專利名稱：通過局部給藥預防和治療再狹窄的制作方法
背景技術：
本申請要求了于2001年9月28日提交的序列號為60/326,379的US申請的優(yōu)先權。
本發(fā)明一般屬于用于降低病態(tài)冠狀動脈、外周動脈和腦動脈的血管再造后的再狹窄以及手術放置旁路移植物或移植器官后的狹窄或再狹窄的方法和組合物的領域，特指將諸如載脂蛋白A-I Milano之類的物質單獨或與脂質制劑或其它膽固醇降低劑或脂質調節(jié)劑聯(lián)合進行局部給藥。
血管成形術、手術和其它血管干預因為以細胞在短期內快速生長到腔內為特征的加速的動脈病變而變得棘手。這種生長常常十分嚴重，其足以危害血液流向末端器官。
正如被用于動脈粥樣硬化中血管表面形成斑塊(plaques)時那樣，血管旁路手術已被廣泛用于治療狹窄和閉合的血管。在旁路手術中，將一根或多根健康的血管越過狹窄或閉合部位移植到狹窄/閉合的血管中，以便在該狹窄或閉合的血管周圍分流血液，從而為血液供應受到該狹窄或閉合危害的組織重建足夠的血液供應。這種手術常常能成功地為受到危害的組織進行血管再造。
血管成形術已發(fā)展成為一種旁路手術中供選擇的治療，尤其是對被診斷為處于由斑塊異常沉積在血管壁腔壁上而形成血管狹窄或閉合的初期階段的患者更是如此。血管成形術一般包括將一根通常配有囊或可膨脹的金屬網(wǎng)狀物的導管引入到狹窄或閉合的動脈區(qū)域，使該囊或絲網(wǎng)短暫地膨脹一次或多次以將血管內的阻塞物或斑塊向血管內皮的壁上進行擠壓，從而壓縮該斑塊和/或將該斑塊擊碎并重建血流。但是，血管成形術治療可能會損傷血管，尤其是當該囊過度膨脹或該網(wǎng)狀物過分擴展時更是如此，從而造成了許多不希望出現(xiàn)的結果，如血管成形術區(qū)域內皮細胞層的剝脫(移動)、血管內壁部分從血管的剩余部分上分割下來并伴有血管閉合、或血管的內膜層破裂。
動物的動脈損傷引致了最終使得動脈變狹窄的血管修復過程。平滑肌細胞和炎癥細胞厚的新層或新內膜在血管內生長，侵占了腔。動物體內的這種過程代表了在血管成形術、血管內支架(stent)移植、器官移植、或旁路手術后臨床發(fā)生的過程，其極大地限制了這些用于治療阻塞性動脈疾病的技術的長期成功性。動脈損傷和新內膜增生的動物模型已被用于研究導致人類再狹窄的細胞事件，用以設計抑制組織生長以試圖減少再狹窄并增加長期臨床效果的治療策略。對于人的再狹窄而言，豬是特別有用的動物模型。
限制血管再造后血管的狹窄或再狹窄的嘗試包括使用藥理學物質和技術性方法。臨床上還沒有被批準用于防止人再狹窄適應征的藥物。正如Serruys等人，N.E.J.Med.1994；331489-495和Fischman等人，N.E.J.Med.1994；331496-501所報道的那樣，已經(jīng)表明一種技術性方法——血管內放置支架可以部分降低冠狀動脈干預后人的再狹窄。然而，支架本身在20-30％的情況中仍然易于產生明顯的再狹窄。
對進行血管修復機理了解的增加使得出現(xiàn)了將藥物用于限制加速的動脈病變的創(chuàng)新提議。已知包括單核細胞在內的循環(huán)的白細胞恰好是當動脈粥樣硬化開始時血管所征募的第一種細胞。當處于病態(tài)動脈壁中時，這些細胞可吞沒膽固醇和其它脂質，并且還可以產生吸引其它細胞、使得其它細胞增生、或使基質成分降解的物質。這些繼發(fā)作用中的各種作用反過來又促進了動脈腔更大程度的內膜變厚和更嚴重的狹窄或閉合。還沒有證據(jù)證實白細胞在血管再造后的再狹窄中扮演了相似的角色。雖然已經(jīng)將白細胞活化與人的再狹窄聯(lián)系起來(Pietersma等人，Circulation 1995；911320-1325；Mickelson等人，1996 JACC 28(2)345-353；Inoue等人，1996 JACC 28(5)1127-1133)，但是在血管再造后例如用糖皮質激素進行的廣泛的炎癥抑制并不能降低人的再狹窄(Pepine等人，Circulation 1990；811753-1761)。這種觀察是對使用廣泛有效和特異性很高的靶向治療用于預防再狹窄進行的回顧性研究。廣泛治療，例如用肝素進行的廣泛治療一直受到全身毒性和給藥限制因素的限制。特異性治療，例如用分子策略進行的特異性治療不能抑制活化和加強血管修復過程的所有多余的細胞和分子途徑。
Ameli等人，Circulation 90(4)1935-41(1994)報道了一些流行病學研究，這些研究表明高密度脂蛋白(HDL)膽固醇水平和冠心病之間呈反比關系，并且HDL和冠狀囊血管成形術后的再狹窄之間也有相似的反比關系。其進行了一項研究以測定是否HDL直接影響新內膜形成，研究了重組的apoA-I Milano(apoA-IM，一種Arg-173被替代為CyS的人apoA-I的變體)對用膽固醇進行喂養(yǎng)的兔子的囊損傷后內膜增厚的影響。在股動脈和骼動脈囊損傷前5天，兔子開始每隔一天靜脈內注射40mg連接到磷脂載體上的apoA-IM，并持續(xù)給藥至損傷后5天(總劑量為200mg/動物，或約11.4mg/kg/給藥)。在囊損傷后三周，與兩個對照組相比，進行apoA-IM治療的兔子的內膜厚度顯著降低。與兩個對照進行的ANOVA比較表明，apoA-IM也顯著降低了內膜-比-中膜的比例。正如由使用巨噬細胞-特異性單克隆抗體進行的免疫組織化學研究所證實的那樣，與用載體進行處理的動物相比，在用apoA-IM進行了治療的兔子中被巨噬細胞所覆蓋的內膜損害部分顯著較少(25.3+/-17％比59.4+/-12.3％，P＜.005)。用apoA-IM進行處理的動物和只用載體進行處理的對照組的主動脈膽固醇含量沒有顯著差異。不幸地是，與其中損害與人更相似的豬不同，還不能用兔子所獲得的結果來預言人的結果。
因此，需要可促進血管組織愈合并控制血管肌細胞增殖(增生)以預防血管成形術、血管旁路手術、器官移植、或血管疾病后血管的再狹窄并同時將快速再閉合的風險最小化的組合物和方法。
因此，本發(fā)明的目的是要提供用于減少病態(tài)冠狀動脈、外周動脈和腦動脈血管再造后的再狹窄以及通過手術放置旁路移植物或移植器官后的狹窄或再狹窄的方法和組合物。
本發(fā)明的另一個目的是要提供一種簡單有效的基因轉移方法。
本發(fā)明的概述在對病態(tài)冠狀動脈、外周動脈和腦動脈進行旁路手術、手術植入移植物或移植器官、或血管成形術、或穩(wěn)定不穩(wěn)定的斑塊之前或期間，可以將單獨或更優(yōu)選地是與脂質載體如磷脂或其它藥物聯(lián)用的載脂蛋白A-I(ApoA-I)，優(yōu)選地變體形式如載脂蛋白A-I Milano(ApoA-IM)進行局部給藥。在優(yōu)選的實施方案中，用INFILTRATOR、壁內釋放裝置和/或其它持續(xù)控釋的方法將ApoA-IM進行給藥，從而將有效劑量給藥于損傷部位?；谑褂肁poA-IM的豬模型，治療或預防再狹窄的有效劑量為0.2至0.4mg ApoA-IM/kg被傳遞到進行治療的部位，或更特定地為4至6mg ApoA-IM/被治療的血管。溶液的粘度限制了用INFILTRATOR進行的壁內給藥的劑量上限。例如，該方法不能使用太粘以至于不能通過INFILTRATOR小孔的ApoA-IM溶液。正如被實施例所證明的那樣，有效量為0.3至0.4ml 14mg/ml的ApoA-IM溶液(其相當于每個血管區(qū)段單次給藥4至6mg或對于25kg豬各進行治療的血管而言約0.2mg/kg)，優(yōu)選地與1-棕櫚酰基-2-油?；字Ｄ憠A(POPC)以約1∶1的重量比聯(lián)合進行給藥。
在供選擇的實施方案中，并不直接提供該載脂蛋白，而是提供編碼該載脂蛋白的基因。將該基因以與蛋白所用方法相似的方法引入到血管中，然后在那里對蛋白進行表達。該技術還可用于治療或預防再狹窄或其它心血管疾病的基因傳遞。
在另一個實施方案中，將支架用單獨的載脂蛋白、用與脂質一起進行制備的載脂蛋白、表達載脂蛋白的遺傳學工程細胞、編碼載脂蛋白的裸DNA、或其它藥物如抗增生劑涂布后局部釋放到受損部位。這實施方案還包括將上述列舉的涂布材料聯(lián)合涂布到支架上以獲得更大的效能。在優(yōu)選的實施方案中，該系統(tǒng)與聯(lián)合治療一起使用，用于與全身抗高血壓治療、脂質調節(jié)和/或抗凝治療聯(lián)合的諸如載脂蛋白之類的物質局部釋放?？梢允褂玫乃幬锏膶嵗ㄖ|調節(jié)劑如煙酸、他汀類藥物、以及貝特類藥物(fibrates)；用于血糖控制的藥物；抗高血壓藥；和預防或延遲凝血或血小板聚集的物質如其中所說的物質是阿司匹林、IIb/IIIa抑制劑、氯吡格雷或肝素。使用局部治療并聯(lián)合一種以上的組合——例如使用局部傳遞治療加抗凝加脂質調節(jié)可以獲得最大的益處。這些治療可以在局部傳遞之前開始、與局部傳遞同時開始或在局部治療之后開始。全身治療優(yōu)選地在該局部傳遞操作之前開始。
附圖詳細說明

圖1-4涉及其中將10只家豬用100mg/kg ETC-216，一種apoA-IM/POPC(重量比約為1/1)復合體(complex)(n＝5)或鹽水(n＝5)單次靜脈內輸入來進行治療的試驗。將試驗物質在約3小時內靜脈內給藥，同時在每只動物的兩個冠狀血管中進行伴有支架展開的過度牽張的經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術。劑量是以該復合體的蛋白組分的重量為基礎的。動物在第28天(8只動物)或29天(1只動物)被實施安樂死，然后進行定量的冠狀血管造影術和血管內超聲(IVUS)，將冠狀動脈進行灌注和固定以進行組織形態(tài)學分析。一只對照動物在第27天時死亡，由該動物僅收集使用其組織形態(tài)學數(shù)據(jù)。
圖1a和1b是定量的冠狀血管造影術數(shù)據(jù)(QCA)的圖，其是在三個時間點進行測定的冠狀血管損傷前、緊接冠狀血管損傷和支架展開后、和處死前，并且是以在接近支架的未展擴(unstented)區(qū)段、在支架近端部分、支架整個長度的平均區(qū)域、支架的遠端部分、和遠離支架的未展擴區(qū)段所進行的直徑測量(mm)為基礎的。從這些數(shù)據(jù)可以測得被展擴(stented)區(qū)域的最大直徑和最小直徑。在展擴和相鄰的未展擴區(qū)段測定腔增量(損傷后的腔直徑減去損傷前的腔直徑)和腔損失(損傷后的腔直徑減去第28-29天追蹤觀察時的腔直徑)的QCA評估。所有血管(即右側冠狀動脈(RCA)和左前下行動脈(LAD)聯(lián)合)的QCA數(shù)據(jù)如圖1a所示，對于各種類型的血管(即RCA或LAD)而言如圖1b所示。
圖2a和2b是用于測定在處死前(手術后28-29天)各被擴展的冠狀血管的末端、中間和近端處支架和腔面積的血管內超聲(IVUS)數(shù)據(jù)圖。這些測量之間的差異是新內膜的面積。圖2a是對于所有血管(即RCA和LAD聯(lián)合)而言的，圖2b是對于各種類型的血管(即RCA或LAD)而言的。
圖3a和3b是用來測定外膜邊界層(ABL)、外部彈性層(EEL)、內部彈性層(IEL)、腔(L)、外膜(A)、中膜(M)、內膜(I)的平均橫截面區(qū)域、內膜與中膜比(I/M)和損傷得分的被擴展動脈的組織形態(tài)學分析。損傷得分是在被展擴血管膨脹部位的近端(a)、中間(b)和遠端(c)區(qū)段各測量12次而獲得的36次損傷測定的均值。將損傷記為0、1、2或3分，0表示完整的IEL(即沒有損傷)，3表示暴露于外膜的破裂的EEL(即最嚴重的損傷)。圖3a是所有血管(即RCA和LAD聯(lián)合)的組織形態(tài)學數(shù)據(jù)，圖3b是各種類型的血管(即RCA或LAD)的組織形態(tài)學數(shù)據(jù)。
圖4表示組織形態(tài)學和IVUS變量之間的選擇相關性。
圖5a和5b表示所收集的組織形態(tài)學數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)是由用INFILTRATOR——一種壁內傳遞裝置給予0.3-0.4ml包含4-6mg蛋白/血管ETC-216，apoA-IM/POPC(重量比約為1/1)復合體(n＝6只豬)或蔗糖-甘露醇介質(n＝6只豬)并且隨后在各動物的兩根冠狀血管中用支架展開進行過度牽張的經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術的家豬所獲得的。劑量表示復合體中蛋白組分的重量。所顯示的是用來測定外膜邊界層(ABL)、外部彈性層(EEL)、內部彈性層(IEL)、腔(L)、外膜(A)、中膜(M)、內膜(I)的平均橫截面區(qū)域、內膜與中膜比(I/M)和損傷得分的被擴展動脈的組織形態(tài)學分析。損傷得分是在被擴張血管膨脹部位的近端(a)、中間(b)和遠端(c)區(qū)段各測量12次而獲得的36次損傷測定的均值。將損傷記為0、1、2或3分，0表示完整的IEL(即沒有損傷)，3表示暴露于外膜的破裂的EEL(即最嚴重的損傷)。圖5a表示了所有血管(即RCA、左旋血管(left circumflex)(LCX)和LAD聯(lián)合)的組織形態(tài)學數(shù)據(jù)，圖5b所示的是相對于各類型的血管(即RCA、LCX或LAD)而言的組織形態(tài)學數(shù)據(jù)。
本發(fā)明的詳細描述已經(jīng)開發(fā)出的系統(tǒng)聚焦于在進行對病態(tài)冠狀動脈、外周動脈和腦動脈的旁路手術、手術植入移植物或移植器官、或血管成形術、或穩(wěn)定不穩(wěn)定的斑塊之前或期間可用于治療或預防再狹窄的物質的局部應用。該局部給藥優(yōu)選地是用一種包括可以在一定時間內緩慢釋放藥物的儲庫的裝置來進行的。該儲庫可以是該裝置如支架的一部分，或者可以通過注入到特定的組織或器官中來產生，例如通過心包內或INFILTRATOR給藥來進行。其可以用可通過商業(yè)途徑獲得的導管來完成。
被給藥的組合物可以是除去膽固醇和氧化脂質的物質(如與磷脂、他汀類物質、貝特類物質聯(lián)用的載脂蛋白)、編碼該類物質的DNA(例如，編碼載脂蛋白的DNA)或其它蛋白質如在一氧化氮產生中所涉及的酶、和/或藥物如抗增生化合物如雷帕霉素、紫杉醇或抗體如替羅非班和阿昔單抗。
還可以使用組合治療，在所說的組合治療中，藥物如ApoA-IM被局部給藥并且另一種藥物被全身給藥，例如全身抗高血壓治療、脂質調節(jié)和/或抗凝治療。可以使用的藥物的實例包括脂質調節(jié)劑如煙酸、他汀類物質、和貝特類物質；用于血糖控制的物質；抗-高血壓藥；和預防或延遲凝血或血小板聚集的物質，如其中所述的物質是阿司匹林、IIb/IIIa抑制劑、氯吡格雷或肝素。
1.脂質調節(jié)劑載脂蛋白制劑可起HDL作用的化合物包括合成的HDL，其包含與HDL關聯(lián)蛋白聯(lián)合的磷脂如磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、和其它磷脂，所說的HDL關聯(lián)蛋白如apoA-I或其變體包括apoAI-Milano以及得自其的生物學活性的肽、逆脂質轉運(RLT)肽、與HDL有關的酶如對氧磷酶、和apoE，其被單獨使用或與脂質體或乳劑聯(lián)合進行配制。這里所用的HDL關聯(lián)蛋白包括與HDL和具有相同連接或作用特性的合成肽相關聯(lián)的存在于HDL關聯(lián)蛋白中的序列?？稍鰪奌DL功能的化合物包括脂質體，其中HDL穿梭般往返于細胞到脂質體之間。University of British Columbia在WO 95/23592中對適宜的脂質體制劑進行了描述。
這里所描述的制劑典型地由α螺旋蛋白如ApoA-I、脂質、以及載體組成。
ApoA-I和ApoA-IM是可用于治療或預防由于對病態(tài)冠狀動脈、外周動脈和腦動脈進行旁路手術、手術植入移植物或器官移植、或血管成形術所導致的狹窄的有代表性的成分。
血漿ApoA-I是一種由243個氨基酸組成的單多肽鏈，其一級序列是已知的(Brewer等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.80623-630(1978))。ApoA-I在細胞中是以267個氨基酸的前體合成的。這種前載脂蛋白原(preproapolipoprotein)A-I通過18個氨基酸的N-末端裂解首先在細胞內被加工從而產生載脂蛋白原(proapolipoprotein)A-I，然后在血漿或淋巴中因特定蛋白酶活性被進一步裂解了6個氨基酸從而產生載脂蛋白A-I。認為ApoA-I分子所需的主要結構是存在11或22個氨基酸的重復單元，假定其是以兩親性的螺旋構型存在的(Segrest等人，F(xiàn)EBS Lett 38247-253(1974))。這種結構與Apoa-I的主要生物學活性相關，所說的主要生物學活性即脂質結合和卵磷脂膽固醇?；D移酶(LCAT)活化。
人載脂蛋白AI-Milano(ApoA-IM)是ApoA-I的天然變體(Weisgraber等人，J.Clin.Invest 66901-907(1980))。在ApoA-IM中，氨基酸Arg173被氨基酸Cys173所代替。因為ApoA-IM每條多肽鏈包含一個Cys殘基，所以其可以以單體、均二聚物、或雜二聚物的形式存在。這些形式在化學上可以互換，并且在本文中術語ApoA-IM在這些形式之間并沒有差別。在DNA水平上，該變體形式是在該基因序列上由C至T的取代所產生的，即密碼子CGC變成TGC，從而使得在氨基酸173位上進行了cys替代arg的轉換。但是，這種ApoA-I的變體是一種最引人注意的變體，這是因為ApoA-IM主體的特征為可顯著降低HDL-膽固醇水平而不會明顯增加動脈疾病的風險(Franceschini等人，J.Clin.Invest 66892-900(1980))。
另一種有用的ApoA-I的變體是Paris變體，其中精氨酸151被半胱氨酸所代替。
在試驗動物和人初期臨床研究(Nanjee等人，Arterioscler ThrombVasc Biol.19979-989(1999)和Eriksson等人，Circulation.100594-598(1999))中已經(jīng)表明給予單獨的ApoA-I(Miyazaki等人，Arterioscer Thromb Vasc Biol.151882-1888(1995))或HDL(Badimon等人，Lab Invest.60455-461(1989)和J Clin Invest.851234-1241(1990))全身輸入可產生顯著的生物化學變化，還可以降低動脈粥樣硬化損害的范圍和嚴重程度。如下面所詳細討論和被下面的實施例所證明的那樣，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其可在損害部位局部給藥并可顯著降低狹窄或再狹窄。
可以使用其他具有α螺旋特性的與HDL有關的載脂蛋白。實例包括Apo E、proApoA-I、ApoA-I Paris、ApoA-II、proApoA-II、ApoA-IV、ApoC-I、ApoC-II、和ApoC-III、這些蛋白中的α-螺旋序列、和被改性為包含一個或多個巰基(sulfhydral)的載脂蛋白，如Bielicki和Oda，Biochemistry 412089-2096(2002)所述的物質。還可以使用另外的HDL關聯(lián)蛋白。實例包括對氧磷酶、膽固醇酯轉移蛋白、LCAT和磷脂轉移蛋白。上面的蛋白可以單獨使用、聯(lián)合使用、單獨與脂質復合或聯(lián)合與脂質復合。此外，還可以使用復合體的混合物。實例有由ApoA-I與脂質所組成的復合體和由對氧磷酶和脂質所組成的復合體以混合物形式給藥。另外的實例包括由一種以上蛋白組分所組成的復合體。例如，由ApoA-I、對氧磷酶和脂質所組成的復合體是有用的。
脂質脂質與ApoA-I組成復合體可增強其功效。一般在給藥前將脂質與ApoA-I進行混合。將載脂蛋白和脂質在水性溶液中以適宜比例進行混合并且可以用現(xiàn)有技術中公知的方法來進行復合，其包括冷凍-干燥、去污劑增溶然后透析、微流化、超聲處理、和勻化。可以將復合效力最優(yōu)化，例如通過改變壓力、超聲頻率、或去污劑濃度來進行優(yōu)化。制備載脂蛋白-脂質復合體時常用的去污劑的實例是膽酸鈉。
在一些情況中，其希望在給藥前將脂質和載脂蛋白進行混合。脂質可以在溶液中或可以是用標準技術如超聲處理或擠出技術所形成的脂質體或乳劑的形式。超聲處理一般是用頂式超聲處理器(tipsonifier)，如Branson頂式超聲處理器在冰浴中進行的。一般將混懸液進行幾次超聲處理循環(huán)。擠出可以用生物膜擠出機，如Lipex生物膜擠出機來進行。在擠出過濾器中所設定的孔徑大小可以產生特定大小的單層脂質體泡囊。還可以通過使其通過不對稱的陶瓷過濾器，如可以從Norton Company，Worcester Mass.通過商業(yè)途徑獲得的Ceraflow Microfilter或聚碳酸酯過濾器或通常所公知的其他類型的聚合材料(即塑料)進行擠出來形成脂質體。
在一些情況中，其優(yōu)選地將單獨載脂蛋白以基本上不含脂質的方式進行給藥來對受損的動脈進行治療。將無菌的水性溶液加入到載脂蛋白中?？梢詫⒃谠撊芤褐械妮d脂蛋白進行給藥以對受損的動脈進行治療?；蛘?，可以在給藥前將復合體的冷凍干燥制劑用水性溶液進行水化。在其它情況中，在給藥于受損血管前將在水性溶液中的復合體的凍干制劑進行解凍直至獲得一種均勻的溶液。
優(yōu)選的脂質是磷脂類物質，最優(yōu)選地包括至少一種磷脂，有代表性的是大豆磷脂酰膽堿、蛋磷脂酰膽堿、大豆磷脂酰甘油、蛋磷脂酰甘油、棕櫚?；王；?磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、或二硬脂酰磷脂酰甘油。其他有用的磷脂類物質包括，例如，磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、鞘磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、N-(2，3-二(9-(Z)-十八碳烯氧基))-丙-1-基-N，N，N-三甲基銨氯化物、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、腦磷脂、心磷脂，腦苷脂、磷酸二(十六烷基)酯、二油?；字Ｄ憠A、二棕櫚?；字Ｄ憠A、二棕櫚?；字８视汀⒍王；字８视?、硬脂酰-棕櫚?；字Ｄ憠A、二-棕櫚?；字Ｒ掖及?、二硬脂?；字Ｒ掖及贰⒍舛罐Ⅴ；?磷脂酰絲氨酸、和二油?；?磷脂酰膽堿。還可以使用不包含磷的脂質，包括硬脂胺、十二烷基胺(docecylamine)、乙?；貦八狨?、和脂肪酸酰胺。
使用的另外的脂質對于本領域技術人員而言是眾所周知的并且可以列舉許多眾所周知的來源，例如，McCutcheon’s Detergents andEmulsifiers and McCutcheon’s Functional Materials，AlluredPublishing Co.，Ridgewood，N.J.。一般而言，希望該脂質在37℃、35℃或32℃下是液晶。液晶態(tài)的脂質一般可以比凝膠態(tài)的脂質更有效地接受膽固醇。因為患者一般具有約37℃的中心溫度，所以在37℃下為液晶的脂質在治療過程中一般為液晶態(tài)。
制劑中脂質的濃度可以發(fā)生變化。普通技術人員可以對這些濃度進行改變以將用不同脂質組分進行的治療或對特定患者進行的治療最優(yōu)化。ApoAI與脂質以1∶0.5至1∶3的重量比組合，對于清除膽固醇而言優(yōu)選使用更多的脂質。優(yōu)選地用約1∶1的比例來產生最均勻的組合群體并用于產生穩(wěn)定和可再生的批次。
其它脂質調節(jié)藥還可以將化合物與可特定地增加HDL水平(即不是作為降低LDL的副產物)的化合物一起進行給藥，從而改善HDL膽固醇與總膽固醇的比例，和這些物質任何組合的給藥都可以有效改善HLD與總血膽固醇水平的比例。
藥物的實例包括脂質調節(jié)劑如煙酸、他汀類物質、和貝特類物質。
抗增生藥可以用INFILTRATOR來釋放藥物如抗增生劑如紫杉醇和托泊替康(Biochemical Pharmacology，2001；61(1)119-127)。
基因傳遞在供選擇的實施方案中，可以將編碼待傳遞蛋白的基因進行給藥，而不是將蛋白進行給藥?？梢杂迷谫|粒或病毒載體中的遺傳物質的直接轉移來獲得基因轉移，或者可以通過在細胞或載體如陽離子脂質體中的遺傳物質轉移來進行傳遞。該類方法在現(xiàn)有技術中是眾所周知的并且對于在這里所描述的基因介導的毒素治療中的應用而言是易于接受的。正如Francis等人，Am.J.Pharmacogenomics 1(1)55-66(2001)所綜述的那樣，基因治療提供了一種預防和治療心血管疾病的新方法。病毒載體系統(tǒng)中的技術進步和梭原素(fusigenic)脂質體載體的發(fā)展對于涉及動物模型中脈管系統(tǒng)和心肌的有效基因治療策略的發(fā)展而言是很重要的。已經(jīng)對基因轉移技術作為遺傳(家族性高膽固醇血癥)和獲得性閉合性血管疾病(動脈粥樣硬化、再狹窄、動脈血栓形成)以及心臟病癥的供選擇的治療的可能性進行了評估，所說的心臟病癥包括心衰、心肌局部缺血、移植冠狀動脈硬化和高血壓。還可參見，Teiger等人，J.Cardiovasc.Pharmacol.33(5)726-732(1999)。
Wolff等人，Biotechniques 11474-85(1991)進行的研究證明將裸DNA注射到肌肉中可以產生DNA序列中所編碼蛋白的長期和低表達水平。可以用一種壁內裝置如INFILTRATOR將裸DNA給藥于平滑肌層并使其表達用于治療受損血管的蛋白或其α螺旋狀區(qū)域。轉移載體可以是用于將基因傳遞到細胞內的任何核苷酸構造(例如，質粒)，或可以是用于傳遞基因的通常策略的一部分，例如，作為重組的逆轉錄病毒或腺病毒的一部分(Ram等人，Cancer Res.5383-88，(1993))。已經(jīng)對用于轉染的適宜方法進行了描述，所說的用于轉染的適宜方法包括病毒載體、化學轉染子、或物理-機械法如電穿孔和DNA的直接擴散，所說的描述例如，Wolff，J.A.等人，Science，247，1465-1468，(1990)；和Wolff，J.A.Nature，352，815-818，(1991)。這里所用的質粒或病毒載體是可以將基因以不發(fā)生降解的方式轉運到細胞內的物質并包括在所傳遞到的細胞中產生基因表達的啟動子。在優(yōu)選的實施方案中，載體得自病毒或逆轉錄病毒。優(yōu)選的病毒載體是腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰質炎病毒、AIDS病毒、神經(jīng)元營養(yǎng)性病毒(neuronal trophic virus)、辛德比斯和其它RNA病毒，包括那些具有HIV主鏈的病毒。還優(yōu)選的是可共享這些病毒適于作為載體的性質的任何病毒族。優(yōu)選的逆轉錄病毒包括鼠Maloney白血病病毒、MMLV、和表達MMLV作為載體的所需性質的逆轉錄病毒。
逆轉錄病毒載體能比其它病毒載體攜帶更多的遺傳有效負載，即，轉基因或標記基因，因此，其是一種常用的載體。但是，其在非增生的細胞中無用。逆轉錄病毒是一種屬于逆轉錄病毒科的動物病毒，包括任何類型、亞科、屬、或向性。Verma，I.M.，在MICROBIOLOGY-1985，American Society for Microbiology，229-232頁，華盛頓(1985)中的“用于基因轉移的逆轉錄病毒載體”中對逆轉錄病毒載體進行了一般性描述。用逆轉錄病毒載體進行基因治療的方法的實例在US專利號4,868,116和4,980,286；PCT申請WO 90/02806和WO 89/07136；以及Mulligan，(Science 260926-932(1993))中進行了描述。
腺病毒載體相對較穩(wěn)定和易于以高滴度來運轉，并且可以在氣霧劑制劑中被進行釋放，可以對非分裂性細胞進行轉染。已經(jīng)對復制-有缺陷的腺病毒的構造進行了描述(Berkner等人，J.Virology611213-1220(1987)；Massie等人，Mol.Cell.Biol.62872-2883(1986)；Haj-Ahmad等人，J.Virology57267-274(1986)；Davidson等人，J.Virology611226-1239(1987)；Zhang “用脂質體介導的轉染和PCR分析進行的重組腺病毒的產生和鑒別”BioTechniques15868-872(1993))。用這些病毒作為載體的益處是在一定程度上限制了其向其它細胞類型的擴散，這是因為其可以在最初被感染的細胞內進行復制，但是不能形成新的有傳染性的病毒顆粒。已經(jīng)表明在直接體內傳遞到呼吸道上皮、肝細胞、血管內皮、CNS實質和許多其它組織部位后重組的腺病毒可以獲高效的基因轉移(Morsy，J.Clin.Invest.921580-1586(1993)；Kirshenbaum，J.Clin.Invest.92381-387(1993)；Roessler，J.Clin.Invest.921085-1092(1993)；Moullier.Nature Genetics4154-159(1993)；La Salle，Science259988-990(1993)；Gomez-Foix，J.Biol.Chem.26725129-25134(1992)；Rich，Human Gene Therapy4461-476(199 3)；Zabner，Nature Genetics675-83(1994)；Guzman，Circulation Research731201-1207(1993)；Bout.Human Gene Therapy53-10(1994)；Zabner，Cell75207-216(1993)；Caillaud，Eur.J.Neuroscience51287-1291(1993)；和Ragot，J.Gen.Virology74501-507(1993))。
重組的腺病毒通過與特定的細胞表面受體進行結合來完成基因轉導，在所述與特定的細胞表面受體結合后，病毒通過受體所介導的胞吞而被內在化，其方式與野生型或復制有缺陷的腺病毒相同(Chardonnet and Dales，Virology40462-477(1970)；Brown andBurlingham，J.Virology12386-396(1973)；Svensson and Persson，J.Virology55442-449(1985)；Seth等人，J.Virol.51650-655(1984)；Seth等人，Mol.Cell.Biol.41528-1533(1984)；Varga等人，J.Virology656061-6070(1991)；Wickham等人，Cell73309-319(1993))。
痘病毒載體大并且具有一些插入基因的部位，其耐熱并且可以在室溫下進行儲存。一個優(yōu)選的實施方案是被設計成可以抑制被該病毒抗原所激發(fā)的宿主有機體的免疫響應的病毒載體。優(yōu)選的這種類型的載體將攜帶白介素8或10的編碼區(qū)域。
病毒載體的處理能力(導入基因的能力)比大多數(shù)將基因引入到細胞中的化學或物理方法更高。典型地，病毒載體包含無結構的早期基因、有結構的晚期基因、RNA聚合酶III轉錄物、復制和包殼所需的末端反向重復、以及控制病毒基因組的轉錄和復制的啟動子。當被設計成載體時，病毒一般具有一個或多個被移除的早期基因和代替被除去的病毒DNA的被插入到病毒基因組中的基因或基因/啟動子盒。這種類型的構造可以攜帶高至約8kb的外源遺傳物質。被除去的早期基因的必需功能一般是由被設計用來表達反式早期基因的基因產物的細胞系所供給的。
在病毒和逆轉錄病毒中被插入的基因通常包含啟動子、和/或用于幫助控制所需基因產品的表達的增強子。啟動子一般是當位于相對于轉錄開始的位置而言相對固定的位置上時起作用的DNA序列或序列們。啟動子包含RNA聚合酶和轉錄因子的基本相互作用所需的核心元素，并且可以包含上游元件和效應元件。在哺乳動物宿主細胞中控制由載體進行的轉錄的優(yōu)選的啟動子可以得自各種來源，例如，病毒的基因組，所說病毒如多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒并且最優(yōu)選地是巨細胞病毒，或得自異源哺乳動物的啟動子，例如β肌動蛋白啟動子。SV40病毒的早期和晚期啟動子作為SV40的限制片段可以方便的獲得，其還包含SV40病毒的復制原點(Fiers等人，Nature，273113(1978))。人巨細胞病毒的直接早期啟動子作為HindIIIE限制片斷可方便地獲得(Greenway，P.J.等人，Gene18355-360(1982))。當然，得自宿主細胞或相關種屬的啟動子在這里也是有用的。
增強子一般指的是在距離轉錄起始部位的不固定距離上起作用的DNA的序列并且相對于該轉錄單元而言可以是5′(Laimins，L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.78993(1981))或3′(Lusky，M.L.等人，Mol.Cell Bio.31108(1983))。此外，增強子可以位于內含子內(內含子)(Banerji，J.L.等人，Cell 33729(1983))以及其本身的編碼序列內(Osborne，T.F.等人，Mol.Cell Bio.41293(1984))。其長度通常為10至300bp，并且其通常以順式形式起作用。增強子可以起增加由附近啟動子所進行的轉錄的作用。增強子常常還包含介導轉錄調節(jié)的效應元件。啟動子也可包含介導轉錄調節(jié)的效應元件。增強子常常決定基因表達的調節(jié)。雖然現(xiàn)在許多增強子序列已知來自哺乳動物的基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰島素)，但是其代表性的是來自真核細胞病毒的增強子。優(yōu)選的實例是在復制原點最近側(late side)上的SV40增強子(bp100270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、位于復制原點最近側上的多瘤病毒增強子、和腺病毒增強子。
該啟動子和/或增強子可以被光或可觸發(fā)其功能的特定的化學事件所特異性活化?？梢杂迷噭┤缢沫h(huán)素和地塞米松來對系統(tǒng)進行調節(jié)。還有通過暴露于輻射如γ輻射或烷化化療藥來增強病毒載體基因表達的方法。
優(yōu)選地，該啟動子和/或增強子區(qū)域作為組成型啟動子和/或增強子將被轉錄的轉錄單位區(qū)域的表達最大化。還優(yōu)選地是該啟動子和/或增強子區(qū)域在所有真核細胞類型內是有活性的。這種類型的優(yōu)選的啟動于是CMV啟動子(650個堿基)。其它優(yōu)選的啟動子有SV40啟動子、巨細胞病毒(全長啟動子)、和逆轉錄病毒載體LTF。已經(jīng)表明所有特定的調節(jié)元件都可以被克隆并用于構造在特定的細胞類型中被選擇性表達的表達載體。
在宿主真核細胞中所用的表達載體還可以包含可以影響mRNA表達的轉錄終止所必需的序列。這些區(qū)域被轉錄為編碼組織因子蛋白的mRNA未轉譯部分中的聚腺苷?；瑪嗟男问?。3′未轉譯的區(qū)域還包括轉錄末端部分。優(yōu)選地，該轉錄單元還包含聚腺苷酸化區(qū)域。這種區(qū)域的一個益處是其增加了轉錄單元象mRNA一樣被加工和轉運的可能性。已經(jīng)建立了聚腺苷酸化信號在表達構造中的識別和應用。優(yōu)選地，在該轉基因構造中使用同源的聚腺苷酸化信號。在該轉錄單元一個優(yōu)選的實施方案中，該聚腺苷酸化區(qū)域得自SV40早期聚腺苷酸化信號并由約400個堿基所組成。還優(yōu)選地是該被轉錄的單元單獨或與上面的序列相聯(lián)合地包含其他標準序列從而改善了得自該構造的表達或該構造的穩(wěn)定性。
該病毒載體可以包括編碼標記產品的核酸序列。這種標記產品被用來測定該基因是否已被傳遞到細胞中和一旦被傳遞是否被表達。對于哺乳動物細胞而言可選擇的適宜標記物的實例有二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸腺嘧啶脫氧核苷激酶、新霉素、新霉素類似物G418、hydromycin、和嘌呤霉素。當該類可選擇的標記物被成功地轉移到哺乳動物宿主細胞中時，如果被放置在選擇壓力下時，被改造的哺乳動物宿主細胞可存活。
在優(yōu)選的實施方案中，在這些蛋白內編碼ApoA-I、ApoA-IV、ApoE、對氧磷酶或α-螺旋狀區(qū)域的DNA的壁內傳遞是在帶有或不帶有脂質的情況下被傳遞到動脈以對受損的血管進行治療的。
還可以傳遞編碼許多不同蛋白的DNA。例如，如Chen等人，Jpn.J.Pharmacol.89(4)327-336(2002)所描述的那樣，心血管基因轉移不僅是用于研究心血管生物學和病理學中特定基因功能的有效技術，而且還是一種用于治療心血管疾病的有希望的策略。從20世紀90年代中期以來，作為一種心血管基因治療可能的候選物，一氧化氮合酶(NOS)——催化由L-精氨酸形成一氧化氮(NO)的酶——已經(jīng)受到了相當大的注意，這是因為NO在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要和多樣的作用，在許多心血管疾病過程中都出現(xiàn)了NO的生物學異常，所說的心血管疾病包括腦血管痙攣、動脈粥樣硬化、血管成形術后的再狹窄、移植血管病、高血壓、糖尿病、陽痿和傷口愈合延遲。有三種NOS同工型，即，內皮的(eNOS)、神經(jīng)元的(nNOS)和可誘導的(iNOS)NOS。三種NOS同工型都已經(jīng)被用于心血管基因轉移研究中，并取得了令人鼓舞的結果。
Kipshidze等人，J.Am.Coll.Cardio.39(10)1686-1691(2002)描述了通過將反義寡核苷酸進行壁內傳遞來降低新內膜的形成。
Turunen等人，Mol Ther 6(3)306(2002)，描述了用與可以結合到基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的肽-基元(motif)(HWGF)相結合的核靶向的lacZ-和TIMP-1-編碼腺病毒進行的基因治療。與對照腺病毒相比，在體內，局部血管內導管介導的HWGF-靶向的TIMP-1-編碼腺病毒(AdTIMP-1(HWGF))的基因轉移顯著降低了兔子主動脈囊剝脫模型中的內膜增厚。
這里所公開的方法的優(yōu)點是其在需要治療的部位可以在更長的時間內提供傳遞和釋放。
用于全身治療的藥物可以將各種不同的藥物全身和/或局部給藥。這些藥物包括用于血糖控制的物質；抗-高血壓藥；抗炎藥如甾類抗炎藥、環(huán)加氧酶-2(COX-2)抑制劑，如西樂葆(Celebrex)、VIOXX、和環(huán)加氧酶抑制劑如布洛芬和非甾類抗炎藥、以及預防或延遲凝血或血小板聚集的物質如其中所說的物質是阿司匹林、IIb/IIIa抑制劑、氯吡格雷或肝素。
支架涂層還可以將支架僅用載脂蛋白、用與脂質一起進行配制的載脂蛋白、表達載脂蛋白或其他蛋白的細胞、編碼治療蛋白的DNA、或具有局部作用的藥物如紫杉醇、雷帕霉素或其他抗增生化合物來進行涂布。然后該涂層在損傷、斑塊或待治療區(qū)域釋放藥物。
可藥用的載體該藥物組合物一般包括可藥用的載體?？梢允褂迷S多可藥用的載體。實例是使用蔗糖-甘露醇。一般用生理鹽水作為可藥用的載體。其它適宜的載體包括葡萄糖、海藻糖、蔗糖、無菌水、進行了緩沖的水、0.4％的鹽水、和0.3％的甘氨酸，并且可進一步包括用于增強穩(wěn)定性的糖蛋白，如白蛋白、載脂蛋白、脂蛋白、球蛋白等等。這些組合物可以用常規(guī)的眾所周知的滅菌技術來進行滅菌?？梢詫⑺玫乃匀芤哼M行用于應用的包裝或在無菌的條件下進行過濾并凍干，可以在給藥前將該冷凍干燥的制劑與無菌的水性溶液相結合。該組合物可以根據(jù)需要包含可藥用的輔料以使其接近生理學條件，所說的輔料如pH調節(jié)劑和緩沖劑、以及滲透壓調節(jié)劑，例如，醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、和氯化鈣。
在另一個實施方案中，ApoA-I以凝膠、或可在給藥部位形成凝膠的聚合物溶液的形式來進行給藥。在一個實施方案中，藻酸鈣和某些其他聚合物可以形成可延展的離子水凝膠。例如，可以通過海藻酸的陰離子鹽(一種由海藻分離出來的碳水化合物聚合物)與鈣陽離子的交聯(lián)來制備水凝膠，可以通過增加鈣離子或藻酸根的濃度來增加其強度。將該藻酸鹽溶液與ApoA-I進行混合從而形成一種在該混懸液硬化前可直接注射于患者的藻酸鹽混懸液。然后，該混懸液由于在體內存在的生理學濃度的鈣離子而在短期內硬化?？梢院铣筛男缘脑逅猁}衍生物，例如，可更迅速降解的物質或用疏水性水不穩(wěn)定鏈進行衍生化的物質，例如(-己內酯的低聚物，其具有形成水凝膠的改良的能力。此外，可以用與上面所描述的藻酸鹽的交聯(lián)的方法相似的方法來將多糖進行交聯(lián)從而形成水凝膠，所說的多糖通過與單價陽離子進行接觸而膠化，包括細菌多糖，如吉蘭糖膠，和植物多糖，如角叉菜膠。可用來形成水凝膠的物質的其他的實例包括聚膦嗪和聚丙烯酸酯，其是離子交聯(lián)的、或嵌段共聚物如Pluronics TM或Tetronics TM、可以分別由溫度或pH來交聯(lián)的聚環(huán)氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。其他材料包括聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、透明質酸和膠原。還可以使用是十分粘的液體或具有觸變性，并可以隨著時間的流逝通過結構的緩慢演化形成凝膠的聚合物如多糖。例如，可以使用可形成一種具有類似發(fā)膠的粘度的可注射凝膠的透明質酸。改性的透明質酸衍生物特別有用。還可以使用聚合物混合物。例如，可以使用混合時通過氫鍵膠化的聚環(huán)氧乙烷和聚丙烯酸的混合物。在一個實施方案中，可以將5％w/w聚丙烯酸的溶液與5％w/w聚環(huán)氧乙烷(聚乙二醇、聚氧化乙烯)100,000的混合物聯(lián)用以在一定的時間過程中形成一種凝膠，例如可以在幾秒鐘內迅速形成一種凝膠。
還可以使用可共價交聯(lián)的水凝膠前體。例如，可以將一種水溶性的聚胺，如殼聚糖與一種水溶性的二異硫氰酸酯，如聚乙二醇二異硫氰酸酯進行交聯(lián)。異硫氰酸酯將可以與胺進行反應從而形成一種化學交聯(lián)的凝膠。還可以利用醛與胺的反應，例如與聚乙二醇二醛的反應。還可以使用羥基化的水溶性聚合物。
或者，可以使用包含一旦與自由基引發(fā)劑進行接觸時可以通過自由基反應來進行交聯(lián)的取代基的聚合物。例如，如在WO 93/17699中所描述的那樣，可以使用包含可被光化學交聯(lián)的烯屬不飽和基團的聚合物。此外，如Matsuda等人，ASAID Trans.，38154-157(1992)所公開的那樣，可以使用包含可被光化學交聯(lián)的肉桂?；乃苄跃酆衔?。
該凝膠材料可以通過噴霧(在開放式操作中)或通過INFILTRATOR或導管(在封閉式操作中)來進行應用。一般而言，在凝固或聚合時將單獨的ApoA-I、與脂質聯(lián)用的ApoA-I、或與脂質復合的ApoA-I與這些凝膠進行混合，然后使其在被治療脈管的表面緩慢向外擴散。
在另一個實施方案中，將該可藥用的載體涂布在支架上。可以選擇以時間依賴方式來釋放本發(fā)明物質的載體。普通技術人員可以對該載體進行變化以獲得最優(yōu)的支架涂層從而獲得本發(fā)明物質從該支架上時間依賴性的釋放。
II.治療方法在主要實施方案中，在對病態(tài)冠狀動脈、外周和腦動脈進行旁路手術、用手術植入移植物或器官移植、或血管成形術、或對不穩(wěn)定的斑塊進行穩(wěn)定之前或進行操作期間，用儲庫裝置如INFILTRATOR將膽固醇降低劑如載脂蛋白A-I(ApoA-I)，優(yōu)選變體形式如載脂蛋白A-IMilano(ApoA-IM)單獨進行局部給藥或更優(yōu)選地將其與脂質載體如磷脂或另一種藥物聯(lián)合進行局部給藥，從而將有效劑量給藥于損傷部位。在其它實施方案中，可以使用相同的技術和材料以減少斑塊破裂的后果，所說的后果包括血栓形成和局部缺血。
在其他優(yōu)選的實施方案中，與全身治療聯(lián)合開始進行局部治療，例如，與用于降低再狹窄、減少或預防斑塊破裂、降低血膽固醇、降低動脈粥樣硬化損傷性膽固醇、減少凝血、調節(jié)一種或多種血液脂質(即脂質調節(jié)劑)、降低炎癥、或控制血壓的物質聯(lián)用?？梢允褂玫乃幬锏膶嵗ㄖ|調節(jié)劑如煙酸、他汀類物質、和貝特類物質；用于控制血糖的物質；抗-高血壓藥；和預防或延遲凝血或血小板聚集的物質，如其中所說的物質是阿司匹林、IIb/IIIa抑制劑、氯吡格雷或肝素。這些另外的物質一般以其正常的治療劑量被全身給藥。
可以通過將局部傳遞治療與一種或多種組合聯(lián)用來獲得最大的益處，例如使用局部傳遞加抗凝加脂質調節(jié)。這些治療可以在局部傳遞之前開始、與局部傳遞同時開始或在局部傳遞之后開始。該全身治療優(yōu)選地在局部傳遞操作之前開始。
在優(yōu)選的實施方案中，通過一種壁內傳遞裝置來將Apo A-I制劑進行給藥，所說的壁內釋放裝置如得自IntraventionalTechnologies，Inc，San Diego，CA(現(xiàn)在被Boston Scientific所擁有)的INFILTRATOR。Pavlides等人，Cathet.Cardiovasc.Diagn.41(3)287-292(1997)描述了另一種有用的裝置。其它的傳遞手段可以使用在血管成形術前、在囊膨脹期間或膨脹后，由儲庫傳遞藥物的導管。
在最優(yōu)選的實施方案中，在治療前或在治療時將ApoA-IM制劑以單劑量進行給藥。治療包括血管成形術，病態(tài)冠狀動脈、外周動脈或腦動脈的旁路手術，植入血管支架，植入所移植的器官或組織，和穩(wěn)定斑塊。
如下面ApoA-IM實施例中所做的那樣，優(yōu)選劑量是通過實驗研究來決定的。以ApoA-IM的劑量為基礎，考慮膽固醇移除功效、半衰期、和其它相關藥代動力學參數(shù)之間的差異，可以容易地計算出其他載脂蛋白的劑量?；蛘?，可以通過考慮該制劑抗氧化、抗炎和抗血栓形成性質在功效上的差異來容易地計算其他載脂蛋白的劑量。以得自ApoA-IM的實驗數(shù)據(jù)為基礎，可以相似地決定不同制劑所存在的脂質和脂質的數(shù)量。
一般而言，該制劑被給藥于治療部位。局部傳遞時的實際劑量顯著低于獲得相同局部劑量時所需的被全身給藥的劑量，但是，局部濃度卻遠遠高于以前將ApoA-I全身給藥的研究所獲得的濃度。如上面所表明的那樣，ApoA-IM的優(yōu)選劑量為4至6mg ApoA-IM/血管(一般用約4至18mg ApoA-IM的總劑量可以對至多三個區(qū)段進行治療)，或對于70kg的哺乳動物而言為約0.05至0.3mg ApoA-IM/kg體重。蛋白與脂質的優(yōu)選比例為1∶0.5至1∶3，對于膽固醇的清除而言可以使用更多的脂質，但是出于制劑的穩(wěn)定性和連續(xù)性考慮，更優(yōu)選更為接近等量的蛋白與脂質，以便管理部門批準。對于除這些包含apoA-IM制劑之外制劑的蛋白與脂質的比例而言，在各種蛋白與脂質比例下進行試驗，并且確定所述穩(wěn)定性以及連續(xù)性以及各特征(如復合體大小以及膽固醇流量)，以便管理部門批準。
雖然已經(jīng)證明單次給藥有效，但是也可以進行多劑量給藥。例如，在進行操作后4周，相對于對照組而言，在第-1、0、1、2、和3天靜脈內給予20mg ApoA-IM/kg體重使得所有囊過度膨脹損傷的血管都表現(xiàn)出增加的腔面積。
將參考下面非限制性的實施例對本發(fā)明進行進一步的說明。
經(jīng)皮的冠狀動脈干預是現(xiàn)在用于增加患有冠狀動脈局部缺血患者狹窄血管腔的主要方法。這些操作是通過通常被成為“氣脹術”的經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術(PTCA)來進行的。在大多數(shù)情況中，該操作是通過支架在被膨脹區(qū)域展開以增加血管直徑從而增加血流并緩解局部缺血來完成的。主要缺陷是操作后被稱為再狹窄的血管腔閉合。在不存在支架時，術后早期反彈和血栓形成的發(fā)生率很成問題，因此，目前大多數(shù)囊操作還包括支架的展開。雖然支架展開操作改善了后果，但是術后被展擴血管的新內膜生長可造成再狹窄和再發(fā)性局部缺血或其他冠狀血管事件，包括心肌梗死。因此，需要一些用于預防用囊和支架進行了處理的血管的新內膜生長的方法來改善術后的結果。選擇豬模型作為用于此研究的適宜試驗系統(tǒng)。文獻中的證據(jù)表明豬模型中的動脈擴張和再狹窄與人再狹窄的情形相似。因此，可以用這種模型來對可能用于臨床再狹窄治療的治療物質進行評估。
實施例1單一高劑量靜脈內給予ETC-216——一種包含由ApoA-IM和棕櫚?；?油?；?磷脂酰膽堿(POPC)所組成的復合體的制劑，對被展擴豬冠狀動脈中過度牽張的經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術(PTCA)中再狹窄的作用。
這項研究的目的是要測定在進行冠狀動脈PTCA和支架放置過程中進行ETC-216的單一靜脈內藥物傳遞對血管損傷的豬模型中的再狹窄的作用。
材料和方法實驗動物選擇豬模型來作為用于此研究的適宜實驗系統(tǒng)。文獻中的證據(jù)表明豬模型中的動脈擴張和再狹窄與人再狹窄中的相似。因此，可以用這種模型對可能可用于治療再狹窄的治療物質進行評估。使動物至少有7天的時間來適應實驗室環(huán)境，并且在開始研究前對動物進行檢查以確保其健康。
在留驗期間和手術前，使動物單獨居住進行飼養(yǎng)。每天清潔兩次動物籠子。對動物籠子的溫度和濕度(70-78°F；30-80％RH)進行監(jiān)測以將其維持在70-80℃和30-80％的相對濕度下。房間里的氣流足以提供每小時用100％新鮮的進行了過濾的空氣進行幾次交換。用自動計時裝置來提供日夜12-小時循環(huán)交替。在手術后，使動物在恢復室中進行恢復，然后將其放回到籠子里。除進行手術的日子里動物被禁食一整夜外，在整個實驗期間，每天給動物喂食一餐得自Newco(Rancho Cucamonga，CA)的豬飼料(Southwest Farms Hog FinisherDiet)。通過一種自動供水系統(tǒng)使動物隨意飲用新鮮的水。
對動物隨機進行選擇并將其分成兩個研究組。當動物因手術操作或認為是由于手術操作而導致的并發(fā)癥死亡或不得不被安樂死時，指定另外的動物進行研究。
試驗物質包括ETC-216，一種由Esperion Therapeutics，Inc.提供的重組的載脂蛋白A-I Milano/1-棕櫚?；?2-油酰基磷脂酰膽堿(POPC)復合體，其為易于注射的溶液或鹽水形式。ETC-216溶液包含約14mg/ml apoA-IM蛋白，蛋白與POPC的比例為重量比約1∶1。
對這種研究而言選擇靜脈內給藥，這是因為這是將用于人類臨床研究的途徑。根據(jù)動物體重來對劑量進行選擇。將試驗物質以100mg/kg體重的劑量進行給藥。這種劑量是以該復合體的載脂蛋白含量為基礎的。因此，在該研究中平均一只豬接受約3000-3500mg藥物。對照動物使用鹽水。
用成年的家豬(重約30-35kg，一只重50kg)來進行手術。使動物正常進食和居住。在手術前將豬禁食一整夜并于手術前3天對其進行口服325mg阿司匹林的預處理并且其后每天進行該處理直至安樂死。在手術開始前3天給動物使用噻氯匹定(250mg)并在手術后每天給藥，給藥14天。在禁食一整夜16小時后，將動物固定并給其肌內(IM)注射乙酰丙嗪(0.5mg/kg)、氯胺酮(20mg/kg)、和阿托品(0.05mg/kg)；通過靜脈內(IV)給予硫噴妥(5-8mg/kg)來誘導麻醉；并在氣管插管后通過1-2％異氟烷來進行維持。在操作期間進行機械換氣、動脈血壓(BP)和連續(xù)的心電圖(ECG)監(jiān)測。在手術后2天每天給動物使用鹽酸地爾硫(cardizem)(120mg)。
手術操作包括暴露頸動脈，然后將一個8F鞘插入到該頸動脈中。在進行動脈器械操作前給動物使用托西溴芐銨(250mg IV)、鹽酸普萘洛爾(inderal)(1mg)和肝素(10,000U IV)。在手術操作開始前90分鐘給動物使用ETC-216或鹽水，從而在約3小時內將整個劑量進行給藥。在熒光鏡的引導下，使一根8F AL-0.75引導導管前進到頸動脈口。在冠狀動脈內給予硝酸甘油(200mcg)后，進行血管造影術以對血管的大小進行評估。在第一個血管中完成支架過度牽張的損傷，然后在第二個血管中重復進行。在所有的情況中，將支架在LAD和RCA中展開。用作為解剖學參考的斜或間隔支的位置使支架在LAD和RCA中在直徑平均為2.7至3.0mm的區(qū)段展開。所有的支架都是用一種囊來展開的，所說的囊在30秒內膨脹1至3次至6-8個大氣壓以達到最終支架動脈的比例約為1.3∶1。開始進行血管造影術以對準支架位置并進行重復以確認在支架展開部位跡象為損傷區(qū)段明顯“遞升”或“遞降”的損傷。將該導管撤回，將進行了結扎的頸動脈和皮膚切口閉合。為了預防感染，在該操作結束時給所有的動物都使用抗生素。動物從麻醉中恢復過來，回到動物飼養(yǎng)室中，喂食添加有如上所述的藥物的常規(guī)飼料。
血管造影術和IVUS測量用定量的冠狀動脈血管造影術(QCA)來在各時間點對平均和最小的腔直徑進行評估，即，在損傷前、緊接損傷后和安樂死前28-29天隨訪時進行評估。
在定量期間所用術語的定義冠狀血管造影術MLD＝平均腔直徑R1＝近端區(qū)段的參考區(qū)段(未展擴的)Prox.＝被展擴動脈的近端區(qū)段Mid.＝被展擴動脈的中間區(qū)段Dist.＝被展擴動脈的遠端區(qū)段R2＝遠端區(qū)段的參考區(qū)段(未展擴的)Max＝在整個展擴區(qū)段中最大腔直徑Min＝在整個展擴區(qū)段中最小腔直徑腔增量＝損傷后的腔直徑減去損傷前的腔直徑腔損失＝損傷后的腔直徑減去28天隨訪時的腔直徑用未損傷區(qū)段作為參考對損傷區(qū)段的狹窄百分比進行估計。用血管內超聲(IVUS)測量了支架區(qū)域、腔區(qū)域、新內膜區(qū)域、狹窄區(qū)域％參數(shù)。
根據(jù)囊損傷后立即測量的MLD和在28-29天隨訪時測量的MLD之間的差異來計算晚期腔損失，并且通過用晚期腔損失除以損傷后的MLD來計算改型指數(shù)。
在隨訪時冠狀動脈的分析在28(n＝8)或29(n＝1)天后，為進行隨后的血管造影術，將動物禁食一整夜并如上進行手術前處理。(在一個在第27天死亡的用生理鹽水處理的對照動物中，僅進行組織學分析)。此外，在隨后，對于各被展擴動脈的IVUS研究而言，將IVUS導管在被展擴冠狀動脈中展開。然后在用IV戊巴比妥90mg/kg進行麻醉的情況下將動物安樂死，在血管切開術后切除心臟。用鹽水對冠狀動脈進行灌注以清除血液，然后用2％低聚甲醛固定灌注15分鐘，然后用4％在磷酸緩沖液(pH7.4)中的低聚甲醛浸漬4小時，最后將其存儲于70％的乙醇中。為了保持外膜和血管周組織的完整性，小心地將冠狀動脈同毗連的組織(脂肪組織和心肌)一起摘除下來。對于被展擴區(qū)段而言，進行特定的組織學處理以用金屬支柱在原位維持血管的體系結構。將組織塊埋入到甲基丙烯酸甲酯中并用金剛石刃的刀對其進行切割。切下三個包含12個支柱的放射狀的橫截面一個得自各支架的近端三分之一處、一個得自各支架的中間三分之一處和一個得自各支架的遠端三分之一處。將這些部分研磨至約50μm的厚度，進行光學拋光，并用甲苯胺藍(paragon染色劑)進行染色。
組織形態(tài)學分析使用用電腦進行處理的成像系統(tǒng)(Image Pro Plus 4.0)來進行下面的組織形態(tài)學測量1.平均的橫截面面積和腔厚度(被內膜/新內膜-腔邊緣所圍繞著的區(qū)域)；新內膜(腔和內部彈性層之間的區(qū)域，IEL，并且當IEL消失時，為腔和中膜或外部彈性層的殘余物之間的區(qū)域，EEL)；中膜(IEL和EEL之間的區(qū)域)；血管大小(被EEL所圍繞的區(qū)域但是不包括外膜區(qū)域)；和外膜(外膜周組織、脂肪組織和心肌、以及EEL間的區(qū)域)。
2.損傷得分。為了對血管損傷程度進行定量，進行以不同壁結構破裂的數(shù)量和長度為基礎的評分。損傷程度的計算如下0＝完整的IEL1＝暴露于淺中間層的破裂的IEL
2＝暴露于較深的中間層(中間解剖層)的破裂的IEL3＝暴露于外膜的破裂的EEL結果用五只用鹽水進行了處理的家豬或五只用ETC-216進行了處理的豬(每組四只雄性和一只雌性豬)來對治療后27-29天的再狹窄進行評估。
在研究過程中，血液得自一些而不是所有的動物，用其來對白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、血細胞比容％、血小板計數(shù)進行測量。在對這些血變量進行測量的所有情況中，與基準值相比，治療后的值并沒有發(fā)生可觀的改變。即，其都在正常的范圍內。
測量所有進入研究時的動物的心率和血壓作為基準。在手術操作過程中和處死前也對大多數(shù)動物的心率和血壓進行了測量。對于進入研究的動物而言，這些變量與基準值相比沒有由于進行了手術操作或治療而發(fā)生可觀的改變。
在三個時間點進行定量的冠狀動脈血管造影術(QCA)的測量冠狀動脈損傷前、緊接冠狀動脈損傷后和支架展開后、和處死前(圖1a和圖1b)。在接近支架的未展擴區(qū)段(R1)、支架的近端部分(Prox)、支架整個長度的平均區(qū)域(Aver)、支架的遠端部分(Dist)和遠離支架的未展擴區(qū)段(R2)進行直徑測量(mm)。此外，測量被展擴區(qū)域的最大直徑(Max)和最小直徑(Min)。在被展擴和毗連的未展擴區(qū)段測量腔增量和腔損失的QCA評估。測定了被擴展血管的最大(腔損失最大指數(shù))和最小(腔損失最小指數(shù))指數(shù)。圖1a和1b分別圖示了對于所有血管(即RCA和LAD聯(lián)合)或各種類型的血管(即RCA或LAD)而言定量的冠狀血管造影術數(shù)據(jù)。
用血管內超聲(IVUS)來測量處死前各擴展的冠狀動脈血管遠端、中間和近端區(qū)域處的支架和腔面積。這些測量之間的差異是新內膜面積。測量各動物和區(qū)段的支架、腔和新內膜區(qū)域的均值，并用其來測量匯集(LAD加RCA)的或各冠狀血管(LAD或RCA)治療組的均值。一只對照處理的豬在其預定操作前一天(即在第27天)死亡，因此，僅對其擴展的冠狀血管進行了組織形態(tài)學測量。圖2a和2b分別圖示了對于所有血管(即RCA和LAD聯(lián)合)和各種類型的血管(即RCA或LAD)而言的血管內超聲數(shù)據(jù)。
用被擴展動脈的組織形態(tài)學分析來測量外膜邊界層(ABL)、外部彈性層(EEL)、內部彈性層(IEL)、腔(L)、外膜(A)、中膜(M)、內膜(I)的平均橫截面區(qū)域、內膜與中膜比(I/M)和損傷得分。損傷得分是在被展擴血管膨脹部分的近端(a)、中間(b)和遠端(c)區(qū)段各測量12次而獲得的36次損傷測定的均值。將損傷記為0、1、2或3分，0表示完整的IEL(即沒有損傷)，3表示暴露于外膜的破裂的EEL(即最嚴重的損傷)。
ETC-216治療顯著降低了冠狀血管內膜與中膜(I/M)的比值，將其降低了32％(RCA和LAD聯(lián)合)。這種作用主要是由于LAD的I/M比例有38％的顯著降低和RCA有較小程度的22％的降低(不顯著)。應當注意的是，對于損傷而言，RCA(損傷得分＝1.87±0.54)比LAD(損傷得分＝2.57±0.34)的反彈更顯著。圖3a和3b分別圖示了所有血管(即，RCA和LAD聯(lián)合)和各種類型的血管(即RCA或LAD)的組織形態(tài)學數(shù)據(jù)。圖4表示了組織形態(tài)學和IVUS變量之間的選擇相關性。
實施例2INFILTRATOR壁內傳遞ETC-216——一種包含由ApoA-IM和棕櫚酰基-油?；?磷脂酰膽堿(POPC)所組成的復合體的制劑對豬冠狀動脈中伴有支架展開的過度牽張的經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術(PTCA)中再狹窄的作用。
材料和方法用體重為25-30kg的成年家豬進行實驗。給動物喂食常規(guī)飼料并將其在動物飼養(yǎng)室中進行喂養(yǎng)。在手術前將豬禁食一整夜并于術前3天對其進行口服阿司匹林(325mg)的預處理并且其后每天對其進行該處理直至安樂死。在手術開始前3天給動物使用噻氯匹定(250mg)并在手術后每天給藥，給藥14天。在手術后2天每天給動物使用鹽酸地爾硫(120mg)。
在禁食一整夜16小時后，將動物固定并給其肌內(IM)注射乙酰丙嗪(0.5mg/kg)、氯胺酮(20mg/kg)、和阿托品(0.05mg/kg)；通過靜脈內(IV)給予硫噴妥(5-8mg/kg)來誘導麻醉；并在氣管插管后通過1-2％異氟烷來進行維持。在操作期間進行機械換氣、動脈血壓(BP)和連續(xù)的心電圖(ECG)監(jiān)測。
手術操作包括暴露頸動脈，然后將一個8F鞘插入到該頸動脈中。在進行動脈器械操作干預前給動物使用托西溴芐銨(250mg IV)、鹽酸普萘洛爾(1mg)和肝素(8,000U IV)。在熒光鏡的引導下，使一根8F AL-0.75引導導管前進到頸動脈口。在冠狀動脈內給予硝酸甘油(200mcg)后，對三個冠狀動脈都進行定量的冠狀動脈血管造影術以對血管的大小進行評估。選擇兩個最大的血管來進行該操作。在用支架展開的PTCA前在該手術操作中通過INFILTRATOR壁內給予ETC-216或蔗糖-甘露醇介質。引入INFILTRATOR導管來以十分低的劑量向冠狀動脈血管壁傳遞ETC-216或蔗糖-甘露醇介質以將進入到循環(huán)中的藥劑的損失降到最低。用4-6mg ETC216或蔗糖-甘露醇介質各自以0.3-0.4ml的給藥體積對各動物的兩個動脈進行滲透。因此，各動物在位于兩個動脈區(qū)段處一共接受總劑量為約8-12mg的ETC-216。在伴有支架展開的囊過度膨脹前在傳遞ETC-216或蔗糖-甘露醇介質過程中通過將所連接的囊膨脹一次至1.5-2個大氣壓的壓力來使各動脈進行滲透操作。在滲透操作后，用斜的或間隔的支作為解剖學參考，將支架在LAD、RCA、和LCX進行了滲透的部分中精確展開。所有的支架都是用一種囊來展開的，所說的囊在30秒內膨脹1至3次至6-8個大氣壓以達到最終支架動脈的比例約為1.3∶1。開始進行血管造影術以對準支架位置并進行重復以確認在支架擴展部位跡象為損傷部位明顯“遞升”或“遞降”的損傷。將該導管撤回，將進行了結扎的頸動脈和皮膚切口閉合。為了預防感染，在該操作結束時給所有的動物都使用抗生素。動物從麻醉中恢復過來，回到動物飼養(yǎng)室中，喂食添加有如上所述的藥物的常規(guī)飼料。
血管造影術和IVUS測量用定量的冠狀動脈血管造影術(QCA)來在各時間點對平均和最小的腔直徑進行評估，即，在損傷前、緊接損傷后和安樂死前在28天隨訪時進行評估。根據(jù)囊損傷后立即測量的MLD和在28天隨訪時測量的MLD之間的差異來計算晚期腔損失，并且通過用晚期腔損失除以損傷后的MLD來計算改型指數(shù)。
在定量期間所用術語的定義冠狀血管造影術R1＝近端區(qū)段的參考區(qū)段(未展擴的)P＝被展擴動脈的近端區(qū)段
M＝被展擴動脈的中間區(qū)段D＝被展擴動脈的遠端區(qū)段R2＝遠端區(qū)段的參考區(qū)段(未展擴的)Max＝在整個展擴區(qū)段中最大的腔直徑Min＝在整個展擴區(qū)段中最小的腔直徑腔增量＝損傷后的腔直徑減去損傷前的腔直徑腔損失＝損傷后的腔直徑減去28天隨訪時的腔直徑用未被損傷部分作為參考對損傷部分的狹窄百分比進行估計。測量支架區(qū)域、腔區(qū)域、新內膜區(qū)域、狹窄區(qū)域(都是用IVUS進行的)。
在隨訪時冠狀動脈的分析在28天后，為進行隨后的血管造影術，將動物禁食一整夜并如上進行手術前處理。此外，在隨后，對于各被展擴動脈的IVUS研究而言，將IVUS導管在被展擴冠狀動脈中展開。然后在用IV戊巴比妥90mg/kg進行麻醉的情況下將動物安樂死，在血管切開術后切除心臟。用鹽水對冠狀動脈進行灌注以清除血液，然后用2％低聚甲醛固定灌注15分鐘，然后用4％在磷酸緩沖液(pH7.4)中的低聚甲醛浸漬4小時，最后將其存儲于70％的乙醇中。為了保持外膜和血管周組織的完整性，小心地將冠狀動脈同毗連的組織(脂肪組織和心肌)一起摘除下來。對于被展擴區(qū)段而言，進行特定的組織學處理以用金屬支柱在原位維持血管的體系結構。將組織塊埋入到甲基丙烯酸甲酯中并用金剛石刃的刀對其進行切割。切下三個包含12個支柱的放射狀的橫截面一個得自各支架的近端三分之一處、一個得自各支架的中間三分之一處和一個得自各支架的遠端三分之一處。將這些部分研磨至約50μm的厚度，進行光學拋光，并用甲苯胺藍(paragon染色劑)進行染色。
組織形態(tài)學分析使用用電腦進行處理的成像系統(tǒng)(Image Pro Plus 4.0)來進行下面的組織形態(tài)學測量1.平均的橫截面面積和腔厚度(被內膜/新內膜-腔邊緣所圍繞著的區(qū)域)；新內膜(腔和內部彈性層之間的區(qū)域，IEL，并且當IEL消失時，為腔和中膜或外部彈性層的殘余物之間的區(qū)域，EEL)；中膜(IEL和EEL之間的區(qū)域)；血管大小(被EEL所圍繞的區(qū)域但是不包括外膜區(qū)域)；和外膜(外膜周組織、脂肪組織和心肌、以及EEL間的區(qū)域)。
2.損傷得分。為了對血管損傷程度進行定量，進行以不同壁結構破裂的數(shù)量和長度為基礎的評分。損傷程度的計算如下0＝完整的IEL1＝暴露于淺中間層的破裂的IEL2＝暴露于較深的中間層(中間解剖層)的破裂的IEL3＝暴露于外膜的破裂的EEL結果將分別來自十四頭家豬的兩個冠狀動脈用蔗糖-甘露醇介質(對照)或4-6mg ETC-216(每組n＝7)進行處理。進行左前下行(LAD)、左旋血管(LCX)和右側冠狀動脈(RCA)的定量的冠狀動脈血管造影術(QCA)以對各血管的大小進行評估；對于該操作而言選擇兩根最大的動脈。在各動脈中，通過INFILTRATOR來將藥物進行壁內傳遞，然后在藥物傳遞部位用支架進行過度牽張的經(jīng)皮經(jīng)腔的冠狀血管成形術(PTCA)。這種手術操作誘導了一種其中形成炎癥、新內膜增生和再狹窄的血管損傷。在擴展之前、擴展后立即、以及在第28天時就在處死前將得自所有動脈的用支架進行了處理的動脈進行QCA。此外，用IVUS來測定支架和腔面積以對就在處死前的新內膜面積進行估計。在處死后，得到用于組織形態(tài)學測量的被展擴動脈區(qū)段，對過度牽張損傷的程度、新內膜增生的數(shù)量、以及再狹窄進行評估。僅用組織學方法對得自在其預定的QCA和IVUS操作前9天死亡的一只用介質進行處理的豬的冠狀動脈血管進行分析。在預定的28天操作后6天，由于錯誤的處理安排而將一只用ETC-216-處理的豬安樂死。為了進行公平的比較，將得自這兩只豬的數(shù)據(jù)排除在分析之外。
此外，將兩只動物用使用INFILTRATOR傳遞的約3倍濃度的ETC-216制劑進行處理。發(fā)現(xiàn)該制劑太粘，不能有效地通過該裝置來傳遞藥物并發(fā)現(xiàn)其對該裝置的囊造成損害，從而增加了動脈損傷的量，這限制了該裝置對粘性溶液的應用。
在研究過程中，血液得自所有的動物，用其來對白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、血細胞比容％、血小板計數(shù)進行測量。在對這些血變量進行測量的所有情況中，與基準值相比，治療后的值并沒有發(fā)生可觀的改變。即，其都在正常的范圍內。測量所有進入研究時的動物的的心率和血壓作為基準。在手術操作過程中和處死前也對大多數(shù)動物的心率和血壓進行了測量。對于進入研究的動物而言，這些變量與基準值相比沒有由于進行手術操作或治療而發(fā)生可觀的改變。
在三個時間點進行定量的冠狀動脈血管造影術(QCA)的測量冠狀動脈損傷前、緊接冠狀動脈損傷和支架展開后、和處死前。在接近支架的未展擴區(qū)段(R1)、支架的近端部分(Prox)、支架整個長度的平均區(qū)域(Aver)、支架的遠端部分(Dist)和遠離支架的未展擴區(qū)段(R2)進行直徑測量(mm)。用血管內超聲(IVUS)來測量處死前各擴展的冠狀動脈血管遠端、中間和近端區(qū)域處的支架和腔面積。這些測量之間的差異是新內膜面積。
用被擴展動脈的組織形態(tài)學分析來測量外膜邊界層(ABL)、外部彈性層(EEL)、內部彈性層(IEL)、腔(L)、外膜(A)、中膜(M)、內膜(I)的平均橫截面區(qū)域、內膜與中膜比(I/M)和損傷得分。損傷得分是在被擴張血管膨脹部分的近端(a)、中間(b)和遠端(c)區(qū)段各測量12次而獲得的36次損傷測定的均值。將損傷記為0、1、2或3分，0表示完整的IEL(即沒有損傷)，3表示暴露于外膜的破裂的EEL(即最嚴重的損傷)。
壁內INFILTRATOR傳遞的ETC-216治療顯著降低了冠狀血管內膜與中膜的比值，將其降低了35％(LAD、LCX、和RCA聯(lián)合)。這種作用主要是由于RCA(-42％，p＝0.002)、LCX(-38％)、和LAD(-29％)的I/M比例的顯著降低。圖5a和5b分別圖示了所有血管(即RCA、LCX和LAD聯(lián)合)和各種類型的血管(即RCA或LAD)的組織形態(tài)學數(shù)據(jù)。
權利要求
1.一種在對病態(tài)冠狀動脈、外周動脈和腦動脈進行旁路手術、植入移植物或移植器官的手術、或血管成形術之前或期間用于治療或預防的方法，其包括在損傷部位給血管局部使用有效量的脂質調節(jié)藥以防止或減少狹窄或再狹窄或對斑塊進行穩(wěn)定。
2.如權利要求1所述的方法，其中所說的抗增生藥是α螺旋狀載脂蛋白或HDL關聯(lián)蛋白。
3.如權利要求2所述的方法，其中所說的載脂蛋白或HDL關聯(lián)蛋白選自載脂蛋白A-I、載脂蛋白A-I Milano、載脂蛋白A-I Paris、載脂蛋白E、載脂蛋白原A-I、載脂蛋白A-II、載脂蛋白原A-II、載脂蛋白A-IV、被改性從而包括一個或多個巰基的載脂蛋白、載脂蛋白C-I、載脂蛋白C-II、和載脂蛋白C-III、這些載脂蛋白中的α-螺旋狀序列、對氧磷酶、膽固醇酯轉移蛋白、LCAT和磷脂轉移蛋白。
4.如權利要求1所述的方法，其中所說的載脂蛋白是載脂蛋白A-I Milano。
5.如權利要求2所述的方法，其包括將載脂蛋白或HDL關聯(lián)蛋白與脂質聯(lián)合進行給藥。
6.如權利要求5所述的方法，其中所說的載脂蛋白是與脂質和HDL關聯(lián)蛋白聯(lián)合進行給藥的。
7.如權利要求5所述的方法，其中載脂蛋白與脂質的重量比為約1∶0.5至1∶3。
8.如權利要求1所述的方法，其中所說的脂質調節(jié)劑是通過壁內的滲入裝置來進行給藥的。
9.如權利要求2所述的方法，其中所說的載脂蛋白或HDL關聯(lián)蛋白是用導管來進行給藥的。
10.如權利要求1所述的方法，其中所說的載脂蛋白是在凝膠中被進行給藥的。
11.如權利要求4所述的方法，其中所說的載脂蛋白是與磷脂以約1∶0.5至1∶3的重量比聯(lián)合給藥的載脂蛋白A-I Milano，劑量為0.05至0.3mg載脂蛋白A-I Milano/kg或4至6mg載脂蛋白A-IMilano/被治療的血管區(qū)段。
12.如權利要求2所述的方法，其中所說的載脂蛋白或HDL關聯(lián)蛋白是以0.01mg載脂蛋白/kg至受粘度或裝置體積/冠狀血管區(qū)段限制的劑量之間的劑量來進行給藥的。
13.如權利要求1所述的方法，其中所說的載脂蛋白是以0.3mg載脂蛋白/kg至受粘度或裝置體積/冠狀血管部分限制的劑量之間的劑量來進行給藥的。
14.如權利要求1所述的方法，其中核酸分子是通過壁內滲入來進行給藥的。
15.如權利要求14所述的方法，其中所說的核酸分子編碼α螺旋狀載脂蛋白或HDL關聯(lián)蛋白。
16.如權利要求14所述的方法，其中所說的核酸分子是寡核苷酸。
17.如權利要求1所述的方法，其中所說的脂質調節(jié)藥是以單一的有效劑量來進行給藥的。
18.如權利要求1所述的方法，其中所說的脂質調節(jié)藥是以多劑量來進行給藥的。
19.如權利要求1所述的方法，其還進一步包括全身給藥選自抗增生化合物、抗炎化合物、抗高血壓化合物、抗凝劑、和脂質調節(jié)劑的藥物。
20.如權利要求19所述的方法，其中所說的全身治療是在所述局部治療之前開始的。
21.如權利要求19所述的方法，其中所說的脂質調節(jié)劑選自煙酸、他汀類物質、和貝特類物質。
22.如權利要求19所述的方法，其中所說的抗增生劑選自紫杉醇、雷帕霉素、AP-17替羅非班、和阿昔單抗。
23.如權利要求19所述的方法，其中所說的用于預防或延遲凝血或血小板聚集的物質選自阿司匹林、IIb/IIIa抑制劑、氯吡格雷、肝素和肝素片斷。
24.如權利要求1所述的方法，其中所說的局部傳遞是通過從導管釋放到心包空間中來進行的。
25.如權利要求2所述的方法，其中所說的釋放是通過使用進行了涂布的支架來獲得的。
26.如權利要求1所述的方法，用于預防或治療再狹窄。
27.如權利要求1所述的方法，用于穩(wěn)定斑塊。
28.如權利要求27所述的用于降低斑塊破裂后果的方法，所說的斑塊破裂后果包括血栓形成和局部缺血。
29.一種在對病態(tài)冠狀動脈、外周動脈和腦動脈進行旁路手術、植入移植物或移植器官的手術、血管成形術或斑塊穩(wěn)定之前或期間用于預防或治療的試劑盒，其包括用于長時間局部釋放有效量脂質調節(jié)藥以防止或減少狹窄或再狹窄或穩(wěn)定斑塊的手段。
30.如權利要求29所述的試劑盒，其包含一種壁內滲入裝置。
31.如權利要求29所述的試劑盒，其包括與用于載脂蛋白和/或脂質的儲庫聯(lián)用的導管。
32.如權利要求29所述的試劑盒，其包含用于將核酸分子進行給藥的手段。
33.如權利要求29所述的試劑盒，其中所說的膽固醇降低藥選自載脂蛋白A-I、載脂蛋白A-I Milano、載脂蛋白A-I Paris、載脂蛋白E、載脂蛋白原A-I、載脂蛋白A-II、載脂蛋白原A-II、載脂蛋白A-IV、被改性從而包括一個或多個巰基的載脂蛋白、載脂蛋白C-I、載脂蛋白C-II、和載脂蛋白C-III、這些載脂蛋白中的α-螺旋狀序列、對氧磷酶、膽固醇酯轉移蛋白、LCAT和磷脂轉移蛋白。
34.一種用將在被治療部位釋放的物質進行了涂布的支架，所說的將在被治療部位釋放的物質選自單獨的或與磷脂一起被配制的α螺旋狀載脂蛋白或HDL關聯(lián)蛋白、表達編碼α螺旋狀載脂蛋白或HDL關聯(lián)蛋白的基因的細胞、和編碼用于局部傳遞到損傷部位的α螺旋狀載脂蛋白或HDL關聯(lián)蛋白的裸DNA。
全文摘要
可在對病態(tài)冠狀動脈、外周動脈和腦動脈進行旁路手術、植入移植物或移植器官的手術、血管成形術、或對不穩(wěn)定斑塊進行穩(wěn)定之前或期間將載脂蛋白A－I(ApoA－I)進行局部給藥，所說的載脂蛋白A－I優(yōu)選地是變體形式如載脂蛋白A－I Milano(ApoA－IM)，載脂蛋白可以單獨給藥或更優(yōu)選地是與脂質載體如磷脂或其他藥物聯(lián)合進行給藥。在供選擇的實施方案中，并不直接提供載脂蛋白，而是提供編碼該載脂蛋白的基因。將基因以與引入蛋白所用方法相似的方法引入到血管內，然后在血管內表達蛋白。該技術還可用于傳遞用于治療或預防再狹窄或其它心血管疾病的基因。在另一個實施方案中，將支架僅用載脂蛋白進行涂布、用與脂質一起進行配制的載脂蛋白進行涂布、用表達載脂蛋白的遺傳學工程細胞進行涂布、用編碼載脂蛋白的裸DNA或其他局部傳遞到損傷部位的藥物如抗增生劑進行涂布。在優(yōu)選的實施方案中，該系統(tǒng)與組合治療一起使用，以將載脂蛋白等藥劑的局部傳遞與全身抗血壓治療、抗炎治療、脂質調節(jié)和/或抗凝治療聯(lián)用。這些治療可以在局部傳遞之前、與局部傳遞一起或在局部傳遞之后進行。
文檔編號A61K38/17GK1596121SQ02823781
公開日2005年3月16日 申請日期2002年9月27日 優(yōu)先權日2001年9月28日
發(fā)明者C·L·比斯蓋爾 申請人:埃斯佩里安醫(yī)療公司, 塞達斯-西奈醫(yī)療中心