專利名稱：疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸構(gòu)建體、含有這種構(gòu)建體的宿主細胞以及它們在核酸疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明進一步涉及含有這種構(gòu)建體的疫苗制劑以及這種制劑在藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明特別涉及用于HIV感染的預(yù)防和治療的DNA疫苗，更特別的是以顆粒介導的釋放方式施用疫苗。
背景技術(shù)：
HIV-1是獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的主要原因，這種疾病被認為是全球主要的健康問題之一。盡管全世界為了生產(chǎn)相關(guān)疫苗進行了廣泛的研究，但是迄今為止這些努力尚未獲得成功。
已經(jīng)描述了HIV-1的非包膜蛋白，包括例如內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白，如gag和pol基因的產(chǎn)物，及其它非結(jié)構(gòu)蛋白如Rev、Nef、Vif和Tat(Green等，New England J.Med，324，5，308以及下列等等(1991)和Bryant等，(Pizzo編輯)，Pediatr.Infect.Dis.J.，11，5，390以及下列等等(1992)。
Gag基因的全長RNA翻譯產(chǎn)生多蛋白前體，隨后該前體被酶切成為3-5個衣殼蛋白；基質(zhì)蛋白、衣殼蛋白和核酸結(jié)合蛋白以及蛋白酶(1.Fundamental Virology，F(xiàn)ields BN，Knipe DM和Howley M 1996；2.Fields Virology，vol 2 1996)。
所述gag基因產(chǎn)生55-千道爾頓(kD)的Gag前體蛋白，也稱為p55，它是從未剪接的病毒mRNA表達產(chǎn)生的。在翻譯過程中，p55的N末端被十四酰化，使其與細胞膜的胞質(zhì)相締合。膜締合的Gag多蛋白使兩個拷貝的病毒基因組RNA連同其它病毒和細胞蛋白聚集而引起病毒顆粒在感染細胞的表面產(chǎn)生芽接。芽接后，在病毒成熟過程中p55被病毒編碼的蛋白酶(pol基因的產(chǎn)物)酶切成為被稱做MA(基質(zhì)[p17])、CA(衣殼[p24])、NC(核殼[p9])和p6.(4)的四個較小蛋白質(zhì)。
除了3個主要的Gag蛋白之外，所有的Gag前體含有一些其它的區(qū)域，它們被酶切成各種大小的肽，保留于病毒粒子中。這些蛋白質(zhì)具有不同的作用，例如p2蛋白被認為在調(diào)節(jié)蛋白酶的活性方面具有作用，并有助于校正蛋白水解過程的時間。
MA多蛋白衍生自p55的十四酰化N末端。大多數(shù)MA分子保持與病毒粒子的脂雙分子層的內(nèi)表面連接，以穩(wěn)定病毒顆粒。在病毒粒子較深層的內(nèi)部聚集其它的MA，而成為攜帶病毒DNA進入細胞核的復(fù)合體的一部分。(5)這些MA分子促進病毒基因組的核轉(zhuǎn)移，因為MA上的親核信號可被細胞核輸入系統(tǒng)所識別。這種情況使HIV可以感染未分裂的細胞，這是反轉(zhuǎn)錄病毒的一個不尋常的特性。
p24(CA)蛋白形成病毒顆粒的錐形核。已證實親環(huán)蛋白A與p55的p24區(qū)域相互作用，而摻合到HIV顆粒中。因為環(huán)孢菌素可以阻止這種相互作用而抑制病毒的復(fù)制，所以Gag和親環(huán)蛋白A之間的相互作用是必需的。
Gag的NC區(qū)域負責特異性識別所謂的HIV包裝信號。所述包裝信號由位于病毒RNA的5’末端附近的4個莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成，足以介導異源RNA整合到HIV-1病毒粒子中。NC通過由兩個鋅指基序介導的相互作用而與包裝信號相結(jié)合。NC還促進逆轉(zhuǎn)錄進行。
p6多肽區(qū)域介導了p55 Gag和輔助蛋白Vpr之間的相互作用，使Vpr整合到組裝好的病毒粒子中。p6區(qū)域還含有一個所謂的晚期結(jié)構(gòu)域，這是芽接病毒粒子從感染細胞有效釋放所需要的。
Pol基因編碼包含病毒早期感染時所需要的具有各別活性的兩種蛋白質(zhì)，即將病毒DNA整合進入細胞DNA所需的RT和整合酶蛋白。Pol的最初產(chǎn)物被病毒粒子蛋白酶切割，產(chǎn)生含有DNA合成所必需的活性(RNA和DNA定向的DNA聚合酶，核酶H)的氨基端RT肽以及羧基端整合酶蛋白。
HIV RT是全長RT(p66)和缺乏羧基末端的RNA酶整合酶結(jié)構(gòu)域的酶切產(chǎn)物(p51)的異源二聚體。
RT是反轉(zhuǎn)錄酶病毒基因組所編碼的保守性最高的蛋白質(zhì)之一。RT的兩個主要活性是DNA Pol和核酶H。RT的DNA Pol活性可交替使用RNA和DNA為模板，并且如所有已知的DNA聚合酶一樣，不能起始DNA的從頭合成，而需要一個預(yù)先存在的分子作為引物(RNA)。
當DNA合成發(fā)生時，在所有的RT蛋白中所固有的RNA酶H的活性在除去RNA基因組復(fù)制早期中起著重要作用。它選擇性地從所有RNA-DNA雜合分子中降解RNA。聚合酶和核酶H在結(jié)構(gòu)上是分離的、具有非重疊結(jié)構(gòu)域，其中Pol覆蓋了Pol的三分之二的氨基。
p66催化亞基折疊成5個不同的亞結(jié)構(gòu)域。這些亞結(jié)構(gòu)域的氨基末端23包含具有RT活性的部分，羧基末端是RNA酶H結(jié)構(gòu)域。
感染宿主細胞后，逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組通過感染顆粒中的反轉(zhuǎn)錄酶而被復(fù)制成線性雙鏈DNA。整合酶(參見Skalka AM’99 Adv inVirus Res 52 271-273)識別和修飾病毒DNA的末端，并伴隨病毒DNA進入宿主染色體位點以進行催化整合。宿主DNA中有許多位點可成為整合的靶標位點。盡管整合酶在體外足以催化整合，但在體內(nèi)它不是唯一與病毒DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，從感染的細胞中分離的大蛋白-病毒DNA復(fù)合體被稱為預(yù)整合復(fù)合體。這促進子代病毒基因組獲得宿主細胞的基因。
整合酶由3個不同的結(jié)構(gòu)域組成，即N末端結(jié)構(gòu)域、催化核心和C末端結(jié)構(gòu)域。催化核心結(jié)構(gòu)域中包含了多核苷酸轉(zhuǎn)移化學反應(yīng)的所有要素。
已知Nef蛋白可引起CD4、HIV受體從細胞表面的去除，但對于這種功能的生物學重要性還存在爭議。此外，Nef與T細胞的信號途徑相互作用并誘導成激活狀態(tài)，這反過來可促進更有效的基因表達。一些HIV分離物在該區(qū)域存在突變，導致不編碼有功能的蛋白而嚴重影響它們在體內(nèi)的復(fù)制和致病過程。
DNA疫苗通常包括插入了強啟動子的細菌質(zhì)粒載體和感興趣的基因所組成，所述基因編碼抗原肽和聚腺苷酸化/轉(zhuǎn)錄終止序列。感興趣的基因可編碼全蛋白或僅編碼與想要預(yù)防的病原體、腫瘤或其它病因有關(guān)的抗原肽序列。在施用給宿主之前，質(zhì)?？稍诩毦绱竽c桿菌中生長，然后分離并在適當介質(zhì)中制備質(zhì)粒，所用介質(zhì)取決于施用途徑。施用后，質(zhì)粒為宿主細胞所攝取，并在其中產(chǎn)生編碼的肽。為了防止質(zhì)粒在哺乳動物宿主中復(fù)制和在有關(guān)動物中對染色體DNA的整合，優(yōu)選地，質(zhì)粒載體被制備成不具有在真核細胞中發(fā)揮功能的復(fù)制起點。
相對于傳統(tǒng)的疫苗接種技術(shù)，DNA疫苗接種具有許多優(yōu)越性。首先，由于DNA序列編碼的蛋白質(zhì)在宿主中合成，可預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象將與疾病有關(guān)的天然蛋白質(zhì)相似。通過產(chǎn)生可以識別保守蛋白質(zhì)的抗原決定簇的細胞毒素T淋巴細胞反應(yīng)，DNA疫苗接種還可能抵抗不同病毒株系。而且，由于質(zhì)粒為宿主細胞所攝取并在其中生產(chǎn)抗原蛋白，可激發(fā)長期的免疫反應(yīng)。DNA疫苗接種還可結(jié)合各種不同的免疫原而可能制成單一制劑，因而促進對許多種疾病的同時免疫。
有關(guān)DNA疫苗接種的有用的背景資料描述于Donnelly等“DNAvaccines”Ann.Rev Immunol.1997 15617-648，本文引用該文公開的全部內(nèi)容作為參考。
發(fā)明概述本發(fā)明提供用于預(yù)防和治療HIV感染和AIDS的核酸疫苗的新構(gòu)建體。
相應(yīng)地，作為第一個方面，本發(fā)明提供了一種核酸分子，其含有編碼HIV gag蛋白或其片段的核苷酸序列和與其連接的編碼了其它HIV抗原或其片段的核苷酸序列，這些核苷酸序列與異源啟動子可操作地連接。所述核苷酸序列的片段編碼HIV表位，并典型地編碼至少8個氨基酸的肽。核苷酸序列優(yōu)選地是DNA序列，并優(yōu)選地包含于沒有復(fù)制起始的質(zhì)粒中。這種核酸分子與藥用的賦形劑、載體、稀釋劑或佐劑一起配制，生產(chǎn)適合于治療和/或預(yù)防HIV感染和AIDS的藥物組合物。
在一個優(yōu)選的實施方案中，DNA序列被配制在適合于以顆粒作為介質(zhì)傳遞藥物的惰性顆粒(particle)或小珠(bead)的表面。優(yōu)選地，小珠是金的。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，提供含有g(shù)ag蛋白高度表達的密碼的DNA序列，所述序列已被優(yōu)化成與哺乳動物細胞中基因所使用的密碼子相似。具體地說，所述gag蛋白被優(yōu)化成類似于高度表達的人類基因。
DNA密碼分別由4個字母(A、T、C和G)表示，并使用它們拼寫成代表生物體基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸的三個字母所表示的“密碼子”。沿著DNA分子的順序排列的密碼子被翻譯成由那些基因編碼的蛋白質(zhì)中氨基酸的序列。密碼子具有高度簡并性，其中61個密碼子編碼20個常見氨基酸(即蛋白質(zhì)氨基酸)和3個密碼子代表“終止”信號。因此，大多數(shù)氨基酸由不止一個密碼子所編碼-事實上，有些氨基酸是由四個或更多不同的密碼子所編碼。
不止一個密碼子編碼了同一個特定的氨基酸，人們已觀察到生物體中密碼子的使用模式是高度不隨機的。不同物種，在密碼子選擇上顯示了不同的偏好性，而且在同一物種中，在以高水平和低水平表達的基因之間的密碼子使用模式可以非常不同。這種偏好性在病毒、植物、細菌和哺乳動物細胞中是不同的，并且某些物種比其他物種顯示出更高的非隨機密碼子選擇的偏好性。例如，人和其他哺乳動物比某些細菌或病毒的偏好性要弱。由于這些原因，在大腸桿菌中表達哺乳動物基因或在哺乳動物細胞中表達外源或重組基因時，對于有效表達而言密碼子分布是非常有可能不適當。在異源DNA序列中存在的密碼子簇或者豐富的密碼子在將要用于表達的宿主中很少觀察到，則往往預(yù)示著在該宿主中對該異源基因的表達水平將很低。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一個編碼氨基酸序列的gag多核苷酸序列，其中多核苷酸序列的密碼子使用模式與高度表達的哺乳動物基因的密碼子使用模式相似。優(yōu)選地，多核苷酸序列是DNA序列。理想地，多核苷酸序列的密碼子使用模式是典型的高度表達的人類基因。
在本發(fā)明的多核苷酸中，密碼子使用模式從人免疫缺陷病毒的密碼子典型模式改變?yōu)楦咏袠松矬w的密碼偏好性的使用模式，例如哺乳動物，特別是人。“密碼子使用系數(shù)(codon usage coefficient)”衡量給定的多核苷酸序列的密碼子模式與靶標物種的密碼子模式相似的程度。許多物種的高度表達基因的密碼子出現(xiàn)頻率可從已有文獻資料中獲得(參見，例如，Nakamura等，Nucleic Acids Rearch 1996，24214-215)。將61個密碼子中每一個密碼子的出現(xiàn)頻率(用所選擇基因類別中每1000個密碼子中出現(xiàn)的數(shù)量來表示)對20個常見氨基酸中每一個進行標準化，將每一個氨基酸最頻繁使用的密碼子的值設(shè)定為1，使用較少的密碼子的頻率范圍將在0和1之間。這樣，對于靶標物種的高度表達基因，61個中的每一個密碼子被確定為值1或更低。為了計算某一特定多核苷酸的密碼子相對于該物種的高度表達基因的使用系數(shù)，記錄該特定多核苷酸的各個密碼子的測量值，并且計算出所有這些值的幾何平均值(這些值的自然對數(shù)之和除以密碼子的總數(shù)，并取反對數(shù))。該系數(shù)的值在0和1之間，并且密碼子的系數(shù)越高，多核苷酸中對該密碼子的使用更為頻繁。如果多核苷酸序列的某一密碼子使用系數(shù)為1，對于靶標物種的高度表達基因而言，所有密碼子均為“最頻繁出現(xiàn)”的密碼子。
依據(jù)本發(fā)明，多核苷酸的密碼子利用模式優(yōu)先地排除在靶標生物體的高度表達基因中RSCU值小于0.2的密碼子?？蛇x地，該密碼子利用模式排除編碼特定氨基酸少于10％的密碼子。如果所述氨基酸的所有密碼子利用頻率相同，那么相對同義密碼子利用率(RSCU)值是密碼子的觀測數(shù)量除以預(yù)測數(shù)量。對于高度表達的人類基因，本發(fā)明的多核苷酸一般具有大于0.3，優(yōu)選大于0.4，最優(yōu)選大于0.5的密碼子使用系數(shù)(或RSCU)。人的密碼子利用率表還可在Genebank中查到。
經(jīng)比較，高度表達的β肌動蛋白基因的RSCU值為0.747。人(homosapiens)的密碼子利用率表如下密碼子利用率表1人(homo sapiens)[gbpri]27143 CDS’s(12816923個密碼子)范圍(fields)[三聯(lián)體][頻率每1000個]([數(shù)量])UUU 17.0(217684) UCU 14.8(189419) UAU 12.1(155645) UGU 10.0(127719)UUC 20.5(262753) UCC 17.5(224470) UAC 15.8(202481) UGC 12.3(157257)UUA 7.3( 93924) UCA 11.9(152074) UAA 0.7( 9195) UGA 1.3( 16025)UUG 12.5(159611) UCG 4.5( 57572) UAG 0.5( 6789) UGG 12.9(165930)CUU 12.8(163707) CCU 17.3(222146) CAU 10.5(134186) CGU 4.6( 59454)CUC 19.3(247391) CCC 20.0(256235) CAC 14.9(190928) CGC 10.8(137865)CUA 7.0( 89078) CCA 16.7(214583) CAA 12.0(153590) CGA 6.3( 80709)CUG 39.7(509096) CCG 7.0( 89619) CAG 34.5(441727) CGG 11.6(148666)AUU 15.8(202844) ACU 12.9(165392) AAU 17.0(218508) AGU 12.0(154442)AUC 21.6(277066) ACC 19.3(247805) AAC 19.8(253475) AGC 19.3(247583)AUA 7.2( 92133) ACA 14.9(191518) AAA 24.0(308123) AGA 11.5(147264)AUG 22.3(285776) ACG 6.3( 80369) AAG 32.6(418141) AGG 11.3(145276)
GUU 10.9(139611) GCU 18.5(236639) GAU 22.4(286742) GGU 10.8(138606)GUC 14.6(187333) GCC 28.3(362086) GAC 26.1(334158) GGC 22.7(290904)GUA 7.0( 89644) GCA 15.9(203310) GAA 29.1(373151) GGA 16.4(210643)GUG 28.8(369006) GCG 7.5( 96455) GAG 40.2(515485) GGG 16.4(209907)編碼GC 52.51％第一個字母GC 56.04％第二個字母GC 42.35％第三個字母GC 59.13％。
密碼子利用率表2(優(yōu)選的)人(高度表達的)基因1/24/91的密碼子利用率(human-high.cod)氨基酸 密碼子數(shù)量 /1000分數(shù)(fraction)Gly GGG 905.0018.760.24Gly GGA 525.0010.880.14Gly GGT 441.009.14 0.12Gly GGC 1867.00 38.700.50Glu GAG 2420.00 50.160.75Glu GAA 792.0016.420.25Asp GAT 592.0012.270.25Asp GAC 1821.00 37.750.75Val GTG 1866.00 38.680.64Val GTA 134.002.78 0.05Val GTT 198.004.10 0.07Val GTC 728.0015.090.25Ala GCG 652.0013.510.17Ala GCA 488.0010.120.13Ala GCT 654.0013.560.17Ala GCC 2057.00 42.640.53Arg AGG 512.0010.610.18Arg AGA 298.006.18 0.10Ser AGT 354.007.34 0.10Ser AGC 1171.00 24.270.34Lys AAG 2117.00 43.880.82Lys AAA 471.009.76 0.18Asn AAT 314.006.51 0.22Asn AAC 1120.00 23.220.78Met ATG 1077.00 22.321.00Ile ATA 88.00 1.82 0.05Ile ATT 315.006.53 0.18Ile ATC 1369.00 28.380.77Thr ACG 405.008.40 0.15
ThrACA373.007.73 0.14ThrACT358.007.42 0.14ThrACC1502.00 31.13 0.57TrpTGG652.0013.51 1.00EndTGA109.002.26 0.55CysTGT325.006.74 0.32CysTGC706.0014.63 0.68EndTAG42.00 0.87 0.21EndTAA46.00 0.95 0.23TyrTAT360.007.46 0.26TyrTAC1042.00 21.60 0.74LeuTTG313.006.49 0.06LeuTTA76.00 1.58 0.02PheTTT336.006.96 0.20PheTTC1377.00 28.54 0.80SerTCG325.006.74 0.09SerTCA165.003.42 0.05SerTCT450.009.33 0.13SerTCC958.0019.86 0.28ArgCGG611.0012.67 0.21ArgCGA183.003.79 0.06ArgCGT210.004.35 0.07ArgCGC1086.00 22.51 0.37GlnCAG2020.00 41.87 0.88GlnCAA283.005.87 0.12HisCAT234.004.85 0.21HisCAC870.0018.03 0.79LeuCTG2884.00 59.78 0.58LeuCTA166.003.44 0.03LeuCTT238.004.93 0.05LeuCTC1276.00 26.45 0.26ProCCG482.009.99 0.17ProCCA456.009.45 0.16ProCCT568.0011.77 0.19ProCCC1410.00 29.23 0.48本發(fā)明的另一個方面提供了一種表達載體，含有并能夠調(diào)控本發(fā)明第一個方面所述多核苷酸序列的表達，特別是gag多核苷酸序列的密碼子使用模式是典型的高度表達的哺乳動物基因，優(yōu)選地是高度表達的人類基因。所述載體可適合于在細菌、昆蟲或哺乳動物細胞、特別是人細胞中的表達異源DNA。在一個實施方案中，所述表達載體是p7313(見

圖1)。
在第三個實施方案中，提供了與編碼NEF及其片段、或HIV反轉(zhuǎn)錄酶(RT)或其片段的DNA序列融合的異源啟動子控制下的gag基因。所述基因的gag部分可以在融合體的N或C端部分。
在一個優(yōu)選的實施方案中，gag基因不編碼gag p6肽。優(yōu)選地，NEF基因是截短的即除去了編碼N末端區(qū)域的序列，也即除去30-85，優(yōu)選地60-85，典型的約81，優(yōu)選地N末端的65個氨基酸。
在另一個實施例中，RT基因也被優(yōu)化成與高度表達的人類基因相似。所述RT優(yōu)選地編碼一個突變以基本上失活了任何反轉(zhuǎn)錄酶的活性。一個優(yōu)選的失活突變包括用W色氨酸229代替K(賴氨酸)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，宿主細胞含有本發(fā)明所述的多核苷酸序列，或者本發(fā)明所提供的表達載體。所述宿主細胞可以是細菌，例如大腸桿菌；哺乳動物，例如人；或者是昆蟲細胞。含有本發(fā)明提供的載體的哺乳動物細胞可以是培養(yǎng)細胞，可體外轉(zhuǎn)染，或者可通過給予哺乳動物載體而發(fā)生體內(nèi)轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明進一步提供了含有本發(fā)明的多核苷酸序列的藥物組合物。優(yōu)選地，所述組合物含有DNA載體。在優(yōu)選的實施方案中，所述組合物含有大量顆粒，優(yōu)選地是金顆粒，為含有編碼本發(fā)明的多核苷酸序列的載體的DNA所包被。優(yōu)選地，編碼HIV gag氨基酸序列的多核苷酸序列的密碼使用模式是典型的高度表達的哺乳動物基因，特別是人的基因。在可選的實施方案中，所述組合物含有藥用的賦形劑以及根據(jù)本發(fā)明第二個方面的DNA載體。所述組合物還可包括佐劑。
因而，本發(fā)明的一個實施方案是本發(fā)明的載體與免疫刺激劑一起利用。優(yōu)選地，免疫刺激劑與本發(fā)明的核酸載體同時給藥，并且在優(yōu)選的實施方案中它們一起配制。這種免疫刺激劑包括，但這里決非全面列舉，也不排除其他的免疫刺激劑合成咪唑并喹啉(imidazoquinoline)例如咪喹莫特(imiquimod)(p14)[S-26308，R-837]，(Harrison等，“單獨使用咪喹莫特或與糖苷配基蛋白質(zhì)疫苗結(jié)合使用減少HSV疾病的復(fù)發(fā)”，Vaccine 191820-1826，(2001))；和resiquimod[S-28463，R-848](Vasilakos等，“免疫反應(yīng)修飾基因R-848的佐劑活性與CpG ODN’的比較”，細胞免疫學(Cellularimmunology)20464-74(2000))，在抗原遞呈細胞和T-細胞表面組成型表達的羰基和胺的Schiff堿基，例如tucaresol(Rhodes，J.等，“通過共刺激Schiff-堿基-形成藥物免疫系統(tǒng)的治療效果增強”，Nature 3777175(1995))，細胞因子、趨化因子和共-刺激分子的蛋白質(zhì)或肽，包括促炎細胞因子例如GM-CSE、IL-1α、IL-1β、TGF-α和TGF-β，Th1誘導劑例如干擾素γ、IL-2、IL-12、IL-15和IL-18，Th2誘導劑例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13和其它趨化因子以及共-刺激基因例如MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TCA-3、CD80、CD86和CD40L，以及其它免疫刺激靶向配基例如CTLA-4和L-選擇蛋白、細胞程序死亡刺激蛋白和肽例如Fas，(49)、合成脂基佐劑，例如vaxfectin，(Reyes等，“Vaxfectin增強抗原特異性抗體的效價并保持對質(zhì)粒DNA免疫的Th1型的免疫反應(yīng)”，Vaccine193778-3786)角鯊烯、α-生育酚、聚山梨醇酯80、DOPC和膽固醇、內(nèi)毒素、[LPS](Beutler，B，“內(nèi)毒素，Toll-樣受體4和先天免疫性的傳入支”，現(xiàn)代微生物學觀點(Current Opinion inMicrobiology)，323-30(2000))；CpG寡-和二-核苷酸(Sato，Y.等，“有效皮內(nèi)基因免疫所必需的免疫刺激DNA序列”，Science 273(5273)352-354(1996)。Hemmi，H等，“一種Toll-樣受體識別細菌DNA”，Nature 408740-745，(2000))、以及其它引發(fā)Toll受體產(chǎn)生Th1-誘導細胞因子的潛在的配基，例如合成的分枝桿菌脂蛋白、分枝桿菌蛋白p19、肽聚糖磷壁質(zhì)和類脂A。
激發(fā)主要的Th1-型反應(yīng)的某些優(yōu)選的佐劑包括，例如，類脂A的衍生物，例如單磷酰類脂A，或優(yōu)選地3-去-O-酰化單磷酰類脂A。MAL佐劑可從Corixa Corporation購得(Seattle，WA；見例如，美國專利4,436,727、4,877,611、4,866,034和4,912,094)。包含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)也誘導主要的Th1反應(yīng)。這種寡核苷酸是眾所周知的，并描述于例如，WO 96/02555、WO99/33488和美國專利6,008,200和5,856,462。免疫刺激DNA序列也在例如Sato等，Science 273352，1996中有描述。另一種優(yōu)選的佐劑包括皂苷，例如Quil A，或其衍生物，包括QS21和QS7(AquilaBiopharmaceuticals Inc.，F(xiàn)ramingham，MA)、七葉皂苷、毛地黃皂苷、或Gypsophila或奎藜籽皂苷(Chenopodium quinoa saponins)。
還提供了根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或根據(jù)本發(fā)明的載體在治療或預(yù)防HIV感染的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了治療HIV或預(yù)防HIV感染、及任何與之有關(guān)的癥狀或疾病的方法，包括給予有效量的本發(fā)明多核苷酸、載體或藥物組合物。藥物組合物可采取一或多個單獨劑量方式給予，例如用相同DNA質(zhì)粒的重復(fù)劑量，或以一種“初次免疫-加強免疫”(prime-boost)的治療接種方式。在某些情況下，“初次”接種可通過顆粒介導DNA釋放本發(fā)明的多核苷酸，優(yōu)選地整合到質(zhì)粒衍生載體中，而“加強免疫”通過給予含有同樣的多核苷酸序列的重組病毒載體進行，或者用佐劑中的蛋白質(zhì)加強。相反地，初次免疫可使用病毒載體或典型地在佐劑中配制蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)制劑，而加強免疫使用本發(fā)明的DNA疫苗。可采用多次劑量的初次免疫和/或加強免疫。
涉及gag、nef或RT蛋白的片段的實施方案也得到了考慮。例如，本發(fā)明的多核苷酸可編碼HIV gag、nef或RT蛋白的片段。一種多核苷酸編碼至少8個氨基酸的片段，例如長度為8-10個氨基酸或高達20、50、60、70、80、100、150或200個氨基酸，只要所編碼的寡肽或多肽顯示了HIV抗原性，均認為屬于本發(fā)明的范圍。特別地，但并不是唯一的，本發(fā)明的這一方面包含多核苷酸編碼完全HIV蛋白序列的片段，其代表著HIV蛋白質(zhì)的一個或多個分離(discrete)表位時的情況。這種片段可以含優(yōu)化密碼子，以使該片段就具有與高度表達的哺乳動物基因相似的密碼子使用模式。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選構(gòu)建體包括1.p17、p24，與截短的NEF融合(缺乏編碼末端氨基酸1-65的核苷酸)2.p17、p24、RT截短的NEF(缺乏編碼末端氨基酸1-65的核苷酸)3.p17、p24(優(yōu)化的gag)截短的NEF(缺乏編碼末端氨基酸1-65的核苷酸)4.p17、p24(優(yōu)化的gag)RT(優(yōu)化的)截短的NEF(缺乏編碼末端氨基酸1-85的核苷酸)5.p17、p24、RT(優(yōu)化的)截短的NEF(缺乏編碼末端氨基酸1-65的核苷酸)6.截短的NEF-(缺乏核苷酸1-65)與優(yōu)化的p17、p24 gag融合。
7.本發(fā)明特別優(yōu)選的構(gòu)建體包括三重融合RT-NEF-Gag，尤其是RT-Gag-Nef；8.優(yōu)化的RT、截短的NEF和優(yōu)化的p17、p24(gag)(RNG)和9.優(yōu)化的RT、優(yōu)化的p17、24(gag)、Nef截短物(缺乏氨基酸1-65)RGN優(yōu)選地，HIV構(gòu)建體衍生自HIV分化體(Clade)B或分化體C，尤其是分化體B。
如上所述，本發(fā)明包括含有本發(fā)明核苷酸序列的表達載體。這種表達載體可用分子生物學領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)進行構(gòu)建，并可能例如涉及利用質(zhì)粒DNA和適當?shù)钠鹗甲?、啟動子、增強子、和其它元件例如多聚腺苷酸化信號，它可能是必需的并位于正確的位置和方向，以能夠使蛋白質(zhì)表達。其它適合的載體是本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員已知的。關(guān)于這一點的其它的實施例我們參考Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloninga Laboratory Manual)，第二版，CSHLaboratory Press.(1989)。
優(yōu)選地，本發(fā)明多核苷酸，或在本發(fā)明中用于載體的多核苷酸，與能夠在宿主細胞中表達編碼序列的控制序列可操作地連接，即該載體是一種表達載體。術(shù)語“可操作地連接”是指所描述的成分毗鄰并以允許它們以其預(yù)定的方式發(fā)揮功能的關(guān)系存在。調(diào)控序列如啟動子與編碼序列“可操作地連接”，意指以這樣的方式連接，即在與調(diào)控序列相容的條件下使編碼序列的成功表達。
載體可以是，例如，有復(fù)制起點的質(zhì)粒、人工染色體(例如BAC、PAC、YAC)、病毒或噬菌體載體，任選地含有用于多核苷酸表達的啟動子和任選地含有該啟動子的調(diào)節(jié)子。該載體可包括一種或多種可選擇的標記基因，例如在細菌質(zhì)粒中可包含氨芐青霉素或卡那霉素抗性基因，或用于真菌載體的抗性基因。載體可在體外使用，例如用于DNA或RNA的生產(chǎn)或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細胞，例如哺乳動物宿主細胞，如用于生產(chǎn)由載體編碼的蛋白質(zhì)。該載體也可適應(yīng)于體內(nèi)使用，例如用于DNA疫苗接種或基因治療中。
選擇的啟動子和其它表達調(diào)節(jié)信號與用于表達的宿主細胞相兼容。例如，哺乳動物啟動子包括可誘導對重金屬例如鎘的反應(yīng)的金屬硫蛋白啟動子，以及β-肌動蛋白啟動子。病毒啟動子例如SV40大T抗原啟動子，人細胞肥大病毒(CMV)立即早期(IE)啟動子、勞氏肉瘤病毒LTR啟動子、腺病毒啟動子或HPV啟動子，特別是還可使用HPV上游調(diào)節(jié)區(qū)(URR)。所有這些啟動子在本領(lǐng)域中已被詳細描述，并可容易地獲得。
一種優(yōu)選的啟動子元件是CMV立即早期啟動子，它缺乏內(nèi)含子A但包括外顯子1。啟動子元件可以是最小的啟動子元件或增強的啟動子，增強的啟動子是優(yōu)選的。因此，這里提供包含了在HCMV IE早期啟動子控制下的含本發(fā)明多核苷酸的載體。
適合的病毒載體例如包括單純皰疹病毒載體、牛痘或α-病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括慢病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。利用這些病毒的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可用于將本發(fā)明多核苷酸穩(wěn)定地整合到宿主基因組，盡管這種重組不是優(yōu)選的。相反，復(fù)制-缺陷型腺病毒載體保持游離狀態(tài)，并因此允許瞬時表達?？墒褂媚茉诶ハx細胞(例如桿狀病毒載體)、人細胞、酵母或細菌中表達的載體，以產(chǎn)生大量的由本發(fā)明多核苷酸編碼的HIV蛋白，例如可用做亞單位疫苗或用于免疫測定。
根據(jù)本發(fā)明多核苷酸可用于表達生產(chǎn)編碼的蛋白質(zhì)，其表達可在體外、體內(nèi)進行或來自體內(nèi)。因此，核苷酸可涉及重組蛋白質(zhì)合成，例如增加產(chǎn)量，或?qū)嶋H上可憑其自身的特性用做治療劑，用于DNA疫苗接種技術(shù)。本發(fā)明的多核苷酸用于體外或來自體內(nèi)、細胞中生產(chǎn)編碼的蛋白質(zhì)，例如在細胞培養(yǎng)物中進行，則這些細胞被修飾以包含被表達的多核苷酸。這種細胞包括瞬時的、或優(yōu)選穩(wěn)定的哺乳動物細胞系。關(guān)于插入編碼本發(fā)明多肽的載體而修飾的細胞例如包括哺乳動物HEK293T、CHO、HeLa、293和COS細胞。優(yōu)選地，所選擇的細胞系不僅僅是穩(wěn)定的，而且能對多肽進行成熟糖基化和在細胞表面表達。表達可通過轉(zhuǎn)化卵母細胞來達到?？稍谵D(zhuǎn)基因非-人動物，優(yōu)選地是小鼠細胞中表達本發(fā)明多核苷酸以獲得多肽。將本發(fā)明多核苷酸表達成多肽的轉(zhuǎn)基因非-人動物包含于本發(fā)明的范圍中。
本發(fā)明進一步提供接種哺乳動物受檢者的方法，包括給予有效量的這種疫苗或疫苗組合物。最優(yōu)選地，用于DNA疫苗、疫苗組合物和免疫療法的表達載體為質(zhì)粒載體。
DNA疫苗可以“裸DNA”的形式給藥，例如配制成液體用注射器或高壓噴射器進行給藥，或?qū)NA與脂質(zhì)體或刺激性轉(zhuǎn)染增強子一起配制，或通過顆粒介導DNA釋放(PMDD)給藥。所有這些釋放系統(tǒng)為本領(lǐng)域所熟知的。例如通過病毒載體釋放系統(tǒng)可將載體導入哺乳動物。
本發(fā)明的組合物可通過許多途徑來給藥釋放，例如通過肌肉內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或粘膜。
在一個優(yōu)選的實施方案中，組合物通過皮內(nèi)給藥釋放。具體地，組合物通過基因槍給予，尤其是粒子轟擊進行給藥，它包括在粒子(例如金顆粒)上包被載體，然后該粒子在高壓下進入表皮；例如，其方法如Haynes等，J Biotechnology 4437-42(1996)中所描述。
在一個說明性的實施例中，氣體-推動顆粒加速可利用例如由Powderject Pharmaceuticals PLC(Oxford，UK)和Powderject VaccinesInc.(Madison，WI)生產(chǎn)的設(shè)備來達到，其中某些例子描述于美國專利5,846,796、6,010,478、5,865,796、5,584,807和歐洲專利0500799中。這種方法提供了無針給藥方法，其中顯微顆粒的干粉制劑，例如多核苷酸，在由手動儀器產(chǎn)生的氦氣噴射器中被加速到高速，將顆粒推進感興趣的靶組織，典型的是皮膚。
優(yōu)選的顆粒是0.4-4.0μm的金顆粒，更優(yōu)選地直徑為0.6-2.0μm，并且DNA合成物包被在這些顆粒上，然后裝入藥筒或彈夾而放入“基因槍”中。
在一個相關(guān)的實施方案中，可用于本發(fā)明組合物的氣體-推動無針注射的其它設(shè)備和方法包括由Bioject，Inc.(Portland，OR)提供的設(shè)備，其中的具體例子描述于美國專利4,790,824、5,064,413、5,312,335、5,383,851、5,399,163、5,520,639和5,993,412中。
含有編碼抗原肽的核苷酸序列的載體將以預(yù)防或治療有效量進行給藥。對于顆粒介導釋藥，給予的量通常為每劑核苷酸為1微微克(picogram)到1毫克，優(yōu)選地為1微微克到10微克，而對于其它途徑，劑量為100納克到1毫克，優(yōu)選地為10微克到1毫克。精確劑量很大程度上取決于被免疫的受檢者的體重和給藥途徑。
對于含有編碼抗原肽的核苷酸序列的免疫原成分可以一次給予或重復(fù)多次給予，例如1-7次，優(yōu)選地1-4次，間隔為1天到18個月。然而這種治療方式將很大程度上根據(jù)有關(guān)受檢者的大小(size)、給予核苷酸序列的數(shù)量、給予的途徑以及其它為熟練獸醫(yī)或醫(yī)師所熟知的因素而進行調(diào)整。受檢者可接受一種或多種其它抗HIV逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物作為它們整個治療方式中的一部分。此外，核酸免疫原可與佐劑一起給予。
類似地，本文列舉的佐劑成分可通過各種不同的途徑給予，例如通過口、鼻、肺、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或體表給予。優(yōu)選地，佐劑成分通過皮內(nèi)或體表途徑給予。最優(yōu)選通過體表給予。佐劑的給予可在核苷酸序列給予前約14天到給予后約14天之間進行，優(yōu)選地在核苷酸序列給予前約1天到給予后約3天之間。在一個實施方案中，佐劑成分與核苷酸序列的給予基本上同時進行?！盎旧贤瑫r”是指佐劑成分優(yōu)選地在核苷酸序列給予的同一時間給予，否則，至少在核苷酸序列給予的前后幾個小時內(nèi)進行給予。在最優(yōu)選的治療方案中，佐劑成分與核苷酸序列的給予基本上同時進行。顯而易見，根據(jù)上述變量的類型，該方案可隨需要而改變。優(yōu)選地佐劑是1H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺衍生物例如咪喹莫特。典型地，咪喹莫特為體表的膏狀制劑，并根據(jù)上述方案進行給予。
同樣，衍生物給予的劑量也依據(jù)這些變量進行調(diào)整，但是可在例如，從約0.1mg/kg到約100mg/kg之間，這里“每千克(/kg)”指相關(guān)哺乳動物的體重。1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的給予優(yōu)選地隨每次核苷酸序列給予后或加強給予而重復(fù)。最優(yōu)選地，給予劑量為約1mg/kg到50mg/kg。在如本文所描述的“初次-加強”方案的情況下，咪喹莫特或其它1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物可隨初次免疫、或加強免疫給予、或在初次和加強免疫中都進行給予。
雖然，佐劑成分可能含有以原始化學狀態(tài)給予唯一的1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物，以藥物制劑的形式給予是優(yōu)選的。即佐劑成分優(yōu)選地含有與一種或多種藥用載體結(jié)合的1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物，以及任選的其它治療成分。載體必須是“可接受的”，是指與制劑中其它成分相兼容，并對其接受者無害。制劑特性將根據(jù)給予途徑自然地進行調(diào)整，并可通過制藥領(lǐng)域熟知的方法來制備。所有方法都包括將1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物與適當?shù)妮d體結(jié)合的步驟。通常，通過均勻和緊密地將衍生物與液體載體或良好分離的固體載體或二者結(jié)合制備制劑，然后如果需要，將產(chǎn)品制成預(yù)期的劑型。適合于口服的本發(fā)明制劑可制成分離的單位，例如制成每一個均含有預(yù)定量活性成分的膠囊、扁囊劑或片劑；粉劑或顆粒；溶液或存在于水成液或非水成液中的懸浮液；或為水包油性液體乳液或油包水性乳狀液?；钚猿煞诌€可制成大丸劑(bolus)、藥糖劑或軟膏。
可任選地與一種或多種助劑壓縮或塑形(moulding)制備成片劑。壓縮的片劑可通過在一個合適的機器中以自由流動形式如粉劑或顆粒的活性成分壓縮制備而成，任選地與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、潤滑劑、表面活性劑或分散劑混合。塑形片劑可通過在適當?shù)臋C器中將惰性液體稀釋劑潤濕的粉狀化合物的混合物塑模制成。
片劑可任選地包被或刻劃，并可配制成活性成分緩慢或控制釋放的片劑。
用于通過例如肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下途徑注射的制劑包括水性和非水性無菌注射溶液，可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和與預(yù)定的接受者的血液等滲的溶質(zhì)；而水性和非水性無菌懸浮液可包括懸浮劑和增稠劑。該制劑可制成單劑量或多劑量的容器中，例如密封的安瓿和管瓶，并可保存于僅需要添加無菌液體載體的凍干條件下，例如在使用前立即添加注射用水。可從前面描述的無菌粉劑、顆粒和片劑類型制備臨時的注射液和懸浮液。適合于通過口或鼻進行肺部給予的制劑被制成理想地具有0.5到7微米直徑的含有活性成分的顆粒，被釋放到接受者的樹狀支氣管。這種制劑可以精細研磨的粉劑形式存在，可方便地制成可穿透(piercable)的膠囊，合適地如明膠，以用于吸入設(shè)備，或者可選地，作為一種含有活性成分、一種適當?shù)囊后w推進劑和任選地其它成分如表面活性劑和/或一種固體稀釋劑的自我推進制劑。也可采用活性成分以溶液或懸浮液液滴的形式配制成自我推進制劑。這種自我推進制劑類似于本領(lǐng)域已知的那些制劑，并可通過成熟方法來制備。手工操作或者用具有所需噴霧特征的自動功能閥來制備，優(yōu)選地，該閥是具有能測量傳遞固定體積的類型，例如每次操作的固定體積為50-100μL。
另一種可能性，佐劑成分可以液體的形式用于噴霧器或霧化器，其中利用加速氣流或超聲攪拌產(chǎn)生用于吸入的微滴薄霧。
適合于經(jīng)鼻給予的制劑通常包括與上述用于肺部給予的制劑相似的制劑，對于這種制劑優(yōu)選地具有約10-200微米的顆粒直徑，使之能夠保持于鼻腔內(nèi)。相應(yīng)地，可通過使用顆粒大小適當?shù)姆蹌┗蜻x擇適當?shù)拈y來獲得。其它適當?shù)闹苿┌ň哂蓄w粒直徑為約20-500微米的粗粉，用于從與鼻靠近的容器中迅速吸入鼻內(nèi)而經(jīng)鼻通道給予，以及在水溶液或油性溶液中含有約0.2-5％w/w的活性成分的鼻滴劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，含有編碼抗原肽的核苷酸序列的載體可以與1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物采用相同的制劑中給予。因此，在這個實施方案中，免疫原性成分和佐劑成分并存于相同的制劑中。
在一個實施方案中，佐劑成分以適合于基因槍給予的形式制備，并經(jīng)該途徑與核苷酸序列基本上同時施用。為了配制適合于以這種方式使用的制劑，對于1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物可能需要凍干并附著在例如適合于基因槍給予的金小珠上。
在另一可選實施方案中，佐劑成分可作為干粉經(jīng)高壓氣體推進器給予。
即使沒有配制在一起，對于佐劑成分可能在核苷酸序列給予位點或者其基本上相同的給予位點進行給予是合適的。
藥物制備的其它細節(jié)可在Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennysylvania(1985)中找到，其公開的全部內(nèi)容被本文引入作為參考。
用于將裸多核苷酸或載體引入患者的合適技術(shù)也包括以適當?shù)姆绞竭M行局部給予。核酸可經(jīng)皮膚局部給予，或粘膜表面，例如經(jīng)鼻內(nèi)、口腔、陰道內(nèi)或直腸內(nèi)給予。裸多核苷酸或載體可與藥用的賦形劑例如磷酸緩沖鹽(PBS)一起存在。通過使用易化劑例如丁呱卡而進一步促進DNA的攝取，該易化劑或者單獨使用或者包含于DNA制劑中。其它將核酸直接給予接受者的方法包括超聲、電刺激、電穿孔和顯微接種，在美國5,697,901中對此有描述。
可通過一些已知的轉(zhuǎn)染技術(shù)增強對核酸構(gòu)建體的吸收，例如包括使用轉(zhuǎn)染試劑的技術(shù)。這些試劑的例子包括陽離子試劑，例如，磷酸鈣和DEAE-葡聚糖和脂轉(zhuǎn)染試劑(lipofectant)，例如lipofectam和transfectam。給予核酸的劑量可以進行調(diào)整。
本發(fā)明的核酸序列還可通過基因療法中使用的特異性釋放載體給予?；蛑委煼椒ɡ缬蒝erme等在Nature 1997，389239-242中描述。病毒和非病毒載體系統(tǒng)均可使用?；诓《镜南到y(tǒng)包括基于逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、Canarypox和痘苗-病毒系統(tǒng)?；诜遣《镜南到y(tǒng)包括核酸的直接給予、微球包囊技術(shù)(聚(丙交酯-共-乙交酯)和基于脂質(zhì)體的系統(tǒng)。病毒和非病毒釋放系統(tǒng)可結(jié)合使用，其中在初始接種后進行強化注射是理想的，例如使用非病毒載體例如質(zhì)粒進行最初的“初次”DNA接種，隨后使用病毒載體或基于非病毒的系統(tǒng)進行一次或多次“加強”接種。同樣地，本發(fā)明設(shè)計了具有本發(fā)明多核苷酸的初次免疫導入系統(tǒng)，隨后用存在于佐劑中的蛋白質(zhì)進行加強免疫，反之亦然。
本發(fā)明的核酸序列還可通過轉(zhuǎn)化細胞給予。這種細胞包括從被試者收集的細胞。在體外將本發(fā)明的裸多核苷酸或載體導入這種細胞，隨后將該轉(zhuǎn)化的細胞返回到被試者體內(nèi)。本發(fā)明的多核苷酸可通過同源重組整合進入細胞中已存在的核酸中。如果需要，轉(zhuǎn)化細胞可在體外生長，并且獲得的一個或多個細胞可用于本發(fā)明。可通過已知的外科或顯微外科技術(shù)(例如移植、顯微注射等)在患者適當?shù)牟课唤o予這種細胞。
本發(fā)明的藥物組合物可包括如上所述的佐劑化合物，或其它可用于提高由DNA編碼的蛋白質(zhì)誘導的免疫反應(yīng)的物質(zhì)。這些物質(zhì)可由DNA編碼，或者單獨存在或與抗原進行了融合，或者作為非DNA元件包含在制劑中。可包含于本發(fā)明制劑中的佐劑型物質(zhì)的例子包括泛素、溶酶體伴隨膜蛋白(LAMP)、乙肝病毒核心抗原、FLT3-配體(一種在消化性抗原呈遞細胞發(fā)生中重要的細胞因子，具體是樹枝狀細胞)以及其它細胞因子例如IFN-γ和GMCSF。其它優(yōu)選的佐劑包括咪喹莫特、Resimquimod和Tucarasol。咪喹莫特是特別優(yōu)選的。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，提供了如本文所描述的核酸分子在治療或預(yù)防HIV感染中的用途。核酸分子優(yōu)選地與咪喹莫特配合給予。咪喹莫特優(yōu)選局部給予，而核酸分子優(yōu)選通過顆粒介導釋放的方式給予。
因此，本發(fā)明提供了治療患有HIV或易于遭受HIV感染的被檢者的方法，包括給予本發(fā)明描述的核酸分子和咪喹莫特。
現(xiàn)在本發(fā)明將參考如下實施例作進一步的描述實施例實施例1優(yōu)化p55 gag(p17、p24、p13)以與高度表達的人類基因的密碼子利用率相似感興趣的基因用于哺乳動物細胞中表達的編碼HIV-1分化體B菌株HXB2的p55gag抗原的優(yōu)化合成基因(GenBank記錄號K03455)，利用PCR擴增的重疊寡核苷酸進行裝配。
優(yōu)化涉及改變病毒基因的密碼子使用模式以獲得與在高度表達的人類基因中發(fā)現(xiàn)的密碼子頻率接近的密碼子頻率。利用被稱做Syngene的統(tǒng)計學Visual Basic程序確定密碼子(由R.S.Hale和G.Thompson編寫的Calcgene的最新版本，蛋白質(zhì)表達和純化，12卷，185-188頁，1998)。
克隆1528bp的gag PCR產(chǎn)物通過凝膠純化，用限制性核酸內(nèi)切酶NotI和BamHI酶切，并連接到NotI/BamHI酶切的載體WRG7077中。即將基因置于CMV啟動子/內(nèi)含子A和牛生長素多腺苷酸化信號之間。
對克隆進行測序并檢查存在的錯誤。沒有一個克隆是100％正確的。因此，通過重疊PCR將兩個克隆中正確序列的區(qū)域結(jié)合，其重疊PCR利用優(yōu)化的寡組合的適當組合以得到密碼子優(yōu)化的全長gag基因。隨后發(fā)現(xiàn)最終克隆中含有一個核苷酸缺失，這導致移碼和翻譯提前終止。通過切除含有不正確序列的基因區(qū)域，并將另一個克隆中含有正確序列的相應(yīng)區(qū)域克隆進來，而修復(fù)了上述缺失。這樣得到密碼子被優(yōu)化p55 gag的最終克隆Gagoptrpr2。(見圖2)。
實施例2制備p17/p24截短的Nef融合基因感興趣的基因通過PCR從質(zhì)粒pHXB？Pr(B.Maschera，E Furfine和E.D.Blair1995J.Virol 69 5431-5436)擴增衍生自HIV-1分化體B菌株HXB2的p55gag基因的p17和p24部分。從該質(zhì)粒中擴增來自HXB2 nef基因的3’末端的pHXB？Pr.426bp。由于HXB2 nef基因含有提前的終止密碼子，因此用兩個重疊PCR修復(fù)密碼子(TGA[終止]到TGG[Trp])。
p17/p24接頭和trNEF接頭的PCR產(chǎn)物通過一個PCR反應(yīng)而接合形成p17p24trNEF融合基因(圖3)(反義)。
1542bp的產(chǎn)物通過凝膠純化，用限制性核酸內(nèi)切酶NotI和BamHI酶切，并克隆進載體WRG7077的NotI BamHI位點。即將基因置于CMV啟動子/內(nèi)含子A和牛生長素多腺苷酸化信號之間。
實施例3制備Gag p17/24opt/trNef1(’Gagopt/Nef’)融合基因感興趣的基因以質(zhì)粒pGagOPTrpr2為模板進行PCR擴增，獲得密碼子優(yōu)化的衍生自HIV-1分化體B菌株HXB2的p55gag基因的p17和p24部分。通過PCR從質(zhì)粒7077trNef20擴增具有修復(fù)的提前終止密碼子(TGA[終止]到TGG[Trp])的截短的HXB2 Nef基因。這兩個PCR產(chǎn)物被設(shè)計成具有重疊的末端，因而這兩個基因在第二輪PCR中發(fā)生接合。
1544bp的產(chǎn)物通過凝膠純化，用限制性核酸內(nèi)切酶NotI和BamHI酶切，并克隆(見圖)進載體WRG7077的NotI BamHI位點。即將基因置于CMV啟動子/內(nèi)含子和牛生長素多腺苷酸化信號之間。
實施例4質(zhì)粒p7077-RT3克隆#A感興趣的基因編碼HIV-1分化體B菌株HXB2的pol基因的RT部分，被優(yōu)化用于在哺乳動物細胞中表達的合成基因是通過PCR擴增的重疊寡核苷酸進行裝配?？寺〉男蛄信cHXB2參考序列(GeneBank記錄號K03455)的位置2550-4222相應(yīng)。為了確保表達，在克隆序列的5’末端具有兩個附加的不存在于原來基因中的密碼子-AUG GGC(MetGly)。
優(yōu)化涉及改變病毒基因的密碼子使用模式，以得到與在高度表達的人類基因中發(fā)現(xiàn)的密碼子頻率相接近的密碼子頻率，但不包括很少使用的密碼子。使用被稱做Syngene的統(tǒng)計學Visual Basic程序確定密碼子(由R.S.Hale和G.Thompson編寫的Calcgene的最新版本，蛋白質(zhì)表達和純化，12卷，185-188頁，1998)。
通過兩個中間克隆，即#16和#21而構(gòu)建成最終克隆。
克隆1.7kb的PCR產(chǎn)物通過凝膠純化，用NotI和BamHI酶切并PCR凈化，然后與NotI/BamHI酶切的pWRG7077連接。這將基因置于CMV啟動子和牛生長素多腺苷酸化信號之間。對克隆進行測序。沒有任何克隆是100％正確的，但通過用來自克隆#21的正確的KpnI-BamHI片段取代克隆#16中含有3個錯誤的403bp的KpnI-BamHI片段，這樣克隆#16被修復(fù)。通過測序證實最終克隆。(見圖5)實施例5優(yōu)化的RT感興趣的基因編碼HIV-1分化體B菌株HXB2的pol基因的RT部分，被優(yōu)化用于在哺乳動物細胞中表達的的合成基因是從質(zhì)粒p7077-RT3切割獲得，即1697bp的NotI/BamHI片段，通過凝膠純化，并克隆進入p7313-ie(衍生自pspC31)的NotI和BamHI位點，而將基因置于Iowa長HCWV啟動子+外顯子1的下游，和兔球蛋白多腺苷酸化信號的上游。(R7004 p27)(圖6)實施例6質(zhì)粒7077trNef20感興趣的基因插入片段含有來自HIV-1分化體B菌株HXB2的Nef基因部分。從基因的5’末端去除195bp，即除去Nef的最初65個氨基酸的密碼子。另外，如前面描述的質(zhì)粒p17/24trNEF1的構(gòu)建中，將已公開的HXB2 nef序列中的提前終止密碼子進行了修復(fù)(TAG到TGG[Trp])。截短的nef序列是從質(zhì)粒p17/24trNef1擴增獲得?？寺⌒蛄信cHXB2參考序列(GenBank記錄號K03455)的位置8992-9417相應(yīng)。為了確保表達，在克隆序列5’末端具有附加的在原來基因中不存在的密碼子-AUG(Met)。
引物StrNef(有義) ATAAGAATGCGGCCGCCATGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTT[SEQ ID No1]AStrNef(反義)CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC[SEQ ID NO2]PCR94℃2分鐘，然后按如下參數(shù)進行25個循環(huán)94℃30秒，50℃30秒，72℃2分鐘，最后72℃5分鐘。
克隆455bp的RT PCR產(chǎn)物通過凝膠純化，用限制性核酸內(nèi)切酶NotI和BamHI酶切，并連接到NotI/BamHI酶切的載體WRG7077上。即將基因置于CMV啟動子/內(nèi)含子A和牛生長素多腺苷酸化信號之間。
實施例7質(zhì)粒7077RT 8感興趣的基因pol基因的RT部分衍生自HIV-1分化體B菌株HXB2。通過PCR從質(zhì)粒p7077Pol14擴增獲得。
克隆序列與HXB2參考序列(GeneBank記錄號K03455)的位置2550-4234相應(yīng)。為了確保表達，克隆序列在5’末端具有兩個附加的不存在于原來基因中的密碼子-AUG GGC(Met Gly)。
引物
SRT(有義) ATAAGAATGCGGCCGCCATGGGCCCCATTAGCCCTATTGAGACT[SEQ ID NO3]ASRT(反義)CGCGGATCCTTAATCTAAAAATAGTACTTTCCTGATT[SEQ ID NO4]PCR94℃2分鐘，然后按如下參數(shù)進行25個循環(huán)94℃30秒，50℃30秒，72℃4分鐘，最后72℃5分鐘。
克隆1720bp的RT PCR產(chǎn)物通過凝膠純化，用限制性核酸內(nèi)切酶NotI和BamHI酶切，并連接到NotI/BamHI酶切的載體WRG7077上。即將基因置于CMV啟動子/內(nèi)含子A和牛生長素多腺苷酸化信號之間。
實施例8p17/24opt/RT/trNef13(’Gagopt/RT/Nef’)該構(gòu)建體含有引起由R到H氨基酸改變的PCR產(chǎn)物。
感興趣的基因衍生自HIV-1分化體B菌株HXB2的優(yōu)化p55gag基因的密碼子的p17/p24部分從質(zhì)粒pGagOPTrpr2經(jīng)PCR擴增獲得。RT編碼序列從質(zhì)粒7077RT 8經(jīng)PCR擴增獲得。具有修復(fù)的提前終止密碼子(TGA[終止]到TGG[Trp])的截短的HXB2 Nef基因經(jīng)PCR從質(zhì)粒7077trNef20擴增得到。三個PCR產(chǎn)物被設(shè)計為具有重疊末端，因此這三個基因在第二輪PCR中發(fā)生連接。
引物(P17/24)Sp17p24opt(有義)ATAAGAATGCGGCCGCCATGGGTGCCCGAGCTTCGGT[SEQ ID NO5]ASp17p24optRT接頭(反義)TGGGGCCCATCAACACTCTGGCTTTGTGTC[SEQ ID NO6]PCR94℃1分鐘，然后按如下參數(shù)進行20個循環(huán)94℃30秒，50℃30秒，72℃2分鐘，最后72℃4分鐘。
1114bp的p17/24opt產(chǎn)物通過凝膠純化。
(RT)
Sp17p24optRT接頭(有義)CAGAGTGTTGATGGGCCCCATTAGCCCTAT[SEQ ID NO7]ASRTtrNef接頭(反義)AACCCACCATATCTAAAA TAGTACTTTCC[SEQ ID NO8]PCR如上文1711bp的RT PCR產(chǎn)物通過凝膠純化。
(5’截短的nef)SRTtrNef接頭(有義)CTATTTTTAGATATGGTGGGTTTTCCAGTCAC[SEQ ID NO9]AStrNef(反義)CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC[SEQ ID NO10]PCR如上文448bp的產(chǎn)物通過凝膠純化。
然后Sp17/24opt和AstrNef為引物進行第二輪PCR將上述三個PCR產(chǎn)物接合在一起。
PCR94℃1分鐘，然后按如下參數(shù)進行30個循環(huán)94℃30秒，50℃30秒，72℃4分鐘，最后72℃4分鐘。
3253bp的產(chǎn)物通過凝膠純化，用限制性核酸內(nèi)切酶NotI和BamHI酶切，并克隆到載體WRG7077的NotI BamHI位點。即將基因置于CMV啟動子/內(nèi)含子A和牛生長素多腺苷酸化信號之間。
實施例9質(zhì)粒pGRN#16(p17/p24opt corr/RT/trNef.)感興趣的基因由于在p24中氨基酸270附近存在不利的密碼子簇，由p17/24opt/RT/trNef13(’Gagopt/RT/Nef’)產(chǎn)生的多蛋白被表達為約30kDa的截短產(chǎn)物。這些密碼子被PCR接合誘變產(chǎn)生的優(yōu)選密碼子所取代。以p17/24opt/RT/trNef13作模板，Sp17/p24opt和GTR-A為引物擴增Gag 5′端的部分以產(chǎn)生突變體，和以GTR-S和Asp17/p24optRT接頭為引物擴增Gag 3′端的部分以產(chǎn)生突變體。利用Sp17/p24opt和Asp17/p24optRT接頭引物將包含了改變的密碼子的重疊產(chǎn)物和凝膠純化的產(chǎn)物連接在一起。所得到的產(chǎn)物用NotI和AgeI酶切，并插入用相同酶切割的p17/24opt/RT/trNef 13中，獲得pGRN。對克隆#16進行驗證并用于進一步的研究。
引物5＇PCR:
Sp17p24opt(有義)ATAAGAATGCGGCCGCCATGGGTGCCCGAGCTTCGGT[SEQ ID NO11]GTR-A(反義)GCGCACGATCTTGTTCAGGCCCAGGATGATCCACCGTTTATAGATTTCTCC[SEQID NO12]3′PCR有義GTR-S(有義)ATCCTGGGCCTGAACAAGATCGTGCGCATGTACTCTCCGACATCCATCC[SEQ IDNO13]ASp17p24optRT接頭(反義)TGGGGCCCATCAACACTCTGGCTTTGTGTC[SEQ ID NO14]用于各個產(chǎn)物和連接，使用PWO DNA聚合酶(Roche)的PCR條件是95℃1分鐘，然后按下述參數(shù)進行20個循環(huán)95℃30秒，55℃30秒，72℃180秒，最后72℃120秒，在4℃保持。
1114bp的產(chǎn)物通過凝膠純化，并用NotI和AgeI酶切產(chǎn)生6647bp的片段，經(jīng)凝膠純化后連接到NotI/AgeI酶切的、凝膠純化的p17/24opt/RT/trNef13中，獲得pGRN#16。
實施例10質(zhì)粒p73i-GRN2克隆#19
(p17/p24(opt)/RT(opt)trNef)-修復(fù)的感興趣的基因來自于HIV-1分化體B菌株HXB2的密碼子被優(yōu)化的gag的p17/p24部分、密碼子優(yōu)化的RT和截短的Nef基因位于Iowa長HCMV啟動子+外顯子1的下游和兔β-球蛋白多腺苷酸化信號的上游之間。
包含衍生自質(zhì)粒p17/24trNef1的trNef基因的質(zhì)粒包含一個PCR錯誤，導致從nef末端的19個氨基酸的R到H的氨基酸改變。這通過PCR誘變得以校正，校正的nef PCR與p7077-RT3的密碼子優(yōu)化RT進行連接，并用ApaI和BamHI酶切連接的片段，并克隆到用ApaI/BamHI酶切的p73i-GRN中。
引物利用引物進行PCR以從p7077-RT3獲得coRT(聚合酶＝全部為PWO(Roche))有義U1GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT[SEQ ID NO15]AScoRT-NefGGTGTGACTGGAAAACCCACCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC[SEQ ID NO16]循環(huán)95℃(30秒)，然后如下參數(shù)進行25個循環(huán)95℃(30秒)，55℃(30秒)，72℃(180秒)，然后72℃(120秒)，最后保持在4℃。
1.7kp的PCR產(chǎn)物通過凝膠純化。
利用下述引物進行PCR以從p17/24trNef1獲得5’Nef有義S-NefATGGTGGGTTTTCCAGTCACACC[SEQ ID NO17]反義ASNef-GGATGAAATGCTAGGCGGCTGTCAAACCTC[SEQ ID NO18]循環(huán)95℃(30秒)，然后按如下參數(shù)進行15個循環(huán)95℃(30秒)，55℃(30秒)，72℃(60秒)，然后72℃(120秒)，最后保持在4℃。
利用如下引物進行PCR以從p17/24trNef1獲得3’Nef有義SNEF-GGAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATC[SEQ ID NO19]反義AStrNef(反義)CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC[SEQ ID NO20]循環(huán)95℃(30秒)，然后按如下參數(shù)進行15個循環(huán)95℃(30秒)，55℃(30秒)，72℃(60秒)，然后72℃(120秒)，最后保持在4℃。
PCR產(chǎn)物通過凝膠純化。使用5’(S-Nef)和3’(AstrNef)引物將兩個最初Nef產(chǎn)物連接。
循環(huán)95℃(30秒)，然后按如下參數(shù)15個循環(huán)95℃(30秒)，55℃(30秒)，72℃(60秒)，然后72℃(180秒)，最后保持在4℃。
PCR產(chǎn)物被PCR凈化，并用U1和AstrNef引物將其與RT產(chǎn)物連接循環(huán)95℃(30秒)，然后按如下參數(shù)進行20個循環(huán)95℃(30秒)，55℃(30秒)，72℃(180秒)，然后72℃(180秒)，最后保持在4℃。
2.1kb的產(chǎn)物通過凝膠純化，并用ApaI和BamHI酶切。質(zhì)粒p73I-GRN也用ApaI和BamHI酶切、凝膠純化并與ApaI-Bam RT3trNef連接產(chǎn)生p17/p24(opt)/RT(opt)trNef基因。
實施例11p73i-GN2克隆#2(p17/p24opt/trNef)-修復(fù)的感興趣的基因來自于HIV-1分化體B菌株HXB2的密碼子優(yōu)化的gag的p17/p24部分、截短的Nef基因位于Iowa長HCMV啟動子+外顯子1的下游和兔β-球蛋白多腺苷酸化信號的上游之間。
包含衍生自質(zhì)粒p17/24trNef1的trNef基因的質(zhì)粒含有一個PCR錯誤，導致從nef末端的19個氨基酸R到H的氨基酸改變。這通過PCR誘變得以校正，校正的片段用BglII和BamHI酶切，并克隆進BglII/BamHI酶切的p73I-GN中。(圖12)重建了Iowa長HCMV啟動子+外顯子1的下游以及兔β-球蛋白多腺苷酸化信號的上游之間經(jīng)校正的p17/p24opt/trNef所產(chǎn)生的融合基因。
利用下述引物以從p17/24trNef1獲得5’Nef聚合酶＝全部為PWO(Roche)有義S-NefATGGTGGGTTTTCCAGTCACACC[SEQ ID NO21]反義ASNef-GGATGAAATGCTAGGCGGCTGTCAAACCTC[SEQ ID NO22]循環(huán)95℃(30秒)，然后按如下述參數(shù)進行15個循環(huán)95℃(30秒)，55℃(30秒)，72℃(60秒)，然后72℃(120秒)，最后保持在4℃。
利用下述引物以從p17/24trNef1獲得3’Nef有義SNEF-GGAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATC[SEQ ID NO23]反義AStrNefCGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC [SEQ ID NO24]循環(huán)95℃(30秒)，然后按如下參數(shù)進行15個循環(huán)95℃(30秒)，55℃(30秒)，72℃(60秒)，然后72℃(120秒)，最后保持在4℃。
PCR產(chǎn)物通過凝膠純化，并用5’(S-Nef)和3’(AstrNef)引物進行連接。
循環(huán)95℃(30秒)，然后按如下參數(shù)進行15個循環(huán)95℃(30秒)，55℃(30秒)，72℃(60秒)，然后72℃(180秒)，最后保持在4℃。
PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR凈化，用BglII/BamHI酶切，得到的367bp片段經(jīng)凝膠純化后，克隆到BglII/BamHI酶切、凝膠純化的p73i-GN中。
實施例12質(zhì)粒p73I-RT w229k(失活的RT)感興趣的基因獲得Iowa長HCMV啟動子+外顯子1的下游和兔β-球蛋白多腺苷酸化信號的上游之間的失活RT基因。
考慮到在治療性疫苗中使用活性HIV RT的種類，需要將該基因失活。這可通過PCR誘變而將RT(衍生自P73I-GRN2)第229位氨基酸從Trp改變?yōu)長ys(R7271 p1-28)來達到。
引物PCR 5’RT+突變用引物(聚合酶＝全部為PWO(Roche))有義RT3-u1GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT[SEQ ID NO25]反義AScoRT-Trp229LysGGAGCTCGTAGCCCATCTTCAGGAATGGCGGCTCCTTCT[SEQ ID NO26]循環(huán)1×[94℃(30秒)]15×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(60秒)]1×[72℃(180秒)]PCR凝膠純化
PCR 3’RT+突變用引物反義RT3-11GAATTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAGCTTGTCGACCTGCTCGTTGCCGC[SEQ ID NO27]有義ScoRT-Trp229LysCCTGAAGATGGGCTACGAGCTCCATG[SEQ ID NO28]循環(huán)1×[94℃(30秒)]15×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(60秒)]1×[72℃(180秒)]PCR凝膠純化PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化，用5’(RT3-U1)和3’(RT3-L1)引物將RT的5’和3’末端連接。
循環(huán)1×[94℃(30秒)]15×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(120秒)]1×[72℃(180秒)]PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化，并利用NotI和BamHI限制性位點克隆進入p7313ie，產(chǎn)生p73I-RT w229k。(見圖13)實施例13質(zhì)粒p73i-Tgrn(#3)感興趣的基因來自HIV-1分化體B菌株HXB2的密碼子被優(yōu)化的gag的p17/p24部分、密碼子優(yōu)化RT和截短的Nef基因位于Iowa長HCMV啟動子+外顯子1的下游和兔β-球蛋白多腺苷酸化信號的上游之間。
含有活性形式RT的三重融合的構(gòu)建體對于用于人類的調(diào)節(jié)目的可能不被接受，因此通過將p73i-RT w229k的NheI和ApaI酶切片段插入到NheI/ApaI酶切的p73i-GRN2#19中而獲得失活的RT(圖14)。這導致在RT的位置229上發(fā)生W改變?yōu)镵。
實施例14p73I-Tnrg(#16)感興趣的基因來自HIV-1分化體B菌株HXB2的截短的Nef、密碼子優(yōu)化的失活RT和密碼子優(yōu)化的gag基因的p17/p24部分位于Iowa長度HCMV啟動子+外顯子1的下游以及兔β-球蛋白多腺苷酸化信號的上游之間。
由p73i-Tgrn編碼的多蛋白中的基因順序通過PCR和PCR結(jié)合重排以產(chǎn)生p73I-Tnrg(圖15)。在基因的PCR結(jié)合以形成單一的多蛋白之前，每個基因都經(jīng)PCR擴增并經(jīng)凝膠純化。該產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化、用NotI/BamHI消化后連接到NotI/BamHI酶切的p7313ie中。
引物trNef PCRS-Nef(NotI)CATTAGAGCGGCCGCGATGGTGGGTTTTCCAC[SEQ ID NO29]AS-Nef-coRT接頭GATGGGACTGATGGGGCCCATGCAGTTCTTGAACTACTCCGG[SEQ ID NO30]RTw229k PCRS-coRTATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAG[SEQ ID NO31]AS-coRT-p17p24接頭CAGTACCGAAGCTCGGGCACCCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC[SEQ ID NO32]
p17p24opt PCRS-p17p24optATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG[SEQ ID NO33]AS-p17p24opt(BamHI)GATGGGGGATCCTCACAACACTCTGGCTTTGTGTCC[SEQ ID NO34]用VENT DNA聚合酶(NEB)的對于各個產(chǎn)物和連接的PCR條件如下1×[94℃(30秒)]25×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(120秒[p17p24或RT]或60秒[trNef])]1×[72℃(240秒)]PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化，并用引物S-trNef(NotI)和AS-p17p24opt(BamHI)進行PCR結(jié)合。
1×[94℃(30秒)]25×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(210秒)]1×[72℃(240秒)]3000bp的產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化，并用NotI和BamHI酶切后經(jīng)PCR凈化，連接到NotI/BamHI消化的、凝膠純化的p7313ie中以產(chǎn)生p73i-Tnrg。
實施例151.質(zhì)粒P73i-Tngr(#3)感興趣的基因來自HIV-1分化體B菌株HXB2的截短的Nef、密碼子優(yōu)化的gag的p17/p24部分、密碼子優(yōu)化的失活RT基因位于Iowa長HCMV啟動子+外顯子1的下游的兔β-球蛋白多腺苷酸化信號的上游之間獲得的。
p73i-Tgrn編碼的多蛋白中的基因順序通過PCR重排以產(chǎn)生p73I-Tngr(圖16)。密碼子優(yōu)化的p17/p24和RT產(chǎn)生單一產(chǎn)物，并經(jīng)PCR接合到擴增的trNef上。該產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化、NotI/BamHI消化并連接到NotI/BamHI酶切的p7313ie中。
引物P17/p24-RT 3’PCRSp17p24opt(有義)ATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG[SEQ ID NO35]RT3 11(反義)GAATTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAGCTTGTCGACCTGCTCGTTGCCGC[SEQ ID NO36]TrNef 5′PCRS-Nef(NotI)CATTAGAGCGGCCGCGATGGTGGGTTTTCCAC[SEQ ID NO37]AS-Nef-p17p24CAGTACCGAAGCTCGGGCACCCATGCAGTTCTTGAACTACTCCGG[SEQ ID NO38]用VENT DNA聚合酶(NEB)的對于各個產(chǎn)物和連接的PCR條件如下1×[94℃(30秒)]25×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(180秒[p17p24+RT]或60秒[trNef]或210秒[連接])]1×[72℃(240秒)]3000bp的產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化，并用NotI和BamHI酶切，經(jīng)PCR凈化后，連接到NotI/BamHI消化的、凝膠純化的p7313ie中以產(chǎn)生p73i-Tngr。
實施例16質(zhì)粒p73I-Trgn(#6)
感興趣的基因來自HIV-1分化體B菌株HXB2密碼子優(yōu)化的失活RT、密碼子優(yōu)化的gagp17/p24部分和截短的Nef基因位于Iowa長HCMV啟動子+外顯子1的下游和兔β-球蛋白多腺苷酸化信號的上游之間。
構(gòu)建體內(nèi)基因的順序通過PCR分別擴增來自質(zhì)粒p73I-GN2和p73I-RTw229k的p17p24-trNef和RTw229k達到。進行PCT連接反應(yīng)，其產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化并用NotI/BamHI酶切，然后與NotI/BamHI消化的p7313ie進行連接。序列測定揭示p17p24沒有被完全優(yōu)化，故用AgeI/MunI從編碼區(qū)切去700bp的片段，被而用來自含有正確編碼序列的p73i-Tgrn#3的MunI/Age片段進行取代。(見圖17)引物p17p24-trNefPCRS-p17p24optATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG[SEQ ID NO39]AstrNef(BamHI)RTw229kRT3-U1GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT[SEQ ID NO40]AS-coRT-p17p24opt接頭CAGTACCGAAGCTCGGGCACCCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC[SEQ ID NO41]用VENT DNA聚合酶(NEB)的對于各個產(chǎn)物和連接的PCR條件如下1×[94℃(30秒)]25×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(120秒(PCR)或180秒(連接)]
1×[72℃(240秒)]PCR接合產(chǎn)生的3000bp產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化，并用NotI和BamHI酶切，經(jīng)PCR凈化后，連接到NotI/BamHI消化的、凝膠純化的p7313ie中以產(chǎn)生p73i-Tngr。序列分析顯示從p73I-GN2獲得的p17p24序列密碼子沒有完全被優(yōu)化，這被攜帶到新的質(zhì)粒中。從MunI和AgeI酶切的p73i-Tngr中切掉700bp的片段，用來自p73i-Tgrn的700bp的MunI/AgeI消化產(chǎn)物進行連接而取代它，產(chǎn)生構(gòu)建體p73I-Tngr#6。
實施例17質(zhì)粒p73i-Trng(#11)感興趣的基因Iowa長度HCMV啟動子+外顯子1下游，以及兔β-球蛋白多腺苷酸化信號上游的、從HIV-1分化體B菌株HXB2獲得的密碼子優(yōu)化的失活RT、截短的Nef和密碼子優(yōu)化的gag基因的p17/p24部分。
構(gòu)建體內(nèi)基因的順序通過PCR擴增來自p73i-Tgrn的RT-trNef和p17p24基因而獲得。進行兩個DNA片段的PCT連接反應(yīng)，其3kb的產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化，并用NotI/BamHI酶切，然后與NotI/BamHI消化的p7313ie進行連接，產(chǎn)生p73I Trng(#11)引物RTw229k-trNefRT3-u1GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT[SEQ ID NO42]AS-Nef-p17p24opt接頭CAGTACCGAAGCTCGGGCACCCATGCAGTTCTTGAACTACTCCGG[SEQ ID NO43]p17p24S-p17p24opt
ATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG[SEQ ID NO44]AS-p17p24opt(BamHI)GATGGGGGATCCTCACAACACTCTGGCTTTGTGTCC[SEQ ID NO45]用VENT DNA聚合酶(NEB)的對于各個產(chǎn)物和連接的PCR條件如下1×[94℃(30秒)]25×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(120秒(基因的PCR)或180秒(連接)]1×[72℃(240秒)]PCR接合產(chǎn)生的3000bp產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化，用NotI和BamHI酶切，經(jīng)PCR凈化后，連接到NotI/BamHI消化的、凝膠純化的p7313ie中，以產(chǎn)生p73i-Tngr。
實施例18p73i-Tgnr(#f1)感興趣的基因Iowa長度HCMV啟動子+外顯子1下游以及兔β-球蛋白多腺苷酸化信號上游的、從HIV-1分化體B菌株HXB2獲得的密碼子優(yōu)化的gag的p17/p24部分、截短的Nef和密碼子優(yōu)化的失活RT基因。
構(gòu)建體內(nèi)基因的順序通過PCR分別擴增來自質(zhì)粒p73I-GN2和p73I-RTw229k的p17p24-trNef和RTw229k來獲得。其對PCR產(chǎn)物進行PCT連接反應(yīng)，經(jīng)凝膠純化，并用NotI/BamHI酶切后，與NotI/BamHI消化的p7313ie進行連接。在序列(p17p24和RT)中發(fā)現(xiàn)兩個序列錯誤，隨后這種錯誤通過利用多蛋白中的限制性位點用正確的基因部分進行取代而得到修復(fù)。(見圖19)引物p17p24-trNefPCRS-p17p24opt
ATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG[SEQ ID NO46]AS-Nef-coRT接頭GATGGGACTGATGGGGCCCATGCAGTTCTTGAACTACTCCGG[SEQ ID NO47]RTw229kS-coRTATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAG[SEQ ID NO48]RT3-11GAATTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAGCTTGTCGACCTGCTCGTTGCCGC[SEQ ID NO49]用VENT DNA聚合酶(NEB)的對于各個產(chǎn)物和連接的PCR條件如下1×[94℃(30秒)]25×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(120秒(PCR)或180秒(連接)]1×[72℃(240秒)]3000bp的產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化，用NotI和BamHI酶切，經(jīng)PCR凈化后，連接到NotI/BamHI消化的、凝膠純化的p7313ie中，以產(chǎn)生p73i-Tngr。序列測定揭示p17p24的密碼子不是完全優(yōu)化的，進而用AgeI/MunI將編碼區(qū)中的一個700bp的片段切掉，并用來自含有正確編碼序列的p73i-Tgrn#3的MunI/Age片段取代。該多蛋白還含有一個點突變(G2609A)，導致多蛋白的RT部分中產(chǎn)生Thr改變成Ala的氨基酸取代。該突變通過ApaI/BamHI消化構(gòu)建體并經(jīng)PCR凈化而除去突變的序列，并用來自p73i-Tgnr的RT的ApaI/BamHI消化部分連接而取代該序列而得到校正。
實施例19制備用于“基因槍”DNA藥筒(cartridges)的質(zhì)粒包被“金漿液”
質(zhì)粒DNA(大約1μg/μl)，例如100μg，和2μm的金顆粒，例如50mg(PowderJect)，懸浮于例如100μl的0.05M的亞精胺中(Sigma)。通過加入例如100μl 1M的CaCl2(American PharmaceuticalPartners，Inc.，USA)使DNA沉淀到金顆粒上。該DNA/金顆粒復(fù)合物在室溫下保持10分鐘，用無水乙醇洗滌3次，例如3×1ml，(事先在分子篩3A(BDH)上干燥)。樣品重懸浮于含有0.05mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Sigma)的無水乙醇中，并將其分成三等份于1.5ml的顯微離心管中(Eppendorf)。該等分試樣分別用于(a)“金漿液”的分析，(b)洗出液-從(a)洗提出的質(zhì)粒的分析和(c)制備用于“基因槍”的包被乙烯-四氟乙烯共聚物(Tefzel)藥筒的金顆粒/質(zhì)粒(見下文的實施例3)。為了制備樣品(a)和(b)，含有質(zhì)粒DNA/乙醇中的“金漿液”/PVP的離心管在Eppendorf 5418顯微離心機中高速旋轉(zhuǎn)2分鐘，除去上清液，“金漿液”在室溫下干燥10分鐘。樣品(a)在TE pH8.0中重懸浮到質(zhì)粒DNA為0.5-1.0μg/μl，假定大約50％被包被。對于洗出液，樣品(b)在TE pH8.0中重懸浮到質(zhì)粒DNA為0.5-1.0μg/μl，并在37℃溫育30分鐘，激烈搖動，然后在Eppendorf 5418顯微離心機中高速旋轉(zhuǎn)2分鐘，其上清液、洗出液被除去后，儲藏在-20℃。洗提的精確DNA濃度用GenequantII(Pharmacia Biotech)通過分光光度法定量測定。
實施例20用于DNA免疫的藥筒的制備如以前所描述的制備用于Accell基因轉(zhuǎn)移裝置的藥筒(Eisenbraun等，DNA和細胞生物學(DNA and Cell Biology)，1993 vol 12 No 9，791-797頁；Pertner等)。簡而言之，質(zhì)粒DNA被包被到2μm的金顆粒上(DeGussa Corp.，South Plainfield，N.J.，USA)并裝載到Tefzel管中，該管隨后被切成1.27cm長以用做藥筒，并在4℃下干燥儲存直至使用。在典型的疫苗接種中，各個藥筒含有0.5mg被包被的金顆粒，總量為0.5μg DNA/藥筒。
實施例21
利用基因槍進行DNA疫苗接種后對HIV抗原的免疫反應(yīng)用位于兩個載體中的核酸所編碼的抗原接種小鼠(n＝3/組)。P7077利用包含內(nèi)含子A和外顯子I的HCMV IE啟動子(fcmv啟動子)。P73I產(chǎn)生相同的抗原，但包含的是缺乏內(nèi)含子A而包括外顯子1的HCMV IE啟動子(icmv啟動子)。
質(zhì)粒被給予到F1(C3H×Balb/c)小鼠的腹部皮膚切開的靶位點。在第0天，對小鼠以2×0.5μg DNA進行最初免疫，在第35天用2×0.5μg DNA進行加強免疫，在第40天時用IFN-γ Elispot檢測細胞反應(yīng)。
·P73I -空載體·P7077 -空載體·P7077 GRN -(fCMV啟動子)Gag，RT，Nef·P73I GRN -(iCMV啟動子)Gag，RT，Nef·P73I GR3N-(CMV啟動子)優(yōu)化的Gag，優(yōu)化的RT，Nef·P7077 GN -(fCMV啟動子)Gag，Nef·P73I GN -(iCMV啟動子)Gag，Nef細胞毒素T細胞反應(yīng)細胞毒素T細胞反應(yīng)通過對5天后收集的脾細胞用CD8+T細胞-限制性IFN-γELISPOT進行分析來評估。經(jīng)頸部離位殺死小鼠，將脾收集到冰冷的PBS中。將梳理出脾細胞放入磷酸緩沖鹽溶液中(PBS)，隨后溶解紅血細胞(在含有155mM NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM EDTA的緩沖液中1分鐘)。用PBS洗滌兩次除去顆粒物質(zhì)后，單個細胞懸浮液按等分放入事先用俘獲的IFN-γ抗體包被的ELISPOT平板中，并用CD8-限制性同源肽(Gag、Nef或RT)刺激。過夜培養(yǎng)后，加入抗-小鼠IFN-γ-生物素標記抗體(Pharmingen)繼而加入鏈霉抗生物素-偶聯(lián)的堿性磷酸酶即可觀察到產(chǎn)生IFN-γ的細胞，用圖象分析進行定量測定。
該實驗結(jié)果顯示于圖20、21和22中。
實施例22疫苗構(gòu)建體的免疫原性1.細胞實驗細胞免疫反應(yīng)包括細胞毒素CD8細胞和輔助CD4細胞。檢測特異性CD8和CD4細胞的靈敏方法是ELIspot分析，它可用于定量測定能夠分泌干擾素-γ或IL-2的細胞。ELIspot分析基于俘獲的從各個細胞分泌的細胞因子。簡而言之，特化的微量滴定板用抗-細胞因子抗體包被。從免疫動物分離的脾細胞與含有已知表位(CD8)或蛋白(CD4)的特異性肽一起培養(yǎng)過夜。如果細胞經(jīng)刺激釋放細胞因子，它們將在滴定板表面上各個產(chǎn)生細胞的位置周圍與抗體結(jié)合。在細胞被溶解和洗滌平板后，細胞因子仍然保持與包被抗體結(jié)合。該分析利用生物素/抗生物素蛋白擴增系統(tǒng)、以與ELISA分析相似的方式進行。斑點的數(shù)量與細胞因子產(chǎn)生細胞的數(shù)量相等。
對6個構(gòu)建體均記錄了可對如下K2d-限制性小鼠表位Gag(AMQMLKETI)、Nef(MTYKAAVDL)和RT(YYDPSKDLI)發(fā)生反應(yīng)的CD8細胞數(shù)量，以及可對Gag和RT蛋白發(fā)生反應(yīng)的CD4細胞數(shù)量。這些實驗的結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學分析，且根據(jù)構(gòu)建體的免疫原性進行分級。結(jié)果顯示于圖23中。
2.體液實驗從兩個實驗中進行加強免疫后7和14天，收集血液樣品用于抗體分析。分離血清并冰凍儲存直到可以用特異性ELISA分析測定抗體的滴定度。檢測了所有樣品對Gag、Nef和RT的抗體。簡而言之，ELISA平板用相關(guān)蛋白包被。洗去多余的蛋白質(zhì)后，將稀釋的血清樣品加入到加樣孔中進行培育。洗去血清樣品，加入與適當?shù)膖ag偶聯(lián)的抗小鼠抗血清。培養(yǎng)平板并在平板讀出器上讀取數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示于圖24中。
3.抗體數(shù)據(jù)在四個實驗中測定了所有六個構(gòu)建體的抗體滴定度。構(gòu)建體p73i-GNR始終對Gag不產(chǎn)生抗體反應(yīng)，對Nef產(chǎn)生有限的抗體反應(yīng)。其原因不清楚，由于分離自同一小鼠的脾細胞中觀察到T-細胞反應(yīng)，表明Gag蛋白是體內(nèi)表達的。
產(chǎn)生Gag特異性抗體的等級如下RNG＞GRN＞NRG＞RGN＞NGR＞GNR分析細胞免疫數(shù)據(jù)該目的是在3個免疫學實驗中根據(jù)點記數(shù)資料對6個構(gòu)建體進行分級。按下述三類反應(yīng)進行評估在第7天(初次免疫始后7天)CD8對Gag、Nef和RT發(fā)生反應(yīng)，第35天(加強免疫后7天)CD4對Gag和RT發(fā)生反應(yīng)，第35天(加強免疫后7天)CD8對Gag、Nef和RT發(fā)生反應(yīng)。
每個反應(yīng)(例如CD8對Gag的反應(yīng))使用SAS第8版中的線性混合效果模型進行模擬。不管具體的抗原(Gag、Nef或RT)存在與否，也不管IL-2存在與否，該模型包括構(gòu)建體的固定效果。另外，對于CD8的反應(yīng)，其數(shù)據(jù)可從各個小鼠獲得，受檢者作為隨機效果被包含于模型中。所述模型包括相互作用以考慮到構(gòu)建體在抗原(存在/缺乏)和IL-2(存在/缺乏)之間的各個組合中的不同效果。
通過模型，在抗原(存在/缺乏)和IL-2(存在/缺乏)的各個組合中，分別評估了各個構(gòu)建體和p7313(對照組)之間的校正平均反應(yīng)的差異，及p值以顯示差異是否具有統(tǒng)計顯著性。基于抗原存在而IL-2缺乏時的差異和p值，對構(gòu)建體進行分極，即具有最大差異的構(gòu)建體的值為6，其次為5等，但是對于其差異在5％的水平上差異不顯著的任何構(gòu)建體均為0。
模型假定——殘差隨常數(shù)方差正態(tài)分布，使用圖解方法和靈敏度分析進行評估，其中首先對反應(yīng)取對數(shù)，接著取平方根而將反應(yīng)轉(zhuǎn)換模型值。構(gòu)建體的等級對與模型假定的背離不敏感。
分別計算了各個實驗中的各個反應(yīng)的等級，對于所有3個實驗中計算了3類反應(yīng)的等級之和。下表顯示了3個實驗總的等級之和。
結(jié)合3個免疫學實驗，3類反應(yīng)中各個反應(yīng)的構(gòu)建體的等級之和。
在第35天時，對于兩類反應(yīng)而言RNG具有最高的等級。而第二高的等級是第7天的RGN。在第35天，對于兩組反應(yīng)而言RGN也都顯示了比較高的等級。
權(quán)利要求
1.一種核苷酸序列，編碼HIV-1 gag蛋白或其含有g(shù)ag表位的片段，以及第二HIV抗原，或編碼所述第二HIV抗原的表位的片段，并與異源啟動子可操作地連接。
2.如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其中所述第二抗原選自Nef或其含有nef表位的其片段，或反轉(zhuǎn)錄酶(RT)或其含有RT表位的片段。
3.如權(quán)利要求1或2所述的核苷酸序列，其中所述gag蛋白包含p17。
4.如權(quán)利要求3所述的核苷酸序列，其中所述gag蛋白還包含p24。
5.如權(quán)利要求1-4中任何一項所述的核苷酸序列，其中對所述gag序列進行密碼子優(yōu)化以與高度表達的人類基因中的密碼子利用率相似。
6.如權(quán)利要求1-5中任何一項所述的核苷酸序列，其中所述序列編碼HIV-1 gag蛋白或含有g(shù)ag表位的片段、nef蛋白或含有nef表位的片段、以及RT蛋白或含有RT表位的片段，優(yōu)選順序為RT、Gag、Nef或RT、Nef、Gag。
7.如權(quán)利要求2-6中任何一項所述的核苷酸序列，其中對所述RT序列或其片段進行密碼子優(yōu)化以與高度表達的人類基因相似。
8.如權(quán)利要求1-7中任何一項所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼nef蛋白或其表位。
9.一種核苷酸序列，選自·Gag(p17，p24)，Nef截短物·Gag(p17，p24)(密碼子優(yōu)化的)，Nef(截短物)·Gag(p17，p24)，RT、Nef(截短物)·密碼子優(yōu)化的Gag(p17，p24)，RT，Nef(截短物)·密碼子優(yōu)化的Gag(p17，p24)，密碼子優(yōu)化的RT，Nef截短物·RT(密碼子優(yōu)化的)，密碼子優(yōu)化的Gag(p17，p24)，Nef截短物·RT(密碼子優(yōu)化的)，Nef截短物，gag p17，密碼子優(yōu)化的p24。
10.如權(quán)利要求1-9中任何一項所述的核苷酸序列，其中所述異源啟動子是HCMV IE基因的啟動子。
11.如權(quán)利要求10所述的核苷酸序列，其中所述啟動子的5’端含有外顯子1。
12.一種含有如權(quán)利要求1-11中任何一項所述的核苷酸序列的載體。
13.一種如權(quán)利要求12所述的載體，其中所述載體是雙鏈DNA質(zhì)粒。
14.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物含有如權(quán)利要求1-11中所述的核苷酸序列或權(quán)利要求12或13中所述的載體以及藥用的賦形劑、稀釋劑、載體或佐劑。
15.如權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物適合于肌肉內(nèi)或皮內(nèi)給藥。
16.如權(quán)利要求14或15所述的藥物組合物，其中所述載體是金小珠。
17.一種皮內(nèi)給藥裝置，其中含有權(quán)利要求14、15或16所述的藥物組合物。
18.一種治療患病或易感疾病的患者的方法，包括給予安全和有效量的如權(quán)利要求14-16中任何一項所述的藥物組合物。
19.如權(quán)利要求1-11中任何一項所述的核苷酸序列、如權(quán)利要求12或13所述的載體、或如權(quán)利要求14-16中任何一項所述的組合物在藥物中的用途。
20.權(quán)利要求1-11中任何一項所述的核苷酸序列在生產(chǎn)治療疾病的藥物中的應(yīng)用。
21.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求1-11中任何一項所述的核苷酸的方法，包括將編碼HIV-1 gag蛋白或其片段以及第二HIV蛋白或其片段的核苷酸序列與異源啟動子序列可操作地連接。
全文摘要
本發(fā)明提供的核苷酸序列，編碼了HIV－1 gag蛋白或其含有g(shù)ag表位的片段以及第二HIV抗原，或編碼所述第二HIV抗原表位的片段，并與異源啟動子可操作地連接。優(yōu)選的核苷酸序列進一步編碼nef或其片段和RT或其片段。
文檔編號A61K39/39GK1606624SQ02823087
公開日2005年4月13日 申請日期2002年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月20日
發(fā)明者A·貝頓, P·F·埃爾特爾, G·W·古, A·利爾, J·P·蒂特, C·A·范維利 申請人:葛蘭素集團有限公司