專利名稱：分離酚類化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從植物原料中分離酚類化合物的方法，更具體的是，本發(fā)明涉及從植物原料如大豆提取物中分離異黃酮的方法。
背景技術(shù)：
植物是生物活性化合物的天然倉庫。獲得這種豐富多樣的化合物的主要困難在于難以分離各種化合物。異黃酮是一類人們感興趣的含有酚的植物類黃酮化合物，被認(rèn)為對哺乳動(dòng)物具有許多有利于健康的作用。例如，異黃酮對于絕經(jīng)期及圍絕經(jīng)期婦女出現(xiàn)的癥狀有療效。目前，15％的絕經(jīng)期婦女都在接受激素取代療法(HRT)，該療法使用動(dòng)物雌激素。來自動(dòng)物雌激素的HRT產(chǎn)品很有效，并且作用于所有的雌激素受體。這種療效與患乳腺癌及其它并發(fā)癥的危險(xiǎn)增大有關(guān)。由于植物異黃酮對雌激素受體的親和力較低，優(yōu)選它們來代替動(dòng)物雌激素。此外，一些研究表明異黃酮甚至可以防止或延緩某些癌癥，如乳腺癌和前列腺癌，并且具有降低血清膽固醇的作用。
盡管植物異黃酮具有有利的療效，但是許多患者并沒有增加異黃酮的攝入，尤其是可從大豆食物中獲得的那些，這是因?yàn)樵谠S多國家中各種基于大豆的食物已經(jīng)受到限制，并且由于許多人發(fā)現(xiàn)大豆食物的味道和顏色是苦的，且不能引起食欲。因此，要求提供一種從各種植物原料中分離異黃酮的方法，改善其純度、顏色、味道、溶解度以及保存穩(wěn)定性，以促進(jìn)這些有益養(yǎng)分摻入各種食物、飲料、食物補(bǔ)充物及藥品中。
發(fā)明概述本發(fā)明提供用于分離酚類化合物的方法，所述方法包括如下步驟(a)提供第一pH大于10的水性植物提取物，所述水性植物提取物包含許多酚類化合物；(b)用有機(jī)溶劑洗滌所述水性植物提取物；(c)將水性植物提取物調(diào)至pH小于9；
(d)從所述水性植物提取物中分離所述酚類化合物。
本發(fā)明還提供用于分離酚類化合物的方法，所述方法包括(a)提供第一pH小于10的水性植物提取物，所述水性植物提取物包含許多酚類化合物；(b)用第一有機(jī)溶劑提取所述水性植物提取物，產(chǎn)生第一有機(jī)提取物；(c)用pH大于10的水相提取所述第一有機(jī)提取物，產(chǎn)生富含苯酚的水相；(d)將所述富含苯酚的水相調(diào)至pH小于9；(e)從所述富含苯酚的水相中分離酚類化合物。
本發(fā)明也提供一種組合物，所述組合物包含(a)兩種或多種異黃酮，其中，異黃酮占所述組合物的15％以上(按重量計(jì))，(b)所述組合物在混合物中的溶解度約80％或以上，所述混合物在水中包含約0.03％組合物(按重量計(jì))。
本發(fā)明也提供一種異黃酮組合物，其中，在燃燒所述組合物時(shí)，灰分含量小于約25％。本發(fā)明也提供一種異黃酮組合物，其中所述組合物的L-色值大于約65。
本發(fā)明也提供一種異黃酮組合物，其中，所述組合物包含黃豆苷和染料木苷，黃豆苷和染料木苷的重量百分比大于1，且所述黃豆苷和染料木苷以糖苷配基或糖基化形式存在。
本發(fā)明也提供一種異黃酮組合物，其中，a)所述組合物的溶解度大于約90％，b)燃燒時(shí)，灰分含量小于約10％，c)所述組合物的L-色值大于約75，a-色值小于2。
d)所述組合物包含黃豆苷、glycitin和染料木苷，黃豆苷和染料木苷的重量百分比大于2，glycitin和染料木苷的重量百分比大于2，e)95％以上的異黃酮呈游離的糖苷形式。
除非另有說明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同意思。雖然也可以使用類似于或相等于本文所述的方法和材料來實(shí)施本發(fā)明，但是以下描述了合適的方法和材料。本文所述的所有出版物、專利申請、專利全文納入供參考。在有矛盾時(shí)，將參照本說明書包括定義。此外，所述原料、方法以及實(shí)施例僅用于說明，而不是用于限制本發(fā)明。
以下將詳細(xì)描述本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式。本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)從說明詳述和權(quán)利要求書中顯而易見。
詳細(xì)說明本發(fā)明提供用于從含酚類化合物的植物原料的水性提取物中分離酚類化合物，尤其是異黃酮的方法。本發(fā)明也提供異黃酮的組合物。所述方法利用溫度、溶劑和pH范圍從含異黃酮的粗水性植物提取物中發(fā)現(xiàn)的主要雜質(zhì)中分離酚類化合物。選擇性分配、提取、純化、分離和轉(zhuǎn)化所需異黃酮促使所需異黃酮的回收率、穩(wěn)定性和純度提高。所得異黃酮組合物的顏色、氣味、香味、溶解度和儲(chǔ)存期得到提高。
本發(fā)明使用調(diào)節(jié)溶液和混合物的pH值的方法?？梢允褂萌魏我阎膲A來升高水溶液或混合物的pH，包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化銫、氫氧化鋰或氨?？梢允褂迷S多已知的有機(jī)或無機(jī)酸來降低水溶液或混合物的PH值，包括乙酸、鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸、草酸、亞硫酸或者亞氯酸。
酚類化合物，尤其是含異黃酮的水性植物提取物可以通過本領(lǐng)域熟知的方法由含這種化合物的任何植物原料制備。含酚類化合物或者多酚化合物的植物原料包括但不限于果實(shí)、蔬菜、谷物、堅(jiān)果、茶、酒、禾本科植物等。本發(fā)明的方法可以使用含酚類化合物(在pH＞10時(shí)穩(wěn)定)的任何植物原料。所述含異黃酮的植物原料包括大豆、鷹嘴豆、紅三葉草、地下三葉草、落花生、黃芪、marama豆、刀豆、洋刀豆、海濱刀豆、carao豆、瓜爾豆、balu、扁豆、香草豌豆、印度野豌豆、青豆、今可豆、四棱豆、西印度豆薯、蠶豆、花生、濱豆、跳豆、苜蓿、絨毛黧豆、非洲角豆莢、音加屬豆科、塞浦路斯豌豆、yebnut、鳥柏樹、波利尼西亞粟樹、野葛根、油豆樹、牧豆樹、羅望子、胡蘆巴、印度甘草和野豆的植物和植物副產(chǎn)物，以及這種植物原料的制品如脫脂豆片、豆粉、大豆胚芽粉和豆渣。
如本文所述，術(shù)語“酚類化合物”包括含酚類亞單位的化合物。所述亞單位可以連接、鍵合或稠合到任何其它類型的分子結(jié)構(gòu)上。優(yōu)選的酚類化合物包括來自植物提取物的酚類化合物(植物酚類化合物)。其它優(yōu)選的酚類化合物包括酚類亞單位上具有一個(gè)以上羥基取代基的化合物，或者具有一個(gè)以上酚類亞單位的化合物(多酚化合物)。尤其優(yōu)選的多酚化合物來自植物提取物(植物多酚化合物)。多酚化合物包括但不限于酚酸和類黃酮。
如本文所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解術(shù)語“類黃酮”(見例如，H.Merken和G..Beecher，J.of Agricultural and Food Chemistry，第48卷，No.3.，2000)，包括但不限于花色素、黃酮/黃酮醇、黃烷酮以及原花色素。
類黃酮通式(在黃酮中R＝H，在黃酮醇中R＝OH)
黃烷酮通式
Rut＝蕓香糖苷(rutinoside)
Neo＝neosesperidose黃酮醇通式
Rut＝蕓香糖Gla＝半乳糖Glu＝葡萄糖Rham＝鼠李糖黃酮通式
Rut＝蕓香糖Gla＝半乳糖Glu＝葡萄糖Rham＝鼠李糖花色素通式
異黃酮通式
表1.糖苷配基異黃酮通式
大豆中發(fā)現(xiàn)的糖基化異黃酮具有以下結(jié)構(gòu)式(結(jié)構(gòu)2)，如表中進(jìn)一步說明。
糖基化異黃酮通式
具體的是，含異黃酮的水性植物提取物可以由大豆或苜蓿制備，已知它們含提高濃度的異黃酮。例如，水性植物提取物可以由大豆、大豆餅粕、大豆片、大豆粉、大豆胚芽、大豆胚芽粉、大豆汁(也稱為大豆溶解液)、Novasoy_、大豆乳清或者任何其它濃縮的異黃酮產(chǎn)品制備。大豆胚芽部分尤其適于用作原料，因?yàn)橄啾绕渌拇蠖共糠郑鼈儼吆?約2重量％/單位重量)異黃酮。已知用于從大豆制備大豆餅粕、大豆片、大豆粉、大豆胚芽、大豆胚芽粉、大豆汁(已稱為大豆溶解液)、Novasoy_和大豆乳清的方法。(可見，例如EricksonD.R.，《大豆加工和利用的實(shí)踐手冊》(Practical Handbook of SoybeanProcessing and Utilization)，AOCS Press，1995和美國專利5,702,752，描述了制備大豆汁的方法)。大豆乳清是由等電或二價(jià)陽離子沉淀所述溶解部分而形成的液體，所述溶解部分由U.S.6,033,714中所述將大豆加工成大豆食物的工藝制得。Novasoy_已描述為來自大豆的產(chǎn)品，它從Archer DanielsMidland Company獲得。
當(dāng)使用大豆或大豆胚芽作為原料時(shí)，它們可以用常規(guī)熟知的油分離方法預(yù)處理。(可見，例如Wan Peter J.，《萃取油籽和非石油油類的技術(shù)和溶劑》(Technology and Solvents for Extracting Oilseeds and Nonpetroleum Oils)，AOCS Press，1997。)例如，輾碎大豆原料、脫殼、壓成片并用有機(jī)溶劑如己烷提取。在除去溶劑之后，可用含水乙醇提取所述來自油提取所得的大豆餅粕或者白色薄片，例如在60-80℃下使用乙醇。在提取之后，優(yōu)先但不需要將所得pH接近中性(約6-8)的水性植物提取粗液中的醇除去。因此，本發(fā)明所用的水性植物提取物常含有殘量的其它各種溶劑。例如可見U.S.6,132,795，舉例說明了用于從植物原料中制備含異黃酮的水性植物提取粗液的其它常規(guī)方法。
如上所述，水性植物提取物可以直接用作本發(fā)明工藝中的原料。或者，在按照本發(fā)明加工之前，使水性植物提取液進(jìn)行其它預(yù)純化步驟。已知其它預(yù)純化步驟，包括但不限于超濾和吸附色譜。此外，預(yù)純化還可以包括對植物提取物進(jìn)行噴霧干燥和重結(jié)晶。例如可見，美國專利號.5,702,752、5,792,503、6,033,714和6,171,638。所得含酚類或異黃酮的部分在按照本發(fā)明所述工藝之前可以適當(dāng)處理，和/或再懸浮在水溶液中。
大豆和大豆食物是異黃酮的普通飲食來源。大豆中存在的異黃酮包括異黃酮糖苷配基和異黃酮糖苷，其中葡萄糖分子通過糖苷鍵連接到異黃酮主鏈上。大豆中存在的異黃酮糖苷配基包括但不限于黃豆苷原、染料木黃酮和黃豆黃素。大豆中存在的異黃酮糖苷化合物包括黃豆苷、染料木苷、glycitin、6″-O-乙?；S豆苷、6″-O-乙酰基染料木苷、6″-O-乙?；鵪lycitin、6″-O-丙二酰黃豆苷、6″-O-丙二酰染料木苷和6″-O-丙二酰glycitin。所述6″-O-乙?；慄S酮和6″-O-丙二酰異黃酮是葡萄糖分子在6位上的酯化衍生物。大豆中約97-98％天然存在的異黃酮均為糖基化形式。
包含異黃酮的水性醇提取粗液中的主要雜質(zhì)是皂角苷、低聚糖和蛋白質(zhì)。異黃酮和所述主要雜質(zhì)之間的一個(gè)差異是異黃酮含酚部分，而皂角苷和低聚糖則沒有。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)包含酚部分時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度和分配通常不受這些酚基控制。低聚糖和皂角苷通常溶于極性溶劑，而不論其PH值，蛋白質(zhì)則被有機(jī)溶劑變性。令人感興趣的是，異黃酮中的酚部分使它們可溶于極性或非極性(水性或有機(jī))溶劑中，這取決于所述溶劑的pH。
本發(fā)明意識到，在如上所述獲得水性植物提取物之后，可以使用如下所述的方法分離異黃酮。
流程I 最初，處理水性醇提取物，以降低存在的醇量。這種降低有助于后續(xù)提取的效率。降低醇量可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，包括在常壓或減壓條件下共沸蒸餾，通常包括加入水。
在步驟a)中，水性植物提取物的pH可以調(diào)至約為6-8的中性pH，并用不混溶的有機(jī)溶劑提取，產(chǎn)生第一有機(jī)提取粗物。所述提取過程可以使用本發(fā)明已知的方法進(jìn)行，常包括多次洗滌混合物，由此制得提取物。有用的有機(jī)溶劑包括1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、己烷、庚烷、辛烷、異己烷、二乙醚、甲基乙基酮、二異丙醚或者其它醚、或者其它不和水混溶的極性或非極性有機(jī)溶劑，或者這些溶劑的混合物。在這一階段中，所述異黃酮主要在有機(jī)提取物中，而一些蛋白質(zhì)、低聚糖和皂角苷則留在水相中。
或者，在第一次有機(jī)提取前，可以在高pH或低pH下預(yù)處理所述水性植物提取物，便于后續(xù)的提取。通過暴露在酸性或堿性條件下，植物提取物中所含的許多組分會(huì)改性。這些改性可以改變各種化合物的溶解度，根據(jù)所需產(chǎn)物使它們更容易或更難分離。為了提取異黃酮糖苷，優(yōu)選在第一提取步驟前在高pH條件下預(yù)處理所述水性植物提取物。在10-12、11-12，或者具體pH如11.1、11.2、11.3、11.4或11.5，或其間任一值下進(jìn)行處理，可以將乙酰基異黃酮和丙二酰異黃酮衍生物轉(zhuǎn)化成糖基化結(jié)構(gòu)2，其中R3是氫。技術(shù)人員意識到，通過升高溫度可以提高這些改性過程的速率。但是，若溫度升得太高，則會(huì)出現(xiàn)不良的副反應(yīng)或副產(chǎn)物。因此，在某些情況下，優(yōu)選在低溫度下進(jìn)行較長時(shí)間的反應(yīng)。優(yōu)選pH調(diào)節(jié)的提取物的溫度升至40℃以上。所述溫度可以升至42-65℃，55-65℃，57-62℃，或者升至具體的溫度如60℃或者其間任一值。優(yōu)選將提取物的pH調(diào)至11.3，加熱至45℃，維持30分鐘，并在接著的提取步驟中冷卻至接近室溫，并將pH調(diào)至接近中性。
在步驟b)中，用pH＞10，優(yōu)選pH＞11的水溶液提取所述第一有機(jī)提取物，得到富含異黃酮的水性提取物。所述提取物的具體pH并不是關(guān)鍵，而是由待提取化合物的pKa決定。在異黃酮的情況下，優(yōu)選接近10-12的pH來驅(qū)動(dòng)平衡至大多數(shù)的酚基脫質(zhì)子的程度，且所得的鹽是水溶的。尤其優(yōu)選pH為11.2-11.5。技術(shù)人員意識到，pH太高和極端溫度一樣有害。常常進(jìn)行多次洗滌，并混合產(chǎn)生富含異黃酮的水性提取物。若需要的話，所述富含異黃酮的水性提取物可以用有機(jī)溶劑洗滌，以獲得更佳的純度。
在步驟c)中，富含異黃酮的水性提取物的pH調(diào)至約中性(6-8)，并用有機(jī)溶劑提取，得到富含異黃酮的(第二)有機(jī)提取物。進(jìn)行再次洗滌，并混合產(chǎn)生這種提取物。
最后，在步驟d)中，使用標(biāo)準(zhǔn)方法如干燥、色譜法、結(jié)晶或者其它熟知的方法，從富含異黃酮的有機(jī)提取物中分離所述異黃酮。最方便的是，噴霧干燥所述提取物，產(chǎn)生本發(fā)明的異黃酮。
技術(shù)人員會(huì)識到，通過本申請的方法，混合使用各種提取步驟或者升高提取溫度有利于獲得更加有效的提取效果。這種修改是熟知的，且根據(jù)使用條件或多或少能應(yīng)用。優(yōu)選的溫度是接近室溫(即15-40℃)。若所述提取物在這種溫度下更加穩(wěn)定，那么在降低的溫度下進(jìn)行提取是有利的。
使用不同pH的極性相進(jìn)行多重分離步驟，可以獲得多次循環(huán)的分離、提取和/或純化。例如，分離步驟可以在中性pH和pH＞10的范圍內(nèi)交替進(jìn)行?；蛘?，所述水性植物提取物可以如流程II所述進(jìn)行處理。
流程II 所述原料水性植物提取物的pH升至大于10，并如流程I的步驟(a)中所述用有機(jī)溶劑洗滌，產(chǎn)生第一有機(jī)提取物和富含異黃酮的水性提取物。所得第一有機(jī)提取物含雜質(zhì)，要丟棄。然后所述富含異黃酮的水性提取物的pH調(diào)至接近中性(6-8)，并如流程I的步驟c)所述用有機(jī)溶劑提取，產(chǎn)生第二有機(jī)提取物。如以上流程I所述，加工所述第二有機(jī)提取物，產(chǎn)生分離的產(chǎn)物。本發(fā)明優(yōu)選的異黃酮產(chǎn)物的純度為15-70％，以所有異黃酮的重量％計(jì)。所述純度優(yōu)選在約35-65％之間，更優(yōu)選約40-50％。
實(shí)施例和制備方法在這些實(shí)施例中使用的材料可以從熟知的商業(yè)來源獲得。所報(bào)道的純度以重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，產(chǎn)率以本方法中原料的理論量為基礎(chǔ)。以本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行異黃酮含量的分析。(例如可見，Song，Tongtong、Barua，Kobita、Buseman，Gwen、Murphy，PA，“大豆異黃酮分析”質(zhì)量控制和新的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)“(Soy IsoflavoneAnalysisQuality Control and a New Internal Standard)，Am J Clin Nutr1998；68(增刊)，第1474S-9S頁；Murphy，PA；Song，TT、Buseman，Gwen、Barua，Kobita、“基于大豆的嬰兒配方中的異黃酮”(Isoflavones in Soy-based Infant Formulas)，J.Agric.Food Chem.1997，45，4635-4638；和Wang，H、Murphy，PA，“市售大豆食品中的異黃豆含量”(Isoflavone Contentin Commercial Soybean Foods)，J.Agric.Food Chem.1994，42，1666-1673。)
制備方法1由大豆胚芽粉制備水性植物提取物己烷提取研磨含80％以上大豆胚芽的產(chǎn)品，產(chǎn)生大豆粉(大豆胚芽產(chǎn)品是本領(lǐng)域熟知的，可見美國專利#5,952,230和WO 96/10341)。用53.5kg沸騰的己烷在連續(xù)攪拌下提取20kg大豆胚芽粉5小時(shí)。在50℃下籃式離心所述提取漿液，從所述己烷中分離固體，產(chǎn)生總共18.6kg脫脂大豆餅粕。在室溫(21-22℃)下，風(fēng)干除去(24小時(shí))這種脫脂大豆餅粕的溶劑。
乙醇提取和濃縮在59-62℃下，用290kg乙醇/水(80/20，體積/體積)在連續(xù)攪拌下提取所述除去溶劑的餅粕。再次通過離心分離所述固體。離心在50℃下進(jìn)行，產(chǎn)生約17.4kg固體和約350L水性粗提取。所述粗提取液然后在65-70℃下真空濃縮約1小時(shí)，到體積約為170L。在65-70℃下再繼續(xù)進(jìn)行真空濃縮4小時(shí)，期間，逐漸加入總共270L的軟水，以便降低提取液中的乙醇含量。在濃縮過程中沒有發(fā)現(xiàn)沉積或顏色變化。得到最終水性提取物(重48kg)，其殘留乙醇含量為825ppm。所述提取物約為5.5％固體、0.3-0.35％異黃酮、0.3-0.5皂角苷、0.2-0.35％低聚糖和0.38％蛋白質(zhì)。
制備方法2由市售大豆粉制備水性植物提取物在60℃下用80％乙醇/水(2.5L)提取呈白色薄片的市售低纖維脫脂大豆餅粕7小時(shí)。在減壓調(diào)節(jié)下蒸發(fā)所述乙醇，產(chǎn)生水性提取物(2.0L)，為17％固體和0.2％異黃酮。
制備方法3由大豆胚芽制備水性植物提取物使用純度約為74％的大豆胚芽制備水性提取物。研磨大豆胚芽，用己烷脫脂并干燥。然后在60℃下用80％乙醇/水提取7小時(shí)。在減壓條件下蒸發(fā)所述乙醇，產(chǎn)生水性提取物，為14％固體和0.86％異黃酮。
由水性植物提取物分離異黃酮實(shí)施例1用6N NaOH將制備方法1所得水性植物提取物(100L)調(diào)節(jié)至pH11.2。然后，用1-丁醇(100mL)提取所述水相，并分離所述層。用濃鹽酸將所述水相pH調(diào)至6.8，并用1-丁醇(60mL)再次提取，產(chǎn)生第二提取物。在減壓條件下濃縮所述第一提取物，產(chǎn)生1.28g黃色固體(3.37％異黃酮)，第二提取物經(jīng)過類似處理產(chǎn)生0.55g淡黃色固體(純度37.78％，回收率56.9％)。
實(shí)施例2將制備方法1所得的水性植物提取物樣品經(jīng)過再生的纖維素膜(10000MWCO)，得到200mL含異黃酮的滲透液。用6N NaOH將所述滲透液的pH調(diào)至11.2，用200ml丁醇在室溫下提取，并分離各層，產(chǎn)生第一提取物。用濃鹽酸將所述水相的pH調(diào)至6.8，并用1-丁醇(200mL)提取水相，產(chǎn)生第二提取物。在減壓條件下濃縮所述第一提取物，產(chǎn)生0.84g黃色固體(異黃酮純度為10.48％)，第二提取物經(jīng)過類似處理產(chǎn)生0.52g淡黃色固體(純度34.88％，回收率38％)。
實(shí)施例3用6N NaOH將制備方法1所得水性植物提取物(100L)調(diào)節(jié)至pH11.8。然后，用乙酸乙酯(100mL)提取，并分離各層，產(chǎn)生第一提取物。用濃鹽酸將所述水相的pH調(diào)至6.7，并用乙酸乙酯(100mL)提取，制得第二提取物。在減壓條件下濃縮所述第一提取物，產(chǎn)生0.4g黃色固體(異黃酮純度為15.71％)，第二提取物經(jīng)過類似處理產(chǎn)生0.19g淡黃色固體(純度67.46％，回收率32％)。
實(shí)施例4用水將制備方法3所得的水性植物提取物稀釋兩倍，得到稀溶液(200mL)，用6N NaOH將pH調(diào)至11.24，用1-丁醇(200mL)提取所述水相，并分離所述層，產(chǎn)生第一提取物。用濃鹽酸將所述水相的pH調(diào)至6.5，并用1-丁醇(200mL)提取，產(chǎn)生第二提取物。在減壓條件下濃縮所述第一提取物，產(chǎn)生1.57g黃色固體(純度為4.5％)，第二提取物經(jīng)過類似處理產(chǎn)生1.44g淡黃色固體(純度34.9％，回收率72％)。
實(shí)施例5將制備方法1所得的水性植物提取物(200mL)加熱至42℃，用6N NaOH將pH調(diào)至11.2。攪拌所述混合物15分鐘。攪拌后，用濃鹽酸將pH調(diào)回至6.5，并將所述混合物冷卻至室溫。然后用1-丁醇(200mL)提取所述混合物。通過攪拌15分鐘，在pH11.2下用水反提取所述丁醇層，并分離各層。然后用濃鹽酸將所述混合的水相調(diào)至pH6.5，并用1-丁醇(200mL)提取，產(chǎn)生第二提取物。在減壓條件下濃縮所述第二提取物，產(chǎn)生0.93g黃色固體(純度45.38％，回收率66.4％，98.6％異黃酮不含糖苷、作為糖苷配基的異黃酮與染料木黃酮、黃豆黃素和黃豆苷原的比例分別為16.1％、36.8％和47.1％)。
實(shí)施例6將制備方法1所得的水性植物提取物(200mL)加熱至45℃，用6N NaOH將pH調(diào)至11.3。攪拌所述混合物10分鐘。攪拌后，用濃鹽酸將pH調(diào)回至6.5，并將所述混合物冷卻至室溫。然后用1-丁醇(2×100mL)提取所述混合物。通過攪拌15分鐘，在pH11.2下用水反提取所述丁醇層，并分離各層。然后用濃鹽酸將所述水相的調(diào)至pH6.5，并用1-丁醇(2×100mL)提取，產(chǎn)生第二提取物。在減壓條件下濃縮所述第二提取物，產(chǎn)生1.15g淡黃色固體(純度42.49％，回收率78.2％)。
實(shí)施例7將制備方法1所得的水性植物提取物(200mL)加熱至40℃，用6N NaOH將pH調(diào)至11.3。攪拌所述混合物10分鐘。攪拌后，用濃鹽酸將pH調(diào)回至6.5，并將所述混合物冷卻至室溫。然后通過攪拌用1-丁醇(2×100mL)提取所述混合物，并通過離心分離所述丁醇層。通過攪拌15分鐘，在pH11.2下用水反提取所述丁醇層，并分離有機(jī)層。然后用濃鹽酸將所述水相調(diào)至pH6.5，并用1-丁醇(2×100mL)提取，并通過離心分離各層，產(chǎn)生第二提取物。在減壓條件下濃縮所述第二提取物，產(chǎn)生1.15g淡黃色固體(異黃酮48.08％，83.6％回收率)。
實(shí)施例8用去離子水將制備方法2所得的水性植物提取物(70mL)稀釋成200mL，并加熱至45℃。用6N NaOH將pH調(diào)至11.3，攪拌15分鐘，并冷卻至室溫。用濃硫酸將pH調(diào)回至6.5，并用1-丁醇(2×100mL)提取所述混合物。向所述丁醇相中加入200mL水，并用6N NaOH將pH調(diào)至11.3。分離各層，用硫酸將水層的pH調(diào)回至6.5，然后用1-丁醇(2×100mL)提取。在減壓條件下蒸發(fā)所述丁醇，產(chǎn)生0.39g淡黃色固體(異黃酮24.44％，86.5％回收率)。
實(shí)施例9將NovaSoy_攪拌入75mL1-丁醇、50mL水和25mL鹽水中，并分離各層。將丁醇相加入75mL水中，并在攪拌中用6N NaOH將PH調(diào)至11.3。分離各層，并用HCl將水相調(diào)至pH6.3，用丁醇(1×75mL)提取。在減壓條件下蒸發(fā)所述丁醇，產(chǎn)生0.34g褐色固體(58.3％異黃酮，51.7％回收率)。
實(shí)施例10將制備方法1所得的水性植物提取物(100mL)加熱至60℃，用6N NaOH將pH調(diào)至11.2。攪拌所述混合物10分鐘。攪拌后，用濃鹽酸將pH調(diào)回至6.5，并將所述混合物冷卻至室溫。然后通過振蕩用100ml溶劑(1-丁醇和乙酸乙酯以1∶1的比例混合)提取所述混合物，并分離各層。將水(100ml)加入所述有機(jī)相中，攪拌所述混合物，同時(shí)用6N NaOH將pH調(diào)至9.3。然后分離各層，并將水相調(diào)至pH6.5。然后，用1-丁醇/乙酸乙酯的1∶1混合物再次提取所述水層，分離所述溶劑層，并在減壓條件下蒸發(fā)，產(chǎn)生0.11g灰白色固體(異黃酮37.25％，13.05％回收率)。
實(shí)施例11將制備方法1所得的水性植物提取物(100mL)加熱至60℃，用6N NaOH將pH調(diào)至11.2。然后，用1-戊醇(100ml，室溫)提取所述混合物。除去所述水相，冷卻至室溫，用濃鹽酸調(diào)至pH6.5，并用1-戊醇(100mL)提取。然后在減壓條件下蒸發(fā)所述1-戊醇，產(chǎn)生0.63g金黃色固體(27.1％異黃酮，67％回收率)。
實(shí)施例12在30分鐘內(nèi)用6N NaOH將制備方法1所得的水性植物提取物(6000mL)調(diào)至pH11.3，并在攪拌中用濃硫酸將pH調(diào)回至6.5。通過蒸發(fā)，將其從6升濃縮至1升，并用1-丁醇(2×1000ml)提取。通過離心將界面處的不溶固體除去。在pH11.3下用水(4×250ml)反提取所述混合的丁醇層。用濃硫酸將水性回洗的第一部分調(diào)至pH6.5，并冷卻至2℃，過夜。通過真空過濾收集6.99g沉淀物，并在60℃和2mmHg的真空爐中干燥。(82.1％異黃酮，60％回收率)。
實(shí)施例13用6N NaOH將所述制備方法1所得水性植物提取物(1000ml)調(diào)節(jié)至pH11.3，攪拌45分鐘，用濃硫酸重新調(diào)節(jié)至pH6.5。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將所述溶液濃縮到干，并在真空爐中干燥，產(chǎn)生69g固體。將12.39g的這些固體加入裝有200ml飽和1-丁醇水溶液的燒杯中，并劇烈攪拌1小時(shí)。將丁醇倒出，并向丁醇中加入200ml水。用6N NaOH將所述溶液的pH調(diào)至pH11.3。分離各層，并用濃硫酸將水相調(diào)至pH6.5。用1-丁醇(1×100ml)提取所述水溶液。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥所述最終丁醇相，產(chǎn)生0.5g大白色粉末，其完全溶解度為0.03％重量/體積。(37.66％異黃酮，57.6％回收率)。
實(shí)施例14在室溫下將制備方法1所述水性植物提取物(10000ml)調(diào)節(jié)至pH11.3，攪拌90分鐘。用濃硫酸將pH調(diào)回至約6.5。然后，在室溫下用1-丁醇(3×2500ml)提取所述混合物。在第三階段離心分離所述乳液相，以從水相中進(jìn)一步分離溶劑?；旌先N丁醇溶液，并加入5000ml水。在攪拌中，用6N NaOH將所述混合溶液的pH調(diào)至11.4。分離各層，并再次離心分離所述乳液相。在攪拌中用濃硫酸將水相的pH調(diào)至6.5。在室溫下用1-丁醇(2×2500ml)提取所述水相?；旌隙〈枷啵ㄟ^旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)來蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)生45.41g灰白色固體(49.51％異黃酮，70.4％回收率)。
實(shí)施例15分離黃烷酮按以下步驟從Kinnow Extract(Mandarin，來自USDA)中分離黃烷酮。通過攪拌用1-丁醇(1×)提取用作原料的水性提取物，分離丁醇層，產(chǎn)生中間提取物。在pH11.2下用水反提取所述丁醇層，攪拌15分鐘，并分離所述有機(jī)層。用濃鹽酸將水相的pH調(diào)至6.5，并用1-丁醇(1×)提取，通過離心分離各層，產(chǎn)生第二提取物。按照已知步驟(例如可見Merken上述)測定所述中間提取物和第二提取物中的橙皮苷和Didymin。
黃烷酮 起始水性提取物 中間提取物 第二提取物橙皮苷 10896微克/克 16624微克/克 73284微克/克Didymin 3137微克/克8575微克/克 30304微克/克實(shí)施例16分離黃烷醇按以下步驟從圓珠茶(Gunpowder Tea)-Pin Head Variety中分離黃烷醇。所述水性提取物用作原料，并在攪拌過程中用1-丁醇(1×)提取，通過離心分離所述丁醇層，產(chǎn)生中間提取物。在pH11.3下用水反提取所述丁醇層，攪拌15分鐘，并分離所述有機(jī)層。用濃鹽酸將水相的pH調(diào)至6.4，并用1-丁醇(1×)提取，通過離心分離各層，產(chǎn)生第二提取物。按照已知步驟(例如可見Merken上述)測定所述中間提取物和第二提取物中所列的黃烷醇。
黃烷醇起始水性提取物中間提取物 第二提取物櫟沮-3-蕓香糖苷 98微克/克 1328微克/克2356微克/克櫟精-3-D 103微克/克1374微克/克1940微克/克半乳糖苷櫟精-3-鼠李糖苷 202微克/克2894微克/克6755微克/克實(shí)施例17分離黃烷醇按以下步驟從Buckwheat Farinetta@中分離黃烷醇。所述水性提取物用作原料，并在攪拌中用1-丁醇(1×)提取，通過離心分離所述丁醇層，產(chǎn)生中間提取物。在pH11.2下用水反提取所述丁醇層，攪拌15分鐘，并分離所述有機(jī)層。用濃鹽酸將水相的pH調(diào)至6.4，并用1-丁醇(1×)提取，通過離心分離各層，產(chǎn)生第二提取物。按照已知步驟(例如可見Merken上述)測定所述中間提取物和第二提取物中的所列的黃烷醇。
高濃度異黃酮產(chǎn)品的比較評價(jià)A.顏色確定使用以下步驟通過HunterLab(Reston，VA)提供的ColorQuest XE上確定各種異黃酮產(chǎn)品的顏色。這種儀器是雙光束氙閃光光譜儀。所述顏色以三個(gè)不同值(L值、a值和b值)表征。所述L值對應(yīng)為亮度，該值越高表明產(chǎn)品越亮。所述a值用正值和負(fù)值表示紅/綠顯色，分別對應(yīng)紅色和綠色的程度。類似地，所述b值量化了黃/藍(lán)顯色的程度，用正值表示黃色色調(diào)，負(fù)值表示藍(lán)色。
1.使用以下設(shè)置使所述光譜儀標(biāo)準(zhǔn)化a.將模式類型設(shè)置為“反射、鏡面排斥(RSEX)”b.將視野設(shè)置為“小”c.將口大小設(shè)置為“0.375英寸”d.使用白色瓷片標(biāo)度，進(jìn)行軟件標(biāo)準(zhǔn)化步驟2.對各樣品而言，將樣品置于20mm透射池中，完全覆蓋所述反射口。填充所述池高度一半以上一點(diǎn)。
3.記錄所述池的基準(zhǔn)，以排除產(chǎn)品的任何可見簇，確保均勻性。
4.將具有樣品的透射池置于反射口前，用擋光器遮蓋，并啟動(dòng)儀器，以表征樣品顏色。
B.水溶解度使用以下步驟確定水溶解度。
1.稱量50.0g 20℃的去離子水，倒入100ml燒杯；2.稱量約0.05g樣品，然后用攪拌棒加入水混合。確保記錄所加樣品的精確量。
3.若樣品容易分散，則再加入0.05g，并充分混合。繼續(xù)所述工藝，直到超過溶解度極限，記錄各次加入樣品的量。
4.攪拌所述混合物30分鐘。
5.稱重并記錄Whatman #4濾紙的質(zhì)量。
6.在真空下使用布氏漏斗，通過所述預(yù)先稱重的濾紙過濾溶液，除去任何不溶的物質(zhì)。
7.將鋁盤稱重，并將帶有殘留物的濾紙置于該盤中。
8.在室溫下，在真空干燥器中干燥所述樣品48小時(shí)。
9.在干燥后，將所述盤、濾紙和不溶物質(zhì)稱重。
計(jì)算水溶性物質(zhì)的重量和溶解度百分?jǐn)?shù)。
結(jié)果將本發(fā)明產(chǎn)品的顏色、溶解度及其它特征和來自NovaSoy_、Solbar和Central Soya的市售異黃酮產(chǎn)品比較。結(jié)果摘要如下。
市售高含量(40％)異黃酮產(chǎn)品的顏色
在視覺上，本發(fā)明的產(chǎn)品相比其它市售產(chǎn)品較紅的外觀，其顯色為淡褐色到米色。這可以通過Hunter光譜儀所得顏色來證實(shí)。本發(fā)明的產(chǎn)品明顯更亮，因?yàn)槠銵值較高。它們的紅顯色也比所檢驗(yàn)的市售高含量異黃酮產(chǎn)品小(a值較小)。而且，Solbar和NovaSoy_產(chǎn)品的黃色色調(diào)比本發(fā)明的產(chǎn)品更強(qiáng)。本發(fā)明的異黃酮組合物的L值優(yōu)選大于約65，更優(yōu)選大于約75，或者在約65-75之間。本發(fā)明異黃酮組合物的a值優(yōu)選低于約4，更優(yōu)選低于約2，或者在2-4之間。
市售高異黃酮(40％)產(chǎn)品0.03％在水中的溶解度
所述Central Soya產(chǎn)品形成金色到淡褐色沉淀，而其它兩種產(chǎn)品具有白色沉淀。按照溶解度評價(jià)，除去上清液，以確定各產(chǎn)品對液體顏色的影響。所述NovaSoy_產(chǎn)品的外觀明顯大于黃色(如其b值高所示)，而且稍帶綠色。Solbar產(chǎn)品形成類似的顏色，但是并不如NovaSoy_那么強(qiáng)。雖然Central Soya和本發(fā)明產(chǎn)品具有淡紅色色調(diào)，如Hunter讀數(shù)的負(fù)b值所示，相比對照水樣品，這種顯色幾乎沒有注意到。
高異黃酮產(chǎn)品在水中的溶液(0.03重量/重量％)的室溫穩(wěn)定性和顏色
來自實(shí)施例13的材料容易分散在水中，完全可溶，并形成透明且肉眼看上去無色的溶液。相比市售產(chǎn)品，本發(fā)明的產(chǎn)品具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)在飲料應(yīng)用中尤其重要。
本發(fā)明的異黃酮產(chǎn)品幾乎排他性地以游離糖苷形式存在(即，結(jié)構(gòu)2，其中R3是氫)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，95％以上的異黃酮以游離糖苷形式存在，更優(yōu)選是98％以上以游離糖苷形式存在。此外，從大豆胚芽分離的異黃酮，其染料木苷含量比不同來源的異黃酮低。能改變異黃酮的性質(zhì)來獲得所需的效果。因此，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式如下所述組合物包含黃豆苷和染料木苷，所述黃豆苷和染料木苷的重量比大于1，更優(yōu)選大于2。另一個(gè)優(yōu)選組合物是其中包含glycitin和染料木苷的組合物，所述glycitin和染料木苷的重量比大于1，更優(yōu)選大于2。
異黃酮性質(zhì)數(shù)據(jù)和其它分析結(jié)果
已經(jīng)描述了本發(fā)明的許多實(shí)施方式。然而應(yīng)理解，在不背離本發(fā)明精神和范圍的條件下可以作出各種修改。例如，所述含異黃酮的提取物可以來自各種植物原料。因此，其它實(shí)施方式在以下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于分離酚類化合物的方法，所述方法包括如下步驟(a)提供第一pH大于10的水性植物提取物，所述水性植物提取物包含許多酚類化合物；(b)用有機(jī)溶劑洗滌所述水性植物提取物；(c)將水性植物提取物調(diào)至pH小于9；(d)從所述水性植物提取物中分離所述酚類化合物。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述水性植物提取物來自大豆。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述水性植物提取物來自脫脂大豆胚芽。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述酚類化合物是異黃酮。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酚類化合物選自類黃酮、花色素、黃酮、黃烷醇、黃烷酮和原花色素。
6.一種用于分離酚類化合物的方法，所述方法包括(a)提供第一pH小于10的水性植物提取物，所述水性植物提取物包含許多酚類化合物；(b)用第一有機(jī)溶劑提取所述水性植物提取物，產(chǎn)生第一有機(jī)提取物；(c)用pH大于10的水相提取所述第一有機(jī)提取物，產(chǎn)生富含苯酚的水相；(d)將所述富含苯酚的水相調(diào)至pH小于9；(e)從所述富含苯酚的水相中分離酚類化合物。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述水性植物提取物來自大豆。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述水性植物提取物來自脫脂大豆胚芽。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述酚類化合物是異黃酮。
10.權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述酚類化合物選自類黃酮、花色素、黃酮、黃烷醇、黃烷酮和原花色素。
11.權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，步驟(e)包括用第二有機(jī)溶劑提取所述富含苯酚的水相，產(chǎn)生第二有機(jī)提取物。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法還包含如下步驟除去第二有機(jī)提取物中的有機(jī)溶劑，產(chǎn)生異黃酮產(chǎn)物。
13.權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述第一和第二有機(jī)溶劑分別選自1-丁醇、2-丁酮、乙酸乙酯或異丙醇。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在步驟(b)前，將所述水性植物提取物的pH升至10以上，并將pH降至6-8。
15.一種組合物，所述組合物包含(a)兩種或多種異黃酮，其中，異黃酮占所述組合物的15重量％以上，(b)所述組合物在混合物中的溶解度約80％或以上，所述混合物在水中包含約0.03重量％的組合物。
16.權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述異黃酮約占所述組合物的15-60％。
17.權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述異黃酮約占所述組合物的35-55％。
18.權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述組合物的溶解度大于約90％。
19.權(quán)利要求18所述的組合物，其特征在于，所述組合物的溶解度大于約95％。
20.權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，在燃燒所述組合物時(shí)，測定的灰分含量小于約25％。
21.權(quán)利要求20所述的組合物，其特征在于，在燃燒時(shí)，灰分含量小于約10％。
22.權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述組合物的L顏色值大于約65。
23.權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述組合物的a顏色值小于約4。
24.權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述組合物的L顏色值大于約75，a顏色值小于2。
25.權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含黃豆苷和染料木苷，所述黃豆苷和染料木苷的重量百分比大于1，其中所述黃豆苷和染料木苷以糖苷配基或糖基化形式存在。
26.權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含黃豆苷和染料木苷，所述黃豆苷和染料木苷的重量百分比大于2，其中所述黃豆苷和染料木苷以糖苷配基或糖基化形式存在。
27.權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含glycitin和染料木苷，所述glycitin和染料木苷的重量百分比大于1，其中所述glycitin和染料木苷以糖苷配基或糖基化形式存在。
28.權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含黃豆苷、glycitin和染料木苷，所述黃豆苷和染料木苷的重量百分比大于1，所述glycitin和染料木苷的重量百分比大于1，其中所述黃豆苷、glycitin和染料木苷以糖苷配基或糖基化形式存在。
29.權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含黃豆苷、glycitin和染料木苷，所述黃豆苷和染料木苷的重量百分比大于2，所述glycitin和染料木苷的重量百分比大于2，其中所述黃豆苷、glycitin和染料木苷以糖苷配基或糖基化形式存在。
30.權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，約95％以上的異黃酮呈游離糖苷的形式。
31.權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，約98％以上的異黃酮呈游離糖苷的形式。
32.權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于a)所述組合物的溶解度大于約90％，b)燃燒對，灰分含量小于約10％，c)所述組合物的L-色值大于約75，a-色值小于2。d)所述組合物包含黃豆苷、glycitin和染料木素，黃豆苷和染料木苷的重量百分比大于2，glycitin和染料木苷的重量百比大于2，e)95％以上的異黃酮呈游離糖苷的形式。
全文摘要
本發(fā)明提供用于從含酚類化合物的植物原料的水性提取物中分離酚類化合物，尤其是異黃酮的組合物和方法。所述方法包括(a)提供第一pH小于10的水性植物提取物，所述水性植物提取物包含許多酚類化合物；(b)用第一有機(jī)溶劑提取所述水性植物提取物，產(chǎn)生第一有機(jī)提取物；(c)用pH大于10的水相提取所述第一有機(jī)提取物，產(chǎn)生富含苯酚的水相；(d)將所述富含苯酚的水相調(diào)至pH小于9；(e)從所述富含苯酚的水相中分離酚類化合物。
文檔編號A61K36/00GK1556699SQ02818486
公開日2004年12月22日 申請日期2002年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月24日
發(fā)明者A·B·哈爾, B·H·希爾伯特, A B 哈爾, 希爾伯特 申請人:嘉吉有限公司