專利名稱：用于間質(zhì)組織紊亂相關(guān)疾病治療的具有雙功能疫苗用途的復(fù)合超免疫原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防和治療由致病性抗原結(jié)構(gòu)的局部組織表達(dá)引起的疾病，所述表達(dá)與免疫或血管秩序的間質(zhì)性紊亂相關(guān)，從而導(dǎo)致免疫毒性或新血管發(fā)生(neoangiogenesis)，此類疾病包括一些病毒感染、一些癌癥及過(guò)敏癥。
本發(fā)明涉及開發(fā)的新預(yù)防性或治療性治療手段，稱作復(fù)合超免疫原，它誘導(dǎo)對(duì)致病性抗原結(jié)構(gòu)和引起相關(guān)間質(zhì)組織紊亂的蛋白的免疫應(yīng)答。
現(xiàn)有技術(shù)作為L(zhǎng)ouis Pasteur首次實(shí)驗(yàn)工作的一個(gè)結(jié)果，在二十世紀(jì)，以制備更高特異性和效率的疫苗為目的，試圖了解免疫機(jī)制。首先大規(guī)模使用的疫苗包括減毒活病菌或伴隨有蛋白或膜雜質(zhì)的免疫原制品，此時(shí)用作免疫佐劑的是未清楚表征的組合物和結(jié)構(gòu)。
后來(lái)，從純化的抗原，例如蛋白亞單位或蛋白類毒素研發(fā)了疫苗，而此時(shí)使用更為明確、更為有效且無(wú)毒性的免疫佐劑，這些疫苗主要設(shè)計(jì)用于通過(guò)針對(duì)致感染因子的免疫應(yīng)答來(lái)克服和控制感染性疾病。
近二十年間，大規(guī)模的疫苗成功(包括通過(guò)基因工程技術(shù)獲得的)和對(duì)免疫反應(yīng)機(jī)制的更好理解使得研究者可以擴(kuò)展疫苗的使用，以治療與載有外源抗原或異常表達(dá)的抗原的生物結(jié)構(gòu)(病菌、惰性或活性環(huán)境細(xì)胞或顆粒)有關(guān)的慢性病，例如艾滋病、癌癥、過(guò)敏癥和自身免疫病等疾病。
為了使用疫苗預(yù)防或治療上面提到的疾病，已經(jīng)系統(tǒng)地嘗試誘導(dǎo)針對(duì)致病結(jié)構(gòu)的免疫應(yīng)答，所述致病結(jié)構(gòu)例如由病毒感染的細(xì)胞選擇表達(dá)的病毒蛋白、由癌細(xì)胞選擇表達(dá)的蛋白或變應(yīng)性蛋白，這些都是此類疾病的主要致病因子。
作為例子，為了克服艾滋病病毒，尤其是HIV1感染，當(dāng)前制備的候選疫苗旨在誘導(dǎo)專門地靶向某些病毒蛋白或肽的免疫應(yīng)答。
相似地，作為最新臨床研究對(duì)象的抗癌疫苗旨在誘導(dǎo)專門定向破壞表達(dá)癌癥相關(guān)抗原(例如，在由某些乳頭瘤病毒引起的癌癥情況下，病毒蛋白)的細(xì)胞或者病毒(例如艾滋病中HIV1)感染細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
根據(jù)同樣的疫苗策略，目前抗過(guò)敏疫苗僅僅旨在誘導(dǎo)針對(duì)主要致病性變應(yīng)原的免疫應(yīng)答。
癌是后來(lái)能在體內(nèi)傳播以至于形成轉(zhuǎn)移的細(xì)胞增殖。已知正常個(gè)體的免疫系統(tǒng)有規(guī)律地清除早期癌細(xì)胞，癌癥的產(chǎn)生(1)與逃脫局部免疫監(jiān)視系統(tǒng)和在癌晚期出現(xiàn)系統(tǒng)免疫抑制有關(guān)；(2)與保證腫瘤細(xì)胞獲得營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有關(guān)，此腫瘤細(xì)胞增殖稱為新血管形成。
通過(guò)誘導(dǎo)宿主免疫防御的原位麻痹而逃脫宿主細(xì)胞的免疫防御是大多數(shù)癌癥采用的策略，且是它們存活所必需的。起初，免疫抑制局限在腫瘤水平，因?yàn)閭€(gè)體仍能保衛(wèi)自己防御其他攻擊，例如感染。
然而，在后期，免疫抑制可能蔓延，擴(kuò)及全身，這可以由轉(zhuǎn)移瘤的擴(kuò)散以及癌癥患者對(duì)感染的高易感性看出。此免疫抑制涉及由癌細(xì)胞或它們周圍細(xì)胞產(chǎn)生的麻痹因子(paralyzing factor)。免疫系統(tǒng)細(xì)胞的局部麻痹或免疫抑制因此是癌細(xì)胞逃脫宿主免疫系統(tǒng)的主要武器。在某些感染性疾病中，例如艾滋病中，病毒入侵者使用的也正是此免疫抑制策略。因此，由HIV1感染的細(xì)胞釋放的蛋白對(duì)周圍免疫細(xì)胞而言是一種真正的毒素，其擾亂并原位，即，以旁分泌方式阻礙免疫系統(tǒng)細(xì)胞從而保護(hù)受感染的細(xì)胞、病毒復(fù)制及它們的傳播。
申請(qǐng)人以前的工作(在出版的國(guó)際申請(qǐng)WO00/03732中提到的)顯示在ATL白血病、宮頸癌及卡波西肉瘤的情況下，以下三種蛋白分別參與了腫瘤或HIV1感染細(xì)胞水平的局部免疫抑制HTLV1病毒的Tax蛋白；乳頭瘤病毒的E7蛋白，及
HIV1病毒的Tat蛋白。
申請(qǐng)人還公開了一些免疫抑制性蛋白，例如HIV1的Tat蛋白及HPV(16和18株)的E7蛋白也有對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活效應(yīng)。
他們因此提出開發(fā)含有衍生自如下蛋白的去毒免疫原性化合物的抗癌或抗病毒疫苗；其中所述蛋白源自癌細(xì)胞、病毒感染的細(xì)胞或間質(zhì)免疫細(xì)胞，并且起初具有局部的免疫抑制和/或生血管作用；所述去毒免疫原性化合物為例如衍生自HIV1病毒Tat蛋白、HTLV-1病毒Tax蛋白、乳頭瘤病毒E7蛋白及甘露聚糖依賴性凝集素的滅活蛋白形式。
在克服艾滋病、癌癥和過(guò)敏癥的潛在治療策略的另一方面，基于與上面PCT申請(qǐng)WO00/03732中所提供的疫苗的原理相類似的原理，ZAGURY D等(2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98(14)8024-8029)通過(guò)文獻(xiàn)研究提出在患者體內(nèi)誘導(dǎo)一些抗細(xì)胞因子免疫以制衡在此類疾病中異常產(chǎn)生的某些細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子包括白介素、淋巴因子、單核因子、干擾素，它們?cè)诮M織中具有生理作用并局部地用作細(xì)胞增殖、分化或程序死亡的因子。
上面提到的作者指出，直到今天，疫苗治療策略僅僅旨在靶向抗原性攻擊者，無(wú)論它是微生物、細(xì)胞或過(guò)敏原，但從沒(méi)有嘗試過(guò)克服在攻擊者作用下誘導(dǎo)的細(xì)胞因子失調(diào)。這些作者提出將抗細(xì)胞因子疫苗接種作為傳統(tǒng)疫苗接種方法的輔助手段以中和或封閉間質(zhì)免疫毒性效應(yīng)及允許免疫應(yīng)答能適應(yīng)于抗原性攻擊者正常發(fā)展。然而，ZAGURY等(2001)沒(méi)有提供能證實(shí)誘導(dǎo)此免疫應(yīng)答對(duì)病毒感染患者、癌癥患者及嚴(yán)重(例如系統(tǒng)的)過(guò)敏反應(yīng)易感個(gè)體具有益處的任何具體實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
為了預(yù)防或治療某些癌癥、病毒感染(包括HTLV-1或HIV-1病毒)或嚴(yán)重過(guò)敏癥，本領(lǐng)域目前需要比現(xiàn)有疫苗療法更安全且更有效的改進(jìn)的疫苗療法。
發(fā)明概述本發(fā)明以具有雙功能疫苗用途的復(fù)合超免疫原化合物家族的形式提供了針對(duì)某些癌癥、病毒感染及過(guò)敏癥的系統(tǒng)或粘膜疫苗治療新方法，所述化合物能誘導(dǎo)針對(duì)兩個(gè)不同靶標(biāo)的免疫應(yīng)答，所述靶標(biāo)分別地為致病性抗原結(jié)構(gòu)和局部產(chǎn)生的負(fù)責(zé)后來(lái)的間質(zhì)免疫毒性或新血管形成紊亂的因子。
本發(fā)明的目的是含有物理上彼此相連的兩個(gè)不同免疫原性多肽的雙功能復(fù)合超免疫原，其中，兩個(gè)多肽分別為(a)誘導(dǎo)針對(duì)惰性或活性細(xì)胞、微生物或顆粒致病性抗原結(jié)構(gòu)的細(xì)胞免疫應(yīng)答或細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的第一免疫原性多肽；(b)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)間質(zhì)局部循環(huán)蛋白的中和或封閉性抗體的第二免疫原性多肽，此間質(zhì)局部循環(huán)蛋白選自有免疫毒性或生血管特性的細(xì)胞因子或細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，此類因子或能由癌細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞(包括T淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(APC))產(chǎn)生，或能被致病性(包括變應(yīng)性)顆粒結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)，所述復(fù)合超免疫原可以用于生產(chǎn)具有誘導(dǎo)對(duì)致病性抗原結(jié)構(gòu)和間質(zhì)局部循環(huán)蛋白的粘膜或系統(tǒng)免疫的抗癌、抗病毒或抗過(guò)敏作用的藥物。
第一方面，多肽(a)誘導(dǎo)對(duì)癌細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞特異表達(dá)的抗原或顆粒結(jié)構(gòu)的抗原成分的細(xì)胞免疫應(yīng)答以及任選地體液免疫應(yīng)答；顆粒結(jié)構(gòu)包括活性顆粒結(jié)構(gòu)，例如花粉、蜱螨類和一些寄生蟲例如碩大利什曼原蟲(Leishmania major)，及惰性顆粒結(jié)構(gòu)，例如灰塵和貓的毛發(fā)。
第一免疫原性多肽(a)選自(i)由癌細(xì)胞選擇表達(dá)的、由病毒感染細(xì)胞選擇表達(dá)的或作為變應(yīng)性致病結(jié)構(gòu)的組分的免疫原性蛋白(如果需要的話，去毒形式的該蛋白)和(ii)衍生自(i)的蛋白。
第二方面，多肽(b)誘導(dǎo)針對(duì)在間質(zhì)組織中以異常方式局部釋放的循環(huán)蛋白的體液應(yīng)答。
在此第二方面，免疫原性多肽(b)選自(i)間質(zhì)局部循環(huán)蛋白(如果需要的話可以去毒)和(ii)衍生自(i)的蛋白。
我們認(rèn)為作為細(xì)胞致病性結(jié)構(gòu)的成分在間質(zhì)中釋放的一些有免疫毒性或生血管特性的蛋白，可用作復(fù)合超免疫原的多肽(a)或多肽(b)。HIV的Tat蛋白、HPV的E7蛋白及細(xì)胞調(diào)節(jié)因子p53正是這種情況。
優(yōu)選地，使用以下超免疫原化合物a)抗病毒疫苗-復(fù)合超免疫原(a)HIVI的gp160-(b)HIV1的Tat類毒素；-復(fù)合超免疫原(b)HIVI的Tat肽[1-15；46-60]-(a)HIV1的gp160；-復(fù)合超免疫原(a)HIV1的Tat類毒素-(b)IFNα；-復(fù)合超免疫原(a)HIV1的Tat類毒素-(b)HIV1的Tat肽[1-15；46-60]；b)抗癌疫苗-復(fù)合超免疫原(a)HPV的L1-(b)HPV的E7；-復(fù)合超免疫原(a)HPV的E7-(b)VEGF；c)抗過(guò)敏疫苗-復(fù)合超免疫原(a)Betv1a-(b)異源IL4。
根據(jù)本發(fā)明，多肽(a)和(b)物理上彼此連接，在所有情況下，它們?cè)谝粋€(gè)載體上一起呈遞給免疫系統(tǒng)細(xì)胞。多肽(a)和(b)可以共價(jià)連接在同一分子結(jié)構(gòu)上。
多肽(a)和(b)也可以一起包含于單個(gè)物理結(jié)構(gòu)中，例如直徑10-500納米，優(yōu)選10-1000納米，最優(yōu)選10-100納米的單顆粒上，例如IMS納米顆粒(參見(jiàn)例如Aucouturier等(2001)的公開)，脫乙酰殼多糖納米顆粒(參見(jiàn)例如Skaugrud(1999)等的公開)，脂質(zhì)體，或可生物降解顆粒例如聚乳酸(PLA)、聚-ε-己內(nèi)酯(PCL)或聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)(參見(jiàn)Baras等(1999)的公開)。
第一方面，所述用途的特征在于多肽(a)和(b)彼此直接共價(jià)連接。
第二方面，所述用途的特征在于多肽(a)和(b)通過(guò)間隔鏈在超免疫原肽中彼此分開。間隔鏈例如可以是線性間隔肽、分支間隔肽及雙官能間隔化合物例如SMCC或SIAB。
第三方面，多肽(a)和(b)固定于納米顆粒(nanoparticle)上或嵌在微米顆粒(microparticle)或納米顆粒中。優(yōu)選地，多肽(a)和(b)一起固定于同一納米顆粒上或嵌入同一納米顆粒中。
本發(fā)明也涉及含有兩個(gè)彼此相連的不同多肽的免疫原性肽綴合物，兩個(gè)多肽分別為如上定義的多肽(a)和(b)。
本發(fā)明也涉及編碼如此處以上定義的復(fù)合超免疫原化合物的核酸，及含有此核酸的表達(dá)盒及重組載體；還有此核酸、表達(dá)盒或重組載體在生產(chǎn)有抗癌、抗病毒或抗過(guò)敏作用的藥物中的用途。
本發(fā)明也涉及免疫原性組合物，它含有免疫學(xué)有效量的如上面定義的免疫原性化合物以及一種或多種賦形劑，包括生理上相容的免疫佐劑。
依賴于所要達(dá)到的目的，使用系統(tǒng)的或粘膜的佐劑。例如，粘膜佐劑優(yōu)選用于預(yù)防上皮組織癌，系統(tǒng)佐劑優(yōu)選用于預(yù)防或治療病毒(例如HIV1和HTLV1)感染及預(yù)防或治療過(guò)敏癥。
系統(tǒng)佐劑中，優(yōu)選使用的佐劑是IFA類(弗氏不完全佐劑)、磷酸鈣或氫氧化鋁。
粘膜佐劑中，優(yōu)選使用的佐劑是例如霍亂毒素B(CTB)或大腸桿菌不穩(wěn)定毒素LT的突變體(LTμ)。
本發(fā)明也涉及粘膜的或系統(tǒng)的疫苗，其特征在于它包含如上面定義的免疫原性化合物作為活性成分并包含一種或多種賦形劑，包括生理上相容的免疫佐劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于粘膜或系統(tǒng)目的的免疫原性組合物和疫苗，其特征在于它們含有治療有效量的如上面定義的核酸、表達(dá)盒或重組載體。
附圖描述

圖1是使用復(fù)合超免疫原化合物開發(fā)的疫苗接種策略的一般方案。
在圖1左側(cè)的箭頭顯示常規(guī)抗癌、抗病毒和抗過(guò)敏疫苗制品所針對(duì)的結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，即作為引起病理癥狀發(fā)展的主要因素的致病性抗原結(jié)構(gòu)，例如癌細(xì)胞、HIV感染細(xì)胞或花粉變應(yīng)性抗原。
在圖1右側(cè)的雙箭頭顯示根據(jù)本發(fā)明的疫苗制品所針對(duì)的結(jié)構(gòu)的兩種性質(zhì)a)如上面詳述的致病性抗原結(jié)構(gòu)；和b)在間質(zhì)微環(huán)境中循環(huán)并可以引起在某些癌癥、重度病毒感染或過(guò)敏癥中見(jiàn)到的免疫和血管類間質(zhì)組織紊亂的蛋白因子。
發(fā)明詳述申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，某些病毒例如HIV-1感染的細(xì)胞的微環(huán)境和癌細(xì)胞的微環(huán)境所具有的免疫抑制和血管發(fā)生作用可以為本領(lǐng)域目前的疫苗接種策略缺乏有效性提供合理解釋，本領(lǐng)域現(xiàn)有的疫苗接種策略僅僅旨在靶向癌細(xì)胞而非它的微環(huán)境紊亂。
申請(qǐng)人的工作顯示，由HIV-1感染細(xì)胞分泌的可溶性因子，尤其是Tat蛋白、或者由HIV感染患者的免疫細(xì)胞分泌的可溶性因子，尤其是IFN-α和TGF-β、或者由癌細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性因子例如宮頸癌中HPV的E7蛋白或ATL白血病中HTLV-1的Tax蛋白具有能抑制感染組織或腫瘤內(nèi)的細(xì)胞免疫應(yīng)答的免疫抑制特性，由此解釋了僅僅使用致病性抗原結(jié)構(gòu)(例如癌細(xì)胞、HIV感染細(xì)胞)所攜帶的免疫原的傳統(tǒng)疫苗為何缺乏有效性。
通過(guò)文獻(xiàn)研究可以支持申請(qǐng)人的觀點(diǎn)，證實(shí)惡性腫瘤的胞外介質(zhì)中存在釋放的免疫抑制因子。
這些因子中的某些，至今仍沒(méi)有鑒定，其產(chǎn)生自-結(jié)腸直腸癌細(xì)胞(Ebert EC，Roberts AI，O`Connell SM，RobertsonFM，Nagase H，表征源自結(jié)腸癌細(xì)胞的免疫抑制性因子，J.Immuneol.(1987)138.2161-8；或者Remacle-Bonn和MM，Pommier FJ，KaplanskiS，Rance RJ，Depieds RC，從結(jié)腸癌中提取的可溶性抑制劑抑制同種異體淋巴細(xì)胞的正常有絲分裂，J.Immunol.(1976)1171145-51)，-成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(29-Fontana A，Hengartner H，de TriboletN，Weber E.成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞釋放白介素1和能抑制白介素2介導(dǎo)的作用的因子，J.Immunol.(1984)1321837-44)，-黑素瘤(30.Hersey P，Bindon，Czerniecki M，spurling A，WassJ，McCarthy WH.腫瘤細(xì)胞釋放的因子抑制白介素2的產(chǎn)生，J.Immunol(1983)1312837-42)或-惡性腹水(Tamura K，Shibata Y，Matsuda Y，Ishida N.分離并表征來(lái)自癌癥患者的酸性體液的免疫抑制性酸性蛋白，CancerRes.(1981)413244-52；Oh SK，Moolten FL，惡性腹水中的非特異性免疫抑制因子進(jìn)一步的表征和與人外周T細(xì)胞的紅細(xì)胞受體的可能關(guān)系，J.Immunol(1981)1272300-7)。
其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，例如上面討論的，是細(xì)胞來(lái)源的，例如p53蛋白，其在某些惡性腫瘤，更特別地結(jié)腸直腸腫瘤中聚積(Remvikos Y.TominagaO，Hammel P，Laurent-Puig P，Salmon RJ，Dutrillaux B，Thomas G.結(jié)腸直腸腫瘤中p53蛋白含量的增加與差的存活相關(guān)，Br.J.Cancer 199266758-64；Gan H，Ouyang Q，Wang Y.p53蛋白在結(jié)腸直腸癌中的表達(dá)及其與細(xì)胞增生活性和預(yù)后的關(guān)系，Chung Hua Chung Liu Tsa Chih(1996))。p53蛋白經(jīng)主動(dòng)運(yùn)輸通過(guò)分泌途徑釋放(不使用信號(hào)肽)或通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散釋放出現(xiàn)在胞外介質(zhì)中，并且已經(jīng)從癌癥患者的血清中通過(guò)在玻璃纖維上層析分離出來(lái)(Zusman I，Sandler B，Gurevich P.，Zusman R，SmirnoffP，Tendler Y，Bass D，Shani A，Idelevich E，Pfefferman R，DavidovichB，Huszar M，Glick J，比較性研究p53抗原血清水平和其腫瘤細(xì)胞濃度在結(jié)腸癌檢測(cè)中的作用，Hum Antibodies Hybridomas，(1996)123-8；Sandler B，Smirnoff P，Tendelr Y，Zinder O，Zusmar R，Zusma I，用于從人血清中分離可溶性p53抗原的多克隆抗p53 IgG的特異性，Int J.Mol.Med，1998，1767-70))。
細(xì)胞因子，例如有名的免疫抑制性TGFβ、有生血管活性的生長(zhǎng)因子VEGF、也有免疫抑制活性的促炎因子IL-6或IL-10會(huì)異常分泌并釋放于某些癌細(xì)胞的胞外介質(zhì)中。申請(qǐng)人自己證實(shí)來(lái)自SIHA癌細(xì)胞系的細(xì)胞、前列腺癌的DU145細(xì)胞和來(lái)自白血病細(xì)胞系的MT2細(xì)胞可以異常產(chǎn)生并釋放細(xì)胞因子例如VEGF和/或IL-6于胞外介質(zhì)中，而白血病細(xì)胞系RAJI細(xì)胞向胞外介質(zhì)中分泌IL10。
根據(jù)本發(fā)明，目前證實(shí)，為了預(yù)防或治療某些癌癥、某些病毒感染或過(guò)敏癥，更尤其是有過(guò)敏性休克危險(xiǎn)的重度過(guò)敏癥，必需同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)如下(a)和(b)的免疫應(yīng)答a)作為引起疾病的主要因素的致病性抗原結(jié)構(gòu)，細(xì)胞、微生物或顆粒；b)造成與疾病有關(guān)的免疫或血管水平上的間質(zhì)組織紊亂的間質(zhì)局部循環(huán)蛋白。
本發(fā)明證實(shí)，上述免疫應(yīng)答可以根據(jù)本發(fā)明使用稱作復(fù)合超免疫原的化合物家族來(lái)誘導(dǎo)，獲得高刺激水平的免疫系統(tǒng)細(xì)胞，所述復(fù)合超免疫原具有雙功能，其包含通過(guò)物理方式彼此連接的第一多肽和第二多肽，其中，第一多肽誘導(dǎo)對(duì)致病性抗原結(jié)構(gòu)的免疫應(yīng)答而第二多肽誘導(dǎo)對(duì)間質(zhì)局部循環(huán)蛋白的免疫應(yīng)答。
對(duì)于給定的組織，間質(zhì)是指作為組織的特化細(xì)胞的微環(huán)境的細(xì)胞間隙。肝組織中，環(huán)繞在特化的肝細(xì)胞周圍的間質(zhì)包括其中容納著兩種免疫細(xì)胞(T和B淋巴細(xì)胞，抗原呈遞細(xì)胞或APC)、多核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)(也稱作淋巴)以及具有內(nèi)皮細(xì)胞襯里的毛細(xì)管。在粘膜的或皮膚的上皮組織中，上皮下間質(zhì)稱為真皮，也包含細(xì)胞間隙，其固定于作為其基質(zhì)的結(jié)締組織上并也在其中包含循環(huán)的免疫系統(tǒng)細(xì)胞和上面提到的毛細(xì)管。
為了預(yù)防或治療某些癌癥，本發(fā)明的復(fù)合超免疫原同時(shí)誘導(dǎo)a)細(xì)胞免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答通過(guò)T輔助細(xì)胞(T helper或Th細(xì)胞)的活化和/或?qū)Π┘?xì)胞表達(dá)的致病抗原結(jié)構(gòu)(例如TAA或TSA腫瘤抗原)特異的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的產(chǎn)生及殺傷細(xì)胞(也稱作自然殺傷細(xì)胞或NK)的產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn)，從而允許選擇性地殺死所述癌細(xì)胞；和b)體液免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答通過(guò)誘導(dǎo)中和性抗體或封閉性抗體的產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn)，所述抗體特異地針對(duì)異常產(chǎn)生的間質(zhì)循環(huán)蛋白，主要是有免疫毒性特性或生血管特性的蛋白。
為了預(yù)防或治療某些病毒感染，如果需要，與癌癥發(fā)展有關(guān)的病毒感染，本發(fā)明的復(fù)合超免疫原同時(shí)誘導(dǎo)
a)細(xì)胞免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答通過(guò)T輔助細(xì)胞的活化和/或通過(guò)誘導(dǎo)對(duì)病毒感染細(xì)胞表達(dá)的病毒致病抗原結(jié)構(gòu)(例如某些HIV1或乳頭瘤病毒蛋白)特異的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的產(chǎn)生或誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞(也稱作自然殺傷細(xì)胞或NK)的產(chǎn)生來(lái)實(shí)現(xiàn)，從而允許選擇性地殺死所述病毒感染細(xì)胞；和b)體液免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答通過(guò)誘導(dǎo)中和性抗體或封閉性抗體的產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn)，所述抗體特異地針對(duì)異常產(chǎn)生的間質(zhì)局部循環(huán)蛋白，包括病毒循環(huán)蛋白或細(xì)胞因子，主要是有免疫抑制或致細(xì)胞凋亡(apoptogenic)(免疫毒性)特性或生血管特性的蛋白。
而且，申請(qǐng)人把HIV1病毒或HTLV1病毒感染情況下的某些細(xì)胞毒性觀察數(shù)據(jù)和Sadick等(1990，J.Exp.Med，171115-127)報(bào)道的在針對(duì)花粉、蜱螨類或寄生蟲，例如碩大利什曼原蟲的顆粒結(jié)構(gòu)的免疫過(guò)程中由IL-4細(xì)胞因子異常產(chǎn)生誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答偏離觀察結(jié)果聯(lián)系起來(lái)。
為了預(yù)防或治療過(guò)敏癥，尤其是重度過(guò)敏癥，本發(fā)明復(fù)合超免疫原同時(shí)誘導(dǎo)a)通過(guò)輔助性T細(xì)胞活化而進(jìn)行的細(xì)胞免疫應(yīng)答，和通過(guò)誘導(dǎo)對(duì)組成變應(yīng)性顆粒的變應(yīng)性致病結(jié)構(gòu)特異的抗體而進(jìn)行的體液免疫應(yīng)答；和b)通過(guò)誘導(dǎo)對(duì)異常產(chǎn)生的間質(zhì)循環(huán)蛋白特異的中和性抗體或封閉性抗體產(chǎn)生而進(jìn)行的體液免疫應(yīng)答，其中所述蛋白主要是尤其通過(guò)Th2型T淋巴細(xì)胞合成的IL4細(xì)胞因子。IL4是引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgE的共刺激物，其過(guò)量產(chǎn)生具有免疫毒性，因?yàn)樗梢哉T導(dǎo)過(guò)敏性炎癥類型的致病性免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的一個(gè)目的是復(fù)合超免疫原的用途，所述復(fù)合超免疫原包含物理上彼此連接的兩個(gè)不同免疫原性多肽，兩個(gè)多肽分別包含a)第一免疫原性多肽，其誘導(dǎo)對(duì)惰性或活性細(xì)胞、微生物或顆粒致病抗原結(jié)構(gòu)的細(xì)胞免疫應(yīng)答或者細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答；b)第二免疫原性多肽，其誘導(dǎo)針對(duì)間質(zhì)局部循環(huán)蛋白的中和性抗體或封閉性抗體的產(chǎn)生，其中所述蛋白選自有免疫毒性或生血管特性的細(xì)胞因子或細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，此類因子可由癌細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生或可以由包括T淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(APC)的間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，或者可以由致病性顆粒結(jié)構(gòu)，尤其是變應(yīng)原誘導(dǎo)。
本發(fā)明中使用的復(fù)合超免疫原被稱作“雙功能的”，因?yàn)榻M成其的兩個(gè)主要部分，即，多肽(a)和(b)允許同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)兩個(gè)不同靶，即，分別地致病抗原結(jié)構(gòu)和間質(zhì)局部循環(huán)蛋白的免疫應(yīng)答。然而，根據(jù)本發(fā)明的雙功能復(fù)合超免疫原在其結(jié)構(gòu)中可以含有多個(gè)拷貝的多肽(a)和/或多肽(b)。
組成本發(fā)明復(fù)合超免疫原的多肽(a)和多肽(b)被稱作是物理上彼此連接的，這是因?yàn)樵谒星闆r中它們一起包含在同一個(gè)物理結(jié)構(gòu)、分子或顆粒(納米顆?；蛭⒚最w粒)中，在其中它們彼此有一定程度的間隔。由于在復(fù)合超免疫原中多肽(a)和多肽(b)是彼此物理上連接的，故多肽(a)和多肽(b)可以一起呈遞給相同免疫活性細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和T或B淋巴細(xì)胞。
細(xì)胞免疫應(yīng)答是指激活-具有特異識(shí)別與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)II類抗原結(jié)合的多肽(a)或多肽(b)的受體的輔助T淋巴細(xì)胞(Th)；-具有特異識(shí)別與MHC I類抗原結(jié)合的多肽(a)的受體的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，和任選地NK細(xì)胞。
可以用小鼠體外測(cè)量細(xì)胞應(yīng)答，通過(guò)脾細(xì)胞的趨化因子(MIP1α和MIP1β)產(chǎn)生和通過(guò)在此免疫原存在下此活化的脾細(xì)胞的增殖，或者還通過(guò)這些細(xì)胞的IFNγ產(chǎn)量的增加來(lái)顯示細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性。
體液免疫應(yīng)答是指，產(chǎn)生對(duì)組成復(fù)合超免疫原的多肽(a)或多肽(b)特異的抗體。
細(xì)胞、微生物或顆粒致病性抗原結(jié)構(gòu)是指-選擇性表達(dá)可稱作腫瘤抗原的抗原的癌細(xì)胞，它能被細(xì)胞免疫應(yīng)答殺死，優(yōu)選被特異識(shí)別此癌細(xì)胞選擇性攜帶的抗原的細(xì)胞毒性細(xì)胞(CTL)殺死，或者能被活化的NK細(xì)胞殺死；-或者選擇性表達(dá)病毒抗原的病毒感染細(xì)胞，它能被細(xì)胞免疫應(yīng)答殺死，優(yōu)選被特異識(shí)別此感染細(xì)胞選擇性表達(dá)的抗原的細(xì)胞毒性細(xì)胞(CTL)殺死，或者能被活化的NK細(xì)胞殺死；-或者含有變應(yīng)性抗原的變應(yīng)性顆粒，它能被對(duì)此變應(yīng)性抗原特異的抗體封閉或滅活，所述抗體在體液免疫應(yīng)答中產(chǎn)生。變應(yīng)性顆粒包括活性變應(yīng)性顆粒，例如花粉或寄生蟲例如蜱螨類或碩大利什曼原蟲和惰性變應(yīng)性顆粒，例如灰塵和貓毛發(fā)顆粒。
在間質(zhì)中異常釋放的有免疫毒性特性的蛋白包括-有免疫抑制特性的蛋白，例如HIV1的Tat蛋白、乳頭瘤病毒的E7蛋白、α干擾素(IFNα)、TGFβ或IL10、循環(huán)形式的p53蛋白或者還有Fas配體致細(xì)胞凋亡細(xì)胞因子(Fasl)；-使免疫應(yīng)答偏離從而產(chǎn)生有害作用的蛋白，例如刺激IgE同種型抗體產(chǎn)生的IL4細(xì)胞因子，IgE可造成例如肥大細(xì)胞的組胺異常釋放，從而可能導(dǎo)致強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，甚至器官損傷，表現(xiàn)為過(guò)敏性休克形式。
有生血管特性的蛋白是誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生的蛋白，例如VEGF細(xì)胞因子。在癌細(xì)胞腫瘤的情況下，有生血管特性的蛋白在腫瘤周圍間質(zhì)中的局部釋放可以在稱作新血管形成的事件中誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的某種增生，從而允許腫瘤的血管化，血管化對(duì)腫瘤存活來(lái)說(shuō)是必需的，更具體地血管形成可以為構(gòu)成腫瘤的癌細(xì)胞提供生存和增殖所需的營(yíng)養(yǎng)。
粘膜免疫是指誘導(dǎo)導(dǎo)致主要IgA同種型抗體產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答(此抗體由位于上皮組織的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，稱作分泌型IgA抗體(s-IgA))和在淋巴節(jié)(腸系膜淋巴節(jié)、陰道的髂淋巴節(jié))中誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。
系統(tǒng)免疫是指誘導(dǎo)導(dǎo)致主要IgG同種型抗體產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答(此抗體全身循環(huán)，特別是通過(guò)血清途徑循環(huán))和在外周淋巴節(jié)或脾中誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。
根據(jù)本發(fā)明顯示，對(duì)于如上限定的各種復(fù)合超免疫原化合物，體內(nèi)獲得的免疫應(yīng)答水平比施用彼此沒(méi)有物理上連接的多肽(a)和(b)后觀察到的免疫應(yīng)答水平要高的多。
不想要受到任何理論的束縛，申請(qǐng)人認(rèn)為，在復(fù)合超免疫原中多肽(a)提供了輔助T細(xì)胞表位，該表位將刺激“輔助”效應(yīng)并因此活化對(duì)多肽(b)的體液免疫應(yīng)答或增加該體液免疫應(yīng)答的活化。當(dāng)多肽(b)是自體細(xì)胞因子，例如設(shè)計(jì)用于向人給藥的復(fù)合超免疫原中的人IL4，則為了誘導(dǎo)抗多肽(b)的抗體產(chǎn)生將尤其需要免疫原性多肽(a)的此輔助作用。
根據(jù)本發(fā)明顯示，當(dāng)gp160-滅活的Tat(類毒素)肽綴合物體內(nèi)給藥時(shí)，抗天然Tat蛋白的IgG類抗體的產(chǎn)生量可以比滅活的Tat蛋白(類毒素)以游離形式給藥時(shí)的反應(yīng)高兩倍。而且，被gp160-Tat(類毒素)復(fù)合超免疫原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可以中和天然Tat蛋白100％的活性，而在Tat蛋白(類毒素)以游離形式給藥后觀察到抗體對(duì)Tat蛋白活性的最大中和是75％。
而且，實(shí)施例的結(jié)果顯示，用gp160-Tat(類毒素)復(fù)合超免疫原免疫的動(dòng)物的脾細(xì)胞比用Tat(類毒素)免疫過(guò)的動(dòng)物的脾細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的MIP1α和MIP1β趨化因子，這說(shuō)明使用根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合超免疫原可以獲得對(duì)免疫細(xì)胞的最佳刺激。
用gp160-Tat(類毒素)復(fù)合超免疫原免疫的動(dòng)物的脾細(xì)胞，當(dāng)其在體外被天然Tat蛋白活化時(shí)，還產(chǎn)生大量的干擾素-γ。
用根據(jù)本發(fā)明的其他超免疫原，例如E7-SIAB-VEGF綴合物或者Betv1a-IL4綴合物也獲得類似的結(jié)果。
因此，使用如上面限定的復(fù)合超免疫原至少在某些情況下可以使治療效果增強(qiáng)，這可以通過(guò)分開使用多肽(a)和(b)而觀察到，或者也可以通過(guò)使用沒(méi)有彼此物理相連的多肽(a)和(b)的組合而觀察到，而且這種增強(qiáng)至少有兩個(gè)原因(i)由于同時(shí)降低或阻斷了免疫抑制、免疫細(xì)胞凋亡或血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，從而可以誘導(dǎo)對(duì)腫瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原或病毒感染細(xì)胞表達(dá)的抗原的有效免疫應(yīng)答(該反應(yīng)根據(jù)情況可以是細(xì)胞類型或體液類型)，或者，由于降低或封閉了IL4誘導(dǎo)的導(dǎo)致IgE抗體產(chǎn)生的同種型轉(zhuǎn)換，從而可以誘導(dǎo)有效但無(wú)害的針對(duì)變應(yīng)原的免疫應(yīng)答；(ii)在許多情況下，可觀察到針對(duì)肽綴合物中的一個(gè)免疫原性多肽的免疫應(yīng)答的增強(qiáng)，這是因?yàn)閹в行螺o助位點(diǎn)的第二免疫原性多肽被聯(lián)合呈遞給免疫系統(tǒng)細(xì)胞，這可以例如在gp160-Tat(類毒素)復(fù)合超免疫原情況中看到。
用于治療某些癌癥及某些病毒感染的復(fù)合超免疫原根據(jù)本發(fā)明使用的復(fù)合超免疫原的第一必要技術(shù)特征，第一免疫原性多肽(a)選自(i)癌細(xì)胞選擇性表達(dá)的、病毒感染細(xì)胞選擇性表達(dá)的或構(gòu)成變應(yīng)性致病抗原結(jié)構(gòu)的，如果需要的話，去毒形式的免疫原性蛋白，和(ii)衍生自(i)的蛋白。
根據(jù)本發(fā)明使用的復(fù)合超免疫原的第二必要技術(shù)特征，免疫原性多肽(b)選自(i)間質(zhì)局部循環(huán)蛋白，如果需要的話，去毒形式的該蛋白，和(ii)衍生自(i)的蛋白。
當(dāng)癌細(xì)胞選擇表達(dá)的免疫原性蛋白、病毒感染細(xì)胞選擇表達(dá)的免疫原性蛋白或組成變應(yīng)性致病抗原結(jié)構(gòu)的免疫原性蛋白有毒性，例如有免疫毒性時(shí)，或者當(dāng)間質(zhì)局部循環(huán)蛋白有毒性，例如有免疫毒性時(shí)，在沒(méi)有預(yù)先降低或封閉其毒性，例如其免疫毒性而保留其免疫原性時(shí)，其本身不能用作根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合超免疫原的多肽(a)或多肽(b)。
如果一種免疫原性蛋白施用于人或動(dòng)物時(shí)可對(duì)所述人或動(dòng)物的健康造成嚴(yán)重有害效應(yīng)，例如誘導(dǎo)免疫毒性以麻痹免疫防御應(yīng)答或引起該反應(yīng)偏離，則此免疫原性蛋白有初始毒性。
如果一種免疫原性蛋白在對(duì)人或動(dòng)物給藥時(shí)引起下列效應(yīng)之一，則此免疫原性蛋白有初始免疫毒性-免疫抑制，包括免疫細(xì)胞凋亡，這可見(jiàn)于HIV1的Tat蛋白、乳頭瘤病毒的E7、IFNα、TGFβ或IL10細(xì)胞因子，或者還有在間質(zhì)中循環(huán)的p53細(xì)胞調(diào)節(jié)因子；-體液免疫應(yīng)答的偏離，例如誘導(dǎo)導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgE的同種型轉(zhuǎn)換，這可見(jiàn)于IL4。
通過(guò)修飾可以使初始有毒(例如免疫毒性)的免疫原性蛋白去毒，更具體地可以使用物理的、化學(xué)的或基因工程的技術(shù)來(lái)去毒，這在以下詳述中有更詳細(xì)的描述。
也可以使用能使多肽(a)和/或多肽(b)去毒的技術(shù)，尤其是化學(xué)技術(shù)從沒(méi)有初始毒性或免疫毒性的蛋白來(lái)制備多肽(a)或多肽(b)，因?yàn)榇颂幚砟苁苟嚯姆€(wěn)定以利于更好的疫苗保存。
本質(zhì)上說(shuō)，與抗破傷風(fēng)或抗白喉疫苗的類毒素，去毒毒素類似，去毒蛋白保留其免疫原性，即，誘導(dǎo)以下反應(yīng)的能力-對(duì)致病抗原結(jié)構(gòu)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，或細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，其中，所述去毒蛋白制備自癌細(xì)胞選擇表達(dá)的免疫原性蛋白、病毒感染細(xì)胞選擇表達(dá)的免疫原性蛋白、或者組成變應(yīng)性致病結(jié)構(gòu)的免疫原性蛋白；-或，對(duì)如前面限定的間質(zhì)局部循環(huán)蛋白的體液免疫應(yīng)答，其中，所述去毒蛋白制備自此間質(zhì)循環(huán)蛋白。
從包含在靶致病抗原結(jié)構(gòu)或靶間質(zhì)局部循環(huán)蛋白中的免疫原性蛋白“衍生”是指，免疫原多性肽(a)或(b)可以從包括在初始免疫原性蛋白中的肽片段制得，或者多肽(a)或(b)與初始免疫原性蛋白相比含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失或添加，這在說(shuō)明書中有進(jìn)一步描述。在所有情況下，衍生自初始免疫原性蛋白的多肽(a)或(b)保留了誘導(dǎo)對(duì)靶致病性抗原結(jié)構(gòu)或靶間質(zhì)局部循環(huán)蛋白的免疫應(yīng)答的能力。如果初始免疫原性蛋白有毒性，衍生自它的多肽(a)或(b)將有減弱的毒性或者失去毒性。這是因?yàn)槎嚯?a)或(b)僅僅是初始免疫原性蛋白的無(wú)毒片段，或者其相對(duì)于初始免疫原性蛋白的氨基酸序列包含了減弱或封閉初始蛋白的毒性的氨基酸修飾。
根據(jù)本發(fā)明用于預(yù)防或治療某些癌癥或某些病毒感染的復(fù)合超免疫原的第一實(shí)施方案，所述復(fù)合超免疫原的特征在于多肽(a)誘導(dǎo)對(duì)癌細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞特異表達(dá)的抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
“細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)”是指，復(fù)合超免疫原結(jié)構(gòu)內(nèi)的多肽(a)可用于起始有效的免疫應(yīng)答，在癌細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞的情況下，所述免疫應(yīng)答主要為特異識(shí)別靶致病性抗原結(jié)構(gòu)的細(xì)胞毒性細(xì)胞(CTL)的產(chǎn)生，其中所述抗原結(jié)構(gòu)為例如腫瘤抗原或病毒抗原，它以與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)I類抗原結(jié)合的形式呈遞在癌細(xì)胞或感染細(xì)胞的表面；或者所述免疫應(yīng)答主要為NK殺傷細(xì)胞(優(yōu)選地破壞癌細(xì)胞)的產(chǎn)生。
另外，免疫原性多肽(a)誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可以引起輔助性T細(xì)胞(T輔助細(xì)胞)的活化，從而增強(qiáng)或允許誘導(dǎo)基于免疫原性多肽(b)并特異針對(duì)間質(zhì)循環(huán)蛋白的體液應(yīng)答。這并不意味著不誘導(dǎo)對(duì)多肽(a)的體液免疫應(yīng)答。然而，在癌癥或病毒感染的情況下，對(duì)多肽(a)的體液應(yīng)答的誘導(dǎo)，盡管其與細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)一起發(fā)生，但不是所要尋求的目標(biāo)。
優(yōu)選地，由宮頸癌(HUCC)的癌細(xì)胞或者HIV感染的細(xì)胞或者ATL白血病細(xì)胞特異表達(dá)的抗原分別選自(i)乳頭瘤病毒的L1、L2和E7蛋白，(ii)HIV-1病毒的gp160、p24、p17、Nef和Tat蛋白，(iii)Tax蛋白，(iv)HTLV-1或2病毒的gp61或gag蛋白(如果需要，這些蛋白可以去毒)或衍生自它們的蛋白。
多肽(a)優(yōu)選地選自HIV1的免疫原性蛋白，此蛋白的免疫原性片段或衍生自此的蛋白。
優(yōu)選地，第一免疫原性多肽(a)選自(i)乳頭瘤病毒的L1、L2和E7蛋白，(ii)HIV-1病毒的gp160、p24、p17、Nef和Tat蛋白，(iii)HTLV-1或2病毒的Tax蛋白(如果需要，這些蛋白可以去毒)或衍生自它們的蛋白。
為了誘導(dǎo)對(duì)致病性抗原結(jié)構(gòu)的免疫應(yīng)答，多肽(a)可以含有致病性蛋白本身。
以上列出的致病性蛋白中的一些有免疫毒性，例如，HIV-1病毒的Tat蛋白、乳頭瘤病毒的E7蛋白或者HTLV-1病毒的Tax蛋白，因此其本身不能用作復(fù)合超免疫原的多肽(a)。
在這種情況下，多肽(a)優(yōu)選選自(i)致病性蛋白的失活形式，例如去毒形式，(ii)致病性蛋白的失活片段，和(iii)衍生自致病性蛋白的無(wú)初始免疫毒性的蛋白，例如基因突變體或此蛋白的片段。
制備例如上文中限定的多肽(a)的各種技術(shù)在說(shuō)明書中有進(jìn)一步描述。
優(yōu)選地，多肽(a)和多肽(b)選自a)對(duì)于預(yù)防或治療AIDS-多肽(a)HIV-1病毒的gp160、p24、p17、Nef和Tat蛋白(如果需要的話，可以為去毒或穩(wěn)定化形式)、此蛋白的免疫原性片段或者衍生自它們的免疫原性蛋白(Zagury等1998)；-多肽(b)Tat、IFNα和TGFβ蛋白(如果需要的話，可以去毒)、此類蛋白的免疫原性片段或者衍生自此的免疫原性蛋白；b)對(duì)于預(yù)防或治療宮頸癌-多肽(a)乳頭瘤病毒，優(yōu)選的乳頭瘤病毒16或18株系的L1、L2和E7蛋白(如果需要的話可以去毒或穩(wěn)定化)、此類蛋白的免疫原性片段或者衍生自它們的免疫原性蛋白(Le Buanec等，1999)；-多肽(b)E7、IFNα、TGFβ、TNFα和VEGF蛋白(如果需要的話去毒或穩(wěn)定化的形式)、此類蛋白的免疫原性片段或者衍生自它們的免疫原性蛋白；c)對(duì)于預(yù)防或治療由HTLV1或2病毒誘導(dǎo)的ATL白血病-多肽(a)HTLV-1或2病毒的gp61和Tax蛋白(如果需要的話可以去毒)、此類蛋白的免疫原性片段或者衍生自它們的免疫原性蛋白(Cowan等，1997；Mori等，1996)；-多肽(b)Tax、IL10、IFNα和TGFβ蛋白(去毒的)、此類蛋白的免疫原性片段或者衍生自它們的蛋白；d)對(duì)于預(yù)防或治療結(jié)腸癌-多肽(a)CEA和p53蛋白(如果需要的話可以去毒)、此類蛋白的免疫原性片段或者衍生自它們的免疫原性蛋白(Zusman等，1996)；-多肽(b)TGFβ、IL10、p53、FasL和VEGF蛋白(去毒的)、此類蛋白的免疫原性肽片段或者衍生自它們的免疫原性蛋白；e)對(duì)于預(yù)防或治療乳腺癌-多肽(a)Di12蛋白，此蛋白的免疫原性片段或者衍生自它們的蛋白(Yoshiji等，1996)；
-多肽(b)TGFβ、TNFα和VEGF蛋白(如果需要的話可以去毒)、此類蛋白的免疫原性片段或者衍生自它們的免疫原性蛋白；f)對(duì)于預(yù)防或治療胰腺癌-多肽(a)CaSm蛋白(如果需要可以去毒)、此蛋白的免疫原性片段或者衍生自它們的免疫原性蛋白；-多肽(b)蛋白VEGF和TNFα蛋白(如果需要的話去毒或穩(wěn)定化)此類蛋白的免疫原性片段或者衍生自它們的免疫原性蛋白；g)對(duì)于預(yù)防或治療前列腺癌-多肽(a)OSA和ETS2蛋白(如果需要的話去毒或穩(wěn)定化)、此類蛋白的免疫原性片段或者衍生自它們的免疫原性蛋白(Sementchenko VI等，1998)；-多肽(b)IL6和TGFβ蛋白(如果需要的話去毒或穩(wěn)定化)、此類蛋白的免疫原性片段或者衍生自它們的免疫原性蛋白(Adler等，1999)。
為了預(yù)防或治療某些其他癌癥，也可以將TSA抗原(腫瘤特異性抗原類型)或TAA抗原(腫瘤相關(guān)抗原類型)、此類蛋白的免疫原性片段或者衍生自它們的免疫原性蛋白用作免疫原性多肽(a)。
Gp160、Tat、Tax和p53蛋白在其天然形式下是有毒的。從這些蛋白制備免疫原性多肽(a)必須要對(duì)其去毒，或者制備其無(wú)毒的免疫原性肽片段或衍生自其的無(wú)毒蛋白，例如可以通過(guò)相對(duì)于參照天然蛋白序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失或添加來(lái)制備。
IFNα、Tat、TGFβ、E7、Tax、p53和FasL蛋白在其天然形式下高濃度時(shí)是有免疫毒性的。從這些蛋白制備免疫原性多肽(b)必須要對(duì)其去毒，或者制備其無(wú)毒的免疫原性肽片段或衍生自其的無(wú)毒蛋白，例如可以通過(guò)相對(duì)于參照天然蛋白序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失或添加來(lái)制備。
VEGF免疫原性蛋白可以以天然形式或者以化學(xué)處理后的穩(wěn)定形式用作組成復(fù)合超免疫原的多肽(b)，其中所述化學(xué)處理優(yōu)選為用于使蛋白去毒的化學(xué)處理。
以上列出的免疫原性多肽(b)中有免疫毒性或生血管特性的細(xì)胞因子或細(xì)胞調(diào)節(jié)因子具有如下詳述的特征-TGFβ蛋白TGFβ是由多種癌細(xì)胞產(chǎn)生的主要免疫抑制細(xì)胞因子；-IL10蛋白IL10也是主要免疫抑制細(xì)胞因子，F(xiàn)asL(Fas配體)同樣也是；-p53蛋白由癌細(xì)胞異常表達(dá)的p53調(diào)節(jié)蛋白是現(xiàn)在技術(shù)已證實(shí)的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。當(dāng)p53蛋白自異常細(xì)胞釋放并在胞外間質(zhì)區(qū)室中累積時(shí)，它可以作用于免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制因子和致細(xì)胞凋亡(免疫毒性的)間質(zhì)因子的作用，因此是具有免疫毒性的間質(zhì)循環(huán)蛋白，根據(jù)本發(fā)明p53是復(fù)合超免疫原誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答的作用對(duì)象，其中所述復(fù)合超免疫原中的多肽(b)為喪失初始蛋白的免疫毒性特性的去毒的p53蛋白或其衍生蛋白。
-VEGF，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF細(xì)胞因子是血管形成的主要細(xì)胞因子，其激活內(nèi)皮細(xì)胞增生；-IL6、IFNγ和TNFα促炎細(xì)胞因子也參與血管形成過(guò)程，激活內(nèi)皮細(xì)胞粘著分子(ICAM、VCAM、和E選擇蛋白)的表達(dá)。
由組成本發(fā)明復(fù)合超免疫原的多肽(b)誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答通過(guò)如下方式使得對(duì)多肽(a)的特異免疫應(yīng)答可以有效地產(chǎn)生(i)中和或封閉某些異常產(chǎn)生的間質(zhì)局部循環(huán)蛋白，例如IFNα或Tat蛋白的免疫抑制活性(免疫毒性)；或者(ii)中和或封閉某些異常產(chǎn)生的間質(zhì)局部循環(huán)蛋白，例如p53細(xì)胞調(diào)節(jié)因子所具有的誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡的特性(免疫毒性)；或者(iii)中和或封閉由某些異常產(chǎn)生的間質(zhì)循環(huán)蛋白，例如VEGF誘導(dǎo)的血管形成，包括腫瘤的新血管形成。
對(duì)預(yù)防或治療某些癌癥和某些病毒感染有用的第一復(fù)合超免疫原優(yōu)選家族包括以下復(fù)合超免疫原-復(fù)合超免疫原(a)gp160-(b)Tat類毒素；-復(fù)合超免疫原(b)Tat肽[1-15；46-60]-(a)gp160；-復(fù)合超免疫原(a)Tat類毒素-(b)IFNα；
-復(fù)合超免疫原(a)Tat類毒素-(b)Tat肽[1-15；46-60]。
第二復(fù)合超免疫原優(yōu)選家族包括以下復(fù)合超免疫原-復(fù)合超免疫原(a)L1-(b)E7；-復(fù)合超免疫原(a)E7-(b)VEGF。
上文中，“(a)”代表多肽(a)，“(b)”代表多肽(b)。以上列出的復(fù)合超免疫原的結(jié)構(gòu)是從左到右為NH2-端部分到COOH-端部分。
在復(fù)合超免疫原(a)gp160-(b)Tat類毒素中，gp160蛋白誘導(dǎo)對(duì)HIV1感染細(xì)胞的細(xì)胞免疫應(yīng)答，該細(xì)胞免疫應(yīng)答可以被誘導(dǎo)的中和或封閉HIV1Tat蛋白(已知可以引起IFNα免疫抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生)的免疫毒性特性的抗體所促進(jìn)。
在(a)L1-(b)E7超免疫原中，HPV的L1蛋白誘導(dǎo)對(duì)HPV感染細(xì)胞(該細(xì)胞可以是癌性的)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答可以被中和或封閉HPV E7蛋白的免疫毒性特性的抗體所促進(jìn)。
由宮頸癌的癌細(xì)胞表達(dá)并由此也可以作為識(shí)別此致病性抗原結(jié)構(gòu)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞或NK細(xì)胞的靶標(biāo)的E7蛋白同樣可以用于制備復(fù)合超免疫原的多肽(a)，其中E7蛋白可以為去毒的E7蛋白形式或者衍生自E7蛋白并失去免疫毒性的蛋白形式。
在復(fù)合超免疫原(a)E7-(b)VEGF中，E7蛋白誘導(dǎo)對(duì)HPV感染細(xì)胞(該細(xì)胞可以是癌性的)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答由于中和或封閉VEGF細(xì)胞因子的生血管特性的抗體的誘導(dǎo)而變得更為有效。
用于預(yù)防或治療過(guò)敏反應(yīng)的復(fù)合超免疫原在用于預(yù)防或治療過(guò)敏反應(yīng)的復(fù)合超免疫原中，多肽(a)誘導(dǎo)針對(duì)組成顆粒致病性抗原結(jié)構(gòu)的變應(yīng)性致病蛋白的體液免疫應(yīng)答，此顆粒致病性抗原結(jié)構(gòu)可以是，例如花粉、蜱螨類、灰塵或貓的毛發(fā)。
優(yōu)選地，變應(yīng)性致病蛋白選自Betv1a，Der p1和Fel d1蛋白，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
優(yōu)選地，多肽(a)選自Betv1a，Der p1和Fel d1蛋白、它們的免疫原性肽片段或衍生自它們的免疫原性蛋白。
Betv1抗原具體地由Ferreira等(1993)公開，Der p1抗原具體地由Tovey等(1981)公開，F(xiàn)el d1抗原具體地由Morgenstern等(1991)公開。
優(yōu)選地，復(fù)合超免疫原中的多肽(b)誘導(dǎo)中和或封閉IL4細(xì)胞因子的抗體產(chǎn)生，所述IL4主要由Th2型T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生并可以引起體液免疫應(yīng)答向IgE同種型抗體產(chǎn)生的方向偏移。
因此多肽(b)優(yōu)選是自體IL4蛋白，并優(yōu)選通過(guò)化學(xué)、物理或遺傳處理去毒的自體IL4蛋白，此蛋白的免疫原性肽片段或者衍生自它的蛋白。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，多肽(b)誘導(dǎo)中和或封閉IL5細(xì)胞因子的抗體產(chǎn)生，所述IL5主要由Th2型T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。
根據(jù)第二實(shí)施方案，多肽(b)優(yōu)選是自體IL5蛋白(優(yōu)選是去毒的)，此蛋白的免疫原性肽片段或者衍生自它的蛋白。
在復(fù)合超免疫原(a)Betv1a-(b)LI4(鼠的)中，Betv1a蛋白誘導(dǎo)針對(duì)變應(yīng)性致病抗原結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)或粘膜體液免疫應(yīng)答，該反應(yīng)通過(guò)產(chǎn)生IgG或IgA同種型抗體，優(yōu)選分泌的IgA而實(shí)現(xiàn)；而IL4蛋白誘導(dǎo)對(duì)此細(xì)胞因子的免疫應(yīng)答，從而允許在過(guò)敏癥狀初期中和或封閉可導(dǎo)致IgE抗體產(chǎn)生的同種型轉(zhuǎn)換，同時(shí)還誘導(dǎo)對(duì)致病變應(yīng)原的有效免疫應(yīng)答。針對(duì)自體IL4蛋白的體液免疫應(yīng)答由于復(fù)合超免疫原中多肽(a)的同時(shí)存在而變得可能，此多肽(a)含有誘導(dǎo)輔助T細(xì)胞活化的輔助T細(xì)胞表位，而輔助T細(xì)胞活化是針對(duì)IL4的B細(xì)胞體液免疫應(yīng)答所必需的。
“輔助T細(xì)胞表位”是免疫原性多肽的一個(gè)區(qū)域，它可以被至少一個(gè)輔助T淋巴細(xì)胞克隆的抗原受體所選擇性地識(shí)別，免疫原性多肽與特異識(shí)別此表位區(qū)域的T淋巴細(xì)胞受體的結(jié)合將導(dǎo)致所述T淋巴細(xì)胞克隆的活化，此T淋巴細(xì)胞克隆將自身增殖并產(chǎn)生細(xì)胞因子例如IL2，而這又將允許體液免疫應(yīng)答發(fā)生，包括允許針對(duì)自體蛋白的體液免疫應(yīng)答發(fā)生，對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合超免疫原中的IL4而言情況正是如此。
通過(guò)去毒作用，滅活組成復(fù)合超免疫原的多肽(a)或多肽(b)的免疫抑制或致細(xì)胞凋亡特性如上面闡釋，用于本發(fā)明的復(fù)合超免疫原應(yīng)當(dāng)沒(méi)有毒性，更具體地不應(yīng)當(dāng)由于其成分(更具體地多肽(a)或多肽(b))之一的內(nèi)在特性而誘導(dǎo)任何免疫系統(tǒng)抑制或造成免疫系統(tǒng)的靶向反應(yīng)發(fā)生偏離。
因此，如果多肽(a)初始具有免疫毒性，則在將其包含于本發(fā)明復(fù)合超免疫原之前，首先要滅活這些特性。
相似地，如果組成根據(jù)本發(fā)明免疫原性肽綴合物的多肽(b)為具有免疫毒性特性的細(xì)胞因子或細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，如IL4，則在其被包含于所述復(fù)合超免疫原中之前，首先要滅活這些特性，其中所述免疫毒性特性為免疫抑制或致細(xì)胞凋亡特性或者為使免疫應(yīng)答偏離的能力，例如使輔助T細(xì)胞(T輔助細(xì)胞)反應(yīng)向利于Th2型細(xì)胞產(chǎn)生的方向偏移的能力。
使用有毒的多肽(a)和/或(b)時(shí)重要的是，以尤其是物理、化學(xué)和/或遺傳修飾的形式(滅活的但仍有免疫原性)及非本來(lái)的(或天然)形式，或者以適當(dāng)?shù)纳w倫制劑形式使用，以便其不再具有天然蛋白的免疫毒性效應(yīng)或引起免疫應(yīng)答偏離的特性但仍保留其免疫原性特性。
相反地，非免疫毒性多肽(a)或多肽(b)，例如VEGF，可以以天然形式使用或者以經(jīng)過(guò)穩(wěn)定化處理后的修飾形式使用。
通過(guò)熱、UV輻射、X射線或與富含O2的空氣接觸可以實(shí)現(xiàn)物理處理。在化學(xué)部分(例如巰基)之間產(chǎn)生分子內(nèi)修飾的物理處理能適當(dāng)?shù)馗淖兎肿訕?gòu)象并滅活其功能而保留其免疫原性特性。
通過(guò)偶聯(lián)劑例如二醛或以二醛(優(yōu)選戊二醛)預(yù)處理活化的載體蛋白，可以實(shí)現(xiàn)化學(xué)處理。使用一元醛，更具體地為甲醛也可以實(shí)現(xiàn)此化學(xué)處理。對(duì)于此，可以參考WO-A-96/27389的教導(dǎo)。
特別地，也可以使用其他方法例如羧甲基化或氨甲?；M(jìn)行化學(xué)處理。在WO-A-99/33872中闡述了羧甲基化技術(shù)的例子。也可以通過(guò)N-乙基馬來(lái)酰亞胺化并結(jié)合或不結(jié)合戊二醛化來(lái)實(shí)施化學(xué)處理。
也可以提及以下反應(yīng)作為滅活技術(shù)蛋白的至少一個(gè)巰基官能團(tuán)與4-氯-7-磺基苯并呋咱銨、N-[碘乙基]三氟乙酰胺或N-(6-[7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺]己基)-3’-(2’-吡啶二硫)-丙酰胺反應(yīng)，以及蛋白的至少一個(gè)氨基官能團(tuán)與乙酰亞氨酸乙基酯、酐、2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷(2-iminothiolane)鹽酸鹽、N-琥珀酰亞胺基S-乙?；虼宜狨?、乙酸磺基琥珀酰亞胺酯、4-O-[4，4-二甲氧基三苯甲基]丁酸磺基琥珀酰亞胺酯、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸琥珀酰亞胺酯、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀亞胺酯或苯甲酰甲醛反應(yīng)。
使用油性液體，例如弗氏不完全佐劑中的蓋倫制劑形式也可以滅活免疫原，或者也可以修飾毒性效應(yīng)所需的非共價(jià)連結(jié)(靜電力、范德華力或氫鍵)。
通過(guò)基因工程進(jìn)行殘基插入、缺失或替換可以獲得遺傳修飾物，上述操作設(shè)計(jì)用于減弱或抑制天然分子的有害功能位點(diǎn)?？梢詫?duì)遺傳突變體進(jìn)行或不進(jìn)行補(bǔ)充化學(xué)和/或物理處理。以上的修飾蛋白例如可以制備自與免疫致病性蛋白的肽序列有相同或類似序列的蛋白，所述免疫致病性蛋白尤其是免疫抑制蛋白或生血管蛋白，例如HIV1 Tat蛋白、乳頭瘤病毒的E7蛋白或HTLV1 Tax蛋白或這些蛋白的片段，并且上述修飾蛋白可以通過(guò)例如在樹脂上的傳統(tǒng)肽合成或基因工程獲得。所有這些方法都是本領(lǐng)域已知的。這些失活但有免疫原性的突變體可以至少是編碼這些產(chǎn)物的DNA分子。在本發(fā)明中此DNA分子尤其有意義，這在下文中可以看到。
為了檢查具有免疫毒性和/或生血管特性的天然蛋白是否可以被針對(duì)(經(jīng)處理去毒或穩(wěn)定化的)本發(fā)明修飾蛋白或者其修飾或未修飾片段的抗體正確地識(shí)別，可以例如在有特異性抗體存在情況下通過(guò)ELISA免疫學(xué)檢查抗原-抗體復(fù)合體的形成。
在優(yōu)選實(shí)施條件下，免疫原性化合物由天然化合物(蛋白或多肽片段)經(jīng)過(guò)醛、或者氨甲酰、或者羧甲基、或者馬來(lái)酰亞胺處理產(chǎn)生。
為了測(cè)定免疫毒性和/或生血管特性被修飾的蛋白或此蛋白的片段是否令人滿意地保留了免疫原特性(即，它是否被滅活但沒(méi)有變性)以致可以用于產(chǎn)生能封閉所述天然蛋白的效應(yīng)的抗體，可以用根據(jù)本發(fā)明的免疫原性化合物免疫動(dòng)物(兔子、大鼠、小鼠)并檢查產(chǎn)生的抗體是否能中和蛋白的免疫抑制、致細(xì)胞凋亡或生血管活性。
為了測(cè)定修飾的免疫毒性蛋白或片段是否失去了其免疫毒性特性的至少期望部分，可以例如在加強(qiáng)抗原(例如PPD或破傷風(fēng)類毒素抗原)刺激的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)物上研究修飾蛋白對(duì)Th2(IL4)和Th1(IFNγ)細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或?qū)γ庖咭种频挠绊憽?br> 免疫毒性(免疫抑制或致細(xì)胞凋亡或引起免疫應(yīng)答偏離)或生血管特性被修飾的免疫原性蛋白可以衍生自任何蛋白，更尤其是具有由AIDS患者的感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的局部免疫毒性作用的蛋白；更尤其要提到的是HIV1病毒的Tat蛋白、乳頭瘤病毒的E7蛋白或HTLV病毒的Tax蛋白。也要提到的是由活化的免疫細(xì)胞產(chǎn)生的依賴甘露聚糖的凝集素。還要提到的是具有生血管特性的VEGF和具有免疫毒性特性并導(dǎo)致免疫應(yīng)答偏向Th2反應(yīng)的IL4。
如上面已經(jīng)闡釋的，本發(fā)明復(fù)合超免疫原的多肽(a)或多肽(b)也可以為作為靶致病抗原結(jié)構(gòu)的組分的初始免疫原性蛋白的片段或者與初始免疫原性蛋白相比在氨基酸上有修飾的多肽。
可以在此蛋白或片段的氨基酸中包含一個(gè)或多個(gè)修飾，例如缺失、替換、添加或官能團(tuán)化例如氨基酸酰化，前提條件是這些修飾應(yīng)屬于上面限定的范圍(缺少毒性、免疫學(xué)特性)。例如，通常，用異亮氨酸代替亮氨酸并不改變此類特性；通常，對(duì)免疫致病性蛋白，尤其是免疫毒性或生血管性蛋白，修飾應(yīng)施用于少于40％的氨基酸，優(yōu)選少于20％，更優(yōu)選地少于10％的氨基酸上。重要的是修飾的蛋白或片段不應(yīng)發(fā)生變性(因?yàn)檫@在例如使用物理處理(例如熱)時(shí)可能發(fā)生)以便保持其構(gòu)象位點(diǎn)以使修飾衍生物誘導(dǎo)的抗體對(duì)天然蛋白具有活性。
在優(yōu)選條件下，本發(fā)明免疫原性化合物含有免疫致病性蛋白(尤其是免疫毒性的或生血管的)之全部或一個(gè)片段的至少50％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少90％，更特別的是所述免疫抑制或生血管蛋白的全部或幾乎全部。
通常，就修飾而言，修飾的免疫原與天然免疫毒性蛋白或其部分的同源性或相似性及免疫原性多肽的大小及應(yīng)用方式及組成本發(fā)明復(fù)合超免疫原的免疫原性多肽與免疫原性蛋白(例如破傷風(fēng)類毒素)的偶聯(lián)條件，可以更具體地參看WO-A-86/06414或EP-A-0.220.273及同族PCT/US 86/00831，它們的教導(dǎo)以參考文獻(xiàn)形式并入此處。
也優(yōu)選通過(guò)基因重組獲得的例如上面限定的免疫原性化合物，它與HIV1的Tat蛋白、HTLV1的Tax蛋白或者HPV的L2及E7蛋白、或者由活化免疫細(xì)胞產(chǎn)生的甘露聚糖依賴性凝集素或者這些蛋白的片段具有至少70％的肽同源性。
也優(yōu)選例如上面限定的免疫原性化合物，其特征在于用醛、氨甲酰、羧甲基、或者馬來(lái)酰亞胺對(duì)其進(jìn)行處理。
還優(yōu)選例如上面限定的免疫原性化合物，其特征在于用佐劑調(diào)制使其生物學(xué)上失活，例如弗氏不完全佐劑(IFA)中的油性乳劑。
也可以從同源突變體衍生所需的免疫原性化合物。
此處應(yīng)當(dāng)注意的是，使用生理活性蛋白的蓋倫制劑，可以隱藏其生物學(xué)活性而保留其免疫原性。
羧甲基化反應(yīng)使得可以在氨基酸序列的半胱氨酸殘基水平上修飾巰基(硫氫基)。羧甲基化作為本領(lǐng)域人員已知的技術(shù)可以滅活依賴于SH基團(tuán)的某些有毒功能，F(xiàn)rankel等(Cell，vol.55，1988)公開了用于Tat蛋白的此技術(shù)。
除了羧甲基化，氨甲酰化或馬來(lái)酰亞胺化也可以用于封閉SH基，并形成S-羧乙基、S-氨甲?；騍-馬來(lái)酰亞胺復(fù)合物。
例如，Tat蛋白有7個(gè)半胱氨酸。這些半胱氨酸參與形成鏈間及鏈內(nèi)二硫橋并有助于形成寡聚體。
在每種情況下的反應(yīng)產(chǎn)物是S-羧甲基半胱氨?；騍-羧甲基酰氨基半胱氨酰殘基。
片段可以包含例如8到110個(gè)氨基酸，優(yōu)選12-60個(gè)氨基酸，更優(yōu)選12-40個(gè)氨基酸。片段也可以含有一個(gè)或多個(gè)有1-5個(gè)附加氨基酸的C或N端側(cè)，所謂“附加”即不同于初始片段。此外，為了實(shí)現(xiàn)例如羧甲基化，片段還應(yīng)當(dāng)至少含有半胱氨酸。片段如果優(yōu)選本身是滅活的，則可以在需要時(shí)進(jìn)行與整個(gè)或幾乎整個(gè)蛋白相同的滅活處理。
上面提到的羧甲基化反應(yīng)同樣可以用其他化學(xué)試劑進(jìn)行，例如過(guò)甲酸、3-溴代丙酸、氮丙啶、(2-溴乙基)三甲基銨溴化物、2-溴乙烷磺酸、1，3-propanesulfone等。
在上述方法的優(yōu)選實(shí)施條件下，所述起始蛋白或所述起始片段可以為與標(biāo)記物的融合形式(FP)或非融合形式(P)。FP形式可以本身修飾分子構(gòu)象，并因此改變其活性。
本方法的起始蛋白或片段是已知產(chǎn)物，它們的滅活方法在文獻(xiàn)如WO-A-99/33872中有描述。此起始蛋白甚至可以購(gòu)買獲得(immunodiagnostics.Inc.貨號(hào)1002-2)或者進(jìn)行傳統(tǒng)制備。
特別是，可以通過(guò)如下方式制備上述起始蛋白或片段1)基因工程或生化合成方法合成；2)純化。
使用基因工程，可以用例如針對(duì)蛋白或其一個(gè)片段的抗體通過(guò)親和層析來(lái)純化產(chǎn)生的蛋白；也可以合成與標(biāo)記物融合的蛋白(FP)，標(biāo)記物可以用于與親和柱結(jié)合。
本發(fā)明復(fù)合超免疫原的優(yōu)選實(shí)施方案為了制備根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合超免疫原，可以用化學(xué)或遺傳重組的方法將多肽(a)和多肽(b)偶聯(lián)。
根據(jù)本發(fā)明肽綴合物的優(yōu)選實(shí)施方案，多肽(a)和(b)通過(guò)formolation、氨甲?；Ⅳ燃谆?、馬來(lái)酰亞胺化或通入氧氣鼓泡進(jìn)行氧化而在它們的免疫毒性特性方面被滅活和/或被穩(wěn)定化。
另一方面，如果使多肽(a)和(b)在免疫毒性或生血管特性方面被滅活，可以通過(guò)遺傳重組實(shí)現(xiàn)此滅活。
在本發(fā)明免疫原性肽綴合物的特定實(shí)施方案中，多肽(a)和(b)彼此直接地共價(jià)連接，例如通過(guò)-CO-NH-肽鍵連接。
然而，為了在免疫原性肽綴合物結(jié)構(gòu)中引入一些彈性，更具體地是允許免疫原性肽綴合物中多肽(a)和(b)一個(gè)相對(duì)另一個(gè)在空間上有一定活動(dòng)性，優(yōu)選綴合物中多肽(a)和(b)通過(guò)間隔鏈彼此分開的肽綴合物。
根據(jù)免疫原性肽綴合物的第一優(yōu)選實(shí)施方案，在所述綴合物中，通過(guò)選自SMCC和SIAB的間隔鏈(它們都是雙官能化合物)使多肽(a)和(b)彼此分開。
SIAB化合物，如Hermanson G.T.(1996，Bioconjugate techniques，SanDiegoAcademic Press，pp239-242)所公開，是下式(I)的化合物 SIAB化合物含有兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，分別是碘乙?；鶊F(tuán)和磺基-NHS酯基，兩個(gè)基團(tuán)分別與氨基和硫氫基反應(yīng)。
SMCC化合物，如Samoszuk M.K.等(1989，Antibody，ImmunoconjugatesRadiopharm.，2(1)37-46)所公開，是下式(II)的化合物 SMCC化合物含有兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，分別是磺基-NHS酯基和馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)，它們分別與氨基和硫氫基反應(yīng)。
根據(jù)第二優(yōu)選實(shí)施方案，復(fù)合超免疫原含有線性間隔肽作為間隔鏈。線性間隔肽優(yōu)選選自3-30個(gè)氨基酸長(zhǎng)，5-20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度是有利的，最優(yōu)選7-15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。
優(yōu)選地，線性間隔肽基本上，也就是排它地，由pH7.0時(shí)帶正電或負(fù)電的氨基酸組成，從而增加所述復(fù)合超免疫原的整體親水性。應(yīng)理解，應(yīng)當(dāng)避免使用由疏水氨基酸組成的間隔肽。優(yōu)選地，間隔肽的特征在于，它由聚(賴氨酸)鏈組成，此鏈由3-30個(gè)賴氨酸殘基組成，更優(yōu)選地5-20個(gè)，最優(yōu)選7-15個(gè)賴氨酸殘基長(zhǎng)度。
根據(jù)本發(fā)明復(fù)合超免疫原的另一實(shí)施方案，所述肽綴合物中，多肽(a)和(b)通過(guò)間隔鏈彼此分開，所述間隔鏈由分支間隔肽組成，所述分支間隔肽優(yōu)選聚(賴氨酸)的寡聚樹狀結(jié)構(gòu)(oligodendrimeric structure)，如Basak等(1995)公開的那些。
在本發(fā)明復(fù)合超免疫原的后一實(shí)施方案中，所述肽綴合物在每個(gè)綴合物分子中可以含有幾個(gè)拷貝的多肽(a)和(b)，多肽(a)和(b)的2-8個(gè)拷貝是有利的，優(yōu)選在每個(gè)綴合物分子中多肽(a)和(b)各有至多4個(gè)拷貝。
多肽(a)和(b)也可以一起包含于單個(gè)物理結(jié)構(gòu)中，例如直徑10-500納米，優(yōu)選10-1000納米，最優(yōu)選10-100納米的單顆粒上，所述顆粒例如IMS納米顆粒(參見(jiàn)如Aucouturier等(2001)的公開)，脫乙酰殼多糖(參見(jiàn)例如Sjaugrud等(1999)的公開)，脂質(zhì)體，或生物可降解顆粒例如聚乳酸(PLA)、聚-ε-己內(nèi)酯(PCL)或聚(內(nèi)交酯-共-乙交酯)(PLG)(參見(jiàn)Baras等(1999)的公開)。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，多肽(a)和(b)在單一載體結(jié)構(gòu)內(nèi)實(shí)現(xiàn)物理上連接，從而允許它們同時(shí)呈遞給免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。在這個(gè)特定實(shí)施方案中，多肽(a)和(b)固定于納米顆粒上，例如脫乙酰殼多糖納米顆粒、IMS納米顆粒、(可以從Societe Seppic Corporation，法國(guó)獲得的免疫調(diào)制劑、由脂質(zhì)納米顆粒組成，直徑范圍為100-300納米)或脂質(zhì)體。
優(yōu)選地，此納米顆粒有小尺寸，以至于可以同時(shí)將多肽(a)和(b)呈遞給細(xì)胞，就好像這些多肽共價(jià)連接成單個(gè)分子似的。納米顆粒的直徑范圍為10-1000nm是有利的，優(yōu)選10-500nm，更優(yōu)選10-300nm，最優(yōu)選10-200nm。
使用如下面限定的免疫原性肽綴合物主要用于治療AIDS、癌癥和過(guò)敏癥。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是含有兩個(gè)彼此物理相連的不同免疫原性多肽的復(fù)合超免疫原，兩個(gè)多肽分別為(a)誘導(dǎo)對(duì)惰性或活性細(xì)胞、微生物或顆粒致病性抗原結(jié)構(gòu)的細(xì)胞免疫應(yīng)答或細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的第一免疫原性多肽；(b)誘導(dǎo)產(chǎn)生能中和或封閉間質(zhì)局部循環(huán)蛋白的抗體的第二免疫原性多肽，此間質(zhì)局部循環(huán)蛋白選自有免疫毒性或生血管特性的細(xì)胞因子或細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，此類因子可以由癌細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞(包括T淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(APC))產(chǎn)生或能被致病性(特別是變應(yīng)性)顆粒結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)。
上述復(fù)合超免疫原的詳細(xì)特征在上面的說(shuō)明書中已經(jīng)闡述，本領(lǐng)域人員可以查閱之。
在第一優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫原性肽綴合物的特征在于它是gp160-Tat類毒素綴合物；在第二優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫原性肽綴合物的特征在于它是Tat類毒素-IFNα綴合物；在第三優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫原性肽綴合物的特征在于它是E7-SIAB-VEGF；在第四優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫原性肽綴合物的特征在于它是Betv1a-SIAB-IL4。
編碼本發(fā)明復(fù)合超免疫原的核酸的用途本發(fā)明的另一個(gè)目的是編碼某些本發(fā)明復(fù)合超免疫原的核酸，所述復(fù)合超免疫為僅由一條線性肽鏈組成的超免疫原肽，此超免疫原肽含有直接或者通過(guò)如上面限定的線性肽間隔鏈彼此相連的多肽(a)和(b)。
本發(fā)明也涉及在哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人中具有功能的表達(dá)盒，其包含被置于在哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人中有功能的調(diào)節(jié)多核苷酸的控制之下的如上面限定的核酸。
本發(fā)明也涉及含有上面限定的核酸或表達(dá)盒的重組載體，其允許在哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人中表達(dá)本發(fā)明復(fù)合超免疫原。
本發(fā)明也涉及使用上面限定的核酸、表達(dá)盒或重組載體來(lái)獲得有抗癌、抗病毒或抗過(guò)敏功能的藥物。
通常，可以將DNA(帶啟動(dòng)子的質(zhì)粒)以裸露DNA形式遞送至粘膜表面，例如可以將DNA配制成例如陽(yáng)離子脂質(zhì)體形式或濃縮于金顆粒周圍，或者制成微球體形式。在有佐劑的情況下這可以有利地實(shí)施，佐劑更具體地是細(xì)菌毒素例如CTB(霍亂毒素)或LT(大腸桿菌不穩(wěn)定腸毒素)，優(yōu)選突變的LT(LTμ)。使用基于DNA分子的疫苗進(jìn)行粘膜免疫的技術(shù)尤其在McCluskie等，Microbes and Infection，1999，685-698頁(yè)公開。
根據(jù)有利的實(shí)施方案，本發(fā)明的重組載體更具體地含有以下元件(1)用于表達(dá)編碼復(fù)合超免疫原的核酸的調(diào)節(jié)元件，例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)序列(“增強(qiáng)子”)；(2)包含在待插入此載體的復(fù)合超免疫原的編碼核酸中的編碼序列，所述編碼序列與如(1)中所述的調(diào)節(jié)信號(hào)同相放置。
(3)轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)起始和終止序列。
另外，根據(jù)本發(fā)明的重組載體還可以含有一個(gè)或多個(gè)在用于擴(kuò)增或表達(dá)所述載體的細(xì)胞宿主中有功能的復(fù)制起點(diǎn)、標(biāo)記或選擇標(biāo)記。
根據(jù)本發(fā)明的重組載體也可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或者腺相關(guān)病毒載體(AAV)。此腺相關(guān)病毒載體由例如Flotte等(1992)、Samulski等(1989)及McLaughlin BA等(1996)公開。
為了將多核苷酸或載體引入宿主細(xì)胞，本領(lǐng)域人員可以有利地使用各種技術(shù)，例如磷酸鈣沉淀技術(shù)(Graham等1993；Chen等1987)、葡聚糖DEAE(Gopal，1985)、電穿孔(Tur-Kaspa，1896；Potter等，1984)、直接微注射(Harland等，1985)、負(fù)載DNA的脂質(zhì)體(Nicolau等，1982；Fraley等，1979)。
根據(jù)特定實(shí)施方案，將本發(fā)明多核苷酸引入宿主細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的體內(nèi)方法包括引入制品的步驟，所述制品包含可藥用載體(vactor)和“裸露”的本發(fā)明多核苷酸(所述多核苷酸處于適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的控制之下)，通過(guò)在所選組織，例如平滑肌組織水平的局部注射，“裸露”多核苷酸可以被該組織細(xì)胞吸收。
在體外及體內(nèi)使用的含有“裸露”多核苷酸的組合物在例如PCT申請(qǐng)WO95/11307(Institut Pasteur，Inserm，Ottawa University)中及在Tacson等(1996)和Huygen等(1996)的文章中公開。
它們也可以是腺病毒載體如2或5型人類腺病毒。
注射入所選宿主生物的載體量因注射位點(diǎn)不同而異。例如，可以在動(dòng)物體內(nèi)，優(yōu)選患者體內(nèi)注射約10-1000μg編碼復(fù)合超免疫原的多核苷酸。
含有復(fù)合超免疫原或編碼它的核酸的免疫原性組合物或疫苗組合物本發(fā)明另一個(gè)目的是免疫原性組合物，其特征在于它含有如上面限定的復(fù)合超免疫原(作為活性劑)與一種或多種生理可接受賦形劑。
本發(fā)明涉及免疫原性組合物，其特征在于它含有足夠量的，如免疫學(xué)活性的如本說(shuō)明書限定的復(fù)合超免疫原。
依據(jù)所要達(dá)到的目的，使用系統(tǒng)佐劑或粘膜佐劑。例如，上皮組織癌優(yōu)選使用粘膜佐劑進(jìn)行預(yù)防；為了預(yù)防或治療病毒感染，例如HIV1和HTLV1病毒感染，或者預(yù)防或治療過(guò)敏癥，優(yōu)選使用系統(tǒng)佐劑。
在系統(tǒng)佐劑中，優(yōu)選使用IFA型佐劑(弗氏不完全佐劑)、磷酸鈣或氫氧化鋁。
粘膜佐劑中，優(yōu)選使用的佐劑為例如霍亂毒素B(CTB)或毒素LT的突變體(LTμ)。
本發(fā)明也涉及粘膜或系統(tǒng)疫苗，其特征在于它含有如上面限定的復(fù)合超免疫原作為活性劑并含有一種或多種生理可接受賦形劑，包括免疫佐劑。
本發(fā)明免疫原性組合物或疫苗可以用于例如治療，以致治愈癌癥，以及治療AIDS和預(yù)防或治療過(guò)敏性炎癥反應(yīng)，其中所述癌癥尤其是病毒誘導(dǎo)的癌癥，例如由HTLV1引起的ATL(急性T細(xì)胞白血病)或由乳頭瘤病毒引起的宮頸癌或者由皰疹病毒引起的伯基特氏淋巴瘤或卡波西肉瘤(分別由Epstein-Barr(EBV)病毒和HHV8病毒引起)。
根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合超免疫原可以如下使用以適合于系統(tǒng)或粘膜給藥的形式將根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合超免疫原化合物或DNA分子施用給患者，例如可以通過(guò)鼻內(nèi)途徑將對(duì)治療有效的足夠量施用給需要此治療的個(gè)體。給藥劑量范圍可以為例如每周一次鼻內(nèi)10至1000μg，持續(xù)2個(gè)月，然后依據(jù)誘導(dǎo)的分泌抗體率周期性地給藥，例如每隔2-6月給藥。
當(dāng)單個(gè)超免疫原分子和DNA分子上未攜帶待被中和的過(guò)量產(chǎn)生的毒素或細(xì)胞因子的所有活性位點(diǎn)時(shí)，可以在一個(gè)制品中施用兩個(gè)或多個(gè)不同復(fù)合超免疫原分子和/或DNA分子，以誘導(dǎo)中和所有有害功能位點(diǎn)的抗體。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供設(shè)計(jì)用于粘膜的藥物組合物，其含有至少一個(gè)上面提到的免疫原性肽綴合物或DNA分子作為活性成分。
當(dāng)用作藥物時(shí)，本發(fā)明免疫原性肽綴合物或DNA分子可以摻入設(shè)計(jì)用于系統(tǒng)給藥或粘膜給藥，包括口粘膜，尤其是鼻內(nèi)、口和陰道給藥的藥物組合物中?？梢砸淮涡越o藥或者一段時(shí)間間隔后重復(fù)一次或幾次給藥。
因此，本申請(qǐng)也涉及治療性或預(yù)防性藥物組合物，其特征在于它含有一個(gè)或多個(gè)與要克服的天然蛋白相應(yīng)的如上面限定的復(fù)合超免疫原，或其片段或DNA分子作為活性成分。免疫原性化合物、DNA片段或分子可以單獨(dú)配制或與一種賦形劑混合，或者與藥物可接受賦形劑(例如佐劑)混合物混合。設(shè)計(jì)用于鼻內(nèi)或口腔給藥的賦形劑中，特別值得提到的是癸?；乎；垡叶几视王ダ鐏?lái)自GATTEFOSSE公司的Labrasol或者氫氧化鋁(Alhydragel，superfos，丹麥)。
應(yīng)該注意，當(dāng)按照傳統(tǒng)口服制劑象這樣給藥時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的活性成分應(yīng)該是滅活的。
為了根據(jù)本發(fā)明口服給藥，活性成分與粘膜免疫佐劑例如CT、LT或者CTB突變體結(jié)合。
特別要提及的是由Boyaka等在“開發(fā)粘膜免疫的策略”Am.J.Trop.Med.Hyg.60(4).1999，35-45頁(yè)公開的蓋倫制劑形式。也要提及的是胃抗性微顆粒，包括生物粘合劑例如由Rojas等在PharmaceuticalResearch，16卷，2號(hào)，1999，255頁(yè)公開的那些。
在特定實(shí)施方案下，涉及上面提到的疫苗藥物組合物，其特征在于它含有粘膜免疫佐劑，例如CT突變體(霍亂毒素)或LT突變體(大腸桿菌不穩(wěn)定腸毒素)。
在另外特定實(shí)施方案下，涉及上面提到的疫苗藥物組合物，其特征在于它含有吸附活性成分的佐劑，例如氫氧化鋁或金顆粒。
在另外優(yōu)選的實(shí)施方案下，涉及上面提到的藥物組合物，其特征在于免疫原性肽綴合物通過(guò)遺傳重組獲得。
在另外優(yōu)選的實(shí)施方案下，涉及上面提到的藥物組合物，其特征在于組成肽綴合物的多肽(a)和/或多肽(b)已經(jīng)被醛處理過(guò)或者被羧甲基化、氨甲?；蝰R來(lái)酰亞胺化。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是制備上述組合物的方法，其特征在于使用本身已知的方法，將一種或多種活性成分與可接受的賦形劑混合，如果需要的話，還與系統(tǒng)或粘膜免疫佐劑混合。
在上面提到的方法的優(yōu)選實(shí)施方案下，制備具有生物粘性(bioadhesive)和胃抗性的微顆粒(microgranule)用于口消化道給藥，所述微顆粒含有免疫原活性成分以及如果需要的話佐劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是免疫原性組合物，其特征在于它含有治療有效量的、編碼本發(fā)明中限定的復(fù)合超免疫原的核酸、包含此核酸的表達(dá)盒或包含此核酸或此表達(dá)盒的重組載體。
本發(fā)明也涉及疫苗，其特征在于它含有治療有效量的如上限定的核酸、表達(dá)盒或重組載體。
通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。
實(shí)施例制備復(fù)合超免疫原的實(shí)施例實(shí)施例1制備[gp160-Tat類毒素]綴合物此綴合物應(yīng)是能主要地誘導(dǎo)對(duì)表達(dá)gp160的感染細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答(趨化因子；輔助T細(xì)胞，CTL)和誘導(dǎo)對(duì)胞外Tat蛋白的抗體反應(yīng)的復(fù)合疫苗的活性成分。
通過(guò)以下過(guò)程活化溶解在1ml PBS中的810μg的gp160蛋白在100ml于PBS中的0.2％戊二醛溶液中過(guò)夜透析，之后，經(jīng)過(guò)在100ml PBS中3次連續(xù)透析，每次2小時(shí)，去除過(guò)多的戊二醛。
向此活化的1ml gp160中加入522μl濃度1.55mg/ml的Tat類毒素溶液(即810μg的Tat類毒素)。4℃攪拌混合物過(guò)夜，然后通過(guò)加入50μ12.5M甘氨酸溶液來(lái)終止反應(yīng)。用排阻層析最終純化反應(yīng)混合物。制品中Tat蛋白和gp160蛋白的抗原性相應(yīng)于每個(gè)單獨(dú)測(cè)定的蛋白的抗原性。
實(shí)施例2制備[Tat類毒素-IFNα]綴合物這個(gè)實(shí)施例涉及復(fù)合疫苗的制備，此疫苗能主要地誘導(dǎo)對(duì)表達(dá)Tat蛋白的感染細(xì)胞的細(xì)胞免疫應(yīng)答(趨化因子；輔助T細(xì)胞，CTL細(xì)胞)和誘導(dǎo)對(duì)IFNα的體液免疫應(yīng)答。另外此綴合物能誘導(dǎo)抗胞外Tat蛋白的抗體的形成。
偶聯(lián)反應(yīng)是通過(guò)還原的IFNα與被SIAB活化的Tat類毒素分子反應(yīng)而發(fā)生的。(參見(jiàn)實(shí)施例2)1.活化Tat類毒素(Tx)5mg的Tx溶解在3ml 5mM PBS-EDTA中，向其中加入187μl的SIAB溶液(1.7mg/ml)。在室溫下反應(yīng)1小時(shí)后，用0.1M-EDTA 5mM硼酸緩沖液(pH8.5)平衡的Sephadex G25柱子過(guò)濾反應(yīng)混合物。
2.還原IFNα條件與實(shí)施例3中的一樣?；厥?.6mg還原的IFNα。
攪動(dòng)下，5mg Tx-SIAB與2.6mg還原的IFNα混合，在室溫下繼續(xù)攪拌1小時(shí)，然后4℃過(guò)夜。通過(guò)加入Cys.HCl到終濃度5mM并反應(yīng)30分鐘來(lái)終止反應(yīng)。
通過(guò)排阻層析純化反應(yīng)混合物。發(fā)現(xiàn)在綴合物中Tat類毒素和IFNα的抗原性仍能保持。
實(shí)施例3制備[Tat肽(1-15；46-60)-SIAB-Tat]綴合物此實(shí)施例涉及復(fù)合疫苗的制備，此疫苗能主要地誘導(dǎo)對(duì)表達(dá)Tat蛋白的感染細(xì)胞的細(xì)胞免疫應(yīng)答(趨化因子；輔助T細(xì)胞，CTL細(xì)胞)和誘導(dǎo)對(duì)胞外Tat蛋白的體液免疫應(yīng)答。
1.用SIAB活化Tat肽溶解在600μl水中的每個(gè)肽(1-15和46-60)的1.5mg混合物，通過(guò)用在PBS中的500μl SIAB溶液(1.7mg/ml)在室溫下處理1小時(shí)來(lái)活化，然后用PBS緩沖液平衡過(guò)的Sephadex G25(1*15cm柱子)過(guò)濾反應(yīng)混合物。
2.還原Tat蛋白用2-巰基乙胺還原Tat(參見(jiàn)實(shí)施例3中的條件)3.偶聯(lián)Tat蛋白與Tat肽由SIAB活化的0.75mg Tat肽與1.25mg還原的Tat混合，室溫下攪動(dòng)混合物45分鐘，然后4℃過(guò)夜保存。通過(guò)加入Cys.HCl到終濃度5mM來(lái)終止反應(yīng)，然后使用分級(jí)濾膜(calibrated membrane)過(guò)濾純化混合物。通過(guò)氨甲?；瘻缁罹Y合物中的Tat蛋白。
用常規(guī)間接ELISA測(cè)定與Tat類毒素相比肽Tat-Tat類毒素綴合物的抗原性。肽Tat-Tat類毒素綴合物的抗原性與Tat類毒素蛋白的抗原性相當(dāng)。
實(shí)施例4制備[E7-SIAB-VEGF]綴合物此綴合物為能主要地誘導(dǎo)對(duì)表達(dá)E7蛋白的感染細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答(趨化因子；輔助T細(xì)胞，CTL細(xì)胞)和誘導(dǎo)對(duì)VEGF蛋白的抗體反應(yīng)的復(fù)合疫苗的活性成分。另外，此綴合物能誘導(dǎo)抗胞外E7蛋白的抗體的形成。
1.活化E7蛋白1mg E7蛋白溶解于含有20％二噁烷的1ml 0.1M EDTA-5mM硼酸鹽緩沖液(pH8.5)中。向此溶液中加入溶解于同樣緩沖液中的400μl 1.7mg/mlSIAB溶液。室溫下繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)，在硼酸-EDTA-二噁烷緩沖液平衡過(guò)的Sephadex G25柱子(1*16cm)上上樣反應(yīng)混合物，回收并合收對(duì)應(yīng)于蛋白的級(jí)分。
2.還原VEGF蛋白在如實(shí)施例3中描述的條件下，通過(guò)與2-巰基乙胺反應(yīng)來(lái)還原蛋白。
3.偶聯(lián)還原的VEGF到E7-SIAB由磺基-SIAB活化的1mg E7與1mg還原的VEGF反應(yīng)。室溫下反應(yīng)1小時(shí)后，通過(guò)加入半胱氨酸到終濃度5mM來(lái)終止反應(yīng)，通過(guò)向固體蔗糖的擴(kuò)散來(lái)濃縮反應(yīng)混合物。用排阻層析最終純化濃縮溶液。在綴合物中E7和VEGF的抗原性仍保留。
實(shí)施例5制備[Betv1a-SIAB-IL-4(鼠的)]綴合物此綴合物為復(fù)合疫苗的活性成分，此復(fù)合疫苗設(shè)計(jì)用于使免疫應(yīng)答朝導(dǎo)致抗BetV1a樺樹變應(yīng)原的IgG類抗體而非IgE類抗體形成的方向轉(zhuǎn)移。
1.還原IL-4根據(jù)實(shí)施例3中的條件，用2-巰基乙胺還原溶解于250μl 10mM磷酸緩沖液，pH7.2+1mM EDTA中的1mg IL-4，通過(guò)在Sephadex G25中過(guò)凝膠回收還原的細(xì)胞因子。
2.用SIAB活化Betv1a蛋白室溫下用80μl 1.7mg/ml磺基-SIAB溶液稀釋溶解于500μl在10mM磷酸緩沖液-1mM EDTA中的1mg BetV1a蛋白2小時(shí)。用排阻層析純化反應(yīng)混合物。
3.偶聯(lián)還原的IL-4到Betv1a-SIAB由磺基-SIAB活化的0.5mg Betv1a與1mg還原的IL-4反應(yīng)。室溫下反應(yīng)1小時(shí)后，通過(guò)加入半胱氨酸到終濃度5mM來(lái)終止反應(yīng)，通過(guò)向固體蔗糖的擴(kuò)散來(lái)濃縮反應(yīng)混合物。用排阻層析最終純化濃縮溶液。在綴合物中Betv1a與IL-4的抗原性仍保留。
超免疫原的免疫原活性實(shí)施例實(shí)施例6gp160-Tat類毒素綴合物的免疫原活性A.材料與方法gp160-Tat類毒素制品與單獨(dú)Tat類毒素相比的免疫原活性及其毒性的缺乏，已經(jīng)在18-20g Balbc小鼠中測(cè)定。
1-免疫接種在第0天，通過(guò)肌內(nèi)途徑將0.2ml(50μg)ACF乳劑注射入一組3只小鼠體內(nèi)。在第21天及60天加強(qiáng)注射5μg AIF。
在第一次注射前第2天，從每個(gè)小鼠后眼眶采集血液樣本。
3只對(duì)照小鼠接受沒(méi)有免疫原的相同制品。最后一次免疫后12天處死小鼠。
2-毒性在接受1人劑量(100μg)(根據(jù)藥典)的3只小鼠內(nèi)研究異常毒性。
用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)體外估計(jì)超免疫原的免疫毒性缺失，在綴合物存在下培養(yǎng)并被PPD或類毒素Tetanos刺激的PBMC上進(jìn)行此細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。
B.結(jié)果1-超免疫原在體內(nèi)和體外毒性的缺乏用Tat類毒素單獨(dú)免疫過(guò)的小鼠及用gp160-Tat類毒素制品免疫過(guò)的小鼠都沒(méi)有任何臨床癥狀和解剖學(xué)上的傷口。免疫抑制實(shí)驗(yàn)顯示100ng/ml至3μg/ml劑量的gp160-Tat類毒素沒(méi)有降低淋巴細(xì)胞增殖。
注射后7天沒(méi)有任何一只用100μg劑量制品免疫過(guò)的小鼠(共3只)顯示任何毒性跡象(體溫、皮膚病癥、系統(tǒng)或局部征兆)。
2-體液應(yīng)答體液應(yīng)答是通過(guò)血清中存在的抗天然Tat重組蛋白的IgG型抗體來(lái)確定的，所述抗體通過(guò)ELISA測(cè)量并以效價(jià)(導(dǎo)致光密度高于0.3的稀釋倍數(shù)的倒數(shù))表示。
表1效價(jià)d-2 D72對(duì)照小鼠對(duì)照小鼠1 ＜500-1＜500-1對(duì)照小鼠2 ＜500-1＜500-1對(duì)照小鼠3 ＜500-1＜500-1用Tat類毒素免疫的小鼠小鼠4 ＜500-132,000-1小鼠5 ＜500-148,000-1小鼠6 ＜500-148,000-1用gp160-Tat類毒素綴合物免疫的小鼠小鼠7 ＜500-164,000-1小鼠8 ＜500-1＞64,000-1小鼠9 ＜500-1＞64,000-1用gp160-Tat類毒素制品免疫過(guò)的小鼠比單用Tat類毒素免疫過(guò)的小鼠有更高的IgG型抗-Tat抗體效價(jià)。
通過(guò)Cat分析測(cè)量此抗體的中和活性。在第2和第72天采集的不同血清稀釋物(1/50-1/400)與50ng/ml天然Tat溫育2小時(shí)。然后再將此稀釋物放在Hela細(xì)胞上，所述細(xì)胞穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了含有HIV-1的LTR作為氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT)的啟動(dòng)子的質(zhì)粒。培養(yǎng)24小時(shí)后，裂解細(xì)胞并用ELISA實(shí)驗(yàn)及Cat分析(Boehringer Mannheim)測(cè)量產(chǎn)生的CAT蛋白的量。中和血清阻止Tat蛋白誘導(dǎo)CAT蛋白表達(dá)，而非中和血清允許合成此CAT蛋白。結(jié)果以中和百分率給出
表2用Tat類毒素免疫的小鼠1/50 1/100 1/200 1/400小鼠4 d-20 0 0 0d7275502520小鼠5 d-20 0 0 0d7275603020小鼠6 d-20 0 0 0d7275603020表3用gp160-Tat類毒素綴合物免疫的小鼠1/50 1/1001/200 1/400小鼠7 d-2 000 0d72 100 100 100 75小鼠8 d-2 000 0d72 100 100 100 100小鼠9 d-2 000 0d72 100 100 100 100gp160-Tat類毒素綴合物誘導(dǎo)的抗體比Tat類毒素誘導(dǎo)的抗體有更強(qiáng)的中和能力。
3.細(xì)胞應(yīng)答3.1在脾細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中MIP1α和MIP1β的產(chǎn)生分離免疫小鼠和對(duì)照小鼠的脾細(xì)胞，然后在微量培養(yǎng)板的圓底孔中培養(yǎng)，100,000細(xì)胞/孔，培養(yǎng)在有5μg/ml p24、gp160、天然Tat及5μg/mlgp160和5μg/ml天然Tat的混合物的情況下進(jìn)行。培養(yǎng)24小時(shí)后收集培養(yǎng)物的上清液，用R&D的ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)量上清液中MIP1α和MIP1β的存在。結(jié)果用pg/ml表示。
表4Gp160 天然Tat gp160+天然Tat p24對(duì)照小鼠小鼠1 d72 MIP1α 110 100 150 10MIP1b 10090140 7小鼠2 d72 MIP1α 120 95153 8MIP1β 112 80114 6小鼠3 d72 MIP1α 124 98128 9MIP1β 99112 117 7表5用Tat類毒素免疫的小鼠小鼠4 d72 MIP1α 152 122 203 10MIP1β 140 118 196 11小鼠5 d72 MIP1α 145 150 215 8.5MIP1β 130 160 230 9小鼠6 d72 MIP1α 147 222 290 7MIP1β 152 218 300 9表6用gp160-Tat類毒素綴合物免疫的小鼠小鼠7 d72 MIP1α 810 729 1,6007.5MIP1β 1,100 850 2,00010小鼠8 d72 MIP1α 1,000 821 1,7008MIP1β 1,125 876 2,1009小鼠9 d72 MIP1α 975 768 1,6858MIP1β 1,000 803 1,8629
用gp160-Tat類毒素綴合物免疫過(guò)的小鼠的脾細(xì)胞比單獨(dú)用Tat類毒素免疫過(guò)的小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生更多的MIP1α和MIP1β趨化因子，所述產(chǎn)生發(fā)生在當(dāng)脾細(xì)胞在體外被用于免疫接種的這些免疫原活化時(shí)。
3.2在脾細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中IFNγ的產(chǎn)生在有5μg/ml p24、gp160、天然Tat及5μg/ml gp160和5μg/ml天然Tat的混合物存在下培養(yǎng)脾細(xì)胞，培養(yǎng)72小時(shí)后用R&D的ELISA測(cè)量培養(yǎng)上清液中IFNγ的存在。結(jié)果用pg/ml表示。
表7Gp160 天然Tat gp160+天然Tat p24對(duì)照小鼠小鼠1 d72 00 0 0小鼠2 d72 00 0 0小鼠3 d72 00 0 0表8用Tat類毒素免疫的小鼠小鼠4 d72 ND ND NDND小鼠5 d72 ND ND NDND小鼠6 d72 ND ND NDND表9用gp160-Tat類毒素綴合物免疫的小鼠小鼠7 d72 40 600 6,000小鼠8 d72 50 620 5,950小鼠9 d72 65 700 6,850
用gp160-Tat類毒素綴合物免疫過(guò)的小鼠的脾細(xì)胞當(dāng)它們?cè)隗w外被用于免疫過(guò)程的這些免疫原活化時(shí)產(chǎn)生大量IFNγ。
3.3免疫過(guò)的小鼠的脾細(xì)胞增殖(CMI)分離免疫小鼠和對(duì)照小鼠的脾細(xì)胞，然后在微量培養(yǎng)板的圓底孔中培養(yǎng)，100,000細(xì)胞/孔，培養(yǎng)在有p24、gp160、天然Tat及gp160和天然Tat的混合物存在下進(jìn)行。37℃在含有5％CO2的潮濕空氣中持續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞6天。溫育結(jié)束前18小時(shí)，每個(gè)孔中加入0.5μCi氚化胸苷。免疫應(yīng)答的強(qiáng)度與增殖系數(shù)(IP)成比例。
Ip＝給定抗原的cpm(每分鐘的計(jì)數(shù))/對(duì)照cpm表10Gp160 天然Tatgp160+ 天然Tat p24對(duì)照小鼠小鼠1 d72 1.2 1 1.1 1小鼠2 d72 11.21 1.1小鼠3 d72 1.1 1.11 1
表11用Tat類毒素免疫的小鼠Gp160天然Tatgp160+ 天然Tat p24小鼠4 d72 1.2 10 9 1小鼠5 d72 1 8 10 1.2小鼠6 d72 1.1 9 8 1.1表12用gp160-Tat類毒素綴合物免疫的小鼠Gp160天然Tatgp160+ 天然Tat p24小鼠7 d72 8 10 9 1小鼠8 d72 9 8 10 1小鼠9 d72 1110 9 1用gp160-Tat類毒素綴合物或Tat類毒素免疫過(guò)的小鼠的脾細(xì)胞在體外被用于免疫過(guò)程的免疫原活化后發(fā)生增殖。
實(shí)施例7[Tat肽(1-15；46-60)]-SIAB-[Tat類毒素]綴合物的免疫原活性A.材料與方法根據(jù)實(shí)施例6中描述的方案，與單獨(dú)Tat類毒素相比Tat肽-Tat類毒素的免疫原活性及其毒性的缺乏，已經(jīng)在18-20g Balbc小鼠中測(cè)定。
B.結(jié)果1-超免疫原在體內(nèi)和體外毒性的缺乏用Tat類毒素單獨(dú)免疫過(guò)的小鼠及用Tat肽-Tat類毒素制品免疫過(guò)的小鼠都沒(méi)有顯示任何臨床征兆和解剖學(xué)上的傷口。免疫抑制實(shí)驗(yàn)顯示100ng/ml至3μg/ml劑量的肽-Tat類毒素沒(méi)有降低淋巴細(xì)胞增殖。
注射后7天用100μg制品免疫過(guò)的3只小鼠沒(méi)有任何一只顯示任何毒性征兆(體溫、皮膚病癥、系統(tǒng)或局部征兆)。
2-體液應(yīng)答體液應(yīng)答是通過(guò)血清中存在的抗天然Tat重組蛋白的IgG類抗體來(lái)測(cè)量的，抗體的存在通過(guò)ELISA測(cè)量并以效價(jià)(導(dǎo)致光密度比0.3高的稀釋倍數(shù)的倒數(shù))表示。
表13效價(jià)d-2 d72對(duì)照小鼠小鼠1 ＜500-1＜500-小鼠2 ＜500-1＜500-1小鼠3 ＜500-1＜500-1效價(jià)d-2 d72用Tat類毒素免疫的小鼠小鼠4 ＜500-132,000-1小鼠5 ＜500-148,000-1小鼠6 ＜500-148,000-1用Tat肽-Tat類毒素綴合物免疫的小鼠小鼠7 ＜500-164,000-1小鼠8 ＜500-164,000-1小鼠9 ＜500-164,000-1用Tat肽-Tat類毒素綴合物免疫過(guò)的小鼠比單用Tat類毒素免疫過(guò)的小鼠有更高的IgG型抗-Tat抗體效價(jià)。
用Cat分析測(cè)定此抗體的中和活性。
結(jié)果以中和百分率給出。
表14用Tat類毒素免疫的小鼠中和％1/50 1/100 1/200 1/400小鼠4 d-2 0 0 0 0d72 75 50 25 20小鼠5 d-2 0 0 0 0d72 75 60 30 20小鼠6 d-2 0 0 0 0d72 75 60 30 20表15用Tat肽-Tat類毒素綴合物免疫的小鼠1/50 1/100 1/200 1/400小鼠7 d-20 0 0 0d7210010050 25小鼠8 d-20 0 0 0d7210010075 50小鼠9 d-20 0 0 0d7210010060 30Tat肽-Tat類毒素綴合物誘導(dǎo)的抗體比Tat類毒素誘導(dǎo)的抗體有更強(qiáng)的中和能力。
實(shí)施例8E7-SIAB-VEGF綴合物的免疫原活性A.材料與方法根據(jù)實(shí)施例6中描述的方案，在6周齡黑色C576小鼠中測(cè)定，與VEGF和E7蛋白相比E7-SIAB-VEGF綴合物的免疫原活性及其毒性的缺乏。
B.結(jié)果
1-超免疫原在體內(nèi)和體外毒性的缺乏用E7蛋白或VEGF免疫過(guò)的小鼠及用E7-SIAB-VEGF制品免疫過(guò)的小鼠都沒(méi)有任何臨床征兆和解剖學(xué)上的傷口。免疫抑制實(shí)驗(yàn)顯示100ng/ml至3μg/ml劑量的E7-SIAB-VEGF綴合物沒(méi)有降低淋巴細(xì)胞增殖。
注射后7天用100μg制品免疫過(guò)的3只小鼠沒(méi)有任何一只顯示任何毒性征兆(體溫、皮膚病癥、系統(tǒng)或局部征兆)。
2-體液應(yīng)答體液應(yīng)答是通過(guò)血清中存在的抗E7蛋白和抗VEGF的IgG類抗體來(lái)測(cè)量的，抗體的存在通過(guò)ELISA測(cè)量并以效價(jià)(導(dǎo)致光密度比0.3高的稀釋倍數(shù)的倒數(shù))表示。
表16效價(jià) d-2 d72對(duì)照小鼠小鼠1 E7＜500-1＜500-1VEGF ＜500-1＜500-1小鼠2 E7＜500-1＜500-1VEGF ＜500-1＜500-1小鼠3 E7＜500-1＜500-1VEGF ＜500-1＜500-1表17用VEGF免疫的小鼠小鼠4 E7＜500-1＜500-1VEGF ＜500-1＜1000-1小鼠5 E7＜500-1＜500-1VEGF ＜500-11,500-1小鼠6 E7＜500-1＜500-1VEGF ＜500-1500-1
表18用E7免疫的小鼠小鼠7 E7＜500-148,000-1VEGF ＜500-1＜500-1小鼠8 E7＜500-164,000-1VEGF ＜500-1＜500-1小鼠9 E7＜500-148,000-1VEGF ＜500-1＜500-1表19用E7-SIAB-VEGF綴合物免疫的小鼠小鼠10 E7＜500-148,000-1VEGF ＜500-148,000-1小鼠11 E7＜500-164,000-1VEGF ＜500-132,000-1小鼠12 E7＜500-148,000-1VEGF ＜500-148,000-1用E7-SIAB-VEGF綴合物免疫過(guò)的小鼠比單獨(dú)用VEGF免疫過(guò)的小鼠有更高的IgG型抗VEGF抗體效價(jià)，而它們的抗-E7反應(yīng)與單獨(dú)用E7免疫的小鼠中所得到的反應(yīng)是相同的。
3.細(xì)胞應(yīng)答3.1免疫過(guò)的小鼠的脾細(xì)胞增殖(CMI)分離免疫小鼠和對(duì)照小鼠的脾細(xì)胞，然后在微量培養(yǎng)板的圓底孔中培養(yǎng)，100,000細(xì)胞/孔，培養(yǎng)在天然E7存在下進(jìn)行。37℃在含有5％CO2的潮濕空氣中持繼培養(yǎng)細(xì)胞6天。溫育結(jié)束前18小時(shí)，每個(gè)孔中加入0.5μCi氚化胸苷。免疫應(yīng)答的強(qiáng)度與增殖系數(shù)(IP)成比例。
Ip＝給定抗原的cpm(每分鐘的計(jì)數(shù))/對(duì)照cpm
表20對(duì)照小鼠小鼠1 d721.2小鼠2 d721小鼠3 d721.1用VEGF免疫的小鼠小鼠4 d721.2小鼠5 d721小鼠6 d721.1用E7免疫的小鼠小鼠7 d726小鼠8 d7210小鼠9 d728用E7-SIAB-VEGF綴合物免疫的小鼠小鼠10 d72 7小鼠11 dj72 10小鼠12 d72 9用E7-SIAB-VEGF綴合物免疫過(guò)的小鼠的脾細(xì)胞在體外被E7蛋白活化后增殖。
實(shí)施例9Betv1a-SIAB-IL4(小鼠的)綴合物的免疫原性A.材料與方法根據(jù)實(shí)施例6中描述的方案，與Betv1a和IL4(鼠的)相比Betv1a-SIAB-IL4(鼠的)綴合物的免疫原活性及其毒性的缺乏，已經(jīng)在18-20g Balbc小鼠中測(cè)定。
B.結(jié)果1-超免疫原在體內(nèi)和體外毒性的缺乏用IL4單獨(dú)免疫過(guò)的小鼠及用Betv1a-SIAB-IL4綴合物免疫過(guò)的小鼠都沒(méi)有顯示任何臨床征兆和解剖學(xué)上的傷口。免疫抑制實(shí)驗(yàn)顯示100ng/ml至3μg/ml劑量的Betv1a-SIAB-IL4綴合物沒(méi)有降低淋巴細(xì)胞增殖。
注射后7天用100μg制品免疫過(guò)的3只小鼠沒(méi)有任何一只顯示任何毒性征兆(體溫、皮膚病癥、系統(tǒng)或局部征兆)。
2-體液應(yīng)答體液應(yīng)答是通過(guò)血清中存在的抗Betv1a和IL4的IgG型抗體來(lái)測(cè)量的，抗體的存在通過(guò)ELISA測(cè)量并以效價(jià)(導(dǎo)致光密度比0.3高的稀釋倍數(shù)的倒數(shù))表達(dá)。
表21效價(jià) d-2D72對(duì)照小鼠小鼠1 Betv1a ＜500-1＜500-1IL4 ＜500-1＜500-1小鼠2 Betv1a ＜500-1＜500-1IL4 ＜500-1＜500-1小鼠3 Betv1a ＜500-1500-1IL4 ＜500-1＜500-1表22用Betv1a免疫的小鼠效價(jià) d-2 D72小鼠4 Betv1a ＜500-148,000-1IL4 ＜500-1＜500-1小鼠5 Betv1a ＜500-164,000-1IL4 ＜500-1＜500-1小鼠6 Betv1a ＜500-164,000-1IL4 ＜500-1＜500-1用IL4免疫的小鼠效價(jià) d-2 D72小鼠7 Betv1a ＜500-1＜500-1IL4 ＜500-1500-1小鼠8 Betv1a ＜500-1＜500-1IL4 ＜500-11,500-1小鼠9 Betv1a ＜500-1＜500-1IL4 ＜500-11,000-1
表23E7-SIAB-IL4綴合物免疫的小鼠效價(jià) d-2 D72小鼠10Betv1a ＜500-148,000-1IL4 ＜500-148,000-1小鼠11Betv1a ＜500-164,000-1IL4 ＜500-132,000-1小鼠12Betv1a ＜500-148,000-1IL4 ＜500-148,000-1用Betv1a-SIAB-IL4綴合物免疫過(guò)的小鼠比單獨(dú)用IL4免疫過(guò)的小鼠有更高的IgG型抗IL4抗體效價(jià)，而它的抗-Betv1a反應(yīng)與單獨(dú)用Betv1a免疫的小鼠所得到的反應(yīng)仍是同樣的。
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權(quán)利要求
1.包含兩個(gè)彼此物理上連接的不同多肽的復(fù)合超免疫原的用途，其中所述兩個(gè)多肽分別是(a)誘導(dǎo)對(duì)惰性或活性細(xì)胞、微生物或顆粒致病性抗原結(jié)構(gòu)的細(xì)胞免疫應(yīng)答或細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的第一免疫原性多肽；(b)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗間質(zhì)局部循環(huán)蛋白的中和性或封閉性抗體的第二免疫原性多肽，其中所述間質(zhì)局部循環(huán)蛋白選自有免疫毒性或生血管特性的細(xì)胞因子或細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，此類因子能夠由癌細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞，包括T淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(APC)產(chǎn)生，或者能被致病性，包括變應(yīng)性，顆粒結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)，所述用途為用于獲得具有誘導(dǎo)對(duì)致病性抗原結(jié)構(gòu)和間質(zhì)局部循環(huán)蛋白的粘膜或系統(tǒng)免疫的抗癌、抗病毒或抗過(guò)敏作用的藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于第一免疫原性多肽(a)選自(i)由癌細(xì)胞選擇性表達(dá)的、由病毒感染細(xì)胞選擇性表達(dá)的或作為變應(yīng)性致病結(jié)構(gòu)之組分的免疫原性蛋白，如果需要的話，去毒形式的免疫原性蛋白，和(ii)衍生自蛋白(i)的蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于免疫原性多肽(b)選自(i)間質(zhì)局部循環(huán)蛋白，如果需要的話，去毒形式的間質(zhì)局部循環(huán)蛋白，和(ii)衍生自蛋白(i)的蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3之任一項(xiàng)的用途，其特征在于第一免疫原性多肽(a)選自HIV1的免疫原性蛋白、此蛋白的免疫原性片段和衍生自它們的蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到3之任一項(xiàng)的用途，其特征在于第一免疫原性多肽(a)選自TAA或TSA腫瘤抗原、此蛋白的免疫原性片段和衍生自它們的免疫原性蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到3之任一項(xiàng)的用途，其特征在于第一免疫原性多肽(a)選自變應(yīng)性Betv1a、Der p1和Fel d1蛋白、這些蛋白的免疫原性片段和衍生自它們的免疫原性蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到3之任一項(xiàng)的用途，其特征在于多肽(a)和多肽(b)選自a)對(duì)于預(yù)防或治療AIDS-多肽(a)HIV1病毒的gp160、p24、p17、Nef和Tat蛋白，如果需要的話，去毒或穩(wěn)定化形式的蛋白，以及這些蛋白的免疫原性片段和衍生自它們的免疫原性蛋白；-多肽(b)Tat、IFNα和TGFβ蛋白，如果需要的話，去毒形式的蛋白，以及這些蛋白的免疫原性片段和衍生自它們的免疫原性蛋白；b)對(duì)于預(yù)防或治療宮頸癌-多肽(a)乳頭瘤病毒，優(yōu)選來(lái)自16或18株系的乳頭瘤病毒的L1、L2和E7蛋白，如果需要的話，去毒或穩(wěn)定化形式的蛋白，以及這些蛋白的免疫原性片段和衍生自它們的免疫原性蛋白；-多肽(b)E7、IFNα、TGFβ、TNFα和VEGF蛋白，如果需要的話，去毒或穩(wěn)定化形式的蛋白，以及這些蛋白的免疫原性片段和衍生自它們的免疫原性蛋白；c)對(duì)于預(yù)防或治療由HTLV1或2病毒誘導(dǎo)的ATL白血病-多肽(a)HTLV1或2病毒的gp61和Tax蛋白，如果需要的話，去毒形式的蛋白，以及這些蛋白的免疫原性片段和衍生自它們的免疫原性蛋白；-多肽(b)去毒形式的Tax、IL10、IFNα和TGFβ蛋白，這些蛋白的免疫原性片段和衍生自它們的蛋白；d)對(duì)于預(yù)防或治療結(jié)腸癌-多肽(a)CEA和p53蛋白，如果需要的話，去毒形式的蛋白，以及這些蛋白的免疫原性片段和衍生自它們的免疫原性蛋白；-多肽(b)去毒形式的TGFβ、IL10、p53、FasL和VEGF蛋白，這些蛋白的免疫原性肽片段和衍生自它們的免疫原性蛋白；e)對(duì)于預(yù)防或治療乳腺癌-多肽(a)Di12蛋白，此蛋白的免疫原性片段和衍生自它們的蛋白；-多肽(b)TGFβ、TNFα和VEGF蛋白，如果需要的話，去毒形式的蛋白，以及這些蛋白的免疫原性片段和衍生自它們的免疫原性蛋白；f)對(duì)于預(yù)防或治療胰腺癌-多肽(a)CaSm蛋白，如果需要的話，去毒形式的蛋白，此蛋白的免疫原性片段和衍生自它們的免疫原性蛋白；-多肽(b)VEGF和TNFα蛋白，如果需要的話，去毒或穩(wěn)定化形式的蛋白，這些蛋白的免疫原性片段和衍生自它們的免疫原性蛋白；g)對(duì)于預(yù)防或治療前列腺癌-多肽(a)OSA和ETS2蛋白，如果需要的話，去毒形式的蛋白，這些蛋白的免疫原性片段和衍生自它們的免疫原性蛋白；-多肽(b)IL6和TGFβ蛋白，如果需要的話，去毒形式的蛋白，這些蛋白的免疫原性片段和衍生自它們的免疫原性蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其特征在于多肽(b)選自IL4和IL5蛋白、這些蛋白的免疫原性片段和衍生自它們的免疫原性蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其特征在于復(fù)合超免疫原選自-復(fù)合超免疫原(a)gp160-(b)Tat類毒素；-復(fù)合超免疫原(b)Tat肽[1-15；46-60]-(a)gp160；-復(fù)合超免疫原(a)Tat類毒素-(b)IFNα；-復(fù)合超免疫原(a)Tat類毒素-(b)Tat肽[1-15；46-60]。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其特征在于復(fù)合超免疫原選自-復(fù)合超免疫原(a)L1-(b)E7；-復(fù)合超免疫原(a)E7-(b)VEGF。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到3和6之任一項(xiàng)的用途，其特征在于復(fù)合超免疫原是(a)Betv1a-(b)IL4。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到11之任一項(xiàng)的用途，其特征在于多肽(a)和(b)直接彼此共價(jià)連接。
13.根據(jù)權(quán)利要求1到11之任一項(xiàng)的用途，其特征在于多肽(a)和(b)在復(fù)合超免疫原中由間隔鏈彼此隔開。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其特征在于間隔鏈含有線性間隔肽。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其特征在于肽鏈含有分支間隔肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其特征在于間隔鏈?zhǔn)荢IAB或SMMC型鏈。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，其特征在于復(fù)合超免疫原選自-復(fù)合超免疫原(a)E7-SIAB-(b)VEGF；和-復(fù)合超免疫原(a)Betv1a-SIAB-(b)IL4。
18.根據(jù)權(quán)利要求1到8之任一項(xiàng)的用途，其特征在于多肽(a)和多肽(b)被固定于單個(gè)納米顆粒上或嵌入單個(gè)微米顆?；騿蝹€(gè)納米顆粒中。
19.含有兩個(gè)彼此物理上連接的不同免疫原性多肽的復(fù)合超免疫原，其中，兩個(gè)多肽分別是(a)誘導(dǎo)對(duì)惰性或活性細(xì)胞、微生物或顆粒致病性抗原結(jié)構(gòu)的細(xì)胞免疫應(yīng)答或細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的第一免疫原性多肽；(b)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗間質(zhì)局部循環(huán)蛋白的中和性或封閉性抗體的第二免疫原性多肽，所述間質(zhì)局部循環(huán)蛋白選自有免疫毒性或生血管特性的細(xì)胞因子或細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，此類因子或者能由癌細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞，包括T淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(APC)產(chǎn)生，或者能被致病性，包括變應(yīng)性，顆粒結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的復(fù)合超免疫原，其特征在于它是(a)gp160-(b)Tat類毒素綴合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的復(fù)合超免疫原，其特征在于它是(a)Tat類毒素-(b)IFNα綴合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的復(fù)合超免疫原，其特征在于它是(a)E7-SIAB-(b)VEGF綴合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求19的復(fù)合超免疫原，其特征在于它是(a)Betv1a-SIAB-(b)IL4綴合物。
24.含有編碼根據(jù)權(quán)利要求19到23之任一項(xiàng)的復(fù)合超免疫原的序列的核酸。
25.含有編碼根據(jù)權(quán)利要求19的復(fù)合超免疫原的多核苷酸的表達(dá)盒，其中所述多核苷酸處于在哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地人中有功能的調(diào)節(jié)多核苷酸的控制下。
26.含有根據(jù)權(quán)利要求24的核酸或根據(jù)權(quán)利要求25的表達(dá)盒的重組載體。
27.根據(jù)權(quán)利要求24的核酸、根據(jù)權(quán)利要求25的表達(dá)盒或根據(jù)權(quán)利要求26的重組載體的用途，用于獲得有抗癌、抗病毒或抗過(guò)敏作用的藥物。
28.免疫原性組合物，其特征在于它含有免疫學(xué)有效量的根據(jù)權(quán)利要求19到23之任一項(xiàng)的復(fù)合超免疫原以及一種或多種生理相容性賦形劑。
29.疫苗，其特征在于它含有根據(jù)權(quán)利要求19到23之任一項(xiàng)的復(fù)合超免疫原作為活性成分并含有一種或多種生理相容性賦形劑。
30.免疫原性組合物，其特征在于它含有治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求24的核酸、根據(jù)權(quán)利要求25的表達(dá)盒或根據(jù)權(quán)利要求26的重組載體。
31.疫苗，其特征在于它含有治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求24的核酸、根據(jù)權(quán)利要求25的表達(dá)盒或根據(jù)權(quán)利要求26的重組載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于某些癌癥、病毒感染和過(guò)敏癥的系統(tǒng)或粘膜疫苗治療新手段，根據(jù)本發(fā)明，所述手段以具有雙功能疫苗功能的復(fù)合超免疫原化合物家族的形式提供，所述化合物可以誘導(dǎo)針對(duì)兩個(gè)不同靶的免疫應(yīng)答，一個(gè)靶是致病性抗原結(jié)構(gòu)，另一個(gè)靶是造成隨后免疫毒性或新血管形成性間質(zhì)紊亂的局部產(chǎn)生的因子。
文檔編號(hào)A61K47/48GK1568197SQ02820084
公開日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2002年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月10日
發(fā)明者D·扎古里, B·比其尼, P·科昂, J·F·扎古里, H·勒布阿內(nèi)克 申請(qǐng)人:尼奧瓦克斯公司