專利名稱：用于角膜和眶內(nèi)缺損修復(fù)的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了分離的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞，其被誘導(dǎo)表達至少一種眼內(nèi)基質(zhì)細胞的特征。還提供了用分化的或未分化的脂肪來源的基質(zhì)細胞修復(fù)眼的角膜和眶內(nèi)缺損的方法。
背景技術(shù)：
眼是由多組織類型構(gòu)成的復(fù)雜器官。眼由三個不同的層構(gòu)成，從外到內(nèi)依次為鞏膜和角膜、脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜。這三層內(nèi)部為折射介質(zhì)房水、晶狀體和玻璃體?；|(zhì)細胞為眼每一層構(gòu)成整體所必要的組分，并與相鄰上皮、內(nèi)皮、神經(jīng)元及炎性細胞共享重要的調(diào)節(jié)關(guān)系。許多情況影響眼和它的功能。例如，角膜疾病包括所謂的原發(fā)病和繼發(fā)病(Kruse和Volcker，1997，Curr.Opin.Opthalmol.8(4)46-54)。眼的原發(fā)病包括但不限于無虹膜或虹膜缺失；紅斑角皮病或皮膚變紅及角化過度；以及具有多重內(nèi)分泌缺陷的角膜炎。眼的繼發(fā)病包括但不限于化學(xué)損傷；熱損傷；接觸鏡角膜??；反復(fù)角膜緣外科手術(shù)以及帶狀角膜病(自角膜緣向角膜形成灰色條帶的變性病癥)。
許多這些疾病涉及角膜自我更新的干細胞，其定居于角膜緣的基底層中，位于角膜和結(jié)膜之間(Kruse和Volcker，1997，Curr.Opin.Opthalmol.8(4)46-54)。角膜緣功能不全(insufficiency)或干細胞機能障礙產(chǎn)生包括視力降低、畏光、炎癥、水腫以及眼瞼控制肌肉痙攣在內(nèi)的癥狀。在有些情況下，這可以通過向角膜患病區(qū)域移植健康角膜緣組織得以矯正，象離散分布的化學(xué)燒傷的情況。許多證據(jù)顯示角膜干細胞與它們下面的基質(zhì)之間的相互作用對于正常功能是關(guān)鍵性的。
這兩種相鄰的細胞類型表現(xiàn)出特異性的自分泌和旁分泌途徑。這些途徑由基質(zhì)細胞所釋放的細胞因子介導(dǎo)，包括但不限于，轉(zhuǎn)化生長因子β1和β2(TGFβ)、胰島素樣生長因子(IGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、肝生長因子(HGF)以及角質(zhì)形成細胞生長因子(KGF)。這些細胞因子中每一個的受體由角膜上皮細胞合成。同樣地，角膜上皮細胞合成TGFβ1和β2、IGF、bFGF和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。除了VEGF受體，基質(zhì)細胞表達所有這些細胞因子以及血小板衍生生長因子(PDGF)和上皮生長因子(EGF)的受體(Kruse和Volcker，1997，Curr.Opin.Opthalmol.8(4)46-54)。
角膜通過將光折射到晶狀體和視網(wǎng)膜上在正常視力的維持中起著關(guān)鍵性的作用。這需要角膜上皮細胞連續(xù)不斷地自我更新以保護深層組織免受感染(Lu等2001，Exp Biol Med 226(7)653-64)。外科手術(shù)操作，例如屈光性角膜切削術(shù)或激光原位角膜磨鑲術(shù)，涉及部分角膜的去除。實施這些操作用來治療各種形式的近視(myopia或nearsightedness)(Wilson等2001，Arch Ophthalmol119(6)889-96)。
這些操作之后的修復(fù)需要伴隨著上皮分層的基質(zhì)收縮(Taliana等2001，Invest Ophthalmol Vis Sci；42(1)81-9)。在愈合過程中，很多患者經(jīng)歷術(shù)后前“基質(zhì)混濁”，在動物模型中特征在于出現(xiàn)表達α平滑肌肌動蛋白(a-SMA)的肌成纖維細胞(Nakamura等2001，Br JOphthalmol；85(2)209-13)。這些肌成纖維細胞在培養(yǎng)物中由TGFβ誘導(dǎo)，并在體內(nèi)被抗-TGFβ抗體阻斷(Jester等1997，Cornea；16(2)177-87；Jester等1999，Prog Retin Eye Res；18-(3)311-56)。同樣地，存在著上皮細胞和相鄰基質(zhì)間直接的相互作用能夠誘導(dǎo)肌成纖維細胞基質(zhì)分化的證據(jù)。這進一步受到羊膜存在的影響(Choi和Tseng 2001，Cornea；20(2)197-204)。動物模型中“基質(zhì)混濁”的程度與屈光性角膜切削術(shù)期間對角膜基質(zhì)的損害深度相對應(yīng)(Moller-Pedersen等1998，Cornea；17(6)627-39)。而在患者中，角膜混濁的程度相同，不取決于去除上皮細胞的技術(shù)(基于機械或激光的技術(shù))(Lee等2001，Ophthalmology；108(1)112-20)。
多種生物材料已用于治療和修復(fù)角膜和眼缺損及損傷。角膜胞外基質(zhì)富含膠原質(zhì)和糖胺聚糖(Robert等2001，Pathol Biol(Paris)；49(4)353-63)。已發(fā)現(xiàn)一種糖胺聚糖-透明質(zhì)酸糖胺多糖在大鼠和家兔模型中可改善角膜上皮傷口愈合，如通過評估基質(zhì)和內(nèi)皮層評價的(Nakamura等1997，Exp Eye Res；64(6)1043-50；Chung等1999，Ophthalmic Res；31(6)432-9)。Tseng及他人開拓了羊膜在治療多種眼疾中的應(yīng)用(美國專利No.6,152,142)。羊膜是有極性的，具有“基質(zhì)”側(cè)和“基底膜”側(cè)?；|(zhì)側(cè)含有膠原I和III及纖連蛋白，其基底層分布有IV型膠原質(zhì)、層粘連蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖。羊膜的基底膜側(cè)支持上皮細胞生長，而基質(zhì)側(cè)以與膠原相似的方式支持成纖維細胞的生長。羊膜分離自人類胎盤，冷藏，并用于眼內(nèi)疾病的外科手術(shù)修復(fù)。
羊膜的作用機制尚未完全了解。不過，存在關(guān)于培養(yǎng)物中羊膜的存在抑制成纖維細胞表達TGFβ(Lee等2000，Curr Eye Res；20(4)325-334)以及上皮細胞表達白介素1α和白介素1β(Solomon等2001，Br J Ophthalmol；85(4)444-449)的體外證據(jù)。
羊膜已被成功地用于治療廣泛的角膜和眼缺損。例如，已經(jīng)利用多層羊膜填充基質(zhì)層、基底膜以及作為傷口覆蓋物治療深度角膜和鞏膜潰瘍(Hanada等2001，Am J Opthalmol；131(3)324-31)。已發(fā)現(xiàn)羊膜可減輕HIV-1角膜炎(一種免疫介導(dǎo)的疾病)中的基質(zhì)炎癥和潰瘍(Heiligenhaus等2001，Invest Ophthalmol Vis Sci；42(9)1969-1974)。也已用羊膜治療了幾種神經(jīng)營養(yǎng)性角膜潰瘍(Chen等2000，Br JOphthalmol；84(8)826-833)。羊膜恢復(fù)角膜和結(jié)膜表面，并減輕由急性化學(xué)或熱燒傷引起的角膜緣基質(zhì)炎癥(Meller等2000，Ophthalmology；107(5)980-989)。在患有部分角膜緣干細胞缺陷的患者中羊膜被用作為角膜緣自體移植或同種異體移植的備選(Anderson等2001，Br J Ophthalmol；85(5)567-575)。羊膜也用于外科手術(shù)治療翼狀胬肉(從結(jié)膜延伸到角膜的膜翼狀折疊，附著于鞏膜上)(Solomon等2001，Ophthalmology108(3)449-460)。羊膜作為結(jié)膜備選物被成功地用于治療晚發(fā)作的青光眼濾床滲漏(Budenz等2000，Am JOphthalmol；130(5)580-588；Barton等2001，Invest Ophthalmol VisSci；42(8)1762-1768)，以及當(dāng)用于外科手術(shù)治療帶狀角膜病(結(jié)節(jié)病、慢性眼色素層炎及其它病因繼發(fā)的角膜基底膜中的鈣沉積)時，可改善穩(wěn)定角膜上皮的恢復(fù)并減輕眼疼痛(Anderson等2001，Cornea；20(4)354-361)。
由于與獲取羊膜材料有關(guān)的困難，研究人員一直在尋找修復(fù)眼或角膜缺損的基質(zhì)材料的替代來源。
Cancedda等的EP 93830229.6公開了體外培養(yǎng)已分化的眼上皮細胞用于隨后的移植以治療角膜缺損的方法。上皮細胞的來源是來自健康眼的自體活檢材料。這樣患者既作為供體又作為受體。
van der Kooy等的美國專利No.6,117,675公開了分離自哺乳動物視網(wǎng)膜的干細胞，其在體外分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞，并被移植到患有視網(wǎng)膜疾病的個體中。視網(wǎng)膜干細胞的來源是胚胎或早期出生后組織。
Wille，Jr.的美國專利No.5,912,178公開了用于在體外形成各種類型的組織學(xué)完整的人類上皮的培養(yǎng)基和方法，所述上皮包括表皮、角膜、齒齦和輸尿管組織。所得的上皮由分離的動物上皮細胞或分離自上皮組織的基底干細胞在體外生長。
Ogawa等的美國專利No.5,942,487公開了包含干細胞因子的能夠施用于患病角膜組織以刺激角膜生長的組合物。該發(fā)明人猜測角膜干細胞被刺激遷移并生長。
Advanced Tissue Sciences，Inc.的美國專利No.5,863,531公開了體外制備的管狀活基質(zhì)組織，包含基質(zhì)細胞和該基質(zhì)細胞天然分泌的結(jié)締組織蛋白，其附著于且實質(zhì)上包被由生物相容性無生命材料構(gòu)成的三維管狀構(gòu)架，其中具有通過基質(zhì)細胞橋接的間質(zhì)間隙。
本發(fā)明的目的是提供協(xié)助修復(fù)眼包括角膜缺損的細胞、材料和方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了脂肪來源的基質(zhì)細胞或干細胞，它已分化為具有眼內(nèi)或眼基質(zhì)細胞的至少一種基因型或表型特征。該細胞可用于眼的變性疾病或其它疾病的治療性治療。
本發(fā)明還提供了利用和培養(yǎng)脂肪組織來源的基質(zhì)細胞治療任何病因?qū)W的眼內(nèi)或眼缺損的方法和組合物。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了穩(wěn)定地定性和定量誘導(dǎo)來源于皮下、乳腺、生殖腺、網(wǎng)膜或任何其它脂肪組織部位的基質(zhì)細胞表達至少一種眼內(nèi)或眼基質(zhì)細胞的基因型或表型的方法和組合物。
在本發(fā)明的另一個方面，分離的脂肪組織來源的細胞被誘導(dǎo)分化成為表達至少一種眼內(nèi)基質(zhì)細胞的特征的細胞，包括步驟使分離的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞與眼誘導(dǎo)物質(zhì)接觸。該物質(zhì)在化學(xué)成分確定的細胞培養(yǎng)基中，包括生長因子、細胞因子、化學(xué)制劑和/或激素，濃度足以誘導(dǎo)分離的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞表達至少一種眼細胞標志。
在本發(fā)明的另一個方面，脂肪組織來源的基質(zhì)細胞被基因改造以表達能夠修飾細胞表型并誘導(dǎo)促進任何眼內(nèi)缺損恢復(fù)和修復(fù)的途徑的蛋白。這通過在合適的條件下將細胞暴露于含核酸(包括轉(zhuǎn)基因)的基因轉(zhuǎn)移載體完成，這樣預(yù)期的核酸被引入到細胞中。備選地，細胞用裸露核酸處理且允許摻入裸露核酸。
本發(fā)明進一步提供了治療宿主中變性眼病的方法，包括施用已被誘導(dǎo)表達期望的眼細胞的一種特征的脂肪來源的基質(zhì)細胞。本發(fā)明獨特的優(yōu)勢在于脂肪組織來源的基質(zhì)細胞可直接從宿主分離(自體移植)，或者可以由另一宿主捐贈(同種異體移植)。
在本發(fā)明的另一方面，脂肪組織來源的基質(zhì)細胞以其未分化或分化狀態(tài)在由用于外科手術(shù)修復(fù)眼內(nèi)基質(zhì)潰瘍位點的天然或合成的生物相容性材料組成的三維基質(zhì)之中或之上培養(yǎng)。
在本發(fā)明的另一方面，脂肪組織來源的基質(zhì)細胞無需分化直接用于細胞的自體和同種異體移植，以通過矯正氣泡滲漏而促進成功的青光眼外科手術(shù)，在這個實施方案中，向眼施用脂肪來源的基質(zhì)細胞，優(yōu)選是在所期望的位置上，并通過(i)共同施用合適的細胞因子和其它生物因子，或者(ii)已經(jīng)存在的或在宿主中誘導(dǎo)的體內(nèi)因子而使之分化。
又在本發(fā)明的另一方面，脂肪組織來源的基質(zhì)細胞用于細胞的自體和同種異體移植，以治療人類疾病，包括但不限于，由屈光性/治療性角膜切削術(shù)誘導(dǎo)的角膜混濁，“露鞏膜”去除翼狀胬肉期間的修復(fù)，外科手術(shù)治療帶狀角膜病，外科手術(shù)去除結(jié)膜和角膜表面的腫瘤或病變或疤痕組織等。
又在本發(fā)明的另一方面，脂肪組織來源的基質(zhì)細胞與羊膜組織聯(lián)合植入到病眼中。
在本發(fā)明的另一方面，脂肪組織來源的基質(zhì)細胞在植入病眼中之前分化為成脂細胞系細胞。
又在本發(fā)明的另一方面，脂肪組織來源的基質(zhì)細胞分化為成脂細胞系細胞并與羊膜組織一起植入到病眼中。
本發(fā)明的細胞或者作為均一細胞群或者作為其中其它細胞分泌物質(zhì)支持該眼樣細胞生長或分化的細胞群的一部分應(yīng)用。
本發(fā)明也構(gòu)思了用于從脂肪組織中分離干細胞或基質(zhì)細胞的試劑盒，其包括用于從患者中分離脂肪組織的工具以及用于將干細胞與脂肪組織的剩余物分離的工具。試劑盒還包括用于分化干細胞的培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基導(dǎo)致細胞表達眼細胞的至少一種基因型或表型特征，或者通常是眼原性的。
本發(fā)明進一步包括從本發(fā)明的脂肪來源的細胞設(shè)計改造組織的組合物和方法。此類組合物包括與使組織分化和擴展的生物相容性網(wǎng)格(lattice)結(jié)構(gòu)組合的脂肪來源的細胞。這樣以這種方式，眼樣組織或完整器官得以制造。生物相容性網(wǎng)格可以本身是脂肪來源的，并包括任何人類蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白、hyaluronin、纖連蛋白分子、激素、細胞因子和生長因子。網(wǎng)格也可以包括或由選自羥基乙酸、乳酸、延胡索酸丙酯、己內(nèi)酯、透明質(zhì)酸糖胺多糖、透明質(zhì)酸或其組合的單體的聚合物制備?？蛇x地，聚合材料可以是蛋白、多糖、多羥基酸、聚原酸酯、聚酐、聚磷腈、合成聚合物或其組合。聚合材料也可以是通過交聯(lián)其中分散有細胞的聚合物懸液形成的水凝膠。
本發(fā)明的其它目的和特點由于下述公開內(nèi)容及所依附的權(quán)利要求將會更加充分明顯。
附圖的簡要說明

圖1為人類脂肪來源的基質(zhì)細胞的流式細胞儀分析。描繪的是代表性的CD9、CD29(β1-整聯(lián)蛋白)、CD44(透明質(zhì)酸受體)、CD49d(α4整聯(lián)蛋白)、CD55(衰變加速因子)以及HLA-ABC(1類組織相容性抗原)的流式細胞儀分析。分離自單個供體的未分化的基質(zhì)細胞用針對所示抗原的單克隆抗體(實線，每個圖表的右側(cè))；同種型單克隆對照抗體(虛線，每個圖表的左側(cè))染色。代表n＝5個供體。柱條表示熒光強度＞99％對照。
圖2為12天共培養(yǎng)物中淋巴先祖細胞的示意圖。顯著百分比的CD34+和CD34-細胞表達CD7或CD10抗原(n＝4個基質(zhì)供體，n＝2個UCB供體)。個體表型代表下列總造血細胞群的百分比早期淋巴先祖細胞分別為20.2％(CD34+CD7+)和9.5％(CD34+CD10+)；NK/T-細胞先祖(CD34-CD7+)，31.4％；而B-細胞先祖(CD34-CD10+)，7.7％。
發(fā)明詳述本發(fā)明是脂肪來源的基質(zhì)細胞或干細胞，其被誘導(dǎo)表達至少一種起源于眼的細胞的基因型或表型特征。更優(yōu)選地，細胞具有至少一種角膜上皮細胞的基因型或表型特征?？蛇x地，細胞具有至少一種眼基質(zhì)細胞的基因型或表型特征。由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的細胞提供了部分或完全分化的、或者未分化的功能細胞來源，所述細胞具有成熟眼細胞的基因型或表型特征，用來研究、移植和研發(fā)細胞治療產(chǎn)品，以治療動物疾病，優(yōu)選人類疾病，組織修復(fù)或改善，以及矯正眼，優(yōu)選角膜上皮的變性疾病。也包括制備和利用此類細胞的方法。
I.定義“結(jié)膜”是指襯著眼瞼并覆蓋鞏膜的暴露表面的膜。
“角膜”是指形成眼的纖維膜的前部的透明構(gòu)造。它由5層構(gòu)成，具體地1)前角膜上皮，與結(jié)膜是連續(xù)的；2)前限制層(前彈性層)；3)固有質(zhì)(substantia propria)或基質(zhì)層；4)后限制層(后彈性層)；和5)前房的內(nèi)皮或keratoderma。
“視網(wǎng)膜”是指眼球3層被膜的最里層，包繞玻璃體并在后與視神經(jīng)相連續(xù)。它被分為視部(位于脈絡(luò)膜上)、睫狀體部(位于睫狀體上)以及虹膜部(位于虹膜后表面上)。粗略地講，視網(wǎng)膜由外色素層(色素部)以及內(nèi)透明層(神經(jīng)部)組成，它們一起構(gòu)成了視部。眼的視部由9層組成，從內(nèi)向外命名為1)內(nèi)限制膜；2)神經(jīng)纖維層；3)神經(jīng)節(jié)細胞層；4)內(nèi)網(wǎng)織層；5)內(nèi)核層；6)外網(wǎng)織層；7)外核層；8)外限制膜；和9)桿細胞和錐細胞層。
“轉(zhuǎn)化生長因子β”(TGFβ)是55kDa、391個氨基酸(aa)的前蛋白原，其由23個aa的信號序列，256個aa的蛋白原(pro)-區(qū)域以及112個aa的成熟區(qū)段組成。分泌前，蛋白原-區(qū)域由弗林蛋白酶樣蛋白酶在RxxR位點處切割。這產(chǎn)生非糖基化的25 kDa二硫鍵連接的成熟二聚體，其與它先前所連的二硫鍵連接的蛋白原-區(qū)域非共價結(jié)合，形成“隱性復(fù)合物”。該復(fù)合物被分泌。活化在胞外在多種條件下發(fā)生，極有可能是通過跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶引發(fā)由轉(zhuǎn)錄因子Smad家族介導(dǎo)的胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)。
“堿性成纖維細胞生長因子”(bFGF)，也被稱為FGF-2，為18kDa非糖基化的多肽，其既表現(xiàn)出胞內(nèi)活性又表現(xiàn)出胞外活性。BFGF作為單體分泌。分泌后，bFGF被隔絕到細胞表面硫酸肝素(HS)或基質(zhì)糖胺聚糖上。雖然bFGF作為單體分泌，細胞表面HS似乎使單體bFGF以非共價側(cè)對側(cè)的構(gòu)型二聚化，其隨后能夠二聚化并活化FGF受體。
“血小板衍生生長因子”(PDGF)為30kDa的命名為A和B的兩個基因上不同而結(jié)構(gòu)上相關(guān)的多肽鏈的同二聚體或異二聚體組合。它最初在血清中被鑒定為血小板衍生的成纖維細胞有絲分裂原。后來的研究證明許多細胞類型分泌PDGF，并且該細胞因子是中胚層細胞系(肌肉、骨骼、結(jié)締組織)細胞的有絲分裂原。
“血管內(nèi)皮生長因子”(VEGF)首先被鑒定為內(nèi)皮細胞的生長和存活因子。它誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖并調(diào)節(jié)血管生成和脈管生成。VEGF是肝素結(jié)合糖蛋白，其作為45kDa的同二聚體分泌。很多細胞類型但通常非內(nèi)皮細胞本身分泌VEGF。
“肝細胞生長因子”(HGF)，也被稱為分散因子，是促進有絲分裂發(fā)生、遷移、侵入和形態(tài)發(fā)生的多功能細胞因子。HGF-依賴性信號傳導(dǎo)通過促進聚集和細胞粘附而調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白功能。HGF/SF-誘導(dǎo)的效果通過MET酪氨酸激酶受體配體結(jié)合之后的信號傳導(dǎo)而發(fā)生。
“角質(zhì)形成細胞生長因子”(KGF)或FGF-7，是28kDa的單鏈分泌糖蛋白，其具有相對局限于上皮細胞的靶標。該分子作為194個aa的前體合成，含有31個aa的信號序列和163個aa的成熟區(qū)段。成熟的生長因子通過該分子分離的區(qū)域與肝素及其受體(KGFR)結(jié)合。表達FGF-7的成人細胞包括成纖維細胞、T-細胞、平滑肌細胞和卵巢卵泡膜細胞。在胚胎中，KGF可在發(fā)育的許多階段見于整個間充質(zhì)。
“胰島素樣生長因子”(IGF)，IGF-I和IGF-II，與胰島素享有50％的結(jié)構(gòu)同源性。IGF起著細胞增殖的促有絲分裂刺激物以及細胞凋亡途徑的抑制劑的作用。在生長激素(GH)的調(diào)控下，肝是IGF產(chǎn)生的主要部位。IGF-I水平也受到營養(yǎng)和發(fā)育階段的影響。自分泌和旁分泌組織產(chǎn)生的IGF有助于可用于生長調(diào)控的IGF的水平。
“發(fā)育表型”是細胞通過分化過程獲得特定表型的潛能。
“激素”是由細胞分泌的且在接觸時導(dǎo)致同一個細胞或另一個細胞表型改變的任何物質(zhì)。
“基因型”是指分化途徑相關(guān)基因的至少一個信使RNA轉(zhuǎn)錄物的表達。
術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”用于描述任何動物或其部分，包括但不限于在其細胞內(nèi)包括外源遺傳材料的細胞、培養(yǎng)物或組織。本發(fā)明的細胞可以向其添加DNA，并且然后這些細胞能夠用于移植或者用于體外產(chǎn)生激素、細胞或組織。
“轉(zhuǎn)基因”是指通過技術(shù)手段插入到細胞中的任何DNA片段，其成為由該細胞發(fā)育而來的細胞、細胞系、組織或生物體基因組的一部分(即穩(wěn)定地整合或作為穩(wěn)定的染色體外元件)。這種轉(zhuǎn)基因可包括對于被引入異源基因的細胞或生物體來說部分或完全異源或者外來的基因，或者可代表與該生物體內(nèi)源基因同源的基因。包括在該定義中的是通過提供RNA序列，轉(zhuǎn)錄成為DNA，然后摻入基因組中所創(chuàng)建的轉(zhuǎn)基因。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”還另外包括通過體外操作或通過任何轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變了其基因組的任何生物體或其部分，包括但不限于細胞、細胞系、細胞培養(yǎng)物或組織。
II.脂肪來源的干細胞或基質(zhì)細胞脂肪來源的干細胞或“脂肪來源的基質(zhì)細胞”是指起源于脂肪組織的細胞。“脂肪”是指任何脂肪組織。脂肪組織可以是來自皮下、網(wǎng)膜/內(nèi)臟、乳腺、性腺或其它脂肪組織部位的褐色或白色脂肪組織。優(yōu)選地，脂肪為皮下白色脂肪組織。此類細胞可以包括原代細胞培養(yǎng)物或者永生化的細胞系。脂肪組織可以來自于具有脂肪組織的任何生物體。優(yōu)選地，脂肪組織是哺乳動物的，更優(yōu)選地該脂肪組織是人類的。脂肪組織便利的來源是來自吸脂外科手術(shù)，不過，脂肪組織的來源或分離脂肪組織的方法對于本發(fā)明不是關(guān)鍵性的。
成人髓外脂肪組織來源的基質(zhì)細胞代表了能夠以對患者最小風(fēng)險或者不適而常規(guī)收獲的基質(zhì)干細胞來源。病理證據(jù)提示脂肪來源的基質(zhì)細胞能夠沿著多種細胞系途徑分化。脂肪組織容易得到并且在許多個體中豐富。在美國肥胖為流行病比例的狀況，其中大于50％的成人超過了推薦的基于他們的身高的BMI。
已經(jīng)充分證明脂肪細胞是可補充的細胞群。即使是通過吸脂術(shù)或其它操作在外科手術(shù)除去后，常見個體中脂肪細胞隨著時間的重現(xiàn)。這提示脂肪組織含有能夠自我更新的基質(zhì)干細胞。
脂肪組織為組織工程應(yīng)用提供了許多實用的優(yōu)勢。首先，它很豐富。其次，它能以患者最小風(fēng)險的方法獲得。第三，它是可補充的。雖然基質(zhì)細胞代表小于0.01％的骨髓有核細胞群，但每克脂肪組織存在高達8.6×104個基質(zhì)細胞(Sen等2001，Journal of CellularBiochemistry 81312-319)。從0.5千克脂肪組織離體擴增2到4周可產(chǎn)生高達500,000,000個基質(zhì)細胞。這些細胞可即刻使用，或者冷藏以備將來的自體或同種異體應(yīng)用。
脂肪來源的基質(zhì)細胞也表多種粘附蛋白和表面蛋白。這些蛋白包括細胞表面標志例如CD9；CD29(整聯(lián)蛋白β1)；CD44(透明質(zhì)酸受體)；CD49d、e(整聯(lián)蛋白α4、5)；CD54(ICAM1)；CD55(衰變加速因子)；CD105(endoglin)；CD106(VCAM-1)；CD166(ALCAM)和HLA-ABC(I類組織相容性抗原)；以及細胞因子例如白介素6、7、8、11；巨噬細胞集落刺激因子；GM集落刺激因子；粒細胞集落刺激因子；白血病抑制因子；干細胞因子以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白。許多這些蛋白具有行使造血支持功能的潛能，并且它們都為骨髓基質(zhì)細胞所共有。
分離、擴增和分化人類脂肪組織來源的細胞的方法已有報道。例如參見Burris等1999，Mol Endocrinol 13410-7；Erickson等2002，Biochem Biophys Res Commun.2002 Jan 18；290(2)763-9；Gronthos等2001，Journal of Cellular Physiology，18954-63；Halvorsen等2001，Metabolism 50407-413；Halvorsen等2001，TissueEng.7(6)729-41；Harp等2001，Biochem Biophys Res Commun 281907-912；Saladin等1999，Cell Growth & Diff 1043-48；Sen等2001，Journal of Cellular Biochemistry 81312-319；Zhou等1999，Biotechnol.Techniques 13513-517。脂肪組織來源的基質(zhì)細胞通過膠原酶消化和差速離心從切碎的人脂肪組織中獲得[Halvorsen等2001，Metabolism 50407-413；Hauner等1989，J Clin Invest 841663-1670；Rodbell等1966，.J Biol Chem 241130-139]。其他人已經(jīng)證明人類脂肪組織來源的基質(zhì)細胞能夠沿著脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞系途徑分化[Erickson等2002，Biochem Biophys Res Commun.2002 Jan 18；290(2)763-9；Gronthos等2001，Journal of Cellular Physiology，18954-63；Halvorsen等2001，Metabolism 50407-413；Halvorsen等，2001，Tissue Eng.2001 Dec；7(6)729-41；Harp等2001，Biochem BiophysRes Commun 281907-912；Saladin等1999，Cell Growth & Diff 1043-48；Sen等2001，Journal of Cellular Biochemistry 81312-319；Zhou等1999，Biotechnol.Techniques 13513-517；Zuk等2001，TissueEng.7211-228。
人類脂肪組織來源的成人基質(zhì)細胞代表了能夠以對患者最小風(fēng)險或者不適而常規(guī)收獲的成人干細胞來源。它們能夠離體擴增，沿著獨特的細胞系途徑分化，被基因工程改造，以及作為自體或者同種異體移植重新引入到個體中。
匹茲堡大學(xué)(University of Pittsburgh)和加州大學(xué)董事會(TheRegents of the University of California)的WO 00/53795以及轉(zhuǎn)讓給匹茲堡大學(xué)的美國專利申請No.2002/0076400公開了基本上沒有脂肪細胞和紅細胞的脂肪來源的干細胞和網(wǎng)格，以及結(jié)締組織干細胞克隆群。所述細胞可以在體內(nèi)和體外單獨或者處于生物相容性組合物中使用，以產(chǎn)生分化的組織和結(jié)構(gòu)。另外，細胞可以擴增并培養(yǎng)以產(chǎn)生激素并提供支持其它細胞群生長和擴增的條件培養(yǎng)基。在另一個方面，這些出版物公開了基本上無細胞的脂肪來源的網(wǎng)格，它包括來自脂肪組織的胞外基質(zhì)材料。網(wǎng)格可用作為基質(zhì)(substrate)在體內(nèi)或體外促進細胞生長和分化為原基或成熟組織或結(jié)構(gòu)。沒有一種出版物公開被誘導(dǎo)表達眼內(nèi)基質(zhì)細胞的至少一種表型或基因型特征的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞。
轉(zhuǎn)讓給Artecel Sciences的美國專利No.6,391,297公開了分離的人類脂肪組織來源的基質(zhì)細胞的組合物，其已經(jīng)分化表現(xiàn)出成骨細胞的至少一種特征，能夠用于體內(nèi)修復(fù)骨骼和治療骨病。該脂肪來源的成骨細胞樣細胞可任選地進行遺傳修飾或與基質(zhì)組合。
轉(zhuǎn)讓給BioHoldings International的美國專利No.6,426,222公開了通過在必須含有糖皮質(zhì)激素的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中溫育脂肪組織細胞而從人類髓外脂肪組織誘導(dǎo)成骨細胞分化的方法。
列舉Halvorsen等為發(fā)明人的WO00/44882和美國專利No.6,153,432公開了將分離自脂肪組織的人類前脂肪細胞分化為帶有與在分離的原始脂肪細胞中所觀察到的相似的生物化學(xué)、遺傳以及生理學(xué)特征的脂肪細胞的方法和組合物。
Artecel Sciences的WO01/62901以及公開的美國專利申請No.2001/0033834公開了已經(jīng)被誘導(dǎo)表達神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、造血先祖細胞或肝細胞的至少一種表型特征的分離的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞。另外，也公開了已經(jīng)分化從而缺乏脂肪細胞表型標志的分離的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞。
轉(zhuǎn)讓給Artecel Sciences的美國專利No.6,429,013公開了涉及已經(jīng)被誘導(dǎo)表達至少一種軟骨細胞特征的分離的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞的組合物。也公開了分化這些細胞的方法。
Peterson等的美國專利No.6,200,606公開了具有產(chǎn)生骨骼或軟骨潛能的前體細胞可以從包括外周血、骨髓和脂肪組織的多種造血及非造血組織中分離。
可用于本發(fā)明的方法的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種方法分離的，例如象匹茲堡大學(xué)等的WO 00/53795中所描述的。在優(yōu)選的方法中，脂肪組織分離自哺乳動物受試者，優(yōu)選為人類受試者。優(yōu)選的脂肪組織來源是網(wǎng)膜脂肪。在人類中，脂肪典型地通過吸脂術(shù)分離。如果本發(fā)明的細胞要移植到人類受試者中，優(yōu)選脂肪組織分離自同一個受試者，以便提供自體移植?？蛇x地，移植的細胞是同種異體的。
作為非限制性實例，在分離脂肪組織來源的基質(zhì)細胞的一個方法中，脂肪組織用0.01到0.5％之間，優(yōu)選0.04到0.2％，最優(yōu)選0.1％濃度的膠原酶、0.01到0.5％之間，優(yōu)選0.04到0.04％，最優(yōu)選0.2％濃度的胰蛋白酶在25到50℃之間，優(yōu)選在33到40℃之間，最優(yōu)選在37℃的溫度下處理10分鐘到3小時，優(yōu)選30分鐘到1小時，最優(yōu)選45分鐘。細胞通過20微米到800微米之間，更優(yōu)選40微米到400微米之間，最優(yōu)選70微米的尼龍或粗棉布網(wǎng)孔過濾器。然后將細胞直接在培養(yǎng)基中或經(jīng)Ficoll或Percoll或其它粒子梯度進行差速離心。細胞可以在4到50℃之間，優(yōu)選在20到40℃之間，最優(yōu)選在25℃的溫度下以100到3000Xg之間，更優(yōu)選200到1500Xg之間，最優(yōu)選以500Xg的速度離心1分鐘到1小時，更優(yōu)選2到15分鐘，最優(yōu)選5分鐘。
又在另一種分離脂肪來源的基質(zhì)細胞的方法中，利用了諸如在Katz等的US 5,786,207中所描述的機械系統(tǒng)。使用系統(tǒng)將脂肪組織樣品引入到自動化裝置中，使其經(jīng)歷洗滌階段和分離階段，其中組織被攪拌并旋轉(zhuǎn)，從而將所得的細胞懸液收集到離心預(yù)備狀態(tài)的容器中。以這種方式，從組織樣品中分離脂肪來源的細胞，保持目的細胞的細胞完整性。
III.誘導(dǎo)脂肪來源的基質(zhì)細胞表現(xiàn)出眼細胞的至少一種特征本發(fā)明包括處理脂肪來源的基質(zhì)細胞以誘導(dǎo)它形成表達眼細胞的至少一種基因型或表型特征的細胞。如何誘導(dǎo)脂肪來源的基質(zhì)細胞分化的非限制性實例包括1)細胞培養(yǎng)基的利用；2)支持細胞的利用；3)將未分化的細胞直接植入患者組織中；和4)細胞工程技術(shù)。
A)細胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)雖然本發(fā)明不束縛于任何操作理論，人們相信用含有血清、胚胎提取物、羊膜組織/液體、純化或重組的生長因子、細胞因子、激素和/或化學(xué)制劑的組合的培養(yǎng)基，在二維或三維微環(huán)境中處理脂肪來源的基質(zhì)細胞，將會誘導(dǎo)預(yù)期的分化。
更具體地，本發(fā)明提供了將脂肪來源的細胞分化為具有眼細胞的基因型或表型特性的細胞的方法，包括以期望的密度平板接種分離的脂肪來源的成人干細胞，包括但不限于約1,000到約500,000細胞/cm2的密度；在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中溫育細胞，所述培養(yǎng)基包含從由生長因子、激素、細胞因子、血清因子、核激素受體配體或任何其它明確的化學(xué)制劑組成的組中選擇的至少一種化合物。
又在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的分化細胞在培養(yǎng)物中生長，直至觀察到角膜上皮形成的跡象。然后通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的標準生物化學(xué)分析技術(shù)對含有上皮的培養(yǎng)基分析可指示角膜上皮功能的標志的存在。然后將角膜上皮層移入到宿主組織中用以組織增殖或再生目的。
可用于本發(fā)明的方法的基本培養(yǎng)基包括但不限于NeurobasalTM(補充有或未補充胎牛血清或堿性成纖維細胞生長因子(bFGF))、N2、B27、Eagle極限必需培養(yǎng)基、ADC-1、LPM(不合牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培養(yǎng)基(有或無Fitton-Jackson改良)、Eagle基本培養(yǎng)基(BME-添加Earle′s鹽基)、Dulbecco′s改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM-無血清)、Yamane、IMEM-20、Glasgow改良Eagle培養(yǎng)基(GMEM)、Leibovitz L-15培養(yǎng)基、McCoy′s 5A培養(yǎng)基、培養(yǎng)基M199(M199E-帶Earle′s鹽基)、培養(yǎng)基M199(M199H-帶Hank′s鹽基)、Eagle極限必需培養(yǎng)基(MEM-E-帶Earle′s鹽基)、Eagle極限必需培養(yǎng)基(MEM-H-帶Hank′s鹽基)以及Eagle極限必需培養(yǎng)基(MEM-NAA-帶非必需氨基酸)，在無數(shù)其它培養(yǎng)基中，包括培養(yǎng)基199、CMRL 1415、CMRL 1969、CMRL 1066、NCTC 135、MB 75261、MAB 8713、DM 145、Williams′G、Neuman& Tytell、Higuchi、MCDB 301、MCDB 202、MCDB 501、MCDB 401、MCDB 411、MDBC153。優(yōu)選的用于本發(fā)明的培養(yǎng)基為DMEM。這些及其它有用的培養(yǎng)基可獲自GIBCO，Grand Island，紐約，美國以及Biological Industries，Bet HaEmek，以色列等。許多這些培養(yǎng)基概述于Academic Press，Inc.出版的由William B.Jakoby和Ira H.Pastan編輯的Methods in Enzymology，卷LVIII，″Cell Culture″，62-72頁中。
優(yōu)選的培養(yǎng)角膜上皮細胞的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域公知的，并包括Wille，Jr.的美國專利No.5,912,175中所描述的培養(yǎng)基。一般而言，可用于本發(fā)明的方法的培養(yǎng)基含有?；蚱渌锓N來源的胎血清，濃度至少1％到約30％，優(yōu)選至少約5％到15％，最優(yōu)選約10％。雞或其它物種來源的胚胎提取物以約1％到30％，優(yōu)選至少約5％到15％，最優(yōu)選約10％的濃度存在。
可用于本發(fā)明的生長因子、細胞因子、激素及其它特異性因子包括但不限于在pg/ml到mg/ml水平之間濃度的生長激素、促紅細胞生成素、血小板生成素、白介素3、白介素6、白介素7、巨嗜細胞集落刺激因子、c-kit配體/干細胞因子、osteoprotegerin配體、胰島素、胰島素樣生長因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、神經(jīng)生長因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、血小板衍生生長因子以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白。例如在此濃度下，可用于本發(fā)明的方法的生長因子、細胞因子和激素在集落形成單位(CFU)測定中能夠誘導(dǎo)高達100％的血細胞形成(淋巴系、紅系、髓系或血小板系)(Moore等(1973)J.Natl.Cancer Inst.50603-623；Lee等(1989)J.Immunol.1423875-3883；Medina等(2993)J.Exp.Med.1781507-1515。
已進一步確認可以向培養(yǎng)基中添加額外的組分。此類組分包括抗生素、白蛋白、氨基酸及本領(lǐng)公知的用于培養(yǎng)細胞的其它組分。另外，可以添加組分以增強分化過程?！盎瘜W(xué)制劑”是指類固醇、類視黃醇及相對于陽性對照誘導(dǎo)脂肪來源的基質(zhì)細胞分化至少25-50％的其它化學(xué)化合物或藥劑。
已確認上文所述的細胞培養(yǎng)基條件產(chǎn)生表達單一類型的眼細胞的至少一種基因型或表型特征的細胞。該特定的細胞類型通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何手段分離。尤其有用的是利用該分化細胞表達的基因型或表型特征的手段。如下文所列的目的細胞的表型標志是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，并已在文獻中充分地公開。額外的表型標志繼續(xù)有待公開或無需過度實驗即可鑒定。這些標志中的任何一種都可用來確認脂肪來源的成人干細胞已經(jīng)被誘導(dǎo)至分化狀態(tài)。細胞系特異性表型特征包括但不限于細胞表面蛋白、細胞骨架蛋白、細胞形態(tài)學(xué)和/或分泌產(chǎn)物。例如，分化的角膜上皮細胞合成轉(zhuǎn)化生長因子β1和β2(TGFβ)、胰島素樣生長因子(IGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、肝生長因子(HGF)以及角質(zhì)形成細胞生長因子(KGF)的受體(Kruse和Volcker，1997，Curr Opin Opthalmol；8(4)46-54)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會意識到已知的量熱、熒光、免疫化學(xué)、聚合酶鏈式反應(yīng)、化學(xué)或放射化學(xué)方法可容易地確定細胞系特異性標志的存在或不存在。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了去分化的、分離的脂肪來源的成人干細胞，其能夠在能夠進行此類分化的培養(yǎng)基中被誘導(dǎo)表達眼細胞的至少一種基因型或表型特征。去分化的脂肪來源的成人干細胞通過缺乏成熟脂肪細胞標志進行鑒定。
B)利用支持細胞促進脂肪來源的基質(zhì)細胞分化在本發(fā)明的另一個實施方案中，支持細胞被用來促進脂肪來源的基質(zhì)細胞分化。因此，本發(fā)明的脂肪來源的細胞被分離并在細胞群中培養(yǎng)，最優(yōu)選該群是確定的群。該細胞群是異質(zhì)的，包括為本發(fā)明的細胞提供因子的支持細胞。支持細胞包括促進目的細胞分化、生長和維持的其它細胞類型。作為非限制性實例，如果需要表達至少一種角膜上皮細胞的基因型或表型特征的脂肪來源的基質(zhì)細胞，首先通過上文所述的任何手段分離脂肪來源的基質(zhì)細胞，并在存在其它眼或非眼支持細胞下在培養(yǎng)物中生長。在另一個實施方案中，支持細胞來自于從培養(yǎng)的角膜組織中取得的這些細胞類型的原代培養(yǎng)物。又在另一個實施方案中，支持細胞來自于永生化的細胞系。在一些實施方案中，支持細胞是自體獲得的。在其它實施方案中，支持細胞是同種異體獲得的。
本發(fā)明也構(gòu)思用于支持目的細胞分化的細胞可被基因工程改造為支持細胞。細胞通過下文所述的或者本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法被基因改造以表達外源基因或阻遏內(nèi)源基因的表達。一種基因改造本發(fā)明的細胞的方法包括將細胞暴露于裸露核酸片段(即DNA或RNA)，由此核酸以核酸在細胞內(nèi)表達的方式被摻入該細胞的基因組中?？蛇x地，本發(fā)明的細胞被暴露于包含包括轉(zhuǎn)基因的核酸的基因轉(zhuǎn)移載體，由此該核酸在適于轉(zhuǎn)基因在細胞內(nèi)表達的條件下被引入到細胞中。
C)植入在另一方面，本發(fā)明提供了可用于自體及同種異體移植的表達至少一種眼細胞基因型或表型特征的脂肪來源的基質(zhì)細胞和分化細胞。優(yōu)選地，受試者為哺乳動物，更優(yōu)選地，受試者為人類。
因此，又在另一個方面，本發(fā)明公開了向受試者提供能夠表達至少一種眼細胞的基因型或表型特征的分化細胞的方法，包括a)分離脂肪組織來源的基質(zhì)細胞；b)在適于分化該細胞的培養(yǎng)基中平板接種并溫育細胞；c)將分化細胞引入到受試者中。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，涉及向受試者提供未分化的脂肪來源的基質(zhì)細胞的方法，包括a)分離脂肪組織來源的基質(zhì)細胞；b)將該未分化的細胞引入到受試者中。
本發(fā)明構(gòu)思當(dāng)向受試者引入未分化的脂肪來源的基質(zhì)細胞時，在一個特別的實施方案中，將它們直接引入到病眼中。又在本發(fā)明的另一方面，未分化的脂肪來源的基質(zhì)細胞與如本文所述的將會提供適于該基質(zhì)細胞在體內(nèi)分化的環(huán)境的任何支持細胞或培養(yǎng)基或分化因子一起引入。例如，這些支持細胞在一個特別的實施方案中是羊膜細胞。在另一個實施方案中，支持細胞來自于從培養(yǎng)的角膜組織中取出的這些細胞類型的原代培養(yǎng)物。又在另一個實施方案中，支持細胞來自于永生化的細胞系。在一些實施方案中，支持細胞是自體獲得的。在其它實施方案中，支持細胞是同種異體獲得的。
在另一個實施方案中，去分化的脂肪來源的細胞與藥學(xué)上可接受的載體組合提供用于治療應(yīng)用，包括但不限于組織修復(fù)、再生、重建或增強。脂肪來源的細胞可以通過美國專利No.6,153,432(特此引用作為參考)中公開的方法培養(yǎng)以使細胞去分化，由此該去分化的成人干細胞然后被誘導(dǎo)表達不同于脂肪組織來源細胞的細胞的基因型或表型特征。去分化的脂肪來源的細胞可以被修飾以包括非內(nèi)源性基因序列用以產(chǎn)生目的蛋白或肽。去分化的脂肪來源的細胞可以，在備選的實施方案中，在二維或三維基質(zhì)中施用于宿主以用于預(yù)期的治療目的。在一個實施方案中，去分化的細胞是從患者自身細胞中自體獲得的。備選地，去分化的細胞同種異體獲得。
D)對本發(fā)明的脂肪來源的細胞的遺傳操作干細胞及其后代是基因治療的重要靶標，其中插入的基因促進移植了這些干細胞的個體的健康。
又在另一個實施方案中，表達眼細胞的至少一種基因型或表型特征的脂肪組織來源的細胞被基因改造以表達外源基因或阻遏內(nèi)源基因的表達。本發(fā)明提供了基因改造此類細胞和細胞群的方法。一種基因改造本發(fā)明的細胞的方法包括將細胞暴露于裸露核酸片段(即DNA或RNA)，由此該核酸被摻入該細胞的基因組中從而核酸在細胞內(nèi)表達。
備選地，本發(fā)明的細胞被暴露于包含包括轉(zhuǎn)基因的核酸的基因轉(zhuǎn)移載體，由此該核酸在適于轉(zhuǎn)基因在細胞內(nèi)表達的條件下被引入到細胞中。轉(zhuǎn)基因可以是表達盒，包括可操作地連接于合適的啟動子的編碼多核苷酸。編碼多核苷酸可以編碼蛋白，或者它可以編碼生物學(xué)活性的RNA(如反義RNA或核酶)。這樣，例如，編碼多核苷酸可以編碼賦予毒素抗性的基因、激素、細胞因子、細胞表面結(jié)合的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)部分(如細胞粘附分子、受體等)、促進生長或內(nèi)源激素分泌的因子、肽或其它因子、或者任何其它細胞產(chǎn)物。當(dāng)期望使用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)遞送給定的轉(zhuǎn)基因時，它的序列將會是已知的。
在表達盒內(nèi)，編碼多肽可操作地與合適的啟動子連接。合適的啟動子的實例包括原核啟動子和病毒啟動子(如反轉(zhuǎn)錄病毒啟動子、皰疹病毒啟動子、巨細胞病毒啟動子)。其它合適的啟動子是真核啟動子，例如增強子、組成型活性啟動子、信號特異性啟動子及組織特異性啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知選擇適于驅(qū)動基因在預(yù)定的細胞環(huán)境中表達的合適的啟動子。表達盒可以包括不止一個編碼多核苷酸，而且根據(jù)需要它可以包括其它元件(如多聚-A序列、轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件等)。
包含轉(zhuǎn)基因的表達盒應(yīng)當(dāng)摻入適于將轉(zhuǎn)基因遞送到細胞的遺傳載體中。根據(jù)期望的最終應(yīng)用，可以使用諸如質(zhì)粒、裸露DNA或病毒的任何這類載體來基因改造細胞?？梢允褂迷谒幂d體中構(gòu)建期望的表達盒的任何方法。這些方法是本領(lǐng)域熟知的，并且包括諸如直接克隆、同源重組等的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解載體的選擇在很大程度上將決定用于將該載體引入細胞的方法。
然后可以通過多種不同的方法在使轉(zhuǎn)基因在體內(nèi)表達的條件下將基因改變的細胞引入到生物體中。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因可以編碼生長因子例如TGFβ。然后可以將含有TGFβ轉(zhuǎn)基因的細胞引入到患病的人或其它哺乳動物的眼中。
備選地，外源外來的或同源的核酸通過許多本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的其它技術(shù)轉(zhuǎn)移到本發(fā)明的細胞中。因此，核酸通過包括但不限于電穿孔、磷酸鈣、微注射、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、反轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒或微生物載體的方法或者本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何其它手段轉(zhuǎn)移。
E)細胞表征對所得的分化細胞的“表征”旨在鑒定可指示基質(zhì)細胞細胞系定型到特定終末分化狀態(tài)的表面及胞內(nèi)蛋白、基因和/或其它標志。這些方法包括但不限于(a)利用用第二熒光標記連接的蛋白特異性單克隆抗體通過免疫熒光法檢測細胞表面蛋白，包括利用流式細胞計數(shù)法；(b)利用用第二熒光標記連接的蛋白特異性單克隆抗體通過免疫熒光法檢測胞內(nèi)蛋白，包括利用流式細胞計數(shù)法；(c)通過聚合酶鏈式反應(yīng)、原位雜交和/或RNA印跡分析檢測細胞基因。終末分化細胞可以通過鑒定指示基質(zhì)細胞細胞系定型到特定終末分化狀態(tài)的表面及胞內(nèi)蛋白、基因和/或其它標志來表征。這些方法包括但不限于(a)通過對脂肪來源的基質(zhì)細胞表面蛋白例如堿性磷酸酶、CD44、CD146、整聯(lián)蛋白β1或骨橋蛋白進行免疫熒光測定例如流式細胞計數(shù)或者原位免疫染色而檢測細胞表面蛋白(Gronthos等1994 Blood 844164-4173)，(b)通過利用特異性單克隆抗體對脂肪組織來源的基質(zhì)細胞進行免疫熒光測定法例如流式細胞計數(shù)或者原位免疫染色而檢測胞內(nèi)蛋白；(c)通過諸如聚合酶鏈式反應(yīng)、原位雜交和/或其它印跡分析的方法檢測細胞系選擇性mRNA的表達，例如由角膜上皮細胞所產(chǎn)生的那些，包括TGFβ1和β2、IGF、bFGF和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)(參見Gimble等1989 Blood 74303-311)。
F)利用本發(fā)明的細胞作為治療劑最優(yōu)選地，本發(fā)明的細胞和細胞群作為治療劑使用。在一個實施方案中，向眼施用脂肪來源的基質(zhì)細胞，優(yōu)選在期望的部位，并通過(i)共同施用合適的細胞因子和其它生物因子或者(ii)已經(jīng)存在的或在宿主中誘導(dǎo)的體內(nèi)因子而使之分化。一般而言，此類方法包括將細胞轉(zhuǎn)移到期望的組織或庫(depot)，或者在體外作為移植或植入前的移植物，或者在體內(nèi)直接施與動物。細胞通過任何合適的方法被轉(zhuǎn)移到期望的組織中，這通常根據(jù)組織類型而變化。例如，通過用含有細胞的培養(yǎng)基浸泡移植物或者灌注移植物而將細胞轉(zhuǎn)移到移植物上。備選地，細胞被種植在組織內(nèi)期望的部位上以建立細胞群?？衫帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的裝置，例如種植有細胞的導(dǎo)管、套針、套管或支架等而將細胞轉(zhuǎn)移到體內(nèi)部位。
本發(fā)明的分化或未分化的脂肪來源的基質(zhì)細胞可用于治療多種疾病。該細胞被用于治療角膜的疾病，包括但不限于無虹膜或虹膜缺失；紅斑角皮病或皮膚變紅及角化過度；以及具有多重內(nèi)分泌缺陷的角膜炎；化學(xué)損傷；熱損傷；接觸鏡角膜病；以及反復(fù)角膜緣外科手術(shù)或角膜緣功能不全。另外，本發(fā)明的細胞在諸如屈光性角膜切削術(shù)或激光原位角膜磨鑲術(shù)的外科手術(shù)操作之后可用于再生角膜，這兩者都涉及部分角膜的去除。這些操作的恢復(fù)通常引起術(shù)后的前“基質(zhì)混濁”，特征在于動物模型中出現(xiàn)表達α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的肌成纖維細胞，這可以通過利用本發(fā)明的細胞和操作來預(yù)防。待治療的疾病狀態(tài)可以是自身免疫機能障礙或病毒或某些其它傳染因子的感染造成的。
IV.組織工程本文所述的細胞可以在組織工程中使用。本發(fā)明提供了產(chǎn)生動物物質(zhì)的方法，包括在足以使其擴增并分化為期望物質(zhì)的條件下維持本發(fā)明的細胞。所述物質(zhì)可以包括，例如眼的一部分。就此而論，本文所述的細胞可與任何已知的組織工程技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，所述組織工程技術(shù)包括但不限于下面描述的那些技術(shù)Advanced Tissue Sciences，Inc.的美國專利No.5,902,741和5,863,531；Vacanti等的美國專利No，6,139,574；Vacanti等的美國專利No.5,759,830；Vacanti的美國專利No.5,741,685；Vacanti等的美國專利No.5,736,372；Vacanti等的美國專利No.5,804,178；Vacanti等的美國專利No.5,770,417；Vacanti等的美國專利No.5,770,193；Griffith-Cima等的美國專利No.5,709,854；Atala等的美國專利No.5,516,532；Vacanti等的美國專利No.5,855,610；Vacanti等的美國專利No.5,041,138；Vacanti等的美國專利No.6,027,744；Vacanti等的美國專利No.6,123,727；Kemp等的美國專利No.5,536,656；Skjak-Braek等的美國專利No.5,144,016；Vacanti的美國專利No.5,944,754；Tubo等的美國專利No.5,723,331以及Sittinger等的美國專利No.6,143,501。
為產(chǎn)生這樣的結(jié)構(gòu)，細胞和細胞群在適于其擴增并分裂形成器官的條件下維持。這可以通過將它們轉(zhuǎn)移到動物中典型地期望新物質(zhì)的部位而實現(xiàn)。因此，本發(fā)明能夠在其中所述細胞植入了這樣的組織中的動物中促進部分眼的再生。
又在其它實施方案中，細胞在體外被誘導(dǎo)分化并擴增為組織。就此而論，細胞可以單獨或在細胞混合物中給藥，或者備選地可以在促進形成有益于組織發(fā)育的三維結(jié)構(gòu)的基質(zhì)上培養(yǎng)。因此，例如，細胞可以培養(yǎng)于或者種植在生物相容性網(wǎng)格上，例如包括胞外基質(zhì)材料、合成聚合物、細胞因子、生長因子等的網(wǎng)格上。這樣的網(wǎng)格可以塑造成期望的形狀以促進組織類型的發(fā)育形成。
因此，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的細胞和細胞群以及生物相容性網(wǎng)格的組合物。網(wǎng)格可以從聚合材料形成，具有作為網(wǎng)孔或海綿的纖維，典型地具有在100μm和約300μm之間數(shù)量級的空隙。這種結(jié)構(gòu)提供細胞能夠在上面生長和增殖的充足面積。期望地，網(wǎng)格隨著時間可生物降解，這樣它將隨著動物物質(zhì)的發(fā)育形成而被其吸收。合適的聚合物或共聚物網(wǎng)格利用單體例如羥基乙酸、乳酸、延胡索酸丙酯、己內(nèi)酯等制備。其它網(wǎng)格可包括蛋白、多糖、多羥基酸、聚原酸酯、聚酐、聚磷腈或合成聚合物，尤其是生物可降解聚合物，或其任何組合。而且，根據(jù)需要，網(wǎng)格可以包括激素，例如生長因子、細胞因子、形態(tài)發(fā)生素(如視黃酸等)、期望的胞外基質(zhì)材料(如纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原等)或其它材料(如DNA、病毒、其它細胞類型等)。
為形成該組合物，細胞被引入到網(wǎng)格中，從而它們滲透進其中的間質(zhì)間隙。例如，基質(zhì)可以用含有細胞的溶液或懸液浸泡，或者該細胞溶液或懸液可以注入或注射到基質(zhì)中。優(yōu)選地，利用通過交聯(lián)包括聚合物并且其中還分散有本發(fā)明的細胞的懸液而形成的水凝膠。這種形成方法允許細胞分散在整個網(wǎng)格中，促進網(wǎng)格更加均勻地被細胞滲透。當(dāng)然，組合物還可以包括期望表型的成熟細胞或其前體，特別地用于加強對網(wǎng)格內(nèi)本發(fā)明細胞的誘導(dǎo)，或者促進網(wǎng)格內(nèi)激素的產(chǎn)生。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解適于包括在組合物中的網(wǎng)格可來自任何合適的來源，如基質(zhì)凝膠(matrigel)，并且當(dāng)然可以包括合適網(wǎng)格的商業(yè)來源。另一種合適的網(wǎng)格來自于脂肪組織的無細胞部分，例如基本上沒有細胞的脂肪組織胞外基質(zhì)。典型地此類脂肪來源的網(wǎng)格包括蛋白例如蛋白聚糖、糖蛋白、hyaluronin、纖連蛋白、膠原等，它們?nèi)靠勺鳛榧毎L的出色基質(zhì)。另外，此類脂肪來源的網(wǎng)格可以包括激素、細胞因子、生長因子等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會知曉分離這種脂肪來源的網(wǎng)格的方法，例如匹茲堡大學(xué)的WO 00/53795中所公開的方法，特此引用作為參考。
本發(fā)明的細胞、細胞群、網(wǎng)格和組合物可用于組織工程和再生。因此，本發(fā)明涉及合并任何公開的發(fā)明特征的可植入結(jié)構(gòu)。植入物的確切性質(zhì)將根據(jù)期望的用途而變化。植入物可以包括成熟組織或可以包括未成熟組織或網(wǎng)格。因此，例如，植入物可以包括正在經(jīng)歷分化的本發(fā)明的細胞群，任選地種植在適當(dāng)大小和維度的網(wǎng)格內(nèi)。這樣的植入物被注射或植入到宿主內(nèi)，以促進患者體內(nèi)眼組織的產(chǎn)生或再生。
脂肪來源的網(wǎng)格可便利地作為細胞培養(yǎng)試劑盒的一部分使用。因此，本發(fā)明提供了試劑盒，其包括本發(fā)明的脂肪來源的網(wǎng)格和一種或多種其它組分，例如水合劑(如水、生理相容性鹽溶液、制備的細胞培養(yǎng)基、血清或其組合或衍生物)、細胞培養(yǎng)基質(zhì)(如皿、板、瓶等)、細胞培養(yǎng)基(無論液體還是粉末形式)、抗生素、激素等。雖然試劑盒可以包括任何此類成分，優(yōu)選地它包括所有在適當(dāng)組合后支持目的細胞培養(yǎng)和生長的必要成分。期望的試劑盒也可以包括所述的種植到網(wǎng)格中的細胞。
備選地，本發(fā)明的細胞被分化為細胞，具有角膜上皮細胞的至少一種特征，它在體外擴增以長成角膜上皮組織用于隨后植入到患者中。細胞單獨或者與其它組織例如羊膜組織聯(lián)合植入。
現(xiàn)在將通過下列實施例更加充分地描述本發(fā)明。不過，本發(fā)明可具體體現(xiàn)為許多不同的形式，而不應(yīng)當(dāng)理解為限于本文所列的實施方案。確切地講，提供這些實施方案，從而使公開更加徹底和完整，并將充分地向本領(lǐng)域技術(shù)人員傳達本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1體外誘導(dǎo)方法脂肪來源的肝細胞按照描述分離自吸脂術(shù)廢物材料(Sen等，2001，Journal of Cellular Biochemistry 81312-319)。這些細胞可以在但不限于下列培養(yǎng)基補充有或未補充胎牛血清(FBS)的NeurobasalTM(InVitrogen)、N2、B27(InVitrogen)或堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的存在下延續(xù)培養(yǎng)。也可以對培養(yǎng)基中的葡萄糖水平進行調(diào)節(jié)。細胞以各種密度種植，并以每3-6天的時間間隔飼喂。最優(yōu)選地，它們以約1000到約500,000細胞/cm2的密度種植。
在培養(yǎng)期間，利用商業(yè)上可獲得的放射免疫測定或酶聯(lián)免疫吸附測定對條件培養(yǎng)基進行生物化學(xué)標志以及與眼基質(zhì)細胞或角膜上皮細胞相關(guān)的表型標志表達的分析。利用針對(但不限于)任何上文所述的表型標志的抗體進行免疫組織化學(xué)(IHC)分析。
實施例2利用帶有生物相容性膜的脂肪來源的細胞提供了利用在組合物中帶有生物相容性材料的未分化狀態(tài)或者脂肪細胞分化狀態(tài)的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞用以移植修復(fù)眼內(nèi)病損的途徑。如Lee等(2001，Journal of Cellular Biochemistry 81312-319)所述，外科手術(shù)患者利用VISX Star S2受激準分子激光器(VISX，Inc.，Santa Clara，CA)內(nèi)產(chǎn)生并在10 Hz以160mJ/cm2的注量(fluence)輸出的193nm的受激準分子束經(jīng)歷光性治療性角膜切削術(shù)。對上皮清創(chuàng)術(shù)采用45μm的深度設(shè)置，對基質(zhì)部分切除術(shù)采取合適的設(shè)置，進行標準化的中心6-mm直徑的激光光部分切除術(shù)(photoablation)。PRK之后，將未分化的或脂肪細胞分化的脂肪組織來源的成人干細胞處于帶有生物相容性材料的組合物中引入到部分切除的區(qū)域。在引入前，脂肪來源的細胞以定向方式培養(yǎng)于生物相容性膜表面，包括但不限于羊膜、豬腸粘膜下層、AmpligraftTM、DermagraftTM或相似產(chǎn)品。脂肪來源的細胞或者作為未分化的成纖維細胞樣細胞培養(yǎng)，或者根據(jù)Halvorsen等(2001，Metabolism 50407-413)描述的方法誘導(dǎo)其經(jīng)歷脂肪細胞分化。切割細胞/生物材料復(fù)合物以適合缺損大小。脂肪來源的細胞表面被置于鄰近角膜裸露區(qū)。在角膜和角膜緣中用10-0尼龍利用間斷或連續(xù)的咬合將細胞/生物材料復(fù)合物縫合到位，修剪掉任何多余的復(fù)合物(Anderson等2001，.Br J Ophthalmol；85(5)567-575)。在該外科手術(shù)之后，插入可棄型繃帶接觸鏡并局部滴注抗生素?；颊咴谕饪剖中g(shù)后進行1到4天的術(shù)后評估，并維持抗生素治療持續(xù)適當(dāng)?shù)臅r間(長達1個月)。在1、3和6個月時進行隨訪檢查，包括視覺敏度測試、manifest折射、裂隙燈評估以及體內(nèi)同焦點顯微鏡檢查。
實施例3基因治療方法下面記載的是利用任何載體途徑(病毒、轉(zhuǎn)染、其它)將脂肪組織來源的基質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_至少一種生長因子或加速眼內(nèi)修復(fù)的蛋白(TGFβ阻斷蛋白)的細胞的方法。如Lee等(2001，Ophthalmology；108(1)112-20)所述，外科手術(shù)患者利用VISX Star S2受激準分子激光器(VISX，Inc.，Santa Clara，CA)內(nèi)產(chǎn)生并在10Hz以160mJ/cm2的注量輸出的193nm的受激準分子束經(jīng)歷光性治療性角膜切削術(shù)。對上皮清創(chuàng)術(shù)采用45μm的深度設(shè)置，對基質(zhì)部分切除術(shù)采取合適的設(shè)置，進行標準化的中心6-mm直徑的激光光部分切除術(shù)。PRK之后，將未分化的或脂肪細胞分化的脂肪組織來源的成人干細胞處于帶有生物相容性材料的組合物中引入到部分切除的區(qū)域。在引入前，細胞用表達可溶性II型轉(zhuǎn)化生長因子β受體蛋白的合適核酸載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。該蛋白與轉(zhuǎn)化生長因子β細胞因子結(jié)合并抑制它在細胞水平引發(fā)信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)的能力(Rowland-Goldsmith等2001，Clin CancerRes.2001，7(9)2931-40)。轉(zhuǎn)化生長因子β已知可干擾角膜外科手術(shù)后的恢復(fù)并促進角膜纖維化(Jester等1997，Cornea；16(2)177-87)。
然后以定向的方式在生物相容性膜表面上培養(yǎng)基因工程改造的細胞，所述膜包括但不限于羊膜、豬腸粘膜下層、AmpligraftTM、DermagraftTM或相似產(chǎn)品。細胞或者作為未分化的成纖維細胞樣細胞培養(yǎng)，或者根據(jù)Halvorsen等(2001，Metabolism 50407-413)描述的方法誘導(dǎo)其經(jīng)歷脂肪細胞分化。切割細胞/生物材料復(fù)合物以適合缺損大小。細胞表面被置于鄰近角膜裸露區(qū)。在角膜和角膜緣用10-0尼龍利用間斷或連續(xù)咬合將細胞/生物材料復(fù)合物縫合到位，修剪掉任何多余的復(fù)合物(Anderson等2001，.Br J Ophthalmol；85(5)567-575)。在外科手術(shù)之后，插入可棄型繃帶接觸鏡并局部滴注抗生素。
患者在外科手術(shù)后進行1到4天的術(shù)后評估，并維持抗生素治療持續(xù)適當(dāng)?shù)臅r間(長達1個月)。在1、3和6個月時進行隨訪檢查，包括視覺敏度測試、manifest折射、裂隙燈評估以及體內(nèi)同焦點顯微鏡檢查。
實施例4簡單移植將脂肪組織來源的基質(zhì)細胞在眼內(nèi)單獨移植。如Lee等(2001，Ophthalmology；108(1)112-20)所述，外科手術(shù)患者利用VISX Star S2受激準分子激光器(VISX，Inc.，Santa Clara，CA)內(nèi)產(chǎn)生并在10Hz以160mJ/cm2的注量輸出的193nm受激準分子束經(jīng)歷光性治療性角膜切削術(shù)。對上皮清創(chuàng)術(shù)采用45μm的深度設(shè)置，對基質(zhì)部分切除術(shù)采取合適的設(shè)置，進行標準化的中心6-mm直徑的激光光部分切除術(shù)。PRK之后，將未分化的或脂肪細胞分化的脂肪組織來源的成人干細胞通過直接注射引入到部分切除區(qū)域。細胞或者作為單一的細胞懸液或者作為細胞片層引入。在外科手術(shù)之后，插入可棄型繃帶接觸鏡并局部滴注抗生素?；颊咴谕饪剖中g(shù)后進行1到4天的術(shù)后評估，并維持抗生素治療持續(xù)適當(dāng)?shù)臅r間(長達1個月)。在1、3和6個月時進行隨訪檢查，包括視覺敏度測試、manifest折射、裂隙燈評估以及體內(nèi)同焦點顯微鏡檢查。
實施例5人類脂肪來源的基質(zhì)細胞的細胞因子表達特征已確定了來自多個供體的人類脂肪來源的基質(zhì)細胞的細胞因子表達特征。在這些實驗中，用脂多糖(LPS，100ng/ml)和條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)鋪滿的靜止的脂肪來源的基質(zhì)細胞培養(yǎng)物，并在1到24小時的周期之后收獲總RNA。與鼠和人骨髓來源的基質(zhì)細胞共同的是，脂肪來源的基質(zhì)細胞表達下列細胞因子mRNA白介素6、7、8和11(IL-6，-7，-8，-11)、白血病抑制因子(LIF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞-集落刺激因子(GM-CSF)；粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、fit-3配體、干細胞因子、腫瘤壞死因子α(TNFα)以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和4t(BMP-2，-4)。
實施例6人類脂肪來源的基質(zhì)細胞支持人類臍帶血先祖細胞增殖和分化的能力確定了人類脂肪來源的基質(zhì)細胞支持共培養(yǎng)中的人類臍帶血CD34+造血先祖細胞增殖和分化的能力。在24孔板上建立鋪滿的脂肪來源的基質(zhì)細胞的培養(yǎng)物(6×104細胞/孔)。臍帶血(UCB)標本通過用羥乙基淀粉(hetastarch)處理排除污染的紅細胞，并通過Ficoll密度離心排除污染的粒細胞。余下的UCB單核的細胞根據(jù)StemSepTM(StemCells，Vancouver，BC)方案進行細胞系耗竭(lineage depleted)；這有賴于利用針對CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b以及血型糖蛋白A的抗體的混合物的免疫磁性陰性細胞的選擇。在最后的純化步驟中，lin-UCB細胞用CD34抗體染色，并通過流式細胞儀分揀。多達10,000個最終的CD34+UCB細胞在單個孔中與鋪滿的脂肪來源的基質(zhì)細胞層共培養(yǎng)。培養(yǎng)物在缺乏外源細胞因子下維持12天、3周或6周。在這些周期的末尾，通過胰蛋白酶/EDTA消化收集單個孔，并利用下列抗體組合的組合(熒光標記顯示在括號中)通過流式細胞儀進行分析CD45(FITC)、CD34(APC)以及CD7、CD10或者CD38(PE)。這些測定的結(jié)果描述如下。
這些研究檢查了UCB造血細胞群在12天脂肪基質(zhì)支持的共培養(yǎng)物中的擴增。在缺乏外源細胞因子的情況下，脂肪來源的基質(zhì)細胞支持總造血細胞數(shù)目的5.1-倍擴增(平均，n＝4個基質(zhì)供體，n＝2個UCB供體；范圍2-9.4)。這與CD34+UCB細胞群的2.4-倍擴增相應(yīng)(平均，n＝4個基質(zhì)供體，n＝2個UCB供體；范圍1.4-3.3)。顯著百分比的CD34+和CD34-細胞都表達CD7或CD10抗原(圖4，平均，n＝4個基質(zhì)供體，n＝2個UCB供體)。個體表型代表下列總造血細胞群的百分比早期淋巴先祖細胞分別為20.2％(CD34+CD7+)和9.5％(CD34+CD10+)；NK/T-細胞先祖(CD34-CD7+)，31.4％；而B-細胞先祖(CD34-CD10+)，7.7％。
進一步分析顯示早期淋巴先祖細胞的顯著擴增。CD34+CD7+細胞群擴增了4.8±2.2-倍超過12天周期的先祖細胞(均值±s.d.，n＝4個基質(zhì)供體，n＝2個UCB供體)。同樣地，CD34+CD10+細胞群擴增了3.5±1.6倍先祖細胞(均值±s.d.，n＝4個基質(zhì)供體，n＝2個UCB供體)。這些數(shù)值超過了CD34+細胞群總體的擴增倍數(shù)，提示該途徑將富集人類淋巴先祖細胞。這些結(jié)果顯示脂肪來源的基質(zhì)細胞在體外能夠支持造血先祖細胞的分化。
對于得益于前述說明書和相關(guān)附圖中提出的教導(dǎo)的本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明的修飾和其它實施方案將是顯而易見的。因而，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不局限于所公開的具體實施方案，并且修飾和其它實施方案旨在包括在所附的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。雖然本文使用了具體術(shù)語，它們僅僅是以通稱和描述性的意義使用的，而并非用于限制目的。
權(quán)利要求
1.分離的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞，其被誘導(dǎo)表達眼細胞的至少一種特征。
2.權(quán)利要求1的眼細胞，它是在體外分化的。
3.權(quán)利要求1的眼細胞，它是在體內(nèi)分化的。
4.權(quán)利要求1的眼細胞，其中在分化前向分離的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞中引入了外源性遺傳材料。
5.權(quán)利要求1的眼細胞，其中細胞是人類的。
6.權(quán)利要求1的眼細胞，它被植入宿主中。
7.權(quán)利要求1的眼細胞，其中向細胞中引入了外源性遺傳材料。
8.權(quán)利要求1-8中任一項的眼細胞，其中細胞為角膜上皮細胞。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的眼細胞，其中細胞為眼基質(zhì)細胞。
10.組合物，包括被誘導(dǎo)表達眼細胞的至少一種特征的分離的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞和生物相容性材料。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中生物相容性材料從由羊膜、膠原、水凝膠、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙醇酸/聚乳酸、透明質(zhì)酸鹽或纖維蛋白組成的組中選擇。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中生物相容性材料為羊膜。
13.權(quán)利要求10-12中任一項的組合物，其中眼細胞為角膜上皮細胞。
14.權(quán)利要求10-12中任一項的組合物，其中眼細胞為眼基質(zhì)細胞。
15.使分離的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞分化以表現(xiàn)出至少一種與眼有關(guān)的細胞標志的方法，包括使分離的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞與宿主中的眼內(nèi)組織部位接觸的步驟。
16.權(quán)利要求15的方法，其中分離的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞得自于該宿主。
17.權(quán)利要求15的方法，其中脂肪組織來源的基質(zhì)細胞分離自不是該宿主的供體。
18.使分離的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞分化以表現(xiàn)出至少一種眼細胞標志的方法，包括使分離的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞與眼誘導(dǎo)物質(zhì)接觸的步驟。
19.權(quán)利要求18的方法，其中眼誘導(dǎo)物質(zhì)存在于化學(xué)成分確定的細胞培養(yǎng)基中。
20.權(quán)利要求18的方法，其中眼細胞標志是角膜上皮細胞的標志。
21.權(quán)利要求18的方法，其中眼細胞標志是眼基質(zhì)細胞的標志。
22.治療宿主的眼疾、變性病癥或術(shù)后病癥的方法，包括i)誘導(dǎo)分離的脂肪組織來源的基質(zhì)細胞表達至少一種眼細胞標志；和ii)將誘導(dǎo)的細胞植入宿主。
23.權(quán)利要求22的方法，其中脂肪組織來源的基質(zhì)細胞分離自該宿主。
24.權(quán)利要求22的方法，其中眼疾、變性病癥或手術(shù)病癥為無虹膜、紅斑角皮病、角膜炎、化學(xué)損傷；熱損傷；接觸鏡角膜??；反復(fù)角膜緣外科手術(shù)、角膜緣功能不全、屈光性角膜切削術(shù)、激光原位角膜磨鑲術(shù)、自身免疫機能障礙或者病毒或細菌感染。
25.治療宿主的眼疾、變性病癥或術(shù)后病癥的方法，包括i)分離脂肪組織來源的基質(zhì)細胞；和ii)將該細胞植入宿主的眼內(nèi)部位。
26.權(quán)利要求25的方法，其中脂肪組織來源的基質(zhì)細胞分離自該宿主。
27.權(quán)利要求25的方法，其中眼疾、變性病癥或手術(shù)病癥為無虹膜、紅斑角皮病、角膜炎、化學(xué)損傷；熱損傷；接觸鏡角膜??；反復(fù)角膜緣外科手術(shù)、角膜緣功能不全、屈光性角膜切削術(shù)、激光原位角膜磨鑲術(shù)、自身免疫機能障礙或者病毒或細菌感染。
28.權(quán)利要求25-27之任一項的方法，其中脂肪組織來源的基質(zhì)細胞在植入宿主前被去分化。
全文摘要
本發(fā)明提供了利用脂肪組織來源的基質(zhì)細胞治療和修復(fù)任何與眼有關(guān)的組織缺損的組合物及方法，所述組織缺損包括但不限于繼發(fā)于外傷、代謝病、先天缺陷或外科手術(shù)的那些。脂肪組織來源的基質(zhì)細胞以未分化、分化或脂肪細胞的狀態(tài)單獨或者在生物相容性材料的存在下培養(yǎng)。所得的材料外科使用以矯正許多恰當(dāng)?shù)难蹆?nèi)缺損。
文檔編號A61P27/00GK1592782SQ02823467
公開日2005年3月9日 申請日期2002年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月9日
發(fā)明者B·奇塔姆, J·M·金貝爾 申請人:阿特塞爾科學(xué)公司