專利名稱：疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及痘病毒。具體而言，本發(fā)明涉及一種具有一個(gè)或多個(gè)野生型FPV基因修飾的禽痘病毒基因組，含有這種基因組的病毒顆粒，及其把目標(biāo)核苷酸(“NOI”)送遞給靶細(xì)胞的用途。
本發(fā)明還涉及使用病毒載體的接種方法，具體而言，是用兩種不同的非復(fù)制型病毒載體組合物的異源激發(fā)-加強(qiáng)接種方案。
背景痘病毒痘病毒先前已經(jīng)被用作異源表達(dá)外源蛋白的重組載體。特別是，已經(jīng)研究過將重組痘苗病毒作為瞬時(shí)表達(dá)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因的工具和實(shí)驗(yàn)重組疫苗的載體(Moss，1991，Proc Natl Acad Sci USA 93，11341-8；和Moss，1996，Proc Natl Acad Sci USA 93，11341-8)。
痘苗病毒與其它痘病毒一樣留存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，它在那里表達(dá)病毒復(fù)制所需的蛋白。因此，重組痘苗病毒可把外源抗原送遞給哺乳動(dòng)物細(xì)胞的胞質(zhì)，由此使它們直接進(jìn)入抗原加工途徑，導(dǎo)致與I類和II類MHC分子有關(guān)的抗原衍生肽在細(xì)胞表面上呈遞(Moss，1991，Proc NatlAcad Sci USA 93，11341-8)。這種性質(zhì)可使痘苗病毒用作重組疫苗，特別用于刺激CD8+和CD4+T-細(xì)胞免疫應(yīng)答。
痘苗病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制的能力限制了它的臨床使用，從而使人們?nèi)ふ腋踩奶娲?。這些包括減毒的痘苗病毒，如修飾過的痘苗Ankara(MVA)(Meyer等，1991，J Gen Virol 72，1031-8；Sutter和Moss，1992，Proc Natl Acad Sci USA 89，10847-51；Sutter等，1994，Vaccine l2，1032-40)，其在人的細(xì)胞中進(jìn)行有限的復(fù)制(Blanchard等，1998，J Gen Virol 79，1159-67)，和禽痘病毒屬，如禽痘，其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不能增殖(Somogyi等，1993，Virology 197，439-44)。
野生型禽痘病毒，其可在鳥類中引起增生性、但很少致死的皮膚病變，是家禽工業(yè)中的商業(yè)問題?？骨荻徊《镜臏p毒活疫苗已經(jīng)通過使病毒在鳥類細(xì)胞中多次傳代而生產(chǎn)出來。表達(dá)家禽病原體抗原的這種減毒禽痘病毒已經(jīng)被廣泛用作鳥類使用的重組疫苗(綜述于Boyle和Heine，1993，Immunol Cell Biol 71，391-7；Paoletti，1996，Proc Natl Acad Sci USA 93，11349-53)。事實(shí)上，表達(dá)新城疫病毒抗原的兩種重組禽痘病毒是商業(yè)可以得到的，在美國(guó)作獸醫(yī)用(Paoletti，1996，Proc Natl Acad Sci USA 93，11349-53)。
禽痘病毒屬可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)抗原并誘導(dǎo)對(duì)哺乳動(dòng)物病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答的觀察結(jié)果(Taylor和Paoletti，1998，Vaccine6，466-8；Taylor等，1998a，Vaccine 6，504-8；Taylor等，1988b，Vaccine 6，497-503)使得研制出了作為疫苗用于哺乳動(dòng)物中的重組禽痘病毒。最重要的是，表達(dá)HIV抗原的重組禽痘有可能在除人以外的靈長(zhǎng)目動(dòng)物中作為疫苗使用(Dale等，2000，J Med Primatol 29，240-7；Kent等，1988，J Virol 72，10180-8；Kent等，2000，Vaccine18，2250-6)。此外，編碼腫瘤-相關(guān)抗原的重組禽痘疫苗已經(jīng)在動(dòng)物中進(jìn)行評(píng)估(Grosenbach等，2001，Cancer Res 61，4497-505；Irvine等，1997，J Natl Cancer Inst 89，1595-601；Wang等，1995，J Immunol154，4685-92)，且目前正在進(jìn)行人類的臨床試驗(yàn)。
絕大多數(shù)減毒禽痘疫苗株都不能在它們的基因組組構(gòu)和準(zhǔn)確序列方面被完全定義。事實(shí)上，近來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有些基因組會(huì)攜帶鳥類網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒(REV)的原病毒感染性拷貝(Hertig等，1997，Virology 235，367-76)，這一點(diǎn)限制了它們作為重組載體的用途。
對(duì)痘病毒載體的基因組大小有一個(gè)上限。對(duì)于痘苗而言，可被有效包裝并送遞的異源序列最大為基因組大小的10％。
因此需要一種改進(jìn)的載體系統(tǒng)，其缺少在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制的能力，但可更好地激發(fā)T-細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有比已知的減毒禽痘疫苗株更高的適應(yīng)和送遞異源DNA的能力和/或更高的安全性。
接種法本領(lǐng)域已知的很多方法都可刺激被試者的免疫應(yīng)答，從而預(yù)防和/或治療疾病。用作疫苗的抗原制劑的例子在下表(表1)中給出。
表1
還有很多其它類型的非抗原免疫法，包括被動(dòng)免疫法(抗體的直接給藥)和非特異性免疫法(如，給予細(xì)胞因子或細(xì)胞因子抑制劑)。
這些方法的問題在于免疫應(yīng)答隨時(shí)間而減弱，導(dǎo)致它不再有效，例如，在控制或消除感染方面。
疫苗誘導(dǎo)對(duì)于疾病的正確種類的免疫應(yīng)答是很重要的。很多已知的疫苗都可用于產(chǎn)生抗體，但不能誘導(dǎo)顯著的細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。很多疾病都很容易通過T細(xì)胞免疫應(yīng)答來預(yù)防和/或治療。例如，溶細(xì)胞性CD8+T細(xì)胞可防止或幫助清除病毒感染。且，在肺結(jié)核，瘧疾和幽門螺桿菌感染的情況下，有證據(jù)顯示分泌IFNγ的CD4+T細(xì)胞具有保護(hù)作用。
某些已知的病毒接種法伴有很多并發(fā)癥和副作用。例如，天花接種可引起普遍的牛痘，牛痘性濕疹，進(jìn)展性牛痘和神經(jīng)及心臟并發(fā)癥(Feery(1977)Med J.Aust 6 180-183；Goldstein等(1975)Pediatrics 55 342-7)。
因此需要改進(jìn)的接種法，特別是能夠刺激或加強(qiáng)免疫系統(tǒng)T細(xì)胞途徑，并引起最小副反應(yīng)的那些。
發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)獲得了減毒禽痘病毒株(FP9)的全基因組序列。
FP9缺少存在于野生型禽痘病毒(FPV)中的多數(shù)基因，或在它們中具有修飾。FP9的基因組為266kbp，比FPV-M的基因組要小，禽痘疫苗株先前已經(jīng)被描述為載體系統(tǒng)(Coupar等(1990)Virology 179159-167)。本發(fā)明人已經(jīng)表明，F(xiàn)P9激發(fā)CD8+T-細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力要優(yōu)于FPV-M。
因此，本發(fā)明提供一種減毒禽痘病毒基因組，它具有一個(gè)或多個(gè)下列野生型FPV基因的修飾形式(根據(jù)Afonso等(2000)J.Virol 743815-3831的基因命名法)FPV001，F(xiàn)PV018，F(xiàn)PV054，F(xiàn)PV063，F(xiàn)PV066，F(xiàn)PV070，F(xiàn)PV071，F(xiàn)PV093，F(xiàn)PV097/098，F(xiàn)PV115，F(xiàn)PV124，F(xiàn)PV125，PPV127，F(xiàn)PV158，F(xiàn)PV159，F(xiàn)PV160，F(xiàn)PV190，F(xiàn)PV191，F(xiàn)PV207，F(xiàn)PV219，F(xiàn)PV220，F(xiàn)PV221，F(xiàn)PV222，F(xiàn)PV239，PPV241，F(xiàn)PV242，F(xiàn)PV243，F(xiàn)PV244，F(xiàn)PV245，F(xiàn)PV246，F(xiàn)PV247，F(xiàn)PV260。
本發(fā)明還提供一種使禽痘減毒的方法，包括修飾一個(gè)或多個(gè)所述基因。優(yōu)選所述基因是按照下面的詳細(xì)描述修飾的。
本發(fā)明還提供一種小于275kbp的減毒禽痘病毒基因組。對(duì)基因組總大小的上限是可被病毒有效包裝。如果基因組本身較小，它可攜帶更大量的異源序列。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，減毒禽痘病毒基因組含有SEQ ID NO1所示的序列。
本發(fā)明的減毒禽痘基因組還可含有目標(biāo)“NOI”的核苷酸。所述“NOI”可以是一種治療性基因。
本發(fā)明還提供一種含這種基因組的病毒顆粒。在基因組含有NOI時(shí)，優(yōu)選所述病毒顆粒能夠把NOI送遞給靶細(xì)胞。可選擇性地(或此外)，所述病毒顆粒能夠把預(yù)表達(dá)的蛋白送遞給靶細(xì)胞。
本發(fā)明還提供一種含這種基因組或病毒顆粒的疫苗，激發(fā)劑或加強(qiáng)劑。
本發(fā)明還提供一種含非復(fù)制型病毒載體的加強(qiáng)組合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物能夠加強(qiáng)靈長(zhǎng)目動(dòng)物中由牛結(jié)核分枝桿菌BCG激發(fā)的免疫應(yīng)答。
對(duì)于接種(和治療)目的而言，多次給藥的過程較之疫苗的單次給藥在產(chǎn)生免疫應(yīng)答方面常常更有效。激發(fā)-加強(qiáng)方案可以是同源(兩次或多次給予相同組合物)或異源的。
本發(fā)明還提供一種接種試劑盒，其包括(i)含F(xiàn)P9禽痘病毒顆粒的第一組合物；和(ii)用于同時(shí)，分開或序貫給藥的第二組合物。
先前已經(jīng)認(rèn)可了病毒載體在使用DNA-疫苗作為激發(fā)劑或加強(qiáng)劑的異源接種法中的用途(Schneider等(1998)Nature Medicine 4(4)397-402；Kent等(1998)J.Gen.Virol 72(12)10180-8；Robinson等(1999)Nature Medicine 5(5)526-534)。
然而，本發(fā)明人首次表明了使用兩種不同非復(fù)制型病毒載體的異源激發(fā)-加強(qiáng)方案在誘導(dǎo)靈長(zhǎng)目動(dòng)物T細(xì)胞免疫應(yīng)答方面意外有效。非復(fù)制型載體的使用可避免與復(fù)制病毒有關(guān)的副反應(yīng)(如天花，見上文)。
因此，本發(fā)明提供一種接種試劑盒，包括用于以任一順序進(jìn)行序貫給藥的(i)含第一非復(fù)制型病毒載體的第一組合物；(ii)含第二非復(fù)制型病毒載體的第二組合物。
優(yōu)選實(shí)施方案中，所述接種試劑盒包括以任一順序進(jìn)行序貫給藥的(i)含第一非復(fù)制型痘病毒載體的第一組合物；(ii)含第二非復(fù)制型痘病毒載體的第二組合物。
所述試劑盒適合給予靈長(zhǎng)目動(dòng)物被試者，用于治療和/或預(yù)防疾病。
在本發(fā)明的試劑盒中，優(yōu)選第一和第二組合物能夠表達(dá)相同抗原。
本發(fā)明還提供一種接種方法，包括給予被試者這種疫苗，激發(fā)或加強(qiáng)組合物或試劑盒的步驟。這種給藥應(yīng)激發(fā)被試者的T-細(xì)胞免疫應(yīng)答。
所述接種方法可用于治療或預(yù)防，例如，通過或由于慢性感染，如HIV，瘧疾，肺結(jié)核及東海岸熱引起的疾病。
當(dāng)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)基因組，病毒顆粒，疫苗，激發(fā)劑/組合物，加強(qiáng)劑/組合物，構(gòu)建體或試劑盒含有或至少部分來源于HIV時(shí)，那么所述基因組，病毒顆粒，疫苗，激發(fā)劑/組合物，加強(qiáng)劑/組合物，構(gòu)建體或試劑盒不是WO02/068654(相應(yīng)于PCT/CU02/00001)中公開的那些。具體而言，本發(fā)明不包括WO02/068654中，如WO02/068654的實(shí)施例1中描述的重組CR3基因。
附圖簡(jiǎn)述

圖1帶注釋的FP9的基因組。
圖2表示在CEF組織培養(yǎng)中，從HP1傳代的過程中，F(xiàn)P9的修飾基因。
圖3由重組FP9和FPV-M激發(fā)的T-細(xì)胞免疫應(yīng)答的比較。
圖4由重組FP9，MVA和編碼PbSCP的DNA疫苗激發(fā)的CD8+T-細(xì)胞免疫應(yīng)答的比較。
圖5禽痘FP9在異源激發(fā)-加強(qiáng)免疫法中可作為激發(fā)劑和加強(qiáng)劑。
圖6禽痘FP9可在Balb/c小鼠中激發(fā)對(duì)結(jié)核分枝桿菌Ag85A的CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
圖7禽痘FP9可在除人以外的靈長(zhǎng)目動(dòng)物中激發(fā)對(duì)結(jié)核分枝桿菌Ag85A的T-細(xì)胞免疫應(yīng)答。
圖8對(duì)FP9和MVA病毒抗原的離體IFNγ ELISPOT應(yīng)答。
圖9用牛結(jié)核分枝桿菌BCG進(jìn)行氣霧或粘膜激發(fā)，并用MVA85A加強(qiáng)后，Balb/c小鼠中的離體IFNγ Elispot應(yīng)答。
圖10用牛結(jié)核分枝桿菌BCG進(jìn)行氣霧或粘膜激發(fā)，并用MVA85A和FPAg85A加強(qiáng)后，恒河獼猴中的離體IFNγ Elispot應(yīng)答。
圖11表示柱形圖。
圖12表示柱形圖。
圖13表示兩幅柱形圖。
圖14表示曲線圖。
圖15表示柱形圖。
圖16表示用pSG2.ME1和FP9.ME1進(jìn)行激發(fā)/加強(qiáng)免疫后，BALB/c小鼠中的特異性免疫應(yīng)答。BALB/c小鼠是用pSG2.ME1(DNA)肌內(nèi)免疫或用FP9.ME1(FP9)靜脈內(nèi)免疫，并以相似方式在15天后加強(qiáng)的。對(duì)照動(dòng)物是用編碼無關(guān)抗原的相同載體免疫的。加強(qiáng)免疫后13天，對(duì)腫瘤表位激發(fā)的T細(xì)胞應(yīng)答是利用IFNγ ELISPOT測(cè)定法，在脾細(xì)胞中測(cè)定的。柱形表示每組4只小鼠的抗原-特異性IFNγ sfc/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞±1SD。圖A描述每組總的表位-特異性應(yīng)答和植物凝集素(PHA)激發(fā)的應(yīng)答，而B描述對(duì)各個(gè)表位的應(yīng)答。
圖17表示用pSG2.ME1和FP9.ME1進(jìn)行激發(fā)/加強(qiáng)免疫后，C57BL/6小鼠中的特異性免疫應(yīng)答。C57BL/6小鼠是用pSG2.ME1(DNA)肌內(nèi)免疫或用FP9.ME1(FP9)靜脈內(nèi)免疫，并以相似方式在14天后加強(qiáng)的。對(duì)照動(dòng)物是用編碼無關(guān)抗原的相同載體免疫的。加強(qiáng)免疫14天后，腫瘤表位激發(fā)的T細(xì)胞應(yīng)答是利用IFNγ ELISPOT測(cè)定法，在脾細(xì)胞中測(cè)定的。柱形表示每組4只小鼠的抗原-特異性IFNγ sfc/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞±1SD。圖A描述每組總的表位-特異性應(yīng)答和作為陽(yáng)性對(duì)照的，植物凝集素(PHA)激發(fā)的應(yīng)答，而B描述對(duì)各個(gè)表位的應(yīng)答。B的圖例表示由CD8+T細(xì)胞識(shí)別的免疫顯性(DOM)和亞顯性(SUB)表位，以及由CD4+T細(xì)胞(CD4)識(shí)別的那些。
圖18表示對(duì)獼猴進(jìn)行氣管內(nèi)結(jié)核分枝桿菌侵襲后的不同周，對(duì)PPD的平均干擾素γ應(yīng)答。
發(fā)明詳述病毒和病毒載體本發(fā)明涉及使用非復(fù)制型病毒載體的接種方案。
本領(lǐng)域已知的很多病毒載體都能夠經(jīng)由靶細(xì)胞感染而送遞NOI。適宜的重組病毒載體包括但不限制于腺病毒載體，腺伴隨病毒(AAV)載體，皰疹病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體，桿狀病毒載體，痘病毒載體或細(xì)小病毒載體(見Kestler等1999 Human Gene Ther10(10)1619-32)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒的例子包括但不限制于鼠白血病病毒(MLV)，人免疫缺陷病毒(HIV)，馬感染性貧血病毒(EIAV)，小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)，勞斯肉瘤病毒(RSV)，F(xiàn)ujinami肉瘤病毒(FuSV)，莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)，F(xiàn)BR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)，莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)，Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)，鳥類成髓細(xì)胞瘤病毒-29(MC29)，和鳥類成紅細(xì)胞增多癥病毒(AEV)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒的詳細(xì)描述可見Coffin等(“Retroviruses”1997Cold Spring Harbour Laboratory Press EdsJM Coffin，SMHughes，HE Varmus 758-763頁(yè))。
痘病毒在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種疫苗，激發(fā)或加強(qiáng)組合物，其含有非復(fù)制型痘病毒載體。
痘病毒科可分為兩個(gè)亞科，脊椎動(dòng)作痘病毒亞科和昆蟲痘病毒亞科。脊椎動(dòng)物痘病毒亞科(脊椎動(dòng)物的痘病毒)，包括正痘病毒屬，副痘病毒屬，禽痘病毒屬，山羊痘病毒屬，野兔痘病毒屬，豬痘病毒屬，軟疣痘病毒屬和亞巴痘病毒屬。痘病毒，它們的結(jié)構(gòu)和組構(gòu)，生物性和抗原性的描述見Murphy等(1995)Virus Taxonomy SpringerVerlag，Vienna 79-87頁(yè)。下表(表2)給出痘病毒科每個(gè)屬內(nèi)各個(gè)種的一些例子。
表2
本發(fā)明提供一種接種試劑盒，其包括以任一順序進(jìn)行序貫給藥的(i)含第一非復(fù)制型病毒載體的第一組合物；(ii)含第二非復(fù)制型病毒載體的第二組合物。
所述第一和/或第二病毒載體可以是痘病毒載體。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種接種試劑盒，其包括以任一順序進(jìn)行序貫給藥的(i)含第一非復(fù)制型痘病毒載體的第一組合物；(ii)含第二非復(fù)制型痘病毒載體的第二組合物。
其中一個(gè)組合物作為首先給藥的“激發(fā)組合物”，另一組合物作為在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔(如3周)后給藥的“加強(qiáng)組合物”。
所述第一和第二非復(fù)制型病毒載體應(yīng)充分不同，如此才不會(huì)發(fā)生明顯的交叉反應(yīng)。
這兩個(gè)病毒載體可來源于不同科的病毒，例如，一個(gè)痘病毒載體和一個(gè)腺病毒載體?？蛇x擇性地，這兩個(gè)病毒載體可來源于相同科(如痘病毒)但不同屬的病毒。例如，第一非復(fù)制型載體可以是禽痘病毒屬載體，而第二非復(fù)制型痘病毒載體可以是正痘病毒屬載體。
這兩個(gè)非復(fù)制型病毒載體甚至可來源于相同屬的不同種，只要這些種充分不同。
每個(gè)痘病毒屬的區(qū)別特征在本領(lǐng)域中是已知的，例如，見Murphy等(1995-如上)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，兩個(gè)非復(fù)制型痘病毒載體中的一個(gè)是禽痘病毒載體(即，來源于禽痘)。例如，所述禽痘病毒載體可含有本發(fā)明的基因組。
非復(fù)制型本發(fā)明中所用的病毒載體在被試者的細(xì)胞(例如，人類的細(xì)胞)中應(yīng)當(dāng)是非復(fù)制型的。這里所用的術(shù)語(yǔ)“非復(fù)制型”或“復(fù)制-受損型”是指在絕大多數(shù)正常被試者細(xì)胞中，不能復(fù)制到任何顯著的程度。非復(fù)制型或復(fù)制受損型病毒可以是天然的(即，它們本身是從大自然中分離出來的)，或通過體外繁殖或基因操作，例如對(duì)復(fù)制而言較為重要的基因的缺失，而是人工的。通常有一個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞類型適于病毒生長(zhǎng)，例如CEF細(xì)胞。
病毒復(fù)制通常以兩種方式測(cè)量1)DNA合成及2)病毒滴度。更準(zhǔn)確地說，這里所用的術(shù)語(yǔ)“非復(fù)制型或復(fù)制受損型”用于痘病毒時(shí)，是指滿足下列標(biāo)準(zhǔn)的任何一個(gè)或兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)都滿足的病毒1)與痘苗病毒的Copenhagen株相比，在MRC-5細(xì)胞(人類細(xì)胞系)中的DNA合成減少了1log(10倍)；2)與痘苗病毒的Copenhagen株相比，在HELA細(xì)胞(人類細(xì)胞系)中的病毒滴度減少了2log。
禽痘病毒如上所述，野生型禽痘病毒可引起鳥類的增生性皮膚病變?？蓮寞忦栉镔|(zhì)獲得FPV的野外分離物，所述瘡痂物質(zhì)是從家禽感染采集的(Boyle等(1997)Arch.Virol.142737-748)。致病性禽痘病毒的基因組序列是可以獲得的(Afonso等(2000)J.Gen.Virol.74(8)3815-3831)。
減毒活病毒株可通過使病毒在鳥類細(xì)胞中多次傳代而產(chǎn)生。禽痘病毒的各種減毒病毒株是已知的，如從Cyanamid-Websters PtY，LtdAustralia獲得的FPV M(弱疫苗株)和FPV S(標(biāo)準(zhǔn)疫苗株)。
痘病毒逃避宿主免疫應(yīng)答的策略包括產(chǎn)生可起腫瘤壞死因子，IL-Ip，干擾素(IFN)-oc和IFN-y的可溶性受體作用的分泌型蛋白，其通常具有與細(xì)胞因子受體(如趨化因子受體)胞外結(jié)構(gòu)域相似的序列。這些病毒受體通常抑制或破壞適宜的宿主免疫應(yīng)答，它們的存在與致病性增加有關(guān)。
FPV基因禽痘病毒的基因組是由具有共價(jià)連接的末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單一雙鏈DNA分子組成的。有關(guān)限制性內(nèi)切核酸酶裂解位點(diǎn)的基本信息是可以獲得的(Coupar等(1990)見上文)。
已經(jīng)對(duì)US dept Agric Standard Challenge(有毒力的)禽痘株的基因組進(jìn)行了測(cè)序，且這里沿用該株的命名(Afonso等(2000)J.Virol.74 3815-1831)。該綜述還列出了此禽痘株的260 ORF(表1)以及它們的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)和/或功能以及登記號(hào)。
本發(fā)明人還對(duì)所有位置上FP9的有毒力的前體(HP1)進(jìn)行了測(cè)序，在這些位置上，F(xiàn)P9的序列不同于該序列。該方法揭示了可歸因于譜系變化的差異，以及在組織培養(yǎng)傳代，適應(yīng)和伴隨減毒過程中的那些。在CEF組織培養(yǎng)中，從HP1傳代過程中的FP1修飾基因在圖2中表示。
本發(fā)明的禽痘病毒基因組可具有一個(gè)或多個(gè)下列野生型基因的修飾FPV001，F(xiàn)PV018，F(xiàn)PV054，F(xiàn)PV063，F(xiàn)PV066，F(xiàn)PV070，F(xiàn)PV071，F(xiàn)PV093，F(xiàn)PV097/098，F(xiàn)PV115，F(xiàn)PV124，F(xiàn)PV125，F(xiàn)PV127，F(xiàn)PV158，F(xiàn)PV159，F(xiàn)PV160，F(xiàn)PV190，F(xiàn)PV191，F(xiàn)PV207，F(xiàn)PV219，F(xiàn)PV220，F(xiàn)PV221，F(xiàn)PV222，F(xiàn)PV239，F(xiàn)PV241，F(xiàn)PV242，F(xiàn)PV243，F(xiàn)PV244，F(xiàn)PV245，F(xiàn)PV246，F(xiàn)PV247，F(xiàn)PV260。
術(shù)語(yǔ)“修飾”是指從野生型序列的變異(如缺失，取代或添加)。
當(dāng)基因編碼蛋白時(shí)，所述修飾基因序列可編碼具有不同氨基酸序列的蛋白。例如，與野生型序列相比，所述氨基酸序列可具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失，添加或取代。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明禽痘病毒基因組的修飾導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)下列基因的非保守氨基酸取代FPV018，F(xiàn)PV063，F(xiàn)PV066，F(xiàn)PV093，F(xiàn)PV127，F(xiàn)PV191，F(xiàn)PV207。
可選擇性地(或此外)，所述基因組還可在一個(gè)或多個(gè)野生型基因中具有顯著修飾。術(shù)語(yǔ)“顯著修飾”是指以這種方式修飾的基因不再發(fā)揮野生型基因的作用。例如，如果野生型基因編碼蛋白，那么顯著修飾的基因可能不能編碼蛋白，或它編碼不能起野生型蛋白作用或起野生型蛋白作用的能力大大降低的蛋白。
所述修飾可以是缺失。例如，整個(gè)基因缺失?？蛇x擇性地，所述修飾基因可包括足以消除或大大降低基因功能的一個(gè)或多個(gè)部分缺失。
可選擇性地，所述修飾可以是取代或添加。例如，可能發(fā)生重組事件，使來源于基因組中其它處序列的一部分摻入到基因中(任選地，具有野生型序列的相應(yīng)缺失)。
部分缺失，取代或添加可引起“移碼”突變，導(dǎo)致下游序列的錯(cuò)誤閱讀。可選擇性地(或此外)，所述突變可導(dǎo)致終止密碼子的產(chǎn)生(“終止突變”)，以致忽略了下游序列。
所述突變可除去終止密碼子，其導(dǎo)致兩個(gè)基因融合形成嵌合基因。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基因組具有一個(gè)或多個(gè)下列基因的部分缺失FPV158，F(xiàn)PV219，F(xiàn)PV222。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基因組完全缺少一個(gè)或多個(gè)下列基因FPV001，F(xiàn)PV124，F(xiàn)PV125，F(xiàn)PV159，F(xiàn)PV160，F(xiàn)PV220，F(xiàn)PV221，F(xiàn)PV241，F(xiàn)PV242，F(xiàn)PV243，F(xiàn)PV244，F(xiàn)PV245，F(xiàn)PV246，F(xiàn)PV247，F(xiàn)PV260。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基因組在一個(gè)或多個(gè)下列基因中具有移碼突變FPV054，F(xiàn)PV070，F(xiàn)PV071，F(xiàn)PV115，F(xiàn)PV190，F(xiàn)PV207。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基因組在一個(gè)或多個(gè)下列基因中具有終止突變FPV071，F(xiàn)PV239。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基因組具有通過基因FPV097和FPV098融合(通過缺失)而得到的嵌合基因。
基因組大小據(jù)估計(jì)，F(xiàn)PV-M的基因組位于308kb區(qū)(Coupar等(1990)見上文)。病毒基因組越小，可以包含越多的異源DNA。
本發(fā)明的禽痘病毒基因組大小優(yōu)選小于275kb。更優(yōu)選所述基因組約266kbp?；蚪M的大小被認(rèn)為沒有任何異源序列(例如，“目標(biāo)核苷酸”(NOI)，見下文)。為了使用禽痘病毒作為載體系統(tǒng)，可通過同源重組將送遞的異源序列摻入到禽痘基因組中。為了測(cè)定大小，在這種重組事件之前就要考慮基因組大小。
優(yōu)選權(quán)利要求1的禽痘病毒基因組含SEQ ID NO1所示的序列。該“序列”包括序列的同源物，只要禽痘基因組整體能夠起載體系統(tǒng)的作用(即，通過同源重組接受異源基因且，當(dāng)摻入到病毒顆粒中時(shí)，把異源基因送遞給靶細(xì)胞)。
同源物這里，術(shù)語(yǔ)“同源物”是指與SEQ ID NO1所示序列相比，具有一定程度同源性的核酸序列。這里，術(shù)語(yǔ)“同源性”等于“同一性”。
在本發(fā)明中，同源性序列包括與主體序列至少75，85或90％相同，優(yōu)選至少95或98％相同的核苷酸序列。通常，同源物包括編碼所編碼蛋白功能性部分(活性位點(diǎn)等)的序列，其與主體序列相同，但其它區(qū)域可能不同。雖然，同源性還可被認(rèn)為是相似性(即，具有相似化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)，但本發(fā)明優(yōu)選以序列同一性來表示同源性。
同源性比較可通過肉眼進(jìn)行，或更通常，在容易獲得的序列比較程序的幫助下進(jìn)行。這些市售的計(jì)算機(jī)程序可計(jì)算兩個(gè)或多個(gè)序列間的同源性百分比。
同源性百分比可對(duì)連續(xù)序列進(jìn)行，即，將一個(gè)序列與另一序列進(jìn)行比對(duì)，并將一個(gè)序列中的每個(gè)堿基與另一序列中的相應(yīng)堿基直接比較，每次比較一個(gè)堿基。這被稱作“無空位”序列比對(duì)。通常，這種無空位序列比對(duì)只對(duì)相對(duì)較少數(shù)量的堿基進(jìn)行。
雖然這是一種非常簡(jiǎn)單且一致的方法，但它不能考慮到，例如，在序列的原本相同的對(duì)中，一個(gè)插入或缺失可引起后面的核酸殘基不能進(jìn)行序列比對(duì)，從而當(dāng)進(jìn)行總體序列比對(duì)時(shí)，可能導(dǎo)致同源性百分比大大降低。所以，絕大多數(shù)序列比較法都被設(shè)計(jì)成產(chǎn)生最佳序列比對(duì)，其中考慮到了可能的插入和缺失，沒有過度地對(duì)總體同源性罰分。這是通過在序列比對(duì)中插入“空位”，從而努力使局部同源性達(dá)到最大而實(shí)現(xiàn)的。
然而，這些更復(fù)雜的方法將“空位罰分”賦予序列比對(duì)中出現(xiàn)的每個(gè)空位，這樣，對(duì)于同樣數(shù)目的相同堿基而言，具有盡可能少空位的序列比對(duì)-反映兩個(gè)比較序列之間更高的相關(guān)性-將獲得比具有很多空位的那些更高的值。通常使用“親族空位值”，它給空位的存在罰相對(duì)較高的分，給空位中的每個(gè)后續(xù)殘基賦予較小的罰分。這是最普遍使用的空位評(píng)分系統(tǒng)。高空位罰分當(dāng)然可產(chǎn)生具有較少空位的最佳序列比對(duì)。絕大多數(shù)序列比對(duì)程序都允許修飾空位罰分。然而，當(dāng)使用這種軟件進(jìn)行序列比較時(shí)，優(yōu)選使用缺省值。例如，當(dāng)使用GCGWisconsin Bestfit軟件包時(shí)，對(duì)于空位而言，核酸序列的缺省空位罰分是12，對(duì)于每個(gè)延伸而言是4。
因此，最大同源性百分比的計(jì)算要求產(chǎn)生最佳序列比對(duì)，考慮空位罰分。進(jìn)行這種序列比對(duì)的適宜計(jì)算機(jī)程序是GCG Wisconsin Bestfit軟件包(University of Wisconsin，U.S.A.；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12387)?？蛇M(jìn)行序列比較的其它軟件的例子包括，但不限制于，BLAST軟件包(見Ausubel等，1999 ibid-Chapter18)，F(xiàn)ASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和比較工具的GENEWORKS程序組。BLAST和FASTA是脫機(jī)使用，在線檢索的(見Ausubel等，1999 ibid，7-58 to 7-60頁(yè))。然而，對(duì)于某些應(yīng)用而言，優(yōu)選使用GCG Bestfit程序。一種被稱作BLAST 2 Sequences的新工具也可用于比較蛋白及核苷酸序列(見FEMS Microbiol Lett 1999174(2)247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
雖然，最終的同源性百分比可以同一性的形式測(cè)量，但通常序列對(duì)比過程本身并不是以全或無的成對(duì)比較為基礎(chǔ)的。相反，通常使用定標(biāo)相似性評(píng)分矩陣，以化學(xué)相似性或進(jìn)化距離為基礎(chǔ)，將得分賦予每次成對(duì)比較。通常所用這種矩陣的例子是BLOSUM62矩陣-BLAST程序組的缺省矩陣。GCG Wisconsin程序通常使用公用缺省值或自定義符號(hào)比較表(進(jìn)一步詳述見用戶指南)。對(duì)于某些應(yīng)用而言，優(yōu)選使用GCG軟件包的公用缺省值，或在其它軟件的情況下，使用缺省矩陣，如BLOSUM62。
一旦所述軟件產(chǎn)生了最佳序列對(duì)比，那么就可計(jì)算同源性百分比，優(yōu)選計(jì)算序列同一性百分比。通常所述軟件將其作為序列比較的一部分而進(jìn)行，產(chǎn)生數(shù)值結(jié)果。
所述序列還可具有核酸殘基的缺失，插入或取代，產(chǎn)生沉默改變并產(chǎn)生功能等價(jià)物質(zhì)。如果所述基因編碼蛋白，那么由同源物編碼的蛋白可以是相同的(由于遺傳編碼的簡(jiǎn)并)或功能等價(jià)的(例如，保守取代可出現(xiàn)在序列中)。優(yōu)選，所述同源物編碼與SEQ ID NO1基因編碼的蛋白具有至少90％，優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少98％同源性的蛋白。
保守取代可按照下表進(jìn)行。第二欄同一格內(nèi)的氨基酸，優(yōu)選第三欄同一行中的氨基酸彼此取代
禽痘病毒載體本發(fā)明還涉及含有這種禽痘病毒基因組的病毒顆粒。
病毒顆粒(或其一部分)可被用作載體系統(tǒng)，用于把目標(biāo)核苷酸(NOI)送遞給靶細(xì)胞。在這種意義上，這里所用的術(shù)語(yǔ)“病毒顆?！卑ê羞@種能夠把NOI或預(yù)表達(dá)蛋白送遞給靶細(xì)胞的顆粒(或其一部分)的病毒載體。使用本領(lǐng)域已知的方法，通過同源重組，可將NOI插入到病毒基因組中(見，例如，Schneider等，(1998)NatureMedicine 4(4)397-402)。
表達(dá)NOI的重組痘病毒的構(gòu)造需要NOI的插入，所述NOI的插入是在對(duì)于病毒基因組復(fù)制并不重要的位點(diǎn)進(jìn)行的。已經(jīng)描述了FP9的適宜插入位點(diǎn)(Pollitt等(1998)175-9；Laidlaw等1998 J Virol72，6742頁(yè))。
預(yù)表達(dá)的蛋白本發(fā)明的禽痘病毒顆粒(或其一部分)可用于把預(yù)表達(dá)的蛋白送遞給靶細(xì)胞。“預(yù)表達(dá)的蛋白”是在達(dá)到靶細(xì)胞之前已經(jīng)被翻譯的蛋白。例如，病毒顆粒在其中生長(zhǎng)的細(xì)胞可表達(dá)蛋白，然后被摻入到病毒顆粒中。
病毒顆粒在其中生長(zhǎng)的細(xì)胞可被工程改造成表達(dá)一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)蛋白(POI)。如果細(xì)胞是原代細(xì)胞(如CEF細(xì)胞)，那么可用編碼這種POI的核苷酸將它瞬時(shí)轉(zhuǎn)染?？蛇x擇性地，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系可用于生長(zhǎng)，如鵪鶉細(xì)胞系QT35。
優(yōu)選，將預(yù)表達(dá)的蛋白定向摻入到病毒顆粒中。
NOI在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)NOI包括任何適宜的核苷酸序列，例如，合成的RNA/DNA序列，重組RNA/DNA序列(即，利用重組DNA技術(shù)制備的)，cDNA序列或部分基因組DNA序列，包括其組合。所述序列無需是編碼區(qū)。如果它是編碼區(qū)，無需是完整的編碼區(qū)。此外，RNA/DNA序列可以是有義方向或反義方向。優(yōu)選，它是有義方向。優(yōu)選，所述序列是cDNA，包含cDNA，或從cDNA轉(zhuǎn)錄。
NOI可編碼目標(biāo)蛋白(“POI”)。這樣，載體系統(tǒng)可用于檢查外源基因在靶細(xì)胞上表達(dá)的作用。例如，禽痘病毒送遞系統(tǒng)可用于篩選對(duì)靶細(xì)胞具有特定作用的cDNA文庫(kù)。
NOI能夠阻斷或抑制基因在靶細(xì)胞中的表達(dá)。例如，NOI可以是反義序列。使用反義技術(shù)抑制基因表達(dá)是已知的。
NOI或源于NOI的序列能夠“剔除”特定基因在靶細(xì)胞中的表達(dá)。有很多“剔除”策略都是本領(lǐng)域已知的。例如，NOI能夠在靶細(xì)胞的基因組中整合，從而破壞特定基因的表達(dá)。NOI可通過，例如，引入早熟的終止密碼子，通過使下游編碼序列處于讀框外，或通過影響所編碼蛋白折疊的能力(由此影響其功能)而破壞表達(dá)。
可選擇性地，NOI能夠提高或誘導(dǎo)基因在靶細(xì)胞中的異位表達(dá)。NOI或源于NOI的序列能夠“介入”特定基因的表達(dá)。
由載體送遞系統(tǒng)送遞的NOI可使靶細(xì)胞無限增殖。本領(lǐng)域中有很多已知的無限增殖化技術(shù)(見，例如，Katakura Y等，(1998)MethodsCell Bio1.5769-91)。
由載體送遞系統(tǒng)送遞的NOI可用于選擇或標(biāo)記目的。例如，NOI可以是選擇基因，或標(biāo)記基因。很多不同的可選擇性標(biāo)記已經(jīng)成功用于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。這些綜述于“Retroviruses”(1997 Cold SpringHarbour Laboratory Press EdsJM Coffin，SM Hughes，HE Varmus444頁(yè))，包括但不限制于，細(xì)菌新霉素和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，它們分別帶來對(duì)G418和潮霉素的抗性；突變小鼠二氫葉酸鹽還原酶基因，其帶來對(duì)甲氨蝶呤的抗性；細(xì)菌gpt基因，其可使細(xì)胞在含有霉酚酸，黃嘌呤的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；細(xì)菌hisD基因，其可使細(xì)胞在沒有組氨酸但含有組氨醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；多藥物抗性基因(mdr)，其帶來對(duì)各種藥物的抗性；和細(xì)菌基因，其帶來對(duì)嘌呤霉素或腐草霉素的抗性。所有這些標(biāo)記都是顯性選擇的，并允許對(duì)表達(dá)這些基因的絕大多數(shù)細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)選擇。
然而在優(yōu)選實(shí)施方案中，NOI可含有或編碼具治療作用的蛋白。例如，由載體送遞系統(tǒng)送遞的NOI可以是治療性基因，該基因本身能夠激發(fā)治療作用，或它可編碼能夠激發(fā)治療作用的產(chǎn)物。
NOI可以，例如，是或編碼下列之一細(xì)胞因子，趨化因子，激素，抗體，抗氧化分子，工程化免疫球蛋白樣分子，單鏈抗體，融合蛋白，酶，免疫共刺激分子，免疫調(diào)節(jié)分子，反義RNA，靶蛋白的反顯性失活突變體，毒素，條件毒素，抗原，腫瘤抑制蛋白和生長(zhǎng)因子，膜蛋白，血管活性蛋白和肽，抗病毒蛋白及核酶，及其衍生物(如，具有相關(guān)報(bào)道基團(tuán))。
在其中一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，NOI能夠編碼疾病相關(guān)抗原。與禽痘載體中的抗原接觸可刺激或加強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，從而更有效處理現(xiàn)有或后繼侵襲。
抗原的性質(zhì)取決于疾病。如果疾病是由生物或感染劑(細(xì)菌，病毒，原生動(dòng)物，朊病毒)引起的，那么抗原可來源于這種生物或感染劑。如果疾病是由腫瘤引起的，那么抗原優(yōu)選是腫瘤相關(guān)抗原，如HER-2/neu，MUC01，睪丸癌抗原或致癌基因或其產(chǎn)物。
優(yōu)選，所述疾病相關(guān)抗原含有一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞表位。所述抗原可含有來源于引起疾病的生物的完整蛋白(如，源于結(jié)核分枝桿菌的抗原85A)?？蛇x擇性地，所述抗原可含有一串源于引起疾病生物的一個(gè)或多個(gè)蛋白的T細(xì)胞表位。它的例子是源于惡性瘧原蟲的MEPfTrap多肽，它含有一串源于惡性瘧原蟲CSP的T細(xì)胞表位和與惡性瘧原蟲TRAP基因融合的Pb9表位。
優(yōu)選，使用質(zhì)粒pEFL或其衍生物制備本發(fā)明的禽痘構(gòu)建體，優(yōu)選質(zhì)粒pEFL29。PEFL29具有同源區(qū)，可使它整合到ORF1的FP9中。這樣做可破壞ORF-1，但不能去除它。所述質(zhì)粒將三個(gè)基因lac A，lacY和lac Z加入到基因組中。這種破壞是插入，并使某些核苷酸缺失。從pEFL29缺失的禽痘Orfl基因堿基是(大寫字母)AgagatcccgccagacggggaacctgggtcaacgACTGGTGCGAAGATCTCtgcgtatggatatggtctccgtgttgttacgtcaagagatgtattcg疫苗本發(fā)明的基因組和/或顆粒可用于治療和/或預(yù)防被試者疾病的方法中。
例如，可將所述基因組和/或顆粒用于疫苗中，然后將疫苗給予被試者，用于預(yù)防或治療的目的。所述疫苗還可含有佐劑(見下文)。
人們發(fā)現(xiàn)，多劑接種(對(duì)于治療或疾病的預(yù)防而言)常常比單劑更有效。多劑接種程序可包括重復(fù)給予相同的組合物，或一劑或多劑給予兩種或多種不同的組合物。
對(duì)于同源接種程序而言，本發(fā)明提供一種疫苗包，其包括以便于反復(fù)給藥方式提供的疫苗。例如，該包可包括多個(gè)小瓶，每個(gè)小瓶都含有劑量準(zhǔn)確、準(zhǔn)備注射到患者中的疫苗。如果疫苗是口服，那么可以丸劑或膠囊劑的形式給藥。
在異源接種方案中，通常包括首先給予患者“激發(fā)”組合物，一段時(shí)間后再給予“加強(qiáng)”組合物。本發(fā)明的基因組和/或病毒顆?？捎糜诩ぐl(fā)組合物和/或加強(qiáng)組合物中。
異源接種程序中可使用很多其它組合物。如果本發(fā)明的基因組/顆粒含有NOI(任選能夠編碼POI)，那么優(yōu)選其它組合物含有相同的NOI或POI。其它組合物包括“裸DNA”，非病毒載體系統(tǒng)和其它病毒載體系統(tǒng)。
裸DNA(或RNA)可以是線形或環(huán)狀的(例如，質(zhì)粒)。它可在載體，如脂質(zhì)體中提供，或以游離形式提供。
激發(fā)組合物中使用的適宜非病毒載體包括被稱為脂肽的有脂類尾的肽，或者作為融合蛋白或者通過化學(xué)鍵與載體蛋白，如KLH融合的肽，具有佐劑的完整抗原，以及其它相似的系統(tǒng)。
如果使用病毒載體系統(tǒng)，而且如果它來源于不同的病毒(即，不是禽痘)，那么它有利于使交叉反應(yīng)減到最少。所述載體可來源于其它禽痘病毒屬，如金絲雀痘，或痘病毒的不同屬(如表2所示)。特別優(yōu)選的是減毒痘苗載體系統(tǒng)，如MVA或NVYAC。其它適宜的病毒載體是基于非痘病毒，如腺病毒，皰疹病毒和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)的載體。適宜的細(xì)菌載體包括重組BCG和重組沙門氏菌以及用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的沙門氏菌(Darji A等，1997 Cell 91765-775)。
對(duì)于異源接種方案而言，本發(fā)明提供一種接種試劑盒，其包括(i)含禽痘病毒顆粒的第一組合物；和(ii)用于同時(shí)，分開或序貫給藥的第二組合物。
異源接種方案本發(fā)明通常還涉及使用兩種不同的非復(fù)制型病毒載體進(jìn)行的異源接種法。
本發(fā)明人第一次提出，使用兩種不同非復(fù)制型病毒載體的異源激發(fā)-加強(qiáng)方案可在靈長(zhǎng)目被試者中有效產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
特別是，本發(fā)明提供一種治療和/或預(yù)防被試者疾病的方法，包括以任一順序給予被試者(i)含第一非復(fù)制型病毒載體的第一組合物；(ii)含第二非復(fù)制型病毒載體的第二組合物的步驟。
優(yōu)選被試者是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選被試者是靈長(zhǎng)目動(dòng)物，最優(yōu)選被試者是人。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一和/或第二組合物是痘病毒載體。
因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療和/或預(yù)防被試者疾病的方法，包括以任一順序給予被試者(i)含第一非復(fù)制型痘病毒載體的第一組合物；(ii)含第二非復(fù)制型痘病毒載體的第二組合物的步驟。
另一方面，本發(fā)明涉及一種治療和/或預(yù)防被試者疾病的方法，包括以任一順序給予被試者(i)含第一非復(fù)制型病毒載體的第一組合物；(ii)含第二非復(fù)制型病毒載體的第二組合物的步驟。
另一方面，本發(fā)明涉及一種治療和/或預(yù)防被試者疾病的方法，包括給予被試者(i)含DNA疫苗的第一組合物；(ii)含第一非復(fù)制型病毒載體的第二組合物；(iii)含第二非復(fù)制型病毒載體的第三組合物的步驟。
另一方面，本發(fā)明涉及一種治療和/或預(yù)防被試者疾病的方法，包括給予被試者(i)含第一非復(fù)制型病毒載體的第一組合物；(ii)含第二非復(fù)制型病毒載體的第二組合物；(iii)含第三非復(fù)制型病毒載體的第三組合物的步驟。
另一方面，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法，其中至少一種組合物含有痘病毒載體。
另一方面，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法，其中所述非復(fù)制型病毒載體含有痘病毒載體。
另一方面，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法，其中至少兩個(gè)痘病毒載體來源于不同屬的痘病毒。
另一方面，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法，其中至少一個(gè)痘病毒載體來源于禽痘病毒屬，至少一個(gè)痘病毒載體來源于正痘病毒屬。
另一方面，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法，其中至少一個(gè)載體來源于禽痘病毒。
另一方面，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法，其中至少一個(gè)載體是，或來源于FP9。
另一方面，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法，其中一個(gè)載體含有禽痘病毒基因組，其選自(i)具有一個(gè)或多個(gè)下列野生型FPV基因修飾形式的禽痘病毒基因組FPV001，F(xiàn)PV018，F(xiàn)PV054，F(xiàn)PV063，F(xiàn)PV066，F(xiàn)PV070，F(xiàn)PV071，F(xiàn)PV093，F(xiàn)PV097，F(xiàn)PV098，F(xiàn)PV115，F(xiàn)PV124，F(xiàn)PV125，F(xiàn)PV127，F(xiàn)PV158，F(xiàn)PV159，F(xiàn)PV160，F(xiàn)PV190，F(xiàn)PV191，F(xiàn)PV207，F(xiàn)PV219，F(xiàn)PV220，F(xiàn)PV221，F(xiàn)PV222，F(xiàn)PV239，F(xiàn)PV241，F(xiàn)PV242，F(xiàn)PV243，F(xiàn)PV244，F(xiàn)PV245，F(xiàn)PV246，F(xiàn)PV247，F(xiàn)PV260；(ii)在一個(gè)或多個(gè)下列基因中具有部分缺失的禽痘病毒基因組FPV158，F(xiàn)PV219，F(xiàn)PV222；(iii)缺少一個(gè)或多個(gè)下列基因的禽痘病毒基因組FPV001，F(xiàn)PV124，F(xiàn)PV125，F(xiàn)PV159，F(xiàn)PV160，F(xiàn)PV220，F(xiàn)PV221，F(xiàn)PV241，F(xiàn)PV242，F(xiàn)PV243，F(xiàn)PV244，F(xiàn)PV245，F(xiàn)PV246，F(xiàn)PV247，F(xiàn)PV260；(iv)在一個(gè)或多個(gè)下列基因中具有移碼突變的禽痘病毒基因組FPV054，F(xiàn)PV070，F(xiàn)PV071，F(xiàn)PV115，F(xiàn)PV190，F(xiàn)PV207；(v)在一個(gè)或多個(gè)下列基因中具有終止突變的禽痘病毒基因組FPV071，F(xiàn)PV239；(vi)具有由基因FPV097和FPV098融合(通過缺失)得到的嵌合基因的禽痘病毒基因組；(vii)小于275kbp的禽痘病毒基因組；(viii)含有SEQ ID NO1所示序列的禽痘病毒基因組；(ix)含有SEQ ID NO1所示序列，并從ORF1缺失ACTGGTGCGAAGATCTC的禽痘病毒基因組。
另一方面，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法，其中所述禽痘病毒基因組還含有NOI。
另一方面，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法，其中所述NOI受痘病毒啟動(dòng)子的控制。
另一方面，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法，其中所述NOI編碼貝氏瘧原蟲，惡性瘧原蟲，犬瘧原蟲，間日瘧原蟲，結(jié)核分枝桿菌或小泰勒蟲的抗原。
另一方面，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法，其中將所述含有源于禽痘病毒屬的病毒載體的組合物作為加強(qiáng)組合物給藥。
另一方面，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法，其中將所述含有源于禽痘病毒屬的病毒載體的組合物作為激發(fā)組合物給藥。
另一方面，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法，其中所述被試者是靈長(zhǎng)目動(dòng)物。
另一方面，本發(fā)明涉及一種如上所述的方法，其中所述被試者是人。
另一方面，本發(fā)明涉及非復(fù)制型載體在動(dòng)物疫苗中的用途，其中所述載體是，或來源于FP9。
另一方面，本發(fā)明涉及上述用途，其中所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
另一方面，本發(fā)明涉及上述用途，其中所述哺乳動(dòng)物是靈長(zhǎng)目動(dòng)物。
另一方面，本發(fā)明涉及上述用途，其中所述靈長(zhǎng)目動(dòng)物是人。
另一方面，本發(fā)明涉及非復(fù)制型病毒載體在藥物中的用途，其中所述載體是，或來源于FP9。
另一方面，本發(fā)明涉及一種在被試者中激發(fā)免疫應(yīng)答的方法，包括給予所述被試者含非復(fù)制型病毒載體的組合物，其中所述載體是，或來源于FP9。
另一方面，本發(fā)明涉及一種在被試者中加強(qiáng)先前存在的免疫應(yīng)答的方法，包括給予所述被試者含非復(fù)制型病毒載體的組合物，其中所述載體是，或來源于FP9。
優(yōu)選所述被試者是靈長(zhǎng)目動(dòng)物，特別是人。
優(yōu)選，所述載體來源于不同屬的痘病毒。特別是，其中一個(gè)來源于禽痘病毒屬，另一個(gè)來源于正痘病毒屬(見表2)。
當(dāng)其中一種組合物含有來源于禽痘病毒屬的載體時(shí)，優(yōu)選該組合物作為加強(qiáng)組合物給藥。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，其中一個(gè)載體源于禽痘病毒。更優(yōu)選其中一個(gè)載體是或來源于FP9。例如，其中一個(gè)載體可含有本發(fā)明第一方面的禽痘病毒基因組。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體含具有SEQ ID NO1序列的基因組。
當(dāng)所述疾病是瘧疾時(shí)，優(yōu)選使用FP9或FP9來源的載體作為激發(fā)劑。
當(dāng)所述疾病是結(jié)核時(shí)，優(yōu)選使用FP9或FP9來源的載體作為加強(qiáng)劑。
優(yōu)選所述第一和第二組合物能夠表達(dá)相同抗原。
所述第一和第二組合物可包裝在一起，或單獨(dú)包裝分開銷售。
所述試劑盒可含有其它成分(如稀釋劑，載體，佐劑等-見下文)，在給藥前與其中一個(gè)或兩個(gè)組合物混合。
所述試劑盒還可包括有關(guān)接種方案的文字說明書。
加蛋組合物本發(fā)明人表明，本發(fā)明的非復(fù)制型病毒載體可有效加強(qiáng)先前存在的，對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。特別是，本發(fā)明人第一次表明，非復(fù)制型載體可用于加強(qiáng)小鼠和靈長(zhǎng)目動(dòng)物中，由牛結(jié)核分枝桿菌BCG激發(fā)的，和靈長(zhǎng)目動(dòng)物，如人中黑色素瘤激發(fā)的免疫應(yīng)答。
先前存在的免疫應(yīng)答已經(jīng)由疫苗產(chǎn)生。已經(jīng)研制出了很多不同的疫苗類型，而且它們是本領(lǐng)域已知的，這些包括活的生物，完整但非活的生物，亞細(xì)胞片段，類毒素，基于DNA的疫苗和抗-獨(dú)特型(見表1)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，先前存在的應(yīng)答是由減毒活病原體，如BCG產(chǎn)生的。
本發(fā)明提供一種加強(qiáng)組合物，它含有能夠加強(qiáng)被試者中先前存在的免疫應(yīng)答的非復(fù)制型病毒載體。
優(yōu)選所述被試者是靈長(zhǎng)目動(dòng)物。
優(yōu)選所述病毒載體是痘病毒載體。例如，所述病毒載體可含有本發(fā)明第一方面的基因組。
三聯(lián)和多聯(lián)方案本發(fā)明通常還涉及使用不同的非復(fù)制型病毒載體進(jìn)行的多聯(lián)異源方案，如三聯(lián)異源方案。
因此，本發(fā)明提供一種三聯(lián)方案，包括給予被試者3種異源組合物。優(yōu)選所述這三種組合物不同于它們相鄰的組合物。例如，如果第一組合物含有X，那么第二組合物優(yōu)選不同于X。很清楚，在本實(shí)施方案中，第三組合物可與第一組合物相似或相同。優(yōu)選所有這三種組合物彼此互不相同。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，其中一個(gè)組合物是基于DNA的組合物，如DNA疫苗。優(yōu)選至少第二和第三組合物含有非復(fù)制型病毒載體。
因此，本發(fā)明提供一種治療和/或預(yù)防被試者疾病的方法，包括給予被試者(i)含DNA疫苗的第一組合物；(ii)含第一非復(fù)制型病毒載體的第二組合物；(iii)含第二非復(fù)制型病毒載體的第三組合物的步驟。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療和/或預(yù)防被試者疾病的方法，包括給予被試者(i)含第一非復(fù)制型病毒載體的第一組合物；(ii)含第二非復(fù)制型病毒載體的第二組合物；(iii)含第三非復(fù)制型病毒載體的第三組合物的步驟。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，第一和第二組合物是異源的，且第二和第三組合物是異源的。更優(yōu)選第一、第二和第三組合物是異源的。最優(yōu)選所述組合物在所述組合物的病毒載體成分方面是異源的。例如，治療方案可包括pDNA激發(fā)，接著是重組MVA加強(qiáng)，然后是重組FP9加強(qiáng)以及重組腺病毒加強(qiáng)等。這些治療/免疫循環(huán)最好重復(fù)進(jìn)行，從而在治療狀態(tài)下，持續(xù)治療性T細(xì)胞應(yīng)答。
優(yōu)選在本發(fā)明的三聯(lián)異源方案中使用三種或更多不同的病毒載體。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫是用下列載體進(jìn)行的任一順序的DNA-FP9-MVA-腺病毒-重組皰疹。優(yōu)選每個(gè)載體表達(dá)相同的抗原。優(yōu)選所述載體以DNA-FP9-MVA-腺病毒-重組皰疹的序貫給藥。
其它優(yōu)選的免疫順序和方案是DNA-FP9-MVA和DNA-MVA-FP9。
優(yōu)選所述載體來源于不同屬的痘病毒。特別是，一個(gè)來源于禽痘病毒屬，另一個(gè)來源于正痘病毒屬(見表2)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，其中一個(gè)載體來源于禽痘病毒。例如，其中一個(gè)載體可含有本發(fā)明第一方面的禽痘病毒基因組。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體含有具SEQ ID NO1所示序列的基因組。
優(yōu)選所述第一、第二和第三組合物能夠表達(dá)相同抗原。
實(shí)施例12(例如，圖11-DDFM)證實(shí)了三聯(lián)方案的有效性。
優(yōu)選被試者是靈長(zhǎng)目動(dòng)物，特別是人。
第一、第二和第三組合物可包裝在一起，或單獨(dú)包裝分開銷售。
試劑盒可包括在給藥前，與一種或多種組合物混合的其它成分(如稀釋劑，載體，佐劑等，見下文)。
試劑盒還可包括有關(guān)接種方案的文字說明。
T細(xì)胞應(yīng)答所述接種方案或程序應(yīng)在被試者中激發(fā)T-細(xì)胞免疫應(yīng)答。
T細(xì)胞免疫應(yīng)答的特性可利用細(xì)胞表面標(biāo)記在細(xì)胞上的表達(dá)來表征。通常，T細(xì)胞可由TCR，CD3，CD2，CD28，CD5或CD7(僅人)的存在而檢測(cè)。CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞可通過它們的共同-受體表達(dá)來區(qū)分(例如，使用抗-CD4或抗-CID8單克隆抗體)。
因?yàn)楫?dāng)由MHCII類分子呈遞時(shí)，CD4+T細(xì)胞可識(shí)別抗原，當(dāng)由MHCI類分子呈遞時(shí)，CD8+T細(xì)胞可識(shí)別抗原，因此CD4+和CD8+T細(xì)胞還可以以與它們反應(yīng)的抗原呈遞細(xì)胞為基礎(chǔ)來區(qū)分。
在特定的靶抗原內(nèi)，有一個(gè)或多個(gè)CD4+T細(xì)胞表位和一個(gè)或多個(gè)CD8+T細(xì)胞表位。如果已經(jīng)表征過特定的表位，可用于區(qū)別T細(xì)胞的兩個(gè)亞型，例如，以識(shí)別特定表位的T細(xì)胞亞型的特異性刺激為基礎(chǔ)。
CD4+T細(xì)胞還可根據(jù)它們的細(xì)胞因子分泌分布再細(xì)分。TH1亞型(有時(shí)稱作“炎性CD4 T細(xì)胞”)特征性地分泌IL-2和IFNγ，并介導(dǎo)與細(xì)胞毒性和局部炎性反應(yīng)有關(guān)的多種功能。TH1細(xì)胞能夠激活巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。TH2亞型(有時(shí)稱作“輔助CD4 T細(xì)胞”)分泌IL-4，IL-5，IL-6和IL-10，并且可刺激B細(xì)胞增殖，并產(chǎn)生抗體(體液免疫)。
TH1和TH2細(xì)胞還具有效應(yīng)分子的特征性表達(dá)。TH1細(xì)胞表達(dá)膜結(jié)合的TNF，TH2細(xì)胞表達(dá)與B細(xì)胞上的CD40結(jié)合的CD40配體。
T細(xì)胞免疫應(yīng)答的類型因此可很容易確定，例如，利用熒光活化細(xì)胞掃描(FACScan)。
靶抗原靶抗原可能是靶疾病的特征。如果所述疾病是一種感染性疾病，由感染性病原體所引起，那么靶抗原則來源于感染性病原體。
靶抗原可以是被疾病感染后，由免疫系統(tǒng)識(shí)別的抗原?？蛇x擇性地，所述抗原對(duì)于免疫系統(tǒng)通?？梢允恰安豢梢姷摹?，這樣該方法就可誘導(dǎo)非-生理學(xué)的T細(xì)胞應(yīng)答。這對(duì)于疾病可能是有幫助的，其中由所述疾病激發(fā)的免疫應(yīng)答無效(例如，不能成功清除感染)，這是因?yàn)樗赡艽蜷_了侵襲的另外一個(gè)途徑。
優(yōu)選的乳腺癌抗原是MUC-1，HER2，CEA；優(yōu)選的結(jié)腸癌抗原CEA，MUC-1，MAGE-12，突變P53；優(yōu)選的子宮頸癌抗原人乳頭瘤病毒蛋白E6和E7；優(yōu)選的EBV-誘導(dǎo)的B和T細(xì)胞淋巴瘤抗原EBNA1和2，LMP1；優(yōu)選的腎癌抗原HER-2 neu，RAGE，MUC-1。優(yōu)選的HPV抗原是病毒蛋白E1-8，L1和L2。優(yōu)選的HSV抗原是病毒蛋白gM，gH，gK，GG，gD。優(yōu)選的HBV抗原是病毒蛋白小，中和大的表面抗原，核心抗原，聚合酶。優(yōu)選的HCV蛋白是病毒蛋白核心蛋白，被膜蛋白，NS2，NS3，NS4和NS5區(qū)。
所述抗原可以是腫瘤抗原，例如HER2/neu，MUC-1，MAGE-1，MAGE-3或NY-ESO。
所述抗原可以是自身抗原，例如，酪氨酸酶。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗原來源于結(jié)核分枝桿菌。例如，所述抗原可以是ESAT6或MPT63。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗原來源于瘧疾相關(guān)病原體惡性瘧原蟲。
本發(fā)明的組合物可包括來源于不止一個(gè)抗原的T細(xì)胞表位。例如，所述組合物可含有一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞表位，它們來源于與同一疾病相關(guān)的兩個(gè)或多個(gè)抗原。所述兩個(gè)或多個(gè)抗原可來源于同一病原生物。
可選擇性地，所述組合物可含有各種來源的表位。例如，實(shí)施例中描述的ME-TRAP插入物含有來源于惡性瘧原蟲，破傷風(fēng)類毒素，結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌的T細(xì)胞表位。
靶疾病本發(fā)明的方法可用于治療和/或預(yù)防很多疾病，特別是對(duì)T-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答敏感的那些。
特別是，本發(fā)明的方法可用于治療和/或預(yù)防屬于或由慢性感染，特別是持續(xù)潛伏感染所引起的疾病。
適合疾病的非窮舉列表包括結(jié)核，HIV，瘧疾，幽門螺桿菌，流感，肝炎，CMV，人乳頭瘤病毒(HPV)，皰疹病毒誘導(dǎo)的疾病和其它病毒感染，麻風(fēng)，非瘧原蟲，如弓形體，以及各種惡性腫瘤，如瘤和/或癌癥，由原生動(dòng)物瘧疾，特別是惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲，弓形體，小泰勒蟲，克氏錐蟲引起的感染性疾病，由分枝桿菌引起的感染性疾病如肺結(jié)核和麻風(fēng)病，細(xì)菌如肺炎衣原體和幽門螺桿菌引起的感染性疾病，由病毒如HIV，EBV，CMV，HBV，HCV，HPV，HSV，RSV，流感病毒引起的感染性疾病和各種惡性腫瘤，如腎，結(jié)直腸，肺，皮膚(黑色素瘤)，肝，卵巢，睪丸，胰腺，子宮，前列腺，胃，頭頸部，子宮頸，乳腺癌和各種淋巴瘤，以及HIV/AIDS，乙型肝炎，丙型肝炎，瘧疾，結(jié)核，HPV感染和疾病，HSV感染和疾病，CMV感染和疾病，EBv感染和疾病，利什曼病，李斯特氏菌病，泰累爾氏梨漿蟲，HTLV感染和疾病，肺炎球菌病，葡萄球菌病，肺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，黑色素瘤，骨髓瘤，淋巴瘤，腎細(xì)胞癌。
本發(fā)明的方法特別用于接種，從而抗肺結(jié)核，瘧疾和東海岸熱。
這里所述的組合物可用作治療或預(yù)防性疫苗。是預(yù)防性更適宜還是治療性免疫更適宜，通常取決于疾病的性質(zhì)。例如，預(yù)期對(duì)癌癥進(jìn)行治療性免疫要好于在已經(jīng)診斷它之前進(jìn)行免疫，而抗瘧疾疫苗優(yōu)選，雖然非必需，用作預(yù)防。
藥物組合物/疫苗本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，如疫苗，激發(fā)劑或加強(qiáng)劑。
所述藥物組合物還可含有，例如，藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑，賦形劑或佐劑。藥物載體，賦形劑或稀釋劑可根據(jù)給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐來選擇。
特別是，含DNA質(zhì)粒載體的組合物可含有粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)，或編碼它的質(zhì)粒，以用作佐劑；有益效果是用多肽形式的GM-CSF觀察到的。佐劑如QS21或SBAS2(Stoute J A等，1997 N Engl J Medicine 22686-91)可與蛋白，肽或核酸一起使用，提高T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)。
在本發(fā)明的藥物組合物中，所述組合物還可與任何適宜的粘合劑，潤(rùn)滑劑，混懸劑，涂層劑，或加溶劑混合。
所述藥物組合物可以是獸(即動(dòng)物)用或人用。作獸用時(shí)，所述組合物可用于治療例如哺乳動(dòng)物(特別是家畜)或鳥。
優(yōu)選被試者是哺乳動(dòng)物，特別是靈長(zhǎng)目動(dòng)物(例如人)或有蹄類動(dòng)物(例如母牛)。
給藥通常，本發(fā)明組合物治療有效的每日真皮內(nèi)或肌內(nèi)劑量為105～1010個(gè)噬斑形成單位(pfu)。
通常，由內(nèi)科醫(yī)生或獸醫(yī)確定實(shí)際給藥劑量，這對(duì)各個(gè)患者最適合，并可根據(jù)年齡，體重，特殊患者的反應(yīng)而變化。上述給藥劑量是一般病例的舉例。當(dāng)然，有可能存在各個(gè)病例，他們接受更高或更低的給藥劑量范圍，這些也落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
脊椎動(dòng)物痘病毒亞科的傳播可通過氣霧劑進(jìn)行(Murphy等，(1995)如上)。本發(fā)明的組合物也可通過氣霧劑給藥，由被試者吸入。本發(fā)明的組合物還可通過注射很方便地給藥，如真皮內(nèi)和/或肌內(nèi)注射。此外，還可使用適當(dāng)?shù)难b置將所述組合物給藥到皮膚或其它組織中(例如，使用“基因槍”或類似物)。
所述藥物組合物還可以栓劑或陰道栓的形式，局部洗劑，溶液，乳油，軟膏或撲粉，皮膚貼膏的形式，含賦形劑如淀粉或乳糖的口服片劑，或單獨(dú)或與賦形劑混合的膠囊劑或小泡，或含芳香或著色劑的酏劑溶液或混懸液的形式給藥，或非腸道注射，例如海綿竇內(nèi)，靜脈內(nèi)，或皮下注射給藥。非腸道給藥時(shí)，所述組合物最好以無菌水溶液的形式使用，其中含有其它物質(zhì)，例如，足量的鹽或單糖，從而使溶液與血液等滲。頰或舌下給藥時(shí)，所述組合物可以按常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式給藥。
還可以緩釋制劑的形式給予本發(fā)明的組合物。
痘病毒的生長(zhǎng)方法已知野生型和重組痘病毒是體外在培養(yǎng)的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中生長(zhǎng)的。本發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)，對(duì)于禽痘病毒屬而言，使用未培養(yǎng)的CEF可獲得顯著改善的噬斑形成和病毒產(chǎn)率。
本發(fā)明提供未培養(yǎng)的CEF細(xì)胞使禽痘病毒屬生長(zhǎng)的用途。
優(yōu)選，所述禽痘病毒屬的病毒是禽痘病毒，特別是含有本發(fā)明第一方面的禽痘基因組的禽痘病毒。
術(shù)語(yǔ)“未培養(yǎng)的”用于表示它們?cè)谂囵B(yǎng)物中繁殖到任何顯著程度之前使用的細(xì)胞。優(yōu)選細(xì)胞在培養(yǎng)物中的時(shí)間不足以使細(xì)胞群中的細(xì)胞數(shù)加倍。
通過定期傳代和補(bǔ)充生長(zhǎng)培養(yǎng)基可使原代CEF細(xì)胞在培養(yǎng)物中維持1個(gè)月。本發(fā)明未培養(yǎng)的CEF細(xì)胞應(yīng)在不傳代的情況下使用。
原代未培養(yǎng)的CEF可通過將新鮮制備的CEF加樣到組織培養(yǎng)皿中而獲得，濃度足以在不生長(zhǎng)的條件下產(chǎn)生匯合的單層。然后用平板，優(yōu)選在24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行鋪板。
僅僅為了舉例說明的目的，在下列實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例1禽痘病毒株FP9的產(chǎn)生和表征禽痘株FP9是從有毒力的野生型禽痘HP-1株，通過在組織培養(yǎng)物中的雞胚成纖維細(xì)胞中傳代438次得到的(Mayr和Malicki(1966)Zentralbl Veterinarmed 13 1-3)，然后純化噬斑。
Fp9的基因組已被完全測(cè)序(SEQ ID NO1)并作了注釋(圖1)。FP9不含REV原病毒。266kbp的FP9基因組多少比FPV-M的預(yù)期大小(大于300kbp)要小一些。
實(shí)施例2由重組FP9和FPV-M激發(fā)的免疫應(yīng)答的比較為了確定在激發(fā)對(duì)重組抗原的T-細(xì)胞應(yīng)答的能力方面，重組FP9是否優(yōu)于FPV-M，利用同源重組將貝氏瘧原蟲環(huán)子孢子表面蛋白(PbCSP)插入到兩種病毒基因組的末端6.8 kbp BamHI片段(Boursnell等，1990a，J Gen Virol 71，621-8；Boursnell等，1990b，Vet Microbiol23，305-16；Campbell等，1989，J Gen Virol 70，145-54)(Quingzhong等，1994，Vaccinre 12，569-73)中。痘苗p7.5早期-晚期啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)插入的基因在兩種重組病毒中的表達(dá)。PbCSP蛋白含有H-2Kd限制性9氨基酸肽表位，可誘導(dǎo)保護(hù)性CD8+T-細(xì)胞應(yīng)答，該應(yīng)答針對(duì)Balb/c小鼠中的貝氏瘧原蟲肝臟期感染(Plebanski等，1998，EurJ Immunol 28，4345-55；Schneider等，1998，Nat Med 4，397-402)。令人吃驚地是，編碼PbCSP基因的FP9(FP9PbCSP)可在Balb/c小鼠中激發(fā)較編碼CSP基因的FPV-M(FPV-MPbCSP)明顯更高的CD8+介導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答，雖然兩種病毒都可誘導(dǎo)對(duì)病毒抗原的顯著T細(xì)胞應(yīng)答。
方法單獨(dú)用1×106PFU的FP9或FPV-M或表達(dá)貝氏瘧原蟲CSP(PbCSP)給雌性Balb/c小鼠靜脈內(nèi)免疫。免疫后7天，利用IFNγ ELISPOT測(cè)定在脾細(xì)胞中激發(fā)的T-細(xì)胞免疫應(yīng)答。對(duì)重組抗原PbCSP的應(yīng)答，是用I類MHC限制性Pb9表位(由CD8+T-細(xì)胞識(shí)別)測(cè)定的。作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)完整病毒的T-細(xì)胞應(yīng)答是通過使免疫脾細(xì)胞與感染了禽痘病毒的那些接觸而測(cè)定的。圖1中的柱形表示每組4只小鼠的平均IFNγ斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)/百萬(wàn)脾細(xì)胞±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。
實(shí)施例3使用FP9PbCSP進(jìn)行的激發(fā)-加強(qiáng)免疫方案和對(duì)貝氏瘧原蟲的保護(hù)性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)在Balb/c小鼠中，由FP9PbCSP激發(fā)的CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答與DNA-疫苗和編碼PbCSP抗原的MVA的比較(圖4)揭示了由重組FP9激發(fā)的應(yīng)答明顯比由DNA-疫苗激發(fā)的更高，雖然低于由重組MVA激發(fā)的應(yīng)答。然而，F(xiàn)P9PbCSP可加強(qiáng)由DNA-接種激發(fā)的CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答，并與MVAPbCSP結(jié)合發(fā)揮激發(fā)劑或加強(qiáng)劑的作用(圖5)。很明顯，較其它同源或異源激發(fā)-加強(qiáng)免疫方案，用FP9PbCSP激發(fā)，隨后用MVAPbCSP加強(qiáng)，可誘導(dǎo)對(duì)貝氏瘧原蟲子孢子侵襲的顯著更高水平的保護(hù)(表3)。
表3.使用重組FP9PbCSP進(jìn)行的激發(fā)-加強(qiáng)免疫方案對(duì)貝氏瘧原蟲侵襲的保護(hù)方法用1×106PFU的FP9PbCSP(FP9)或MVAPbCSP(MVA)對(duì)雌性Balb/c小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)免疫，或用50μg的pSG2PbCSP(DNA)對(duì)它進(jìn)行肌內(nèi)注射，并在2周后，用FP9PbCSP或MVAPbCSP加強(qiáng)。對(duì)PbCSP的CD8+ T-細(xì)胞應(yīng)答是加強(qiáng)后14天，用I類MHC限制性Pb9表位，在IFNγ ELISPOT測(cè)定法中測(cè)定的。柱形表示每組3只小鼠的平均IFNγ斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)/百萬(wàn)脾細(xì)胞±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(圖4)。
加強(qiáng)免疫2周后，通過用2000個(gè)貝氏瘧原蟲子孢子靜脈內(nèi)注射來侵襲動(dòng)物，隨后在侵襲后6-14天，檢測(cè)血液階段感染(表2)。結(jié)果是4次實(shí)驗(yàn)的累積。
實(shí)施例4編碼不同外源重組抗原和表位串的FP9病毒的構(gòu)建為了證實(shí)FP9可被用作遞送重組抗原的一般系統(tǒng)，將編碼原核生物和真核生物來源的整個(gè)抗原的基因及編碼多表位和多蛋白融合體的合成基因通過同源重組插入到FP9的基因組中(表4)。這些基因編碼的抗原在結(jié)構(gòu)上有很大不同，而且來源于各種不同的病原體。表4所列的每個(gè)重組FP9衍生物已經(jīng)于體外在雞胚成纖維細(xì)胞中繁殖到較高濃度，表明它們是活的且穩(wěn)定的。痘苗p7.5早期-晚期啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)所編碼的抗原在所有重組病毒中的表達(dá)。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，所編碼的抗原在所有已經(jīng)測(cè)定過的情況下表達(dá)(表4)。包括這些構(gòu)建體中最大的，F(xiàn)P9L3SEPTL，其具有一個(gè)9.9kbp的合成基因，它編碼被表達(dá)為6融合瘧疾抗原的多蛋白。
表4迄今為止構(gòu)造的重組FP9病毒
*重組病毒的表達(dá)是通過免疫熒光或免疫應(yīng)答的存在而測(cè)定的。ND，沒有測(cè)定。
實(shí)施例5利用FP9誘導(dǎo)對(duì)惡性瘧原蟲抗原的T細(xì)胞免疫應(yīng)答MEPfTrap多肽，其包括一串惡性瘧原蟲CSP的T細(xì)胞表位和與惡性瘧原蟲TRAP基因(Robson等，1988，Nature 335，79-82)融合的Pb9表位(Gilbert等，1997 Nat Biotechnol 15，1280-4)，被研究作為用于接種的，抗人惡性瘧原蟲瘧疾的抗原。已經(jīng)構(gòu)建了編碼MEPfTrap的FP9(表4)，并顯示可在Balb/c小鼠(107±20IFNγ斑點(diǎn)形成細(xì)胞/百萬(wàn)脾細(xì)胞)中進(jìn)行的效力試驗(yàn)中激發(fā)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
實(shí)施例6利用FP9誘導(dǎo)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抗原85A的CD8+和CD4+ T細(xì)胞免疫應(yīng)答抗原85A(Ag85A)是一種源于結(jié)核分枝桿菌的主要分泌型和保護(hù)性抗原。由編碼源于結(jié)核分枝桿菌的Ag85A的FP9激發(fā)的免疫應(yīng)答最初是在Balb/c小鼠中測(cè)定的(圖6)。抗原85A含有20個(gè)氨基酸的H-2dII類MHC-限制性肽表位(由CD4+ T-細(xì)胞識(shí)別)以及9個(gè)氨基酸的H-2dI類MHC-限制性表位(由CD8+ T-細(xì)胞識(shí)別)(Huygen等，1994)。用FP9Ag85A免疫可誘導(dǎo)對(duì)Ag85A的CD4+和CD8+ T-細(xì)胞應(yīng)答，表明FP9可在小鼠中誘導(dǎo)對(duì)所編碼抗原的CD4+和CD8+ T-細(xì)胞應(yīng)答。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，人們發(fā)現(xiàn)FP9Ag85A可明顯加強(qiáng)恒河獼猴中用MVA85A免疫誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答(圖7)。
方法雌性Balb/c小鼠是用1×107PFU的編碼源于結(jié)核分枝桿菌的抗原85A(FP9Ag85A)的重組FP9靜脈內(nèi)免疫的，而1×106PFU的編碼相同抗原的MVA用于比較。對(duì)85A的應(yīng)答是免疫后6天，在INFγ ELISPOT測(cè)定法中，使用II類MHC限制性P15表位(由CD4+ T-細(xì)胞識(shí)別)和I類MHC限制性P11表位(由CD8+ T-細(xì)胞識(shí)別)測(cè)定的。柱形表示每組3只小鼠的平均INFγ斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)/百萬(wàn)脾細(xì)胞±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。
用編碼抗原85A的重組MVA(MVA85A)免疫兩次的雄性恒河獼猴是在21和26周后，用5×108PFU的FP9Ag85A加強(qiáng)的(↓)。對(duì)Ag85A的應(yīng)答是在INFγ ELISPOT測(cè)定法的外周血單核細(xì)胞(PBMC)中，使用包括Ag85A多膚的氨基酸序列的重疊肽混合物測(cè)定的。曲線表示4種肽混合物的INFγ斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)/百萬(wàn)PBMC。
實(shí)施例7-FP9和MVA不能激發(fā)對(duì)病毒抗原的交叉反應(yīng)性T細(xì)胞有證據(jù)表明，用不同而不是相同病毒載體進(jìn)行的激發(fā)-加強(qiáng)免疫可提高對(duì)重組抗原的CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答(Gilbert等，Vaccine In Press)。近來的證據(jù)表明，當(dāng)使用相同重組病毒作為激發(fā)劑和加強(qiáng)劑時(shí)，對(duì)病毒載體的CD8+ T-細(xì)胞應(yīng)答可抑制加強(qiáng)(未公開的觀察結(jié)果，Eric G.Sheu)。當(dāng)與感染MVA的幼稚細(xì)胞接觸時(shí)，用FP9PbCSP免疫小鼠的免疫脾細(xì)胞不能產(chǎn)生INFγ，而與感染FP9的幼稚細(xì)胞接觸時(shí)則可以(圖8)。相反，MVAPbCSP免疫脾細(xì)胞可識(shí)別感染MVA的幼稚細(xì)胞，但不能識(shí)別感染FP9的幼稚細(xì)胞(圖8)。盡管如此，當(dāng)FP9PbCSP免疫脾細(xì)胞與感染了MVAPbCSP的脾細(xì)胞接觸時(shí)，可觀察到分泌INFγ的T細(xì)胞應(yīng)答，反之亦然(圖8)。綜合考慮，這些結(jié)果表明重組FP9和重組MVA可激發(fā)對(duì)所編碼抗原的T細(xì)胞應(yīng)答，而不激發(fā)與兩種病毒抗原交叉反應(yīng)的T細(xì)胞應(yīng)答。
初步結(jié)果表明，非復(fù)制型金絲雀痘病毒也不與MVA交叉反應(yīng)。因此禽痘病毒屬和正痘病毒屬一般不會(huì)激發(fā)交叉反應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答，使得它們適于作為同一接種方案中的激發(fā)或加強(qiáng)劑。
方法用FP9PbCSP或MVAPbCSP靜脈內(nèi)免疫后14天，對(duì)PbCSP以及從小鼠中分離的脾細(xì)胞的病毒抗原的離體IFNr elispot應(yīng)答。IFNγ應(yīng)答是通過使從免疫動(dòng)物中分離的脾細(xì)胞與用Pb9肽刺激的幼稚脾細(xì)胞或感染了FP9，F(xiàn)P9PbCSP，MVA，或MVAPbCSP的那些接觸而測(cè)定的。柱形(圖8)表示每組3只小鼠的平均IFNγ斑點(diǎn)形成細(xì)胞(sfc)數(shù)/百萬(wàn)脾細(xì)胞±S.E.M.。
實(shí)施例8-禽痘病毒屬的體外生長(zhǎng)野生型和重組痘病毒通常于體外在培養(yǎng)的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中生長(zhǎng)。最初在我們實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的，通過培養(yǎng)的CEF單層的感染而使重組FP9生長(zhǎng)的嘗試中，我們觀察到了游走的病毒噬斑的形成以及病毒的較差產(chǎn)率(表5)。相反，在類似的培養(yǎng)CEF感染之后，獲得了較好的噬斑形成和始終較高的MVA產(chǎn)率。原代“未培養(yǎng)的”CEF可通過將新鮮制備的CEF加樣到組織培養(yǎng)皿中而獲得，濃度足以在不生長(zhǎng)的情況下產(chǎn)生匯合的單層。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在原代“未培養(yǎng)的”CEF單層感染之后，F(xiàn)P9和重組FP9形成可見的病毒噬斑，并產(chǎn)生較好的病毒產(chǎn)率(表5)。同樣，噬斑形成和減毒金絲雀痘病毒，ALVAC的較高產(chǎn)率已經(jīng)由本發(fā)明人使用原代“未培養(yǎng)的”CEF獲得。
這些研究共同表明，禽痘病毒屬較MVA以及其它正痘病毒屬在它們的生長(zhǎng)要求方面更挑剔。希望不會(huì)受到理論的束縛，本發(fā)明人相信禽痘病毒屬在CEF內(nèi)的復(fù)制可能需要特定的宿主分子，其是作為體外培養(yǎng)的CEF損失的。相反，MVA和正痘病毒通常不需要這種宿主分子進(jìn)行復(fù)制。觀察的主要結(jié)果是初級(jí)未培養(yǎng)的CEF可能是產(chǎn)生大量重組禽痘病毒屬所需的。因此，實(shí)際上，I期臨床研究中，重組FP9的大量產(chǎn)生只能使用“未培養(yǎng)的”CEF獲得。
表5源于培養(yǎng)和未培養(yǎng)CEF的病毒的近似產(chǎn)率
1培養(yǎng)的CEF是在用病毒感染之前，在培養(yǎng)物中傳代的。
2對(duì)于“未培養(yǎng)的”CEF而言，在感染前，以大約1.5×105個(gè)細(xì)胞/cm2將原代CEF加樣到組織培養(yǎng)燒瓶中，并生長(zhǎng)12-18小時(shí)。
實(shí)施例9-利用FP9在人類志愿者中誘導(dǎo)對(duì)惡性瘧原蟲瘧疾的保護(hù)性免疫應(yīng)答FP9MEPfTrap的I期臨床試驗(yàn)(見實(shí)施例5)用超過3×107PFU的FP9MEPfTrap給健康的成年志愿者免疫2次，隨后用相同劑量的MVAMEPfTrap加強(qiáng)。5名免疫志愿者中，有2名可免受5只感染了有毒力的惡性瘧原蟲瘧疾的史氏按蚊叮咬的侵襲。
相反，在同一實(shí)驗(yàn)中，5名未患過瘧疾的志愿者全部患上惡性瘧原蟲瘧疾。因此，首次證明用兩種重組非復(fù)制型病毒對(duì)人類志愿者進(jìn)行異源激發(fā)-加強(qiáng)免疫可對(duì)感染性疾病激發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答。
保護(hù)是通過志愿者沒有發(fā)展成血液期的瘧疾而確定的，證實(shí)了痘病毒免疫可阻斷肝中的惡性瘧原蟲感染。
實(shí)驗(yàn)還確定了保護(hù)的機(jī)理，雖然很可能保護(hù)是由對(duì)MEPfTrap多肽激發(fā)的T-細(xì)胞應(yīng)答介導(dǎo)的。
實(shí)施例10-在瘧疾流行地區(qū)進(jìn)行的臨床試驗(yàn)I期試驗(yàn)為了確定使用重組FP9和MVA的異源激發(fā)-加強(qiáng)免疫方案是否能夠加強(qiáng)暴露于瘧疾的人群中的免疫應(yīng)答，在岡比亞進(jìn)行了I期臨床試驗(yàn)，其中使用了編碼MEPfTrap分子的構(gòu)建體。
成年志愿者(大約12名)用FP9MEPfTrap構(gòu)建體免疫2次，并用單一劑量的MVAMEPfTrap加強(qiáng)。T-細(xì)胞和抗體免疫應(yīng)答是在血液中測(cè)定的，研究的最初目的是為了證實(shí)用重組非復(fù)制型痘病毒免疫是否能夠加強(qiáng)由先前存在的、天然感染激發(fā)的抗瘧疾應(yīng)答。
IIb期研究IIb期研究是在使用相同免疫方案的岡比亞成年人中進(jìn)行的。
監(jiān)測(cè)志愿者在試驗(yàn)過程中免疫應(yīng)答的提高以及血液期感染的證據(jù)，這是在瘧疾發(fā)病季節(jié)進(jìn)行的(6月-12月)。
進(jìn)一步的研究進(jìn)一步的I期研究也是2002年在岡比亞進(jìn)行的，其中使用適宜的重組FP9和MVA接種，以防結(jié)核分枝桿菌和HIV。兩次試驗(yàn)都是用感染了各自病原體的志愿者進(jìn)行的，因此而評(píng)估FP9和使用兩種非復(fù)制型病毒進(jìn)行的異源激發(fā)-加強(qiáng)免疫法用作治療性疫苗的能力。
因此，它證實(shí)了本發(fā)明的接種可產(chǎn)生和/或提高人的保護(hù)性應(yīng)答。實(shí)施例11-利用非復(fù)制型重組痘病毒加強(qiáng)由牛結(jié)核分枝桿菌BCG激發(fā)的、對(duì)Ag85A的T細(xì)胞應(yīng)答牛結(jié)核分枝桿菌BCG作為抗結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核的疫苗而被廣泛給予發(fā)展中國(guó)家的兒童。雖然可有效抵抗嚴(yán)重的兒童形結(jié)核，但牛結(jié)核分枝桿菌BCG對(duì)成人疾病的保護(hù)功效非常不確定，并隨時(shí)間而改變。因?yàn)锳g85A是牛結(jié)核分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌的主要分泌型抗原，加強(qiáng)由牛結(jié)核分枝桿菌BCG免疫激發(fā)的對(duì)Ag85A的免疫應(yīng)答是提高這種疫苗對(duì)成人肺結(jié)核保護(hù)功效的可靠策略。這種策略已經(jīng)由其他人在鼠模型中進(jìn)行，其中用重組Ag85A蛋白(Brooks等，2001Infect Immun 69，2714-7)或編碼這種抗原的DNA-疫苗(Tanghe等，2001 Infect Immun 69，3041-7.)加強(qiáng)。
以FP9Ag85A可加強(qiáng)由MVA85A免疫激發(fā)的免疫應(yīng)答的觀察結(jié)果為基礎(chǔ)，本發(fā)明人希望確定痘病毒構(gòu)建體是否能夠加強(qiáng)由牛結(jié)核分枝桿菌BCG激發(fā)的免疫應(yīng)答。在Balb/c小鼠中進(jìn)行的初步實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)Ag85A的CD4+和CD8+ T-細(xì)胞應(yīng)答可通過用牛結(jié)核分枝桿菌BCG免疫而加強(qiáng)(圖9)。利用恒河獼猴進(jìn)行的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，通過真皮內(nèi)或氣霧途徑進(jìn)行牛結(jié)核分枝桿菌BCG免疫，可誘導(dǎo)對(duì)Ag85A的T細(xì)胞應(yīng)答。在給予牛結(jié)核分枝桿菌BCG后的早期，用MVA85A加強(qiáng)可激發(fā)對(duì)PPD和Ag85A蛋白不定的、短暫的免疫應(yīng)答提高。然而，隨后用FP9Ag85A加強(qiáng)可顯著提高對(duì)這些蛋白(圖10)以及對(duì)跨越Ag85A蛋白序列的肽混合物的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)可確定免疫動(dòng)物中激發(fā)的T細(xì)胞應(yīng)答特性和定位。
這些實(shí)驗(yàn)提供的第一個(gè)實(shí)施例是非復(fù)制型病毒可用于加強(qiáng)小鼠和靈長(zhǎng)目動(dòng)物中，由牛結(jié)核分枝桿菌BCG激發(fā)的免疫應(yīng)答。此外，他們建立了非復(fù)制型痘病毒可有效用作抗人類持續(xù)潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染的治療性疫苗的概念。
方法Balb/c小鼠用牛結(jié)核分枝桿菌BCG真皮內(nèi)(i.d.)免疫，并在12周后，用1×106PFU的MVA85A真皮內(nèi)加強(qiáng)。對(duì)照動(dòng)物是單獨(dú)用牛結(jié)核分枝桿菌BCG或MVA85A免疫的。免疫后12天，在IFNγ ELISPOT測(cè)定法中，用P15(CD4+)和P11(CD8+)表位測(cè)定對(duì)PPD和Ag85A的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。柱形(圖9)表示每組3只小鼠的平均IFNγ斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)/百萬(wàn)脾細(xì)胞±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。
雄性恒河獼猴用BCG真皮內(nèi)或通過氣霧送遞免疫，并用5×108PFU的重組MVA95A加強(qiáng)2次，用5×108PFU的FP9Ag85A加強(qiáng)2次。對(duì)Ag85A的應(yīng)答是在IFNγ ELISPOT測(cè)定法的外周血單核細(xì)胞(PBMC)中測(cè)定的，其中使用純化的Ag85A，重組Ag85B(其與Ag85A共有約80％的同源性)或源于結(jié)核分枝桿菌的純化蛋白(PPD)。曲線(圖10)表示單一動(dòng)物的IFNγ斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)/百萬(wàn)PBMC。
實(shí)施例12-痘病毒是一種有效的加強(qiáng)劑3名健康的未患過瘧疾的人類志愿者是如下免疫的第0周肌內(nèi)給予2mg DNA-ME.TRAP，第3周(第21天)再次肌內(nèi)給予2mg相同疫苗，第7周真皮內(nèi)給予1×10e8 pfu的FP9-ME.TRAP，第11周真皮內(nèi)給予1.5×10e8 pfu的MVA-ME.TRAP。
在PBMC中，通過ELISPOT測(cè)量的平均應(yīng)答在圖11中表示。
ME應(yīng)答主要針對(duì)CD8T細(xì)胞表位。T996應(yīng)答是TRAP的同源株，3D7應(yīng)答于TRAP的異源株。
很清楚的是，F(xiàn)P9-ME.TRAP可加強(qiáng)DNA激發(fā)的T細(xì)胞應(yīng)答。還很清楚的是，用MVA-ME.TRAP進(jìn)一步免疫可提高由DDF方案誘導(dǎo)的應(yīng)答。
因此，證實(shí)了FP9可有效加強(qiáng)人靈長(zhǎng)目動(dòng)物中的T細(xì)胞應(yīng)答。
用DNA、然后用FP9、然后用MVA進(jìn)行的三聯(lián)免疫方案的有效性還可在人靈長(zhǎng)目動(dòng)物中證實(shí)(DDFM)。
實(shí)施例13痘病毒是一種有效的激發(fā)劑未患過瘧疾的人類志愿者是如下用FP9-MVA激發(fā)-加強(qiáng)方案免疫的在本實(shí)施例中有2組，1組5名接種者，1組12名接種者。
FFM方案第0天，以1×10e8 pfu真皮內(nèi)給予FP9-ME.TRAP，第21天，以1×10e8 pfu真皮內(nèi)給予FP9-ME.TRAP，第49天，以1.5×10e8 pfu真皮內(nèi)給予MVA-ME.TRAP。
所有志愿者，連同未接種的對(duì)照組，都是通過用5只傳染性蚊子叮咬而用3D7株惡性瘧原蟲子孢子侵襲的。
在第一組中，2/5FFM接種者完全未受感染。這種保護(hù)水平明顯不同于以相同方式，在不同時(shí)間點(diǎn)侵襲的24名未接種對(duì)照者(P＜0.05，卡方檢驗(yàn))；所有對(duì)照者都被感染。
有2名受到保護(hù)的接種者在6個(gè)月后再次受到侵襲，1名仍然受到完全保護(hù)。
第2組中的11名志愿者同樣受到侵襲，這些接種者與對(duì)照接種者相比，明顯更晚地發(fā)展成顯著的瘧疾寄生蟲血癥(P＜0.05)。
圖12表示經(jīng)計(jì)算，由于接種導(dǎo)致的、肝臟期寄生蟲的減少，假設(shè)寄生蟲每48小時(shí)在外周血中增殖8倍。“晚期FFM”組表示2名再次受到侵襲者(如上文)和接種后第5個(gè)月，首次受到侵襲的另一志愿者(FFM組是在最后一次接種13-50天后受侵襲的)。
還給出了僅用FP9進(jìn)行單一激發(fā)免疫(“FM”)的4名接種者的結(jié)果。顯著性水平是根據(jù)接種者和未接種的侵襲對(duì)照組中，時(shí)間對(duì)寄生蟲血癥的對(duì)數(shù)秩Kaplan-Meier分析計(jì)算的。
總的說來，與對(duì)照組相比，在FFM接種者中可觀察到非常顯著的保護(hù)(P＜0.01)。
用DDMF方案(以4周的間隔兩次肌內(nèi)給予2mg劑量的DNA，接著在3-4周后，給予1.5×10e8 MVA ME.TRAP，然后在3-4周后，給予1.0×10e8 FP9-ME.TRAP)免疫的4名個(gè)體也顯著受到保護(hù)(P＜0.05)。
因此，證實(shí)了禽痘，如FP9在本發(fā)明的方法中是一種有效的激發(fā)劑和一種有效的加強(qiáng)劑。
實(shí)施例14更高劑量免疫方案的臨床試驗(yàn)更高劑量的激發(fā)-加強(qiáng)方案是在長(zhǎng)期與瘧疾感染接觸的岡比亞農(nóng)村成年男性中研究的。
28名被試者按照下面其中一種方案用ME.TRAP疫苗免疫(14名被試者/組/法)1)DDM方案以3-4周的間隔，給予DNA(2mg肌內(nèi))2次(DDM)，或3次(DDDM)，接著是真皮內(nèi)給予MVA-ME.TRAP 1.5×10e8(DDM組-在圖13中，DDM和DDDM接種者亞組合并，這是因?yàn)樗麄冎g沒有顯著性差異。)2)FFM方案以3周的間隔給予FP9(1×10e8真皮內(nèi))2次，接著是真皮內(nèi)給予1.5×10e8的MVA-ME.TRAP(FFM組)。
數(shù)據(jù)在圖13中給出。
在接種之前，兩組都表現(xiàn)出對(duì)瘧疾ME.TRAP插入物的T細(xì)胞應(yīng)答。FP9免疫較之DNA免疫對(duì)這些應(yīng)答的加強(qiáng)作用更高(比較DD+7天與FF+7天)可表明，F(xiàn)P9免疫可加強(qiáng)在人靈長(zhǎng)目動(dòng)物中天然激發(fā)的T細(xì)胞應(yīng)答。
DDM和FFM方案可在這些天然與瘧疾接觸的志愿被試者中誘導(dǎo)高水平(＞250/百萬(wàn))的T細(xì)胞應(yīng)答。
還可證實(shí)激發(fā)-加強(qiáng)方案(DDM和FFM)較單獨(dú)的FP9和MVA而言，免疫原性更強(qiáng)，盡管這些個(gè)體中的T細(xì)胞應(yīng)答是由天然瘧疾感染所激發(fā)的。
還證實(shí)了，誘導(dǎo)的應(yīng)答表現(xiàn)出良好的瘧疾株交叉反應(yīng)性-對(duì)疫苗株(T996)和TRAP的3D7非疫苗株的應(yīng)答強(qiáng)度是可以比較的。
可比較的免疫原性是在用相同F(xiàn)FM方案免疫的11名人靈長(zhǎng)目志愿者中觀察到的(見圖14)。
因此，證實(shí)了按照本發(fā)明對(duì)被試者進(jìn)行治療可在所述被試者中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。
實(shí)施例15在靈長(zhǎng)目動(dòng)物中對(duì)TB抗原進(jìn)行免疫為了評(píng)估激發(fā)-加強(qiáng)免疫法對(duì)結(jié)核的保護(hù)功效，使用重組FP9作為加強(qiáng)劑，在靈長(zhǎng)目動(dòng)物中進(jìn)行下列研究。
在本實(shí)施例中，所述靈長(zhǎng)目動(dòng)物是獼猴，天然對(duì)結(jié)核分枝桿菌易感的動(dòng)物。
在荷蘭的生物醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)目動(dòng)物中心(BPRC)，將3只獼猴用BCG真皮內(nèi)免疫，8周后，真皮內(nèi)給予MVA-Ag85A，4周后，真皮內(nèi)給予FP9-Ag85A。平行的其它3只獼猴是用單獨(dú)的BCG免疫的。最后一次免疫后4周，用大劑量(1000CFU)的結(jié)核分枝桿菌氣管內(nèi)侵襲所有這些獼猴連同未免疫的獼猴。觀察動(dòng)物28周，進(jìn)行免疫測(cè)定，在侵襲后第28周，處死動(dòng)物，進(jìn)行尸體解剖。
在尸體解剖時(shí)，所有未免疫的獼猴都具有肉眼可見的結(jié)核跡象；1/3BCG免疫的獼猴沒有肉眼可見的結(jié)核跡象；2/3BCG-MVA-FP9免疫的獼猴沒有結(jié)核的跡象。
使用PPD和ESAT-6作為分枝桿菌抗原侵襲后的ELISPOT測(cè)定表明，與侵襲對(duì)照組相比，BCG-MVA-FP9免疫動(dòng)物中的應(yīng)答大大降低。
使用PPD作為分枝桿菌抗原侵襲后的干擾素γELISA測(cè)定表明，與單獨(dú)用BCG或單獨(dú)用佐劑免疫的侵襲對(duì)照組(對(duì)照動(dòng)物)相比，BCG-MVA-FP9免疫動(dòng)物中的應(yīng)答大大降低，從而支持了這些BCG-MVA-FP9激發(fā)-加強(qiáng)的獼猴很少會(huì)感染肺結(jié)核的觀點(diǎn)(圖18)。該圖表示氣管內(nèi)給予結(jié)核分枝桿菌，從而侵襲獼猴后的不同周，對(duì)PPD的平均干擾素γ應(yīng)答。BCG-MVA-FP9動(dòng)物具有對(duì)PPD最低的免疫應(yīng)答，表明在侵襲后最少有結(jié)核分枝桿菌復(fù)制，并因此受到最高度保護(hù)。相似的數(shù)據(jù)是用ESAT6作為抗原獲得的。
因此證實(shí)了，按照本發(fā)明激發(fā)-加強(qiáng)免疫的靈長(zhǎng)目動(dòng)物，如獼猴極少會(huì)感染肺結(jié)核。
實(shí)施例16在激發(fā)和加強(qiáng)CD8T細(xì)胞應(yīng)答方面，F(xiàn)P9株較之Webster′sFPV-M更有效目的確定在使用MVAPbCSP的激發(fā)/加強(qiáng)免疫方案中，當(dāng)通過臨床相關(guān)途徑給藥時(shí)，與FPV-MPbCSP相比，F(xiàn)P9PbCSP是否能提高抗原-特異性T細(xì)胞應(yīng)答方法雌性BALB/c小鼠(6-8周齡)用FPPbCSP，F(xiàn)PV-MPbCSP或MVAPbCSP真皮內(nèi)(i.d.)免疫，2周后以相似方式加強(qiáng)。將病毒在沒有熱原的PBS中稀釋到2×107PFU/ml，按照專利申請(qǐng)實(shí)施例1和2進(jìn)行表征，給小鼠的每只耳朵真皮內(nèi)雙側(cè)注射25μl。免疫后14天，通過頸部脫臼處死小鼠，按照下面所述，利用IFNγ測(cè)定對(duì)PbCSP的Pb9表位和源于β-半乳糖苷酶的對(duì)照表位激發(fā)的T細(xì)胞應(yīng)答鼠IFNγ ELISPOT方案A.材料IFNγ ELISpot ALP試劑盒Mabteeh 3321-2A600μg抗-IFN-γ純化Mab AN1850μg抗-IFN-γ生物素化Mab R46A250μl鏈霉抗生物素-堿性磷酸酶完全的α-MEM培養(yǎng)基500ml MEMα-修飾Sigma M-452650ml FCS[10％]Sigma F-24425ml青霉素/鏈霉素[100U青霉素，100μg鏈霉素] Sigma P-078110ml L-谷氨酰胺[4mM]Sigma G-7513
500μl 2-巰基乙醇[50μm]Gibco BRL 31350-010ACK緩沖液8.29g NH4Cl
(Sigma A-4514)1g KHCO3[1mM](Sigma P-9144)37.2mg Na2EDTA(Sigma ED2SS)800ml milli-Q水用HCl(Sigma S-7653)調(diào)節(jié)pH到7.2-7.4用水補(bǔ)足至1000ml，高壓滅菌顯色緩沖液BioRad AP偶聯(lián)底物試劑盒(170-6432)對(duì)于一個(gè)平板而言5ml去離子水200μl 25x緩沖液50μl試劑A50μl試劑B混合后立即使用方案1.平板的制備1.1涂覆平板用大鼠抗-小鼠IFNγ(Mab AN18)抗體涂覆MAIP多篩選平板。在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS；Sigma P-3813)中稀釋到10μg/ml，向MAIP平板的每個(gè)孔加入50μl。在濕潤(rùn)的室中，4℃過夜培養(yǎng)。
1.2封閉平板除去涂覆抗體，用多道吸量管，每孔150μl無菌PBS(Sigma P-3813)清洗平板1次。除去PBS，每孔加入100μl的完全α-MEM培養(yǎng)基，室溫培養(yǎng)1小時(shí)以上。重要的是在此階段保持平板無菌。
2.脾細(xì)胞的制備2.1.在陪替氏皿的70μm細(xì)胞過濾器(Falcon 352350)中，用10ml注射器的活塞，將單個(gè)脾臟在2ml PBS中碾碎，加入5ml PBS，通過吸量使脾細(xì)胞混懸，然后轉(zhuǎn)移到50ml試管中。用10ml PBS清洗細(xì)胞過濾器和培養(yǎng)皿，并加入到50ml試管中。1500rpm離心5分鐘。
2.2.除去上清液，輕敲試管使細(xì)胞重懸浮，并加入5ml ACK緩沖液，翻轉(zhuǎn)混合。室溫培養(yǎng)不超過5分鐘。加入25ml PBS，翻轉(zhuǎn)混合，1500rpm離心5分鐘。
2.3.除去上清液，輕敲試管使沉淀重懸浮，加入10ml PBS，旋轉(zhuǎn)。
在0.4％臺(tái)盼藍(lán)溶液(Sgima T-8154)中110稀釋，用改進(jìn)的Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。等分Elispot所需的量，1500rpm離心5分鐘，通過在適當(dāng)體積的完全α-MEM培養(yǎng)基中旋轉(zhuǎn)而重懸浮，達(dá)到1千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml的濃度。
3.平板設(shè)置50μl 50μl50μl←→→→←→→→←→→→1 2 3 4 5 67 8 9 10 11 12
C C C注意平板設(shè)置可根據(jù)特定實(shí)驗(yàn)的需要，由操作者選擇。
3.1.除去平板中的封閉培養(yǎng)基，加入50μl完全αMEM培養(yǎng)基到第3，4，7，8，11&12列中。
3.2.一式兩份向第2，6和10列中加入150μl脾細(xì)胞(直到12份樣品/平板)3.3.從第2，6和10列中取50μl脾細(xì)胞，并分別轉(zhuǎn)移到第1，5和9列中這些是陰性對(duì)照孔3.4.通過從第2，6和10列取50μl加入到第3，7和11列中混合孔而將每份樣品連續(xù)稀釋，然后將50μl轉(zhuǎn)移到第4，9和12列中。
稀釋混合最后一列后，棄去50μl。
3.5.向完全α-MEM培養(yǎng)基中1千萬(wàn)/ml的幼稚脾細(xì)胞中加入所需終濃度兩倍的試驗(yàn)肽和對(duì)照肽。向第1，5和9列中加入50μl對(duì)照肽和靶細(xì)胞。向其余列中加入50μl試驗(yàn)肽和靶細(xì)胞。
3.6.37℃培養(yǎng)平板18-20小時(shí)。
4.使測(cè)定顯色4.1.用含有0.05％Tween 20的PBS(SigmaP1379)清洗平板2次，用蒸餾水清洗1次，用PBST清洗2次。
4.2.以50μl/孔加入在PBS中稀釋為1μg/ml的生物素化大鼠抗小鼠干擾素γ。室溫培養(yǎng)2小時(shí)。
4.3.用PBST清洗平板4次，然后加入在PBS中稀釋為1μg/ml的50μl鏈霉抗生物素堿性磷酸酶(Mabtech)。室溫培養(yǎng)1小時(shí)。
4.4.用PBST清洗平板4次，以50μl/孔加入顯色緩沖液。
4.5.室溫培養(yǎng)，直到斑點(diǎn)顯色(大約10分鐘)。用自來水清洗平板孔，剝?nèi)ゲＡ芰系?，并在紙巾上干燥過夜。
結(jié)果結(jié)果是按照抗原-特異性IFNγ斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)/百萬(wàn)脾細(xì)胞(sfc/百萬(wàn))計(jì)算的。組間差異是使用Microsoft Excel 2000，通過T-檢驗(yàn)(假設(shè)兩份樣品具有相等變異)測(cè)定的。
與FPV-MPbCSP相比，當(dāng)使用FP9PbCSP作為激發(fā)(P＝0.002)或加強(qiáng)(P＝0.004)劑與MVAPbCSP結(jié)合使用時(shí)，可顯著提高對(duì)PbCSP的抗原-特異性T細(xì)胞應(yīng)答(圖15)。有趣地是，在已經(jīng)用FP9PbCSP激發(fā)并用MVAPbCSP加強(qiáng)的組之間沒有顯著性差異，反之亦然。
因此，證實(shí)了FP9PbCSP作為激發(fā)和/或加強(qiáng)劑比FPV-MPbCSP更有效，且與和重組MVA結(jié)合使用的激發(fā)或加強(qiáng)劑同等有效。
實(shí)施例17重組FP9可抗病毒疾病目的確定單獨(dú)用重組FP9的免疫，或激發(fā)/加強(qiáng)方案是否能激發(fā)對(duì)源于病毒和腫瘤抗原的CD4+和CD8+T細(xì)胞表位的T細(xì)胞應(yīng)答。
方法按照下面所述，合成編碼新多肽(ME1)的440bp的合成基因，其由源于淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)抗原和鼠腫瘤(P815和CT26)抗原的CD8+和CD4+限制性表位組成ME1模型表位串按照下面所述，在慢性感染(LCMV)和癌癥(P815/CT26)的鼠模型中，產(chǎn)生編碼腫瘤和病毒表位的T細(xì)胞表位串。
為了避免潛在的免疫競(jìng)爭(zhēng)，LCMV-來源的表位是H-2b-限制性的，癌癥表位是H-2d-限制性的。表位的順序在H-2d和H-2b間交替。
表位串的序列表示表位克隆位點(diǎn)Kozak M[GLNGPDIYKGVYQFKSVEFD][KAVYNFATCGI][LPYLGWLVF][FQPQNGQFI][GYCGLRGTGV][SGVENPGGYCL][SPSYAYHQF][YTVKYPNL][TPHPARIGL][CSANNSHHYI][SGEGWPYIACRTSIVGRAWE][DAPIYTNV][YPYDVPDYA]AA(終止信號(hào))氨基酸串MGLNGPDIYKGVYQFKSVEFDKAVYNFATCGILPYLGWLVFFQPQNGQFIGYCGLRGTGVSGVENPGGYCLSPSYAYHQFYTVKYPNLTPHPARIGLCSANNSHHYISGEGWPYIACRTSIVGRAWEDAPIYTNVYPYDVPDYAAA側(cè)翼核苷酸及氨基酸GGGCCCGCCGCCACCATGG...
MGLNGPDIYKGVYQFKSVEFDKAVYNFATCGIL
PYLGWLVFFQPQNGQFIGYCGLRGTGVSGVENPGGYCLSPSYAYHQFYTVKYPNLTPHPARIGLCSANNSHHYISGEGWPYIACRTSIVGRAWEDAPI...TAAGGCGCGCCYTNVYPYDVPDYAAA表位串不包括ApaI和AscI靶序列。
表位串不包括痘病毒早期基因轉(zhuǎn)錄終止序列，TTTTTNT。
載體制備將ME1表位串連接到DNA疫苗載體(PSG2)和痘病毒穿梭載體pEFL29中。接著，在確立方法后，將質(zhì)粒pEFL29.ME1重組到FP9的染色體中構(gòu)建FP9.ME1。
隨后，這種病毒通過在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中繁殖，并通過30％蔗糖墊離心而大量純化。病毒的滴度是在確立方法后，通過在CEF上滴定和X-gal染色而證實(shí)的。以1×107PFU/ml，將病毒混懸在沒有熱原的PBS中，用于進(jìn)行免疫。質(zhì)粒PSG2.ME1是用Qiagen Giga柱大量純化的，并以1mg/ml重懸浮在沒有熱原的PBS中。
雌性BALB/c(H-2d)C57BL/6(H-2b)小鼠(6-8周齡)是用PSG2.ME1或?qū)φ召|(zhì)粒pSG2.Mel3肌內(nèi)(im.)免疫的，所述對(duì)照質(zhì)粒包括不相關(guān)的表位串。病毒FP9.ME1和空白對(duì)照病毒FP9.EFL29是以1×106PFU的劑量靜脈內(nèi)(iv.)給藥到尾靜脈中的。免疫后兩周，給動(dòng)物加強(qiáng)。加強(qiáng)后14天，頸部脫臼處死小鼠，按照實(shí)施例16所述的IFNγ測(cè)定法測(cè)定對(duì)LCMV，P815，CT26和源于β-半乳糖苷酶的對(duì)照表位激發(fā)的T細(xì)胞應(yīng)答。
結(jié)果是以抗原特異性IFNγ斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)/百萬(wàn)脾細(xì)胞(sfc/百萬(wàn))計(jì)算的。組間差異是用Microsoft Excel 2000，通過斯氏T-檢驗(yàn)(假設(shè)兩個(gè)樣品具有相等的變異)和ANOVA測(cè)定的。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果為了避免病毒和腫瘤表位之間的競(jìng)爭(zhēng)，ME1編碼源于在H-2b單倍型小鼠中表征的LCMV抗原的表位，和源于在H-2d單倍型小鼠中表征的腫瘤抗原的那些。因此，F(xiàn)P9.ME1激發(fā)CD4+和CD8+ T-細(xì)胞表位的能力是按照表6所述，在BALB/c(H-2d)C57BL/6(H-2d)小鼠中測(cè)試的。
這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在表6中給出。
表6確定ME1多表位串的免疫原性的實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)1和2是平行進(jìn)行的。每組包括4只6-8周齡的雌性小鼠。疫苗是按照方法中所述給藥的，激發(fā)和加強(qiáng)間隔14-16天。T-細(xì)胞應(yīng)答是按照實(shí)施例16所述的IFNγ ELISPOT測(cè)定法，使用上述LCMV，腫瘤和模型表位測(cè)定的。結(jié)果與對(duì)LCMV和腫瘤來源的表位的累積應(yīng)答相關(guān)，其是以使用鼠瘧疾和肺結(jié)核模型的觀察結(jié)果為基礎(chǔ)的。
實(shí)施例18重組FP9可抗癌目的確定單獨(dú)用FP9.ME1免疫，或是用pSG2.ME1的激發(fā)/加強(qiáng)方案是否能夠在小鼠中激發(fā)對(duì)CT26腫瘤侵襲的保護(hù)性免疫應(yīng)答。因此，總體上證實(shí)了重組FP9可激發(fā)抗癌的抗原-特異性T細(xì)胞應(yīng)答。
方法如上所述，雌性BALB/c(H-2d)小鼠(6-8周齡)用pSG2.ME1，F(xiàn)P9.ME1，或?qū)φ諛?gòu)建體pSG2.Mel3和FP9.EFL29注射。免疫后2周，給動(dòng)物加強(qiáng)。加強(qiáng)14天后，如下通過用5×105個(gè)CT26腫瘤細(xì)胞皮下(sc.)左脅腹側(cè)注射而侵襲小鼠CT26腫瘤的皮下生長(zhǎng)某些實(shí)驗(yàn)問題最好使用皮下植入的、可測(cè)量的實(shí)體瘤來解決。CT26細(xì)胞可經(jīng)受這種實(shí)驗(yàn)方法。雖然常規(guī)的野生型CT26細(xì)胞在皮下間隙以側(cè)面擴(kuò)散的方式生長(zhǎng)，但高度可轉(zhuǎn)染的變體，CT26，生長(zhǎng)為更致密的腫瘤塊，可能與粘附性增加有關(guān)，產(chǎn)生更好的測(cè)量再現(xiàn)性。
材料CT26細(xì)胞含10％(w/v)FCS的完全DMEM培養(yǎng)基無菌PBSBALB/c小鼠，6-8周齡1-ml無菌一次性注射器16-G和25-G針測(cè)徑規(guī)計(jì)算細(xì)胞的其它試劑和設(shè)備1.在含有10％FCS的完全DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)CT26細(xì)胞2.采集細(xì)胞，通過室溫200Xg離心5分鐘而用PBS清洗2次3.計(jì)算細(xì)胞數(shù)，并以2×107個(gè)細(xì)胞/ml重懸浮在PBS中，將混懸液轉(zhuǎn)移到1-ml注射器中，然后將16-G針換成25-G針。
4.通過50μl/只小鼠的皮下注射而給BALB/c小鼠接種。
通過輕輕敲打并翻轉(zhuǎn)，確保在注射前，細(xì)胞均勻混懸在注射器中。
所給出的條件導(dǎo)致植入106個(gè)腫瘤細(xì)胞。已經(jīng)成功使用了2×105-1×107個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞濃度。
5.所述過程可由單個(gè)操作者快速完成。把小鼠放在左手中，用前兩個(gè)手指夾住頸部，用手掌和第四指夾住尾。右手拿注射器，用針頭刺穿小鼠左脅腹的皮膚。利用注射器和針頭的杠桿作用，將皮膚輕輕拉離小鼠的身體，以保證針尖在皮下間隙內(nèi)。然后排出50μl的體積。
一周至少給小鼠檢查兩次，檢查腫瘤的生長(zhǎng)，并評(píng)估一般的健康狀況。一旦腫瘤出現(xiàn)，使用測(cè)徑規(guī)測(cè)量并記錄最長(zhǎng)和最短的尺寸。
這兩次測(cè)量的平均值就是小鼠在該時(shí)間點(diǎn)的平均腫瘤直徑。
植入后1周，首先腫瘤是可以觸知的。測(cè)量應(yīng)當(dāng)在最近的0.5mm處進(jìn)行。
侵襲后，觀察小鼠腫瘤發(fā)展的跡象2周，然后處死并解剖。腫瘤大小是通過測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)度和寬度，然后取這些測(cè)量值的平均值而測(cè)定的。利用GraphPrism Instat進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，腫瘤發(fā)生率的差異是由Fishers Exact檢驗(yàn)測(cè)定的，腫瘤大小的差異是用T-檢驗(yàn)測(cè)定的(兩個(gè)樣品采用不等的變異)。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和預(yù)期結(jié)果CT26是源于BALB/c小鼠的結(jié)腸癌細(xì)胞系。皮下注射約1周后，CT26在BALB/c小鼠中形成實(shí)體瘤。ME1表位串包括由CT26腫瘤表達(dá)的、源于MuLV gp70被膜蛋白的保護(hù)性CD8+限制性表位(見上文)。因?yàn)槭褂胮SG2.Mel，然后是FP9.ME1的激發(fā)/加強(qiáng)免疫方案可提高對(duì)這種表位的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答(見上文)，因此我們認(rèn)為這種免疫方案可在BALB/c小鼠中激發(fā)對(duì)CT26侵襲的保護(hù)。表7給出結(jié)果。
表7腫瘤侵襲后，免疫BALB/c小鼠中的腫瘤發(fā)生率
每組12只BALB/c小鼠按照所示以14天的間隔進(jìn)行激發(fā)和加強(qiáng)。加強(qiáng)后14天，通過用CT26細(xì)胞在左脅腹皮下注射而對(duì)動(dòng)物進(jìn)行侵襲。觀察動(dòng)物2周，然后解剖，按照方法中所述，觀察腫瘤是否存在，并測(cè)定腫瘤大小。
該表以16中的免疫原性數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，給出腫瘤發(fā)生率。還預(yù)期了每組平均腫瘤大小之間的差異，但沒有在表中給出。
實(shí)施例19重組FP9可抗淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)目的確定單獨(dú)用FP9.ME1的免疫，或使用PSG2.ME1的激發(fā)/加強(qiáng)方案，是否能在小鼠中激發(fā)對(duì)LCMV侵襲的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
這證實(shí)了，當(dāng)用于本發(fā)明中時(shí)，重組FP9可激發(fā)抗原-特異性CD4+和CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答，從而抗病毒感染。
方法雌性C57BL/6(H-2b)小鼠(6-8周齡)是按上面所述用PSG2.ME1，F(xiàn)P9.ME1，或?qū)φ諛?gòu)建體pSG2.Mel3和FP9.EFL29注射的。免疫2周后，給動(dòng)物加強(qiáng)。加強(qiáng)14天后，每組6只動(dòng)物通過腹膜內(nèi)(ip.)注射2×105PFU的LCMV Armstrong(輕度感染)而被侵襲，還有6只動(dòng)物通過靜脈內(nèi)注射2×106PFU的LCMV Clone 13(嚴(yán)重感染)而被侵襲。
用LCMV Armstrong侵襲的動(dòng)物在侵襲后3天處死，用LCMV Clone13侵襲的那些在侵襲后7天處死。
受侵襲動(dòng)物脾臟中的病毒負(fù)載量是如下測(cè)定的LCMV滴度的噬斑測(cè)定法1.6孔平板每個(gè)孔的3ml培養(yǎng)基中含有3×105Vero細(xì)胞，在5％CO2下，37℃過夜培養(yǎng)，直到它們形成匯合單層。
2.以1∶100開始(10μl樣品+1ml培養(yǎng)基)，在冰上連續(xù)稀釋試驗(yàn)樣品，隨后得到10倍稀釋物(100μl+900μl培養(yǎng)基)。
3.除去Vero細(xì)胞中的培養(yǎng)基(小心不要損害單層)，向每個(gè)孔中加入500μl稀釋的試驗(yàn)樣品。每次測(cè)定包括至少1個(gè)孔，其中只加入培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。在5％CO2下，37℃培養(yǎng)平板1小時(shí)，從而使病毒感染。
4.用3-4ml 1％瓊脂糖水溶液及含有10％FB5的2×199培養(yǎng)基的1∶1混合物覆蓋每個(gè)孔。用箔片包裹平板，并在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)6天。
5.固定并染色。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析是用Excel 2000進(jìn)行的，感染發(fā)生率的差異是用卡方檢驗(yàn)測(cè)定的，病毒負(fù)載差異是用斯氏T-檢驗(yàn)測(cè)定的(假設(shè)兩個(gè)樣品具有相等變異)。雙重P值是在所有情況下測(cè)定的。
結(jié)果LCMV是一種熟知的病毒，可引起小鼠的慢性和急性感染。Armstrong株可引起輕度，可自我消除的感染，而Clone13株引起可發(fā)展成慢性感染的嚴(yán)重感染。ME1表位串被設(shè)計(jì)包括兩個(gè)CD4+表位和若干源于LCMV的CD8+限制性表位(見上文)，它們中的一些已經(jīng)鑒定為可以抗LCMV感染。因?yàn)槭褂肍P9.ME1進(jìn)行激發(fā)/加強(qiáng)免疫可顯著提高對(duì)ME1中LCMV表位的T細(xì)胞應(yīng)答(圖17)，因此這種免疫方案對(duì)LCMV的Armstrong和Clone13株的侵襲都具有保護(hù)功效。表8給出結(jié)果。
表8C57BL/6小鼠中的LCMV侵襲
每組12只C57BL/6小鼠是以14天的間隔激發(fā)和加強(qiáng)的。加強(qiáng)后14天，按照方法中所述，用LCMV Armstrong(輕度感染)或LCMV Clone13(嚴(yán)重感染)侵襲每組6只動(dòng)物。該測(cè)定法的檢測(cè)限是1000pfu/器官(Log10 3.00)。A，B和C組的病毒負(fù)載是以每組6只動(dòng)物的結(jié)果為基礎(chǔ)的。D，E和F的病毒負(fù)載是以圖17中的免疫原性結(jié)果為基礎(chǔ)的。
圖15表示用FP9PbCSP，F(xiàn)PV-MPbCSP和MVAPbCSP進(jìn)行異源激發(fā)/加強(qiáng)免疫后的抗原-特異性免疫應(yīng)答。在BALB/c小鼠的耳朵中，用FP9PbCSP(FP9)，F(xiàn)PV-MPbCSP(FPV-M)，或MVAPbCSP雙側(cè)真皮內(nèi)免疫，14天后以相似方式異源加強(qiáng)。加強(qiáng)免疫后14天，利用INFγ ELISPOT測(cè)定法，在脾細(xì)胞中測(cè)定對(duì)PbCSP的Pb9表位和源于β-半乳糖苷酶的對(duì)照表位激發(fā)的T細(xì)胞應(yīng)答。柱形表示每組4只小鼠的平均抗原特異性INFγsfc/百萬(wàn)脾細(xì)胞±1 SD。P值是用Microsoft Excel 2000，通過斯氏T-檢驗(yàn)測(cè)定的，其中假設(shè)相等變異。
實(shí)施例20Websters’減毒禽痘不同于FP9在本實(shí)施例中，證實(shí)了與現(xiàn)有禽痘載體相比，F(xiàn)P9的獨(dú)特性質(zhì)。FP9的遺傳組成是按照上面所述測(cè)定的，并與現(xiàn)有的痘載體‘Websters’進(jìn)行了比較。數(shù)據(jù)在表9中給出。
缺失相對(duì)于有毒力的US FPV序列，在FP9中觀察到了25處缺失(FPVUS；Afonso等，2000)。這些之中，在US和歐洲譜系之間有6處不同，且在傳代(伴隨減毒)過程中又出現(xiàn)了19處，最終產(chǎn)生FP9。
在那些19處傳代-特異性缺失部位中，有15個(gè)已經(jīng)在Websters(FPV-M)中檢測(cè)，且所有都表現(xiàn)出與FPV US，而不是與FP9相同的序列。
插入同樣，15處插入也可將FP9與FPV US區(qū)分開來。這些之中，只有5處在傳代和減毒過程中發(fā)生。
這5處傳代-特異性插入基因座之一已經(jīng)在Websters中檢查，且它顯示出與FPV US，而不是與FP9相同的序列。
堿基取代77個(gè)單一堿基取代可將FP9與FPV US區(qū)分開來。這些之中，有25處出現(xiàn)在傳代和減毒過程中。
這25處傳代-特異性取代位點(diǎn)中的11處已經(jīng)在Websters中檢查且，在所有情況下，它們具有與FPV US，而不是與FP9相同的序列。另一FP9突變，其也可在HP1中找到，并因此是一種譜系-特異性突變體，在Websters中也與FPV US相同。
因此，它顯示出Websters減毒疫苗在遺傳學(xué)方面明顯不同于FP9。
實(shí)施例20，表9
實(shí)施例21重組FP9可激發(fā)對(duì)病毒和腫瘤的表位的CD4和CD8 T細(xì)胞應(yīng)答目的除實(shí)施例17外，本實(shí)施例進(jìn)一步確定單獨(dú)用重組FP9的免疫，或激發(fā)/加強(qiáng)方案是否能夠激發(fā)對(duì)病毒和腫瘤抗原的CD4+和CD8+T細(xì)胞表位T細(xì)胞應(yīng)答。
方法合成編碼新多肽(ME1)的440bp的合成基因，其由源于淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)抗原和鼠腫瘤(P815’和CT26)抗原的CD8+和CD4+限制性表位組成(見上文)。將ME1連接到DNA疫苗載體(pSG2)和禽痘穿梭載體pEFL29中。接著，在確立方法后，將質(zhì)粒pEFL29.ME1重組到FP9的染色體中，從而構(gòu)建FP9.ME1。隨后，這種病毒通過在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中繁殖，并通過30％蔗糖墊離心而被大量純化。病毒的滴度是在確立方法之后，通過在CEF上滴定和X-gal染色而證實(shí)的。以1×107PFU/ml，將病毒混懸在沒有熱原的PBS中，進(jìn)行制備以用于免疫。質(zhì)粒PSG2.ME1是用Qiagen Giga柱大量純化的，并以1mg/ml重懸浮在沒有熱原的PBS中。
雌性BALB/c(H-2d)或C57BL/6(H-2b)小鼠(6-8周齡)是用50μg的pSG2.ME1或含有不相關(guān)的表位串的對(duì)照質(zhì)粒pSG2.Mel3肌內(nèi)(im.)免疫的。病毒FP9.ME1和空白對(duì)照病毒FP9.EFL29是以1×106PFU的劑量靜脈內(nèi)(iv.)給藥到尾靜脈中的。免疫14-15天后，給動(dòng)物加強(qiáng)。加強(qiáng)后14-15天，頸部脫臼處死小鼠，并按照上面所述，利用IFNγ測(cè)定法確定對(duì)LCMV，P815，CT26和源于β-半乳糖苷酶的對(duì)照表位的T細(xì)胞應(yīng)答。結(jié)果是以抗原特異性IFNγ斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)/百萬(wàn)脾細(xì)胞(sfc/百萬(wàn))計(jì)算的。組間差異是用Microsoft Excel 2000，通過斯氏T-檢驗(yàn)(假設(shè)兩個(gè)樣品具有不等變異)測(cè)定的。單側(cè)P值是在所有情況下給出的。
結(jié)果為了避免病毒和腫瘤表位間的競(jìng)爭(zhēng)，ME1編碼在H-2b單倍型小鼠中表征的LCMV抗原的表位，和在H-2d單倍型小鼠中表征的腫瘤抗原的那些表位(Appendix II)。因此，F(xiàn)P9.ME1激發(fā)免疫應(yīng)答的能力是在BALB/c(H-2d)和C57BL/6(H-2b)小鼠中檢測(cè)的。
用pSG2.ME1和/或FP9.ME1對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫可激發(fā)對(duì)腫瘤表位(H-2d)的分泌INFγ的T細(xì)胞應(yīng)答(圖16)，但不能激發(fā)對(duì)LCMV表位(H-2b)的T細(xì)胞應(yīng)答。在使用pSG2.ME1/FP9.ME1進(jìn)行異源激發(fā)/加強(qiáng)免疫后，對(duì)腫瘤表位激發(fā)的分泌INFγ的T細(xì)胞應(yīng)答的總頻率明顯(P＜0.004)高于其它異源或同源免疫方案(圖16)。其它免疫方案可激發(fā)較使用對(duì)照構(gòu)建體進(jìn)行免疫更高的T細(xì)胞應(yīng)答，但彼此之間沒有顯著性差異(P＞0.05)。重要的是，使用pSG2.ME1/FP9.ME1進(jìn)行的激發(fā)/加強(qiáng)免疫可對(duì)CT26的免疫顯性表位，P815的MSR表位，以及β-半乳糖苷酶的模型Ld-限制性表位的顯著T細(xì)胞應(yīng)答。在這些表位之中，對(duì)CT26表位的應(yīng)答最顯著，并超過了本實(shí)驗(yàn)所用INFγ ELISPOT測(cè)定法的檢測(cè)極限(2000sfc/百萬(wàn))。這些結(jié)果表明，使用pSG2.ME1/FP9.Mel進(jìn)行的激發(fā)/加強(qiáng)免疫很可能在BALB/c小鼠中激發(fā)對(duì)CT26結(jié)腸癌的保護(hù)性免疫應(yīng)答(如上文)。
使用pSG2.ME1和/或FP9.ME1對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行免疫可激發(fā)對(duì)LCMV表位(H-2b)的分泌INFγ的T細(xì)胞應(yīng)答，但不能激發(fā)對(duì)腫瘤表位(H-2b)的T細(xì)胞應(yīng)答(圖17)。通過使用pSG2.ME1/FP9.Mel進(jìn)行的激發(fā)/加強(qiáng)免疫對(duì)LCMV表位激發(fā)的分泌INFγ的T細(xì)胞應(yīng)答總頻率明顯高于單獨(dú)使用FP9.ME1(P＝0.003)或pSG2.ME1(P＝0.016)進(jìn)行同源免疫所激發(fā)的。有趣的是，與單獨(dú)使用pSG2.ME1和FP9.ME1的同源免疫方案相比，使用pSG2.ME1和FP9.ME1進(jìn)行的異源激發(fā)/加強(qiáng)免疫方案可大大提高對(duì)以顯性和亞顯性為特征的CD8+表位的免疫應(yīng)答，和由CD4+T細(xì)胞識(shí)別的表位的免疫應(yīng)答。因此，這種激發(fā)/加強(qiáng)免疫方案與同源激發(fā)/加強(qiáng)免疫方案相比，對(duì)C57BL/6小鼠的LCMV感染可能更有效(見上文)。
上面說明書中提高的所有公開出版物都引入此處作為參考。在不背離本發(fā)明范圍和精神的前提下，本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的各種改進(jìn)和變化對(duì)于本領(lǐng)域那些技術(shù)人員是顯而易見的。雖然已經(jīng)結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不應(yīng)被限制到這種具體的實(shí)施方案。事實(shí)上，對(duì)于化學(xué)，生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的那些技術(shù)人員顯而易見的、進(jìn)行本發(fā)明的所述方法的各種改進(jìn)也落在下列權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
序列表<110>埃西斯創(chuàng)新有限公司<120>疫苗<130>P012506WO WJR<140>PCT/GB2002/005411<141>2002-11-29<150>GB0128733.3<151>2001-11-30<150>US60/334649<151>2001-11-30<160>22<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>266145<212>DNA
<213>禽痘病毒<400>1accctcatct tacgatgagt atttatatag taaaaaaaat gtataaacag taccttccaa 60aaccctaata tacacattct tttacccctt aatttgttaa ggtgtaaaat accccctatt 120aaaatatata ttattgtttt aataaaaaaa accatacggt tttacataaa ataatactat 180atctaatttc cttccggaaa atattttata aagctaccca acgttagcga aaaacttttt 240tatcgagagc tcgagttata gaaaaagttt ttatcgagat ttcgaaaagc ttttttatcg 300agagctcgag ttatagaaaa acttttttat cgagagctag agttatagaa aaagttttta 360tcgagatttc gaaaagcttt tttatcgaga gctcgagtta tagaaaaact tttttatcga 420gagctcgagt tatagaaaaa cttttttatc gagatttcga aaagcttttt tttatcgaga 480gctcgagtta tagaaaaact ttttatcgag agctcgagtt atagaaaaac ttttttatcg 540agagctcgag ttatagaaaa agtttttatc gagatttcga aaagcttttt tatcgagagc 600tcgagttata gaaaaacttt tttatcgaga gctcgagtta tagaaaaagt ttttatcgag 660atttcgaaaa gcttttttat cgagagctcg agttatagaa aaactttttt atcgagagct 720cgagttatag aaaaagtttt tatcgagatt tcgaaaagct ttttttatcg agagctcgag 780ttatagaaaa agttttttat cgagagctcg agttatagaa aaactttttt atcgagagct 840cgagttatag aaaaactttt ttatcgagag ctcgagttat agaaaaactt ttttatcgag 900agctcgagtt atagaaaaac ttttttatcg agagctagag ttatagaaaa agtttttatc 960gagatttcga aaagcttttt tatcgagagc tcgagttata gaaaaacttt tttatcgaga1020gctcgagtta tagaaaaact tttttatcga gatttcgaaa agcttttttt tatcgagagc1080tcgagttata gaaaaagttt ttatcgagat ttcgaaaagc tttttttatc gagagctcga1140gttatagaaa aagtttttta tcgagagctc gagttataga aaaacttttt tatcgagagc1200tcgagttata gaaaaacttt tttatcgaga gctcgagtta tagaaaaact tttttatcga1260gagctcgagt tatagaaaaa cttttttatc gagagctaga gttatagaaa aagtttttat1320
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<211>98<212>DNA<213>禽痘病毒<400>2agagatcccg ccagacgggg aacctgggtc aacgactggt gcgaagatct ctgcgtatgg60atatggtctc cgtgttgtta cgtcaagaga tgtattcg98<210>3<211>17<212>DNA<213>禽痘病毒<400>3actggtgcga agatctc 17<210>4<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>表位<400>4Leu Pro Tyr Leu Gly Trp Leu Val Phe1 5<210>5
<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>表位<400>5Gly Tyr Cys Gly Leu Arg Gly Thr Gly Val1 5 10<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>表位<400>6Ser Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe1 5<210>7<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>表位<400>7Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Cys Gly Ile1 5 10<210>8<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>表位<400>8Phe Gln Pro Gln Asn Gly Gln Phe Ile1 5<210>9<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>表位<400>9Ser Gly Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Cys Leu1 5 10<210>10
<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>表位<400>10TyrThr Val Lys Tyr Pro Asn Leu1 5<210>11<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>表位<400>11Cys Ser Ala Asn Asn Ser His His Tyr Ile1 5 10<210>12<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>表位<400>12Gly Leu Asn Gly Pro Asp Ile Tyr Lys Gly Val Tyr Gln Phe Lys Ser1 5 10 15Val Glu Phe Asp20<210>13<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>表位<400>13Ser Gly Glu Gly Trp Pro Tyr Ile Ala Cys Arg Thr Ser Ile Val Gly1 5 10 15Arg Ala Trp Glu20<210>14<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>表位<400>14
Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val1 5<210>15<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>表位<400>15Thr Pro His Pro Ala Arg Ile Gly Leu1 5<210>16<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>表位<400>16Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 5<210>17<211>146<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>表位串序列<400>17Met Gly Leu Asn Gly Pro Asp Ile Tyr Lys Gly Val Tyr Gln Phe Lys1 5 10 15Ser Val Glu Phe Asp Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Cys Gly Ile20 25 30Leu Pro Tyr Leu Gly Trp Leu Val Phe Phe Gln Pro Gln Asn Gly Gln35 40 45Phe Ile Gly Tyr Cys Gly Leu Arg Gly Thr Gly Val Ser Gly Val Glu50 55 60Asn Pro Gly Gly Tyr Cys Leu Ser Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe65 70 75 80Tyr Thr Val Lys Tyr Pro Asn Leu Thr Pro His Pro Ala Arg Ile Gly85 90 95Leu Cys Ser Ala Asn Asn Ser His His Tyr Ile Ser Gly Glu Gly Trp100 105 110Pro Tyr Ile Ala Cys Arg Thr Ser Ile Val Gly Arg Ala Trp Glu Asp115 120 125Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala130 135 140Ala Ala145<210>18<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>側(cè)翼序列<400>18gggcccgccg ccaccatgg19<210>19<211>131<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>串序列<400>19Met Gly Leu Asn Gly Pro Asp Ile Tyr Lys Gly Val Tyr Gln Phe Lys1 5 10 15Ser Val Glu Phe Asp Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Cys Gly Ile20 25 30Leu Pro Tyr Leu Gly Trp Leu Val Phe Phe Gln Pro Gln Asn Gly Gln35 40 45Phe Ile Gly Tyr Cys Gly Leu Arg Gly Thr Gly Val Ser Gly Val Glu50 55 60Asn Pro Gly Gly Tyr Cys Leu Ser Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe65 70 75 80Tyr Thr Val Lys Tyr Pro Asn Leu Thr Pro His Pro Ala Arg Ile Gly85 90 95Leu Cys Ser Ala Asn Asn Ser His His Tyr Ile Ser Gly Glu Gly Trp100 105 110Pro Tyr Ile Ala Cys Arg Thr Ser Ile Val Gly Arg Ala Trp Glu Asp115 120 125
Ala Pro Ile130<210>20<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>側(cè)翼序列<400>20taaggcgcgc c 11<210>21<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>側(cè)翼序列<400>21Tyr Thr Asn Val Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ala Ala1 5 10 15<210>22<211>7<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>終止序列<220>
<221>misc_特征<222>(6)..(6)<223>N是任何堿基<400>22tttttnt 權(quán)利要求
1.一種治療和/或預(yù)防被試者痰病的方法，包括以任一順序給予被試者(i)含第一非復(fù)制型病毒載體的第一組合物(ii)含第二非復(fù)制型病毒載體的第二組合物的步驟，其中至少一種組合物含有源于禽痘病毒的痘病毒載體。
2.一種治療和/或預(yù)防被試者疾病的方法，包括給予被試者(i)含DNA疫苗的第一組合物(ii)含第一非復(fù)制型病毒載體的第二組合物(iii)含第二非復(fù)制型病毒載體的第三組合物的步驟，其中至少一種組合物含有源于禽痘病毒的痘病毒載體。
3.一種治療和/或預(yù)防被試者疾病的方法，包括給予被試者(i)含第一非復(fù)制型病毒載體的第一組合物(ii)含第二非復(fù)制型病毒載體的第二組合物(iii)含第三非復(fù)制型病毒載體的第三組合物的步驟，其中至少一種組合物含有源于禽痘病毒的痘病毒載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)載體是，或源于FP9。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中每個(gè)非復(fù)制型病毒載體都含有痘病毒載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中至少兩個(gè)痘病毒載體源于不同屬的痘病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中至少一個(gè)痘病毒載體源于禽痘病毒屬，至少一個(gè)痘病毒載體源于正痘病毒。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中一個(gè)載體含有的禽痘病毒基因組選自(i)具有一個(gè)或多個(gè)下列野生型FPV基因的修飾形式的禽痘病毒基因組FPV001，F(xiàn)PV018，F(xiàn)PV054，F(xiàn)PV063，F(xiàn)PV066，F(xiàn)PV070，F(xiàn)PV071，F(xiàn)PV093，F(xiàn)PV097，F(xiàn)PV098，F(xiàn)PV115，F(xiàn)PV124，F(xiàn)PV125，F(xiàn)PV127，F(xiàn)PV158，F(xiàn)PV159，F(xiàn)PV160，F(xiàn)PV190，F(xiàn)PV191，F(xiàn)PV207，F(xiàn)PV219，F(xiàn)PV220，F(xiàn)PV221，F(xiàn)PV222，F(xiàn)PV239，F(xiàn)PV241，F(xiàn)PV242，F(xiàn)PV243，F(xiàn)PV244，F(xiàn)PV245，F(xiàn)PV246，F(xiàn)PV247，F(xiàn)PV260；(ii)在一個(gè)或多個(gè)下列基因中具有部分缺失的禽痘病毒基因組FPV158，F(xiàn)PV219，F(xiàn)PV222；(iii)缺少一個(gè)或多個(gè)下列基因的禽痘病毒基因組FPV001，F(xiàn)PV124，F(xiàn)PV125，F(xiàn)PV159，F(xiàn)PV160，F(xiàn)PV220，F(xiàn)PV221，F(xiàn)PV241，F(xiàn)PV242，F(xiàn)PV243，F(xiàn)PV244，F(xiàn)PV245，F(xiàn)PV246，F(xiàn)PV247，F(xiàn)PV260；(iv)在一個(gè)或多個(gè)下列基因中具有移碼突變的禽痘病毒基因組FPV054，F(xiàn)PV070，F(xiàn)PV071，F(xiàn)PV115，F(xiàn)PV190，F(xiàn)PV207；(v)在一個(gè)或多個(gè)下列基因中具有終止突變的禽痘病毒基因組FPV071，F(xiàn)PV239；(vi)具有由基因FPV097和FPV098融合(通過缺失)得到的嵌合基因的禽痘病毒基因組；(vii)小于275kbp的禽痘病毒基因組；(viii)含有SEQ ID NO1所示序列的禽痘病毒基因組；(ix)含有SEQ ID NO1所示序列，并從ORF1缺失ACTGGTGCGAAGATCTC的禽痘病毒基因組。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述禽痘病毒基因組還含有NOI。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述NOI受痘病毒啟動(dòng)子的控制。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述NOI編碼貝氏瘧原蟲，惡性瘧原蟲，犬瘧原蟲，間日瘧原蟲，結(jié)核分枝桿菌或小泰勒蟲的抗原。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中將所述含有源于禽痘病毒屬的病毒載體的組合物作為加強(qiáng)組合物給藥。
13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中將所述含有源于禽痘病毒屬的病毒載體的組合物作為激發(fā)組合物給藥。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述被試者是靈長(zhǎng)目動(dòng)物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述被試者是人。
16.非復(fù)制型病毒載體在動(dòng)物疫苗中的用途，其中所述載體是，或源于FP9。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的用途，其中所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中所述哺乳動(dòng)物是靈長(zhǎng)目動(dòng)物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的用途，其中所述靈長(zhǎng)目動(dòng)物是人。
20.非復(fù)制型病毒載體在藥物中的用途，其中所述載體是，或源于FP9。
21.一種在被試者中激發(fā)免疫應(yīng)答的方法，包括給予所述被試者含有非復(fù)制型病毒載體的組合物，其中所述載體是，或源于FP9。
22.一種加強(qiáng)被試者中先前存在的免疫應(yīng)答的方法，包括給予所述被試者含有非復(fù)制型病毒載體的組合物，其中所述載體是，或源于FP9。
23.一種具有一個(gè)或多個(gè)下列野生型FPV基因的修飾形式的禽痘病毒基因組FPV001，F(xiàn)PV018，F(xiàn)PV054，F(xiàn)PV063，F(xiàn)PV066，F(xiàn)PV070，F(xiàn)PV071，F(xiàn)PV093，F(xiàn)PV097，F(xiàn)PV098，F(xiàn)PV115，F(xiàn)PV124，F(xiàn)PV125，F(xiàn)PV127，F(xiàn)PV158，F(xiàn)PV159，F(xiàn)PV160，F(xiàn)PV190，F(xiàn)PV191，F(xiàn)PV207，F(xiàn)PV219，F(xiàn)PV220，F(xiàn)PV221，F(xiàn)PV222，F(xiàn)PV239，F(xiàn)PV241，F(xiàn)PV242，F(xiàn)PV243，F(xiàn)PV244，F(xiàn)PV245，F(xiàn)PV246，F(xiàn)PV247，F(xiàn)PV260。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的禽痘病毒基因組，其在一個(gè)或多個(gè)下列基因中具有部分缺失FPV158，F(xiàn)PV219，F(xiàn)PV222。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的禽痘病毒基因組，其缺少一個(gè)或多個(gè)下列基因FPV001，F(xiàn)PV124，F(xiàn)PV125，F(xiàn)PV159，F(xiàn)PV160，F(xiàn)PV220，F(xiàn)PV221，F(xiàn)PV241，F(xiàn)PV242，F(xiàn)PV243，F(xiàn)PV244，F(xiàn)PV245，F(xiàn)PV246，F(xiàn)PV247，F(xiàn)PV260。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的禽痘病毒基因組，其在一個(gè)或多個(gè)下列基因中具有移碼突變FPV054，F(xiàn)PV070，F(xiàn)PV071，F(xiàn)PV115，F(xiàn)PV190，F(xiàn)PV207。
27.根據(jù)前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的禽痘病毒基因組，其在一個(gè)或多個(gè)下列基因中具有終止突變FPV071，F(xiàn)PV239。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的禽痘病毒基因組，其具有由基因FPV097和FPV098融合(通過缺失)得到的嵌合基因。
29.一種小于275kbp的禽痘病毒基因組。
30.根據(jù)前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的禽痘病毒基因組，其含有SEQ ID NO1所示的序列。
31.根據(jù)前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的基因組，其還含有NOI。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的基因組，其中所述NOI受痘病毒啟動(dòng)子的控制。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的基因組，其中所述NOI編碼貝氏瘧原蟲，惡性瘧原蟲，犬瘧原蟲，間日瘧原蟲，結(jié)核分枝桿菌或小泰勒蟲的抗原。
34.一種含有前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的基因組的病毒顆粒。
35.一種含有權(quán)利要求31-33任何一項(xiàng)所述的基因組，并且能夠把NOI送遞給靶細(xì)胞的病毒顆粒。
36.一種含有權(quán)利要求34或35所述的病毒顆粒的疫苗。
37.一種含有權(quán)利要求34或35所述的病毒顆粒的激發(fā)劑或加強(qiáng)劑。
38.一種接種試劑盒，其包括(i)含有權(quán)利要求34或35所述的禽痘病毒顆粒的第一組合物；和(ii)用于同時(shí)，分開或序貫給藥的第二組合物。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的試劑盒，其包括(i)含有權(quán)利要求34或35所述的禽痘病毒顆粒的激發(fā)組合物；和(ii)含有痘苗病毒顆粒的加強(qiáng)組合物。
40.一種接種試劑盒，其包括用于以任一順序?qū)`長(zhǎng)目動(dòng)物序貫給藥的(i)含第一非復(fù)制型病毒載體的第一組合物；(ii)含第二非復(fù)制型病毒載體的第二組合物。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的接種試劑盒，其包括(i)含第一非復(fù)制型痘病毒載體的第一組合物；(ii)含第二非復(fù)制型痘病毒載體的第二組合物。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的試劑盒，其中所述第一非復(fù)制型痘病毒載體是禽痘病毒屬載體，第二非復(fù)制型痘病毒載體是正痘病毒屬載體。
43.根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的試劑盒，其中所述第一非復(fù)制型痘病毒載體是禽痘病毒載體。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的試劑盒，其中所述第一非復(fù)制型痘病毒載體是，或源于權(quán)利要求34或35所述的病毒顆粒。
45.根據(jù)權(quán)利要求38-44任何一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第一和第二組合物能夠表達(dá)相同抗原。
46.一種加強(qiáng)組合物，其含有能夠加強(qiáng)靈長(zhǎng)目動(dòng)物被試者中先前存在的免疫應(yīng)答的非復(fù)制型病毒載體。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的加強(qiáng)組合物，其含有禽痘病毒載體。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的加強(qiáng)組合物，其是，或源于權(quán)利要求34或35所述的病毒顆粒。
49.一種接種方法，包括給予被試者權(quán)利要求36所述的疫苗，權(quán)利要求37，46，47或48任何一項(xiàng)所述的激發(fā)或加強(qiáng)組合物，或權(quán)利要求38-45任何一項(xiàng)所述的試劑盒的步驟。
50.根據(jù)權(quán)利要求36所述的疫苗，權(quán)利要求37，46，47或48任何一項(xiàng)所述的激發(fā)或加強(qiáng)組合物，或權(quán)利要求38-45任何一項(xiàng)所述的試劑盒在制備用于治療和/或預(yù)防被試者疾病的藥物中的用途。
51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求50所述的用途，其在被試者中激發(fā)T-細(xì)胞免疫應(yīng)答。
52.根據(jù)權(quán)利要求49-51任何一項(xiàng)所述的方法或用途，其中所述痰病是，或由慢性感染，如瘧疾，肺結(jié)核或東海岸熱引起。
53.未培養(yǎng)的CEF細(xì)胞使禽痘病毒屬生長(zhǎng)的用途。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的用途，其中所述禽痘病毒屬的病毒是禽痘病毒。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的用途，其中所述痘病毒是權(quán)利要求34或35所述的病毒顆粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有一個(gè)或多個(gè)野生型FPV基因修飾的禽痘病毒基因組。本發(fā)明還涉及一種含有這種基因組的病毒顆粒及其把目標(biāo)核苷酸(NOI)送遞給靶細(xì)胞的用途。本發(fā)明還涉及接種方法，特別是包括將激發(fā)組合物(其含有第一非復(fù)制型病毒載體)和加強(qiáng)組合物(其含有第二非復(fù)制型病毒載體)給予被試者，從而治療和/或預(yù)防疾病的方法。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1596126SQ02823921
公開日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2002年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月30日
發(fā)明者S·萊勞, M·斯金納, A·希爾, S·吉爾伯特, R·安德森 申請(qǐng)人:埃西斯創(chuàng)新有限公司