn)化成氧化形式有關(guān)。在被γ輻射的抗壞血酸鹽中，由加熱引起的轉(zhuǎn)化過(guò)程是在43℃進(jìn)行，而在未被輻射的抗壞血酸鹽中，該過(guò)程在50℃達(dá)到最大。這意味著，通過(guò)暴露于γ輻射，抗壞血酸鹽在其化學(xué)結(jié)構(gòu)方面發(fā)生了變化，使得被輻射的抗壞血酸鹽比未被輻射的抗壞血酸鹽更容易轉(zhuǎn)化成氧化形式。
如下所述通過(guò)比較變性躍遷的焓來(lái)定量評(píng)估被輻射和未被輻射的白蛋白的結(jié)構(gòu)完整性，結(jié)果表明它們之間的差別小于15％。結(jié)構(gòu)完整性比在沒(méi)有抗壞血酸鹽存在下觀察的結(jié)果好得多，其中在巴氏滅菌后被輻射的PPF的復(fù)原率接近70％。
在有和沒(méi)有抗壞血酸鹽存在下進(jìn)行的巴氏滅菌之后，被輻射和未被輻射的HPLC分析能夠定量評(píng)估巴氏滅菌后PPF中的單體/聚集體數(shù)量，其表明，在沒(méi)有抗壞血酸鹽存在的情況下，將未被輻射的PPF在60℃巴氏滅菌10.5小時(shí)導(dǎo)致產(chǎn)生了接近12.4％的聚集體。在將γ輻射的PPF巴氏滅菌后，聚集體的數(shù)量增加至36.3％。在100mM抗壞血酸鹽存在下PPF的巴氏滅菌將S-S交聯(lián)的聚集體的數(shù)目減少了幾乎14％-22.8％。
實(shí)施例11在本試驗(yàn)中，將得自糊的人血清白蛋白在不同的條件下進(jìn)行照射。
方法將主要含有白蛋白的Fraction V糊沉淀在水中重新配制和加工以獲得人白蛋白。最終的溶液在pH7.0的未緩沖溶液中含有20mg/ml蛋白，蛋白中白蛋白的含量是97％。從重新配制的糊獲得白蛋白的收率是約30-35％。在密封的玻璃小瓶中，在-80℃將Fraction V糊沉淀以1.8kGy/小時(shí)的速率輻射至50kGy的總劑量。把移動(dòng)對(duì)照樣本在等同的條件下貯藏。按照操作，用丙氨酸輻射劑量計(jì)測(cè)定輻射劑量并用溫度因子校正。在巴氏滅菌之前，將市售穩(wěn)定劑辛酸鹽(CA)和N-乙酰色氨酸(AT)加到白蛋白溶液中至4mM的濃度。通過(guò)在60℃連續(xù)加熱10小時(shí)來(lái)進(jìn)行巴氏滅菌。
結(jié)果由糊純化得到的白蛋白的SDS PAGE表明，在有或沒(méi)有穩(wěn)定劑存在的情況下，純化的白蛋白具有～96％的純度。達(dá)到50kGy的γ輻射產(chǎn)生了高和低分子量的白蛋白分子，這是由于多肽鏈的降解和其轉(zhuǎn)化成S-S交聯(lián)聚集體而產(chǎn)生的。在減少的條件下，后者轉(zhuǎn)化成低MW片段。兩者的數(shù)目都是相當(dāng)少，為全部蛋白的～8％。巴氏滅菌沒(méi)有改變譜帶的強(qiáng)度，這表明在10個(gè)小時(shí)的加熱期間沒(méi)有發(fā)生化學(xué)降解。對(duì)于被γ輻射的蛋白，巴氏滅菌最顯著的結(jié)果是，它引起了分子間交聯(lián)，表現(xiàn)為在凝膠上的高分子量聚集體。對(duì)于未被輻射的蛋白，沒(méi)有觀察到聚集狀態(tài)。
在AT和CA存在下，巴氏滅菌之前和之后，γ輻射后的白蛋白樣本的HPLC分析顯示，輻射導(dǎo)致二聚體和多聚體稍微增加，而單體形式稍微減少。在HPLC的未減少的條件下，多聚體是通過(guò)多肽的裂解形成的(見SDS PAGE)，并通過(guò)S-S交聯(lián)而穩(wěn)定。在被輻射的白蛋白中，在60℃進(jìn)行10個(gè)小時(shí)的巴氏滅菌導(dǎo)致白蛋白的分子質(zhì)量向形成高分子量聚集體的方向顯著重排。
在沒(méi)有AT和CA存在的情況下，被輻射和未被輻射的白蛋白的DSC分析顯示，被輻射的白蛋白的主要部分與未被輻射的蛋白的熱穩(wěn)定性是類似的。然而，被輻射的白蛋白具有某些分子，其與天然白蛋白相比具有較低的穩(wěn)定性。
被輻射的和未被輻射的白蛋白的過(guò)度熱容量函數(shù)的解卷曲分析表明了下述內(nèi)容。雖然未被輻射的白蛋白的熱容量函數(shù)符合簡(jiǎn)單的變性躍遷二態(tài)模型，但是未被輻射的白蛋白表現(xiàn)出更復(fù)雜的行為。其由至少兩個(gè)獨(dú)立群體的熱穩(wěn)定性不同的白蛋白分子組成。一個(gè)群體是其熱穩(wěn)定性類似于未輻射蛋白的分子，另一個(gè)群體與去穩(wěn)定化分子有關(guān)。最后一部分被輻射的白蛋白在巴氏滅菌溫度下(60℃)對(duì)變性最敏感，并且可能是它們形成了S-S交聯(lián)的聚集體。加入市售穩(wěn)定劑AT和CA增加了被輻射和未被輻射的白蛋白的穩(wěn)定性。
在穩(wěn)定劑存在下，90％以上的未被輻射的分子具有高于60℃的熱穩(wěn)定性，因此，在60℃巴氏滅菌時(shí)能夠避免熱損害。雖然大多數(shù)被輻射的分子在CA和AT存在下也是穩(wěn)定的，但是有一部分(10-15％)分子還是具有低于60℃的穩(wěn)定性。這部分分子在巴氏滅菌時(shí)預(yù)計(jì)會(huì)發(fā)生不可逆的變性。
在巴氏滅菌之前和之后被輻射的和未被輻射的白蛋白的DSC分析顯示，具有低于60℃的熱穩(wěn)定性的部分在加熱過(guò)程中轉(zhuǎn)化成了變性的形式。被輻射的白蛋白的變性躍遷峰在巴氏滅菌后變得更加協(xié)同，這表明富含天然結(jié)構(gòu)，而轉(zhuǎn)化成變性形式的低穩(wěn)定性白蛋白分子則很少。
使用HPLC來(lái)測(cè)定γ輻射和巴氏滅菌后白蛋白的質(zhì)量復(fù)原率。使用Peak Fit程序，由這些形式的峰百分比來(lái)評(píng)估單體、多聚體和低分子量碎片數(shù)量。輻射后質(zhì)量的損失主要與少量聚合物(～2％)的形成有關(guān)。
以作為蛋白結(jié)構(gòu)完整性標(biāo)志的穩(wěn)定焓的DSC分析為基礎(chǔ)，來(lái)確定γ輻射和巴氏滅菌后白蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)原百分比。得自被γ輻射的糊的白蛋白的復(fù)原率為81-82％，其接近于先前對(duì)得自被輻射的PPF粉末的白蛋白所評(píng)估的78-80％。當(dāng)把市售穩(wěn)定劑CA和AT以4mM的濃度分別或組合加入時(shí)，在白蛋白的復(fù)原百分率方面沒(méi)有觀察到顯著的差別。
被γ輻射的白蛋白的巴氏滅菌導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的額外約10％的損失，這時(shí)由于在60℃加熱10個(gè)小時(shí)期間，去穩(wěn)定化的分子群體的變性所致。
在巴氏滅菌以及隨后在pH4.9、10mM Na-Ac緩沖液中為通過(guò)沉淀而除去受損分子所進(jìn)行的透析之后，被輻射的白蛋白的HPLC分析顯示，在透析和通過(guò)離心除去不溶材料之后，由巴氏滅菌導(dǎo)致的交聯(lián)聚集體的量顯著減少了。然而，這種方法的缺點(diǎn)在于，盡管可以優(yōu)先除去70％聚集的材料，但是在pH4.9的透析期間，有相當(dāng)數(shù)量的完整蛋白也被除去了。
保護(hù)性添加劑的選擇是以它們的清除能力和乙醇/水溶解性為基礎(chǔ)。添加劑在有機(jī)和水溶液中具有不同溶解度的能力是必需的，這樣在它們是實(shí)質(zhì)可溶的時(shí)，能夠保護(hù)糊(有機(jī)母液)中的蛋白，而當(dāng)不溶時(shí)，在水溶液中重新配制時(shí)就有助于它們的除去。
為了均勻分布并溶解在有機(jī)環(huán)境中，在0℃將清除劑和穩(wěn)定劑加到白蛋白糊中。將含有添加劑的糊冷凍以為在-80℃下為輻射做準(zhǔn)備。然后從被輻射的和未被輻射的糊中純化出白蛋白。
在不同清除劑存在下于-72℃被輻射至50kGy(4.6kGy/小時(shí))的得自糊的白蛋白的SDS PAGE表明，輻射導(dǎo)致了全部材料的約10％發(fā)生裂解，其在清除劑存在下并沒(méi)有被改善。
根據(jù)DSC比較在不同穩(wěn)定劑存在下的Fraction V白蛋白的結(jié)構(gòu)復(fù)原率表明，在月桂酸(91％)和維生素E(87.3％)存在下觀察到了最佳的白蛋白復(fù)原率。然而，雖然白蛋白的復(fù)原率看上去很高，但是這些數(shù)據(jù)沒(méi)有反映出完整情況，因?yàn)樵谒星闆r下，與沒(méi)有清除劑存在相比，蛋白的總收率是約40％。存在的添加劑顯著改變了白蛋白的溶解度，朝著形成不溶性聚集體的方向改變。
實(shí)施例12在本試驗(yàn)中，在有或沒(méi)有SDS存在下對(duì)白蛋白進(jìn)行輻射。
結(jié)果存在的100μM SDS提高了在PBS緩沖液(pH7.0)中于64-80.5℃測(cè)定的白蛋白的熱穩(wěn)定性。在這樣的低濃度下，眾所周知是強(qiáng)變性劑的SDS對(duì)白蛋白結(jié)構(gòu)有相反影響，將其穩(wěn)定了20℃以上。這表明SDS對(duì)白蛋白有特異結(jié)合親和力，與脂肪酸例如月桂酸相差不大。
將SDS加到在沒(méi)有SDS的情況下進(jìn)行輻射的白蛋白中，僅穩(wěn)定了沒(méi)有被γ輻射損害的白蛋白。正如所看到的那樣，在γ輻射之后，78％的蛋白保持其結(jié)合SDS的能力，而25％的分子失去了這種能力并且不能被穩(wěn)定。配體結(jié)合測(cè)試使得易于將未被輻射損害的天然分子與失去其天然結(jié)合性質(zhì)的分子鑒別開和分離出來(lái)。失去其天然結(jié)合性質(zhì)的白蛋白分子在60℃的熱處理下不能存活，因此在巴氏滅菌后產(chǎn)生變性的材料。巴氏滅菌的材料的熱容量峰缺乏在巴氏滅菌之前觀察到的低穩(wěn)定性群體，在形狀上與未被輻射的蛋白的熱容量峰類似。該觀察還證實(shí)了，在巴氏滅菌之后，通過(guò)能將天然白蛋白與變性形式白蛋白區(qū)別開的方法(例如僅與天然形式相互作用的配體結(jié)合基質(zhì))可將天然白蛋白與被輻射的部分分離來(lái)。
在沒(méi)有和有100μM SDS存在下被輻射的白蛋白的DSC表明，在部分熱容量的預(yù)變性值方面有顯著差別，這意味著在輻射期間，存在的SDS保護(hù)蛋白不轉(zhuǎn)化成變性狀態(tài)。依據(jù)該熱動(dòng)力學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，與在SDS存在下相比，在沒(méi)有SDS存在的情況下被輻射的白蛋白含有更多的變性材料。
在巴氏滅菌之前和之后，在沒(méi)有SDS存在的情況下被輻射的相同白蛋白樣本的HPLC分析表明，在60℃將這些樣本(在沒(méi)有SDS的情況下被輻射的)巴氏滅菌10.5小時(shí)導(dǎo)致出現(xiàn)了交聯(lián)的聚集體。這些高M(jìn)W聚集體得自在輻射期間已經(jīng)變性，并且在巴氏滅菌期間熱穩(wěn)定性低于60℃的分子群體。在γ輻射期間沒(méi)有被損害，因此能夠被SDS穩(wěn)定的白蛋白分子在熱巴氏滅菌期間可以保持其完整性。
這些樣本的SDS PAGE分析表明，如果白蛋白被γ輻射損害，并且轉(zhuǎn)化成變性形式，則變性的分子在10小時(shí)的巴氏滅菌期間形成S-S交聯(lián)聚集體。主要呈天然形式的未被輻射的白蛋白在巴氏滅菌期間不表現(xiàn)出聚集。
本試驗(yàn)證實(shí)，存在的SDS不僅在巴氏滅菌期間可提高白蛋白復(fù)原率(當(dāng)其把白蛋白熱穩(wěn)定性提高至60℃以上時(shí))，而且在輻射期間也能提高其在γ輻射之后的復(fù)原率。
為了確定對(duì)白蛋白有最大保護(hù)作用，同時(shí)不將白蛋白變性的最佳SDS濃度，在兩個(gè)冷凍和冷凍干燥的制劑中測(cè)定在不同濃度的SDS下蛋白的復(fù)原率。使用下列輻射條件50kGy，4kGy/小時(shí)，-72℃。
如下所述制備含有SDS的樣本將SDS加到由Fraction V糊中純化的白蛋白中。根據(jù)SDS(288.38Da)和白蛋白(66470Da)的MW計(jì)算摩爾比。將樣本在-53℃冷凍干燥至水分含量約為10％(未預(yù)先測(cè)定)。在冰浴(-72℃)上，將冷凍干燥的樣本以1.42kGy/小時(shí)的速率輻射至50kGy，輻射后，將粉末在PBS緩沖液，pH7.0中重新配制。根據(jù)該試驗(yàn)的特定目的，將重新配制的樣本稀釋至特定生物物理測(cè)定或用PBS緩沖液透析所需的濃度。
用5％白蛋白進(jìn)行另一組試驗(yàn)。除了在濃度分別為4mM的市售穩(wěn)定劑AT和CA存在下，該白蛋白與得自糊的白蛋白的結(jié)構(gòu)特征方面沒(méi)有表現(xiàn)出任何差別。將SDS加到產(chǎn)品中，將樣本在干冰上以冷凍狀態(tài)輻射至50kGy，1.415kGy/小時(shí)。
在巴氏滅菌之前和之后，在有和沒(méi)有SDS存在下的5％白蛋白的被輻射和對(duì)照樣本的SDS PAGE分析表明，以1∶10的摩爾比存在的SDS使得S-S交聯(lián)聚集體消失，其可用于在沒(méi)有SDS存在的情況下在巴氏滅菌之后觀察，以1∶1的摩爾比存在的SDS不足以保護(hù)蛋白不形成聚集體。
被輻射的白蛋白樣本的HPLC分析表明，γ輻射僅導(dǎo)致二聚體和多聚體含量的少量增加，而在60℃的熱處理導(dǎo)致經(jīng)由分子間S-S交聯(lián)生成了大量高M(jìn)W聚集體。在1∶10摩爾比的SDS存在下的白蛋白的HPLC分析表明，該濃度的SDS白蛋白完全保護(hù)了被輻射的白蛋白不發(fā)生聚集，使得其不能與未被輻射的蛋白區(qū)別開。
在沒(méi)有和有SDS存在下在液體制劑中被輻射的白蛋白的DSC分析表明，存在的SDS不僅在輻射期間提高了白蛋白的熱穩(wěn)定性，更重要的是，其顯著提高了在輻射后的蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)原率。與在沒(méi)有SDS存在的情況下被輻射的白蛋白相比，在SDS存在下的蛋白復(fù)原率提高了90％。在量熱曲線上的被輻射的白蛋白的吸熱峰的位置表明，有90％以上的被輻射的分子具有60℃以上的穩(wěn)定性，預(yù)計(jì)這對(duì)于在60℃進(jìn)行巴氏滅菌時(shí)保護(hù)蛋白是很重要的。
巴氏滅菌后，被輻射和未被輻射的白蛋白的DSC分析表明，在沒(méi)有SDS存在的情況下，巴氏滅菌使得被輻射的樣本幾乎有20％的白蛋白發(fā)生了變性，而在SDS存在下，巴氏滅菌不影響蛋白結(jié)構(gòu)。SDS對(duì)白蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用保護(hù)了被輻射的蛋白在巴氏滅菌期間不被損害。
在不同量SDS存在下的γ輻射和巴氏滅菌之后的白蛋白的結(jié)構(gòu)復(fù)原率表明，以1∶1蛋白/SDS摩爾比存在的SDS僅輕微地提高了在輻射期間的蛋白復(fù)原率。然而，在該濃度下，在巴氏滅菌期間其不保護(hù)被輻射的白蛋白不發(fā)生變性。相反，當(dāng)?shù)鞍?SDS摩爾比增加至1∶10時(shí)，其提高了保護(hù)蛋白免受γ輻射和巴氏滅菌損害的穩(wěn)定性。
雖然已充分描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可在不背離本發(fā)明范圍或其任何實(shí)施方案的情況下，用寬且等同的條件、制劑以及其它參數(shù)范圍來(lái)實(shí)施本發(fā)明方法。
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權(quán)利要求
1.用于將含有對(duì)輻射敏感的白蛋白的制劑滅菌的方法，所述方法包括(i)將至少一種穩(wěn)定劑以有效保護(hù)所述含有白蛋白的制劑免受所述輻射損害的量加到所述含有白蛋白的制劑中；和(ii)用適宜的射線以有效速率將所述含有白蛋白的制劑照射能將所述含有白蛋白的制劑有效滅菌的時(shí)間。
2.用于將含有對(duì)輻射敏感的白蛋白的制劑滅菌的方法，所述方法包括(i)將所述含有白蛋白的制劑的殘余溶劑含量降低到有效保護(hù)所述含有白蛋白的制劑免受所述輻射損害的水平；和(ii)用適宜的射線以有效速率將所述含有白蛋白的制劑照射能將含有白蛋白的制劑有效滅菌的時(shí)間。
3.用于將含有對(duì)輻射敏感的白蛋白的制劑滅菌的方法，所述方法包括(i)將所述含有白蛋白的制劑的溫度降低到有效保護(hù)所述含有白蛋白的制劑免受所述輻射損害的水平；和(ii)用適宜的射線以有效速率將所述含有白蛋白的制劑輻射能將含有白蛋白的制劑有效滅菌的時(shí)間。
4.用于將含有對(duì)輻射敏感的白蛋白的制劑滅菌的方法，所述方法包括(i)給所述含有白蛋白的制劑施加至少一種選自下列的穩(wěn)定化處理(a)降低所述含有白蛋白的制劑的殘余溶劑含量，(b)降低所述含有白蛋白的制劑的溫度，和(c)將至少一種穩(wěn)定劑加到所述含有白蛋白的制劑中；和(ii)用適宜的射線以有效速率將所述含有白蛋白的制劑照射能將含有白蛋白的制劑有效滅菌的時(shí)間，其中所述至少一種穩(wěn)定化處理和輻射速率一起有效地保護(hù)所述含有白蛋白的制劑免受所述輻射損害。
5.用于將含有對(duì)輻射敏感的白蛋白的制劑滅菌的方法，所述方法包括(i)給所述含有白蛋白的制劑施加至少兩種選自下列的穩(wěn)定化處理(a)降低所述含有白蛋白的制劑的殘余溶劑含量，(b)降低所述含有白蛋白的制劑的溫度，和(c)將至少一種穩(wěn)定劑加到所述含有白蛋白的制劑中；和(ii)用適宜的射線以有效速率將所述含有白蛋白的制劑輻射能將含有白蛋白的制劑有效滅菌的時(shí)間，其中所述至少兩種穩(wěn)定化處理一起有效地保護(hù)所述含有白蛋白的制劑免受所述輻射損害，并且其中所述至少兩種穩(wěn)定化處理可以以任何次序進(jìn)行。
6.按照權(quán)利要求2、4或5的方法，其中所述溶劑是水。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其中通過(guò)加入有機(jī)溶劑來(lái)降低所述殘余水含量。
8.按照權(quán)利要求2、4或5的方法，其中所述溶劑是有機(jī)溶劑。
9.按照權(quán)利要求2、4或5的方法，其中在將所述殘余溶劑含量降低后，將所述含有白蛋白的制劑懸浮在有機(jī)溶劑中。
10.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率不超過(guò)約3.0kGy/小時(shí)。
11.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率不超過(guò)約2.0kGy/小時(shí)。
12.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率不超過(guò)約1.0kGy/小時(shí)。
13.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率不超過(guò)約0.3kGy/小時(shí)。
14.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率超過(guò)約3.0kGy/小時(shí)。
15.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率是至少約6.0kGy/小時(shí)。
16.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率是至少約18.0kGy/小時(shí)。
17.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率是至少約30.0kGy/小時(shí)。
18.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述有效速率是至少約45kGy/小時(shí)。
19.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述含有白蛋白的制劑保持在低氧氣氛中。
20.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述含有白蛋白的制劑保持在含有至少一種稀有氣體的氣氛中。
21.按照權(quán)利要求20的方法，其中所述稀有氣體是氬。
22.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述含有白蛋白的制劑保持在真空中。
23.按照權(quán)利要求2、4或5的方法，其中用選自下列的方法將所述殘余溶劑含量降低凍干、干燥、濃縮、加入溶質(zhì)、蒸發(fā)、化學(xué)萃取、噴霧干燥和玻璃化。
24.按照權(quán)利要求2、4或5的方法，其中所述殘余溶劑含量小于約15％。
25.按照權(quán)利要求2、4或5的方法，其中所述殘余溶劑含量小于約10％。
26.按照權(quán)利要求2、4或5的方法，其中所述殘余溶劑含量小于約3％。
27.按照權(quán)利要求2、4或5的方法，其中所述殘余溶劑含量小于約2％。
28.按照權(quán)利要求2、4或5的方法，其中所述殘余溶劑含量小于約1％。
29.按照權(quán)利要求2、4或5的方法，其中所述殘余溶劑含量小于約0.5％。
30.按照權(quán)利要求2、4或5的方法，其中所述殘余溶劑含量小于約0.08％。
31.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中在所述照射所述含有白蛋白的制劑的步驟之前，把至少一種增敏劑加到所述含有白蛋白的制劑中。
32.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述含有白蛋白的制劑含有至少一種選自下列的生物污染物或病原體病毒、細(xì)菌、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或單獨(dú)或聯(lián)合引起TSE的類似物和/或單細(xì)胞或多細(xì)胞寄生物。
33.按照權(quán)利要求1、4或5的方法，其中所述至少一種穩(wěn)定劑是抗氧化劑。
34.按照權(quán)利要求1、4或5的方法，其中所述至少一種穩(wěn)定劑是自由基清除劑。
35.按照權(quán)利要求1、4或5的方法，其中所述至少一種穩(wěn)定劑是聯(lián)合穩(wěn)定劑。
36.按照權(quán)利要求1、4或5的方法，其中所述至少一種穩(wěn)定劑是配體。
37.按照權(quán)利要求36的方法，其中所述配體是肝素。
38.按照權(quán)利要求1、4或5的方法，其中所述至少一種穩(wěn)定劑減輕反應(yīng)性氧物質(zhì)引起的損害。
39.按照權(quán)利要求1、4或5的方法，其中所述至少一種穩(wěn)定劑選自抗壞血酸或其鹽或酯；谷胱甘肽；6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸；尿酸或其鹽或酯；蛋氨酸；組氨酸；N-乙酰半胱氨酸；硫辛酸；甲醛次硫酸鈉；五倍子酸或其衍生物；五倍子酸丙酯和它們兩種或多種的混合物。
40.按照權(quán)利要求39的方法，其中所述兩種或多種附加穩(wěn)定劑的混合物選自抗壞血酸、或其鹽或酯與尿酸、或其鹽或酯的混合物；抗壞血酸、或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸的混合物；抗壞血酸、或其鹽或酯、尿酸、或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸的混合物；和尿酸、或其鹽或酯；硫辛酸；甲醛次硫酸鈉；五倍子酸或其衍生物；五倍子酸丙酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸的混合物。
41.按照權(quán)利要求1、4或5的方法，其中所述至少一種穩(wěn)定劑是二肽類穩(wěn)定劑。
42.按照權(quán)利要求41的方法，其中所述二肽類穩(wěn)定劑選自甘氨?；?甘氨酸(Gly-Gly)、肌肽和鵝肌肽。
43.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述輻射是粒子輻射或電磁輻射或它們的混合物。
44.按照權(quán)利要求43的方法，其中所述電磁輻射選自無(wú)線電波、微波、可見和不可見光、紫外線、X-射線輻射、γ輻射和它們的聯(lián)合。
45.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述輻射是γ輻射。
46.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述輻射是E-射線輻射。
47.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述輻射是可見光。
48.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述輻射是紫外線。
49.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述輻射是X-射線輻射。
50.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述輻射是多色可見光。
51.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述輻射是紅外線。
52.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述輻射是一種或多種波長(zhǎng)的可見光與紫外線的聯(lián)合。
53.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述輻射是在室溫進(jìn)行的。
54.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述輻射是在低于室溫的溫度進(jìn)行的。
55.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述輻射是在低于所述含有白蛋白的制劑的冰點(diǎn)的溫度進(jìn)行的。
56.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述輻射是在低于所述含有白蛋白的制劑的低共熔點(diǎn)的溫度進(jìn)行的。
57.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述輻射是在高于室溫的溫度進(jìn)行的。
58.組合物，其中包含至少一種含有白蛋白的制劑和一定量的至少一種穩(wěn)定劑，其中所述量的穩(wěn)定劑能有效保護(hù)所述含有白蛋白的制劑在用輻射滅菌后仍可實(shí)現(xiàn)其預(yù)期應(yīng)用。
59.包含至少一種含有白蛋白的制劑的組合物，其中所述含有白蛋白的制劑的殘余溶劑含量處于能有效保護(hù)所述含有白蛋白的制劑在用輻射滅菌后仍可實(shí)現(xiàn)其預(yù)期應(yīng)用的水平上。
60.權(quán)利要求59的組合物，其中所述殘余溶劑含量低于約15％。
61.權(quán)利要求59的組合物，其中所述殘余溶劑含量低于約10％。
62.權(quán)利要求59的組合物，其中所述殘余溶劑含量低于約5％。
63.權(quán)利要求59的組合物，其中所述殘余溶劑含量低于約2％。
64.權(quán)利要求59的組合物，其中所述殘余溶劑含量低于約1％。
65.權(quán)利要求59的組合物，其中所述殘余溶劑含量低于約0.5％。
66.權(quán)利要求59的組合物，其中所述殘余溶劑含量低于約0.08％。
67.權(quán)利要求58或59的組合物，其中所述含有白蛋白的制劑是玻璃狀或玻璃化的。
68.權(quán)利要求58或59的組合物，其中所述含有白蛋白的制劑還包含至少一種選自單克隆免疫球蛋白、多克隆免疫球蛋白、糖苷酶、硫酸酯酶、尿激酶、凝血酶和因子VIII的蛋白。
69.權(quán)利要求59的組合物，其中所述含有白蛋白的制劑的蛋白濃度為至少約0.5％。
70.權(quán)利要求59的組合物，其中所述含有白蛋白的制劑的蛋白濃度為至少約1％。
71.權(quán)利要求59的組合物，其中所述含有白蛋白的制劑的蛋白濃度為至少約5％。
72.權(quán)利要求59的組合物，其中所述含有白蛋白的制劑的蛋白濃度為至少約10％。
73.權(quán)利要求59，其中所述含有白蛋白的制劑的蛋白濃度為至少約15％。
74.權(quán)利要求59的組合物，其中所述含有白蛋白的制劑的蛋白濃度為至少約20％。
75.權(quán)利要求59，其中所述含有白蛋白的制劑的蛋白濃度為至少約25％。
76.權(quán)利要求59的組合物，其中所述含有白蛋白的制劑的蛋白濃度為至少約50％。
77.權(quán)利要求59的組合物，其中所述含有白蛋白的制劑的蛋白濃度能有效地保護(hù)所述含有白蛋白的制劑免受輻射損害。
78.按照權(quán)利要求6的方法，其中在將所述殘余溶劑含量降低后，將所述含有白蛋白的制劑懸浮在有機(jī)溶劑中。
79.治療血容量減少性休克的方法，包括對(duì)有此需要的人給藥有效量的含有白蛋白的制劑，其中所述制劑已經(jīng)按照權(quán)利要求1、2、3、4、或5的方法進(jìn)行過(guò)滅菌。
80.治療燒傷的方法，包括對(duì)有此需要的人給藥有效量的含有白蛋白的制劑，其中所述制劑已經(jīng)按照權(quán)利要求1、2、3、4、或5的方法進(jìn)行過(guò)滅菌。
81.在接受心肺旁路術(shù)的患者中保持液體容量方法，包括對(duì)有此需要的人給藥有效量的含有白蛋白的制劑，其中所述制劑已經(jīng)按照權(quán)利要求1、2、3、4、或5的方法進(jìn)行過(guò)滅菌。
82.治療急性肝功能衰竭的方法，包括對(duì)有此需要的人給藥有效量的含有白蛋白的制劑，其中所述制劑已經(jīng)按照權(quán)利要求1、2、3、4、或5的方法進(jìn)行過(guò)滅菌。
83.在患有選自下列的病癥的患者中預(yù)防富含蛋白質(zhì)的流體螯合的方法急性腹膜炎、胰腺炎、縱隔炎和過(guò)度蜂窩織炎，所述方法包括對(duì)有此需要的人給藥有效量的含有白蛋白的制劑，其中所述制劑已經(jīng)按照權(quán)利要求1、2、3、4、或5的方法進(jìn)行過(guò)滅菌。
84.治療低白蛋白血癥的方法，包括對(duì)有此需要的人給藥有效量的含有白蛋白的制劑，其中所述制劑已經(jīng)按照權(quán)利要求1、2、3、4、或5的方法進(jìn)行過(guò)滅菌。
85.治療有或沒(méi)有水腫的低蛋白血癥的方法，包括對(duì)有此需要的人給藥有效量的含有白蛋白的制劑，其中所述制劑已經(jīng)按照權(quán)利要求1、2、3、4、或5的方法進(jìn)行過(guò)滅菌。
86.治療成人呼吸窘迫綜合癥的方法，包括對(duì)有此需要的人給藥有效量的含有白蛋白的制劑，其中所述制劑已經(jīng)按照權(quán)利要求1、2、3、4、或5的方法進(jìn)行過(guò)滅菌。
87.治療新生兒溶血疾病的方法，包括對(duì)有此需要的人給藥有效量的含有白蛋白的制劑，其中所述制劑已經(jīng)按照權(quán)利要求1、2、3、4、或5的方法進(jìn)行過(guò)滅菌。
88.治療急性腎病的方法，包括對(duì)有此需要的人給藥有效量的含有白蛋白的制劑，其中所述制劑已經(jīng)按照權(quán)利要求1、2、3、4、或5的方法進(jìn)行過(guò)滅菌。
89.在經(jīng)受腎透析的患者中預(yù)防休克或低血壓的方法，包括對(duì)有此需要的人給藥有效量的含有白蛋白的制劑，其中所述制劑已經(jīng)按照權(quán)利要求1、2、3、4、或5的方法進(jìn)行過(guò)滅菌。
90.治療由于燒傷、擠壓傷、腹部急癥、脫水、感染或其中血漿流體而不是紅細(xì)胞顯著損失的其它原因引起的休克的方法，所述方法包括對(duì)有此需要的人給藥有效量的含有白蛋白的制劑，其中所述制劑已經(jīng)按照權(quán)利要求1、2、3、4、或5的方法進(jìn)行過(guò)滅菌。
91.治療由于出血引起的休克的方法，包括對(duì)有此需要的人給藥有效量的含有白蛋白的制劑，其中所述制劑已經(jīng)按照權(quán)利要求1、2、3、4、或5的方法進(jìn)行過(guò)滅菌。
92.培養(yǎng)細(xì)胞的改進(jìn)方法，其中所述改進(jìn)包括將含有白蛋白的制劑加到培養(yǎng)所述細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，所述制劑已經(jīng)按照權(quán)利要求1、2、3、4、或5的方法進(jìn)行過(guò)滅菌。
93.通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)細(xì)胞代謝產(chǎn)品的改進(jìn)方法，其中所述改進(jìn)包括將含有白蛋白的制劑加到培養(yǎng)所述細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，所述制劑已經(jīng)按照權(quán)利要求1、2、3、4、或5的方法進(jìn)行過(guò)滅菌。
94.按照權(quán)利要求93的方法，其中所述產(chǎn)品是蛋白。
95.按照權(quán)利要求93的方法，其中所述產(chǎn)品是重組蛋白。
96.權(quán)利要求58或59的組合物，其中所述含有白蛋白的制劑還包含選自下列的至少一種生物材料血紅蛋白、抗凝血酶III、多糖、疫苗、膠原、明膠、胰蛋白酶、胎牛血清、運(yùn)鐵蛋白、胰島素、人生長(zhǎng)激素、因子IX、纖維蛋白原、因子XIII、因子XIIIa、因子VII、因子VIIa、生長(zhǎng)因子、免疫毒素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、成骨蛋白、細(xì)胞因子、因子XI和血漿。
97.權(quán)利要求58或59的組合物，其中所述含有白蛋白的制劑還包含選自下列的至少一種組織心臟瓣膜、皮膚、骨、血管、神經(jīng)、韌帶和角膜。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于將含有白蛋白的制劑滅菌，以降低其中一種或多種活性生物污染物或病原體的含量的方法，所述活性生物污染物或病原體是例如病毒、細(xì)菌(包括細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，例如支原體屬、尿原體屬、nanobacteria、衣原體屬、立克次氏體)、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或單獨(dú)或聯(lián)合引起TSEs的類似物和/或單細(xì)胞或多細(xì)胞寄生物。這些方法涉及用輻射法將含有白蛋白的制劑例如血漿蛋白組分滅菌的方法。
文檔編號(hào)A61P7/06GK1606457SQ02818098
公開日2005年4月13日 申請(qǐng)日期2002年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月31日
發(fā)明者Y·格里科, S·I·米卡, W·H·伯格斯, W·N·德羅翰, M·J·馬科菲, R·S·肯特, D·M·曼恩 申請(qǐng)人:克里蘭特公司