專利名稱：細胞增殖的有機小分子調節(jié)劑的制作方法
相關申請本申請是于2001年3月1日申請的PCT申請US01/10296的部分連續(xù)申請，并且是于2001年9月26日申請的美國專利申請?zhí)?9/964276的部分連續(xù)申請，后者是于2000年11月28日申請的美國專利申請?zhí)?9/724,492的部分連續(xù)申請，而且基于2000年3月30日申請的美國臨時申請?zhí)?0/193,279，所述文獻的說明書內(nèi)容通過引用全部結合到本文中。
背景技術：
圖式形成是胚胎細胞形成分化組織的有序空間排列的活動。高等生物的機體復雜性通過細胞內(nèi)在譜系和細胞外在信號的相互作用在胚胎發(fā)生期間產(chǎn)生。從機體計劃的最早建立，到器官系統(tǒng)的圖式發(fā)育，到組織分化期間各種細胞類型的產(chǎn)生，誘導相互作用對脊椎動物發(fā)育中的胚胎圖式發(fā)育是必不可少的(Davidson，E.，(1990)Development108365-389；Gurdon，J.B.，(1992)Cell68185-199；Jessell，T.M.等，(1992)Cell68257-270)。發(fā)育細胞相互作用的影響是可變的。通常，由于誘導與未誘導狀態(tài)和誘導狀態(tài)的效應細胞不同的細胞，所述效應細胞從細胞分化的一種途徑轉向另一種途徑(誘導)。有時，細胞誘導其相鄰細胞同其本身一起分化(自體誘導)；在其它情況下，細胞抑制其相鄰細胞同其本身一起分化。早期發(fā)育中的細胞相互作用可能是序貫的，致使兩種細胞類型之間的原始誘導導致多樣性的漸進放大。此外，誘導相互作用不僅發(fā)生在胚胎，而且也發(fā)生在成體細胞中，并且可起到建立并保持形態(tài)發(fā)生圖式以及誘導分化的作用(J.B.Gurdon(1992)Cell68185-199)。
信號分子的Hedgehog家族成員在無脊椎動物和脊椎動物發(fā)育期間介導許多重要的近程和遠程圖式發(fā)育過程。在蠅中，一種hedgehog基因調節(jié)體節(jié)和成蟲盤的圖式發(fā)育。相反，在脊椎動物中，hedgehog基因家族參與控制左右不對稱、CNS中的極性、體節(jié)和肢體、器官發(fā)生、軟骨發(fā)生和精子發(fā)生。
通過遺傳篩選，在果蠅即黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中鑒定出第一個hedgehog基因(Nüsslein-Volhard，C.和Wieschaus，E.(1980)Nature287，795-801)。該篩選鑒定出許多影響胚胎發(fā)育和幼體發(fā)育的突變。在1992年和1993年，果蠅hedgehog(hh)基因的分子性質已有報道(C.F，Lee等(1992)Cell71，33-50)，此后，已從各種脊椎動物中分離出數(shù)種hedgehog同源物。盡管在果蠅屬(Drosophila)和其它無脊椎動物中只發(fā)現(xiàn)了一種hedgehog基因，但是在脊椎動物中卻存在多種Hedgehog基因。
脊椎動物hedgehog基因家族包括至少4個成員，例如單個果蠅hedgehog基因的共生同源物。示例性的hedgehog基因和蛋白描述于PCT公布號WO 95/18856和WO 96/17924中。這些成員中的3個成員，在本文稱為Desert hedgehog(Dhh)、Sonic hedgehog(Shh)和Indianhedgehog(Ihh)，顯然存在于所有脊椎動物中，包括魚、鳥類和哺乳動物。第4個成員，在本文稱為tiggie-winke hedgehog(Thh)，似乎是魚特有的。Desert hedgehog(Dhh)在小鼠胚胎發(fā)育和成年嚙齒動物和人類中主要在睪丸中表達；Indian hedgehog(Ihh)在胚胎發(fā)生期間參與骨發(fā)育，而在成體中參與骨形成；而如上所述的Shh主要參與形態(tài)發(fā)生和神經(jīng)誘導活動。已知hedgehog多肽在脊椎動物器官的發(fā)育和保持中的決定性誘導作用，因此在臨床和研究方面，對hedgehog相互作用蛋白的鑒定具有最重要的意義。
各種Hedgehog蛋白由一個信號肽、一個高度保守的N-末端區(qū)和一個更多樣化的C-末端結構域組成。除在分泌途徑中的信號序列切割外(Lee，J.J.等(1992)Cell7133-50；Tabata，T.等(1992)Genes Dev.2635-2645；Chang，D.E.等(1994)Development1203339-3353)，Hedgehog前體蛋白還經(jīng)歷了依賴于C-末端部分中保守序列的內(nèi)部自我蛋白酶解(Lee等(1994)Science2661528-1537；Porter等(1995)Nature374363-366)。該自我切割產(chǎn)生一種19 kD N-末端肽和一種26-28 kD C-末端肽(Lee等(1992)，參見上文；Tabata等(1992)，參見上文；Chang等(1994)，參見上文；Lee等(1994)，參見上文；Bumcrot，D.A.等(1995)Mol.Cell.Biol.152294-2303；Porter等(1995)，參見上文；Ekker，S.C.等(1995)Curr.Biol.5944-955；Lai，C.J.等(1995)Development1212349-2360)。所述N-末端肽與合成所述肽的細胞表面保持緊密結合，而所述C-末端肽在體外和體內(nèi)均可自由擴散(Porter等(1995)Nature374363；Lee等(1994)，參見上文；Bumcrot等(1995)，參見上文；Mart′，E.等(1995)Development1212537-2547；Roelink，H.等(1995)Cell81445-455)。有趣的是，所述N-末端肽在細胞表面的保留依賴于自我切割，因為由RNA編碼的、在內(nèi)部切割的正常位置上準確終止的截短形式的HH在體外(Porter等(1995)，參見上文)和在體內(nèi)(Porter，J.A.等(1996)Cell86，21-34)均是可擴散的。生物化學研究已經(jīng)表明，HH前體蛋白的自我蛋白酶解通過隨后在親核取代中被切下的內(nèi)部硫酯中間體來進行?？赡芩鲇H核體是一種最終共價結合到所述N-肽的C-末端的親脂性小分子(Porter等(1996)，參見上文)，從而使其粘附于細胞表面。該生物學意義是深遠的。由于所述粘連，在產(chǎn)生Hedgehog的細胞表面產(chǎn)生了局部高濃度的N-末端Hedgehog肽。就是所述N-末端肽對果蠅屬和脊椎動物中的近程和遠程Hedgehog信號活性而言既是必要的又是充分的(Porter等(1995)，參見上文；Ekker等(1995)，參見上文；Lai等(1995)，參見上文；Roelink，H.等(1995)Cell81445-455；Porter等(1996)，參見上文；Fietz，M.J.等(1995)Curr.Biol.5643-651；Fan，C.-M等(1995)Cell81457-465；Mart′，E.等(1995)Nature375322-325；Lopez-Martinez等(1995)Curr.Biol5791-795；Ekker，S.C.等(1995)Development1212337-2347；Forbes，A.J.等(1996)Development1221125-1135)。
在果蠅發(fā)育期間，在不同的位點上，HH都影響近程和遠程圖式發(fā)育過程。在早期胚胎的體節(jié)極性的確立中，它具有似乎被直接介導的近程作用，而在成蟲盤的圖式發(fā)育中，它通過誘導次級信號而誘導遠程作用。
在脊椎動物中，幾種hedgehog基因已在最近幾年被克隆出來。在這些基因中，Shh研究得最為深入細致，由于它在使相鄰組織發(fā)生圖式發(fā)育的信號源的不同組構中心中表達。最新的證據(jù)表明，Shh參與這些相互作用。
Shh的表達在預定中線中胚層即小鼠(Chang等(1994)，參見上文；Echelard，Y.等(1993)Cell751417-1430)、大鼠(Roelink，H.等(1994)Cell76761-775)和雞(Riddle，R.D.等(1993)Cell751401-1416)中的結節(jié)以及在蓑鲉(zebrafish)的鱗(Ekker等(1995)，參見上文；Krauss，S.等(1993)Cell751431-1444)中原腸胚形成開始后立即起動。在雞胚中，Shh在結節(jié)中的表達圖式產(chǎn)生左右不對稱，這似乎是心臟左右排列的原因(Levin，M.等(1995)Cell82803-814)。
在CNS中，來自脊索和底板的Shh似乎誘導腹部細胞的命運。當異位表達時，Shh導致以下動物的大面積中腦和后腦腹面發(fā)育小鼠(Echelard等(1993)，參見上文；Goodrich，L.V.等(1996)Genes Dev.10301-312)、非洲爪蟾屬(Xenopus)(Roelink，H.等(1994)，參見上文；Ruizi Altaba，A.等(1995)Mol.Cell.Neurosci.6106-121)和蓑鲉(Ekker等(1995)，參見上文；Krauss等(1993)，參見上文；Hammerschmidt，M.等(1996)Genes Dev.10647-658)。在脊髓水平上的中間神經(jīng)外胚層的外植塊中，Shh蛋白誘導底板和運動神經(jīng)元發(fā)育的濃度閾各不相同，底板濃度高，而運動神經(jīng)元濃度較低(Roelink等(1995)，參見上文；Mart′等(1995)，參見上文；Tanabe，Y.等(1 995)Curr.Biol.5651-658)。此外，抗體阻斷提示，由脊索產(chǎn)生的Shh對于運動神經(jīng)元命運的脊索介導的誘導是必需的(Mart′等(1995)，參見上文)。因此，產(chǎn)生Shh的中線細胞表面高濃度的Shh似乎導致在體外觀察到的底板的接觸介導誘導(Placzek，M.等(1993)Development117205-218)，以及在體內(nèi)觀察到的緊接脊索上的底板的中線定位。從脊索釋放的Shh濃度越低，在已顯示在體外接觸依賴性的過程中，底板推測誘導在更遠腹側區(qū)的運動神經(jīng)元(Yamada，T.等(1993)Cell73673-686)。在取自中腦和前腦水平上的外植塊中，Shh也誘導合適的腹側神經(jīng)元細胞類型，分別為多巴胺能前體(Heynes，M.等(1995)Neuron1535-44；Wang，M.Z.等(1995)Nature Med.l1184-1188)和膽堿能前體(Ericson，J.等(1995)Cell81747-756)，表明Shh是全長CNS內(nèi)腹部特化的共同誘導物。這些觀察結果提出了這樣的問題對Shh的差異應答是如何在特定前后位置上受到調節(jié)的。
來自中線的Shh也使脊椎動物胚胎的近軸區(qū)、軀干的體節(jié)(Fan等(1995)，參見上文)和體節(jié)的頭部間充質喙(Hammerschmidt等(1996)，參見上文)發(fā)生圖式發(fā)育。在雞和小鼠的軸旁中胚層外植塊中，Shh以生皮肌節(jié)標記Pax3的不表達為代價來促進生骨節(jié)特異性標記如Pax1和Twist的表達。此外，濾器屏障實驗提示，Shh直接介導生骨節(jié)的誘導，而不是通過激活第二信號機制來介導(Fan，C.-M.和Tessier-Lavigne，M.(1994)Cell79，1175-1186)。
Shh也誘導生肌節(jié)基因表達(Hammerschmidt等(1996)，參見上文；Johnson，R.L.等(1994)Cell791165-1173；Münsterberg，A.E.等(1995)Genes Dev.92911-2922；Weinberg，E.S等(1996)Development122271-280)，盡管最近的實驗表明，還需要WNT家族成員即無翅果蠅(Drosophila wingless)的脊椎動物同源物的協(xié)作(Münsterberg等(1995)，參見上文)。令人不解的是，雞中的生肌節(jié)誘導需要的Shh濃度要比誘導生骨節(jié)標記的高(Münsterberg等(1995)，參見上文)，盡管生骨節(jié)起源于距脊索近得多定位的體節(jié)細胞。在蓑鲉中獲得了相似的結果，其中高濃度的Hedgehog誘導生肌節(jié)標記基因表達，并且阻抑生骨節(jié)標記基因表達(Hammerschmidt等(1996)，參見上文)。然而，與羊膜動物相反，這些觀察結果與魚胚胎的構造相一致，在此，生肌節(jié)是體節(jié)的主要和更多的軸向成分。因此，對Shh信號的調節(jié)以及新信號因子的獲得可能改變了脊椎動物進化過程中的體節(jié)結構。
在脊椎動物肢芽中，后間充質細胞的亞組即“Zone of polarizingactivity(極化活性區(qū))”(ZPA)調節(jié)前后指趾的身份(綜述參見Honig，L.S.(1981)Nature29172-73)。Shh的異位表達或Shh肽中浸泡的微珠的應用模擬前ZPA移植物的作用，產(chǎn)生了指趾的鏡像重迭(Chang等(1994)，參見上文；Lopez-Martinez等(1995)，參見上文；Riddle等(1993)，參見上文)(圖2g)。因此，指趾身份似乎主要取決于Shh濃度，盡管有可能其它信號可以在似乎是AP圖式發(fā)育所需要的相當長的距離內(nèi)(100-150μm)分程傳遞該信息。與果蠅成蟲盤中HH和DPP的相互作用類似，脊椎動物肢芽中的Shh激活Bmp2即dpp同源物的表達(Francis，P.H.等(1994)Development120209-218)。然而，與果蠅中的DPP不同，Bmp2不能模擬Shh在雞肢芽中的異位應用上的極化作用(Francis等(1994)，參見上文)。除前后圖式發(fā)育之外，Shh似乎也通過誘導后頂端外胚嵴中成纖維細胞生長因子FGF4的合成而參與肢體的遠近生長暈的調節(jié)(Laufer，E.等(1994)Cell79993-1003；Niswander，L.等(1994)Nature371609-612)。
Hedgehog蛋白和BMP之間的密切關系可能在脊椎動物Hedgehog表達的許多位點上是保守的，但可能不是在其所有位點上都是保守的。例如，在雞后腸中，已經(jīng)表明Shh誘導Bmp4即另一種脊椎動物dpp同源物的表達(Roberts，D.J.等(1995)Development1213163-3174)。此外，Shh和Bmp2、4或6顯示其在胃、泌尿生殖系統(tǒng)、肺、牙蕾和毛囊的上皮細胞和間充質細胞中的表達方面的意外關系(Bitgood，M.J.和McMahon，A.P.(1995)Dev.Biol.172126-138)。此外，Ihh即兩種其它小鼠Hedgehog基因之一在腸和正在發(fā)育的軟骨中的Bmp表達細胞附近表達(Bitgood和McMahon(1995)，參見上文)。
最新的證據(jù)提出了一種其中Ihh在調節(jié)軟骨發(fā)生發(fā)育中起關鍵性作用的模型(Roberts等(1995)，參見上文)。在軟骨形成中，軟骨細胞從增殖狀態(tài)通過中間體變成肥大前狀態(tài)，再變成分化的肥大軟骨細胞。Ihh在肥大前軟骨細胞中表達并且起動導致軟骨細胞分化被阻斷的信號級聯(lián)。其直接靶是Ihh表達結構域周圍的軟骨膜，后者通過Gli和Patched(ptc)(Hedgehog信號的保守轉錄靶)的表達而應答(參見下文)。最有可能的是，這產(chǎn)生導致在關節(jié)周軟骨膜中合成甲狀旁腺激素相關蛋白(PTHrP)的第二信號。PTHrP本身再發(fā)信號至肥大前軟骨細胞，阻斷其進一步分化。同時，PTHrP抑制Ihh的表達，從而形成調節(jié)軟骨細胞分化速率的負反饋環(huán)。
Patched最初在果蠅中被鑒定為一種體節(jié)極性基因，即一組影響不同體節(jié)內(nèi)沿胚胎的前后軸以同源系列發(fā)生的細胞分化的發(fā)育基因之一。參見Hooper，J.E.等(1989)Cell59751；和Nakano，Y.等(1989)Nature341508。patched的脊椎動物同源物表達圖式提示其參與神經(jīng)管、骨胳、肢體、顱面結構和皮膚的發(fā)育。
遺傳學和功能研究證明，patched是hedgehog信號級聯(lián)即進化上保守的、調節(jié)許多下游基因表達的途徑的一部分。參見Perrimon，N.(1995)Cell80517；和Perrimon，N.(1996)Cell86513。Patched參與所述靶基因的組成型轉錄抑制；其作用與由hedgehog或脊椎動物同源物編碼的、誘導轉錄激活的分泌型糖蛋白的相反。處于該途徑控制之下的基因包括Wnt和TGF-β家族的成員。
Patched蛋白具有2個大的胞外結構域、12個跨膜區(qū)段和幾個胞質區(qū)段。參見Hooper，參見上文；Nakano，參見上文；Johnson，R.L.等(1996)Science2721668；和Hahn，H.等(1996)Cell85841。patched在hedgehog信號途徑中的生化作用尚不清楚。然而，與hedgehog蛋白的直接相互作用已有報道(Chen，Y.等(1996)Cell87553)，并且patched可能與另一種由smoothened基因編碼的跨膜蛋白一起參與hedgehog受體復合物。參見Perrimon，參見上文；和Chen，參見上文。
patched的人同源物最近被克隆出來并且作圖于染色體9q22.3上。參見Johnson，參見上文；和Hahn，參見上文。該區(qū)已涉及基底細胞痣綜合征(BCNS)，其特征為發(fā)育異常，包括肋骨和顱面改變、手足畸形以及脊柱裂。
BCNS也易發(fā)生多種腫瘤類型，最常見的是在機體多個部位發(fā)生的且似乎在生命的前20年內(nèi)發(fā)生的基底細胞癌(BCC)。然而，BCC最常見的病例與所述綜合征無關并且散發(fā)性發(fā)生在少數(shù)祖籍北歐的中年人或老年人暴曬陽光的部位。
最近在BCNS相關BCC和散發(fā)性BCC中的研究表明，patched兩個等位基因的功能性喪失導致發(fā)生BCC。參見Johnson，參見上文；Hahn，參見上文；和Gailani，M.R.等(1996)Nature Genetics1478。染色體9q22.3的單個等位基因缺失通常發(fā)生在散發(fā)性和遺傳性BCC中。連鎖分析揭示出，在BCNS患者的腫瘤中，缺陷型遺傳性等位基因得到保留，而正常等位基因丟失。
散發(fā)性腫瘤也證明patched兩個功能性等位基因的喪失。在用單鏈構象多態(tài)性篩選測定鑒定出patched突變中的12個腫瘤中，9個具有第二個等位基因的染色體缺失，而其余3個在這兩個等位基因中具有失活突變(Gailani，參見上文)。所述改變在相應的種系DNA中沒有發(fā)生。
大多數(shù)經(jīng)鑒定的突變導致出現(xiàn)提前終止密碼子或移碼。Lench，N.J.等，Hum.Genet.1997 Oct；100(5-6)497-502。然而，有幾個是導致胞外結構域或胞質結構域中氨基酸取代的點突變。這些突變位點可能表明對與胞外蛋白或下游信號途徑的胞質成員相互作用具有功能重要性。
patched參與抑制基因表達以及發(fā)生patched在BCC中的常見等位基因缺失證明了該基因的腫瘤抑制功能。其在調節(jié)已知參與細胞信號和細胞間通訊的基因家族中的作用提供了一種可能的腫瘤抑制機制。
發(fā)明概述本發(fā)明提供可利用的用于調節(jié)細胞分化或增殖的方法和組合物。可用于所述方法和組合物的化合物包括那些由通式(I)表示的化合物 式I其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Ar和Ar′獨立代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和任選被1-2個諸如低級烷基、鏈烯基或鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)，例如與N一起可形成4-8元環(huán)；Cy和Cy′獨立代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括多環(huán)基；且i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等。
在某些實施方案中，Ar和Ar′代表苯環(huán)，例如未取代的苯環(huán)或者被一個或多個包含雜原子(例如O、N和S)的基團取代的苯環(huán)。在某些實施方案中，Ar和Ar′中至少一個代表苯環(huán)。在某些實施方案中，Ar和Ar′至少一個代表雜芳環(huán)，例如吡啶環(huán)、噻唑環(huán)、噻吩環(huán)、嘧啶環(huán)等。在某些實施方案中，Y和Ar′在間位和/或1，3-位與Ar連接。
在某些實施方案中，Y在所有位置上都不存在。在其中某個位置上存在Y的實施方案中，在相鄰的Mi中，如果i＝0將導致存在的兩個Y直接連接，或者存在的一個Y直接與N連接，則在相鄰的Mi中i優(yōu)選代表1-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的芳基或雜芳基。在某些實施方案中，Cy′直接與X連接。在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的雙環(huán)或雜芳環(huán)，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶等。在某些實施方案中，Cy′為單環(huán)芳環(huán)，或者為至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即形成聯(lián)芳體系。在某些實施方案中，Cy′包括兩個取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如相同或不同、直接由一個或多個鍵連接的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如以形成聯(lián)芳環(huán)或雙環(huán)體系。
在某些實施方案中，X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
在某些實施方案中，R代表H或低級烷基，例如H或Me。
在某些實施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，即包括至少一個sp3雜化原子，最好是多個sp3雜化原子。在某些實施方案中，Cy在所述環(huán)中或所述環(huán)的取代基上包含一個氨基，例如Cy為吡啶基、咪唑基、吡咯基、哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基等，和/或帶有一個氨基取代基。在某些實施方案中，Cy為5-7元環(huán)。在某些實施方案中，Cy直接與N連接。在其中Cy為直接與N連接的6元環(huán)并且在所述環(huán)相對于N的4位上帶有一個氨基取代基的實施方案中，所述N和胺取代基可以在所述環(huán)上以反式排列。
在某些實施方案中，Ar或Ar′上的取代基選自鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、疊氮基、磺?；?、亞磺酰基(sulfoxido)、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺?；?、亞磺酰氨基、磷?；?、膦酸酯基、亞膦酸酯基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)P芳基、-(CH2)P芳烷基、-(CH2))POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式，其中p和n每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，可用于本發(fā)明的化合物可以由通式(II)表示 式II其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Ar和Ar′獨立代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和任選被1-2個諸如低級烷基、鏈烯基或鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔，其中在Mj中，M有時或每次出現(xiàn)時都構成完整的環(huán)結構或其一部分；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)，例如與N一起可形成4-8元環(huán)；Cy′代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括多環(huán)基；j每次出現(xiàn)時獨立代表0-10的整數(shù)，最好是2-7的整數(shù)；且i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等。
在某些實施方案中，Ar和Ar′代表苯環(huán)，例如未取代的苯環(huán)或者被一個或多個包含雜原子(例如O、N和S)的基團取代的苯環(huán)。在某些實施方案中，Ar和Ar′中至少一個代表苯環(huán)。在某些實施方案中，Ar和Ar′中至少一個代表雜芳環(huán)，例如吡啶環(huán)、噻唑環(huán)、噻吩環(huán)、嘧啶環(huán)等。在某些實施方案中，Y和Ar′在間位和/或1，3-位與Ar連接。
在某些實施方案中，Y在所有位置上都不存在。在其中某個位置上存在Y的實施方案中，在相鄰的Mi中，如果i＝0將導致存在的兩個Y直接連接，或者存在的一個Y直接與N或NR2連接，則在相鄰的Mi中i優(yōu)選代表1-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的芳基或雜芳基。在某些實施方案中，Cy′直接與X連接。在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的雙環(huán)或雜芳環(huán)，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶等。在某些實施方案中，Cy′為單環(huán)芳環(huán)，或者為至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即形成聯(lián)芳體系。在某些實施方案中，Cy′包括兩個取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如相同或不同、直接由一個或多個鍵連接的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如以形成聯(lián)芳環(huán)或雙環(huán)體系。
在某些實施方案中，X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
在某些實施方案中，R代表H或低級烷基，例如H或Me。
在某些實施方案中，NR2代表分別被一個或兩個低級烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，最好是伯胺或仲胺。
在某些實施方案中，Ar或Ar′上的取代基選自鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、疊氮基、磺?；?、亞磺?；?、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺酰基、亞磺酰氨基、磷?；?、膦酸酯基、亞膦酸酯基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)P芳基、-(CH2)P芳烷基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式，其中p和n每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，可用于本發(fā)明的化合物可以由通式(III)表示 式III
其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Ar和Ar′獨立代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)、-O-、-S-或-Se-；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和任選被1-2個諸如低級烷基、鏈烯基或鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)，例如與N一起可形成4-8元環(huán)；Cy和Cy′獨立代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括多環(huán)基；且i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等。
在某些實施方案中，Ar和Ar′代表苯環(huán)，例如未取代的苯環(huán)或者被一個或多個包含雜原子(例如O、N和S)的基團取代的苯環(huán)。在某些實施方案中，Ar和Ar′中至少一個代表苯環(huán)。在某些實施方案中，Ar和Ar′中至少一個代表雜芳環(huán)，例如吡啶環(huán)、噻唑環(huán)、噻吩環(huán)、嘧啶環(huán)等。在某些實施方案中，Y和Ar′在間位和/或1，3-位與Ar連接。
在某些實施方案中，Y在所有位置上都不存在。在其中某個位置上存在Y的實施方案中，在相鄰的Mi中，如果i＝0將導致存在的兩個Y直接連接，或者存在的一個Y直接與N或NR2連接，則在相鄰的Mi中i優(yōu)選代表1-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的芳基或雜芳基。在某些實施方案中，Cy′直接與X連接。在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的雙環(huán)或雜芳環(huán)，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶等。在某些實施方案中，Cy′為單環(huán)芳環(huán)，或者為至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即形成聯(lián)芳體系。在某些實施方案中，Cy′包括兩個取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如相同或不同、直接由一個或多個鍵連接的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如以形成聯(lián)芳環(huán)或雙環(huán)體系。
在某些實施方案中，X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
在某些實施方案中，R代表H或低級烷基，例如H或Me。
在某些實施方案中，NR2代表分別被一個或兩個低級烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，最好是伯胺或仲胺。
在某些實施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，即包括至少一個sp3雜化原子，最好是多個sp3雜化原子。在某些實施方案中，Cy直接與N連接和/或與NR2連接。在某些實施方案中，Cy為5-7元環(huán)。在其中Cy為直接與N連接的6元環(huán)并且在所述環(huán)相對于N的4位上帶有一個氨基取代基的實施方案中，所述N和胺取代基可以在所述環(huán)上以反式排列。
在某些實施方案中，Ar或Ar′上的取代基選自鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、疊氮基、磺?；?、亞磺?；⒘蛩狨セ?、磺酸酯基、氨磺?；?、亞磺酰氨基、磷?；㈧⑺狨セ?、亞膦酸酯基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)P芳基、-(CH2)P芳烷基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式，其中n和p每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，可用于本發(fā)明主題方法的化合物包括由通式(IV)表示的化合物 式IV其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Cy′代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，包括多環(huán)；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和任選被1-2個諸如低級烷基、鏈烯基或鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等，或兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)，例如與N一起可形成4-8元環(huán)；R1和R2只要化合價允許則獨立代表與其連接的環(huán)上的0-5個選自以下的取代基鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、酰胺基、脒基、氰基、硝基、羥基、疊氮基、磺?；喕酋；⒘蛩狨セ?、磺酸酯基、氨磺酰基、亞磺酰氨基、磷?；㈧⑺狨セ?、亞膦酸酯基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)P芳基、-(CH2)P芳烷基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、NR(CH2)nR和上述基團的被護形式；Cy代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括多環(huán)基；i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)；且p和n每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等。
在某些實施方案中，Cy′代表取代或未取代的雙環(huán)或雜環(huán)體系，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶等。在某些實施方案中，Cy′直接與X連接。在某些實施方案中，Cy′為單環(huán)芳環(huán)，或者為至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即形成聯(lián)芳體系。在某些實施方案中，Cy′包括兩個取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如相同或不同、直接由一個或多個鍵連接的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如以形成聯(lián)芳環(huán)或雙環(huán)體系。
在某些實施方案中，Y在所有位置上都不存在。在其中某個位置上存在Y的實施方案中，在相鄰的Mi中，如果i＝0將導致存在的兩個Y直接連接，或者存在的一個Y直接與N連接，則在相鄰的Mi中i優(yōu)選代表1-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
在某些實施方案中，R代表H或低級烷基，例如H或Me。
在某些實施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，即包括至少一個sp3雜化原子，最好是多個sp3雜化原子。在某些實施方案中，Cy在所述環(huán)中或所述環(huán)的取代基上包含一個氨基，例如Cy為吡啶基、咪唑基、吡咯基、哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基等，和/或帶有一個氨基取代基。在某些實施方案中，Cy直接與N連接。在某些實施方案中，Cy為5-7元環(huán)。在其中Cy為直接與N連接的6元環(huán)并且在所述環(huán)相對于N的4位上帶有一個氨基取代基的實施方案中，所述N和胺取代基可以在所述環(huán)上以反式排列。
在某些實施方案中，R1和R2只要化合價允許則獨立代表與其連接的環(huán)上的0-5個選自以下的取代基鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、磺?；?、亞磺酰基、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺酰基、亞磺酰氨基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式。
在某些實施方案中，可用于本發(fā)明的化合物可以由通式(V)表示 式V其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則
Cy′代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，包括多環(huán)；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝CN)-、-P(＝O)(OR)-和任選被1-2個諸如低級烷基、鏈烯基或鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)，例如與N一起可形成4-8元環(huán)；R1和R2只要化合價允許則獨立代表與其連接的環(huán)上的0-5個選自以下的取代基鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、酰胺基、脒基、氰基、硝基、羥基、疊氮基、磺?；?、亞磺?；?、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺酰基、亞磺酰氨基、磷酰基、膦酸酯基、亞膦酸酯基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)P芳基、-(CH2)P芳烷基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式；Cy′代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括多環(huán)基；j每次出現(xiàn)時獨立代表0-10的整數(shù)，最好是2-7的整數(shù)；i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)；且p和n每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等。
在某些實施方案中，Cy′代表取代或未取代的雙環(huán)或雜環(huán)體系，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶等。在某些實施方案中，Cy′直接與X連接。在某些實施方案中，Cy′為單環(huán)芳環(huán)，或者為至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即形成聯(lián)芳體系。在某些實施方案中，Cy′包括兩個取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如相同或不同、直接由一個或多個鍵連接的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如以形成聯(lián)芳環(huán)或雙環(huán)體系。
在某些實施方案中，Y在所有位置上都不存在。在其中某個位置上存在Y的實施方案中，在相鄰的Mi中，如果i＝0將導致存在的兩個Y直接連接，或者存在的一個Y直接與N或NR2連接，則在相鄰的Mi中i優(yōu)選代表1-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
在某些實施方案中，NR2代表分別被一個或兩個低級烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，最好是伯胺或仲胺。
在某些實施方案中，R代表H或低級烷基，例如H或Me。
在某些實施方案中，R1和R2只要化合價允許則獨立代表與其連接的環(huán)上的0-5個選自以下的取代基鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、磺?；?、亞磺?；?、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺?；?、亞磺酰氨基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式。
在某些實施方案中，可用于本發(fā)明的化合物可以由通式(VI)表示
式VI其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Cy′代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，包括多環(huán)；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和任選被1-2個諸如低級烷基、鏈烯基或鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)，例如與N一起可形成4-8元環(huán)；Cy代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括多環(huán)基；R1和R2只要化合價允許則獨立代表與其連接的環(huán)上的0-5個選自以下的取代基鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、酰胺基、脒基、氰基、硝基、羥基、疊氮基、磺?；?、亞磺?；?、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺?；?、亞磺酰氨基、磷?；㈧⑺狨セ?、亞膦酸酯基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)P芳基、-(CH2)P芳烷基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式；i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)；且n和p每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等。
在某些實施方案中，Cy′代表取代或未取代的雙環(huán)或雜芳環(huán)體系，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶基等。在某些實施方案中，Cy′直接與X連接。在某些實施方案中，Cy′為單環(huán)芳環(huán)，或者為至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即形成聯(lián)芳體系。在某些實施方案中，Cy′包括兩個取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如相同或不同、直接由一個或多個鍵連接的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如以形成聯(lián)芳環(huán)或雙環(huán)體系。
在某些實施方案中，Y在所有位置上都不存在。在其中某個位置上存在Y的實施方案中，在相鄰的Mi中，如果i＝0將導致存在的兩個Y直接連接，或者存在的一個Y直接與N或NR2連接，則在相鄰的Mi中i優(yōu)選代表1-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
在某些實施方案中，NR2代表分別被一個或兩個低級烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，最好是伯胺。
在某些實施方案中，R代表H或低級烷基，例如H或Me。
在某些實施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，即包括至少一個sp3雜化原子，最好是多個sp3雜化原子。在某些實施方案中，Cy直接與N連接和/或與NR2連接。在某些實施方案中，Cy為5-7元環(huán)。在其中Cy為直接與N連接的6元環(huán)并且在所述環(huán)相對于N的4位上帶有一個氨基取代基的實施方案中，所述N和胺取代基可以在所述環(huán)上以反式排列。
在某些實施方案中，R1和R2只要化合價允許則獨立代表與其連接的環(huán)上的0-5個選自以下的取代基鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、磺酰基、亞磺酰基、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺?；?、亞磺酰氨基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式。
在某些實施方案中，本發(fā)明主題化合物具有以下式VII的結構 式VII其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Cy代表取代或未取代的雜環(huán)基或環(huán)烷基；Cy′為取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，包括多環(huán)；W為O或S；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)，例如與N一起可形成4-8元環(huán)；
R1和R2只要化合價允許則獨立代表與其連接的環(huán)上的0-5個選自以下的取代基鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、酰胺基、脒基、氰基、硝基、羥基、疊氮基、磺?；喕酋；⒘蛩狨セ?、磺酸酯基、氨磺?；喕酋０被?、磷?；㈧⑺狨セ?、亞膦酸酯基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)P芳基、-(CH2)P芳烷基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式；n和p每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，Cy′代表取代或未取代的雙環(huán)或雜芳環(huán)體系，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶基等。在某些其它的實施方案中，Cy′代表芳環(huán)或至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即以形成聯(lián)芳環(huán)體系。
在某些實施方案中，NR2代表分別被一個或兩個低級烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，最好是伯胺或仲胺。
在某些實施方案中，Cy代表取代或未取代的飽和碳環(huán)或雜環(huán)，即由多個sp3雜化原子組成的碳環(huán)或雜環(huán)。在某些實施方案中，Cy為5-7元環(huán)。在其中Cy為直接與N連接的6元環(huán)并且在所述環(huán)相對于N的4位上帶有一個氨基取代基的實施方案中，所述N和胺取代基可以在所述環(huán)上以反式排列。
在某些實施方案中，R1和R2只要化合價允許則獨立代表與其連接的環(huán)上的0-5個選自以下的取代基鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、磺?；?、亞磺?；⒘蛩狨セ?、磺酸酯基、氨磺?；?、亞磺酰氨基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式。
在某些實施方案中，本發(fā)明主題化合物具有以下式VIII的結構 式VIII其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則U代表取代或未取代的、與含氮環(huán)稠合的芳環(huán)或雜芳環(huán)；V代表低級亞烷基，例如亞甲基、1，2-亞乙基、1，1-亞乙基、1，1-亞丙基、1，2-亞丙基、1，3-亞丙基等；W代表S或O，最好是O；X代表C＝O、C＝S或SO2；R3代表取代或未取代的芳基、雜芳基、低級烷基、低級鏈烯基、低級鏈炔基、碳環(huán)基、碳環(huán)基烷基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、芳烷基或雜芳烷基；R4代表取代或未取代的芳烷基或低級烷基，例如苯乙基、芐基或氨基烷基等；R5代表取代或未取代的芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基，包括多環(huán)芳基或雜芳基。
在某些實施方案中，U代表與含氮環(huán)稠合的苯環(huán)。
在某些實施方案中，R3選自取代或未取代的芳基、雜芳基、低級烷基、低級鏈烯基、芳烷基和雜芳烷基。
在某些實施方案中，R4為未取代的低級烷基，或者為被仲胺或叔胺取代的低級烷基。
在某些實施方案中，R5選自取代或未取代的苯基或萘基，或者為二芳基烷基，例如2，2-二苯基乙基、二苯基甲基等。
另外，具有式IX-XII結構的化合物可用于本發(fā)明的組合物和方法中。
在某些實施方案中，可用于本發(fā)明的hedgehog依賴性化合物(例如上述化合物)誘導或增加一種或多種hedgehog活性(例如正調節(jié)gli表達)的EC50可能小于約1000nm，小于約100nm，小于約10nm，或者甚至小于約1nm。在某些實施方案中，可用于本發(fā)明的hedgehog依賴性化合物(例如上述化合物)，增加一種或多種hedgehog活性(例如正調節(jié)gli表達)至少1個數(shù)量級，2個數(shù)量級，或者甚至3個數(shù)量級。本發(fā)明的化合物可用于例如治療動物或病人的疾病或病癥的體內(nèi)方法中，以及可用于例如包括干細胞或祖細胞在內(nèi)的培養(yǎng)細胞(例如作為培養(yǎng)基成分)的體外方法中，例如以促進所述培養(yǎng)細胞的增殖、存活和/或分化。
附圖簡述
圖1-31顯示可用于合成依照本發(fā)明化合物的反應。
圖32和圖33舉例說明依照本發(fā)明的代表性化合物。
圖34a和圖34b顯示使用本發(fā)明化合物的hedgehog途徑報道測定結果。
圖35顯示證明本發(fā)明hedgehog激動劑正調節(jié)Ptc和Gli的測定結果。
圖36和圖37顯示在本發(fā)明主題激動劑存在下，小腦神經(jīng)元前體的增殖增加。
圖38A和圖38B顯示根據(jù)握力分析測定，本發(fā)明主題激動劑對壓傷的坐骨神經(jīng)愈合的影響。
圖39A-D證明根據(jù)趾伸展分析測定，本發(fā)明主題激動劑對壓傷的坐骨神經(jīng)愈合的影響。
圖40顯示本發(fā)明主題激動劑與低劑量的hedgehog蛋白一起對正在發(fā)育的小鼠肺組織、肩胛骨組織、皮膚組織和顱骨組織的影響。
圖41顯示其中加有和不加hedgehog蛋白的本發(fā)明主題激動劑對正在發(fā)育的小鼠胰臟組織、腎臟組織、皮膚組織和心臟組織的影響。
圖42顯示本發(fā)明主題激動劑對新生小鼠前肢的影響。
圖43顯示不同濃度的本發(fā)明主題激動劑對新生小鼠前肢的影響。
圖44顯示本發(fā)明主題激動劑對正在發(fā)育的肺組織的影響。
圖45顯示本發(fā)明主題激動劑對正在發(fā)育的腎臟組織的影響。
圖46A和圖46B顯示在存在和不存在hedgehog蛋白的情況下，本發(fā)明主題激動劑對小鼠皮膚組織的影響。
圖47A和圖47B比較本發(fā)明主題激動劑在小鼠和人報道細胞中的活性。
圖48顯示Gli在用經(jīng)修飾的Sonic hedgehog N-末端片段處理的HEPM細胞或用本發(fā)明主題激動劑處理的HEPM細胞中的正調節(jié)。
圖49舉例說明本發(fā)明化合物對丙二酸誘導的損害的影響。
圖50和圖51顯示在MCAO中風模型中，測試本發(fā)明化合物預防損傷的實驗結果。
圖52和圖53顯示MCAO后用本發(fā)明化合物處理的作用。
圖54顯示在帕金森病模型中，用本發(fā)明化合物預處理的作用。
圖55顯示在帕金森病模型中，用本發(fā)明化合物作為治療藥物的作用。
圖56顯示在注射本發(fā)明化合物后，體內(nèi)神經(jīng)細胞的增殖增加。
圖57和圖58舉例說明在口服本發(fā)明化合物后，體內(nèi)神經(jīng)細胞的增殖增加。
圖59顯示Sonic hedgehog(Shh)蛋白在糖尿病性神經(jīng)病模型中的作用。
圖60證明本發(fā)明激動劑在糖尿病性神經(jīng)病模型中的作用。
圖61和圖62顯示在糖尿病性神經(jīng)病模型中，在給予本發(fā)明激動劑后，坐骨神經(jīng)滋養(yǎng)血管的影像。
圖63-65舉例說明在給予本發(fā)明激動劑后，各種生長因子的正調節(jié)。
實施本發(fā)明的最佳模式發(fā)明詳述I.概述本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)由hedgehog、patched(ptc)、gli和/或smoothened調節(jié)的信號轉導途徑可以至少部分受到小分子的調節(jié)。雖然不希望受任何具體理論的束縛，但是通過改變細胞表面締合物(例如復合物)而激活patched-smoothened途徑可能是這些因子起作用的機制。人們認為，通過patched和smoothened的締合，例如以蛋白質復合物形式締合，可負調節(jié)hedgehog途徑，所述締合由于hedgehog與patched的結合而被破壞。因此，這些因子激活hedgehog途徑的能力可能是由于這樣的分子的以下能力所致與patched或smoothened相互作用或者與其結合，以其它方式破壞smoothened與patched的締合，或者至少促進所述蛋白激活hedgehog、ptc和/或smoothened介導的信號轉導途徑的能力。該作用模式，例如smoothened依賴性途徑的調節(jié)要與以下化合物相區(qū)別所述化合物通過直接激活cAMP途徑而調節(jié)hedgehog途徑，例如通過與PKA、腺苷酸環(huán)化酶、cAMP磷酸二酯酶結合或者與其相互作用而調節(jié)hedgehog途徑。
本文中公開的某些hedgehog激動劑在不存在hedgehog蛋白本身的情況下可調節(jié)hedgehog活性，例如所述激動劑模擬hedgehog的活性，而不是僅僅例如通過促進hedgehog與patched的結合來補充或增加hedgehog蛋白的活性。在本文將這些化合物稱為hedgehog非依賴性激動劑，并且這些化合物單獨可以模擬由于hedgehog處理產(chǎn)生的表型或效應。本發(fā)明的某些其它化合物增強hedgehog蛋白的活性，并且需要存在或加入hedgehog蛋白，才能觀察到由于hedgehog誘導產(chǎn)生的表型或作用。這樣的hedgehog依賴性激動劑可用于包含hedgehog蛋白的治療制劑或治療中，或者可用于增加由待用所述激動劑處理的細胞或組織天然產(chǎn)生的hedgenog蛋白的活性。本文中公開的hedgehog激動劑可以例如通過與patched或smoothened結合來誘導patched-smoothened復合物的解離，或者破壞patched和smoothened之間的相互作用，從而激活所述hedgehog途徑。在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法使用一種作用于靶細胞胞外膜的一種或多種組分的化合物。
在某些實施方案中，可用于本發(fā)明的hedgehog激動劑誘導hedgehog依賴性轉錄調節(jié)，例如表達glil或ptc基因。因此，這樣的激動劑可以誘導或增強由于例如hedgehog蛋白水平增加而產(chǎn)生的hedgehog依賴性途徑激活。
因此，準確地講，本發(fā)明考慮了調節(jié)hedgehog、ptc或smoothened信號轉導活性各方面的這些小分子將在具有功能性ptc-smo途徑的細胞中同樣能夠促進增殖(或其它生物學結果)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明主題激動劑是這樣的有機分子所述有機分子的分子量小于2500amu，更優(yōu)選小于1500anu，甚至更優(yōu)選小于750amu，并且能夠誘導或增加hedgehog蛋白、準確地講最好是靶細胞中的hedgehog蛋白的至少某些生物活性?？梢詫edgehog激動劑激活hedgehog途徑進行定量，例如相對于在不存在激動劑的情況下的對照，檢測在所述激動劑存在下ptc或gli-1轉錄方面的增加情況。例如，增加至少5％、至少10％、至少20％或甚至至少50％可以說明hedgehog途徑被試驗化合物激活。在某些實施方案中，本發(fā)明主題化合物的激動劑活性不被hedgehog抗體5E1所抑制，但被介藜蘆胺或具有下式的拮抗劑所抑制
該性質可以進行定量，例如在不存在所述hedgehog拮抗劑的情況下，通過測定所述抗體或拮抗劑是否誘導由所述激動劑誘導的ptc或gli-1的正調節(jié)減少大于50％、大于20％、大于10％或甚至大于5％，等等。在某些實施方案中，可用于本發(fā)明化合物(例如上述化合物)誘導或增加一種或多種hedgehog活性(例如正調節(jié)ptc或gli表達)的EC50可能小于約1000nM，小于約100nM，小于約10nM，或者甚至小于約1nM。示例性人Gli基因的編碼序列包括例如Genbank登記號X07384的Gli-1基因序列以及Genbank登記號AB007298的Gli-2基因序列。另見Kinzler等Nature1988，332，371。例如，通過測量mRNA水平(轉錄)或蛋白質水平(翻譯)，可以確定gli或ptc表達的水平。
因此，本發(fā)明的方法包括例如通過激活smoothened或所述信號途徑的下游組分而拮抗hedgehog信號的ptc抑制的小分子在調節(jié)各種各樣的細胞、組織和器官的修復和/或功能表現(xiàn)中的用途。例如，本發(fā)明主題方法具有以下范圍的治療和美容應用調節(jié)神經(jīng)組織、骨和軟骨的形成和修復、調節(jié)精子發(fā)生、調節(jié)平滑肌、調節(jié)肺、肝、泌尿生殖器官(例如膀胱)和其它起源于原始消化管的器官、調節(jié)造血功能、調節(jié)皮膚和毛發(fā)的生長等。此外，可以在培養(yǎng)物中提供的細胞(體外)或完整動物中的細胞(體內(nèi))上實施本發(fā)明主題方法。參見例如PCT公布號WO 95/18856和WO 96/17924(所述文獻的說明書內(nèi)容通過引用結合到本文中)。
在一個實施方案中，本發(fā)明主題方法可用于處理上皮細胞。一般而言，可以使上皮細胞與一定量的hedgehog激動劑接觸，以誘導上皮組織生長和/或形成?？梢栽谂囵B(yǎng)物中分散的上皮細胞或者為完整組織或器官的一部分上實施本發(fā)明主題方法。此外，可以在培養(yǎng)物中提供的細胞(體外)或完整動物中的細胞(體內(nèi))上實施所述方法。
本發(fā)明的hedgehog激動劑可用作治療上皮組織的疾病或者手術修復或美容修復上皮組織的方案的一部分，所述上皮組織例如皮膚和皮膚器官；角膜、晶狀體和其它眼組織；粘膜；和牙周上皮。本文中公開的方法和組合物提供對各種各樣受損上皮組織和粘膜組織的治療或預防手段。例如，本發(fā)明主題方法可用于控制傷口愈合過程，例如可能最好是聯(lián)合使用涉及上皮組織的任何手術如皮膚病學手術或牙周病學手術。hedgehog激動劑可能對其有用的示例性手術修復包括嚴重燒傷和皮膚再生、皮膚移植、褥瘡、皮膚潰瘍、裂傷、術后瘢痕縮小和潰瘍性結腸炎。
在本發(fā)明的另一方面，hedgehog激動劑可用于實現(xiàn)毛發(fā)生長，例如用于治療脫發(fā)，從而促進毛發(fā)生長。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明主題方法可用作惡性成神經(jīng)管細胞瘤和其它原發(fā)性CNS惡性神經(jīng)外胚層腫瘤的治療方案的一部分。
另一方面，本發(fā)明提供包含作為有效成分的hedgehog激動劑、ptc拮抗劑或smoothened激動劑(如本文所述的激動劑和拮抗劑)、以足以促進體內(nèi)增殖或其它生物學結果的量配制的藥用制劑。
使用hedgehog激動劑、patched拮抗劑或smoothened激動劑的本發(fā)明主題治療對于人和動物受治療者可能都是有效的。本發(fā)明可應用的動物受治療者延伸至作為寵物或商業(yè)目的飼養(yǎng)的馴養(yǎng)動物和家畜。實例為狗、貓、牛、馬、綿羊、豬和山單。
II.定義為了方便起見，在此收集了本發(fā)明說明書、實施例和所附權利要求書中所用的某些術語。
短語基因的“異常修飾或突變”是指這樣的遺傳損傷，如基因核苷酸的缺失、取代或添加以及基因的嚴重染色體重排或基因的異常甲基化。同樣，基因的錯誤表達是指基因的轉錄水平相對于在正常細胞中在相似條件下的轉錄水平為異常，以及從該基因轉錄的mRNA的非野生型剪接。
“燒傷”是指個體大面積的皮膚表面由于熱和/或化學劑而被完全損壞或喪失的病例。
“真皮”是指表皮深處的皮膚層，由血管結締組織的致密基底構成，并且含有神經(jīng)和感覺終末器官。毛根以及皮脂腺和汗腺是深埋在真皮內(nèi)的表皮結構。
“牙組織”是指口腔中類似于上皮組織的組織，例如牙齦組織。本發(fā)明的方法可用于治療牙周疾病。
“真皮皮膚潰瘍”是指由組織的淺表性損傷引起的皮膚損傷，通常伴有炎癥?？梢杂帽景l(fā)明方法治療的真皮皮膚潰瘍包括褥瘡、糖尿病性潰瘍、靜脈曲張性潰瘍和動脈潰瘍。褥瘡是指由于長期壓迫皮膚區(qū)引起的慢性潰瘍。該類型的創(chuàng)傷常常稱為褥瘡。靜脈曲張性潰瘍由血液或缺損靜脈的其它流體的滯留引起。動脈潰瘍是指血流不暢的動脈周圍區(qū)域中的壞死性皮膚。
術語“ED50”是指產(chǎn)生其最大反應或效應的50％的藥物劑量。
就本發(fā)明主題治療方法而言，例如hedgehog激動劑的“有效量”是指制劑中所述激動劑的量，其中當激動劑用作所需給藥方案的一部分時，根據(jù)對待治療疾病或美容目的臨床公認標準，引起例如細胞增殖率和/或細胞分化狀態(tài)和/或細胞存活率的改變。
術語“上皮”是指機體內(nèi)表面和外表面的細胞覆蓋物(皮膚、粘液和漿液)，包括由其衍生的腺體和其它結構，例如角膜、食管、表皮和毛囊的上皮細胞。其它示例性的上皮組織包括嗅上皮，它為襯于鼻腔嗅區(qū)的假復層上皮，并且含有嗅覺感受器；腺上皮，它是指由分泌細胞構成的上皮；鱗狀上皮，它是指由扁平樣細胞構成的上皮。術語“上皮”也可以指移行上皮，其特征為發(fā)現(xiàn)由于收縮和擴張而經(jīng)歷巨大機械變化的被覆中空器官，例如位于復層鱗狀上皮和復層柱狀上皮之間的過渡型組織。
術語“上皮形成”是指由于上皮組織在裸露表面生長而使傷口愈合。
術語“表皮腺”是指與表皮相關的細胞的聚集并且特化以分泌或排泄與其正常代謝需求無關的物質。例如，“皮脂腺”是真皮內(nèi)分泌油性物質和皮脂的全質分泌腺。術語“汗腺”是指分泌汗液的腺體，位于真皮或皮下組織內(nèi)，汗液通過打開體表的導管而排出體外。
術語“表皮”是指皮膚的最外層和非血管層，起源于胚胎外胚層，厚度在0.07-1.4mm之間變動。在手掌面和足趾面，從內(nèi)向外，它包括5層基底層，由垂直排列的柱狀細胞構成；棘細胞層或棘層，由帶有短突起或短刺的扁平多角細胞構成；顆粒層，由扁平顆粒細胞構成；透明層，由幾層無核透明細胞層構成；和角質層，由扁平、角質化無核細胞構成。在全身體表的表皮內(nèi)，通常不存在透明層。
“切除創(chuàng)傷”包括皮膚上皮層內(nèi)的撕裂傷、擦傷、刀傷、刺傷或裂傷，并且可以延伸到真皮層，甚至延伸到皮下脂肪和更深部位。切除創(chuàng)傷可以由外科手術或偶然穿透皮膚引起。
細胞的“生長狀態(tài)”是指細胞增殖速率和/或細胞分化狀態(tài)?！案淖兊纳L狀態(tài)”是特征為異常增殖速率的生長狀態(tài)，例如相對于正常細胞，表現(xiàn)出增殖速率增加或減少的細胞。
術語“毛發(fā)”是指由角蛋白構成且由真皮的乳頭狀凹陷發(fā)育而來的線狀結構，尤其是特化的表皮結構，其僅由哺乳動物產(chǎn)生的，并且是該組動物的特征。另外，“毛發(fā)”可以指這類毛發(fā)的聚集物。“毛囊”是指包裹毛發(fā)的一種管狀內(nèi)陷，毛發(fā)從中生長出來?！懊疑掀ぜ毎笔侵该覂?nèi)真皮乳頭周圍的上皮細胞，例如干細胞、外根鞘細胞、基質細胞和內(nèi)根鞘細胞。這樣的細胞可以是正常的非惡性細胞或轉化細胞/無限增殖化細胞。
術語“hedgehog激動劑”是指增強或再現(xiàn)hedgehog生物活性、例如激活靶基因轉錄的試劑。優(yōu)選的hedgehog激動劑可用于以smoothened依賴性方式模擬或增強hedgehog蛋白的活性或作用。本文所用的術語“hedgehog激動劑”不僅指可以通過直接激活hedgehog蛋白正常功能而發(fā)揮作用的任何試劑，而且指激活hedgehog信號途徑并因此抑制ptc功能的任何試劑。
術語“hedgehog功能喪失”是指ptc基因、hedgehog基因或smoothened基因的異常修飾或突變，或者在這樣的基因的表達水平方面的降低(或喪失)，從而導致類似使細胞與hedgehog抑制劑接觸的表型，例如hedgehog途徑的異常抑制。“功能喪失”可以包括ptc基因產(chǎn)物調節(jié)Ci基因(例如Gli1、Gli2和Gli3)表達水平的能力增加。術語“hedgehog功能喪失”在本文中也用來指由于在hedgehog信號轉導途徑任何其它方面的改變而出現(xiàn)的任何相似的細胞表型(例如表現(xiàn)出增殖降低)，包括但不限于hedgehog本身的修飾或突變。例如，由于使hedgehog信號途徑失活而具有異常低增殖速率的細胞將會具有“hedgehog功能喪失”的表型，即使hedgehog在該細胞中不發(fā)生突變的情況下也是如此。
本文所用的“無限增殖化細胞”是指已通過化學方法和/或重組方法改變的細胞，致使所述細胞具有通過在培養(yǎng)時不限定分裂次數(shù)的生長能力。
“內(nèi)部上皮組織”是指機體內(nèi)的組織，其特征類似于皮膚表皮層。實例包括腸內(nèi)襯。本發(fā)明的方法可用來促進某些內(nèi)部傷口(例如由于手術引起的傷口)的愈合。
術語“角化病”是指特征為表皮角質層增生的增生性皮膚疾病。示例性角化病包括毛囊角化病、掌跖角化病、咽角化病、毛周角化病和光化性角化病。
術語“LD50”是指使受試者的50％致死的藥物劑量。
術語“甲”是指手指或足趾的遠端背面上的角化皮膚板。
術語“patched功能獲得”是指ptc基因的異常修飾或突變，或者所述基因的表達水平增加，從而導致類似使細胞與hedgehog抑制劑接觸的表型，例如hedgehog途徑的異常失活。所述功能獲得可以包括ptc基因產(chǎn)物調節(jié)Ci基因(例如Gli1、Gli2和Gli3)表達水平的能力增加。
待經(jīng)本發(fā)明主題方法治療的“患者”或“受治療者”可指人類或非人類動物。
術語“前體藥物”意指包括在生理條件下轉變成本發(fā)明的治療活性劑的化合物。用于制備前體藥物的普通方法是包括在生理條件下被水解以獲得所需分子的選定部分。在其它實施方案中，所述前體藥物經(jīng)宿主動物的酶活性作用發(fā)生轉化。
本文所用的“增殖”是指經(jīng)歷有絲分裂的細胞。
在本申請中，術語“增生性皮膚病”是指特征為皮膚組織的不需要或異常增殖的任何皮膚疾病/障礙。這些病癥的特征通常為表皮細胞增殖或不完全細胞分化，包括例如X連鎖魚鱗病、牛皮癬、特應性皮炎、過敏性接觸性皮炎、表皮松解性角化過度癥和脂溢性皮炎。例如，表皮發(fā)育不良是一種表皮有缺陷發(fā)育的形式。另一實例是“表皮松解”，它是指表皮的松弛狀態(tài)，伴有自發(fā)或者在創(chuàng)傷部位形成皰和大皰。
術語“皮膚”是指機體的保護性外覆蓋層，它由真皮和表皮構成，可理解為包括汗腺和皮脂腺以及毛囊結構。在本發(fā)明說明書中，可以使用形容詞“皮膚的”，并且應該理解為一般指皮膚的屬性，適合于其在本發(fā)明說明書正文中所用之處的上下文含義。
術語“小分子”是指具有以下分子量的化合物小于約2500amu，優(yōu)選小于約2000amu，甚至更優(yōu)選小于約1500amu，再更優(yōu)選小于約1000amu，或者最優(yōu)選小于約750amu。
術語“smoothened功能喪失”是指smo基因的異常修飾或突變，或者所述基因表達水平降低，從而導致類似使細胞與hedgehog抑制劑接觸的表型，例如hedgehog途徑的異常失活。雖然不希望受任何具體理論的束縛，但要注意ptc不可能直接發(fā)信號到細胞中，而是與smoothened相互作用，smoothened是位于hedgehog信號中ptc下游的另一種膜結合蛋白(Marigo等，(1996)Nature384177-179)?；騭mo是果蠅中每個體節(jié)正確圖式發(fā)育所必需的體節(jié)極性基因(Alcedo等，(1996)Cell86221-232)。已經(jīng)鑒定出smo的人同系物。參見例如Stone等(1996)Nature384129-134，和GenBanlc登記號U84401。smoothened基因編碼其特征為異源三聚體G-蛋白偶聯(lián)受體的膜內(nèi)在蛋白；即七跨膜區(qū)。該蛋白顯示與果蠅Frizzled(Fz)蛋白即wingless途徑的一個成員有同源性。人們最初認為smo編碼Hh信號的受體。然而，該猜測隨后證明有誤，因為獲得了ptc為Hh受體的證據(jù)。表達Smo的細胞不能結合Hh，說明smo不直接與Hh相互作用(Nusse，(1996)Nature384119-120)。相反，認為Sonic hedgehog(SHH)與其受體PTCH的結合阻止對PTCH對smoothened(SMO)即七跨膜蛋白的正常抑制。
術語“治療指數(shù)”是指藥物的治療指數(shù)，定義為LD50/ED50。
術語“酰氨基”是本領域公知的，指可由以下通式表示的部分 其中R9如上定義，而R’11代表氫、烷基、鏈烯基或-(CH2)m-R8，其中m和R8如上定義。
在此，術語“脂族基”是指直鏈烴基、支鏈烴基或環(huán)狀脂族烴基，包括飽和和不飽和脂族基，例如烷基、鏈烯基和鏈炔基。
術語“鏈烯基”和“鏈炔基”是指長度類似的且上述烷基可能取代的、但分別含有至少一個雙鍵或叁鍵的不飽和脂族基。
本文所用的術語“烷氧基”是指如上定義的、具有與其連接的氧基團的烷基。代表性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。“醚”是兩個通過氧共價連接的烴。因此，使烷基變成醚的烷基的取代基是烷氧基或者類似于烷氧基，例如可以由下式之一表示-O-烷基、-O-鏈烯基、-O-鏈炔基、-O-(CH2)m-R8，其中m和R8如上所述。
術語“烷基”是指飽和脂族基，包括直鏈烷基、支鏈烷基、環(huán)烷基(脂環(huán)基)、烷基取代的環(huán)烷基和環(huán)烷基取代的烷基。在優(yōu)選的實施方案中，直鏈烷基或支鏈烷基在其主鏈中具有30個或少于30個碳原子(例如對于直鏈為C1-C30，對于支鏈為C3-C30)，更優(yōu)選20個或少于20個碳原子。同樣，優(yōu)選的環(huán)烷基在其環(huán)狀結構中具有3-10個碳原子，更優(yōu)選在其環(huán)狀結構中具有5個、6個或7個碳原子。
此外，在本發(fā)明說明書、實施例和權利要求書中所用的術語“烷基”(或“低級烷基”)意指既包括“未取代的烷基”又包括“取代的烷基”，后者是指具有置換烴主鏈的一個或多個碳上的氫的取代基的烷基部分。這樣的取代基可以包括例如鹵基、羥基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或?；?、硫代羰基(例如硫代酸酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷?；?、磷酸酯基、膦酸酯基、亞膦酸酯基、氨基、酰胺基、脒基、亞氨基、氰基、硝基、疊氮基、巰基、烷硫基、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺?；?、亞磺酰氨基、磺酰基、雜環(huán)基、芳烷基或芳族或雜芳族部分。本領域技術人員將會知道，烴鏈上取代的部分本身必要時可以再次被取代。例如，取代烷基的取代基可以包括氨基、疊氮基、亞氨基、酰胺基、磷?；?包括膦酸酯基和亞膦酸酯基)、磺?；?包括硫酸酯基、亞磺酰氨基、氨磺?；突撬狨セ?和甲硅烷基以及醚基、烷硫基、羰基(包括酮基、醛基、羧酸酯基和酯基)、-CF3、-CN等的取代和未取代形式。示例性的取代烷基如下所述。環(huán)烷基可進一步被烷基、鏈烯基、烷氧基、烷硫基、氨基烷基、羰基取代的烷基、-CF3、-CN等取代。
除非對碳數(shù)目另有說明，否則本文所用的“低級烷基”是指如上定義的、但在其主鏈結構中具有1-10個碳原子、更優(yōu)選1-6個碳原子的烷基。同樣，“低級鏈烯基”和“低級鏈炔基”具有相似的鏈長。在本申請中，優(yōu)選的烷基是低級烷基。在優(yōu)選的實施方案中，在本文稱為烷基的取代基是低級烷基。
術語“烷硫基”是指如上定義的、具有一個與其結合的硫基團的烷基。在優(yōu)選的實施方案中，“烷硫基”部分由-S-烷基、-S-鏈烯基、-S-鏈炔基和-S-(CH2)m-R8之一表示，其中m和R8如上定義。代表性的烷硫基包括甲硫基、乙硫基等。
術語“胺基”和“氨基”是本領域公知的，既指未取代的胺又指取代的胺，例如可由以下通式表示的部分 或 其中R9、R10和R’10各自獨立代表氫、烷基、鏈烯基、-(CH2)m-R8，或者R9和R10與其所連接的N原子結合在一起形成在其環(huán)狀結構中具有4-8個原子的雜環(huán)；R8代表芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)基或多環(huán)基；而m為0或1-8范圍內(nèi)的整數(shù)。在優(yōu)選的實施方案中，僅R9或R10中的一個可以為羰基，例如R9、R10和氮一起不形成二酰亞胺。在再更優(yōu)選的實施方案中，術語“胺基”不包括酰胺基，例如，其中R9和R10中的一個代表羰基。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，R9和R10(和任選R’10)各自獨立代表氫、烷基、鏈烯基或-(CH2)m-R8。因此，本文所用的術語“烷基氨基”是指如上定義的、具有與其連接的取代或未取代的烷基的胺基，即R9和R10中至少一個為烷基。
術語“酰胺基”是本領域公知的氨基取代的羰基，包括可由以下通式表示的部分
其中R9、R10如上定義。酰胺的優(yōu)選實施方案將不包括可能為不穩(wěn)定的二酰亞胺。
本文所用的術語“芳烷基” 是指被芳基取代的烷基(例如芳族基或雜芳族基)。
本文所用的術語“芳基”包括可包括0-4個雜原子的5元、6元或7元單環(huán)芳族基團，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪和嘧啶等。那些在環(huán)結構中具有雜原子的芳基也可以被稱為“芳基雜環(huán)基”或“雜芳基”。芳環(huán)可以在一個或多個環(huán)位置上被如上所述的這類取代基取代，所述取代基例如鹵基、疊氮基、烷基、芳烷基、鏈烯基、鏈炔基、環(huán)烷基、羥基、烷氧基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、酰胺基、磷酸酯基、膦酸酯基、亞膦酸酯基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚基、烷硫基、磺?；?、亞磺酰氨基、酮基、醛基、酯基、雜環(huán)基、芳族或雜芳族部分、-CF3、-CN等。術語“芳基”也包括具有兩個或兩個以上環(huán)的多環(huán)體系，其中兩或兩個以上碳對于兩個相鄰環(huán)是共用的(所述環(huán)為“稠環(huán)”)，其中所述環(huán)中至少一個為芳環(huán)，例如其它環(huán)可以是環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基和/或雜環(huán)基。
本文所用的術語“碳環(huán)”是指其中每個環(huán)原子都為碳的芳環(huán)或非芳環(huán)。
術語“羰基”是本領域公知的，包括可由以下通式表示的部分 或 其中X為一個鍵，或者代表氧或硫，且R11代表氫、烷基、鏈烯基、-(CH2)m-R8或藥學上可接受的鹽，R′11代表氫、烷基、鏈烯基或-(CH2)m-R8，其中m和R8如上定義。在X為氧且R11或R′11不為氫的情況下，該式代表“酯”。在X為氧且R11如上定義的情況下，該部分在本文被稱為羧基，特別是當R11為氫時，該式代表“羧酸”。在X為氧且R′11為氫的情況下，該式代表“甲酸酯”。一般而言，在上式中氧原子被硫原子取代的情況下，該式代表“硫代羰基”。在X為硫且R11或R′11不為氫的情況下，該式代表“硫代酸酯”。在X為硫且R11為氫的情況下，該式代表“硫代羧酸”。在X為硫且R′11為氫的情況下，該式代表“硫代甲酸酯”。另一方面，在X為一個鍵且R11不為氫的情況下，上式代表“酮”基。在X為一個鍵且R11為氫的情況下，上式代表“醛”基。
本文所用的術語“雜原子”是指除碳或氫以外的任何元素的原子。優(yōu)選的雜原子為硼、氮、氧、磷、硫和硒。
術語“雜環(huán)基”是指其環(huán)結構包括1-4個雜原子的3-10元環(huán)狀結構，更優(yōu)選3-7元環(huán)。雜環(huán)也可以是多環(huán)。雜環(huán)基包括例如噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、異苯并呋喃、色烯、咕噸、苯并氧硫雜環(huán)己二烯(phenoxathiin)、吡咯、咪唑、吡唑、異噻唑、異噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、吲嗪、異吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、異喹啉、喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、吩嗪、吩砒嗪、吩噻嗪、呋咱、吩嗪、吡咯烷、噁烷、硫雜環(huán)戊烷、噁唑、哌啶、哌嗪、嗎啉、內(nèi)酯、內(nèi)酰胺例如β-丙內(nèi)酰胺和吡咯烷酮、磺內(nèi)酰胺、磺酸內(nèi)酯等。雜環(huán)可以在一個或多個位置上被如上所述的這類取代基取代，所述取代基例如鹵基、烷基、芳烷基、鏈烯基、鏈炔基、環(huán)烷基、羥基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、酰胺基、磷酸酯基、膦酸酯基、亞膦酸酯基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚基、烷硫基、磺酰基、酮基、醛基、酯基、雜環(huán)基、芳族或雜芳族部分、-CF3、-CN等。
本文所用的術語“硝基”是指-NO2；術語“鹵基”是指-F、-Cl、-Br或-I；術語“巰基”是指-SH；術語“羥基”是指-OH；而術語“磺酰基”是指-SO2-。
“亞膦酰胺基”可由以下通式表示 或 其中R9和R10如上定義，Q2代表O、S或N，且R48代表低級烷基或芳基，Q2代表O、S或N。
“亞磷酰胺基”可由以下通式表示 或 其中R9和R10如上定義，而Q2代表O、S或N。
“磷酰基”通?？捎梢韵峦ㄊ奖硎?其中Q1代表S或O，而R46獨立代表氫、低級烷基或芳基。當用于取代例如烷基時，所述磷酰基烷基的磷?；捎梢韵峦ㄊ奖硎?或 其中Q1代表S或O，而每個R46獨立代表氫、低級烷基或芳基，Q2代表O、S或N。當Q1為S時，所述磷?；糠譃椤傲虼姿狨セ?。
術語“多環(huán)基”是指兩個或兩個以上的環(huán)基(例如環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基和/或雜環(huán)基)，其中兩個或兩個以上碳是兩個相鄰環(huán)所共有的，例如所述環(huán)為“稠環(huán)”。通過非相鄰原子連接的環(huán)稱為“橋連的”環(huán)。多環(huán)的每個環(huán)都可以被如上所述的這類取代基取代，所述取代基例如鹵基、烷基、芳烷基、鏈烯基、鏈炔基、環(huán)烷基、羥基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、酰胺基、磷酸酯基、膦酸酯基、亞膦酸酯基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚基、烷硫基、磺?；?、酮基、醛基、酯基、雜環(huán)基、芳族或雜芳族部分、-CF3、-CN等。
本文所用的短語“保護基”是指保護潛在反應性官能團免遭不需要的化學轉化的臨時取代基。這類保護基的實例分別包括羧酸的酯、醇的甲硅烷基醚以及醛和酮的縮醛和縮酮。保護基化學領域已有綜述(Greene，T.W.；Wuts，P.G.M.Protective Groups in OrganicSynthesis，第二版；WileyNew York，1991)。
“硒烷基”是指具有與其連接的取代硒基的烷基。可以在烷基上取代的示例性“硒醚”選自-Se-烷基、-Se-鏈烯基、-Se-鏈炔基和-Se-(CH2)m-R8之一，m和R8如上定義。
本文所用的術語“取代的”意指包括有機化合物的所有容許的取代基。廣義上，所述容許的取代基包括有機化合物的無環(huán)和環(huán)、分支和不分支、碳環(huán)和雜環(huán)、芳族和非芳族取代基。說明性的取代基包括例如上文描述的那些取代基。容許的取代基對于合適的有機化合物可以是一種或多種以及相同或不同的取代基。對于本發(fā)明而言，諸如氮的雜原子可具有氫取代基和/或本文描述的滿足雜原子化合價的有機化合物的任何容許的取代基。本發(fā)明并不以任何方式受到有機化合物的可能取代基的限制。
可以理解“取代”或“被……取代”包括隱含的附加條件，即這樣的取代依照取代原子和取代基的允許化合價進行，并且取代產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物，例如不自發(fā)地例如通過重排、環(huán)化、消除等發(fā)生轉化。
術語“氨磺?；笔潜绢I域公知的，包括可由以下通式表示的部分 其中R9和R10如上定義。
術語“硫酸酯基”是本領域公知的，包括可由以下通式表示的部分 其中R41如上定義。
術語“亞磺酰氨基”是本領域公知的，包括可由以下通式表示的部分 其中R9和R′11如上定義。
術語“磺酸酯基”是本領域公知的，包括可由以下通式表示的部分 其中R41為一個電子對、氫、烷基、環(huán)烷基或芳基。
本文所用的術語“亞磺?；笔侵缚捎梢韵峦ㄊ奖硎镜牟糠?其中R44選自氫、烷基、鏈烯基、鏈炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳烷基或芳基。
可以對鏈烯基和鏈炔基進行類似的取代，以產(chǎn)生例如氨基鏈烯基、氨基鏈炔基、酰胺基鏈烯基、酰胺基鏈炔基、亞氨基鏈烯基、亞氨基鏈炔基、硫代鏈烯基、硫代鏈炔基、羰基取代的鏈烯基或鏈炔基。
本文所用的對每種表達方式例如烷基、m、n等的定義，當其在任一結構中不止出現(xiàn)一次時，意味著獨立其相同結構另外的定義。
術語三氟甲磺?；?、甲苯磺?；⒓谆酋；途欧谆酋；潜绢I域公知的，分別指三氟甲磺?；妆交酋；⒓谆酋；途欧』酋；?。術語三氟甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、甲磺酸酯基和九氟甲磺?；潜绢I域公知的，分別指三氟甲磺酸酯基、對甲苯磺酸酯基、甲磺酸酯基和九氟丁磺酸酯基官能團和含有所述基團的分子。
縮寫Me、Et、Ph、Tf、Nf、Ts、Ms分別代表甲基、乙基、苯基、三氟甲磺?；⒕欧』酋；?、對甲苯磺酰基和甲磺?；１绢I域普通有機化學家所用的縮寫的更詳盡一覽表參見the Journal ofOrganic Chemistry每卷的第一期；該一覽表通常在題為Standard List ofAbbreviations的表中給出。所述一覽表中包括的縮寫以及本領域普通有機化學家所用的縮寫通過引用結合到本文中。
本發(fā)明的某些化合物可以以特定幾何形式或立體異構形式存在，本發(fā)明考慮認為所有這樣的化合物，包括順式-異構體和反式-異構體、R-對映異構體和S-對映異構體、非對映異構體、(D)-異構體、(L)-異構體、其外消旋混合物及它們的其它混合物，都屬于本發(fā)明的范圍。在取代基例如烷基中可以存在另外的不對稱碳原子。所有這樣的異構體以及它們的混合物都有意包括在本發(fā)明中。
如果例如本發(fā)明化合物的具體對映異構體是所需的，則它可以通過不對稱合成來制備，或者通過用手性助劑衍生化，其中分離所得的非對映異構體混合物并切下所述輔助基團，以提供所需的純對映異構體。或者，在所述分子含有一個堿性官能團(例如氨基)或酸性堿性官能團(例如羧基)的情況下，可以與合適的旋光酸或堿形成非對映異構體的鹽，接著通過本領域熟知的分級分離結晶法或色譜法，對如此形成的非對映異構體進行拆分，隨后回收所述純對映異構體，從而制備非對映異構體的鹽。
考慮了上述化合物的等同實施方案包括在其它方面符合上述化合物并且具有上述化合物相同的一般特性(例如激活hedgehog信號的能力)的化合物，其中對取代基進行一種或多種不負面影響所述化合物功效的簡單變化。一般而言，本發(fā)明化合物可以采用容易得到的原料、試劑和常規(guī)合成方法，通過通用反應方案舉例說明的方法(例如下述方法)來制備，或者通過改進方法來制備。在這些反應中，也有可能利用本身已知的但此處并未提及的改進方法。
對于本發(fā)明而言，化學元素依照以下文獻進行鑒定the PeriodicTable of the Elements，CAS version，Handbook of Chemistry and Physics，第67版，1986-87，(封二)。對于本發(fā)明而言，也考慮了術語“烴”包括具有至少一個氫原子和一個碳原子的所有容許的化合物，廣義上，所述容許的烴包括無環(huán)或有環(huán)、分支和不分支、碳環(huán)和雜環(huán)、芳族和非芳族的、可以被取代或者是未取代的有機化合物。
III.本發(fā)明的示例性化合物正如下文進一步詳細描述的，本發(fā)明考慮了可以用可以容易鑒定的各種不同的小分子，例如通過本文所述的這類藥物篩選測定鑒定的小分子，來實施本發(fā)明主題方法。例如，可用于本發(fā)明主題方法的化合物包括由通式(I)表示的化合物
式I其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Ar和Ar′獨立代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和任選被1-2個諸如低級烷基、鏈烯基或鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)，例如與N一起可形成4-8元環(huán)；Cy和Cy′獨立代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括多環(huán)基；且i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等。
在某些實施方案中，Ar和Ar′代表苯環(huán)，例如未取代的苯環(huán)或者被一個或多個包含雜原子(例如O、N和S)的基團取代的苯環(huán)。在某些實施方案中，Ar和Ar′中至少一個代表苯環(huán)。在某些實施方案中，Ar和Ar′中至少一個代表雜芳環(huán)，例如吡啶環(huán)、噻唑環(huán)、噻吩環(huán)、嘧啶環(huán)等。在某些實施方案中，Y和Ar′在間位和/或1，3-位與Ar連接。
在某些實施方案中，Y在所有位置上都不存在。在其中某個位置上存在Y的實施方案中，在相鄰的Mi中，如果i＝0將導致存在的兩個Y直接連接，或者存在的一個Y直接與N連接，則在相鄰的Mi中i優(yōu)選代表1-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的芳基或雜芳基。在某些實施方案中，Cy′直接與X連接。在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的雙環(huán)或雜芳環(huán)，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶等。在某些實施方案中，Cy′為單環(huán)芳環(huán)，或者為至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即形成聯(lián)芳體系。在某些實施方案中，Cy′包括兩個取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如相同或不同、直接由一個或多個鍵連接的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如以形成聯(lián)芳環(huán)或雙環(huán)體系。在某些實施方案中，Cy′代表苯并(b)噻吩-2-基，優(yōu)選3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，例如其中所述苯并環(huán)被1-4個選自以下的取代基取代鹵基、硝基、氰基、甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)和乙基(例如包括鹵代乙基，例如CH2CCl3，C2F5等)，優(yōu)選鹵基和甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)。在某些這樣的實施方案中，Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，其中所述苯并環(huán)在4-位(鄰近噻吩環(huán)的3-取代基)、且任選在7-位(“鄰近”噻吩環(huán)的S)被氟取代。
在某些實施方案中，X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
在某些實施方案中，R代表H或低級烷基，例如H或Me。
在某些實施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，即包括至少一個sp3雜化原子，最好是多個sp3雜化原子。在某些實施方案中，Cy在所述環(huán)中或所述環(huán)的取代基上包含一個氨基，例如Cy為吡啶基、咪唑基、吡咯基、哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基等，和/或帶有一個氨基取代基。在某些實施方案中，Cy為5-7元環(huán)。在某些實施方案中，Cy直接與N連接。在其中Cy為直接與N連接的6元環(huán)并且在所述環(huán)相對于N的4位上帶有一個氨基取代基的實施方案中，所述N和胺取代基可以在所述環(huán)上以反式排列。
在某些實施方案中，Ar或Ar′上的取代基選自鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、疊氮基、磺酰基、亞磺酰基、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺酰基、亞磺酰氨基、磷?；㈧⑺狨セ?、亞膦酸酯基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)P芳基、-(CH2)P芳烷基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式，其中p和n每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，可用于本發(fā)明的化合物可以由通式(II)表示 式II其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Ar和Ar′獨立代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)；
Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和任選被1-2個諸如低級烷基、鏈烯基或鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔，其中在Mj中，M有時或每次出現(xiàn)時都構成完整的環(huán)結構或其一部分；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)，例如與N一起可形成4-8元環(huán)；Cy′代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括多環(huán)基；j每次出現(xiàn)時獨立代表0-10的整數(shù)，最好是2-7的整數(shù)；且i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等。
在某些實施方案中，Ar和Ar′代表苯環(huán)，例如未取代的苯環(huán)或者被一個或多個包含雜原子(例如O、N和S)的基團取代的苯環(huán)。在某些實施方案中，Ar和Ar′中至少一個代表苯環(huán)。在某些實施方案中，Ar和Ar′中至少一個代表雜芳環(huán)，例如吡啶環(huán)、噻唑環(huán)、噻吩環(huán)、嘧啶環(huán)等。在某些實施方案中，Y和Ar′在間位和/或1，3-位與Ar連接。
在某些實施方案中，Y在所有位置上都不存在。在其中某個位置上存在Y的實施方案中，在相鄰的Mi中，如果i＝0將導致存在的兩個Y直接連接，或者存在的一個Y直接與N或NR2連接，則在相鄰的Mi中i優(yōu)選代表1-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的芳基或雜芳基。在某些實施方案中，Cy′直接與X連接。在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的雙環(huán)或雜芳環(huán)，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶等。在某些實施方案中，Cy′為單環(huán)芳環(huán)，或者為至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即形成聯(lián)芳體系。在某些實施方案中，Cy′包括兩個取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如相同或不同、直接由一個或多個鍵連接的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如以形成聯(lián)芳環(huán)或雙環(huán)體系。在某些實施方案中，Cy′代表苯并(b)噻吩-2-基，優(yōu)選3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，例如其中所述苯并環(huán)被1-4個選自以下的取代基取代鹵基、硝基、氰基、甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)和乙基(例如包括鹵代乙基，例如CH2CCl3、C2F5等)，優(yōu)選鹵基和甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)。在某些這樣的實施方案中，Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，其中所述苯并環(huán)在4-位(鄰近噻吩環(huán)的3-取代基)、且任選在7-位(“鄰近”噻吩環(huán)的S)被氟取代。
在某些實施方案中，X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
在某些實施方案中，R代表H或低級烷基，例如H或Me。
在某些實施方案中，NR2代表分別被一個或兩個低級烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，最好是伯胺或仲胺。
在某些實施方案中，Ar或Ar′上的取代基選自鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、疊氮基、磺?；?、亞磺?；⒘蛩狨セ?、磺酸酯基、氨磺?；?、亞磺酰氨基、磷?；?、膦酸酯基、亞膦酸酯基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)P芳基、-(CH2)P芳烷基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)nNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式，其中p和n每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，可用于本發(fā)明的化合物可以由通式(III)表示 式III其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Ar和Ar′獨立代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和任選被1-2個諸如低級烷基、鏈烯基或鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)，例如與N一起可形成4-8元環(huán)；Cy和Cy′獨立代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括多環(huán)基；且i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等。
在某些實施方案中，Ar和Ar′代表苯環(huán)，例如未取代的苯環(huán)或者被一個或多個包含雜原子(例如O、N和S)的基團取代的苯環(huán)。在某些實施方案中，Ar和Ar′中至少一個代表苯環(huán)。在某些實施方案中，Ar和Ar′中至少一個代表雜芳環(huán)，例如吡啶環(huán)、噻唑環(huán)、噻吩環(huán)、嘧啶環(huán)等。在某些實施方案中，Y和Ar′在間位和/或1，3-位與Ar連接。
在某些實施方案中，Y在所有位置上都不存在。在其中某個位置上存在Y的實施方案中，在相鄰的Mi中，如果i＝0將導致存在的兩個Y直接連接，或者存在的一個Y直接與N或NR2連接，則在相鄰的Mi中i優(yōu)選代表1-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的芳基或雜芳基。在某些實施方案中，Cy′直接與X連接。在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的雙環(huán)或雜芳環(huán)，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶等。在某些實施方案中，Cy′為單環(huán)芳環(huán)，或者為至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即形成聯(lián)芳體系。在某些實施方案中，Cy′包括兩個取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如相同或不同、直接由一個或多個鍵連接的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如以形成聯(lián)芳環(huán)或雙環(huán)體系。在某些實施方案中，Cy′代表苯并(b)噻吩-2-基，優(yōu)選3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，例如其中所述苯并環(huán)被1-4個選自以下的取代基取代鹵基、硝基、氰基、甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)和乙基(例如包括鹵代乙基，例如CH2CCl3，C2F5等)，優(yōu)選鹵基和甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)。在某些這樣的實施方案中，Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，其中所述苯并環(huán)在4-位(鄰近噻吩環(huán)的3-取代基)、且任選在7-位(“鄰近”噻吩環(huán)的S)被氟取代。
在某些實施方案中，X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
在某些實施方案中，R代表H或低級烷基，例如H或Me。
在某些實施方案中，NR2代表分別被一個或兩個低級烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，最好是伯胺或仲胺。
在某些實施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，即包括至少一個sp3雜化原子，最好是多個sp3雜化原子。在某些實施方案中，Cy直接與N連接和/或與NR2連接。在某些實施方案中，Cy為5-7元環(huán)。在其中Cy為直接與N連接的6元環(huán)并且在所述環(huán)相對于N的4位上帶有一個氨基取代基的實施方案中，所述N和胺取代基可以在所述環(huán)上以反式排列。
在某些實施方案中，Ar或Ar′上的取代基選自鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、疊氮基、磺?；喕酋；?、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺?；?、亞磺酰氨基、磷?；?、膦酸酯基、亞膦酸酯基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)P芳基、-(CH2)P芳烷基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式，其中n和p每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，可用于本發(fā)明主題方法的化合物包括由通式(IV)表示的化合物 式IV
其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Cy′代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，包括多環(huán)；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和任選被1-2個諸如低級烷基、鏈烯基或鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等，或兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)，例如與N一起可形成4-8元環(huán)；R1和R2只要化合價允許則獨立代表與其連接的環(huán)上的0-5個選自以下的取代基鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、酰胺基、脒基、氰基、硝基、羥基、疊氮基、磺酰基、亞磺酰基、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺?；?、亞磺酰氨基、磷酰基、膦酸酯基、亞膦酸酯基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)P芳基、-(CH2)P芳烷基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式；Cy代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括多環(huán)基；i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)；且p和n每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等。
在某些實施方案中，Cy′代表取代或未取代的雙環(huán)或雜環(huán)體系，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶等。在某些實施方案中，Cy′直接與X連接。在某些實施方案中，Cy′為單環(huán)芳環(huán)，或者為至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即形成聯(lián)芳體系。在某些實施方案中，Cy′包括兩個取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如相同或不同、直接由一個或多個鍵連接的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如以形成聯(lián)芳環(huán)或雙環(huán)體系。在某些實施方案中，Cy′代表苯并(b)噻吩-2-基，優(yōu)選3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，例如其中所述苯并環(huán)被1-4個選自以下的取代基取代鹵基、硝基、氰基、甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)和乙基(例如包括鹵代乙基，例如CH2CCl3，C2F5等)，優(yōu)選鹵基和甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)。在某些這樣的實施方案中，Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，其中所述苯并環(huán)在4-位(鄰近噻吩環(huán)的3-取代基)、且任選在7-位(“鄰近”噻吩環(huán)的S)被氟取代。
在某些實施方案中，Y在所有位置上都不存在。在其中某個位置上存在Y的實施方案中，在相鄰的Mi中，如果i＝0將導致存在的兩個Y直接連接，或者存在的一個Y直接與N連接，則在相鄰的Mi中i優(yōu)選代表1-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
在某些實施方案中，R代表H或低級烷基，例如H或Me。
在某些實施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，即包括至少一個sp3雜化原子，最好是多個sp3雜化原子。在某些實施方案中，Cy直接與N連接。在某些實施方案中，Cy為5-7元環(huán)。在其中Cy為直接與N連接的6元環(huán)并且在所述環(huán)相對于N的4位上帶有一個氨基取代基的實施方案中，所述N和胺取代基可以在所述環(huán)上以反式排列。
在某些實施方案中，R1和R2只要化合價允許則獨立代表與其連接的環(huán)上的0-5個選自以下的取代基鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、磺?；?、亞磺酰基、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺?；?、亞磺酰氨基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式。
在某些實施方案中，可用于本發(fā)明的化合物可以由通式(V)表示 式V其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Cy′代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，包括多環(huán)；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和任選被1-2個諸如低級烷基、鏈烯基或鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)，例如與N一起可形成4-8元環(huán)；R1和R2只要化合價允許則獨立代表與其連接的環(huán)上的0-5個選自以下的取代基鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、酰胺基、脒基、氰基、硝基、羥基、疊氮基、磺?；?、亞磺酰基、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺?；喕酋０被?、磷?；?、膦酸酯基、亞膦酸酯基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)P芳基、-(CH2)P芳烷基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式；Cy′代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括多環(huán)基；j每次出現(xiàn)時獨立代表0-10的整數(shù)，最好是2-7的整數(shù)；i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)；且p和n每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等。
在某些實施方案中，Cy′代表取代或未取代的雙環(huán)或雜環(huán)體系，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶等。在某些實施方案中，Cy′直接與X連接。在某些實施方案中，Cy′為單環(huán)芳環(huán)，或者為至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即形成聯(lián)芳體系。在某些實施方案中，Cy′包括兩個取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如相同或不同、直接由一個或多個鍵連接的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如以形成聯(lián)芳環(huán)或雙環(huán)體系。在某些實施方案中，Cy′代表苯并(b)噻吩-2-基，優(yōu)選3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，例如其中所述苯并環(huán)被1-4個選自以下的取代基取代鹵基、硝基、氰基、甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)和乙基(例如包括鹵代乙基，例如CH2CCl3，C2F5等)，優(yōu)選鹵基和甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)。在某些這樣的實施方案中，Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩基，其中所述苯并環(huán)在4-位(鄰近噻吩環(huán)的3-取代基)、且任選在7-位(“鄰近”噻吩環(huán)的S)被氟取代。
在某些實施方案中，Y在所有位置上都不存在。在其中某個位置上存在Y的實施方案中，在相鄰的Mi中，如果i＝0將導致存在的兩個Y直接連接，或者存在的一個Y直接與N或NR2連接，則在相鄰的Mi中i優(yōu)選代表1-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
在某些實施方案中，NR2代表分別被一個或兩個低級烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，最好是伯胺或仲胺。
在某些實施方案中，R代表H或低級烷基，例如H或Me。
在某些實施方案中，R1和R2只要化合價允許則獨立代表與其連接的環(huán)上的0-5個選自以下的取代基鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、磺酰基、亞磺?；⒘蛩狨セ⒒撬狨セ?、氨磺酰基、亞磺酰氨基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式。
在某些實施方案中，可用于本發(fā)明的化合物可以由通式(VI)表示 式VI其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Cy′代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，包括多環(huán)；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和任選被1-2個諸如低級烷基、鏈烯基或鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)，例如與N一起可形成4-8元環(huán)；Cy代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括多環(huán)基；R1和R2只要化合價允許則獨立代表與其連接的環(huán)上的0-5個選自以下的取代基鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、酰胺基、脒基、氰基、硝基、羥基、疊氮基、磺?；喕酋；?、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺酰基、亞磺酰氨基、磷?；?、膦酸酯基、亞膦酸酯基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)P芳基、-(CH2)P芳烷基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式；i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)；且n和p每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等。
在某些實施方案中，Cy′代表取代或未取代的雙環(huán)或雜芳環(huán)體系，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶基等。在某些實施方案中，Cy′直接與X連接。在某些實施方案中，Cy′為單環(huán)芳環(huán)，或者為至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即形成聯(lián)芳體系。在某些實施方案中，Cy′包括兩個取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如相同或不同、直接由一個或多個鍵連接的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如以形成聯(lián)芳環(huán)或雙環(huán)體系。在某些實施方案中，Cy′代表苯并(b)噻吩-2-基，優(yōu)選3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，例如其中所述苯并環(huán)被1-4個選自以下的取代基取代鹵基、硝基、氰基、甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)和乙基(例如包括鹵代乙基，例如CH2CCl3，C2F5等)，優(yōu)選鹵基和甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)。在某些這樣的實施方案中，Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，其中所述苯并環(huán)在4-位(鄰近噻吩環(huán)的3-取代基)、且任選在7-位(“鄰近”噻吩環(huán)的S)被氟取代。
在某些實施方案中，Y在所有位置上都不存在。在其中某個位置上存在Y的實施方案中，在相鄰的Mi中，如果i＝0將導致存在的兩個Y直接連接，或者存在的一個Y直接與N或NR2連接，則在相鄰的Mi中i優(yōu)選代表1-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
在某些實施方案中，NR2代表分別被一個或兩個低級烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，最好是伯胺。
在某些實施方案中，R代表H或低級烷基，例如H或Me。
在某些實施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，即包括至少一個sp3雜化原子，最好是多個sp3雜化原子。在某些實施方案中，Cy直接與N連接和/或直接與NR2連接。在某些實施方案中，Cy為5-7元環(huán)。在其中Cy為直接與N連接的6元環(huán)并且在所述環(huán)相對于N的4位上帶有一個氨基取代基的實施方案中，所述N和胺取代基可以在所述環(huán)上以反式排列。
在某些實施方案中，R1和R2只要化合價允許則獨立代表與其連接的環(huán)上的0-5個選自以下的取代基鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、磺?；喕酋；?、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺?；?、亞磺酰氨基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式。
在某些實施方案中，本發(fā)明主題化合物具有以下式VII的結構
式VII其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Cy代表取代或未取代的雜環(huán)基或環(huán)烷基；Cy′為取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，包括多環(huán)；W為O或S；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)，例如與N一起可形成4-8元環(huán)；R1和R2只要化合價允許則獨立代表與其連接的環(huán)上的0-5個選自以下的取代基鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、酰胺基、脒基、氰基、硝基、羥基、疊氮基、磺酰基、亞磺酰基、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺?；?、亞磺酰氨基、磷?；㈧⑺狨セ?、亞膦酸酯基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)P芳基、-(CH2)P芳烷基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式；n和p每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，Cy′代表取代或未取代的雙環(huán)或雜芳環(huán)體系，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶基等。在某些其它的實施方案中，Cy′代表芳環(huán)或至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即以形成聯(lián)芳環(huán)體系。在某些實施方案中，Cy′代表苯并(b)噻吩-2-基，優(yōu)選3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，例如其中所述苯并環(huán)被1-4個選自以下的取代基取代鹵基、硝基、氰基、甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)和乙基(例如包括鹵代乙基，例如CH2CCl3，C2F5等)，優(yōu)選鹵基和甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)。在某些這樣的實施方案中，Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，其中所述苯并環(huán)在4-位(鄰近噻吩環(huán)的3-取代基)、且任選在7-位(“鄰近”噻吩環(huán)的S)被氟取代。
在某些實施方案中，NR2代表分別被一個或兩個低級烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，最好是伯胺或仲胺。
在某些實施方案中，Cy代表取代或未取代的飽和碳環(huán)或雜環(huán)，即由多個sp3雜化原子組成的碳環(huán)或雜環(huán)。在某些實施方案中，Cy為5-7元環(huán)。在其中Cy為直接與N連接的6元環(huán)并且在所述環(huán)相對于N的4位上帶有一個氨基取代基的實施方案中，所述N和胺取代基可以在所述環(huán)上以反式排列。
在某些實施方案中，R1和R2只要化合價允許則獨立代表與其連接的環(huán)上的0-5個選自以下的取代基鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、磺酰基、亞磺酰基、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺酰基、亞磺酰氨基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式。
在某些實施方案中，本發(fā)明主題化合物具有以下式VIII的結構
式VIII其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則U代表取代或未取代的、與含氮環(huán)稠合的芳環(huán)或雜芳環(huán)；V代表低級亞烷基，例如亞甲基、1，2-亞乙基、1，1-亞乙基、1，1-亞丙基、1，2-亞丙基、1，3-亞丙基等；W代表S或O，最好是O；X代表C＝O、C＝S或SO2；R3代表取代或未取代的芳基、雜芳基、低級烷基、低級鏈烯基、低級鏈炔基、碳環(huán)基、碳環(huán)基烷基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、芳烷基或雜芳烷基；R4代表取代或未取代的芳烷基或低級烷基，例如苯乙基、芐基或氨基烷基等；R5代表取代或未取代的芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基，包括多環(huán)芳基或雜芳基。
在某些實施方案中，U代表與含氮環(huán)稠合的苯環(huán)。
在某些實施方案中，R3選自取代或未取代的芳基、雜芳基、低級烷基、低級鏈烯基、芳烷基和雜芳烷基。
在某些實施方案中，R4為未取代的低級烷基，或者為被仲胺或叔胺取代的低級烷基。
在某些實施方案中，R5選自取代或未取代的苯基或萘基，或者為二芳基烷基，例如2，2-二苯基乙基、二苯基甲基等。
在某些實施方案中，本發(fā)明主題化合物包括由通式(IX)表示的化合物
式IX其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Ar代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)；Z不存在，或者代表取代或未取代的芳環(huán)、碳環(huán)、雜環(huán)或雜芳環(huán)，或者代表低級烷基、硝基、氰基或鹵基取代基；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-，條件是如果Z不是環(huán)，則與Z連接的Y不存在；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和任選被1-2個諸如低級烷基、鏈烯基或鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、碳環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜環(huán)基烷基、碳環(huán)基烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)，例如與N一起可形成4-8元環(huán)；Cy和Cy′獨立代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括多環(huán)基；i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)；且k代表0-3的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等。在某些實施方案中，i每次出現(xiàn)時代表0，只是在排列順序N-Mi-Y-Ar中例外，其中i代表1。
在某些實施方案中，Ar和X獨立代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，或者被一個或多個任選包含雜原子(例如O、N和S)的基團取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)。在某些實施方案中，Ar代表苯環(huán)。在某些實施方案中，Ar中至少一個代表雜芳環(huán)，例如吡啶環(huán)、噻唑環(huán)、噻吩環(huán)、嘧啶環(huán)、呋喃環(huán)等。在某些實施方案中，與Ar連接的Y出現(xiàn)時以間位和/或1，3-位排列。
在某些實施方案中，Y在所有位置上都不存在。在某些實施方案中，Y的唯一一次出現(xiàn)與Mk連接。在其中某個位置上存在Y的實施方案中，在相鄰的Mi/k中，如果i/k＝0將導致存在的兩個Y直接相互連接，或者存在的一個Y直接與N連接，則在相鄰的Mi/k中i或k優(yōu)選代表2。在某些實施方案中，如果Y的兩次出現(xiàn)與M連接，則Y的至少一次這樣的出現(xiàn)不存在。在某些實施方案中，存在不多于兩次出現(xiàn)的Y。
在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的芳基或雜芳基。在某些實施方案中，Cy′直接與X連接。在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的雙環(huán)或雜芳環(huán)，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶等。在某些實施方案中，Cy′為單環(huán)芳環(huán)，或者為至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即形成聯(lián)芳體系。在某些實施方案中，Cy′包括兩個取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如相同或不同、直接由一個或多個鍵連接的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如以形成聯(lián)芳環(huán)或雙環(huán)體系。在某些實施方案中，Cy′代表苯并(b)噻吩-2-基，優(yōu)選3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，例如其中所述苯并環(huán)被1-4個選自以下的取代基取代鹵基、硝基、氰基、甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)和乙基(例如包括鹵代乙基，例如CH2CCl3，C2F5等)，優(yōu)選鹵基和甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)。在某些這樣的實施方案中，Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，其中所述苯并環(huán)在4-位(鄰近噻吩環(huán)的3-取代基)、且任選在7-位(“鄰近”噻吩環(huán)的S)被氟取代。
在某些實施方案中，X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
在某些實施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，即包括至少一個sp3雜化原子，最好是多個sp3雜化原子。在某些實施方案中，Cy在所述環(huán)中或所述環(huán)的取代基上包含一個氨基，例如Cy為吡啶基、咪唑基、吡咯基、哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基等，和/或帶有一個氨基取代基。在某些實施方案中，Cy為5-7元環(huán)。在某些實施方案中，Cy直接與N連接。在其中Cy為直接與N連接的6元環(huán)并且在所述環(huán)相對于N的4位上帶有一個氨基取代基的實施方案中，所述N和胺取代基可以在所述環(huán)上以反式排列。
在某些實施方案中，Ar或Z(其中Z為芳環(huán)或雜芳環(huán))上的取代基選自鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、疊氮基、磺?；?、亞磺酰基、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺?；喕酋０被?、磷?；㈧⑺狨セ?、亞膦酸酯基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)P芳基、-(CH2)P芳烷基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式，其中n和p每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，Z直接與Ar連接，或者通過一個或兩個原子鏈與Ar連接。在某些實施方案中，Z-Y-M不存在。
在某些實施方案中，可用于本發(fā)明的化合物可以由通式(X)表示 式X其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Ar代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)；Z不存在，或者代表取代或未取代的芳環(huán)、碳環(huán)、雜環(huán)或雜芳環(huán)，或者代表低級烷基、硝基、氰基或鹵基取代基；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-，條件是如果Z不為環(huán)，則不存在與Z連接的Y；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和任選被1-2個諸如低級烷基、鏈烯基或鏈炔基的基團取代的亞甲基；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、碳環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜環(huán)基烷基、碳環(huán)基烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)，例如可與N形成形成4-8元環(huán)；Cy′代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括多環(huán)基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔，其中在Mj中，M有時或每次出現(xiàn)時都構成完整的環(huán)結構或其一部分；
j每次出現(xiàn)時獨立代表2-10的整數(shù)，最好是2-7的整數(shù)；i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)；且k代表0-3的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，NR2代表分別被一個或兩個低級烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，最好是伯胺或仲胺。
在某些實施方案中，M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等。在某些實施方案中，i每次出現(xiàn)時代表0，只是在排列順序N-Mi-Y-Ar中例外，其中i代表1。
在某些實施方案中，Ar和X獨立代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，或者被一個或多個任選包含雜原子(例如O、N和S)的基團取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)。在某些實施方案中，Ar代表苯環(huán)。在某些實施方案中，Ar代表雜芳環(huán)，例如吡啶環(huán)、噻唑環(huán)、噻吩環(huán)、嘧啶環(huán)、呋喃環(huán)等。在某些實施方案中，與Ar連接的Y出現(xiàn)時排列在間位和/或1，3-位上。
在某些實施方案中，Y在所有位置上都不存在。在某些實施方案中，Y的唯一一次出現(xiàn)與Mk連接。在其中某個位置上存在Y的實施方案中，在相鄰的Mi/k中，如果i/k＝0將導致存在的兩個Y直接相互連接，或者存在的一個Y直接與N連接，則在相鄰的Mi/k中i或k優(yōu)選代表2。在某些實施方案中，如果Y的兩次出現(xiàn)與M連接，則Y的至少一次這樣的出現(xiàn)不存在。在某些實施方案中，存在不多于兩次出現(xiàn)的Y。
在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的芳基或雜芳基。在某些實施方案中，Cy′直接與X連接。在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的雙環(huán)或雜芳環(huán)，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶等。在某些實施方案中，Cy′為單環(huán)芳環(huán)，或者為至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即形成聯(lián)芳體系。在某些實施方案中，Cy′包括兩個取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如相同或不同、直接由一個或多個鍵連接的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如以形成聯(lián)芳環(huán)或雙環(huán)體系。在某些實施方案中，Cy′代表苯并(b)噻吩-2-基，優(yōu)選3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，例如其中所述苯并環(huán)被1-4個選自以下的取代基取代鹵基、硝基、氰基、甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)和乙基(例如包括鹵代乙基，例如CH2CCl3，C2F5等)，優(yōu)選鹵基和甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)。在某些這樣的實施方案中，Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，其中所述苯并環(huán)在4-位(鄰近噻吩環(huán)的3-取代基)、且任選在7-位(“鄰近”噻吩環(huán)的S)被氟取代。
在某些實施方案中，X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
在某些實施方案中，Ar或Z(其中Z為芳環(huán)或雜芳環(huán))上的取代基選自鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、疊氮基、磺?；喕酋；?、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺?；?、亞磺酰氨基、磷?；?、膦酸酯基、亞膦酸酯基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)P芳基、-(CH2)P芳烷基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式，其中n和p每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，Z直接與Ar連接，或者通過一個或兩個原子鏈與Ar連接。在某些實施方案中，Z-Y-M不存在。
在某些實施方案中，可用于本發(fā)明的化合物可以由通式(XI)表示
式XI其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Ar代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)；Z不存在，或者代表取代或未取代的芳環(huán)、碳環(huán)、雜環(huán)或雜芳環(huán)，或者代表低級烷基、硝基、氰基或鹵基取代基；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-，條件是如果Z不為環(huán)，則不存在與Z連接的Y；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(NCN)-、-P(＝O)(OR)-和任選被1-2個諸如低級烷基、鏈烯基或鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、碳環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜環(huán)基烷基、碳環(huán)基烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)，例如可與N形成形成4-8元環(huán)；Cy和Cy′獨立代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括多環(huán)基；
i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)；且k代表0-3的整數(shù)，最好是0-2的整數(shù)。
在某些實施方案中，NR2代表分別被一個或兩個低級烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，最好是伯胺或仲胺。
在某些實施方案中，M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等。
在某些實施方案中，Ar和Z獨立代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，或者被一個或多個任選包含雜原子(例如O、N和S)的基團取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)。在某些實施方案中，Ar和Z中至少一個代表苯環(huán)。在某些實施方案中，Ar和Z中至少一個代表雜芳環(huán)，例如吡啶環(huán)、噻唑環(huán)、噻吩環(huán)、嘧啶環(huán)、呋喃環(huán)等。在某些實施方案中，與Ar連接的Y出現(xiàn)時排列在間位和/或1，3-位上。
在某些實施方案中，Y在所有位置上都不存在。在某些實施方案中，Y的唯一一次出現(xiàn)與Mk連接。在其中某個位置上存在Y的實施方案中，在相鄰的Mi/k中，如果i/k＝0將導致存在的兩個Y直接相互連接，或者存在的一個Y直接與N連接，則在相鄰的Mi/k中i或k優(yōu)選代表2。在某些實施方案中，如果Y的兩次出現(xiàn)與M連接，則Y的至少一次這樣的出現(xiàn)不存在。在某些實施方案中，存在不多于兩次出現(xiàn)的Y。
在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的芳基或雜芳基。在某些實施方案中，Cy′直接與X連接。在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的雙環(huán)或雜芳環(huán)，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶等。在某些實施方案中，Cy′為單環(huán)芳環(huán)，或者為至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即形成聯(lián)芳體系。在某些實施方案中，Cy′包括兩個取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如相同或不同、直接由一個或多個鍵連接的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如以形成聯(lián)芳環(huán)或雙環(huán)體系。在某些實施方案中，Cy′代表苯并(b)噻吩-2-基，優(yōu)選3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，例如其中所述苯并環(huán)被1-4個選自以下的取代基取代鹵基、硝基、氰基、甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)和乙基(例如包括鹵代乙基，例如CH2CCl3，C2F5等)，優(yōu)選鹵基和甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)。在某些這樣的實施方案中，Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，其中所述苯并環(huán)在4-位(鄰近噻吩環(huán)的3-取代基)、且任選在7-位(“鄰近”噻吩環(huán)的S)被氟取代。
在某些實施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，即包括至少一個sp3雜化原子，最好是多個sp3雜化原子。在某些實施方案中，Cy為5-7元環(huán)。在某些實施方案中，Cy直接與N連接和/或與NR2連接。在其中Cy為直接與N連接的6元環(huán)并且在所述環(huán)相對于N的4位上帶有一個氨基取代基的實施方案中，所述N和胺取代基可以在所述環(huán)上以反式排列。
在某些實施方案中，X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
在某些實施方案中，Ar或Z(其中Z為芳環(huán)或雜芳環(huán))上的取代基選自鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、疊氮基、磺?；?、亞磺?；?、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺酰基、亞磺酰氨基、磷?；?、膦酸酯基、亞膦酸酯基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)P芳基、-(CH2)P芳烷基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式，其中n和p每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，Z直接與Ar連接，或者通過一個或兩個原子鏈與Ar連接。在某些實施方案中，Z-Y-M不存在。
在某些實施方案中，可用于本發(fā)明的化合物可以由通式(XII)表示 式XII其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Ar代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)；Z不存在，或者代表取代或未取代的芳環(huán)、碳環(huán)、雜環(huán)或雜芳環(huán)，或者代表低級烷基、硝基、氰基或鹵基取代基；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-，條件是如果Z不為環(huán)，則不存在與Z連接的Y；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和任選被1-2個諸如低級烷基、鏈烯基或鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、碳環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜環(huán)基烷基、碳環(huán)基烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基；Cy和Cy′獨立代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括多環(huán)基；且k代表0-1的整數(shù)。
在某些實施方案中，NR2代表分別被一個或兩個低級烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，優(yōu)選伯胺或仲胺，最優(yōu)選仲胺。
在某些實施方案中，M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-等。
在某些實施方案中，Y在所有位置上都不存在。在某些實施方案中，在Y與Mk相鄰的情況下，或者Y不存在，或者k＝0。在某些實施方案中，對于與Cy連接的Mk出現(xiàn)至少一次，k＝0，對于任選出現(xiàn)兩次也是如此。在某些實施方案中，對于與Ar和N連接的Mk，k＝1。
在某些實施方案中，Ar和Z獨立代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，或者被一個或多個任選包含雜原子(例如O、N和S)的基團取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)。在某些實施方案中，Ar和Z中至少一個代表苯環(huán)。在某些實施方案中，Ar和Z中至少一個代表雜芳環(huán)，例如吡啶環(huán)、噻唑環(huán)、噻吩環(huán)、嘧啶環(huán)、呋喃環(huán)等。在某些實施方案中，與Ar連接的Mk出現(xiàn)時排列在間位和/或1，3-位上。
在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的芳基或雜芳基。在某些實施方案中，Cy′直接與X連接。在某些實施方案中，Cy′為取代或未取代的雙環(huán)或雜芳環(huán)，最好是既為雙環(huán)又為雜芳環(huán)，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶等。在某些實施方案中，Cy′為單環(huán)芳環(huán)，或者為至少被取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)取代的雜芳環(huán)，即形成聯(lián)芳體系。在某些實施方案中，Cy′包括兩個取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如相同或不同、直接由一個或多個鍵連接的芳環(huán)或雜芳環(huán)，例如以形成聯(lián)芳環(huán)或雙環(huán)體系。在某些實施方案中，Cy′代表苯并(b)噻吩-2-基，優(yōu)選3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，例如其中所述苯并環(huán)被1-4個選自以下的取代基取代鹵基、硝基、氰基、甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)和乙基(例如包括鹵代乙基，例如CH2CCl3，C2F5等)，優(yōu)選鹵基和甲基(例如包括鹵代甲基，例如CHCl2和CF3)。在某些這樣的實施方案中，Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，其中所述苯并環(huán)在4-位(鄰近噻吩環(huán)的3-取代基)、且任選在7-位(“鄰近”噻吩環(huán)的S)被氟取代。
在某些實施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，即包括至少一個sp3雜化原子，最好是多個sp3雜化原子。在某些實施方案中，Cy為5-7元環(huán)。在某些實施方案中，Cy直接與N連接和/或與NR2連接。在其中Cy為直接與N連接的6元環(huán)并且在所述環(huán)相對于N的4位上帶有一個氨基取代基的實施方案中，所述N和氨基取代基可以在所述環(huán)上以反式排列。
在某些實施方案中，X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
在某些實施方案中，Ar或Z(其中Z為芳環(huán)或雜芳環(huán))上的取代基選自鹵基、低級烷基、低級鏈烯基、芳基、雜芳基、羰基、硫代羰基、酮基、醛基、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羥基、磺?；?、亞磺?；⒘蛩狨セ⒒撬狨セ?、氨磺酰基、亞磺酰氨基、-(CH2)P烷基、-(CH2)P鏈烯基、-(CH2)P鏈炔基、-(CH2)POH、-(CH2)PO-低級烷基、-(CH2)PO-低級鏈烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)PSH、-(CH2)PS-低級烷基、-(CH2)PS-低級鏈烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)PN(R)2、-(CH2)PNR-低級烷基、-(CH2)PNR-低級鏈烯基、-NR(CH2)nR和上述基團的被護形式，其中n和p每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)，最好是0-5的整數(shù)。
在某些實施方案中，Z直接與Ar連接，或者通過一個或兩個原子鏈與Ar連接。在某些實施方案中，Z-Y-M不存在。
在某些實施方案中，本發(fā)明主題激動劑可以根據(jù)其對于hedgehog途徑的選擇性進行選擇。這種選擇性可以是針對所述hedgehog途徑的，而不是針對其它途徑的，或者是針對特定hedgehog途徑(例如ptc-1，ptc-2等)之間的選擇性。
在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明主題激動劑調節(jié)ptc-smo介導的信號轉導的ED50為1mM或更低，更優(yōu)選為1μM或更低，甚至更優(yōu)選為1nM或更低。對于hedgehog依賴性激動劑，本發(fā)明主題激動劑使hedgehog的活性增加10倍、100倍或甚至1000倍。
在具體的實施方案中，所述小分子根據(jù)用途進行選擇，因為它對一種patched同種型比對另一種patched同種型更具選擇性，例如對一種patched途徑(ptc-1，ptc-2)比對另一種patched途徑的選擇性高10倍，更優(yōu)選高至少100倍，或者甚至高1000倍。
在某些實施方案中，對作為hedgehog途徑激動劑的化合物進行選擇，以超過除PKA以外的蛋白激酶(例如PKC)選擇性地激活hedgehog活性，例如所述化合物調節(jié)PKA/hedgehog途徑的活性要比其調節(jié)其它蛋白激酶的活性高至少一個數(shù)量級，優(yōu)選高至少兩個數(shù)量級，甚至更優(yōu)選高至少三個數(shù)量級。因此，例如，hedgehog途徑的優(yōu)選激活劑可以激活hedgehog活性的Ki要比其激活PKC的Ki低至少一個數(shù)量級，優(yōu)選低至少兩個數(shù)量級，甚至更優(yōu)選低至少三個數(shù)量級。在某些實施方案中，PKA/hedgehog激活的Ki小于10nM，優(yōu)選小于1nM，甚至更優(yōu)選小于0.1nM。
本發(fā)明主題化合物的合成本發(fā)明的化合物可以容易地通過有機合成的標準技術來制備，例如依照下面實施例部分中敘述的實施例來制備。例如，可以通過使如下所示命名為A的一種化合物或一對化合物與如下所示命名為B的一種化合物或一對化合物以及命名為C的一種化合物反應，制備本發(fā)明主題化合物，
同樣，可以使以上命名為C的一種化合物與以下命名為D的一種化合物或一對化合物以及以下命名為E的一種化合物或一對化合物反應，
或者，可以使以上命名為A的一種化合物或一對化合物以及以上命名為E的一種化合物或一對化合物與以下命名為F的一種化合物反應， 優(yōu)選如上所示的化合物的組合相互連續(xù)反應，例如使兩種化合物一起反應，使產(chǎn)物與第三種化合物反應等等，并且所述化合物一般可以以任何順序連續(xù)進行偶聯(lián)，這是本領域技術人員知道的。在某些實施方案中，一種或多種化合物上的官能團在一個或多個反應過程中可能需要保護，這是本領域眾所周知的，并且為此可以使用任何合適的保護基。對于具體官能團和具體反應，本領域技術人員可以容易地選擇出合適的保護基?？梢噪S時進行加工步驟，以修飾反應產(chǎn)物上的官能團或部分，例如通過親核取代、還原性烷基化或任何其它合適的方法，例如以將N(R)2＝NH2轉變成N(R)2＝NHR。
在以上命名為A-F的化合物中，元件M、X、Y、Z、Cy、Cy′、Ar、i、k、R等如上定義(正如可由下文所概述的)，而R′每次出現(xiàn)時獨立代表H、保護基或不穩(wěn)定反應性基團，例如三烷基甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基)，且R″每次出現(xiàn)時獨立代表1)離去基團，例如鹵素(例如F、Cl、Br或I)、烷硫基、氰基、烷氧基或當與X連接時能夠被胺親核試劑置換的任何其它基團，2)可活化基團，例如OH，它可以被以下活化劑激活例如碳二亞胺(例如二異丙基碳二亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺等)、含磷試劑(例如BOP-Cl、PyBROP等)、草酰氯、光氣、三光氣或任何相似的試劑，以產(chǎn)生相對于其中R″＝OH的化合物，其針對與胺偶聯(lián)的、敏感性增加的反應性中間體，或3)X和R″結合在一起代表能夠與胺反應的親電子基團，例如異氰酸酯、異硫氰酸酯或其它類似的反應性部分。
各種命名為A-F的亞單位可以采用本領域技術人員熟知的多種反應中的任一種進行混合，而且取決于待偶聯(lián)的具體部分。例如，如在亞單位A-F上標出的NH2基團之一的胺可以通過以下反應與烷基進行偶聯(lián)還原性烷基化(例如最后出現(xiàn)的M為醛)、離去基團的親核置換(例如鹵基、磺酸酯基或其它合適的取代基)、環(huán)氧化物的親核開環(huán)或者本領域技術人員已知的任何其它合適的反應。同樣，胺可以與活化羧酸衍生物或硫代羧酸衍生物進行偶聯(lián)，例如，從羧酸或硫代羧酸以及活化劑原位制備，或者制備為分離的化合物，例如異氰酸酯、羧酸氯化物等，以提供酰胺、脲、硫脲、硫代酰胺等；與氯甲酸酯、磺酰氯或其它這類化合物反應來提供尿烷、氨磺酰等；或者同與胺形成共價鍵的其它親電子試劑反應。
芳環(huán)和/或雜芳環(huán)可以容易地直接使用Stille、Suzuki或其它相關反應例如鈀介導的交叉偶聯(lián)反應進行偶聯(lián)。芳環(huán)和/或雜芳環(huán)可以容易地使用以下反應通過雜原子進行偶聯(lián)例如使用各種反應例如Ullman反應、由S.Buchwald等開發(fā)的各種鈀介導的反應之一、通過親核芳族取代或其它這類反應。同樣，采用由S.Buchwald等開發(fā)的鈀介導的反應、親核芳族取代等，可以使胺、醇、硫醇和其它這類帶有雜原子的化合物與芳環(huán)和/或雜芳環(huán)進行偶聯(lián)。對本領域技術人員而言顯而易見的是，通過Stille、Suzuki、Heck、Friedel-Crafts反應和其它反應，可以制備通過取代或未取代的烴鏈連接的芳環(huán)和/或雜芳環(huán)。
可能可以用來制備本發(fā)明化合物的多種通用合成反應在下文有更詳細的描述并且示于圖1-31。在不偏離以上概述的通用合成方法的情況下，以上命名為A-F的亞單位中包括的可變基團可以改變以符合式I-VIII和式X-XII中的任一個。
同樣，本發(fā)明的化合物可以通過使合適的部分與部分裝配的結構進行偶聯(lián)來制備。例如，可以通過以下方案所示的步驟I-VI中的任一步驟，來制備式XI化合物。
同樣，可以通過以下方案中的任一步驟，來制備式X化合物。
以此類推，可以通過以下方案中敘述的任一步驟，來制備式XII化合物。
在以上方案中，M、Cy、Ar、X、Cy′、Y、Z、R、i、k、R′和R″對應于其以上應用，并且可以在如式X-XII描述中所敘述的更窄范圍內(nèi)定義，或者對應于式I-VIII的元件，任選如式I-VIII所附描述進行改進。
適合進行步驟I的反應包括由S.Buchwald等開發(fā)的各種鈀介導的反應、親核芳族取代、氧化性偶聯(lián)等。
適合進行步驟II的反應包括M上離去基團的親核置換、還原性烷基化、胺與以下基團的反應親電子羧酸/硫代羧酸衍生物(酰基氯、異氰酸酯、異硫氰酸酯或由BOP-Cl、PyBrOP、碳二亞胺或其它活化劑(例如肽偶聯(lián)領域中常用的)活化的羧酸，或者其它類似的反應，包括圖1-31中某些圖詳細描述的反應和下文所附的描述中的反應，或者在不存在M和Y的情況下的那些反應，使用由Buchwald等開發(fā)的鈀介導的反應。
適合進行步驟III或IV的反應包括Y-R′與親電子羰基或磺?；苌?X-R″＝?；?、異氰酸酯、異硫氰酸酯，氯甲酸酯，磺酰氯或由BOP-Cl、PyBrOP、碳二亞胺或其它活化劑(例如肽偶聯(lián)領域中常用的)活化的酸)的反應，或者其它類似的反應，例如圖1-31中某些圖詳細描述和下文所附的描述中的那些反應。
適合進行步驟V的反應包括離去基團的親核置換、還原性烷基化、胺與以下基團的反應親電子羧酸/硫代羧酸衍生物(?；取惽杷狨?、異硫氰酸酯或由BOP-Cl、PyBrOP、碳二亞胺或其它活化劑(例如肽偶聯(lián)領域中常用的)活化的羧酸)，或者其它類似的反應，包括圖1-31中某些圖詳細描述和下文所附的描述中的那些反應。
適合進行步驟VI的反應包括離去基團的親核置換、還原性烷基化、胺與以下基團的反應親電子羧酸/硫代羧酸衍生物(?；取惲蚯杷狨?、異氰酸酯或由BOP-Cl、PyBrOP、碳二亞胺或其它活化劑(例如肽偶聯(lián)領域中常用的)活化的羧酸)，或者其它類似的反應，包括圖1-31中某些圖詳細描述和下文所附的描述中的那些反應。
適合進行其中Y與所出現(xiàn)的M偶聯(lián)的步驟VII的反應包括離去基團的親核置換、還原性烷基化、胺與以下基團的反應親電子羧酸/硫代羧酸衍生物(酰基氯、異氰酸酯、異硫氰酸酯或由BOP-Cl、PyBrOP、碳二亞胺或其它活化劑(例如肽偶聯(lián)領域中常用的)活化的羧酸，或者其它類似的反應，包括圖1-31中某些圖詳細描述和下文所附的描述的那些反應。在其中M不出現(xiàn)的實施方案中，合適的偶聯(lián)反應包括由S.Buchwald等開發(fā)的鈀介導的反應、親核芳族取代、氧化性偶聯(lián)等。在其中M和Y不存在且Z代表芳環(huán)或雜芳環(huán)的實施方案中，合適的反應包括Stille、Suzuki和適合形成聯(lián)芳體系的其它反應。
本發(fā)明的方法還包括使式I-VII中任一個的化合物在以下條件下反應其中NR2中至少一個R代表H，在使該化合物轉變成同一結構式的化合物的條件下，其中相應出現(xiàn)的R代表低級烷基。例如，可以使用與醛和還原劑的還原性烷基化、與烷基鹵例如MeI的親核烷基化或其它類似的反應。在某些實施方案中，這樣的反應可以通過甲硅烷基化的(例如R＝SiMe3)中間體進行。
本領域技術人員將會容易地認識到，本發(fā)明的化合物適合于依照本領域熟知的各種各樣的方案來合成，除了本文描述的方案外，所有其它方案計劃都屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。
IV.方法和組合物的示例性應用本發(fā)明的另一方面涉及一種調節(jié)細胞的分化狀態(tài)、存活和/或增殖的方法，即依照本發(fā)明主題方法并且在環(huán)境可以保證的情況下，使所述細胞與hedgehog激動劑接觸。
例如，本發(fā)明考慮了根據(jù)這樣的發(fā)現(xiàn)hedgehog、ptc和smoothened明顯廣泛參與形成脊椎動物體內(nèi)分化組織的有序空間排列，本發(fā)明主題方法可用作在體外和體內(nèi)產(chǎn)生和/或保持一系列不同脊椎動物組織的方法的一部分。所述hedgehog激動劑，就給定組織的增殖或分化而論，無論是誘導型還是抗誘導型的，都可以適當時作為上述任一種制劑。
例如，本發(fā)明方法適用于細胞培養(yǎng)技術。已經(jīng)證明，體外神經(jīng)元培養(yǎng)系統(tǒng)對于研究神經(jīng)發(fā)育以及鑒定神經(jīng)營養(yǎng)因子例如神經(jīng)生長因子(NGF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)和腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是基礎的和必不可少的工具。本發(fā)明的一種用途可以是神經(jīng)元干細胞培養(yǎng)物，例如使用這類培養(yǎng)物產(chǎn)生新神經(jīng)元和神經(jīng)膠質。在本發(fā)明主題方法的這些實施方案中，可以使培養(yǎng)細胞與本發(fā)明的hedgehog激動劑接觸，以便改變培養(yǎng)物中的神經(jīng)元干細胞的增殖速率和/或改變分化率，或者保持某些終末分化神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物的完整性。在一個示例性的實施方案中，本發(fā)明主題方法可用于培養(yǎng)例如感覺神經(jīng)元或者運動神經(jīng)元。這樣的神經(jīng)元培養(yǎng)物可用作常規(guī)測定系統(tǒng)以及用于治療性治療的可植入細胞源。
依照本發(fā)明，大量非致瘤性神經(jīng)祖細胞可以在體外無限增殖，并且其增殖速率和/或分化率可由于所述細胞與本發(fā)明的hedgehog激動劑接觸而受到影響。一般而言，提供一種包括下述步驟的方法從動物中分離出神經(jīng)祖細胞，使這些細胞在體外或體內(nèi)無限增殖，優(yōu)選在生長因子存在下使這些細胞無限增殖，然后調節(jié)這些細胞，使其分化成特定的神經(jīng)表型，例如神經(jīng)元和神經(jīng)膠質，即通過使所述細胞與hedgehog激動劑接觸。
人們認為祖細胞是在緊張性抑制影響之下，這保持所述祖細胞處于抑制狀態(tài)，直到其需要分化為止。然而，已提供了允許這些細胞增殖的最新技術，而且與終末分化并因此是不分裂的神經(jīng)元不同，它們可以以無限的數(shù)量產(chǎn)生并且特別適合于移植到患有神經(jīng)變性性疾病的異源宿主和自體宿主中。
所謂“祖細胞”是指能夠無限分裂的并且在特定條件下可以產(chǎn)生最終分化成例如神經(jīng)元和神經(jīng)膠質的子細胞的寡潛能干細胞或多潛能干細胞。這些細胞可用于移植到異源宿主或自體宿主體內(nèi)。所謂異源是指所述祖細胞所來源的動物以外的宿主。所謂自體是指與所述細胞所來源的相同的宿主。
細胞可得自任何動物的胚胎、出生后、幼體或成體神經(jīng)組織。所謂任何動物是指含有神經(jīng)組織的任何多細胞動物。更具體地講，是指任何魚、爬行動物、鳥類、兩棲動物或哺乳動物等。最優(yōu)選的供體是哺乳動物，尤其是小鼠和人類。
就異源供體動物而論，可以使所述動物安樂死，采用無菌程序取出腦和感興趣的特定部位。具體的感興趣腦區(qū)包括可以獲得祖細胞的任何部位，所述祖細胞用于恢復宿主腦退化區(qū)的功能。這些區(qū)包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)區(qū)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)區(qū)，其中CNS區(qū)包括大腦皮質、小腦、中腦、腦干、脊髓和腦室組織，而PNS區(qū)包括頸動脈體和腎上腺髓質。更具體地講，這些區(qū)包括由尾狀核和豆狀核組成的基底神經(jīng)節(jié)、最好是紋狀體內(nèi)的區(qū)，或者發(fā)現(xiàn)在早老性癡呆患者中變性的各組細胞，例如蒼白球、底丘腦核、上顎基質核；或者發(fā)現(xiàn)在帕金森病患者中變性的致密黑質部分。
人異源神經(jīng)祖細胞可來源于從選擇流產(chǎn)獲得的胎兒組織或者來源于出生后、幼年或成年器官供體。自體神經(jīng)組織可得自活檢組織，或者可得自經(jīng)歷其中去除神經(jīng)組織的神經(jīng)外科手術的患者，尤其是在癲癇外科手術，更具體地講在顳葉切除術和海馬切除術期間的患者。
通過從組織的連接性胞外基質分離出單個細胞，可以從供體組織中獲得細胞?？梢圆捎萌魏我阎姆椒?，包括用酶例如胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理，或者采用物理分離方法，例如用鈍頭儀器或者用解剖刀切碎，以從組織中獲得特定的細胞類型的生長暈，可以實現(xiàn)分離。胎兒細胞的分離可以在組織培養(yǎng)液中進行，而對于分離幼體和成體細胞的優(yōu)選培養(yǎng)液是人工腦脊髓液(aCSF)。常用的aCSF含有124mM NaCl、5mM KCl、1.3mM MgCl2、2mM CaCl2、26mMNaHCO3和10mM D-葡萄糖。低Ca2+aCSF含有相同的組分，只是MgCl2的濃度為3.2mM，而CaCl2的濃度為0.1mM。
可以將分離的細胞置于能夠支持細胞生長的任何已知培養(yǎng)基(包括MEM、DMEM、RPMI、F-12等)中，所述培養(yǎng)基含有細胞代謝所需的添加劑，例如谷氨酰胺和其它氨基酸、維生素、礦物質和有用的蛋白質例如運鐵蛋白等。培養(yǎng)基也可以含有諸如青霉素、鏈霉素和慶大霉素等抗生素，以防止被酵母、細菌和真菌污染。在某些情況下，所述培養(yǎng)基也可以含有來源于牛、馬、雞等的血清。一種特別優(yōu)選的細胞培養(yǎng)基是DMEM和F-12的混合物。
培養(yǎng)條件應該接近生理條件。培養(yǎng)基的pH應該接近生理pH，優(yōu)選在pH 6-8之間，更優(yōu)選接近pH 7，甚至更特別是大約pH 7.4。應該在接近生理溫度，優(yōu)選在30℃-40℃之間，更優(yōu)選在32℃-38℃之間，最優(yōu)選在35℃-37℃之間，培養(yǎng)細胞。
細胞可以在懸浮液中或固定底物上生長，但祖細胞的增殖最好是在懸浮液中進行，以通過形成“神經(jīng)球(neurosphere)”而產(chǎn)生大量的細胞(參見例如Reynolds等(1992)Science 2551070-1709；和PCT公布號WO93/01275、WO94/09119、WO94/10292和WO94/16718)。就繁殖(或分裂)懸浮細胞而論，將燒瓶充分振蕩，讓神經(jīng)球沉降在瓶底的角落上。然后將該球轉移至50ml離心管中，并低速離心。吸出培養(yǎng)基，將細胞重懸于含生長因子的少量培養(yǎng)基中，機械方法分離細胞，然后將其重懸于單獨的等份培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)基中的細胞懸液補充任何使祖細胞增殖的生長因子，并且接種到能夠支持細胞的任何容器中，盡管如上所述，但是最好是接種到培養(yǎng)瓶或滾瓶中。細胞通常在37℃培養(yǎng)箱中在3-4天內(nèi)增殖，并且增殖可以在任何時間重新啟動，此后分離細胞并將其重懸于含有生長因子的新鮮培養(yǎng)基中。
在不存在底物的情況下，細胞從瓶底向上生長并且在懸液中繼續(xù)增殖，形成未分化細胞的中空球。大約在體外3-10天之后，通過輕輕離心并重懸于含有生長因子的培養(yǎng)基中，每2-7天、更準確地講每2-4天喂養(yǎng)增殖細胞團(神經(jīng)球)。
在體外6-7天后，可以通過用鈍頭儀器、更準確地講用移液管研磨神經(jīng)球，以對神經(jīng)球進行物理分離，可以分離出神經(jīng)球內(nèi)的單個細胞。將來自分離神經(jīng)球的單細胞懸浮于含有生長因子的培養(yǎng)基中，通過在hedgehog激動劑存在下，平板接種(或重懸浮)細胞，可以在培養(yǎng)物中控制細胞的分化。
為了進一步說明本發(fā)明主題hedgehog激動劑的其它用途，注意到大腦內(nèi)的移植已顯露出作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)療法的另一方案。例如，一種修復受損腦組織的方法包括將來自胎兒或新生動物的細胞移植到成體腦中(Dunnett等(1987)J Exp Biol 123265-289；和Freund等(1985)J Neurosci 5603-616)。來自多個腦區(qū)的胎神經(jīng)元可以成功地植入到成體腦中，并且這樣的移植物可以緩解行為缺陷。例如，可以通過胚胎多巴胺能神經(jīng)元的移植物，防止由多巴胺能投射到基底神經(jīng)節(jié)的損傷誘發(fā)的運動疾病。新皮質損傷后減退的綜合認知功能也可通過胚胎皮層細胞移植物得到部分恢復。本發(fā)明主題方法可用于調節(jié)培養(yǎng)物的生長狀態(tài)，或者在使用胎組織、尤其是神經(jīng)元干細胞的情況下，可用于調節(jié)所述干細胞的分化速率。
可用于本發(fā)明的干細胞是眾所周知的。例如，已經(jīng)鑒定出數(shù)種神經(jīng)嵴細胞，其中一些細胞是多潛能的，可能代表未定型神經(jīng)嵴細胞，而另一些細胞只可以產(chǎn)生一種細胞類型，例如感覺神經(jīng)元，可能代表定型祖細胞。本發(fā)明方法中所用的hedgehog激動劑對培養(yǎng)這樣的干細胞的作用可以是調節(jié)未定型祖細胞的分化，或者是調節(jié)對定型祖細胞朝向變成終末分化的神經(jīng)元細胞的發(fā)育命運的進一步限制。例如，本發(fā)明方法可用于在體外調節(jié)神經(jīng)嵴細胞分化成神經(jīng)膠質細胞、許旺細胞、嗜鉻細胞、膽堿能交感或副交感神經(jīng)元以及肽能神經(jīng)元和5-羥色胺能神經(jīng)元。所述hedgehog激動劑可以單獨使用，或者可以與用來更具體地講增強神經(jīng)元祖細胞的具體分化命運的其它神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合使用。
除了在本發(fā)明主題hedgehog激動劑存在下植入培養(yǎng)的細胞外，本發(fā)明的另一方面涉及hedgehog激動劑調節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元和其它神經(jīng)元細胞的生長狀態(tài)的治療性應用。ptc、hedgehog和smoothened在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育期間并且也可能在成體狀態(tài)調節(jié)神經(jīng)元分化的能力說明，在某些情況下，預期本發(fā)明主題hedgehog激動劑可以有利于成體神經(jīng)元對正常細胞的維持、功能表現(xiàn)和衰老的控制；化學或機械損傷細胞中的修復和再生過程；并且治療某些病理病癥的變性。根據(jù)這種理解，本發(fā)明具體考慮了將本發(fā)明主題方法用于來源于下述神經(jīng)病癥的治療方案(預防和/或降低嚴重性)(i)神經(jīng)系統(tǒng)的急性、亞急性或慢性損傷，包括創(chuàng)傷性損傷、化學損傷、血管損傷和缺陷(例如由中風引起的局部缺血)，以及感染/炎癥和腫瘤誘導的損傷；(ii)神經(jīng)系統(tǒng)的衰老，包括早老性癡呆(Alzheimer′s disease)；(iii)神經(jīng)系統(tǒng)的慢性神經(jīng)變性性疾病，包括帕金森病、亨廷頓舞蹈病(Huntington′s chorea)、肌萎縮性側索硬化等以及脊髓小腦變性；和(iv)神經(jīng)系統(tǒng)或影響神經(jīng)系統(tǒng)的慢性免疫性疾病，包括多發(fā)性硬化。例如，就帕金森病的具體病例而論，通過用本發(fā)明主題激動劑增加hedgehog活性的干預可以提高胎兒和成體多巴胺能神經(jīng)元的體內(nèi)存活率，因而可以提供對該疾病的更有效治療。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明主題方法包括給予罹患帕金森病的動物或者處于發(fā)生帕金森病危險之中的動物有效量的hedgehog激動劑，以提高所述動物多巴胺能神經(jīng)元的存活率。
本發(fā)明的方法適用于細胞培養(yǎng)技術。已經(jīng)證明，體外神經(jīng)元培養(yǎng)系統(tǒng)對于研究神經(jīng)發(fā)育以及鑒定神經(jīng)營養(yǎng)因子例如神經(jīng)生長因子(NGF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)和腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是基礎的和必不可少的工具。一旦神經(jīng)元細胞已變成終末分化的，則它通常將不會變成另一種終末分化的細胞類型。然而，盡管如此神經(jīng)元細胞容易喪失其分化狀態(tài)。當它們在來自成體組織的培養(yǎng)物中生長時以及當它們在再生期間形成胚基時常常觀察到這種現(xiàn)象。本發(fā)明方法提供一種用于確保充分限制環(huán)境的手段，以便在分化狀態(tài)下保持多巴胺能和GABA能細胞，并且可用于例如設計來測試其它營養(yǎng)因子的特定活性的細胞培養(yǎng)物中。
在本發(fā)明主題方法的這些實施方案，可以使包括多巴胺能和/或GABA能細胞的分化細胞培養(yǎng)物與hedgehog激動劑接觸，以便通過防止分化喪失而保持終末分化神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物的完整性。本發(fā)明主題方法可以與誘導神經(jīng)元前體(例如祖細胞或干細胞)分化成多巴胺能神經(jīng)元或GABA能神經(jīng)元的試劑聯(lián)合使用許多神經(jīng)障礙與神經(jīng)元元件離散群體的變性相關，并且可以用包括hedgehog激動劑的治療方案進行治療。例如，早老性癡呆與幾個神經(jīng)遞質系統(tǒng)中的缺陷相關，既包括投射到新皮質的那些缺陷又包括居留在皮質的那些缺陷。例如，與年齡相匹配的對照相比，已經(jīng)觀察到早老性癡呆患者體內(nèi)的基底核的神經(jīng)元損失相當大(75％)。雖然早老性癡呆迄今為止仍是最常見的癡呆形式，但是數(shù)種其它的障礙也可以引起癡呆。這些變性疾病中的幾種是特征為中樞神經(jīng)系統(tǒng)各部位、尤其是大腦皮質中的神經(jīng)元死亡的變性性疾病。然而，某些形式的癡呆與位于大腦皮質下的丘腦或白質的變性相關。在此，認知功能障礙由傳出物和傳入物變性導致的皮質區(qū)的分離而引起。亨廷頓舞蹈病涉及紋狀體內(nèi)和皮質膽堿能神經(jīng)元以及GABA能神經(jīng)元的變性。皮克病(Pick′s disease)是一種額顳葉和前顳葉的新皮質中的嚴重神經(jīng)元變性，有時伴有紋狀體內(nèi)神經(jīng)元的死亡。對患有這類變性病癥的患者的治療可包括應用hedgehog激動劑，以便控制例如分化和導致神經(jīng)元損失的細胞凋亡事件(例如提高現(xiàn)有神經(jīng)元的存活率)以及通過受影響區(qū)內(nèi)的祖細胞促進分化和再生。
除變性劑誘發(fā)的癡呆外，一種或多種本發(fā)明主題hedgehog激動劑的藥用制劑可以適當?shù)赜糜谥委熎浔憩F(xiàn)為震顫和不隨意運動的神經(jīng)變性性疾病。帕金森病例如主要影響皮質下結構，其特征為黑質紋狀體通路、縫核、藍斑和迷走神經(jīng)運動核的變性。顫搐通常與底丘腦核損傷相關，該損傷由于急性血管意外傷害所致。也包括最終影響周圍神經(jīng)系統(tǒng)的體細胞分裂的神經(jīng)原性疾病和肌病，并且表現(xiàn)為神經(jīng)肌肉障礙。實例包括慢性萎縮癥，例如肌萎縮性側索硬化、Guillain-Barre綜合征和慢性周圍神經(jīng)病以及可以表現(xiàn)為進行性延髓性麻痹或脊髓性肌萎縮的其它疾病。本發(fā)明方法適合于治療導致張力減退或共濟失調的小腦障礙，例如在同側肢體中引起損傷性疾病的小腦中的那些病變。例如，hedgehog激動劑制劑可用于治療涉及前葉(蚓區(qū)和腿區(qū))的小腦皮質變性的有限形式，例如這種形式常見于酒癮患者。
在一個說明性的實施方案中，本發(fā)明主題方法用來治療肌萎縮性側索硬化。ALS是包括上運動神經(jīng)元和下運動神經(jīng)元在內(nèi)的疾病綜合征所給出的名稱?；颊呖杀憩F(xiàn)出進行性脊髓性肌萎縮、進行性延髓性麻痹、原發(fā)性側索硬化或這些病癥的組合。主要病理異常的特征為脊髓中的下運動神經(jīng)元和大腦皮質中的上運動神經(jīng)元的選擇性和進行性變性。hedgehog激動劑的治療性應用可以單獨使用，或者結合其它神經(jīng)營養(yǎng)因子例如CNTF、BDNF或NGF一起使用，以預防和/或逆轉ALS患者的運動神經(jīng)元變性。
本發(fā)明的hedgehog激動劑也可用于治療周圍神經(jīng)系統(tǒng)的自主性障礙，所述障礙包括影響平滑肌和內(nèi)分泌組織(例如腺體組織)的神經(jīng)無力的障礙。例如，本發(fā)明主題方法可用于治療可能由支配心臟紋狀肌的神經(jīng)的變性性病癥引起的心動過速或房性心律不齊。
此外，某些hedgehog激動劑的潛在作用源自hedgehog蛋白在軸索神經(jīng)元樹突的發(fā)育和保持中的作用。因此，hedgehog激動劑的潛在作用包括指導軸索的投射以及促進使受神經(jīng)支配細胞的軸突的分化和保持的能力。因此，包含hedgehog激動劑的組合物可用于支持幾種類型的神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元交感神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元以及運動神經(jīng)元的存活和再投射。特別是，這樣的治療組合物可用于設計的恢復性治療，例如，恢復來自損傷誘發(fā)的死亡的各種神經(jīng)元以及在這樣的損傷后指導這些神經(jīng)元的再投射。這樣的疾病包括但不限于CNS創(chuàng)傷性梗死、感染(例如病毒性感染，如水痘-帶狀皰疹病毒感染)、代謝疾病、營養(yǎng)缺乏癥、毒性劑(例如順鉑治療)。
適當時，本發(fā)明主題方法也可用于產(chǎn)生供中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)損傷修復用的神經(jīng)修復物。特別是，在通過利用假器官裝置插入壓傷或切斷軸突的情況下，可以將hedgehog激動劑加入到假器官裝置中，以調節(jié)樹突的生長率和再生率。示例性的神經(jīng)指導通道描述于美國專利5,092,871和4,955,892。
在另一個實施方案中，本發(fā)明主題方法可用于治療瘤性或增生性轉化，例如可能發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的瘤性或增生性轉化。例如，hedgehog激動劑可用于使這樣的轉化細胞變成有絲分裂期后的細胞或凋亡細胞。因此，本發(fā)明方法可用作治療例如惡性神經(jīng)膠質瘤、腦脊膜瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、神經(jīng)外胚層腫瘤和室管膜瘤的治療方案的一部分。
本發(fā)明主題方法對于治療或預防影響調節(jié)周圍神經(jīng)的疾病具有廣泛的應用性，所述周圍神經(jīng)包括周圍神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元、交感神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元和運動神經(jīng)元。一般而言，所述方法的特征可能為包括給予動物有效量的hedgehog激動劑以改變經(jīng)治療周圍神經(jīng)細胞的增殖和/或分化狀態(tài)的步驟。這樣的治療組合物可用于設計的治療性拯救例如來自損傷誘導死亡的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)、內(nèi)耳神經(jīng)和聽神經(jīng)以及運動神經(jīng)元以及這樣的損傷后指導這些神經(jīng)元再投射。這樣的疾病和病癥包括但不限于化學創(chuàng)傷或機械性創(chuàng)傷、感染(例如病毒性感染，如水痘-帶狀皰疹病毒感染)、代謝疾病(例如糖尿病)、營養(yǎng)缺乏癥和毒性劑(例如順鉑治療)。每種情況下的治療目的都可以具有兩重性(1)消除病因和(2)減輕其癥狀。
周圍神經(jīng)病是一種涉及手足神經(jīng)末稍損傷的病癥。周圍神經(jīng)病一般是指影響周圍神經(jīng)的疾病，最常見的表現(xiàn)為運動神經(jīng)、感覺神經(jīng)、感覺運動神經(jīng)或自主神經(jīng)的功能障礙中的一種或其組合。周圍神經(jīng)病所表現(xiàn)出的各種各樣的形態(tài)可以分別對同樣各種各樣的原因造成獨特影響。例如，周圍神經(jīng)病可以是遺傳獲得的，可以由系統(tǒng)疾病引起，或者可以由毒性劑誘發(fā)。某些引起神經(jīng)毒性的毒性劑是治療藥物、抗腫瘤藥、食物或藥物中的污染物以及環(huán)境和工業(yè)污染物。
特別是，已知引起感覺和/或運動神經(jīng)病的化療藥包括長春新堿—一種用于治療血液惡性腫瘤和肉瘤的抗腫瘤藥。神經(jīng)毒性是劑量依賴性的，并且表現(xiàn)為腸動力降低和周圍神經(jīng)病(在手腳遠端肌肉中尤其如此)、體位性低血壓和膀胱張力缺乏。同樣的問題用紫杉醇和順鉑已有記載(Mollman，J.E.，1990，New Eng Jour Med.322126-127)，雖然順鉑相關神經(jīng)毒性可以用神經(jīng)生長因子(NGF)緩解(Apfel，S.C.等，1992，Annals of Neurology 3176-80)。盡管所述神經(jīng)毒性有時在神經(jīng)毒性劑停藥后是可逆轉的，但是恢復過程可能非常緩慢(Legha，S.，1986，Medical Toxicology 1421-427；Olesen等，1991，Drug Safety 6302-314)。
存在許多遺傳性周圍神經(jīng)病，包括雷弗素姆病(Refsum′sdisease)、血內(nèi)β-脂蛋白缺乏癥、丹吉爾病(Tangier disease)、克拉貝病(Krabbe′s disease)、異染性腦白質營養(yǎng)不良、法布萊病(Fabry′sdisease)、Dejerine-Sottas綜合征等。迄今為止，所有這些遺傳性神經(jīng)病中，最常見的仍是Charcot-Marie-Tooth病。
Charcot-Marie-Tooth(CMT)病(亦稱腓骨肌萎縮或遺傳性運動感覺神經(jīng)病(HMSN))是最常見的遺傳性神經(jīng)障礙。其特征為無力和萎縮，主要是腓骨肌的無力和萎縮，這是由于周圍神經(jīng)的節(jié)段性脫髓鞘及軸突和前角細胞的相關變性所致。通常為常染色體顯性遺傳，并且常見相關變性性CNS障礙例如弗里德賴希共濟失調(Friedreich′sataxia)。
一方面，本發(fā)明的方法可用于治療遺傳性神經(jīng)病和維持現(xiàn)狀。隨著分子遺傳學的顯著進步，該組神經(jīng)病現(xiàn)在越來越被人們所了解。不同遺傳性神經(jīng)病的癥狀是多種多樣的。共同特性通常是早期開始的腳輕度麻木和麻刺感，緩慢進行性發(fā)展到腿和手，隨后發(fā)展到上肢的其它部位。大多數(shù)遺傳性神經(jīng)病的確具有由下肢和上肢遠端無力構成的運動組元。大多數(shù)遺傳性神經(jīng)病患者的腳患有高位足弓或其它牙間骨變形。該癥狀是非常緩慢進行性的，并且大多數(shù)患者在其癥狀開始后仍能行走二十多年。
對遺傳性神經(jīng)病的診斷通常建議早期開始診斷神經(jīng)病癥狀，尤其是當也存在有家族史時。在最新遺傳學進步之前，該診斷的支持為這樣的典型發(fā)現(xiàn)肌電圖描記法上神經(jīng)傳導顯著變慢以及神經(jīng)活組織檢查。對神經(jīng)活組織檢查的典型發(fā)現(xiàn)包括存在所謂的洋蔥球，說明神經(jīng)纖維的反復脫髓鞘和加髓鞘(remyelinating)。隨著最新的遺傳學進步，兩種被稱為Charcot-Marie-Tooth病的重要遺傳性神經(jīng)病和易患壓迫性麻痹的遺傳性神經(jīng)病現(xiàn)在可用簡單的血試驗進行診斷，該血試驗鑒定出負責這兩個實體的不同突變。
遺傳性神經(jīng)病由代代相傳的遺傳性異常引起。對于這些病中的幾種，遺傳缺陷是已知的，并且有各種試驗可用于診斷和產(chǎn)前忠告。
如上所述，本發(fā)明主題方法可用作治療Charcot-Marie Tooth病(CMT)的治療方案的一部分。這是對遺傳性感覺運動神經(jīng)病的統(tǒng)稱。CMT 1型(CMT 1)與髓鞘的脫髓鞘或分解相關。幾種不同的異常已被鑒定出來。CMT 1A型最常見由編碼髓鞘蛋白(稱為PMP-22)的基因的重復引起，而CMT 1B型由一種髓鞘蛋白(稱為Po糖蛋白)中的一個突變引起。CMTX是主要影響男人的遺傳性感覺運動神經(jīng)病。它由在X-染色體上編碼一種稱為連接蛋白32的蛋白的基因突變引起。
在另一個實施方案中，本發(fā)明主題方法可用于治療家族性淀粉狀蛋白性神經(jīng)病和其它相關遺傳性神經(jīng)病。淀粉狀蛋白性神經(jīng)病通常伴有疼痛、感覺缺失和自主性功能障礙。它由稱為甲狀腺素運載蛋白的蛋白中的一個突變引起，導致如淀粉狀蛋白的蛋白在周圍神經(jīng)中的沉積。
本發(fā)明主題方法可用于治療遺傳性卟啉病，該病可以具有周圍神經(jīng)病的組元?？梢杂帽景l(fā)明主題方法進行治療的另一種遺傳性神經(jīng)病是遺傳性感覺神經(jīng)病II型(HSN II)。本發(fā)明的方法和組合物也可用于治療獲得性神經(jīng)病和維持現(xiàn)狀。
例如，hedgehog激動劑可用于預防糖尿病性神經(jīng)病。糖尿病是神經(jīng)病最常見的已知病因。它在大約10％糖尿病病人中產(chǎn)生癥狀。在大多數(shù)情況下，該神經(jīng)病主要是感覺性的，伴有手腳疼痛和感覺缺失。但有些糖尿病病人患有引起一根或多根神經(jīng)無力的單神經(jīng)炎或多發(fā)性單神經(jīng)炎，或者患有引起腿無力的腰骶叢病或肌萎縮。
本發(fā)明方法也可用于治療免疫介導的神經(jīng)病。免疫系統(tǒng)的主要功能是保護機體抵抗由外界進入的感染性生物體。然而，在某些情況下，免疫系統(tǒng)轉變成抵抗自身機體，并引起自身免疫病。免疫系統(tǒng)由幾種類型的白細胞組成，所述白細胞包括T-淋巴細胞，它也調節(jié)免疫應答；和B-淋巴細胞或漿細胞，它們分泌稱為“抗體”的特異性蛋白，有時，由于未知的原因，免疫系統(tǒng)錯誤地攻擊機體的某些部位，例如周圍神經(jīng)。這就是“自身免疫性”周圍神經(jīng)病。根據(jù)受攻擊的周圍神經(jīng)部位和免疫反應的類型，存在幾種不同的類型。下文概述由免疫系統(tǒng)介導的神經(jīng)病。
例如，hedgehog激動劑可用于治療Guillain-Barre綜合征(GBS)-一種發(fā)病突然或快速的急性神經(jīng)病。Guillain-Bane綜合征可在發(fā)病后數(shù)天或數(shù)周內(nèi)發(fā)展成麻痹和呼吸衰竭。當免疫系統(tǒng)破壞運動和感覺神經(jīng)的髓鞘時引起所述神經(jīng)病。該病發(fā)生之前常常發(fā)生感染、接種疫苗或創(chuàng)傷，而這被認為是觸發(fā)自身免疫反應的原因。該病是自身限制性的，而且在6-8周內(nèi)自發(fā)性恢復。但是恢復常常是不完全的。
急性發(fā)病并且可以用本發(fā)明方法進行治療的其它神經(jīng)病包括急性運動神經(jīng)病、急性感覺神經(jīng)病和急性自主神經(jīng)病，其中存在分別針對運動神經(jīng)、感覺神經(jīng)或自主神經(jīng)的免疫攻擊。Miller-Fisher綜合征是另一種變異體，其中發(fā)生眼注視麻痹、動作失調和不穩(wěn)定步態(tài)。
可以用本發(fā)明主題方法進行治療的另一種獲得性神經(jīng)病是慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病(CIDP)。人們認為CIDP是Guillain-Barre綜合征的一種慢性和比較無痛的形式。該病由于重復攻擊(稱為復發(fā))或以逐步或穩(wěn)定方式而發(fā)展。如在GBS中，這似乎是髓鞘被抗體和T-淋巴細胞破壞。但是由于沒有針對CIDP的特異性試驗，因此診斷基于臨床和實驗室特征。
具有抗周圍神經(jīng)抗體的慢性多神經(jīng)病是另一種可以用本發(fā)明主題方法進行治療或預防的周圍神經(jīng)病。在某些類型的慢性神經(jīng)病中，抗神經(jīng)特異性組分的抗體已被鑒定出來。這些包括與抗髓磷脂相關糖蛋白(MAG)抗體相關的脫髓鞘神經(jīng)病、與抗神經(jīng)節(jié)苷脂GM1或GD1a抗體相關的運動神經(jīng)病和與抗硫腦苷脂或GD1b神經(jīng)節(jié)苷脂抗體相關的感覺神經(jīng)病。在這些情況下，所述抗體與寡糖或糖等分子結合，所述分子與神經(jīng)中的蛋白(糖蛋白)或脂質(糖脂或神經(jīng)節(jié)苷脂)結合。懷疑這些抗體可能引起所述神經(jīng)病。
本發(fā)明主題方法也可用作治療與周圍神經(jīng)的脈管炎或血管炎癥相關的神經(jīng)病的治療計劃的一部分。神經(jīng)病也可以由脈管炎—周圍神經(jīng)中的血管炎癥引起。它在周圍神經(jīng)病程中產(chǎn)生小“中風”，并且可以限于所述神經(jīng)或者它可以擴散到全身，包括皮疹，或者涉及其它器官。數(shù)種風濕病如類風濕性關節(jié)炎、狼瘡、結節(jié)性動脈外膜炎或斯耶格倫綜合征(Sjogren′s syndrome)都與也可涉及周圍神經(jīng)的全身性脈管炎相關。根據(jù)病變的分布和嚴重程度，脈管炎可以引起多神經(jīng)炎、單神經(jīng)炎或多發(fā)性單神經(jīng)炎。
在再一個實施方案中，本發(fā)明的方法可以用來治療臂神經(jīng)叢炎或腰骶神經(jīng)叢炎。位于腋下的臂神經(jīng)叢包含臂神經(jīng)和手神經(jīng)。臂神經(jīng)叢炎是神經(jīng)束炎癥的結果，并且在一個手臂或兩個手臂中產(chǎn)生無力和疼痛。發(fā)生在骨盆的骶突(umbosacral)神經(jīng)叢炎引起腿無力和疼痛。
hedgehog激動劑也可以適合用于治療與單克隆γ球蛋白病相關的神經(jīng)病。在單克隆γ球蛋白病中，骨髓或淋巴器官中的B細胞或漿細胞的單克隆擴充形成良性或惡性腫瘤并且分泌抗體?！皢慰寺 笔且驗榇嬖诳贵w的單克隆，而“γ球蛋白病”表示抗體另一名稱的γ球蛋白。在某些情況下，所述抗體與神經(jīng)組分反應；在其它情況下，所述抗體的片段形成淀粉狀蛋白沉積。
本發(fā)明的再一方法涉及本發(fā)明主題方法在治療與腫瘤或贅生物相關的神經(jīng)病中的用途。神經(jīng)病可能是由于腫瘤細胞直接浸潤神經(jīng)或者是由于腫瘤的間接作用引起的。后者稱為副腫瘤性神經(jīng)病。幾種類型已有描述。例如，本發(fā)明主題方法可用于控制與肺癌相關性的感覺神經(jīng)病。這種神經(jīng)病與抗稱為Hu的蛋白的抗體相關，Hu存在于周圍神經(jīng)的感覺神經(jīng)元中。同樣，本發(fā)明主題方法可用于治療與多發(fā)性骨髓瘤相關的神經(jīng)病。多發(fā)性骨髓瘤是一種由骨髓中的分泌抗體的漿細胞引起的骨腫瘤。該腫瘤由漿細胞的單克隆構成，并且它們產(chǎn)生的抗體是相同的或者是單克隆抗體。某些多發(fā)性骨髓瘤病人發(fā)生感覺運動多神經(jīng)病，而且伴有周圍神經(jīng)軸突變性。在其它實施方案中，本發(fā)明主題方法可用于治療與瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥(Waldenstrom′s macroglobulemia)、慢性淋巴細胞白血病或B細胞淋巴瘤相關的神經(jīng)病。這些是由脾、骨髓或淋巴結中分泌抗體的B-淋巴細胞引起的腫瘤。這些抗體是單克隆抗體，并且通常與周圍神經(jīng)組元例如MAG、GM1或硫腦苷脂反應。在其它實施方案中，本發(fā)明的hedgehog激動劑可用作治療癌癥患者的治療方案的一部分，其中神經(jīng)病是局部照射的結果，或者由藥物例如長春新堿和順鉑引起。
本發(fā)明也考慮了應用hedgehog激動劑治療與淀粉狀蛋白病相關的神經(jīng)病。淀粉狀蛋白是一種在周圍神經(jīng)中沉積的物質并且干預其作用所述疾病為淀粉狀蛋白病。存在兩種主要的類型原發(fā)性淀粉狀蛋白病，其中所述沉積含有單克隆抗體的片段(參見上述單克隆γ球蛋白病)；和遺傳性淀粉狀蛋白病，其中所述沉積含有稱為甲狀腺素運載蛋白的突變蛋白。原發(fā)性淀粉狀蛋白病通常與單克隆γ球蛋白病或骨髓瘤相關。
本發(fā)明的另一方面提供作為治療由感染引起的神經(jīng)病的手段的本發(fā)明主題方法。周圍神經(jīng)病可以由周圍神經(jīng)的感染引起。引起周圍神經(jīng)病的病毒包括引起緩慢進行性感覺神經(jīng)病的AIDS病毒HIV-I、引起快速進行性麻痹性神經(jīng)病的巨細胞病毒、引起帶狀皰疹的帶狀皰疹病毒和引起運動神經(jīng)病的脊髓灰質炎病毒。有時，乙型肝炎或丙型肝炎感染與脈管炎性神經(jīng)病相關。
引起神經(jīng)病的細菌性感染包括麻風病和白喉，麻風病引起斑形(patchy)感覺神經(jīng)病，而白喉可以引起快速進行性麻痹性神經(jīng)病。引起神經(jīng)病的其它感染性疾病包括由螺旋體引起萊姆病(Lyme disease)和由寄生蟲引起的錐蟲病。它們兩者均同時伴有多病灶性神經(jīng)病。
由營養(yǎng)失調引起的神經(jīng)病也是用本發(fā)明主題方法進行治療的候選疾病。例如維生素B12、B1(硫胺素)、B6(吡哆醇)或E的缺乏可以產(chǎn)生多神經(jīng)病，而且伴有周圍神經(jīng)軸突變性。這可能是由于飲食差或者不能從胃或腸吸收營養(yǎng)物所致。此外，巨大劑量的維生素B6也可以引起周圍神經(jīng)病，因而本發(fā)明主題方法可用作這類病例中解毒作用程序的一部分。
本發(fā)明主題方法的另一用途是治療由腎臟疾病引起的神經(jīng)病。慢性腎衰可引起嚴重感覺周圍神經(jīng)病，而且伴有周圍神經(jīng)軸突變性。
本發(fā)明的另一方面提供一種用于治療甲狀腺機能減退性神經(jīng)病的方法。甲狀腺機能減退有時與疼痛性感覺多神經(jīng)病相關，而且伴有軸突變性。單神經(jīng)病或多發(fā)性單神經(jīng)病也可能由于腫脹組織壓迫周圍神經(jīng)而引起。
本發(fā)明主題方法也可用于治療由酒精和毒素引起的神經(jīng)病。某些毒素可引起周圍神經(jīng)病。鉛毒性與運動神經(jīng)病相關；砷或汞引起感覺神經(jīng)病，而鉈可引起感覺神經(jīng)病和自主神經(jīng)病。數(shù)種有機溶劑和殺蟲劑也可以引起多神經(jīng)病。酒精對神經(jīng)有直接毒性，而酒癮是神經(jīng)病的一個主要病因。在某些實施方案中，本發(fā)明主題方法可用作更廣泛解毒作用程序的一部分。
在再一個實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用來治療由藥物引起的神經(jīng)病。已知數(shù)種藥物引起神經(jīng)病。它們其中包括用于治療癌癥的長春新堿和順鉑、用于治療腎盂腎炎的呋喃妥因、用于治療心律失常的胺碘酮、用于治療酒精中毒的戒酒硫、用于治療AIDS的ddC和ddI以及用于治療麻瘋病的氨苯砜。如上所述，在某些實施方案中，本發(fā)明主題方法可用作更廣泛解毒作用程序的一部分。
本發(fā)明的方法也可用于治療由創(chuàng)傷或壓迫引起的神經(jīng)病。局部神經(jīng)病可以因神經(jīng)由于受外力或者受到腱和其它組織壓迫而引起。其中了解最清楚的是由于腕關節(jié)受壓引起的腕管綜合征和由于神經(jīng)根伸出脊柱時受壓引起的頸神經(jīng)根病或腰神經(jīng)根病(坐骨神經(jīng)痛)。神經(jīng)壓迫的其它共同部位包括肘、腋和膝蓋。
本發(fā)明主題方法也可用于各種各樣的特發(fā)性神經(jīng)病。每當不能找出神經(jīng)病的病因時，就使用術語“特發(fā)性神經(jīng)病”。在這些情況下，所述神經(jīng)病依照其表現(xiàn)進行分類，即感覺特發(fā)性多神經(jīng)病、運動特發(fā)性多神經(jīng)病或感覺運動特發(fā)性多神經(jīng)病。
本發(fā)明主題方法對治療或預防影響肌肉組織的疾病具有廣泛應用性。一般而言，所述方法的特征可以為包括給予動物有效量的hedgehog激動劑以改變經(jīng)治療肌肉組織的增生狀態(tài)的步驟。給藥模式和給藥方案將根據(jù)待治療的肌肉組織而變化。
一方面，本發(fā)明涉及肌肉營養(yǎng)因子及其在刺激哺乳動物肌肉生長或分化方面的應用。對肌肉生長的這種刺激可用于治療萎縮或無力，特別是骨胳肌萎縮和心肌萎縮。另外，其中肌肉組織受損傷、異常或已萎縮的某些疾病是可用本發(fā)明進行治療的，所述疾病例如正常衰老、廢用性萎縮、無力或惡病質以及與衰老和肌肉質量丟失相關的各種繼發(fā)性疾病，例如高血壓、葡萄糖不耐癥和糖尿病、異常脂血癥和動脈粥樣硬化性心血管疾病。對肌肉肌病例如肌營養(yǎng)不良的治療也包括在本發(fā)明中。
就去神經(jīng)或廢用而論，骨胳肌經(jīng)歷導致肌肉大小、蛋白質含量和收縮強度顯著減小的快速萎縮。這種萎縮是人類許多神經(jīng)肌肉疾病的重要組元。在臨床環(huán)境下，包含本發(fā)明主題hedgehog激動劑的組合物可用來抑制肌肉變性，例如用來減小肌肉質量的丟失，例如作為治療這樣的肌消耗性疾病的一部分。
在優(yōu)選的實施方案中，將依照本發(fā)明的藥用組合物給予患有以下疾病的患者即身體狀況異常、與異常肌肉組織和/或肌肉組織的異常調節(jié)相關的疾病或病理生理病癥。優(yōu)選給予本發(fā)明組合物的疾病是那些直接或間接產(chǎn)生肌肉質量消耗(即丟失)的疾病，即肌肉消耗性疾病。這些疾病包括肌營養(yǎng)不良、心源性惡病質、肺氣腫、麻瘋病、營養(yǎng)不良、骨軟化癥、兒童急性白血病、AIDS惡病質和癌癥惡病質。
肌營養(yǎng)不良是遺傳性疾病，其特征為進行性無力和肌纖維變性，而無明顯神經(jīng)變性跡象。在杜興肌營養(yǎng)不良(Duchenne musculardystrophy)(DMD)中，患者表現(xiàn)出肌肉質量平均降低67％，而在肌強直性營養(yǎng)不良中，已經(jīng)顯示少數(shù)肌蛋白合成平均減少28％，而在非肌蛋白合成中卻無任何相應的減少(可能是由于對合成代謝激素或底物反應的終末器官反應減退所致)。已經(jīng)證明在DMD患者肌肉中蛋白質降解加速。本發(fā)明主題方法可用作預防并且在某些情況下逆轉與這樣的營養(yǎng)不良相關的肌消耗性病癥的治療策略的一部分。
嚴重充血性心力衰竭(CHF)的特征為“心源性惡病質”，即心肌和骨骼肌兩者中肌蛋白消耗，體重平均減輕19％。所述心源性惡病質由肌纖維蛋白分解速率增加引起。本發(fā)明主題方法可用作治療心源性惡病質的一部分。
肺氣腫是一種慢性阻塞性肺部疾病，定義為終末非呼吸細支氣管遠端的氣腔膨大，伴有小泡壁的破壞性改變。肺功能降低的臨床表現(xiàn)包括咳嗽、喘鳴、周期性發(fā)生呼吸感染、水腫、和功能減退以及壽命縮短。在肺氣腫患者中，酪氨酸流出增加47％。另外，全身亮氨酸流出仍保持正常，全身亮氨酸氧化作用增加，而全身蛋白質合成減少。結果是肌蛋白合成減少，伴有全身蛋白質更新和骨骼肌質量減少。這種減少隨著疾病的發(fā)展和長期惡化而變得越來越明顯。本發(fā)明主題hedgehog激動劑可用于預防和/或逆轉與這樣的疾病相關的肌肉消耗性病癥。
在糖尿病中，存在由于慢性部分去神經(jīng)(神經(jīng)病)引起的手的小塊肌肉的全面消耗。這隨著長期疾病的發(fā)展和嚴重程度而更加明顯和惡化。本發(fā)明主題方法可用作治療糖尿病的治療策略的一部分。
麻瘋病與發(fā)生在拇指和食指掌骨之間的肌肉消耗相關。嚴重營養(yǎng)不良的特征尤其為嚴重肌肉消耗。本發(fā)明主題方法可用于治療麻瘋病的肌肉消耗作用。
骨軟化癥是一種由維生素D和鈣缺乏引起的營養(yǎng)障礙。在兒童中稱其為“佝僂病”，而在成年人中稱其為“骨軟化癥”。顯著特征為骨軟化(由于礦化作用削弱，伴有過量的骨樣累積)、疼痛、觸痛、肌肉消耗和無力、食欲缺乏和體重減輕。這可以由營養(yǎng)不良、屢次妊娠和泌乳(耗盡或減少維生素D和鈣貯存)以及維生素D抗性引起。本發(fā)明主題方法可用作治療骨軟化癥的治療策略的一部分。
在兒童急性白血病中，存在導致骨骼肌消耗的蛋白質能量營養(yǎng)不良。研究已經(jīng)表明，某些兒童表現(xiàn)出肌肉消耗，甚至在診斷出白血病之前就表現(xiàn)出肌肉消耗，肌肉質量平均減少27％。同時脂肪組織卻增加33％-37％，導致相對體重和四肢粗細沒有凈變化。這樣的患者可適合用hedgehog激動劑依照本發(fā)明方法進行治療。
癌癥惡病質是一種實體瘤和血液惡性腫瘤患者中以可變發(fā)生率發(fā)生的復征綜合征。在臨床上，癌癥惡病質表現(xiàn)為脂肪組織和凈肌肉質量均大量消耗的體重減輕，是癌癥引起的一種死亡病因。癌癥惡病質患者生存時間縮短，并且對化療反應降低。除引起肌肉消耗的疾病外，其它環(huán)境條件似乎以某種方式與肌肉質量減少相關。這樣的疾患包括由慢性背痛引起的肌肉消耗、衰老提前、由疾病或損傷造成的長期住院治療、酒精中毒和皮質類固醇治療。本發(fā)明主題方法可用作預防并且在某些情況下逆轉與這類癌癥相關的肌肉消耗性病癥的治療策略的一部分。
研究已經(jīng)表明，在慢性腰背痛的嚴重病例中，存在脊柱旁肌肉消耗。減少脊柱旁肌肉消耗能緩解疼痛并改善機能。疾病的療程可包括給予治療量的一種hedgehog激動劑。
也認為，老年人中全身無力是由于肌肉消耗引起的。隨著機體年齡的增加，越來越多的骨骼肌被纖維組織置換。結果是肌肉力量顯著降低，但僅在無脂肪肌肉中只有少量減少。本發(fā)明主題方法可用作預防/逆轉老年患者肌肉消耗的治療和預防策略的一部分。
研究也表明，在損傷或慢性疾病患者和長期住院患者中，存在持續(xù)性單側肌肉消耗，肌肉質量平均減少31％。研究也表明，這可以用增強的物理治療加以糾正。然而，至少用本發(fā)明主題方法擴展至少這樣的療法，可能對許多患者更有效。
在酗酒者中，存在前脛骨肌肉的消耗。這種近端肌肉損傷由神經(jīng)原性損傷即糖酵解和磷酸化酶活性降低引起。酒癮持續(xù)時間越長，損害越明顯越大。用皮質類固醇治療的患者經(jīng)歷肌肉質量丟失。這樣的患者可能也適合用本發(fā)明主題方法進行治療。
本發(fā)明化合物可用于緩解由上述病癥以及其它病癥引起的肌肉質量丟失。另外，本發(fā)明的hedgehog激動劑可用于獸醫(yī)和動物飼養(yǎng)業(yè)應用，以對抗動物體重減輕，或者促進生長。例如，本發(fā)明也可用于提高動物肉品生產(chǎn)效率。具體地說，用hedgehog激動劑喂養(yǎng)動物，或者給動物注射hedgehog激動劑，以便增加總骨骼肌質量，例如，增加如牛、豬、羊、雞和大麻哈魚等養(yǎng)殖動物的體重。
組織和器官的離體保存也是非常需要的。在治療人類疾病中已很好建立了組織置換療法。在許多情況下，人們可能希望將肌肉細胞、尤其是肌肉干細胞移植到受體宿主體內(nèi)，所述受體宿主的細胞是肌肉消耗性疾病中死亡、損傷或功能異常的肌細胞。例如，正常成肌細胞的移植可用于治療杜興肌營養(yǎng)不良(Duchenne musculardystrophy)和其它肌肉變性和消耗性疾病。參見例如Partridge(1991)Muscle&Nerve 14197-212。就成肌細胞而論，可以將其在不同部位進行注射，以治療肌消耗性疾病。
本發(fā)明主題方法可用于調節(jié)體外肌細胞和組織的生長以及加速將植入的肌組織移植到動物宿主中。在這方面，本發(fā)明也涉及用hedgehog激動劑進行處理以擴充的成肌細胞培養(yǎng)物。在一個說明性的實施方案中，這樣的方法包括獲得肌肉樣品，最好是包括成肌細胞的樣品；任選用酶學方法處理所述細胞樣品，以分離所述細胞；在hedgehog激動劑存在下進行培養(yǎng)。
本發(fā)明的另一方面涉及本領域的觀察結果ptc、hedgehog和/或smoothened參與除如上所述的神經(jīng)元分化以外的其它脊椎動物器官發(fā)生途徑中所包括的形態(tài)發(fā)生信號，在其它內(nèi)皮圖式發(fā)育以及中胚層和內(nèi)胚層分化過程中都具有重要的作用。因此，本發(fā)明考慮了包含hedgehog激動劑的組合物也可用于細胞培養(yǎng)和包括非神經(jīng)元組織的產(chǎn)生和維持的治療方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明利用了這樣的發(fā)現(xiàn)ptc、hedgehog和smoothened顯然參與控制負責形成消化道、肝臟、肺、和其它起源于原始消化管的其它器官的干細胞的發(fā)育。Shh用作從內(nèi)胚層至中胚層的誘導型信號，該信號對腸形態(tài)發(fā)生是必不可少的。因此，例如，本發(fā)明方法的hedgehog激動劑可用來調節(jié)可以具有正常肝臟的多種代謝功能的人工肝臟的發(fā)育和保持。在一個示例性的實施方案，本發(fā)明主題方法可用于調節(jié)消化管干細胞的增殖和分化，以形成可用于聚集胞外基質或者可以在生物相容性聚合物中被囊化的肝細胞培養(yǎng)物，以形成可移植的體外人工肝臟。
在另一個實施方案中，hedgehog激動劑的治療組合物可以與這樣的人工肝臟移植以及胚胎肝結構聯(lián)合使用，以調節(jié)腹膜內(nèi)植入的攝取、血管形成以及所植入肝組織的體內(nèi)分化和保持。
在再一個實施方案中，本發(fā)明主題方法可用于治療性調節(jié)物理損傷、化學損傷或病理損害后的所述器官。例如，包含hedgehog激動劑的治療組合物可用于部分肝切除術后的肝臟修復。
起源于胚胎腸的胰腺和小腸的產(chǎn)生取決于腸的內(nèi)胚層細胞和中胚層細胞之間的細胞間信號。特別是，已經(jīng)表明，腸中胚層分化成平滑肌取決于來自相鄰內(nèi)胚層細胞的信號。在胚胎后腸中內(nèi)胚層源性信號的一種候選介質是Sonic hedgehog。參見例如Apelqvist等(1997)Curr Biol7801-4。Shh基因通過胚胎腸內(nèi)胚層表達，但胰腺芽內(nèi)胚層除外，胰腺芽內(nèi)胚層反而表達高水平的同源域蛋白Ipfl/Pdxl(胰島素啟動子因子1/胰和十二指腸同源框1)，即一種早期胰腺發(fā)育的必要調節(jié)劑。Apelqvist等(參見上文)已檢查了Shh在胚胎腸管中的差異表達是否控制將周圍中胚層分化成小腸和胰腺的特化中胚層衍生物。為了測試這一點，他們使用Ipfl/Pdxl基因的啟動子選擇性地表達發(fā)育中的胰腺上皮中的Shh。在Ipfl/Pdxl-Shh轉基因小鼠中，胰中胚層發(fā)育成腸特有的平滑肌和Cajal間質細胞，而不發(fā)育成胰間充質和脾臟。另外，接觸Shh的胰外植塊經(jīng)歷腸分化的相似程序。這些結果提供了這樣的證據(jù)內(nèi)胚層源性Shh的差異表達控制腸管不同部位中相鄰中胚層的命運。
因此，在本發(fā)明的正文中，考慮了本發(fā)明主題hedgehog激動劑可用于在體內(nèi)和體外控制或調節(jié)胰腺組織的增殖和/或分化。
存在各種各樣的病理細胞增殖和分化病癥，本發(fā)明的激動劑可為這些病癥提供治療益處，就一般策略而論，例如，為對異常胰島素表達進行糾正或者調節(jié)分化。然而，更一般而言，本發(fā)明涉及一種通過使所述細胞與本發(fā)明主題激動劑接觸來誘導和/或保持分化狀態(tài)、提高存活率和/或影響胰細胞增殖的方法。例如，本發(fā)明考慮了，鑒于ptc、hedgehog和snoothened顯然參與形成胰臟組織的有序空間排列，本發(fā)明主題方法可作為在體外和體內(nèi)產(chǎn)生和/或保持這種組織的技術的一部分。例如，可以在細胞培養(yǎng)和治療方法中使用對hedgehog功能的調節(jié)作用，包括產(chǎn)生并保持β-細胞，并且也可能對非胰腺組織，例如用于控制以下組織的發(fā)育和保持現(xiàn)狀，這些組織得自消化道、脾臟、肺和其它起源于原始消化管的器官。
在一個示例性的實施方案中，本發(fā)明方法可用于治療影響胰腺組織、特別是其特征為胰腺細胞異常增殖的增生性疾病和腫瘤疾病。例如胰腺癌的特征為可以導致胰腺胰島素分泌能力改變的胰腺細胞異常增殖。例如，某些胰腺增生(例如胰腺癌)可以導致由于β-細胞功能異?；蛞葝u細胞團減少所致的低胰島素血癥。就疾病進程中顯示異常ptc、hedgehog和snoothened信號而言，本發(fā)明主題激動劑可用于提高抗腫瘤治療后所述組織的再生。
此外，對hedgehog信號特性在不同點上進行操作可用作在體內(nèi)和體外重構/修復胰腺組織的策略的一部分。在一個實施方案中，本發(fā)明利用了這個事實ptc、hedgehog和smoothened顯然參與調節(jié)胰腺組織的發(fā)育。一般而言，本發(fā)明主題方法可用于治療性地調節(jié)物理損傷、化學損傷或病理損害后的胰腺。在再一個實施方案中，本發(fā)明主題方法可用于細胞培養(yǎng)技術，特別是可用于增強假器官胰腺組織裝置的初始產(chǎn)生。例如通過改變hedgehog活性對胰腺組織的增殖和分化的操作，可以提供一種更加小心地控制培養(yǎng)組織特征的手段。在一個示例性的實施方案中，本發(fā)明主題方法可用于增強需要β-胰島細胞的假器官裝置的生產(chǎn)，例如可以用于以下專利中介紹的被囊化裝置the Aebischer等的美國專利第4,892,538號、the Aebischer等的美國專利第5,106,627號、the Lim的美國專利第4,391,909號和theSefton的美國專利第4,353,888號。胰島細胞的早期祖細胞是多潛能的，并且顯然從其一開始出現(xiàn)就輔助激活所有胰島特異性基因。隨著發(fā)育進行，胰島特異性激素例如胰島素的表達變得限于成熟胰島細胞所特有的表達圖式。然而，成熟胰島細胞的表型在培養(yǎng)時是不穩(wěn)定的，這是由于可以觀察到胚胎性狀在成熟β-細胞中的再現(xiàn)。通過應用本發(fā)明主題hedgehog激動劑，可以對細胞的分化途徑或增殖指數(shù)進行調節(jié)。
此外，對胰腺組織分化狀態(tài)的操縱可以與人工胰臟的移植聯(lián)合使用，以便促進植入、血管形成和所植入組織的體內(nèi)分化和保持。例如，對影響組織分化的hedgehog功能的操縱可用作保持移植物存活的一種手段。
Bellusci等(1997)Development12453中報道了Sonic hedgehog調節(jié)體內(nèi)肺間充質細胞增殖。因此，本發(fā)明方法可用于調節(jié)肺組織的再生，例如用于治療肺氣腫。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，包含hedgehog激動劑的組合物可用于體外產(chǎn)生骨骼組織，例如來自骨骼發(fā)生干細胞的骨骼組織，以及體內(nèi)治療骨骼組織缺陷。本發(fā)明特別考慮了應用hedgehog激動劑調節(jié)軟骨發(fā)生和/或骨發(fā)生的速率。所謂“骨骼組織缺陷”，是指需要恢復骨或結締組織的任何部位的骨或其它骨骼結締組織中的缺陷，而與缺陷來源無關，例如無論是外科手術干預、切除腫瘤、潰瘍、植入物、骨折的結果還是其它創(chuàng)傷性或變性性病癥的結果。
例如，本發(fā)明方法可用作恢復結締組織軟骨功能的方案的一部分。這樣的方法可用于例如修復軟骨組織的缺陷或損傷，所述缺陷或損傷是例如引起關節(jié)炎的變性性磨損的結果，以及可由組織創(chuàng)傷引起的機械性擾亂的結果，所述組織創(chuàng)傷例如撕裂半月板組織的置換、半月板切除術、由于撕裂韌帶引起的關節(jié)松馳、關節(jié)錯位、骨折或遺傳性疾病。本發(fā)明的修復方法也可用于重建軟骨基質，例如用于整形外科或修復外科以及牙周外科。本發(fā)明方法也可用于改進例如半月板、韌帶或軟骨手術修復后的初步修復程序。此外，如果創(chuàng)傷后盡早應用時，則它可以防止變性性疾病的發(fā)生或惡化。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明主題方法包括用治療上足夠量的一種hedgehog激動劑、特別是Indian hedgehog信號轉導選擇性激動劑治療受影響結締組織，以通過控制包埋在結締組織中的軟骨細胞分化和/或增殖速率來調節(jié)所述組織的軟骨修復反應。例如關節(jié)軟骨、關節(jié)間軟骨(半月板)、肋軟骨(連接真肋骨和胸骨)、韌帶和腱等結締組織特別適合于用本發(fā)明主題方法在重建和/或再生療法中進行治療。本文所用的再生療法包括治療已發(fā)展至有明顯損害的組織的變性狀態(tài)以及預防性治療其變性處于最早期或即將來臨時的組織。
在一個說明性的實施方案中，本發(fā)明主題方法可用作治療動關節(jié)例如膝關節(jié)、踝關節(jié)、肘關節(jié)、髖關節(jié)、腕關節(jié)、手指或腳指的指節(jié)關節(jié)或顳下頜關節(jié)的軟骨中的治療性干預的一部分。所述治療可針對關節(jié)的半月板、關節(jié)的關節(jié)軟骨或者它們兩者。為了進一步說明，本發(fā)明主題方法可用于治療膝關節(jié)的變性性疾病，例如可能由于創(chuàng)傷性損傷(例如運動損傷或過度勞損)或骨關節(jié)炎引起的變性性疾病?？梢杂美珀P節(jié)鏡檢查針注射到關節(jié)腔內(nèi)而給予本發(fā)明主題激動劑。在某些情況下，所述注射劑可以為水凝膠形式或其它上述緩釋溶媒形式，以便使所述注射劑更長時間和更有規(guī)律地接觸受治療的組織。
本發(fā)明還考慮了將本發(fā)明主題方法用于軟骨移植和假器官裝置治療領域。然而，例如因為軟骨和纖維軟骨的特征在不同組織間的變化而出現(xiàn)各種問題例如在關節(jié)軟骨、半月板軟骨、韌帶和腱之間，在同一韌帶或腱的兩端之間，以及在組織表面和深處之間。這些組織的帶狀排列可以反映出機械性能的逐漸變化，并且當植入組織時不能發(fā)生，所述植入組織在這些情況下不分化，缺乏適當應答的能力。例如，當用半月板軟骨修復前十字形韌帶時，所述組織經(jīng)歷組織轉化成純纖維組織。通過調節(jié)軟骨發(fā)生的速率，本發(fā)明主題方法可用于具體解決該問題，即通過有助于適當控制新環(huán)境中的植入細胞，可以有效地模擬所述組織較早發(fā)育期的肥大軟骨細胞。
同樣，本發(fā)明主題方法可用于增加假器官軟骨裝置的產(chǎn)生及其植入。改進治療的需要已推動以下目的的研究產(chǎn)生基于膠原-糖胺聚糖模板的新軟骨(Stone等(1990)Clin Orthop Relat Red 252129)、分離的軟骨細胞(Grande等(1989)J Orthop Res 7208；和Takigawa等(1987)Bone Miner 2449)以及與天然或合成聚合物連接的軟骨細胞(Walitani等(1989)J Bone Jt Surg 71B74；Vacanti等(1991)PlastReconstr Surg 88753；von Schroeder等(1991)J Biomed Mater Res 25329；Freed等(1993)J Biomed Mater Res 2711；和the Vacanti等的美國專利第5,041,138號)。例如，軟骨細胞可以在培養(yǎng)物中在由諸如以下聚合物構成的生物可降解、生物相容的高度多孔支架上生長聚乙醇酸、聚乳酸、瓊脂糖凝膠或在規(guī)定時間內(nèi)隨著所述聚合物主鏈的水解而降解成無害單體的其它聚合物。所述基質可設計允許合適營養(yǎng)素和氣體交換到所述細胞中，直到開始植入。所述細胞可以在體外進行培養(yǎng)，直至得到待植入細胞的適當細胞體積和密度。所述基質的一個優(yōu)點是它們可以鑄塑或模制成所需的個性化形狀，使得最終產(chǎn)物非常類似患者本人的耳或鼻(作為實例)，或者如在關節(jié)中，可以使用允許在植入時進行操作的柔性基質。
在本發(fā)明主題方法的一個實施方案中，使所述植入物在培養(yǎng)過程的某些階段與hedgehog激動劑接觸，以便控制軟骨細胞的分化速率以及在培養(yǎng)中形成肥大軟骨細胞。
在另一個實施方案中，所述植入裝置用hedgehog激動劑進行處理，以便主動重建植入基質，并且使其更適合其預定功能。如上關于組織移植所敘述的，在與基質植入其中的實際機械環(huán)境相當?shù)沫h(huán)境中，人工移植物具有不是所來源的相同缺陷。用本發(fā)明主題方法調節(jié)所述基質中的軟骨細胞的能力可以允許所述植入物獲得與計劃置換的組織相似的特征。
在又一個實施方案中，本發(fā)明主題方法用于增強假器官裝置的附著。為了說明，本發(fā)明主題方法可用于植入牙周假器官，其中對周圍結締組織的處理刺激在所述假器官周圍形成牙周韌帶。
在再一個實施方案中，本發(fā)明主題方法可用作在其中這樣的骨骼組織有缺陷的動物的某一部位產(chǎn)生骨(骨發(fā)生)的方案的一部分。Indian hedgehogis特別是與最終被成骨細胞所置換的肥大軟骨細胞相關。例如，本發(fā)明hedgehog激動劑的給藥可用作調節(jié)受治療者骨丟失速率的方法的一部分。例如，可以使用包含hedgehog激動劑的制劑，例如以控制骨化“模型”形成中軟骨內(nèi)的骨化。
在本發(fā)明的又一個實施方案中，hedgehog激動劑可用于調節(jié)精子發(fā)生。已經(jīng)表明，hedgehog蛋白、特別是Dhh參與睪丸生殖細胞的分化和/或增殖和保持。Dhh表達始于緊接Sry(睪丸決定基因)活化后的支持細胞前體，并且在睪丸中持續(xù)存在至成年。雄性生物是有活力的但不生育，原因是完全不存在成熟精子。發(fā)育中的睪丸在不同遺傳背景下的檢查提示，Dhh既調節(jié)早期精子發(fā)生又調節(jié)晚期精子發(fā)生。Bitgood等(1996)Curr Biol6298。在一個優(yōu)選的實施方案中，hedgehog激動劑可用作致育因子。同樣，本發(fā)明主題方法的hedgehog激動劑可潛在用于調節(jié)正常的卵巢功能。
本發(fā)明主題方法對治療或預防影響上皮組織的疾病以及在美容應用中具有廣泛的應用性。一般而言，所述方法的特征可以為包括給予動物有效量的一種hedgehog激動劑以改變經(jīng)治療上皮組織生長狀態(tài)的步驟。給藥模式和給藥方案將根據(jù)待治療上皮組織而變化。例如，在受治療組織為表皮組織例如皮膚組織或粘膜組織的情況下，將優(yōu)選局部制劑。
一種“促進傷口愈合”的方法導致由于進行所述治療的傷口比沒有進行所述治療的相似傷口更快的愈合?！按龠M傷口愈合”也可以指所述方法調節(jié)尤其是角質形成細胞的增殖和/或生長，或者傷口愈合瘢痕形成更少、疤痕收縮更少、膠原沉積更少和淺表面積更大的方法。在某些情況下，“促進傷口愈合”也可以指當與本發(fā)明方法一起使用時，傷口愈合的某些方法提高了成功率(例如皮膚移植的成活率(take rate))。
并發(fā)癥對具有不完全愈合的傷口和開放型傷口是恒定的危險因素。盡管大多數(shù)傷口無需治療就可快速愈合，但是某些類型的傷口抵抗愈合。覆蓋大表面積的傷口也在較長時間內(nèi)也仍然開放。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明主題方法可用于加速涉及上皮組織的傷口愈合，例如由于手術、燒傷、炎癥或刺激引起的傷口愈合。本發(fā)明的某些hedgehog激動劑也可預防性用于例如美容制劑形式，以促進組織的再生過程，例如促進皮膚、毛發(fā)和/或手指甲的再生過程。
盡管在修復性外科技術方面的顯著進步，但是瘢痕形成在重新獲得愈合皮膚的正常功能和形狀方面可能是一個重要的障礙。當病理瘢痕形成例如手或臉的瘢痕疙瘩或肥大瘢痕引起功能喪失或身體畸形時尤其如此。在最嚴重的情況下，這樣的瘢痕形成可以突然造成精神社會苦惱和經(jīng)濟生活剝奪的困頓。傷口修復包括下述階段止血、炎癥、增殖和重建。增殖期包括成纖維細胞和內(nèi)皮細胞和上皮細胞的增殖。通過應用本發(fā)明主題方法，可以使上皮細胞在傷口內(nèi)及其附近的增殖速率受到控制，以便加速傷口愈合和/或使瘢痕組織的形成減至最小。
完全或部分厚度燒傷是常常覆蓋大表面積的傷口類型的一個實例，因此需要相當長時間來愈合。結果，常常發(fā)生威脅生命的并發(fā)癥例如感染及體液損失。另外，燒傷愈合常常是無序的，導致瘢痕形成和毀容。在某些情況下，由于過度膠原蛋白沉積所致的傷口攣縮導致傷口附近肌肉活動性降低。本發(fā)明的組合物和方法可用于加速燒傷的愈合速率，促進導致更理想的美容結果和更小的傷口攣縮和瘢痕形成的愈合過程。
覆蓋大面積的嚴重燒傷常常通過取自患者自身的未損壞面積的皮膚自體移植物進行治療。本發(fā)明主題方法也可以與皮膚移植物聯(lián)合使用，以通過加速移植皮膚和患者的接近移植物的皮膚的生長而提高移植物的“存活”率。
皮膚潰瘍是適合于用本發(fā)明主題方法進行治療的傷口的又一個實例，例如使?jié)冇虾?或防止?jié)冏兂陕詡?。例如，七分之一的糖尿病患者在其四肢發(fā)生易受感染的皮膚潰瘍。受感染糖尿病性潰瘍患者常常需要住院治療、深切護理、昂貴的抗生素且在某些情況下需要截肢。皮膚潰瘍例如由于靜脈疾病(靜脈停滯潰瘍)、過度受壓(褥瘡)和動脈潰瘍引起的那些皮膚潰瘍也抵抗愈合?，F(xiàn)有技術治療一般限于保護傷口免遭感染，并且在某些情況下，通過血管手術恢復血液流動。依照本發(fā)明方法，受影響皮膚部位可以通過包括應用促進傷口的上皮形成的hedgehog激動劑的療法進行治療，例如加速皮膚潰瘍的愈合速率。
本發(fā)明治療也可有效作為治療口腔潰瘍和非口腔潰瘍(例如由放療和/或化療引起的)的治療方案的一部分。這樣的潰瘍通常在化療或放療后數(shù)天內(nèi)開始。這些潰瘍通常開始為被細軟灰色壞死性膜覆蓋且為炎性組織所包圍的小的疼痛性不規(guī)則形狀損害。在許多情況下，不經(jīng)過治療將會導致炎癥基礎上的損害周圍發(fā)生的組織增生。例如，潰瘍邊緣的上皮通常證明有增殖活性，導致表面上皮的持續(xù)性損失。這些損害，由于其大小和上皮完整性喪失，使機體易受繼發(fā)性感染。食物和水的常規(guī)攝取成為一個非常痛苦的事情，如果潰瘍擴散到整個消化道，則腹瀉及其并發(fā)因素通常是顯而易見的。依照本發(fā)明，包括應用hedgehog激動劑對這樣的潰瘍的治療可以降低受影響上皮的異常增殖和分化，有助于降低后續(xù)炎癥的嚴重程度。
在另一個示例性的實施方案中，提供用于治療或預防胃腸道疾病的本發(fā)明主題方法。簡而言之，各種各樣的疾病與胃腸上皮或絨毛被破壞有關，包括化療和放療誘發(fā)的腸炎(例如腸毒性)和粘膜炎、消化性潰瘍疾病、胃腸炎和結腸炎、絨毛萎縮性疾病等。例如，骨髓移植和癌癥治療中所用的化療藥和放療快速影響造血組織和小腸中的增殖細胞，導致嚴重毒性，且常常是劑量限制性毒性。對小腸粘膜屏障的損害導致出血和膿毒病的嚴重并發(fā)癥。本發(fā)明主題方法可用于促進胃腸上皮的增殖，從而增加對放療和化療藥的耐受劑量。對胃腸道疾病的有效治療可以根據(jù)包括腸炎評分在內(nèi)的幾個標準、本領域熟知的其它試驗來確定。
Levine等(1997)J Neurosci 176277中表明了，hedgehog蛋白可以調節(jié)脊椎動物視網(wǎng)膜中的有絲分裂發(fā)生和光感受器分化，而Ihh是一種來自著色上皮、促進視網(wǎng)膜祖細胞增殖和光感受器分化的候選因子。同樣，Jensen等(1997)Development124363中證明了，用Sonichedgehog蛋白的氨基末端片段處理圍產(chǎn)期小鼠視網(wǎng)膜細胞，導致?lián)饺脘迕撗跄蜍盏募毎壤?、總細胞?shù)和棒狀光感受器、無長突細胞和放射狀膠質細胞增加，提示Sonic hedgehog促進視網(wǎng)膜前體細胞的增殖。因此，本發(fā)明主題方法可用于治療視網(wǎng)膜細胞的變性性疾病，并且調節(jié)光感受器分化。
隨年齡增加，表皮變薄，皮膚附件萎縮。毛發(fā)變得稀疏，皮脂分泌減少，結果是皮膚對干燥敏感、皸裂和裂隙。皮膚彈性降低，膠原纖維減少，從而皮膚收縮。此外，角質化細胞的增殖(說明皮膚厚度和皮膚增殖能力)隨年齡的增加而減少。據(jù)認為，角質化細胞的增殖對抗皮膚衰老，即皺紋、厚度、彈性和修復。根據(jù)本發(fā)明，增殖形式的hedgehog激動劑可在治療上或美容上對抗、至少在一段時間內(nèi)對抗衰老對皮膚的作用。
本發(fā)明的再一方面涉及應用本發(fā)明主題方法促進毛發(fā)生長。毛發(fā)基本上由角蛋白即一種堅韌不溶性蛋白組成；其主要強度在于其半胱氨酸的二硫鍵。每個個體的毛發(fā)包括圓柱形毛干和毛根，并且包含在毛囊—皮膚中的瓶樣凹陷中。毛囊基部含有稱為乳頭的指樣突出，它由毛發(fā)從中生長和血管賴以供應營養(yǎng)的細胞的結締組織組成。毛干是從皮膚表面向外延伸的部分，而毛根則被描述為毛發(fā)的隱蔽部分。毛根的基部延伸到位于乳頭上的毛球中。產(chǎn)生毛發(fā)的細胞生長在毛囊球中；它們由于毛囊中的細胞增殖而以纖維形式被擠出。毛發(fā)“生長”是指由于分裂細胞而形式和延伸毛發(fā)纖維。
正如本領域眾所周知的，普通的毛發(fā)循環(huán)可分為3個階段毛發(fā)生長初期、毛發(fā)生長中期和毛發(fā)生長終期。在活動期(毛發(fā)生長初期)，皮膚乳頭的表皮干細胞快速分裂。子細胞向上移動并分化形成毛發(fā)本身的同心層。過渡期即毛發(fā)生長中期的特征為毛囊中干細胞的有絲分裂停止。休眠期被稱為毛發(fā)生長終期，此時毛發(fā)保留在頭皮中達數(shù)周，然后重從其下面長出的新毛發(fā)使毛發(fā)生長終期的毛干從毛囊除去。根據(jù)該模型，顯而易見的是，分化成毛細胞的分裂干細胞庫越大，毛發(fā)生長發(fā)生越多。因此，通過分別加強或抑制這些干細胞的增殖，可以實施增加或減少毛發(fā)生長的方法。
因此，在某些實施方案中，本發(fā)明主題方法可用作一種促進人毛發(fā)生長的方法，例如治療禿發(fā)、脫發(fā)或特征為掉頭發(fā)的其它疾病。
本發(fā)明主題方法也可用于治療眼組織創(chuàng)傷。一般而言，根據(jù)創(chuàng)傷性質，角膜組織的損傷，無論是由于疾病引起，還是由于手術或損傷引起的角膜組織的損傷，都可以影響到上皮細胞和/或內(nèi)皮細胞。角膜上皮細胞是襯于角膜外表面的非角化上皮細胞，并且提供抗抵外部環(huán)境的保護性屏障。角膜創(chuàng)傷愈合是臨床醫(yī)師和研究人員均十分關注的事情。眼科醫(yī)師通常面對角膜營養(yǎng)不良和導致持續(xù)且復發(fā)的上皮糜爛的疑難損傷，這些損傷常常導致永久性內(nèi)皮損失。在這些情況下，可以使用增殖形式的本發(fā)明主題hedgehog激動劑，來促進受影響角膜組織的上皮形成。
為了進一步說明，通常與眼上皮細胞損傷相關的并且本發(fā)明主題方法可提供有益治療的特殊疾病包括持久性角膜上皮缺陷、復發(fā)性糜爛、神經(jīng)營養(yǎng)性角膜潰瘍、角膜結膜炎性干燥、細菌性角膜潰瘍、病毒性角膜潰瘍等。通常引起上皮細胞層損傷的外科手術包括在眼睛表面實施的激光手術、任何屈光矯正外科手術例如放射狀角膜切開術和散光角膜切開術、結膜片、結膜移植、角膜表面片術(epikeratoplasty)和角膜刮除術。此外，淺表創(chuàng)傷例如擦傷、表面糜爛、炎癥等可引起上皮細胞損失。根據(jù)本發(fā)明，使角膜上皮與有效量的hedgehog激動劑接觸，以使角膜上皮細胞增殖至適當愈合所述創(chuàng)傷。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明主題方法可用于誘導上皮源性組織分化和/或促進上皮源性組織增殖。這些分子的這類形式可提供用于治療涉及上皮組織的增生性和/或瘤性病癥的分化療法的基礎。例如，這類制劑可用于治療其中存在皮膚細胞異常增殖或生長的皮膚疾病。
本發(fā)明方法可用來提高皮膚移植物的“存活率”。表皮組織的移植物，如果所述移植物的存活速率延長，則可以起皰和發(fā)生剪切，使所述自體移植物的“存活”概率降低，即與傷口粘連并與下面的肉芽組織形成基底膜。通過用本發(fā)明主題方法誘導角質化細胞增殖，可以提高存活率。提高存活率的方法包括使皮膚自體移植物與有效傷口愈合量的一種hedgehog激動劑接觸，所述激動劑描述于如上所述的促進傷口愈合的方法中以及促進角質化細胞生長和增殖的方法中。
皮膚等同物具有許多用途，不僅用作人或動物皮膚供皮膚移植用的置換物，而且用作測定藥物和化妝品對皮膚的影響的試驗皮膚。藥理試驗、化學試驗和美容試驗中的主要困難是確定產(chǎn)品對皮膚的功效和安全性有困難。本發(fā)明皮膚等同物的一個優(yōu)點是其通過對試驗皮膚的體外測試可用作由這類物質產(chǎn)生的效應的指示劑。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明主題方法可用作例如裸露區(qū)、形成肉芽傷口和燒傷等皮膚移植的方案的一部分。hedgehog激動劑的應用可以提高這樣的移植技術，如分離厚度自體移植物和表皮自體移植物(培養(yǎng)的自體角質化細胞)和表皮自體移植物(培養(yǎng)的同種異體角質化細胞)。就所述同種異體移植物而論，應用本發(fā)明主題方法增加培養(yǎng)物中皮膚等同物的形成有助于提供/保持這類移植物的迅速供應(如在組織庫中)，使得患者可以在一次手術中用允許持久性愈合出現(xiàn)的材料覆蓋。
在該方面，本發(fā)明也涉及包含經(jīng)用hedgehog激動劑處理而擴充的培養(yǎng)角質化細胞表皮層的活的復合皮膚等同物。本發(fā)明主題方法可用作制備活的復合皮膚等同物的方法的一部分。在一個說明性的實施方案中，這種方法包括獲得皮膚樣品，用酶學方法處理所述皮膚樣品，使表皮與真皮分開，用酶學方法處理所述表皮，以釋放角質化細胞，在hedgehog激動劑存在下培養(yǎng)表皮角質化細胞直至匯合，平行或獨立用酶學方法處理所述真皮，以釋放成纖維細胞，培養(yǎng)所述成纖維細胞直至亞匯合，接種含有所述培養(yǎng)細胞的多孔交聯(lián)膠原蛋白海綿膜，孵育其表面接種的膠原蛋白海綿，使所述成纖維細胞在整個膠原蛋白海綿上生長，然后將其與培養(yǎng)角質化細胞一起接種，再在hedgehog激動劑存在下孵育所述復合皮膚等同物復合物，以促進所述細胞的生長。
在其它實施方案中，既含有上皮層又含有間充質層的皮膚片可以在培養(yǎng)時分離并且用補充增殖形式的hedgehog激動劑的培養(yǎng)基進行擴充。適用于細胞培養(yǎng)技術的任何皮膚樣品可以按照本發(fā)明使用。所述皮膚樣品可以是自體皮膚樣品，或者是同種異體皮膚樣品。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明主題方法可以與各種牙周手術聯(lián)合使用，其中最好是控制牙周組織內(nèi)及其周圍的上皮細胞增殖。在一個實施方案中，hedgehog激動劑可用于增強天然牙和假牙周圍再次上皮形成(reepithelialization)，例如促進牙齦組織的形成。
hedgehog基因產(chǎn)物能夠調節(jié)T淋巴細胞的成熟。本發(fā)明的某些方面涉及hedgehog激動劑及其用作抵抗獲得性和遺傳性免疫性疾病的免疫調節(jié)劑。
例如，這樣的組合物可用于使T輔助細胞群體增加到宿主的最佳水平，例如刺激所述動物的免疫系統(tǒng)。本發(fā)明主題組合物的這些用途可用于治療細菌性感染或病毒性感染，以及有助于機體抵抗癌細胞。另一方面，這些物質也能夠使宿主適應由自我識別過程紊亂引起的疾病，在所述過程中宿主T-細胞過度攻擊內(nèi)源組織。在這些情況下，本發(fā)明主題組合物可用于減少T-細胞群體，使得針對自身的炎性疾病(自身免疫病)例如類風濕性關節(jié)炎和多發(fā)性硬化的體征和癥狀得以緩解。
如本文所述，hedgehog蛋白抑制T淋巴細胞的成熟。根據(jù)其抑制作用，在本文提示給予hedgehog激動劑，作為對數(shù)種類型的涉及細胞免疫不想要的活化的免疫性疾病例如移植物排斥、自身免疫病等的治療。
一般而言，本發(fā)明的方法包括給予動物或體內(nèi)培養(yǎng)淋巴細胞一定量的hedgehog激動劑，所述激動劑通過抑制細胞的成熟而產(chǎn)生非毒性應答?？梢栽诩毎蠈嵤┍景l(fā)明主題方法，所述細胞可以在培養(yǎng)物時分散或是為完整組織或器官的一部分。此外，可以在培養(yǎng)物中提供的細胞(體外)或者完整動物體內(nèi)的細胞(體內(nèi))上實施所述方法。本發(fā)明也涉及通過應用本發(fā)明的藥用制劑來控制T細胞功能性表現(xiàn)的方法。
雖然不希望受任何具體理論的束縛，但是hedgehog對T細胞成熟的抑制作用可能是至少部分由于hedgehog蛋白拮抗(直接或間接)patched介導的基因表達的調節(jié)作用以及由該蛋白介導的其它生理作用的能力所致的。人們知道，patched基因產(chǎn)物—一種細胞表面蛋白通過引起形態(tài)發(fā)生素即傳遞位置信息的蛋白的Wnt和Dpp/BMP家族成員的轉錄抑制的途徑發(fā)送信號。在其它組織中，hedgehog的導入緩解(去抑制)由patched賦予的這種抑制，使得特定基因程序得以表達。
另一方面，本發(fā)明提供包含hedgehog激動劑的藥用制劑。可供本發(fā)明主題方法用的hedgehog激動劑可以方便地與以下生物學上可接受的介質一起配制便于給藥例如水、緩沖鹽水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)或它們的合適混合物。有效成分在所選介質中的最適濃度可以依照藥物化學家熟知的方法憑經(jīng)驗確定。本文所用的“生物學上可接受的介質”包括任何和所有溶劑、分散介質以及適合用于所述藥用制劑的所需給藥途徑的介質。對于藥學上的活性物質，這類介質的應用是本領域已知的。除非在任何常規(guī)介質或試劑與hedgehog激動劑的活性不相容的情況下，否則考慮了其在本發(fā)明藥用制劑中的用途。合適的溶媒及其包括其它蛋白的制劑描述于例如參考書Remington′s Pharmaceutical Sciences(Remington′s Pharmaceutical Sciences.Mack Publishing Company，Easton，Pa.，USA 1985)。這些溶媒包括注射用“貯庫制劑(depositformulation)”。
本發(fā)明的藥用制劑也可以包括獸用組合物，例如適合于獸用的hedgehog激動劑的藥用制劑，例如用于治療家畜或馴養(yǎng)動物，例如狗。
可充電裝置或生物可降解裝置也可以提供引入方法。已經(jīng)開發(fā)出各種緩釋聚合物裝置并且已在最近數(shù)年內(nèi)對藥物(包括蛋白質性生物藥物)的控制釋放進行了體內(nèi)測試。包括生物可降解聚合物和不可降解聚合物的各種各樣的生物相容性聚合物(包括水凝膠)可用于形成供hedgehog激動劑在特定靶部位緩慢釋放的植入物。
本發(fā)明的制劑可以經(jīng)口、胃腸外、局部或直腸給予。它們當然通過適合于每種給藥途徑的形式給予。例如，它們以片劑或膠囊劑形式通過注射、吸入、洗眼劑、軟膏劑、栓劑、控釋貼劑等給予，通過注射、輸注或吸入給予；通過洗劑或軟膏劑局部給予；以及通過栓劑經(jīng)直腸給予。優(yōu)選口服和局部給藥。
本文所用的短語“胃腸給藥”是指除腸內(nèi)給藥和局部給藥以外的給藥模式，通常通過注射給藥，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關節(jié)內(nèi)、被膜下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)和胸骨內(nèi)注射和輸注。
本文所用的短語“系統(tǒng)給藥”和“外周給藥”是指將化合物、藥物或其它物質間接給予中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，致使其進入到患者的系統(tǒng)內(nèi)，因而經(jīng)過代謝和其它類似的過程，例如皮下給藥。
可以將這些化合物通過以下任何合適的給藥途徑給予人或其它動物用于治療包括經(jīng)口、鼻(例如噴霧)、直腸、陰道內(nèi)、胃腸外、腦池內(nèi)和局部(例如散劑、軟膏劑或滴劑)，包括口腔含化和舌下。
無論選擇何種給藥途徑，可以合適的水合形式使用的本發(fā)明化合物和/或本發(fā)明藥用組合物都可以配制成藥學上可接受的劑型(例如下述劑型)，或者通過本領域技術人員已知的常規(guī)方法來配制，本發(fā)明藥用組合物中有效成分的實際劑量水平可以根據(jù)具體患者、組合物和給藥模式而變化，以便獲得有效達到所需的治療反應而對所述患者無毒的有效成分的量。
所選劑量水平將會取決于各種各樣的因素，包括所用的本發(fā)明具體化合物或其酯、鹽或酰胺的活性、給藥途徑、給藥時間、待用具體化合物的排泄率、治療持續(xù)時間、結合所用的具體hedgehog激動劑一起使用的其它藥物、化合物和/或物質、待治療患者的年齡、性別、體重、病癥、一般健康狀況和先前的藥物史以及藥學領域熟知的其它因素。
掌握本領域常規(guī)技術的主治醫(yī)師或獸醫(yī)可以容易地確定所需藥用組合物的有效量并開出處方。例如，主治醫(yī)師或獸醫(yī)可以開始以低于需要達到所需療效的水平給予所述藥用組合物中所用的本發(fā)明化合物，然后逐漸增加劑量直到達到所需的效應。
一般而言，本發(fā)明化合物的合適日劑量必將是產(chǎn)生療效的最低有效劑量的化合物的量。一般而言，這樣的有效劑量將取決于上述因素。總的來講，對于患者，本發(fā)明化合物的靜脈內(nèi)、腦室內(nèi)和皮下劑量范圍為每天每千克體重約0.0001mg至約100mg，優(yōu)選約0.001mg/kg至約10mg/kg，甚至更優(yōu)選約0.01mg/kg至約1mg/kg。
如果需要，所述活性化合物的有效日劑量可以在一天內(nèi)、以適當?shù)拈g隔、任選在單位劑型內(nèi)，以獨立給予的2、3、4、5、6或更多個亞劑量給予。
術語“治療”意指也包括預防、治療和治愈。
接受該治療的患者是有需要的任何動物，一般包括靈長類(特別是人類)和其它哺乳動物，例如馬、牛、豬和羊；以及家禽和寵物。
本發(fā)明化合物可以照原樣給予，或者在含有藥學上可接受的和/或無菌的載體的混合物中給予，并且也可以與其它抗微生物劑例如青霉素、頭孢菌素、氨基糖苷和糖肽聯(lián)合給予。因此，聯(lián)合療法包括以第一次給予的化合物當后續(xù)給藥時并不完全消失的方式序貫、同時和獨立給予所述活性化合物。
V.藥用組合物盡管有可能單獨給予本發(fā)明化合物，但是優(yōu)選本發(fā)明化合物作為藥用制劑(組合物)給予。依照本發(fā)明的hedgehog激動劑可以以任何方便的方式配制，以供人用或獸用藥物。在某些實施方案中，所述藥用制劑中所包括的化合物本身可以是有活性的，或者可以是前體藥物，例如能夠在生理環(huán)境中轉變成活性化合物的前體藥物。
因此，本發(fā)明的另一方面提供包含治療有效量的一種或多種上述化合物的藥學上可接受的組合物，所述化合物與一種或多種藥學上可接受的載體(添加劑)和/或稀釋劑配制在一起。如下文詳細描述的，本發(fā)明的藥用組合物可以具體配制成用于給藥的固體或液體形式，包括適合于以下的那些形式(1)口服給藥，例如獸用頓服藥(水性或非水性溶液劑或混懸劑)、片劑、大丸劑、散劑、顆粒劑、舌用糊劑等；(2)胃腸外給藥，例如皮下注射、肌內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射，例如無菌溶液劑或混懸劑等；(3)局部應用，用于皮膚的乳膏劑、軟膏劑或噴霧劑等；或(4)陰道內(nèi)或直腸內(nèi)給藥，例如子宮托、乳膏劑或泡沫劑等。然而，在某些實施方案中，可以將本發(fā)明主題化合物簡單地溶于或懸浮于無菌水中。在某些實施方案中，所述藥用制劑是無熱原的，即不會升高患者的體溫。
本文所用的短語“治療有效量”是指化合物、物質或包含本發(fā)明化合物的組合物以可用于任何醫(yī)學治療的合理利益/風險比在動物細胞的至少一個亞群中有效產(chǎn)生某種所需療效、從而阻斷經(jīng)治療的細胞內(nèi)該途徑的生物學結果的量。
本文所用的短語“藥學上可接受的”是指在合理的醫(yī)療判斷范圍內(nèi)、適合用于與人類和動物組織接觸時無過度毒性、刺激性、過敏反應或其它問題或并發(fā)癥、同時具有合理利益/風險比的那些化合物、物質、組合物和/或劑型。
本文所用的短語“藥學上可接受的載體”是指參與將本發(fā)明主題激動劑從機體的一種器官或部分運送或轉運到機體的另一種器官或部分的藥學上可接受的材料、組合物或溶媒，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包囊材料。每種載體在與制劑的其它組分相容的意義上必須是“可接受的”并且對患者不造成傷害?？捎米魉帉W上可接受的載體的材料的某些實例包括(1)糖類，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉狀西黃蓍膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；(9)油類，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和豆油；(10)甘醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯類，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)藻酸；(16)無熱原水；(17)等滲鹽水；(18)Ringer氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖溶液；和(21)藥用制劑中所用的其它無毒性相容的物質。
如上所述，本發(fā)明hedgehog激動劑的某些實施方案可含有堿性官能團，例如氨基或烷基氨基，因而能夠與藥學上可接受的酸形成藥學上可接受的鹽。在該方面，術語“藥學上可接受的鹽”是指本發(fā)明化合物的相對無毒性無機酸和有機酸的加成鹽。這些鹽可以在本發(fā)明化合物的最后分離和純化期間在現(xiàn)場制備，或者通過使本發(fā)明的純化化合物以其游離堿形式與合適的有機酸或無機酸分別反應，并且分離如此形成的鹽。代表性的鹽包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、醋酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘酸鹽、甲磺酸鹽、葡庚糖酸鹽、乳二糖酸鹽和月桂基磺酸鹽等。(參見例如Berge等(1977)″Pharmaceutical Salts(藥用鹽)″，J.Pharm.Sci.661-19)。
本發(fā)明主題化合物的藥學上可接受的鹽包括所述化合物的常規(guī)無毒鹽或季銨鹽，例如衍生自無毒有機酸或無機酸的鹽。例如，這樣的常規(guī)無毒鹽包括衍生自無機酸的那些鹽以及由有機酸制備的鹽，所述無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；而所述有機酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、棕櫚酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸、對氨基苯磺酸、2-乙酸苯甲酸、富馬酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、異硫代硫酸等。
在其它情況下，本發(fā)明化合物可以含有一個或多個酸性官能團，因而能夠與藥學上可接受的堿形成藥學上可接受的鹽。在這些情況下，術語“藥學上可接受的鹽”是指本發(fā)明化合物的相對無毒性無機堿和有機堿的加成鹽。這些鹽同樣可以在本發(fā)明化合物的最后分離和純化期間在現(xiàn)場制備，或者通過使本發(fā)明的純化化合物以其游離酸形式與合適的堿(例如藥學上可接受的金屬陽離子的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽)、氨或與藥學上可接受的有機伯胺、仲胺或叔胺分別反應。代表性的堿金屬鹽或堿土金屬鹽包括鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽和鋁鹽等。可用于形成堿加成鹽的代表性有機胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。(參見例如Berge等，參見上文)。
在所述組合物中也可以存在潤濕劑、乳化劑和潤滑劑例如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、矯味劑和香味劑、防腐劑和抗氧化劑。
藥學上可接受的抗氧化劑的實例包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；(2)脂溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螫合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
本發(fā)明的制劑包括適合于經(jīng)口、鼻、局部(包括口腔含化和舌下)、直腸、陰道和/或胃腸外給藥的那些制劑。所述制劑可以方便地為單位劑型，并且可以通過藥學領域熟知的任何方法來制備?？梢耘c載體材料混合以生產(chǎn)一種劑型的有效成分的量將會根據(jù)待治療宿主、具體的給藥模式而變化?？梢耘c載體材料混合以生產(chǎn)一種劑型的有效成分的量一般將是產(chǎn)生療效的化合物的量。一般而言，在100％范圍以內(nèi)，該量的范圍將為有效成分的約1％至約99％，優(yōu)選約5％至約70％，最優(yōu)選約10％至約30％。
這些制劑或組合物的制備方法包括使本發(fā)明化合物與所述載體且任選與一種或多種助劑結合的步驟。一般而言，通過使本發(fā)明化合物與液體載體或細分的固體載體或它們兩者均勻且最終結合、然后必要時使所述產(chǎn)物成形，來制備所述制劑。
適合于口服給藥的本發(fā)明制劑可以為以下形式膠囊劑、扁囊劑、丸劑、片劑、錠劑(使用矯味基質，通常為蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠)、散劑、顆粒劑，或者為水性或非水性液體中的溶液劑或混懸劑，或者為水包油液體乳劑或油包水液體乳劑，或者為酏劑或糖漿劑，或者作為軟錠劑(使用惰性堿，例如明膠和甘油，或者蔗糖和阿拉伯膠)和/或漱口劑等，每種劑型都含有預定量的作為有效成分的本發(fā)明化合物。本發(fā)明化合物也可以作為大丸劑、干藥糖劑或糊劑給予。
在本發(fā)明供口服給藥用的固體劑型(膠囊劑、片劑、丸劑、糖錠劑、散劑、顆粒劑等)中，將所述有效成分與一種或多種藥學上可接受的載體例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣和/或任一下述物質混合(1)填充劑或增量劑，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯膠等；(3)濕潤劑，例如甘油；(4)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；(5)溶液型阻滯劑，例如石蠟；(6)吸收加速劑，例如季銨化合物；(7)潤濕劑，例如鯨蠟醇和一硬脂酸甘油酯等；(8)吸收劑，例如高嶺土和膨潤土；(9)潤滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固態(tài)聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉和它們的混合物；和(10)著色劑。就膠囊劑、片劑和丸劑而論，所述藥用組合物也可以包含緩沖劑。相似類型的固體組合物也可以用如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等賦形劑作為填充軟明膠和填充硬明膠的膠囊劑中的填充劑。
片劑可以通過壓制或模制、任選與一種或多種助劑一起壓制或模制來制備。壓制片劑可以使用以下物質來制備粘合劑(例如明膠或羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如淀粉羥乙酸鈉或交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑。模制片劑可以通過在合適的機器中使粉狀與用惰性液態(tài)稀釋劑濕潤的化合物的混合物塑型來制備。
本發(fā)明藥用組合物的片劑和其它固體劑型例如糖錠劑、膠囊劑、丸劑和顆粒劑可以任選用包衣劑和殼體(例如腸溶衣或制藥領域熟知的其它包衣劑)刻痕或包衣。也可以例如提供所需釋放分布型的不同比例的羥丙基甲基纖維素、其它聚合物基質、脂質體和/或微球體，將其配制成提供緩慢釋放或控制釋放其中的有效成分。它們可以通過例如除菌濾器來過濾除菌，或者通過在無菌固體組合物形式中摻入滅菌劑，臨用前將該無菌固體組合物溶于無菌水或某些其它無菌注射用介質中。這些組合物也可以任選含有遮光劑，并且可以為它們僅釋放所述有效成分或者優(yōu)先在胃腸道的某一部位中釋放所述有效成分、任選以延遲方式釋放所述有效成分的組合物?？梢允褂玫陌窠M合物的實例包括聚合物和蠟。所述有效成分也可以為微囊化形式，適當時含有一種或多種上述賦形劑。
本發(fā)明化合物用于口服給藥的液體劑型包括藥學上可接受的乳劑、微乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和酏劑。所述液體劑型除含有所述有效成分，還可以含有本領域中常用的惰性稀釋劑例如水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油類(特別是棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫呋喃醇、聚乙二醇和脫水山梨糖醇的脂肪酸酯以及它們的混合物。
除惰性稀釋劑外，所述口服組合物還可以包括輔料，例如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑、著色劑、芳香劑和防腐劑。
混懸劑除含有所述活性化合物外，還可以含有懸浮劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和脫水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化(metahydroxide)鋁、膨潤土、瓊脂和西黃蓍膠以及它們的混合物。
可供直腸或陰道給藥用的本發(fā)明藥用組合物的制劑可以為栓劑，所述栓劑可以通過將一種或多種本發(fā)明化合物與一種或多種合適的非刺激性賦形劑或載體混合來制備，所述栓劑包含例如可可脂、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸酯，所述栓劑在室溫下為固體，但在體溫下為液體，因此，在直腸或陰道腔內(nèi)會熔化并釋放所述活性hedgehog激動劑。
適用于陰道給藥的本發(fā)明制劑適當時也包括含所述載體的子宮托、棉塞、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧劑，這是本領域已知的。
用于局部或透皮給予本發(fā)明化合物的劑型包括散劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、溶液劑、貼劑和吸入劑?？梢栽跓o菌條件下將所述活性化合物與藥學上可接受的載體以及任何可能需要的防腐劑、緩沖劑或拋射劑混合。
所述軟膏劑、糊劑、乳膏劑和凝膠劑除含有本發(fā)明的活性化合物外，還可以含有賦形劑例如動物和植物脂肪、油、蠟、石蠟、淀粉、西黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤土、硅酸、滑石粉和氧化鋅或它們的混合物。
散劑和噴霧劑除含有本發(fā)明化合物外，還可以含有賦形劑例如乳糖、滑石粉、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉末或這些物質的混合物。噴霧劑可另外還含有常用的拋射劑(例如含氯氟烴)和揮發(fā)性未取代烴(例如丁烷和丙烷)。
透皮貼劑具有給機體提供控制傳遞本發(fā)明化合物的相加優(yōu)點。這樣的劑型可以通過將所述hedgehog激動劑溶于或分散在合適的介質中來制備。也可以用吸收增強劑來增強所述hedgehog激動劑穿過皮膚的流出。這樣的流出速率可以通過提供控制膜或所述化合物在聚合物基質或凝膠中分散來控制。
眼用制劑、眼膏劑、散劑、溶液劑等也考慮在本發(fā)明范圍內(nèi)。
適用于胃腸外給藥的本發(fā)明藥用組合物包含一種或多種本發(fā)明化合物以及一種或多藥學上可接受的無菌等滲水性或非水性溶液劑、分散劑、懸浮劑或乳劑，或者臨用前可以在無菌注射用溶液或分散體中重建的無菌粉針劑，還可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、使所述制劑與計劃受體血液等滲的溶質或懸浮劑或增稠劑。
可用于本發(fā)明藥用組合物中的合適水性和非水性載體的實例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它們的合適混合物、植物油(例如橄欖油)和注射用有機酯(例如油酸乙酯)?？梢岳缤ㄟ^使用包衣材料例如卵磷脂、就分散體而論保持所需粒徑以及使用表面活性劑，來維持適當?shù)牧鲃有浴?br>
這些組合物也可以含有輔料，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可以通過包括各種抗細菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，來確保防止微生物的作用。在所述組合物中可能最好還包括等滲劑例如糖、氯化鈉等。另外，可以通過包括延遲吸收的試劑例如一硬脂酸鋁和明膠，來延長吸收所述注射藥物形式。
在某些情況下，為了延長藥物的作用，最好使皮下或肌內(nèi)注射的藥物緩慢吸收。通過使用水溶性差的晶形或非晶形材料的液體混懸劑，可以完成這一步。所述藥物的吸收速率則取決于其溶解率，進而可能還取決于晶體大小和晶形。另一方面，通過將所述藥物溶于或懸浮于油性溶媒中，可完成胃腸外給予的藥物形式的延遲吸收。
注射用貯庫(depot)形式通過使本發(fā)明主題化合物在生物可降解聚合物例如聚交酯-聚乙交酯中形成微囊化基質而制備。根據(jù)藥物與聚合物之比以及所用具體聚合物的性質，可以控制藥物釋放的速率。其它生物可降解聚合物的實例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。貯庫注射制劑也可通過將所述藥物包封在與機體組織相容的脂質體或微乳劑中來制備。
當本發(fā)明化合物作為藥物給予人類和動物時，它們可以照原樣給予或者作為含有例如0.1-99.5％(更優(yōu)選0.5-90％)的有效成分以及藥學上可接受的載體的藥用組合物給予。
優(yōu)選通過制備含有有效量的所述活性化合物的合適飼料預混合物，并將所述預混合物摻入到完全口糧中，完成在動物飼料中添加本發(fā)明的活性化合物。
另一方面，可以將含有所述有效成分的中間體濃縮物或飼料添加劑摻混到飼料中。可以制備或給予的這種飼料預混合物和完全口糧的方式在參考書中有介紹(例如″Applied Animal Nutrition″，W.H.Freedman and CO.，San Francisco，U.S.A.，1969或″Livestock Feeds andFeeding″O and B books，Corvallis，Ore.，U.S.A.，1977)。
VI.活性激動劑的合成方案和鑒定本發(fā)明主題抑制劑及其同類物可以容易地通過采用Suzuki、Stille等的交叉偶聯(lián)技術來制備。這些偶聯(lián)反應在相對溫和的條件下進行并且容許各種各樣的“旁觀者(spectator)”官能度。
a.組合文庫本發(fā)明化合物、特別是具有各類代表性取代基的變異體的文庫適合于組合化學和其它平行合成方案(參見例如PCT WO 94/08051)。結果是相關化合物的大文庫，例如在高通量測量中可以對上述化合物的花斑文庫(variegated library)進行快速篩選，以便鑒定出潛在的hedgehog激動劑先導化合物，以及改進先導化合物的特異性、毒性和/或細胞毒性-動力學分布型。例如，ptc、hedgehog或smoothened生物活性測定可用于篩選本發(fā)明主題化合物文庫中針對ptc具有拮抗劑活性或者針對hedgehog或smoothened具有激動劑活性的那些化合物。
僅僅用以說明，對本發(fā)明而言，組合文庫是可以根據(jù)所需特性一起篩選的化學上相關化合物的混合物。在一個反應中制備許多相關化合物大大減少和簡化了需要進行的多個篩選過程。可以通過常規(guī)方法對合適的物理性能進行篩選。
可以在多種不同水平上創(chuàng)建文庫的多樣性。例如，組合反應中所用的底物芳基就核心芳基部分而論、例如就環(huán)狀結構而論花斑可以是多樣化的，和/或可以隨其它取代基而變化。
在本領域可以利用各種各樣的技術來產(chǎn)生有機小分子例如本發(fā)明主題hedgehog激動劑的組合文庫。參見例如Blondelle等(1995)Trends Anal.Chem.1483；the Affymax的美國專利5,359,115和5,362,899the Ellman的美國專利5,288,514the Still等的PCT公布號WO 94/08051；the ArQule的美國專利5,736,412和5,712,171；Chen等(1994)JACS1162661Kerr等(1993)JACS115252；PCT公布號WO92/10092、WO93/09668和WO91/07087；和the Lerner等的PCT公布號WO93/20242)。因此，可以合成本發(fā)明主題hedgehog激動劑數(shù)量級約100-1,000,000或更多的多樣化單體(diversomer)的種類繁多的文庫，并可以對其特定活性或性能進行篩選。
在一個示例性的實施方案中，可以利用適合于Still等的PCT公布號WO 94/08051中介紹的技術的方案，來合成候選hedgehog激動劑多樣化單體的文庫，例如將其通過可水解基團或可光解基團、任選位于候選激動劑或合成中間體取代基的一個位置上的可水解基團或可光解基團與聚合物微珠連接。按照the Still等的技術，在一組微珠上合成所述文庫，每個微珠包括一組鑒定該微珠上特定多樣化單體的標簽。然后可以給微珠文庫“平板接種(plated)”hedgehog-效應細胞。所述多樣化單體例如通過水解可以從所述微珠中釋放出來。
可用于本發(fā)明的化合物結構使其本身可進行快速有效的合成?？偟膩碇v，如上所述，本發(fā)明主題化合物的結構性質允許這類化合物的快速組合裝配。例如，正如在下述的方案中，與微珠或其它固體支持體連接的活化芳基、例如芳基三氟甲磺酸酯或芳基溴可以通過與芳基錫烷或芳基硼酸進行Stille或Suzuki偶聯(lián)而與另一芳基連接。如果第二芳基被醛官能化，則可以通過還原性胺化加入一個胺取代基?；蛘?，第二芳基可以被能夠被胺置換的離去基團例如三氟甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基或鹵化物官能化。或者，第二芳基可以被能夠與胺(例如CyKNH2)進行還原性胺化的胺基官能化。其它可行的偶聯(lián)技術包括過渡金屬介導的胺芳基化反應。所產(chǎn)生的仲胺則可以通過?；?、烷基化或芳基化進一步官能化，產(chǎn)生叔胺或酰胺，然后可以將其從所述樹脂或支持體上切割下來。這些反應一般是相當溫和的，并且已成功地應用于組合固相合成方案。此外，適合這些反應并且是可利用的各種各樣的底物和偶聯(lián)配偶體允許在如此中敘述的測定中快速裝配大的多樣化化合物文庫，以供測試用。對于某些方案以及本發(fā)明主題化合物的各種取代基上的某些取代，本領域技術人員將會認識到，需要用合適的保護基掩蔽某些官能團。這樣的技術是本領域眾所周知的，并且容易地應用于組合合成方案中。
對以上途徑和相關途徑的許多改變使得可以合成可以測試作為hedgehog功能激動劑的化合物的多種多樣化文庫。
b.篩選測定各種各樣的測定可用于測定化合物拮抗ptc功能或激活smoothened或hedgehog功能的能力，其中許多化合物可以以高通量形式排列。在許多測試化合物和天然提取物的文庫的藥物篩選程序中，優(yōu)選高通量測量，以便使在給定時間周期內(nèi)所檢查的化合物數(shù)量最大化。因此，可以抽樣檢查合成和天然產(chǎn)物文庫中作為hedgehog激動劑的其它化合物。
除無細胞測定外，也可以在基于細胞的測定中對試驗化合物進行測試。在一個實施方案中，使對加入的hedgehog蛋白有反應的細胞與感興趣試驗化合物接觸，同時對所述測定評分，例如對在所述試驗化合物存在下促進細胞增殖進行評分。
已知多種基因產(chǎn)物涉及patched介導的信號轉導，包括patched、cubitus interruptus(ci)家族的轉錄因子、絲氨酸/蘇氨酸激酶fused(fu)和costal-2、smoothened和suppressor-of fused的基因產(chǎn)物。
通過hedgehog蛋白誘導細胞啟動包括對下游效應物的激活和抑制的級聯(lián)，最終的結果是，在某些情況下，出現(xiàn)基因轉錄或翻譯方面的可檢測變化。hedgehog介導信號的潛在轉錄靶是patched基因(Hidalgo和Ingham，1990Development110，291-301；Marigo等，1996)和果蠅cubitus interruptus基因的脊椎動物同系物即Gli基因(Hui等(1994)Dev Biol162402-413)。已經(jīng)表明，patched基因表達在對Shh有反應的肢芽細胞和神經(jīng)板細胞中被誘導。(Marigo等(1996)PNAS939346-51；Marigo等(1996)Development1221225-1233)。Gli基因編碼具有鋅指DNA結合結構域的推定轉錄因子(Orenic等(1990)Genes &Dev41053-1067；Kinzler等(1990)Mol Cell Biol10634-642)。據(jù)報道，Gli基因的轉錄在肢芽中在對hedgehog反應時受到正調節(jié)，而Gli3基因的轉錄在對hedgehog誘導反應時受到負調節(jié)(Marigo等(1996)Development1221225-1233)。通過選擇來自這樣的靶基因、例如來自基因patched或Gli基因、在對hedgehog信號反應時負責正調節(jié)或負調節(jié)這些基因的轉錄調節(jié)序列，并且將這樣的啟動子與報道基因有效連接，可以進行對特定試驗化合物改變hedgehog介導的信號途徑的能力靈敏的基于轉錄的測定。因此，報道基因的表達提供一種用于開發(fā)用作hedgehog激動劑的化合物的有價值的篩選工具。
本發(fā)明基于報道基因的測定測量上述事件級聯(lián)例如轉錄調節(jié)的末期。因此，在實施所述測定的一個實施方案中，將報道基因構建體插入到試藥細胞中，以便產(chǎn)生依賴于hedgehog途徑被激活或被Shh本身刺激的檢測信號?？梢杂眠m合于本領域技術人員已知的任一方法，測量所述報道基因的轉錄量。例如，可以用RNA酶保護或基于RNA的PCR來檢測報道基因的mRNA表達，或者可以通過特征性染色劑或內(nèi)在生物活性鑒定出所述報道基因的蛋白質產(chǎn)物。然后，將報道基因的表達量與在不存在試驗化合物的情況下在任一相同細胞中的表達量進行比較，或者將其與在缺少靶受體蛋白的大致相同的細胞中的轉錄量進行比較。轉錄量方面的任何統(tǒng)計學上或其它方面的顯著增加說明，所述試驗化合物以某種方式拮抗正常ptc信號(或激活hedgehog或smoothened信號)，例如所述試驗化合物是一種潛在的hedgehog激動劑。
實施例部分現(xiàn)在，參照以下實施例，將會更加容易地理解以上作出概括描述的本發(fā)明，以下實施例僅僅用來說明本發(fā)明的某些方面和實施方案，而不是用來限制本發(fā)明。
在以下的實驗部分，術語“Hh蛋白”用來指辛基-Shh-N，即一種親脂形式的人sonic hedgehog蛋白的細菌源性片段(氨基酸24-198，Shh-N)。準確地講，Shh-N在體外通過其氨基末端半胱氨酸與辛基馬來酰胺基團共價連接。這種修飾形式，同最近描述的其它形式一樣(Pepinsky等，J Biol.Chem.1998，273，14037-45)，在hedgehog信號的幾種基于細胞的測定中表現(xiàn)出要比相應的未修飾片段高的特異性潛力。
化合物篩選為了測量化合物的hedgehog激動劑活性，我們使用含有hedgehog效應Gli-Luc報道構建體的[10T1/2(s12)]細胞。在每個MTP(微量滴定板；96孔板)中，每孔在完全培養(yǎng)基(10％FBS)中接種10,000-20,000個細胞。大約24-48小時后，各板更換成低血清培養(yǎng)基(＝0.5％FBS)。隨后，在存在或不存在辛基-hedgehog的情況下，加入1-5μM試驗化合物(參見下文)。再過24小時后，棄去MTP中的培養(yǎng)基，更換為含有裂解緩沖液和螢光素酶底物的螢光素酶測定混合物。將各板在室溫下孵育約15-30分鐘，然后在發(fā)光計中讀數(shù)。
篩選A將各板孵育48小時，然后更換為低血清培養(yǎng)基。在Hh蛋白(0.01μg/ml；EC30＝最大誘導活性的約30％)存在下，對1-2μM化合物進行篩選。
篩選B將各板孵育24小時，然后更換為低血清培養(yǎng)基。在不加Hh蛋白的情況下，對5μM化合物進行篩選。
化合物反篩選(SV-Luc)對于反篩選，我們使用含有SV40-螢光素酶表達盒的[10T1/2(SV-Luc)]細胞，該表達盒允許螢光素酶-活性在所述細胞中的組成型水平。該測定使人們能夠評價Gli-Luc測定中所選化合物的特異性，即所述化合物是否僅特異性地刺激hedgehog信號途徑還是一般的報道構建體。細胞接種和培養(yǎng)以及化合物操作依照Gli-Luc測定進行。在該測定中，不加入Hh蛋白，因為所述報道構建體已具有組成型活性。
根據(jù)篩選A，我們鑒定出圖32和圖33中鑒定的命中物(hits)。圖32中包括該部分的化合物的1，4-二氨基環(huán)己烷亞單位具有兩個以反式排列的氨基取代基，例如等同于環(huán)己烷亞單位上的這兩個取代基。這些命中物在篩選B中得到證實。圖34a和圖34b所示的數(shù)據(jù)實質上包括在這兩個測定中給予這兩種化合物(Gli-Luc和SV-Luc)。
將Gli-Luc測定的數(shù)據(jù)換算成活性百分比，其中將Hh蛋白的完全活性設定在100％(圖35；表1)。該數(shù)據(jù)表明，這兩種化合物均可以顯著刺激Gli-luc報道構建體的活性(即激活hedgehog信號)，甚至在沒有Hh蛋白的情況下也是如此；用Hh蛋白，濃度范圍0.1-15μM，EC50＝2μM，EC最大＝最大誘導活性的50-70％)。此外，在hedgehog存在下，所述化合物顯示出更顯著的誘導作用(用Hh蛋白，EC50＝0.2-0.3μM，EC最大＝最大誘導活性的70-90％)，說明所述化合物和Hh蛋白的協(xié)同作用，這與用作hedgehog途徑激動劑的化合物一致。
表1
SV-Luc測定的數(shù)據(jù)(圖35)表明，這兩種化合物在所測試的濃度范圍(高達15μM)內(nèi)并不影響所述螢光素酶活性，提示所述化合物不刺激來自報道構建體本身的活性，但可能對hedgehog途徑有特異性。此外，未受影響的活性提示，所述化合物對所述細胞沒有內(nèi)在毒性。
Hh激動劑gli正調節(jié)的定量RT-PCR測定測試圖32和圖33的化合物激活Hedgehog途徑的兩個已進行了深入細致研究的靶的轉錄的能力轉錄因子gli-1和推定的Hedgehog受體組分Ptc-1。如圖35所示，我們發(fā)現(xiàn)化合物濃度為8μM時，對這兩個靶的誘導是對對氰基苯基化合物B而言約為用最適濃度Hh蛋白獲得的60％，而對間硝基苯基化合物A而言約為用最適濃度Hh蛋白獲得的40％。
各測定如下進行將鼠C3H 10T1/2細胞以約200,000個細胞/孔接種到裝有完全培養(yǎng)基(10％FBS)的24孔板中。24小時后，除去培養(yǎng)基并更換成含有不同稀釋度的化合物或Hh蛋白的“饑餓”培養(yǎng)基(0.5％FBS)。16-18小時后，采用TriZol(Life Technologies，inc.)制備總RNA。
用1μg等分的總RNA和M-MTV逆轉錄酶(Life Technologies，Inc.)制備隨機六聚體引發(fā)的cDNA。
為了測量Gli-1和Ptc-1轉錄物的相對水平，用ABI Prism 7700Sequence Detection System(序列檢測系統(tǒng))進行TaqMan測定(PEBiosystems)。作為內(nèi)部對照，在各反應中同時測量GAPDH轉錄物水平。運用Sequence Detector vl.6.3(PerkinElmer)數(shù)據(jù)進行分析。
Hedgehog信號激動劑誘導小腦神經(jīng)元前體增殖為了測試Hedgehog信號激動劑的功效，測定所述激動劑刺激小腦神經(jīng)元前體增殖的能力。已知小腦顆粒神經(jīng)元前體由于增殖而對Hh蛋白應答。為了測試所述激動劑，剝離出生后(1周)大鼠腦的小腦神經(jīng)元，并將其置于原代細胞培養(yǎng)物中。在培養(yǎng)的第一天(0 DIV)加入處理劑一次。保持細胞在培養(yǎng)物中直至2 DIV，當加入3H-胸苷達5小時；該3H-胸苷摻入到細胞中的量提供對所述細胞增殖水平的度量。然后將細胞裂解，測定3H-胸苷的摻入情況。陽性對照為終濃度為1.0μg/ml的Hh蛋白。單獨的Hh蛋白在3H-胸苷摻入方面引起約20倍增加，這與Shh刺激這些細胞增殖的已知能力一致。未經(jīng)Hh-蛋白刺激的細胞(包括用對照溶媒(DMSO)處理的細胞)的增殖水平非常低。然而，發(fā)現(xiàn)圖32中所測試的兩種Hh激動劑即A和B在不存在Hh蛋白處理的情況下顯著刺激3H-胸苷摻入，如圖36所示。5.0μM的對氰基苯基化合物B引起誘導3H-胸苷摻入達10.2倍。圖37顯示激動劑D在不存在Shh的情況下也強烈刺激3H-胸苷摻入。1.0μM、0.3μM或0.1μM D分別引起16倍、17倍或13倍的誘導3H胸苷摻入到所述細胞中。這些觀察結果證明，所述hedgehog激動劑可以刺激靶細胞中已知的hedgehog生物反應。
神經(jīng)擠壓測定CD-1雄性小鼠用240mg/kg IP阿佛丁進行麻醉。剃掉小鼠膝周圍大腿腹側部位上的毛，用70％乙醇消毒，接著用聚維酮碘拭抹。用鑷子鑷住大腿上的皮膚，然后用小剪刀在皮膚上剪開1/4英寸切口。去掉脂肪并暴露出股神經(jīng)、動脈和靜脈。用7號向下彎曲的鑷子尖，剝離出恰好位于股動脈/靜脈下的肌肉，以露出該肌肉深處的坐骨神經(jīng)。同時使用兩把鑷子保持肌肉分開，再用兩把鑷子小心地鑷出該神經(jīng)。小心操作以致不鑷出肌肉纖維。用鑷子鑷3次，以使神經(jīng)與肌肉分開。用彎頭鑷子提起神經(jīng)且保持在肌肉之上，用止血鉗夾住神經(jīng)，使神經(jīng)保持在該止血鉗的中部。將該止血鉗在該處保持10秒。以這種方式，擠壓膝蓋(和分支)上大約1+cm的兩條坐骨神經(jīng)。松開止血鉗，讓神經(jīng)重新縮回到肌肉中。用一支小吸管尖(P2)將少量組織學組織標記染料加入到該壓傷部位。用手術小夾縫合該切口。小心操作以防止將皮膚夾進肌肉中。在整個實驗過程中，將該小夾保留在原處。
給一組小鼠進行對照手術。這包括用鑷子攝出神經(jīng)，然后讓其在無任何擠壓的情況下縮回原處。該部位也可以用組織學染料進行標記。
藥物處理在手術后當天開始。對于以劑量為1mg/kg的PBS溶液給予的Shh蛋白即Shh和免疫球蛋白的融合蛋白(如描述于美國臨時專利申請?zhí)?0/164025，該文獻通過引用結合到本文中)，用裝有28針頭的1/2cc胰島素注射器在小鼠背的中部進行皮下注射，并且每隔一天重復該步驟直到第12-13天。(到那時完成恢復過程)。對于激動劑給藥，通過微量泵(1μL/小時)給予在43％DMSO/PBS中的激動劑溶液(圖38A和圖39B)或在10％DMSO/水中的激動劑溶液(圖38B和圖39D)。手術后第4天開始行為實驗，并連續(xù)進行到第12天或第13天。
行為實驗—握力分析將一只小鼠放在8″×8″金屬網(wǎng)格(類似試管架)，孔徑1cm，將該網(wǎng)格慢慢地勻速反轉10次。記錄小鼠不能用其左右后肢抓握的次數(shù)。必要時，通過將小鼠在該網(wǎng)格上重定位，使該小鼠遠離網(wǎng)格邊緣。如果小鼠恰好用其小腿鉤住網(wǎng)格或攀住網(wǎng)格，則認為失敗。如果小鼠走動而不能抓住網(wǎng)格，則重復反轉。
左右腿失敗的動物與該實驗組的其它動物混放在一起(在任何給定的時間點，6只動物/組×2只腳握力評分/動物＝12握力評分/組)。激動劑D的結果示于圖38A。僅用溶媒處理的動物一般到手術后第9天自發(fā)恢復。圖38B顯示在處理方案中用在10％DMSO/水的溶媒中溶解的激動劑D獲得的結果。
行為實驗—趾伸展測量趾伸展測量在手術后第4天開始并且每隔一天進行測量。小鼠通過近尾部的部位固定，并讓小鼠用其前肢抓住籠子的金屬絲上面。用一把小的漆刷或棉花涂藥器給小鼠的后趾和爪墊涂上油漆。讓小鼠走過一張干凈的紙，使每個后肢留下至少兩個清楚的趾印。用一把尺子，在每只腳最寬的趾印間畫出一條直線，然后量出它們之間的距離。隨著動物的恢復，距離增加至正常測量結果。
求出該動物左右腿分值的平均值，并將其與該實驗組的其它動物混放在一起(在任何給定的時間點，6只動物/組×2只腳握力評分/動物＝12握力評分/組)。激動劑D的結果示于圖39A和圖39B。圖39D顯示了在該方案中在10％DMSO/水的溶媒中溶解的激動劑D的作用。
報道小鼠測定帶有處于patched基因座調節(jié)控制之下的β-半乳糖苷酶轉基因的小鼠(ptc-lacZ小鼠)在其中表達內(nèi)源小鼠patched基因的相同細胞中表達β-半乳糖苷酶蛋白。因此，所述β-半乳糖苷酶蛋白可用作表達內(nèi)源patched基因的真正報道基因。所述patched基因是hedgehog信號途徑的已知組分并且當所述hedgehog途徑被激活時而受到正調節(jié)。因此，在ptc-lacZ小鼠中，β-半乳糖苷酶蛋白在其中所述hedgehog途徑已被激活的小鼠中過量表達，導致當組織用X-gal底物針對酶活性進行染色時著更深的藍色(由于較高水平的β-半乳糖苷酶所致)。
將ptc-lacZ小鼠分成4個處理組并且用以下化合物或化合物的組合處理4天，而且從出生后的第1天開始(dipal-Shh＝二棕櫚酰化Sonic hedgehog)1)dipal-Shh 10mg/kg/注射 2X/天2)Dipal-Shh 1mg/kg/注射2X/天溶媒 10-15μl/注射 4X/天3)dipal-Shh 1mg/kg/注射2X/天激動劑B 15mg/kg/注射 4X/天4)不進行處理所述激動劑的溶媒是10％DMSO的PBS溶液(pH 7.2)。注射來自在溶媒溶液中溶解的4.67mM原液的激動劑。
最后一次注射后18小時，處死小鼠，收集以下組織顱骨、腎臟、肺、肩胛骨、皮膚和心臟。所有組織都在0.2％戊二醛、5mM EDTA(pH 8.0)、20mM MgCl2、100mM Na2HPO4中固定30分鐘，然后在1mg/ml X-gal、12.5mM亞鐵氰化鉀、12.5mM鐵氰化鉀、2mMMgCl2、0.01％脫氧膽酸、0.02％NP-40和100mM Na2HPO4中染色30小時。判斷各組織的相對強度并照相。
與處理組2(溶媒+低劑量dipal-Shh)相比，來自處理組3(激動劑+低劑量dipal-Shh)的所有組織都表現(xiàn)出β-半乳糖苷酶的顯著正調節(jié)(根據(jù)著更深的藍色所示)，如圖40所示，其中各圖的右邊顯示來自組3的組織。圖41的圖像顯示來自4個處理組中每個處理組的組織的一個實例。組3中觀察到的正調節(jié)與處理組1(高劑量dipal-Shh)中所見到的相似。處理組2中β-半乳糖苷酶染色的水平與在處理組4(不進行處理)中所見到的相似。
在低劑量的dipal-shh存在下，激動劑B顯然能夠正調節(jié)體內(nèi)hedgehog途徑，而低劑量的dipal-shh本身不足以產(chǎn)生可檢測的正調節(jié)。
圖42將ptc-lacZ小鼠分成2個處理組并且用以下化合物處理3天，而且從出生后的第1天開始1)溶媒 8-15μl/注射4X/天2)激動劑D 4mg/kg/注射 4X/天所述激動劑的溶媒是10％DMSO的PBS溶液(pH 7.2)。注射在溶媒溶液中溶解的1.0mM原液的激動劑。
最后一次注射后18小時，處死小鼠，收集前肢并如上所述進行處理。來自激動劑處理的小鼠的前肢在神經(jīng)、血管、軟骨和結締組織中顯示出強正調節(jié)。
在不存在dipal-Shh的情況下，激動劑D顯然能夠正調節(jié)體內(nèi)hedgehog途徑。在該劑量的激動劑D所見到的正調節(jié)要比注射10mg/kg/注射(2X/天)的dipal-Shh所見到的正調節(jié)高。
在第3個實驗中，將ptc-lacZ小鼠分成5個處理組并且用以下化合物處理4天，而且從出生后的第1天開始1) 溶媒 9-20μl/注射 4X/天2) 激動劑D 0.9mg/kg/注射4X/天3) 激動劑D 0.3mg/kg/注射4X/天4) 激動劑D 0.1mg/kg/注射4X/天5) 辛基-shh 10mg/kg/注射 2X/天所述激動劑的溶媒是10％DMSO的PBS溶液(pH 7.2)。注射在溶媒溶液中溶解的0.3mM、0.1mM和0.03mM原液的激動劑。
最后一次注射后18小時，處死小鼠，收集前肢并如上所述進行處理。該實驗結果示于圖43中，在圖中沒有顯示溶媒對照。來自激動劑處理的小鼠的前肢在神經(jīng)、血管、軟骨和結締組織中再次顯示出強正調節(jié)(與溶媒組相比)。在該實驗中，0.9mg/kg組顯示出最高水平的正調節(jié)。0.9mg/kg和0.3mg/kg劑量組均顯示比10mg/kg Hh蛋白組高的正調節(jié)。0.1mg/kg組顯示出很弱的正調節(jié)，顯然比在Hh蛋白組中所見到的要低。
激動劑D顯然能夠以劑量-反應方式正調節(jié)體內(nèi)hedgehog途徑。0.9mg/kg和0.3mg/kg劑量的激動劑D所見到的正調節(jié)比注射Hh蛋白(10mg/kg/注射，2X/天)所見到的正調節(jié)高。
肺分支分布測定收獲E12.5齡ptc-1(d11)lacZ肺，通過使用尾的lacZ檢測，鑒定出轉基因胚胎。將外植塊在置于塑料柵格上層(組織學包埋室)的1μm聚碳酸酯濾膜(Costar)上裝配，然后將其置于裝有肺外植塊培養(yǎng)液(基于DMEM的，其中添加劑對小鼠肺培養(yǎng)物優(yōu)化)的標準12孔組織培養(yǎng)板中達48小時，在lacZ固定劑中固定，沖洗，然后于37℃對lacZ染色。
結果示于圖44。在左邊的對照小圖中，可以觀察到在緊鄰遠端分布尖的間充質中的LacZ表達，即反映出內(nèi)源patched表達的圖式。用5μM激動劑B處理導致報道基因表達和該轉基因表達結構域擴充顯著增加，說明hedgehog途徑受到正調節(jié)。最右邊的小圖顯示用5μg/ml Hh蛋白處理的結果。
腎臟分支分布測定收獲E13.5齡ptc-1(d11)lacZ肺，通過使用尾的lacZ檢測，鑒定出轉基因胚胎。將外植塊在置于塑料柵格上層(組織學包埋室)的1μm聚碳酸酯濾膜(Costar)上裝配，然后將其置于裝有腎外植塊培養(yǎng)液(基于DMEM的，添加劑對小鼠肺培養(yǎng)物優(yōu)化)的標準12孔組織培養(yǎng)板中達48小時，在lacZ固定劑中固定，沖洗，然后于37℃對lacZ染色。
結果示于圖45。在左邊的對照小圖中，可以觀察到在緊鄰最接近的輸尿管上皮的間充質中的LacZ表達，即反映出內(nèi)源patched表達的圖式。用5μM激動劑B處理導致報道基因表達和該轉基因表達結構域擴充顯著增加，說明hedgehog途徑受到正調節(jié)。注意到該信號仍位于間充質中，并且不擴充到位于更遠端的輸尿管上皮中，說明僅內(nèi)源位置中的hedgehog信號反應的間充質細胞類型對所述激動劑有反應，而通常不激活該途徑的細胞類型不受激動劑處理的影響。最右邊的小圖顯示用5μg/ml Hh蛋白處理的結果。
皮膚外植塊用2mm皮膚鉆孔器鉆取ptc-lacZ E17.5幼鼠的皮膚。然后將這些皮膚穿刺物在對照培養(yǎng)基、或者包括激動劑B或D或Hh蛋白的培養(yǎng)基、或者包括激動劑和Hh蛋白兩者的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天。然后該外植塊用X-Gal染色劑染色。圖46A顯示激動劑B的結果。用單獨的激動劑處理顯示比僅與低劑量的Hh蛋白一起培養(yǎng)的染色強，并且用激動劑和低劑量的Hh蛋白處理顯示染色類似于實質上較高劑量的Hh蛋白。激動劑D的類似結果示于圖46B。
人細胞活性圖47A和圖47B比較本發(fā)明主題化合物O和R在小鼠報道細胞(具有Gli-Luc報道構建體的TM3細胞，如上所述)和人報道細胞(具有Gli-Luc構建體的人胚胎腭間充質(HEPM)細胞)中的活性。圖48顯示對在用溶媒、Hh蛋白和激動劑0處理的人細胞中由hedgehog靶基因Gli-1表達的RNA的定量PCR分析。報道細胞系的激活以及Gli-1信使對所述化合物應答時增加證明該激動劑在人細胞中發(fā)揮作用。
體內(nèi)神經(jīng)病學活性已經(jīng)表明，hedgehog(Hh)途徑的激活在包括帕金森病(PD)在內(nèi)的神經(jīng)變性性疾病的動物模型中產(chǎn)生有益的效應。Hh途徑的本發(fā)明主題小分子激動劑表現(xiàn)出有利的藥代動力學特性，并且在口服給藥后有效激活成年嚙齒動物腦中的Hh途徑，正如通過紋狀體誘導的Gli-1表達所證明的。通過這些激動劑激活Hh途徑在以下疾病的體內(nèi)模型中產(chǎn)生保護/再生效應亨廷頓舞蹈病(丙二酸損害)、中風(小鼠大腦中動脈閉塞，MCAO)和帕金森病(小鼠1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶，MPTP)。這些化合物可以誘導以下區(qū)中神經(jīng)前體細胞的增殖兩個已知神經(jīng)發(fā)生持續(xù)終生的腦區(qū)、側腦室的腦室下區(qū)(SVZ)和海馬齒狀回的亞粒狀區(qū)。
部分1Hh激動劑在大鼠亨廷頓舞蹈病的丙二酸模型中是神經(jīng)保護性的先前的研究證明了直接腦給予的Shh蛋白在動物亨廷頓舞蹈病(HD)模型即丙二酸損害模型中是神經(jīng)保護性的。丙二酸是一種線粒體毒素，并且認為線粒體能量代謝方面的缺陷在神經(jīng)變性性疾病(例如HD)的病理中起作用。當將丙二酸注射到大鼠紋狀體中時，病變在該腦區(qū)中形成。下述實驗測試Hh激動劑是否會縮小丙二酸誘導的紋狀體損害的大小。
將Hh激動劑通過與Alzet滲透泵連接的插管直接給藥到雄性SD大鼠的腦室內(nèi)。所述泵裝有溶媒(5％2-羥丙基-B-環(huán)糊精、4.35％甘露糖醇、0.2％DMSO)或Hh激動劑(U″，濃度范圍1-600mM)，并且所述泵將化合物以1μl/小時的恒定速率釋放到腦室內(nèi)達6天。用化合物預處理6天后，將丙二酸直接注射到腦紋狀體中，然后除去Alzet泵。4天后，將大鼠安樂死，然后取出腦組織并將其切成2mm薄切片。將該薄切片置于2％溶液(TTC)中，活組織被染成紅色，而紋狀體梗死組織被染成白色。運用圖象分析軟件測量梗死大小(梗死百分率)，并通過單因素ANOVA，接著通過合適的事后檢驗，對數(shù)據(jù)進行分析(p＜0.05)。
在圖49所示的實驗中，大鼠用溶媒溶媒(n＝8)或200μMU″(n＝8)或300μMU″(n＝7)進行預處理。這些數(shù)據(jù)表明，與溶媒處理的動物相比，直接腦給予的濃度為300μM的Hh激動劑縮小丙二酸誘導的梗死大小(F(2，20)＝5.12，p＝0.0159)。
這些數(shù)據(jù)證明，Hh激動劑在HD的丙二酸模型中是神經(jīng)保護性的。另外，該結果表明，Hh激動劑可以模擬Hh蛋白的神經(jīng)保護效應，這是因為先前已經(jīng)證明所述蛋白在該模型系統(tǒng)中縮小紋狀體損害大小。
部分2Hh激動劑在小鼠中風的MCAO模型中是神經(jīng)保護性的在該動物模型中，將一根細縫線插入到頸總動脈內(nèi)，并直接穿過腦的循環(huán)系統(tǒng)。放入該縫線使其阻斷大腦中動脈(MCA閉塞)的血流，大腦中動脈是前腦的主要血源。過了一段時間，在此為90分鐘，取出縫線，恢復前腦的血流(再灌注)。前腦血流的暫時性阻斷導致模擬人中風患者中所見到的行為癥狀和腦部病理。在腦中，MCA閉塞后24小時，使用染色劑(TTC)可見梗死，TTC將活組織染成紅色，而將梗死區(qū)染成白色。90分鐘后，MCAO通常既出現(xiàn)在腦皮質區(qū)又出現(xiàn)在腦皮質下區(qū)。
MCAO前用Hh激動劑處理在本項研究中，在MCAO之前，小鼠用溶媒(0.5％甲基纖維素、0.2％Tween-80/0.9％NaCl，n＝12)或Hh激動劑X″(20mg/kg，po，n＝11)處理3天(1次/天)。然后使動物經(jīng)受90分鐘MCAO，接著再灌注。開始閉塞后大約24小時(再灌注23.5小時)，將小鼠安樂死，然后取出腦組織并將其切成2mm薄切片。將該腦薄切片用TTC染色，以顯示腦的梗死區(qū)。通過測量和統(tǒng)計學分析，對梗死區(qū)/總前腦(梗死百分率)進行分析。
圖50顯示與溶媒處理的對照相比，用Hh激動劑預處理的小鼠的總梗死大小顯著縮小(p＝0.057)。
圖51顯示皮質中梗死百分率和皮質下(包括紋狀體、丘腦和海馬)中梗死百分率。這些數(shù)據(jù)表明，皮質梗死大小顯著縮小(p＝0.052)。因此，用Hh激動劑預處理在該動物中風模型中是神經(jīng)保護性的。
MCAO后用Hh激動劑處理使雄性小鼠(7-8周齡)經(jīng)受90分鐘MCAO，然后再灌注。然后動物在開始再灌注(閉塞后90分鐘)時用溶媒(n＝11)或Hh激動劑X″(20mg/kg，po，n＝12)處理。開始MCAO后24小時，將小鼠安樂死，然后取出腦組織并將其切成2mm薄切片，然后將各薄切片用TTC染色，供梗死大小分析用。
圖52顯示MCAO后用Hh激動劑處理顯著縮小小鼠梗死大小(p＜0.05)。
同樣，圖53顯示MCAO后用激動劑處理顯著縮小皮質和皮質下?lián)p害大小。
總之，這些數(shù)據(jù)表明，在小鼠MCAO中風模型中，口服給予的Hh激動劑是神經(jīng)保護性的和神經(jīng)恢復性的。
部分3口服Hh激動劑在小鼠MPTP帕金森病模型中是有效的先前的研究證明，SHh蛋白在動物PD模型中是有效的。1-甲基-4-苯基-1，2，3 6-四氫吡啶即MPTP是一種多巴胺能神經(jīng)毒素，給小鼠系統(tǒng)注射該化合物引起與在帕金森病(PD)患者中所見到的相似多巴胺水平降低。設計下述實驗以測試將Hh激動劑給予小鼠是否減少用MPTP處理所見到的多巴胺和酪氨酸羥化酶的損失。
用Hh激動劑預處理減輕由MPTP損害引起的損傷圖54所示的數(shù)據(jù)得自其中給小鼠口服Hh激動劑X″(0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg，po)3天然后用MPTP處理的實驗。MPTP處理后7天，將小鼠安樂死，測量紋狀體中多巴胺(DA)和酪氨酸羥化酶(TH)的水平。
圖54顯示根據(jù)紋狀體DA(圖54)和TH活性的測定，損傷后7天，與溶媒處理的小鼠相比，用Hh激動劑預處理顯著減輕(～↓260％)對黑質紋狀體通路的損傷。
MPTP后用Hh激動劑處理是有效的圖55所示的數(shù)據(jù)得自其中MPTP后3天開始用Hh激動劑處理的實驗。當MPTP損害后3天開始用激動劑處理時，紋狀體DA(圖55)和TH活性水平顯著高于(～↑250％)溶媒處理的小鼠。
這些發(fā)現(xiàn)清楚地證明，小分子Hh激動劑激活Hh途徑對黑質紋狀體通路既發(fā)揮保護性作用又發(fā)揮恢復性作用?？偟膩碇v，這些數(shù)據(jù)對開發(fā)帕金森病的新治療策略具有重要的意義。
部分4用Hh激動劑處理增加成年嚙齒動物神經(jīng)前體細胞的增殖在成體腦中，已知新神經(jīng)元的產(chǎn)生在兩個腦區(qū)即側腦室的腦室下區(qū)(SVZ)和海馬齒狀回的亞粒狀區(qū)(SG)中持續(xù)進行。已知Shh蛋白在各種各樣的體外系統(tǒng)中誘導前體細胞的增殖，包括小腦顆粒狀神經(jīng)元。下述實驗測試用Hh激動劑處理是否會影響成年嚙齒動物腦中內(nèi)源神經(jīng)前體細胞的增殖。
將Hh激動劑直接腦給予成年大鼠增加SVZ前體細胞的增殖通過與Alzet滲透泵連接的導管，將Hh激動劑直接給予雄性SD大鼠的腦室內(nèi)。所述泵裝有溶媒(5％2-羥丙基-B-環(huán)糊精、4.35％甘露糖醇、0.2％DMSO)或Hh激動劑(U″，濃度范圍10-600μM)，所述泵以0.5μl/小時的恒定速率將化合物釋放到腦室中達6天。用化合物預處理6天后，給動物注射溴脫氧尿苷(BrdU，50mg/kg，ip)，以標記正在分裂的細胞。BrdU處理后2小時，將大鼠安樂死，然后灌注固定液。采集大腦并進行加工，供BrdU免疫組織化學用。然后對有導管的腦側(同側)和沒有導管的腦側(對側)SVZ中的BrdU免疫反應性(BrdU-IR)細胞的數(shù)目進行計數(shù)。
圖56顯示得自其中各動物用溶媒(n＝3)或Hh激動劑(200μM，n＝3)的實驗數(shù)據(jù)。在激動劑處理6天后，兩側大腦中BrdU-IR細胞的數(shù)目顯著增加(*p＜0.05)。
這些數(shù)據(jù)證明，直接腦給予Hh激動劑增加成年大鼠腦中內(nèi)源前體細胞的增殖。
口服給予Hh激動劑增加成年小鼠神經(jīng)前體細胞的增殖為了測試口服給予Hh激動劑是否會影響前體細胞的增殖，每天給予小鼠溶媒或Hh激動劑X″達1-7天(每天1次或2次，po)。在適當?shù)囊惶?，給小鼠注射BrdU(ip)，2小時后，將小鼠安樂死，然后灌注固定液并對腦進行加工，供BrdU免疫組織化學用。對SVZ和海馬齒狀回的亞粒狀區(qū)(SG)中的BrdU-IR細胞數(shù)目進行計數(shù)。
圖57和圖58所示的數(shù)據(jù)得自其中口服給予小鼠溶媒(n＝4)或Hh激動劑X″(10mg/kg，n＝3或25mg/kg，n＝3)達7天(BID)的研究。最后一次給藥后一天，給小鼠注射BrdU，2小時后，如上所述采集大腦，加工并進行分析。
圖57顯示與溶媒處理的對照相比，口服給予Hh激動劑7天增加了SVZ中BrdU標記細胞的數(shù)目(*p＜0.05)。圖58的數(shù)據(jù)顯示口服給予Hh激動劑也增加了齒狀回SG中增殖細胞的數(shù)目。
這些數(shù)據(jù)表明，口服給予Hh激動劑增加了這兩個腦區(qū)中神經(jīng)前體細胞的增殖，其中已知神經(jīng)發(fā)生持續(xù)終生。對干細胞增殖的這種影響可能是Hh激動劑在各種神經(jīng)疾病和/或損傷模型中，是一種神經(jīng)保護性/神經(jīng)再生性機制。
部分5在成年動物中口服給予的激動劑正調節(jié)Hh-效應組織用正調節(jié)的Hh效應轉錄因子gli-1作為證明口服給予的Hh激動劑的體內(nèi)生物功效的標記。將為單劑量的本發(fā)明所選的代表性化合物口服給予成年動物，24小時后處死動物并采集組織。用標準定量實時PCR測定測量Gli-1表達，且用GapDH作為參比基因。證明Gli-1在腦、脊髓、周圍神經(jīng)、心臟和肺中受到激動劑的正調節(jié)。綜合得自CNS疾病和周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療模型的數(shù)據(jù)，這些結果證明Hh途徑-效應組織以預期方式對口服給予的激動劑應答，產(chǎn)生了顯著的生物和治療效應。
部分6對鏈佐菌素(STZ)糖尿病大鼠模型中糖尿病性神經(jīng)病的治療在大鼠糖尿病性神經(jīng)病的STZ模型中，顯示SHh-Ig蛋白使運動和感覺神經(jīng)傳導速度正?；?，即標準臨床試驗終點(圖59)。也顯示了口服給予的激動劑D對運動NCV的類似結果(圖60)。另外，根據(jù)坐骨神經(jīng)滋養(yǎng)血管的Doppler激光灌注成像(圖61)和坐骨神經(jīng)滋養(yǎng)血管的BS-1凝集素熒光成像(圖62)的測定，受損神經(jīng)的血流得到改善。另外，SHh-Ig和激動劑D均導致神經(jīng)生長因子(NGF)在坐骨神經(jīng)中的水平增加(圖63)，這被認為是改善神經(jīng)健康狀況的指標。
進行各項研究，以評價參與神經(jīng)功能和修復的因子是否在SHh處理后受到正調節(jié)。在SHh蛋白存在下，體外培養(yǎng)來源于神經(jīng)束膜的成纖維細胞。經(jīng)處理的成纖維細胞證明BDNF和IGF-1被正調節(jié)(圖64)，這被認為有助于介導神經(jīng)以及VEGF的生長和修復(圖65)，而作為生血管生長因子的介導血管的修復和生長的血管生成素-II(圖66)。也證明了VEGF對培養(yǎng)神經(jīng)具有直接營養(yǎng)作用。綜上所述，這些數(shù)據(jù)證明，用SHh蛋白或激動劑激活Hh途徑導致對神經(jīng)組織的許多關鍵性生長因子的正調節(jié)，從而導致神經(jīng)修復。
另外，這些結果證明，用SHh蛋白或激動劑處理對血管疾病具有潛在的廣泛治療效用，以促進血管生長和血流改善。
方法糖尿病的誘發(fā)、監(jiān)控和維持在雄性Wistar大鼠(Charles River，UK or Harlan，San Diego，USA)中，用腹膜內(nèi)注射(55mg/kg)鏈佐菌素(STZ；Sigma)誘發(fā)糖尿病，而且在空腹過夜后給予。臨注射前將藥物新鮮溶于無菌鹽水中。3天后，用strip-operated反射光度計測量尾靜脈血葡萄糖，血葡萄糖＜15mmol/l的任何STZ處理的大鼠排除在本研究之外。大鼠分組關養(yǎng)，自由進食進水，12小時光照/黑暗周期。每項研究結束時，采集所有大鼠的血樣，提取血漿，使用商業(yè)試劑盒(Sigma，St.Louis，MO)，通過分光光度分析測量血漿葡萄糖水平。
藥物治療對于體外分析，所用的SHh蛋白或者是未經(jīng)修飾的(SHh)或者是通過用2個異亮氨酸分子取代N-末端半胱氨酸而修飾的(II-SHh)(F.R.Taylor等，Enhanced potency of human sonic hedgehog byhydrophobic Modification(人sonic hedgehog由于疏水性修飾而效力增強).2001.Biochemistry 404359-4371)。對于體內(nèi)研究，另外將經(jīng)修飾的SHh與IgG1融合(SHh-IgG)。讓SHh-IgG在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastorus)中表達，用SP瓊脂糖凝膠、A蛋白瓊脂糖凝膠和CMporos層析純化。將完整的融合蛋白合并，過濾并透析到2X PBS中，供貯存用。在每項研究開始時制備日等份樣品，進行編號，以便實驗者無法得知處理組，然后將其貯存于-70℃。臨用前將注射物在室溫下解凍，然后用水稀釋，以達到溶媒終濃度為1X PBS。在大鼠頸背皮下注射劑量為0.3mg/kg、1.0mg/kg或3.0mg/kg的SHh-IgG (Mon，Wed，F(xiàn)ri)，每周注射3次。給不接受SHh-IgG的所有動物都注射溶媒?；继悄虿?-8周后開始進行治療，并再維持4周，致使糖尿病的總持續(xù)時間為8-12周，這取決于具體的研究。
神經(jīng)傳導速度測量大鼠用氟烷或異氟烷麻醉，然后評價神經(jīng)傳導速度(NCV)。根據(jù)后肢肌電圖的化合物M波的潛伏期，測量運動神經(jīng)傳導速度(MNCV)；根據(jù)同一系統(tǒng)中H反射潛伏期，測量感覺神經(jīng)傳導速度(SNCV)。涉及背根但不是前根的選擇性橫切片的初步研究建立了我們的H波測量的真實有效性(APM，未發(fā)表的數(shù)據(jù))。在坐骨神經(jīng)壓跡處對神經(jīng)進行刺激，并記錄足骨間肌的引發(fā)的肌電圖。在整個程序中，將中股神經(jīng)溫度保持在36±0.5℃。
坐骨神經(jīng)滋養(yǎng)血管的Laser Doppler灌注成像根據(jù)P.Schratzberger等，Reversal of experimental diabeticneuropathy by VEGF gene transfer(通過VEGF基因轉移逆轉實驗性糖尿病性神經(jīng)病).2001.J Clin.Invest.107(9)1083-92描述的方法，進行所述程序。
坐骨神經(jīng)滋養(yǎng)血管的BS-1凝集素熒光成像根據(jù)P.Schratzberger等，Reversal of experimental diabeticneuropathy by VEGF gene transfer(通過VEGF基因轉移逆轉實驗性糖尿病性神經(jīng)病).2001.J Clin.Invest.107(9)1083-92描述的方法，進行使用BS-1凝集素的程序。
神經(jīng)生長因子(NGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)蛋白質測定根據(jù)P.Fernyhough等，Human recombinant nerve growth factorreplaces deficient neurotrophic support in the diabetic rat(人重組神經(jīng)生長因子置換糖尿病大鼠體內(nèi)的缺陷型神經(jīng)營養(yǎng)支持體).1995.Eur.JNeurosci.71107-1110描述的方法，通過ELISA測定坐骨神經(jīng)節(jié)段提取物中的NGF。通過標準ELISA測定、VEGF、腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)mRNA測定，測量VEGF。使用GapDH作為參比基因，通過標準定量實時PCR技術，測定所有這3種生長因子。
本發(fā)明化合物的制備a.說明性的合成方案用于制備可用于本發(fā)明方法和組合物的hedgehog激動劑的示例性合成方案示于圖1-31。
圖1-31的說明性方案中的反應條件如下1)R1CH2CN，NaNH2，甲苯(Arzneim-Forsch，1990，40，11，1242)2)H2SO4，H2O，回流(Arzneim-Forsch，1990，40，11，1242)3)H2SO4，EtOH，回流(Arzneim-Forsch，1990，40，11，1242)4)NaOH，EtOH，回流5)(Boc)2O，2M NaOH，THF6)LiHDMS，R1X，THF(Merck專利申請?zhí)朩O 96/06609)7)Pd-C，H2，MeOH8)t-BuONO，CuBr，HBr，H2O
(J.Org.Chem.1977，42，2426)9)ArB(OH)2，Pd(PPh3)4，二噁烷(J.Med.Chem.1996，39，217-223)10)R12(H)C＝CR13R14，Pd(OAc)2，Et3N，DMF(Org.React.1982，27，345)11)Tf2O，THF(J.Am.Chem.Soc.1987，109，5478-5486)12)ArSnBu3，Pd(PPh3)4，二噁烷(J.Am.Chem.Soc.1987，109，5478-5486)13)KMnO4，Py，H2O(J.Med.Chem.1996，39，217-223)14)NaOR1，THF15)NaSR1，THF16)HNR1R13，THF17)HONO，NaBF4(Adv.Fluorine Chem.1965，4，1-30)18)Pd(OAc)2，NaH，DPPF，PhCH3，R1OH(J.Org.Chem.1997，62，5413-5418)19)i.R1X，Et3N，CH2Cl2，ii.R13X20)SOCl2，催化性DMF21)CH2N2，Et2O22)Ag2O，Na2CO3，Na2S2O3，H2O(Tetrahedron Lett.1979，2667)23)AgO2CPh，Et3N，MeOH(Org.Syn.，1970，50，77；J.Am.Chem.Soc.1987，109，5432)24)LiOH，THF-MeOH25)(EtO)2P(O)CH2CO2R，BuLi，THF26)MeO2CCH(Br)＝P(Ph)3，苯27)KOH或KOtBu28)堿，X(CH2)nCO2R29)DPPA，Et3N，甲苯
(Synthesis 1985，220)30)HONO，H2O31)SO2，CuCl，HCl，H2O(Synthesis 1969，1-10，6)32)Lawesson氏試劑，甲苯(Tetrahedron Asym.1996，7，12，3553)33)R2M，溶劑34)30％H2O2，冰CH3CO2H(Helv.Chim.Acta.1968，349，323)35)三光氣，CH2Cl2(Tetrahedron Lett.，1996，37，8589)36)i.(EtO)2P(O)CHLiSO2Oi-Pr，THF，ii.NaI37)Ph3PCH3I，NaCH2S(O)CH3，DMSO(Synthesis 1987，498)38)Br2，CHCl3或其它溶劑(Synthesis 1987，498)39)BuLi，Bu3SnCl40)ClSO2OTMS，CCl4(Chem.Ber.1995，128，575-580)41)MeOH-HCl，回流42)LAH，Et2O或LiBH4，EtOH或BH3-THF(Tetrahedron Lett.，1996，37，8589)43)MsCl，Et3N，CH2Cl2(Tetrahedron Lett.，1996，37，8589)44)Na2SO3，H2O(Tetrahedron LETT.，1996，37，8589)45)R2R4NH，Et3N，CH2Cl246)R2M，溶劑47)CH3NH(OCH3)，EDC，HOBt，DIEA，CH2Cl2或DMF(Tetrahedron Lett，1981，22，3815)48)MeLi，THF
49)mCPBA，CH2Cl250)HONO，Cu2O，Cu(NO3)2，H2O(J.Org.Chem.1977，42，2053)51)R1M，溶劑52)HONO，NaS(S)COEt，H2O(Org.Synth.1947，27，81)53)HSR2或HSR4，CH2Cl254)i-BuOC(O)Cl，Et3N，NH3，THF55)R2R4NH，CH2Cl2，NaBH(OAc)356)R2R4NH，MeOH/CH3CO2H，NaBH3CN57)R2OH，EDC，HOBt，DIEA，CH2Cl2或DMF58)R2OH，HBTU，HOBt，DIEA，CH2Cl2或DMF59)R2R4NH，EDC，HOBt，DIEA，CH2Cl2或DMF60)R2R4NH，HBTU，HOBt，DIEA，CH2Cl2或DMF61)POCl3，Py，CH2Cl262)R2R4NCO，溶劑63)R2OC(O)Cl，Et3N，溶劑64)R2CO2H，EDC或HBTU，HOBt，DIEA，CH2Cl2或DMF65)R2X，Et3N，溶劑66)(CH3S)2C＝N(CN)，DMF，EtOH(J.Med.Chem.1994，37，57-66)67)R2SO2Cl，Et3N，CH2Cl268)R2-或R3-或R4CHO，MeOH/CH3CO2H，NaBH3CN(Synthesis 1975，135-146)69)Boc(Tr)-D或L-CysOH，HBTU，HOBt，DIEA，CH2Cl2或DMF70)Boc(Tr)-D或L-CysH，NaBH3CN，MeOH/CH3CO2H(Synthesis 1975，135-146)71)S-Tr-N-Boc cysteinal，ClCH2CH2Cl或THF，NaBH(OAc)3(J.Org.Chem.1996，61，3849-3862)72)TFA，CH2Cl2，Et3SiH或(3∶1∶1)茴香硫醚/乙二硫醇/DMS
73)TFA，CH2Cl274)DPPA，Et3N，甲苯，HOCH2CH2SiCH3(Tetrahedron Lett.1984，25，3515)75)TBAF，THF76)堿，TrSH或BnSH77)堿，R2X或R4X78)R3NH2，MeOH/CH3CO2H，NaBH3CN79)N2H4，KOH80)Pd2(dba)3，P(o-tol)3，RNH2，NaOtBu，二噁烷，R1NH2(Tetrahedron Lett.1996，37，7181-7184)。
81)氨腈。
82)Fmoc-Cl，碳酸氫鈉。
83)BnCOCl，碳酸鈉。
84)AllylOCOCl，吡啶。
85)芐基溴，堿。
86)草酰氯，DMSO。
87)RCONH2。
88)碳酰二咪唑，中性溶劑(例如DCM，DMF，THF，甲苯)。
89)硫代碳酰二咪唑，中性溶劑(例如DCM，DMF，THF，甲苯)。
90)溴化氰，中性溶劑(例如DCM，DMF，THF，甲苯)。
91)RCOCl，三乙胺92)RNHNH2，EDC。
93)RO2CCOCl，Et3N，DCM。
94)MsOH，吡啶(J.Het.Chem.，1980，607)。
95)堿，中性溶劑(例如DCM，甲苯，THF)。
96)H2NOR，EDC。
97)RCSNH2。
98)RCOCHBrR，中性溶劑(例如DCM，DMF，THF，甲苯)，(Org.Proc.
Prep.Intl.，1992，24，127)。
99)CH2N2，HCl。(Synthesis，1993，197)。
100)NH2NHR，中性溶劑(例如DCM，DMF，THF，甲苯)。
101)RSO2Cl，DMAP。(Tertahedron Lett.，1993，34，2749)。
102)Et3N，RX。(J.Org.Chem.，1990，55，6037)。
103)NOCl或Cl2(J.Org.Che m.，1990，55，3916)。
104)H2NOH，中性溶劑(例如DCM，DMF，THF，甲苯)。
105)RCCR，中性溶劑(DCM，THF，甲苯)。
106)RCHCHR，中性溶劑(DCM，THF，甲苯)。
107)H2NOH，HCl。
108)硫代碳酰二咪唑，SiO2或BF3OEt2。(J.Med.Chem.，1996，39，5228)。
109)硫代碳酰二咪唑，DBU或DBN。(J.Med.Chem.，1996，39，5228)。
110)HNO2，HCl。
111)ClCH2CO2Et(Org.Reactions，1959，10，143)。
112)嗎啉烯胺(Eur.J.Med.Chem.，1982，17，27)。
113)RCOCHR′CN114)RCOCHR′CO2Et115)Na2SO3116)H2NCHRCO2Et117)EtO2CCHRNCO118)RCNHNH2。
119)RCOCO2H，(J.Med.Chem.，1995，38，3741)。
120)RCHO，KOAc。
121)2-氟硝基苯。
122)SnCl2，EtOH，DMF。
123)RCHO，NaBH3CN，HOAC。
124)NH3，MeOH。
l25)2，4，6-Me3PhSO2NH2。
126)Et2NH，CH2Cl2
127)MeOC(O)Cl，Et3N，CH2Cl2128)R2NH2，EDC，HOBT，Et3N，CH2Cl2129)DBU，PhCH3130)BocNHCH(CH2STr)CH2NH2，EDC，HOBT，Et3N，CH2Cl2131)R2NHCH2CO2Me，HBTU，HOBT，Et3N，CH2Cl2132)BocNHCH(CH2STr)CH2OMs，LiHMDS，THF133)R2NHCH2CO2Me，NaBH(OAc)3，ClCH2CH2Cl或THF134)R2NHCH2CH(OEt)2，HBTU，HOBT，Et3N，CH2Cl2135)NaBH(OAc)3，ClCH2CH2Cl或THF，AcOH。
136)哌啶，DMF。
137)Pd(Ph3P)4，Bu3SnH。
138)RCO2H，EDC，HOBT，Et3N，DCM。
139)RNH2，中性溶劑。
140)RCHO，NaBH3CN，HOAc。
141)RNCO，溶劑。
142)RCO2H，EDC或HBTU，HOBt，DIEA，CH2Cl2或DMF。
143)RCOCl，三乙胺144)RSO2Cl，Et3N，CH2Cl2。
145)SnCl2，EtOH，DMF。
146)RNH2，EDC，HOBt，DIEA，CH2Cl2或DMF。
147)二溴乙烷，Et3N，CH2Cl2148)草酰氯，中性溶劑。
149)LiOH，THF-MeOH。
150)碳酰二咪唑，中性溶劑(例如DCM，DMF，THF，甲苯)。
151)RNH2，Et3N，CH2Cl2。
152)堿，RX。
153)DBU，PhCH3154)DPPA，Et3N，甲苯(Synthesis 1985，220)155)SOCl2，催化性DMF。
156)ArH，路易斯酸(AlCl3，SnCl4，TiCl4)，CH2Cl2。
157)H2NCHRCO2Et，中性溶劑。
158)BocHNCHRCO2H，EDC或HBTU，HOBt，DIEA，CH2Cl2或DMF。
159)TFA，CH2Cl2。
b.芳基亞單位的說明性制備方法采用本領域技術人員已知的各種各樣的反應，可以對Ary亞單位進行官能化。芳環(huán)和雜芳環(huán)的化學方法是豐富的，在此僅可給出有用反應的一些例子。下面顯示了多個說明性實施例，特別是可用于產(chǎn)生本發(fā)明主題化合物的聯(lián)芳部分的說明性實施例。
Suzuki偶聯(lián)第1號 Suzuki偶聯(lián)第2號
Stille偶聯(lián)第1號 Stille偶聯(lián)第2號 Stille偶聯(lián)第3號 c.偶聯(lián)底物的說明性制備方法以上概述的偶聯(lián)底物的各大類成員即芳基錫烷、芳基硼酸、芳基三氟甲磺酸酯基和芳基鹵—可得自母體雜環(huán)。一般而言，制備偶聯(lián)底物所需的轉化作用是可靠的，并且適用于大規(guī)模制備。下面顯示了說明性實施例。
芳基碘的制備 芳基錫烷的制備 芳基三氟甲磺酸酯的制備 芳基硼酸的制備 本發(fā)明主題化合物的固相合成法概要洗滌方案方法1水(3x)，丙酮(2x)，N，N-二甲基甲酰胺(3x)，水(2x)，丙酮(1x)，N，N-二甲基甲酰胺(3x)，水(2x)，丙酮(3x)，甲醇(3x)，丙酮(3x)和甲醇(3x)；方法2二氯甲烷，己烷，N，N-二甲基甲酰胺，二氯甲烷，己烷，二氯甲烷和己烷；方法3水，N，N-二甲基甲酰胺，水，1.0M氫氧化鈉水溶液，水，N-N二甲基甲酰胺，水，1.0氫氧化鈉水溶液，水，N，N-二甲基甲酰胺，二氯甲烷，甲醇，二氯甲烷和甲醇。
方法4N，N-二甲基甲酰胺，二氯甲烷，N，N-二甲基甲酰胺，二氯甲烷，甲醇，二氯甲烷，甲醇(2x)和乙醚(2x)。
通用方案 步驟A-(硝基苯-4′-基氧基羧基)芐-4-基氧基甲基聚苯乙烯-(WangPNP碳酸酯聚苯乙烯)的制備羥基芐-4-基氧基甲基聚苯乙烯(Wang樹脂)-在室溫、氮氣下將甲醇鈉(233g，4.31mol)緩慢加入到氯甲基聚苯乙烯(2.4kg，3.6mol官能化填料(functionalised loading))和4-羥基芐醇(581g，4.68mol)的N，N-二甲基乙酰胺(10L)的攪拌混合物中。用N，N-二甲基乙酰胺(13 L)稀釋后，將該混合物于50℃加熱5小時，然后通過裝有P-ETFE篩網(wǎng)(70μm)的套管過濾。采用方法1的順序，將該粗產(chǎn)物進行充分洗滌，然后于60℃真空干燥，得到2630g的標題樹脂。
(硝基苯-4′-基氧基羧基)芐-4-基氧基甲基聚苯乙烯-(Wang PNP碳酸酯聚苯乙烯)在0℃、氮氣下將4-甲基嗎啉(660ml，6.0mol)在2小時內(nèi)滴加到羥基芐-4-基氧基甲基聚苯乙烯(2000g，2.5mol官能化填料)和氯甲酸4-硝基苯酚(1209g，6.0mol)的二氯甲烷(22 L)的攪拌混合物中。將混合物逐漸加熱至室溫，攪拌過夜并通過裝有P-ETFE篩網(wǎng)(70μm)的套管過濾。采用方法2的順序，將該粗品樹脂進行充分洗滌，然后在室溫下真空干燥，得到2728g的標題樹脂和4-甲基嗎啉鹽酸鹽的混合物。
步驟B-Wang樹脂結合的二胺的制備通用方法(對于哌嗪、高哌嗪和反式-1，4-二氨基環(huán)己烷而言)將粗品(硝基苯-4′-基氧基羧基)芐-4-基氧基甲基聚苯乙烯(1002.5g，～0.9mol官能化填料)在50％v/v無水二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺(9L)的混合物中在氮氣下溶脹15分鐘。加入N，N-二異丙胺(626ml，5摩爾當量)和合適的二胺(5摩爾當量)，將混合物在室溫下劇烈攪拌過夜。將混合物通過P-ETFE篩網(wǎng)(70μm)過濾，采用方法3的順序充分洗滌，然后于60℃真空干燥，得到標題樹脂結合的二胺。
與Wang樹脂結合的乙二胺將粗品(硝基苯-4′-基氧基羧基)芐-4-基氧基甲基聚苯乙烯(1002.5g，～0.9mol官能化填料)在二氯甲烷(7L)中在氮氣下溶脹15分鐘，然后用乙二胺(181ml，2.7mol)溶液處理。將所得的粘稠黃色懸浮液用二氯甲烷(2L)稀釋并在室溫下劇烈攪拌過夜。將混合物通過P-PETFE篩網(wǎng)(70μm)過濾，采用方法3的順序充分洗滌，然后于60℃真空干燥，得到樹脂結合的二胺。
與Wang樹脂結合的間苯二甲胺將粗品(硝基苯-4′-基氧基羧基)芐-4-基氧基甲基聚苯乙烯(1002.5g，～0.9mol官能化填料)在四氫呋喃(7L)中在氮氣下溶脹15分鐘，然后用間苯二甲胺(828ml，6.27mol)的四氫呋喃(1L)溶液處理。將所得的粘稠黃色懸浮液用二氯甲烷(2L)稀釋并在室溫下劇烈攪拌過夜。將混合物通過P-ETFE篩網(wǎng)(70μm)過濾，采用方法3的順序充分洗滌，然后于60℃真空干燥，得到樹脂結合的二胺。
步驟C采用Suzuki偶聯(lián)程序制備結構單元將合適的芳基溴(1當量)和碳酸鉀(2.2當量)在甲苯(13倍體積)中的懸浮液在室溫下攪拌并脫氣。加入四(三苯膦)鈀(0)(0.01當量)，將反應容器抽空并用氮氣吹掃(3次)。15分鐘后，通過套管加入2-甲氧基-5-甲?；交鹚?1.2當量)的乙醇(6.3倍體積)脫氣溶液，然后將混合物在回流下加熱并在氮氣下攪拌過夜。冷卻后，從溶液中濾出固體，將其用甲苯充分洗滌。將濾液在減壓下蒸發(fā)至干，得到粗產(chǎn)物。將該粗產(chǎn)物用乙醚(5倍體積)研磨，將所得漿液過濾，用乙醚洗滌并真空干燥。得到為黃色粉末的聯(lián)芳醛。
步驟D將結構單元加載到Wang二胺上還原性烷基化將合適的樹脂(1當量，～0.75mmol官能化填料)在四氫呋喃、原甲酸三甲酯和二氯甲烷(1∶1∶1，v/v/v，10ml)的混合物中溶脹15分鐘，然后輕輕攪拌并用合適的醛(2當量)處理。在室溫下輕輕攪拌過夜后，將樹脂過濾，用四氫呋喃充分洗滌并于40℃真空干燥。然后將干樹脂在四氫呋喃中溶脹15分鐘并用乙酸(0.12當量)和三乙酰氧基硼氫化鈉(5當量)處理。將樹脂懸浮液在室溫下輕輕攪拌過夜，然后過濾，采用方法4的順序充分洗滌并于60℃真空干燥。
?；燃用睂⒑线m的樹脂(1當量)在二氯甲烷(10倍體積)中溶脹10分鐘，然后用合適的?；?3當量)和N，N-二異丙基乙胺(3當量)處理。將樹脂懸浮液在室溫下輕輕攪拌過夜，然后過濾，采用方法4的順序充分洗滌并于40℃真空干燥。
本發(fā)明主題化合物的溶液相合成下面的示例性方案舉例說明一種可以制備本發(fā)明hedgehog激動劑的途徑。對該示例性途徑的變化對于本領域技術人員將會是容易理解和實施的，使得有可能制備屬于所公開通式中的多種化合物。該方案中所用的化合物編號與以下程序中的一致，并且獨立于本申請其它地方(例如附圖)所用的化合物編號。
3-氯-苯并[b]噻吩-2-羧酸(4′-氰基-6-甲氧基-二苯基-3-基甲基)-(4-甲基氨基環(huán)己基)-酰胺鹽酸鹽(7)的合成 (4-氨基-環(huán)己基)-氨基甲酸叔丁酯(1)
將碳酸氫二叔丁酯(12.0g，54.7mmol)和四氫呋喃(250ml)溶液在氮氣下、在3小時內(nèi)緩慢加入到1，4-二氨基環(huán)己烷(50.0g，0.44mol)的四氫呋喃(250ml)懸浮液中，同時將溫度保持在10℃以下。讓混合物升溫至室溫，隨后攪拌16小時，然后過濾。真空濃縮濾液，得到殘余物。向該殘余物中加入水(500ml)，然后攪拌約15分鐘，此后將混合物過濾，水層用二氯甲烷(3×200ml)萃取。合并有機萃取液并濃縮，得到殘余物，將其溶于叔丁基甲基醚(350ml)中，用水(3×50ml)洗滌。真空除去叔丁基甲基醚，得到為固體的標題化合物1(8.1g，69％)δH(360MHzCDCl3)1.06-1.24(m，4H)，1.43(s，9H)，1.83(d，2H)，1.98(d，2H)，2.56-2.66(m，1H)，3.30-3.35(m，1H)和4.31-4.38(m，1H)。
N-甲基-環(huán)己烷-1，4-二胺(2)將胺1(15.0g，0.7mol)在氮氣下、在45分鐘內(nèi)緩慢加入到1N氫化鋁鋰的THF(450ml，0.36mol)溶液中。將混合物在室溫下攪拌30分鐘，然后在回流、氮氣下加熱5-6小時。向該混合物中先加入水(13.2ml)，接著加入15％氫氧化鈉水溶液(13.2ml)和水(39.7ml)。然后將混合物攪拌15-30分鐘。濾出固體，用叔丁基甲基醚(200ml)、二氯甲烷(200ml)和叔丁基甲基醚(200ml)洗滌。收集有機萃取液，干燥(MgSO4)，并過濾。然后干燥劑用二氯甲烷洗滌，合并有機萃取液并真空濃縮，得到為淺黃色固體的標題化合物2(7.52g，84％)δH(360MHzCDCl3)1.04-1.20(q，4H)，1.51(br s，3H)，1.80-1.96(m，4H)，2.25-2.35(m，1H)，2.41(s，3H)，2.61-2.72(m，1H)。
(4-氨基-環(huán)己基)-甲基-氨基甲酸叔丁酯(3)在氮氣下將苯甲醛(12.8ml，0.13mol)一次性加入到N-甲胺2(16.2g，0.13mol)和甲苯(150ml)的溶液中。將所得的混合物用Dean-Stark裝置加熱至回流達4小時，讓該混合物冷卻至室溫后，分次加入碳酸氫叔丁酯(27.5g，0.13mol)，然后將混合物攪拌16小時。真空濃縮混合物，得到黃色油狀物，向所述油狀物中加入1N硫酸氫鉀水溶液(90ml)，接著劇烈攪拌，直到TLC指示反應完成為止(～2.5小時)。將混合物萃取到乙醚(3×100ml)中，用氫氧化鈉水溶液使水層變成堿性(pH～12)。然后水層用氯化鈉飽和，將產(chǎn)物萃取到氯仿(3×40ml)中。真空濃縮合并的萃取液，得到為黃色油狀物的標題化合物3(16.3g，59％)δH(360MHzCDCl3)1.11-1.34(m，5H)，1.45(s，9H)，1.66(br d，2H)，1.90(br d，2H)，2.56-2.66(m，1H)，2.71(s，3H)和3.98(br s，2H)。
{4-[(4′-氰基-6-甲氧基-二苯基-3-基甲基)-氨基]-環(huán)己基}-甲基-氨基甲酸叔丁酯(5)將胺3(5.0g，21.92mmol)、醛4(5.19g，21.92mmol)和原甲酸三甲酯(50ml)的溶液在室溫、氮氣下攪拌16小時。然后分次加入三乙酰氧基硼氫化鈉(6.5g，30.7mmol)，將混合物在室溫下攪拌直至根據(jù)LC-MS分析確定，反應完成。小心地加入水，將混合物攪拌5分鐘，接著分離各層。將原甲酸三甲酯層傾至1N硫酸氫鉀水溶液(100ml)中并攪拌15分鐘。將沉淀的固體過濾，用水(50ml)、冷的三丁基甲基醚(3×30ml)洗滌。然后將經(jīng)洗滌的沉淀懸浮于二氯甲烷(150ml)中，邊劇烈攪拌邊向所述二氯甲烷溶液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液(50ml)，使得pH變成堿性(pH～10)。二氯甲烷層用水和鹽水洗滌，將有機萃取液干燥(MgSO4)并真空濃縮，得到為灰白色固體的標題化合物5(6.9g，69％)δH(360MHzCDCl3)1.18-1.31(m，4H)，1.43(s，9H)，1.68(d，2H)，2.01(d，2H)，2.44-2.56(m，1H)，2.69(s，3H)，3.76(s，2H)，3.80(s，3H)，6.92(d，1H)，7.24(s，1H)，7.29(d，1H)，7.61(d，2H)和7.66(d，2H)。
{4-(3-氯-苯并[b]噻吩-2-羰基)-(4′-氰基-6-甲氧基-二苯基-3-基甲基)-氨基-環(huán)己基}-甲基-氨基甲酸叔丁酯(6)在氬氣下邊攪拌邊將N，N-二異丙基乙胺(2.1ml，12.1mmol)加入到胺5(2.2g，4.9mmol)、3-氯苯并[b]噻吩-2-碳酰氯(1.3g，5.86mmol)和無水二氯甲烷(22ml)的溶液中。根據(jù)TLC監(jiān)測，一旦所有原料耗盡(約2.5小時)，則將該混合物用水、飽和碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗滌。將有機層干燥(MgSO4)并真空濃縮。然后將黃色殘余物經(jīng)用己烷/乙酸乙酯3∶1的硅膠色譜純化，得到為淺黃色固體的標題化合物6(2.93g，93％)。
3-氯-苯并[b]噻吩-2-羧酸(4′-氰基-6-甲氧基-二苯基-3-基甲基)-(4-甲基氨基-環(huán)己基)-酰胺鹽酸鹽(7)將濃鹽酸(27.5ml)加入到化合物6(11.0g，17.1mmol)和乙醇(82.5ml)的溶液中。攪拌混合物，直到根據(jù)TLC監(jiān)測反應完成。真空濃縮混合物，加入二氯甲烷并再次濃縮，重復該步驟直到得到固體為止。然后將固體用叔丁基甲基醚(30ml)研磨成漿液，過濾，將有機層干燥(MgSO4)并真空濃縮，得到標題化合物7(10.0g，99％)δH(360MHzDMSO，70℃)1.30-1.50(m，2H)，1.85(br s，4H)，2.12(br d，2H)，2.48(s，3H)，2.91(br t，1H)，3.81(s，3H)，3.87 (br s，1H)，4.71(s，2H)，7.14(d，1H)，7.29(s，1H)，7.40(d，1H)，7.57-7.68(m，4H)，7.80-7.90(m，3H)，8.09(d，1H)，8.82(br s，2H)。
所選原料的合成反式4-(BOC甲基氨基)環(huán)己胺的合成 反式4-(氨基環(huán)己基)氨基甲酸正丁酯在氮氣下邊攪拌邊將氯甲酸正丁酯(102ml，0.79mol，0.5eq)的二氯甲烷(1.8L，10vol)溶液加入到1，4-反式-二氨基環(huán)己烷(180g，1.58mol，1.0eq)的二氯甲烷(1.8L，10vol)中，并保持溫度在0-5℃之間(冰/鹽浴)。
將所得的懸浮液再攪拌60-70分鐘，然后讓其升溫至5-10℃。加入新鮮配制的碳酸鈉溶液(Na2CO392.0g，0.8mol，0.5eq，在水720ml中，4vol)并再攪拌5分鐘，同時升溫至環(huán)境溫度。
分離各相，水相用二氯甲烷(720ml，4vol)洗滌。合并二氯甲烷相并經(jīng)硫酸鈉(360g，2wt)干燥，過濾并在旋轉蒸發(fā)器上于40℃濃縮至干，得到二胺、雙氨基甲酸酯和單氨基甲酸酯的混合物粗品。
將該粗制材料(164g，1wt)懸浮于水(410ml，2.5vol)中，并在20-25℃下劇烈攪拌10-15分鐘。通過過濾除去固體雙氨基甲酸酯，濾餅用水(164ml，1vol)洗滌。含水濾液用3×TBME(3×3.28L，20vol)萃取。合并TBME層，用水(246ml，1.5vol)回洗，經(jīng)硫酸鈉(492g，3wt)干燥，過濾并在旋轉蒸發(fā)器上于35-40℃濃縮至干，得到固體單氨基甲酸酯產(chǎn)物(87.5g，52％)。
1H-NMR(400MHz)(CDCl3)4.47(1H，bs)；3.97(2H，m)；3.36(1H，bs)；2.57(1H，m)；1.94(2H，m)；1.78(2H，m)；1.51(2H，m)；1.38(2H，六重峰)；1.13(6H，m)；0.86(3H，t)。
反式4-(甲基氨基)環(huán)己胺將氨基甲酸酯(102g)的THF(1L10vol)溶液在30分鐘內(nèi)加入到在冰上冷卻的氫化鋁鋰(90.4g5當量)的THF(2L20vol)懸浮液中。一旦加完，則將反應加熱至回流達2小時(根據(jù)TLC確定完成情況)，然后讓其冷卻過夜。將反應冷卻至0-5℃，通過加入水(90ml)、15％氫氧化鈉(90ml)和更多的水(270ml)猝滅反應。然后將懸浮液在室溫下攪拌1小時，然后過濾并用TBME(2×2L)和DCM(2×2L)洗滌濾餅。通過蒸發(fā)除去溶劑，并通過與甲苯(2L)共沸而除去剩余的水和正丁醇。收率＝62g，通過NMR測定含有10.6wt％甲苯。這等于55.4g(91％)。
反式4-(BOC甲基氨基)環(huán)己胺將甲胺(55.4g)和苯甲醛(46ml1.05當量)溶于甲苯(554ml10vol)中，然后用Dean-Stark裝置加熱至回流達6小時。除去水的計算體積(7.5ml)。向該冷卻溶液中在15分鐘內(nèi)分次加入BOC酐(103.7g1.1當量)，然后將反應物攪拌約3小時(通過NMR測定顯示完成情況)。除去溶劑，得到160g油狀固體(8wt％甲苯相當于147.2g(107％)產(chǎn)物)。將該固體懸浮于1M KHSO4(1.47L10vol)中。此外，用水(200ml)和TBME(100ml)洗滌剩余的原料。4小時后，用TBME(600ml，然后3×300ml)萃取反應物。水層用6M氫氧化鈉(75ml)堿化至pH13，然后用DCM(2×735ml)萃取。合并的DCM層用鹽水(2×500ml)洗滌，然后用Na2SO4干燥。將溶液過濾并蒸發(fā)，得到含有DCM(2.4wt％)的油狀物(69.5g)。收率＝67.8g(69％)。
總收率基于氨基甲酸酯計算＝64％，而基于反式1，4-二氨基環(huán)己烷計算＝16.5％。
3-氯-4，7-二氟苯并[b]噻吩-2-碳酰氯的合成 2，5-二氟苯甲醛的制備將1，4-二氟苯(10g，87.6mmol，1wt)的THF(175ml，17.5vol)溶液在氮氣下攪拌并冷卻至-75℃至-78℃。在大約20分鐘內(nèi)，向反應混合物中加入正丁基鋰(82ml 1.6M的己烷溶液，131.4mmol，1.5eq)，同時保持溫度低于-65℃。再過1小時后，在大約10分鐘內(nèi)，加入DMF(10.16ml，131.4mmol，1.5eq)，同時保持溫度低于-65℃。10分鐘后通過加入乙酸(17.5ml，1.75ml)、緊接著加入水(440ml，36.4vol)而猝滅反應混合物。這使反應放熱至5℃。然后除去冷浴，加入TBME(220ml，22vol)，將反應物攪拌5分鐘。分離各相，水相用TBME(2×220ml，22vol)萃取。將有機相合并，先用0.2M HCl(220ml，22vol)、2M Na2CO3(220ml，22vol)、然后用飽和鹽水(220ml，22vol)洗滌，經(jīng)硫酸鎂(50g，5wt)干燥并在旋轉蒸發(fā)器上濃縮，得到粗產(chǎn)物(11.07g)。經(jīng)Kugelrohr蒸餾純化，得到為無色透明油狀的產(chǎn)物(7.52g，60％)。
2，5-二氟肉桂酸的制備將哌啶(2ml，20.2mmol，0.168vol)加入到2，5-二氟苯甲醛(12.07g，85.0mmol，1wt)和丙二酸(18.28g，175.6mmol，1.51wt)在吡啶(50ml，4.14vol)中的攪拌混合物中。將反應混合物在氮氣下加熱并在回流(油浴100℃)下保持2小時，觀察到泡騰達90分鐘—開始劇烈，然后逐漸減弱。然后讓反應混合物冷卻至20-25℃并傾至經(jīng)攪拌的2M鹽酸(310ml，25.7vol)(pH記錄為1)中。所得的沉淀于20-25℃老化1小時，然后過濾。濾餅用水(2×50ml，4.1vol)洗滌，然后再干燥1小時。如下干燥固體產(chǎn)物將其溶于TBME(250ml，20.7vol)中，分離各相，水相用TBME(100ml，8.3vol)洗滌。將TBME相合并，經(jīng)硫酸鎂(25g，2wt)干燥，過濾并在旋轉蒸發(fā)器上濃縮，得到為白色固體的產(chǎn)物(13.4g，85.7％)。
3-氯-4，7-二氟苯并[b]噻吩-2-碳酰氯的制備將2，5-二氟肉桂酸(26g，0.14mol)和亞硫酰氯(36.1ml；0.49mol)在裝有滌氣聯(lián)動裝置(train)的燒瓶中混合。加入吡啶(2.85ml；35mmol)，使其產(chǎn)生更多的氣體。將反應混合物加熱(Text＝140℃)過夜。將庚烷(260ml；10vol)加熱至回流，然后加入反應混合物。用熱庚烷(2×25ml)充分洗滌反應燒瓶，并使合并的溶液冷卻至0℃。將沉淀濾出，用庚烷(2×25ml)洗滌，在氮氣流下干燥。收率＝17.4g(46％)。
本文中所引用的所有出版物和專利通過引用全部結合到本文中。
本領域技術人員只使用常規(guī)實驗方法就可確認或者能夠確定，此中描述的本發(fā)明具體實施方案的許多等同實施方案。這樣的等同實施方案計劃包括在以下權利要求書的范圍內(nèi)。
權利要求
1.一種由通式(IX)表示的化合物， 式IX其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Ar代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-和任選被1-2個低級烷基取代的亞甲基；Y不存在；Z不存在，或者代表取代或未取代的芳環(huán)、碳環(huán)、雜環(huán)或雜芳環(huán)，或者代表低級烷基、硝基、氰基或鹵基取代基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；Cy代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括包括多環(huán)基；Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，其中所述苯并環(huán)被1-4個選自鹵基、硝基、氰基、甲基和乙基的取代基取代；i所有出現(xiàn)時都代表0，只是在排列順序N-Mi-Y-Ar中例外，其中i代表1；且k代表0。
2.權利要求1的化合物，其中Cy包括至少一個sp3雜化原子。
3.權利要求2的化合物，其中Cy在所述環(huán)中還包括至少一個氮原子或者在所述環(huán)上還包括一個氨基取代基。
4.權利要求1的化合物，其中Cy包括伯胺、仲胺或叔胺，或者被伯胺、仲胺或叔胺取代。
5.權利要求4的化合物，其中Cy為被伯胺或仲胺取代的環(huán)己環(huán)。
6.權利要求5的化合物，其中所述胺為甲氨基。
7.權利要求1的化合物，其中所述苯并環(huán)被1-4個選自鹵基和甲基的取代基取代。
8.權利要求7的化合物，其中所述苯并環(huán)為1，4-二氟苯環(huán)。
9.一種由通式(X)表示的化合物， 式X其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Ar代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-和任選被1-2個低級烷基取代的亞甲基；Y不存在；Z不存在，或者代表取代或未取代的芳環(huán)、碳環(huán)、雜環(huán)或雜芳環(huán)，或者代表低級烷基、硝基、氰基或鹵基取代基；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的低級烷基；Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，其中所述苯并環(huán)被1-4個選自鹵基、硝基、氰基、甲基和乙基的取代基取代；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔，其中在Mj中，M有時或每次出現(xiàn)時都構成完整的環(huán)結構或其一部分；j代表2-7的整數(shù)；i所有出現(xiàn)時都代表0，只是在排列順序N-Mi-Y-Ar中例外，其中i代表1；且k代表0。
10.權利要求9的化合物，其中Mj包括具有5-7個環(huán)原子的環(huán)烷基環(huán)。
11.權利要求10的化合物，其中NR2代表NHMe。
12.權利要求9的化合物，其中Cy為被伯胺或仲胺取代的環(huán)己環(huán)。
13.權利要求12的化合物，其中所述胺為甲氨基。
14.權利要求9的化合物，其中所述苯并環(huán)被1-4個選自鹵基和甲基的取代基取代。
15.權利要求14的化合物，其中所述苯并環(huán)為1，4-二氟苯環(huán)。
16.一種由通式(XI)表示的化合物， 式XI其中，只要化合價和穩(wěn)定性允許，則Ar代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-和任選被1-2個低級烷基取代的亞甲基；Y不存在；Z不存在，或者代表取代或未取代的芳環(huán)、碳環(huán)、雜環(huán)或雜芳環(huán)，或者代表低級烷基、硝基、氰基或鹵基取代基；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的低級烷基；Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，其中所述苯并環(huán)被1-4個選自鹵基、硝基、氰基、甲基和乙基的取代基取代；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；Cy代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基，包括多環(huán)基；i所有出現(xiàn)時都代表0，只是在排列順序N-Mi-Y-Ar中例外，其中i代表1；且k代表0。
17.權利要求16的化合物，其中Cy為被伯胺或仲胺取代的環(huán)己環(huán)。
18.權利要求17的化合物，其中所述胺為甲氨基。
19.權利要求16的化合物，其中所述苯并環(huán)被1-4個選自鹵基和甲基的取代基取代。
20.權利要求19的化合物，其中所述苯并環(huán)為1，4-二氟苯環(huán)。
21.一種藥用組合物，所述組合物包含無菌賦形劑和一種權利要求1的化合物。
22.一種藥用組合物，所述組合物包含無菌賦形劑和一種權利要求9的化合物。
23.一種藥用組合物，所述組合物包含無菌賦形劑和一種權利要求16的化合物。
24.一種調節(jié)細胞增殖或分化的方法，所述方法包括使所述細胞與權利要求1的化合物接觸。
25.權利要求21的方法，其中所述hedgehog激動劑激活hedgehog介導的信號轉導的ED50為1μM或1μM以下。
26.權利要求21的方法，其中所述hedgehog激動劑激活hedgehog介導的信號轉導的ED50為1nM或1nM以下。
27.權利要求24的方法，其中將所述hedgehog激動劑作為治療或美容應用的一部分給予患者。
28.權利要求27的方法，其中所述治療或美容應用選自調節(jié)神經(jīng)組織、骨和軟骨的形成和修復、調節(jié)精子發(fā)生、調節(jié)平滑肌、調節(jié)肺、肝和其它起源于原始消化管的器官、調節(jié)造血功能和調節(jié)皮膚和毛發(fā)的生長。
29.一種調節(jié)細胞增殖或分化的方法，所述方法包括使所述細胞與權利要求9的化合物接觸。
30.權利要求29的方法，其中所述hedgehog激動劑激活hedgehog介導的信號轉導的ED50為1μM或1μM以下。
31.權利要求29的方法，其中所述hedgehog激動劑激活hedgehog介導的信號轉導的ED50為1nM或1nM以下。
32.權利要求29的方法，其中將所述hedgehog激動劑作為治療或美容應用的一部分給予患者。
33.權利要求32的方法，其中所述治療或美容應用選自調節(jié)神經(jīng)組織、骨和軟骨的形成和修復、調節(jié)精子發(fā)生、調節(jié)平滑肌、調節(jié)肺、肝和其它起源于原始消化管的器官、調節(jié)造血功能和調節(jié)皮膚和毛發(fā)的生長。
34.一種調節(jié)細胞增殖或分化的方法，所述方法包括使所述細胞與權利要求16的化合物接觸。
35.權利要求34的方法，其中所述hedgehog激動劑激活hedgehog介導的信號轉導的ED50為1μM或1μM以下。
36.權利要求34的方法，其中所述hedgehog激動劑激活hedgehog介導的信號轉導的ED50為1nM或1nM以下。
37.權利要求34的方法，其中將所述hedgehog激動劑作為治療或美容應用的一部分給予患者。
38.權利要求37的方法，其中所述治療或美容應用選自調節(jié)神經(jīng)組織、骨和軟骨的形成和修復、調節(jié)精子發(fā)生、調節(jié)平滑肌、調節(jié)肺、肝和其它起源于原始消化管的器官、調節(jié)造血功能和調節(jié)皮膚和毛發(fā)的生長。
39.一種藥用制劑，所述制劑包含無菌的藥用賦形劑和一種由通式(I)表示的化合物， 式I其中Ar和Ar′獨立代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR2)-和任選被1-2個選自低級烷基、鏈烯基和鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)；Cy和Cy′獨立代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基；i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)；且n每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)。
40.權利要求39的藥用制劑，其中Y在所有位置上都不存在。
41.權利要求39的藥用制劑，其中M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基。
42.權利要求39的藥用制劑，其中X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
43.權利要求39的藥用制劑，其中Cy包括至少一個sp3雜化原子。
44.權利要求39的藥用制劑，其中Cy′為取代或未取代的芳基或雜芳基。
45.權利要求39的藥用制劑，其中Cy包括伯胺、仲胺或叔胺，或者被伯胺、仲胺或叔胺取代。
46.一種藥用制劑，所述制劑包含無菌的藥學上可接受的賦形劑和由通式(II)表示的有機分子， 式II其中Ar和Ar′獨立代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR2)-和任選被1-2個選自低級烷基、鏈烯基和鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔，其中在Mj中，M有時或每次出現(xiàn)時都構成完整的環(huán)結構或其一部分；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)；Cy′代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基；j每次出現(xiàn)時獨立代表0-10的整數(shù)；i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)；且n每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)。
47.權利要求46的藥用制劑，其中Y在所有位置上都不存在。
48.權利要求46的藥用制劑，其中M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基。
49.權利要求46的藥用制劑，其中X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
50.權利要求46的藥用制劑，其中NR2代表被一個或兩個低級烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺。
51.權利要求46的藥用制劑，其中Cy′為取代或未取代的芳基或雜芳基。
52.權利要求46的藥用制劑，其中Cy′為雙環(huán)基。
53.一種藥用制劑，所述制劑包含無菌的藥學上可接受的賦形劑和一種由通式(III)表示的化合物， 式III其中Ar和Ar′獨立代表取代或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)；Y不存在，或者每次出現(xiàn)時獨立代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR2)-和任選被1-2個選自低級烷基、鏈烯基和鏈炔基的基團取代的亞甲基；M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基，或者兩個M結合在一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔，其中在Mj中，M有時或每次出現(xiàn)時都構成完整的環(huán)結構或其一部分；R每次出現(xiàn)時獨立代表H或者取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈炔基、鏈烯基或烷基，或者兩個R結合在一起可形成4-8元環(huán)；Cy和Cy′獨立代表取代或未取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基或環(huán)烷基；i每次出現(xiàn)時獨立代表0-5的整數(shù)；且n每次出現(xiàn)時分別代表0-10的整數(shù)。
54.權利要求53的藥用制劑，其中Y在所有位置上都不存在。
55.權利要求53的藥用制劑，其中M每次出現(xiàn)時獨立代表取代或未取代的亞甲基。
56.權利要求53的藥用制劑，其中X選自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。
57.權利要求53的藥用制劑，其中NR2代表被一個或兩個低級烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺。
58.權利要求53的藥用制劑，其中Cy′為取代或未取代的芳基或雜芳基。
59.權利要求53的藥用制劑，其中Cy′為雙環(huán)基。
60.一種調節(jié)細胞增殖或分化的方法，所述方法包括使所述細胞與權利要求39的制劑接觸。
61.權利要求60的方法，其中將所述hedgehog激動劑作為治療或美容應用的一部分給予患者。
62.權利要求61的方法，其中所述治療或美容應用選自調節(jié)神經(jīng)組織、骨和軟骨的形成和修復、調節(jié)精子發(fā)生、調節(jié)平滑肌、調節(jié)肺、肝和其它起源于原始消化管的器官、調節(jié)造血功能和調節(jié)皮膚和毛發(fā)的生長。
63.一種調節(jié)細胞增殖或分化的方法，所述方法包括使所述細胞與權利要求46的制劑接觸。
64.權利要求63的方法，其中將所述hedgehog激動劑作為治療或美容應用的一部分給予患者。
65.權利要求64的方法，其中所述治療或美容應用選自調節(jié)神經(jīng)組織、骨和軟骨的形成和修復、調節(jié)精子發(fā)生、調節(jié)平滑肌、調節(jié)肺、肝和其它起源于原始消化管的器官、調節(jié)造血功能和調節(jié)皮膚和毛發(fā)的生長。
66.一種調節(jié)細胞增殖或分化的方法，所述方法包括使所述細胞與權利要求53的制劑接觸。
67.權利要求66的方法，其中將所述hedgehog激動劑作為治療或美容應用的一部分給予患者。
68.權利要求67的方法，其中所述治療或美容應用選自調節(jié)神經(jīng)組織、骨和軟骨的形成和修復、調節(jié)精子發(fā)生、調節(jié)平滑肌、調節(jié)肺、肝和其它起源于原始消化管的器官、調節(jié)造血功能和調節(jié)皮膚和毛發(fā)的生長。
69.一種治療或預防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，所述方法包括口服給予患者一種權利要求1、9或16的化合物或者一種權利要求39、46或53的制劑。
70.權利要求69的方法，其中所述疾病是帕金森病、亨廷頓舞蹈病或局部缺血。
71.一種在體外調節(jié)細胞生長、分化或存活的方法，所述方法包括口服給予患者一種權利要求1、9或16的化合物或者一種權利要求39、46或53的制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供可利用的用于調節(jié)細胞或組織增殖或分化的方法和試劑，所述方法包括使所述細胞與hedgehog激動劑例如圖32和圖33中所示的化合物接觸。在某些實施方案中，所述方法和試劑可用于例如通過拮抗正常ptc途徑或者激活smoothened或hedgehog活性來校正或抑制異?；虿幌胍纳L狀態(tài)。
文檔編號A61P21/00GK1578779SQ02823332
公開日2005年2月9日 申請日期2002年9月18日 優(yōu)先權日2001年9月26日
發(fā)明者A·D·巴克斯特, E·A·博伊德, M·弗蘭克－卡梅內(nèi)特斯基, J·波特, S·普里斯, L·L·魯賓, J·H·A·施蒂巴德 申請人:柯里斯公司