專利名稱：對拉米夫定相關(guān)疾病復(fù)發(fā)和耐藥性具有預(yù)防作用的藥物組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療肝病患者的方法，其包括向患者給藥包含藥物組合物和拉米夫定的藥方。該藥物組合物包含白花蛇舌草(Herba Hedyotidisdiffusae)的整株，拳參(Rhizoma Bistoriae)的根莖，虎杖(Rhizoma PolygoniCuspidali)的根莖，和五味子(Fructus Schisandrae)的熟果的水性提取物作為核心成分。本發(fā)明還涉及通過向患者給藥本發(fā)明的藥物組合物預(yù)防由拉米夫定治療的停藥導(dǎo)致的肝病復(fù)發(fā)和抑制拉米夫定耐藥性發(fā)展的方法。
背景技術(shù)：
病毒性肝炎是由病毒感染導(dǎo)致的主要腸道傳播肝病。該疾病的主要傳播途徑是通過攝食；病毒性肝炎也通過病毒污染的血液或血液制品如血漿的輸血傳播。
病毒性肝炎在全世界蔓延。例如，在中國約有3000萬病毒性肝炎患者，包括每年900萬估計量的新患者和約1億乙型肝炎病毒(HBV)攜帶者。預(yù)計10％的中國懷孕婦女是HBV攜帶者。在中國每年大約10萬人死于源于肝病的肝癌。
HBV感染是由乙型肝炎病毒所導(dǎo)致，該病毒是42-nm，雙鏈和環(huán)狀的脫氧核糖核酸(DNA)病毒，屬于嗜肝DNA病毒科。HBV由表面和核心組成。在HBV DNA基因組中存在4個編碼主要多肽的基因S(表面)，C(核心)，P(聚合酶)，和X(轉(zhuǎn)錄反式激活蛋白)。S基因由3個區(qū)域組成前S1區(qū)，前S2區(qū)，和編碼表面蛋白的區(qū)域。該表面蛋白組成表面抗原(HbsAg)。C基因分成兩(2)個區(qū)域，前核區(qū)和核心區(qū)；C基因編碼兩(2)種不同的蛋白質(zhì)，核心抗原(HbcAg)和e抗原(HbeAg)。
在病毒表面上發(fā)現(xiàn)HbsAg并被過量生產(chǎn)。HbsAg在血液中作為22-nm的球形和管狀顆粒循環(huán)。HBsAg可以在暴露于HBV 30-60天后的血清中鑒定和持續(xù)不同的時期。針對HbsAg的抗體(抗-HBs)在消退的感染后發(fā)展并負責(zé)長期免疫。
針對HBcAg(抗-HBc)的抗體在所有類型的HBV感染中發(fā)展并不確定地持續(xù)。IgM抗-HBc在感染早期中出現(xiàn)并持續(xù)六(6)個月或以上，因此它是急性或近來HBV感染的可靠標志。
第三種抗原，HBeAg可以在來自急性或慢性HBV感染患者的樣品中檢測。HBeAg的存在與病毒復(fù)制和高傳染性有關(guān)。針對HBeAg(抗-HBe)的抗體在大多數(shù)HBV感染中發(fā)展并與復(fù)制病毒的減少和更低的傳染性有關(guān)。
乙型病毒感染進展伴隨在患者中變化的結(jié)果。最初，肝臟急性感染導(dǎo)致身體產(chǎn)生免疫應(yīng)答以去除病毒。免疫系統(tǒng)設(shè)法通過破壞HBV感染的肝細胞來清除病毒。在某些人中，免疫系統(tǒng)取得成功以致病毒連同感染的肝細胞一起被完全破壞，患者獲得完全恢復(fù)。這稱為疾病的消退。然而在另一些患者中，對感染的免疫應(yīng)答在多個月或多年內(nèi)不足以完全或根本不去除病毒，隨著病毒擴散免疫系統(tǒng)慢慢地破壞越來越多的受染肝細胞，形成長期感染。肝細胞這樣緩慢但持久地被免疫系統(tǒng)破壞導(dǎo)致纖維化，硬變和甚至肝癌。免疫系統(tǒng)不能去除病毒的感染HBV的人被稱為慢性HBV攜帶者。在慢性HBV患者中通常無顯著的身體癥狀。特異的血液檢查將顯示病毒的存在，患者也通過血液，分娩，性，針等傳染。慢性HBV攜帶者可將病毒傳給其他人。
美國專利5,047,407公開一種具有抗病毒活性的化合物。該化合物是(2R，順)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-oxathiolan-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮(也稱為3TC)，并給予藥典名拉米夫定(lamivudine)和由Glaxo SmithKline以商標Epivir在市場上出售。拉米夫定用于治療和預(yù)防病毒性感染。
拉米夫定是核苷類似物，對HBV和人免疫缺陷病毒(HIV)的依賴于RNA的DNA聚合酶具有有效的抑制作用。已經(jīng)體外和體內(nèi)顯示拉米夫定對HBV復(fù)制抑制的抗病毒作用。(Lai等，N.Engl.J.Med.(1998)，33961-68)。拉米夫定在大多數(shù)患者中實現(xiàn)病毒復(fù)制的抑制，如通過血清HBV-DNA的陰性所確定，但該化合物在短期治療內(nèi)HBeAg的清除方面效果差很多。對HBeAg清除的無效或降低的效果可能歸因于肝細胞核中HBV共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)的持久性；在拉米夫定治療停藥后經(jīng)常出現(xiàn)HBV復(fù)制的快速復(fù)發(fā)。已經(jīng)提出延長拉米夫定治療來解決該問題，HBeAg的血清轉(zhuǎn)化率已經(jīng)顯著改善。
當長期使用拉米夫定時，它導(dǎo)致拉米夫定耐藥HBV突變株的選擇和在患者中發(fā)展耐藥性，其對治療方案提出新的挑戰(zhàn)。(Hussain等，J.Viral.Hepat.(1999)，6183-194；Balzarini等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1996)，2363-369)。拉米夫定耐藥的HBV突變株對長期拉米夫定治療期間患者中的急性惡化和代償失調(diào)發(fā)展負主要責(zé)任。(Liaw等，Hepatology(1999)，30567-572)。
一旦突變株存在和患者發(fā)展耐藥性，內(nèi)科醫(yī)師面臨停止還是繼續(xù)治療的難題。有時，持續(xù)治療導(dǎo)致肝壞死炎癥(hepatonecroinflammation)的反復(fù)惡化，其導(dǎo)致肝代償失調(diào)或硬化；另一方面，停止治療可導(dǎo)致野生型病毒的再活化，其也導(dǎo)致肝壞死炎癥的惡化。針對耐藥性HBV突變株以及野生型病毒的抗病毒治療方案的開發(fā)對于這些患者是關(guān)鍵性的。
本發(fā)明提供一種對于治療病毒性肝炎有效的草藥組合物，特別是，該組合物在治療病毒性肝炎中有效。該草藥組合物同樣在體內(nèi)和體外治療耐受拉米夫定的突變株HBV中有效。另外，該草藥組合物增強拉米夫定的抗病毒療效和改善由拉米夫定的長期使用導(dǎo)致的拉米夫定耐藥HBV突變株的發(fā)展。
將該草藥組合物命名為乙肝康(Yi-Gan-Kang)(在中文中，“乙”意為“第二或B”；“肝”意為“肝臟”；“康”意為“健康”；總起來說，“乙肝康”表示“無HBV感染的健康肝臟”)，縮寫為YGK。
發(fā)明概述本發(fā)明提供通過向所述患者聯(lián)合給藥包含有效量的名為YGK和拉米夫定的藥物組合物的藥方來治療肝病患者的方法。YGK包含作為核心成分下列草藥白花蛇舌草(Herba Hedyotidis diffusae)的整株，拳參(RhizomaBistoriae)的根莖，虎杖(Rhizoma Polygoni Cuspidali)的根莖，和五味子(Fructus Schisandrae)的熟果的水性提取物。YGK另外包含下列草藥的水性提取物北豆根(Rhizoma Menispermi)的根莖，黃苓(RadixScutellariae)根，牛黃粉，郁金(Radix Curcumae)的塊莖，山楂(FructusCrataegi)的熟果，和三七(Radix Notoginseng)的根。最后，YGK另外包含下列草藥的水性提取物枸杞子(Fructus Lycii)熟果的水性提取物，紅參(Radix Ginseng Rubra)的根，玄參(Radix Scorphulariae)的根，當歸(Radix Angelicae sinensis)的根，和黃芪(Radix Astragali)的根。用于從草藥中提取藥物成分的水性溶液的實例包括但不限于水，乙醇，或其混合物。優(yōu)選水性溶液為水。
可以將YGK口服和/或靜脈內(nèi)給藥于患者。對于口服給藥，優(yōu)選劑量約為每人每日0.5-5g YGK提取物，最優(yōu)選1-3g YGK提取物。對于靜脈注射，優(yōu)選劑量約為每人每日1-10g YGK提取物，最優(yōu)選3-5g YGK提取物。將術(shù)語“YGK提取物”用作確定YGK劑量的標準單位。YGK提取物是在濃縮兩次后草本成分的水性提取物。YGK提取物定義的詳細描述在以下“本發(fā)明詳述”的實施例1中提供。使用“YGK提取物”作為標準劑量單位的原因是因為“YGK提取物”是在口服劑量形式和注射液中使用的YGK的通用形式。然而，對于YGK口服劑量形式的制備，加入其它賦形劑，如淀粉以將YGK提取物轉(zhuǎn)換成最終的粉劑形式。但是對于注射液，通過將它稀釋在適當?shù)木彌_液中可以直接使用YGK提取物。因此，對于YGK的口服劑量和注射劑量之間的適當比較，“YGK提取物”而不是YGK的最終重量應(yīng)當更準確。優(yōu)選將YGK口服劑量和靜脈注射液同時給予患者。
優(yōu)選將拉米夫定口服給藥于患者。拉米夫定的優(yōu)選劑量約為每人每日50-500mg，最優(yōu)選100-200mg。
YGK和拉米夫定的聯(lián)合給藥在治療肝病如肝炎，硬化，和肝癌患者中特別有效。YGK和拉米夫定的聯(lián)合給藥在治療由乙型肝炎病毒(HBV)感染導(dǎo)致的肝病中尤其有效。
本發(fā)明還提供包含第一劑量單位(即YGK)和第二劑量單位(即拉米夫定)的藥物組合。YGK是口服劑量形式或靜脈注射液。優(yōu)選YGK口服劑量形式是膠囊形式。優(yōu)選每次給藥服用約0.1-2g YGK提取物和1天約2-4次。YGK提取物的靜脈注射液的量是每次給藥約1-10g YGK提取物，優(yōu)選1天1次向患者給藥。
優(yōu)選將拉米夫定以每次給藥約50-500mg，最優(yōu)選100-200mg和約1天1次口服給藥于患者。
本發(fā)明另外提供在他們的拉米夫定治療已經(jīng)停止后，通過向患者口服和/或靜脈內(nèi)給藥YGK，預(yù)防在拉米夫定治療已經(jīng)停止后患者肝炎復(fù)發(fā)的方法。當肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所導(dǎo)致時該方法特別有效。
最后，本發(fā)明提供通過向正在服用拉米夫定的患者口服和/或靜脈內(nèi)給藥YGK，抑制拉米夫定耐藥性的發(fā)展的方法。當拉米夫定耐藥性是由患者中拉米夫定耐藥乙型肝炎病毒(HBV)毒株的發(fā)展所導(dǎo)致時，該方法特別有效。
附圖簡述

圖1顯示YGK對Hep3B細胞(圖1A)和HepA2細胞(圖1B)中HbsAg的生產(chǎn)率的影響?！?-◆表示用不同濃度的YGK處理的細胞?！?-■表示用YGK和“條件培養(yǎng)基”處理的細胞。條件培養(yǎng)基是從已經(jīng)溫育24小時的單核細胞的培養(yǎng)基中收集的培養(yǎng)基。
發(fā)明詳述拉米夫定耐藥的病毒在依賴于RNA的DNA聚合酶的酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)基序上具有特有的氨基酸取代，如在拉米夫定耐藥的免疫缺陷病毒中所示。(Balzarini等，(1996)，2363-369)。密碼子552的甲硫氨酸被異亮氨酸(M552I)或纈氨酸(M552V)替換。(Ling等，Hepatology(1996)，3711-713；Tipples等，Hepatology，3714-717；和Naoumov等，Hepatology(1996)，24282；其在此引入作為參考)。
M552V突變經(jīng)常伴隨亮氨酸528至甲硫氨酸(L528M)的替代。(Fu等，Biochem.Pharmacol.(1998)，551567-1572；Niesters等，J.Infect.Dis.(1998)，1771382-1385)。這兩種突變株，M552I和L528M/M552V通常被鑒定為拉米夫定耐藥的突變株。(Liaw等，Hepatology(1999)，30567-572)。此外，開發(fā)另外兩種抗性突變株，L528M/M552V和A529T。顯著地，發(fā)現(xiàn)這些突變株中的一些的復(fù)制是部分依賴于拉米夫定。
本發(fā)明的藥物組合物，YGK包含十五(15)種草藥，其按照它們的基本作用分組如下首先，存在四(4)種形成YGK核心成分的草藥。這4種草藥有助于組合物的主要功效和治療效果。這4種草藥是(1)白花蛇舌草(藥用名稱Herba Hedyotidis Diffusae；植物名Hedyotis diffusa Wild。)；(2)拳參根莖(藥用名稱Rhizoma Bistortae；植物名Polygonum bistorta L.)(3)虎杖(藥用名稱Rhizoma Polygoni Cuspidati；植物名Polygonumcuspidatum Sieb.et Zucc.)；和(4)五味子(藥用名稱Fructus SchisandraeChinensis；植物名Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.，S.sphenanthera Rehd.et Wils.)。白花蛇舌草，拳參根莖，虎杖，和五味子的優(yōu)選重量比約為3∶3∶1∶2。
核心草藥的功能包括清熱解毒，改善免疫系統(tǒng)及循環(huán)，治療黃疸癥狀并滋補內(nèi)臟。
存在另外六(6)種用于改善和平衡由核心成分產(chǎn)生的藥物活性的草藥。這六種草藥還具有調(diào)節(jié)效果和改善肝臟血液循環(huán)以幫助肝病治療。這六種成分是(1)北豆根(藥用名稱Rhizoma Menispermi；植物名Menisermumdauricum DC)；(2)黃芩(藥用名稱Radix Scutellariae Baicalensis；植物名Scutellaria baicalensis Georgi)；(3)牛黃(動物名Vesica Fellea Bovus)；(4)郁金(藥用名稱Radix Curcumae；植物名Curcuma wenyujin Y.H.Lee etCl Ling)；(5)山楂(藥用名稱Fructus Crataegi；植物名Crataeguspinnatifida Bge.)；和(6)三七(藥用名稱Radix Notoginseng；植物名Panaxnotoginseng(Burk.))。
最后五(5)種成分主要用于提供營養(yǎng)和能源給患者以加速恢復(fù)過程。這些成分包括(1)枸杞子(藥用名稱Fructus Lycii；植物名Lyciumbarbarum L.)；(2)紅參(藥用名稱Radix Ginseng Rubra；植物名PanaxGinseng C.A.Mey)；(3)玄參(藥用名稱Radix Scrophulariae；植物名Scrophularia ningpoensis)；(4)當歸(藥用名稱Radix Angelicae sinensis；植物名Angelica sinensis (Oliv.)Diels)；和(5)黃芪(藥用名稱Radix Astragali；植物名Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.)。
在這五種成分中，紅參還具有改善人體抵抗疾病的免疫功能。
本發(fā)明所用的草藥的藥用名稱、植物名或動物名、科名、一般名稱及其主要成分在表1中顯示。
表一本發(fā)明藥物組合物中各種草藥



白花蛇舌草(Herba Hedyotidis Diffusae)屬于茜草(Rubiaceae)科植物。將整株用作草本藥用成分。此草藥無毒。在中國大陸于夏、秋季節(jié)，在臺灣則于晚春或早冬采收。Dan Bensky與Andrew Gamble編譯的“MateriaMedia”(Chinese Herbal Medicine)中便指出，白花蛇舌草清熱和利尿解毒。對舒緩熱痛型尿道功能障礙以及濕熱型黃疸特別有益。白花蛇舌草是有助于對肝病與HIV的醫(yī)療作用的本發(fā)明草藥組合物的主要成份。
拳參(Rhizoma Bistortae)是植物Polygonum bistorta L.的干燥根莖。它屬于蓼(Polygonaceae)科。拳參中度性寒(意指拳參是“陽性”草藥)。它可以用來清熱解毒，消腫與止血。
虎杖(Radix et Rhizoma Polygoni Cuspidati)為Polygonum cuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根莖與根。它屬于Polygonaceae科。此植物遍布全中國，特別在江蘇、浙江、安徽、廣東、廣西、四川及貴州等省份。在春季和秋季收獲?；⒄韧ǔＳ糜陟铒L(fēng)利濕、散瘀定痛以及止咳化痰。
五味子(Fructus Schisandrae)為Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.或Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的干燥成熟果實。它屬于木蘭(Magnoliaceae)科。前者，它最好的的種類產(chǎn)于中國北方，慣稱“北五味子”；后者通常稱為“南五味子”因為它產(chǎn)于中國南方。兩種均可用于本發(fā)明的藥物制劑。果實于秋季采摘，去除果梗后在太陽下曬干。五味子通常用于收斂固澀、益氣生津以及補腎寧心。五味子也可以降低肝炎患者的GPT(谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶)水平。
北豆根(Rhizoma Menispermi)為Menispermum dauricum DC的干燥根莖。它屬于防己(Menispermacea)科，性寒，多用于清熱解毒、祛風(fēng)止痛。
黃芩(Radix Scutellariae)為唇形(Labiatae)科植物Scutellariabaicalensis georgi的干燥根。該植物產(chǎn)于河北、山西、內(nèi)蒙等，春、秋二季采挖。黃芩主要用于患者的清熱燥濕、瀉火解毒、止血與安胎。
牛黃是牛Vesica Fellea Bovus的膽結(jié)石?？汕鍩幔婢彲d攣。
郁金(Radix Curcumae)為Curcuma wenyujin Y.H.Lee et C.Ling.或Curcuma Longa L.或Curcuma aromatica Salisb.或Curcuma zedoaria Rosc.或Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang的干燥塊根。此藥材主要產(chǎn)于中國四川、浙江、廣東與廣西等省份，冬天或春天采挖，除去須根后清洗，蒸透后曬干。郁金為姜(Zingiberaceae)科，性寒味苦，用于清熱、解郁及祛痰。
山楂(Fructus Crataegi)為Crataegus pinnatifida Bge.var major N.E.Br.或Crataegus pinnatifida Bge.或Crataegus cuneata Sieb的干燥成熟果實。主要產(chǎn)地為中國河南、江蘇、山東等省份，秋季成熟時采收、切片并曬干。山楂屬薔薇(Rosaceae)科，一般用于健胃整腸，行氣散瘀。
三七(Radix Notoginseng)為五加(Araliaceae)科植物Panax notoginsent(Burk.)F.H.Chen的干燥根。植物三七又稱為P.pseudoginseng Wall或P.sanchi Hoo，產(chǎn)于中國云南、廣西、四川、貴州與江西等省份。通常在種植后第三或第七年秋冬，花開前(更好)或果實成熟后采挖。H.Gao等，Pharmaceutical Research，(1996)13(8)1196-1200公開來自三七(San-Chi)的多糖在體外具有改善免疫刺激活性。
枸杞子(Fructus Lycii)是Lycium barbarum L.的干燥成熟果實，屬茄(Solanaceae)科，產(chǎn)于中國寧夏、甘肅、青海等省份，于夏、秋二季采收，用于滋補肝腎，益精明目。
玄參(Radix Scrophulariae)為玄參(Scrophulariaceae)科Scrophularianingpoensis Hemsl的干燥根。主要產(chǎn)于中國浙江與四川兩省，冬季莖葉枯萎時采挖。將根輪換堆放、曬干直到內(nèi)部呈黑色，然后切片備用。玄參可用于涼血滋陰、瀉火解毒。
紅參(Radix Ginseng Rubra)為Panax ginseng C.A.Mey.經(jīng)人工栽培(通稱為稱“園參”)、蒸制后變成紅色，性味則成溫?zé)?。此藥材屬五?Arliaceae)科植物，藥用部位為干燥根，通常作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。紅參可加強中樞神經(jīng)系統(tǒng)的刺激與抑制作用，從而促進神經(jīng)反應(yīng)的調(diào)節(jié)能力。它還可以降低血糖與膽固醇，并且對治療與預(yù)防胃潰瘍的效果。
當歸(Radix Angelicae Sinensis)為傘形(Umbelliferae)科植物Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根。此藥材主要產(chǎn)于中國甘肅與陜西省，秋末采挖，除須根、切段、酒炙后用慢火熏干。當歸可以補血、活血、通經(jīng)、止痛、潤腸等。
黃芪(Radix Astragali)是Astragalus membrancaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus.(Bge.)Hsiao或Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，屬豆科。主要產(chǎn)地為中國山西省、甘肅省、黑龍江省以及內(nèi)蒙古。于春、秋兩季采挖4年或以上的黃芪。黃芪可以消炎化膿、促進組織生長。
YGK在治療肝病患者中特別有效。YGK適合于制藥業(yè)典型規(guī)模以及較小量的制備。
在制備本發(fā)明的草藥組合物的方法中，按照常規(guī)方法對單獨的草藥組分進行預(yù)處理。切割草藥并放入含有水和/或低級醇(如乙醇)的容器煎煮兩次。第一次先煎煮約兩個小時，收集溶液，加入水和/或低級醇第二次煎煮約1.5半小時。來自煎煮步驟的溶液通過篩/濾器收集。然后將濾液從約1.4倍體積濃縮成1.0倍體積。隨后將液體冷凝液噴霧干燥和造粒，制成顆粒。將顆粒進一步包裝成膠囊和保護待用或通過活性成分的常規(guī)方法進一步分析以確保它們的質(zhì)量。也可將液體冷凝液制備成靜脈注射液。在一個安瓿中約有5ml靜脈注射液。
本發(fā)明的組合物可以進一步加工和配制成適合口服給藥或靜脈注射的形式。
在YGK治療慢性乙型肝炎效果的臨床研究中，在以下各方面評估療效
(1)血清HBV-DNA的連續(xù)消失，這是在血清和肝臟組織中HBV-DNA的清除的指征；(2)HBsAg的清除和抗-HBs的產(chǎn)生；(3)HBV復(fù)制的抑制；(4)HBeAg的清除和抗-HBe的產(chǎn)生；和(5)肝功能的顯著改善(如通過組織損傷判斷)，如由正常水平的血清轉(zhuǎn)氨酶，死肝細胞的組織學(xué)檢查，和緩和的炎癥指示所顯示。
當與拉米夫定聯(lián)合給藥時，YGK在治療慢性乙型肝炎中特別有效，血清HBV-DNA迅速清除和HBeAg以及HBsAg陰性。為了治療有效，將YGK以兩種形式，膠囊或靜脈注射液給藥于患者?？梢耘c拉米夫定分開或一起給藥。本發(fā)明的草藥組合物也已經(jīng)證明使肝炎或肝硬化患者肝酶正?；途徍团R床癥狀的能力。
本發(fā)明的方法在治療慢性乙型肝炎中特別有效，血清HBV-DNA迅速清除和HBeAg以及HBsAg陰性。本發(fā)明治療乙型肝炎的方法包括與拉米夫定同時(concurrent)或聯(lián)合給藥YGK，有效增強拉米夫定的抗病毒性能和抑制由拉米夫定的長期使用導(dǎo)致的拉米夫定耐藥的HBV突變株的發(fā)展。
本發(fā)明YGK和拉米夫定的聯(lián)合治療可以實現(xiàn)抑制病毒復(fù)制和改善患者免疫系統(tǒng)功能的雙重目標。
拉米夫定，一種核苷類似物，在抑制HBV復(fù)制期間逆轉(zhuǎn)錄酶的酶活方面有效。六個月的拉米夫定治療有效減少血清中的HBV-DNA，患者的轉(zhuǎn)陰率可高達90.4％。與拉米夫定治療有關(guān)的缺點是拉米夫定在病毒復(fù)制循環(huán)中的單個階段切斷，患者HBeAg轉(zhuǎn)陰率極低，于是需要拉米夫定長期治療。在拉米夫定治療完成后，患者具有高HBeAg轉(zhuǎn)陽率。
兩種類型的YGK制劑，即YGK靜脈注射液和YGK膠囊，具有稍微不同的抗-HBV作用。YGK靜脈注射液具有直接的抗-HBV作用。它可以阻止病毒復(fù)制期間病毒的核苷酸攝取以致病毒將變得虛弱和死亡。在另一方面YGK膠囊對于保護肝細胞和調(diào)節(jié)免疫功能特別有效。靜脈注射液和YGK膠囊的結(jié)合使用對于HBV的抑制和肝功能的恢復(fù)有效。
本發(fā)明證明拉米夫定和YGK的聯(lián)合治療對HBV復(fù)制的多個階段具有多重功能拉米夫定抑制HBV復(fù)制期間逆轉(zhuǎn)錄酶的酶活，YGK靜脈注射液阻止DNA復(fù)制期間病毒核苷酸的攝??；同時，YGK膠囊調(diào)節(jié)患者的免疫功能。該有效結(jié)合可以在8周內(nèi)快速清除血清HBV-DNA以致100％患者顯HBV-DNA陰性，更多的患者在治療16周后HBeAg轉(zhuǎn)陰。聯(lián)合治療中的拉米夫定治療在16周治療后終止，這樣服用拉米夫定的時期大大減少，避免了長期拉米夫定治療的副作用，包括拉米夫定耐藥的HBV的誘導(dǎo)和疾病的復(fù)發(fā)。
下列實施例是例證性的，但不限制本發(fā)明的范圍?？梢圆槐畴x本發(fā)明的范圍進行如普通技術(shù)人員所想到的那些合理變化。
實施例1藥物制劑在制備本發(fā)明藥物組合物的方法中所用草藥成分的種類和量在表2中描述。該藥物組合物稱為“YGK”。它可以配制成注射液和膠囊。
表2.用于制備YGK注射液和YGK膠囊的成分

(1)原料的質(zhì)量控制按照在草藥領(lǐng)域中使用的常規(guī)方法，對于每種單獨的原料進行質(zhì)量控制試驗，其包括但不限于物理外觀，干燥失重，總灰分，酸不溶灰分，醇提物，水提物，TLC，HPLC，重金屬，微生物計數(shù)和殘留農(nóng)藥。
檢驗牛黃粉的外觀，TLC和普通化學(xué)。
(2)制備方法按照常規(guī)方法預(yù)處理單獨的草藥組分。
按照表3稱量草藥。在表3中提供用于制備YGK膠囊和/或注射液的制備方法的流程圖表3YGK制備方法制備方法 質(zhì)量控制方法遞送的原料草藥原料草藥的質(zhì)量控制｜ ·物理外觀↓制備(切割，干燥等)｜ 原料草藥的質(zhì)量控制｜ ·物理外觀↓ ·干燥失重·總灰分獲得總共20.003kg原料草藥 ·酸不溶灰分并放于提取器中用于制備·醇提物｜ ·水性提取物｜ ·TLC↓ ·HPLC加350L±10％水以浸漬提取器中 ·重金屬的草藥60±10min ·微生物｜ ·殘留農(nóng)藥｜ 注意只檢驗牛黃粉(也稱為↓ Bovis Bezoar)的外觀，TLC
和普通化學(xué)制備方法質(zhì)量控制方法第1次提取質(zhì)量控制參數(shù)設(shè)置(取10-15g作為試樣)1.設(shè)定溫度為95℃ ·固體含量濃度可接受范圍為90℃-100℃。
·水分濃度2.設(shè)定蒸汽壓力為2kg/cm2。
3.讀取蓋壓為0.2-0.4kgf/cm2范圍內(nèi)。
4.提取45分鐘。
｜｜液體提取物↓第1次濃縮參數(shù)設(shè)置1.設(shè)定真空為-60～-76cmHg。
2.設(shè)定溫度為40℃±5℃。
3.處理40分鐘。
｜｜原料草藥加水350L±10％↓第2次提取參數(shù)設(shè)置1.設(shè)定溫度為95℃。
可接受范圍為90℃-100℃。
2.設(shè)定蒸汽壓力為2kg/cm2。
3.讀取蓋壓為0.2-0.4kgf/cm2范圍內(nèi)。
4.提取45分鐘。
｜｜↓制備方法 質(zhì)量控制方法合并濃縮的提取物并倒入不銹鋼容器中｜↓產(chǎn)率6.1kg±10％噴霧艙參數(shù)設(shè)置1.設(shè)定溫度為60℃。
2.預(yù)熱15分鐘。
｜↓流化床干燥器1.加入3.9kg淀粉(基于淀粉的含水量)。
2.設(shè)定內(nèi)溫為60℃；外溫為50℃。
3.預(yù)熱10分鐘。
4.處理目標2小時±20分鐘，直至LOD＜5％。
(下頁繼續(xù))｜↓產(chǎn)率9.5kg-10.5kg過篩參數(shù)設(shè)置1.設(shè)定溫度為23±4℃。
2.讀取RH為50±10％。
3.以100網(wǎng)目篩過篩，再以80網(wǎng)目篩過篩。
｜｜產(chǎn)率9.0kg-10.5kg↓YGK粉劑制備方法質(zhì)量控制方法藥物的質(zhì)量控制·物理外觀·干燥失重·總灰分·酸不溶灰分·醇提物·水性提取物·TLC·HPLC·重金屬·微生物·殘留農(nóng)藥·穩(wěn)定性將單獨草藥切成小片，然后充分混合。將混合的草藥裝入具有足夠展開空間的袋中。將袋放入含有350L(±10％)水的提取器中，浸泡約60±10分鐘。首先在95±5℃下在2kg/cm2的蒸汽壓力和0.2-0.4kg/cm2的蓋壓下提取草藥45分鐘。將水性提取物收集到濃縮器中并在40±5℃下在-60～-76cmHg的真空下濃縮40分鐘以形成第一次濃縮物。
將袋中的草藥從提取器中回收，放入另外350L(±10％)水并再次在95±5℃下在2kg/cm2的蒸汽壓力和0.2-0.4kg/cm2的蓋壓下提取45分鐘。將來自第二次提取的提取物收集到濃縮器中并在40±5℃下在-60～-76cmHg的真空下濃縮40分鐘以形成第二次濃縮物。
合并第一和第二次濃縮物并倒入不銹鋼容器。合并的濃縮物的總重約為6.1kg±10％。合并的濃縮物稱為“YGK提取物”。
對于YGK注射液，將約0.4g“YGK提取物”溶解在約1ml注射緩沖液中。將約5ml注射液倒入安瓿。
對于YGK粉劑(其被包裝成YGK膠囊)，將約3.9kg淀粉(基于淀粉的含水量可調(diào))加入YGK提取物并在設(shè)置為內(nèi)溫60℃和外溫50℃的流化床中噴霧干燥約120±20min直至LOD(檢出限)＜5％。
所得粉劑先以100網(wǎng)目篩過篩，再以80網(wǎng)目篩過篩。YGK粉劑的最終產(chǎn)率約為9.5～10.5kg。可將YGK粉劑進一步包裝成YGK膠囊。存在兩種劑量形式的YGK膠囊500mg的YGK膠囊，其包含約305mg“YGK提取物”和約195mg淀粉；和220mg的YGK膠囊，其包含約134mg“YGK提取物”和約86mg淀粉。
(3)加工過程中的質(zhì)量控制在提取物濃縮后，收集10～15克樣品，依美國藥典、中國藥典、和/或日本藥典所述方法，測定固體物濃度和水分濃度。
(4)YGK粉劑的質(zhì)量控制對YGK粉劑進行的質(zhì)量控制試驗包括但不限于通過常規(guī)方法和通過在美國藥典、中國藥典、和/或日本藥典中所述方法的物理外觀，干燥失重，總灰分，酸不溶灰分，醇提物，水提物，TLC，HPLC，重金屬，微生物計數(shù)，殘留農(nóng)藥和穩(wěn)定性。
(5)YGK膠囊的質(zhì)量控制對500mg YGK膠囊進行的質(zhì)量控制試驗包括但不限于通過常規(guī)方法和通過在美國藥典、中國藥典、和/或日本藥典中所述方法的物理外觀，干燥失重，總灰分，酸不溶灰分，醇提物，水提物，TLC，HPLC，重金屬，微生物計數(shù)，殘留農(nóng)藥和穩(wěn)定性。
實施例2YGK草藥組合物對乙型肝炎(HBV)患者的治療功效該臨床研究在中國人民解放軍211醫(yī)院進行。乙型肝炎的致病原因很多，包括免疫反應(yīng)、宿主遺傳因子以及HBV突變。慢性肝炎與急性肝炎不同。急性肝炎是肝臟活性和有癥狀的感染。急性肝炎患者有傳染性。急性HBV感染的癥狀是非特異性的，但可能包括不適，厭食或黃疸。慢性肝炎患者無癥狀。HBV存在于肝臟和血液中，盡管通常沒有明顯身體癥狀。特異的血液檢查將顯示病毒的存在，患者也通過血液，分娩，性，針等傳染。肝硬化是肝臟的病理性功能障礙狀態(tài)，由慢性肝炎，慢性持續(xù)性肝炎(CPH)和慢性活性肝炎(CAH)導(dǎo)致的肝臟硬化。
共有948位急性HBV、慢性HBV以及肝硬化患者參與臨床比較研究。將患者分為兩(2)組。研究組有642位患者，比較組則有306位患者。參與本研究的患者資料在表4中列出。
表4臨床研究中的患者資料

(*根據(jù)1990年上海肝炎會議修訂的病毒性肝炎診斷分型標準)患者以下列方式進行治療(1)研究組的患者每天口服八(8)顆含有本發(fā)明草藥組合物的YGK膠囊。
(2)比較組的患者則每天口服四(4)片護肝(“肝臟保護”)片。護肝(“肝臟保護”)片由五味子(Fructus Schisandrae chinensis)醇浸膏、保肝浸膏(含茵陳、紫胡、板藍根(isatis root，Radix Isatidis seu Baphicacanthi))以及膽汁膏粉等組成。它治療慢性肝炎的有效率為95.08％(70％有顯著效果)，治療肝硬化的有效率為82.5％(63％有顯著效果)。
兩組患者均給藥九十(90)天。
表5顯示該臨床研究的結(jié)果。
表5.YGK膠囊療效

(p＜0.01)*有療效的定義為在服藥90天後，病患的B型肝炎病毒e抗原(HBeAg)及去氧核糖核酸基因體(HBV-DNA)標記轉(zhuǎn)陰。
如表5所示，約71.3％服用YGK草藥組合物90天的患者對草藥組合物顯示陽性應(yīng)答。這與其中向患者給予在中國市場上可商購的常見“護肝”片的比較組相反。已經(jīng)服用“護肝”片的患者僅具有顯示他們肝病改善的約33.98％的有效率。
實施例3YGK草藥組合物在動物中的毒性研究目的下列實驗于中國黑龍江省勞動衛(wèi)生職業(yè)病研究所的毒理學(xué)實驗室進行，檢驗在靜脈注射于動物期間YGK草藥組合物的急性毒性。
方法試驗動物為獲自中國黑龍江省哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物中心的日本大耳白種屬家兔，此種屬家兔的特點為耳部血管清楚，實驗容易操作。
獲得10只上述家兔，雄六只、雌四只，每只體重在1900克與3000克之間。
將兔子隨機分為兩組，每組五只，包括兩只雌兔和三只雄兔。兩組動物分別用10g/kg以及15g/kg劑量經(jīng)家兔的耳靜脈將YGK草藥組合物靜脈注射到家兔中。
包含草藥組合物的注射液的濃度約為1g/ml，因此高劑量組15g/kg的濃度約為15ml/kg，換算成60公斤成人一次用900ml草藥組合物治療。
靜脈注射后連續(xù)觀察兔子行為兩周。第一天每小時觀察一次；之后每天觀察四到六次。
觀察期結(jié)束時，殺死動物并解剖，檢查眼睛、肝臟、肺臟和胰臟是否有異常。
結(jié)論觀察期間家兔行為正常，體重也與日俱增。殺死和解剖后觀察，眼睛、肝臟、肺臟和胰臟均無異常。此結(jié)果相較于一般急性毒理分級標準，屬正常無急毒。
實施例4YGK的體外抗病毒活性人肝癌Hep3B細胞的HBsAg的生產(chǎn)對各種試劑非常敏感。(Hsu等，J.Biol.Chem.(1993)，26823093-23097)。因此，可將Hep3B細胞發(fā)展成用于檢查抗病毒活性相關(guān)的中草藥的有效檢驗系統(tǒng)。
為了進一步研究HBV基因表達和病毒復(fù)制的調(diào)節(jié)，發(fā)展另一種肝癌細胞系，HepA2。通過將串聯(lián)排列的HBV基因組轉(zhuǎn)染到其基因組不含HBV序列的HepG2細胞之中，HepA2細胞衍生于HepG2細胞。HepA2細胞可以合成和分泌HBsAg和HBeAg到培養(yǎng)基中。
將這兩種細胞系用作模式系統(tǒng)來檢驗YGK的抗病毒活性。因為YGK已經(jīng)通過靜脈內(nèi)注射被直接用于治療慢性活性肝炎患者，通過收集來自溫育24小時的單核細胞(來自血液)的培養(yǎng)基，還檢驗了YGK可以與循環(huán)中單核細胞分泌的細胞因子配合來抑制肝細胞HBsAg生長的可能性。溫育單核細胞的培養(yǎng)基稱為“條件培養(yǎng)基”。
然后用單獨YGK或YGK與條件培養(yǎng)基處理Hep3B細胞和HepA2細胞。結(jié)果在圖1中顯示。
單獨YGK對Hep3B和HepA2細胞中HbsAg生產(chǎn)的抑制作用是劑量依賴性的。(圖1A中◆--◆)。當YGK濃度約為2％(w/v)時在Hep3B細胞中約50％的HBsAg生產(chǎn)被抑制。當YGK濃度約為3％(w/v)時約50％的HBsAg生產(chǎn)被抑制。
在Hep3B細胞中，單獨條件培養(yǎng)基對HBsAg沒有影響。(圖1A中未顯示)。然而，當將條件培養(yǎng)基與2％的YGK一起加入Hep3B細胞培養(yǎng)基，Hep3B細胞中HBsAg的生產(chǎn)率從約50％(不含條件培養(yǎng)基)(◆--◆)降低到約15％(含條件培養(yǎng)基)(圖1A■--■)。HBsAg生產(chǎn)的抑制作用似乎在約4％YGK時達到穩(wěn)定水平，這時HBsAg生產(chǎn)率約為5％。
在HepA2細胞中，單獨的條件培養(yǎng)基似乎對HBsAg生產(chǎn)有一些影響。(圖1B中未顯示)。當將條件培養(yǎng)基與2％YGK一起加入Hep3B細胞培養(yǎng)基，Hep3B細胞中HBsAg的生產(chǎn)率從約65％(不含條件培養(yǎng)基)降低到約20％(含條件培養(yǎng)基)(圖1A■--■)。HBsAg生產(chǎn)的抑制作用似乎在約3-5％YGK時達到穩(wěn)定水平，這時HBsAg生產(chǎn)率約為10％。
實施例5YKG對抑制拉米夫定耐藥的HBV突變株病毒復(fù)制的作用的體外抗病毒研究方法(1)定點誘變產(chǎn)生包含HBV基因組的質(zhì)粒的方法是按照Yeh等(Yeh等，Hepatology(2000)，311318-1326)。簡短地，通過將1拷貝大于單位長度的HBV基因組(3.37kb；核苷酸1820-1990；adw亞型，衍生于pECE-C[Walsh等，Gut(2001)，49436-440])插入載體，pRc/CMV(Invitrogen，SanDiego，CA)產(chǎn)生質(zhì)粒pCMVHBH。在該插入片段的3’和5’末端設(shè)計一個Hind III位點和Xba I位點。
為了產(chǎn)生表達拉米夫定耐藥的突變株的質(zhì)粒，使用基于PCR的策略進行定點誘變實驗。合成側(cè)鄰?fù)蛔兾稽c的兩個引物，Pol-L(上游)和Pol-R(下游)。還合成一組引物，其彼此互補和跨越突變位點。該組引物(有義和反義)包含用于定點誘變的設(shè)計的錯配核苷酸。分別使用Pol-L/反義和Pol-P/有義引物作為PCR引物進行兩組PCR(30個循環(huán))。凝膠純化產(chǎn)生的DNA片段。將1/10每個純化的DNA片段混合在一起，在缺少引物下進行另一個PCR反應(yīng)(10個循環(huán))。最后，將Pol-L和Pol-R加入反應(yīng)，再進行20個循環(huán)的PCR。在用Xba I消化和通過瓊脂糖凝膠電泳純化后，將產(chǎn)生的DNA片段用來替代pCMVHBV中相應(yīng)的Xba I至Xba I片段(核苷酸250-1990)。用于定點誘變實驗的所有引物的核苷酸序列都在以前公布。(Yeh等，Hepatology(2000)，311318-1326)。
通過一步誘變實驗構(gòu)建質(zhì)粒pCMV-LLTQ和pCMV-YIDD。通過兩步誘變實驗構(gòu)建另外兩個質(zhì)粒，pCMV-YVDD-LMAQ和pCMV-YIDD-LMAQ，其中突變位于兩個分開位點。首先產(chǎn)生中間質(zhì)粒，pCMV-LMAQ，實驗第二步產(chǎn)生最終質(zhì)粒。所有DNA質(zhì)粒的核苷酸序列通過DNA序列分析證實。
(2)DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2細胞將HepG2細胞保持在包含10％胎牛血清的極限最低培養(yǎng)基(MEM)中。使用標準CaPO4沉淀法來轉(zhuǎn)染細胞。在轉(zhuǎn)染5小時后細胞甘油受激1分鐘。次日換培養(yǎng)基并加入所需濃度的YKG。24小時后收獲細胞。
(3)HBV DNA的分離和DNA印跡分析。
通過DNA印跡分析HBV-DNA。按照稍微修改的前述方案進行從HepG2細胞中提取HBV DNA。(Yeh等，J.Med.Virol.(1998)，5542-50)。簡短地，將細胞從培養(yǎng)皿中胰蛋白酶化，用磷酸鹽緩沖鹽水漂洗2次并用0.5ml包含0.5％諾乃洗滌劑P-40(NP-40)的TBS(10mM Tris-HCl[pH7.2]，150mM NaCl)溶解。在微型離心機中在1500xg下簡短離心后，將上清液轉(zhuǎn)移至新管中并調(diào)整到10mmol/L MgCl2。在用100μg/ml DNA酶I在37℃下消化30分鐘后，將乙二胺四乙酸(EDTA)加至30mmol/L的終濃度以終止反應(yīng)。為了提取HBV DNA，加入等體積的包含蛋白酶K的緩沖液(50mM Tris-HCl[pH7.2]，1mM EDTA，1％SDS，0.45％NP-40，和200g/ml蛋白酶K)并在55℃下將混合物溫育3小時。在用等體積的酚-氯仿提取兩次和用氯仿提取一次后，用酸性乙醇沉淀DNA并溶解在TE緩沖液(10mM Tris[pH8.0]，1mM EDTA)中。
為了檢測HBV DNA，在印到硝化纖維膜上之前將提取的樣品上樣到1％瓊脂糖凝膠以電泳。通過與地高辛標記的探針雜交檢測HBV DNA。標記探針的方法以及用該探針定量HBV DNA的靈敏度，特異性和有效范圍在別處描述。
結(jié)果通過在HBV在HepG2細胞中溫育24小時后，進行電泳，接著southern印跡分析來檢測HBV-DNA復(fù)制中間體來評估YGK對HBV復(fù)制的作用。通過光密度分析法測量松弛環(huán)狀加上線性形式的HBV-DNA的相對數(shù)量，將來源于無藥物處理(0mg/ml藥物)的細胞的HBV-DNA的量指定為1倍。
結(jié)果顯示濃度為20mg/ml的YGK抑制野生型HBV(抑制到0.61倍)，M552I HBV突變株(抑制到0.76倍)，L528M/M552V HBV突變株(抑制到0.45倍)，和A529T HBV突變株(抑制到0.61倍)中的病毒復(fù)制。
總之，似乎YGK可以有效抑制大多數(shù)拉米夫定耐藥的HBV突變株的復(fù)制。
實施例6YGK和拉米夫定治療對慢性乙型肝炎(HBV)的功效本臨床研究是在中國深圳Liuhua醫(yī)院進行。
目標本臨床研究研究了YGK和拉米夫定單獨或聯(lián)合的治療對慢性乙型肝炎患者中血漿HBV-DNA的清除和HBeAg陰性的作用。
方法I.試驗樣品YGK注射液(5ml/安瓿，包含約2g YGK提取物)和YGK膠囊(約220mg/膠囊，包含約134mg YGK提取物和約86mg淀粉)由中國黑龍江省Gongming制藥有限公司供應(yīng)。
100mg拉米夫定片購自Glaxo Wellcome。
II.病例選擇(1)包含標準(a)按照1990年國家乙型肝炎診斷標準的患者診斷(b)血清HBV-DNA在治療前持續(xù)3周陽性(c)血清HBeAg和HBsAg持續(xù)陽性和波動或連續(xù)異常ALT。
(2)排除標準(a)小于18或大于60的男性或女性，孕婦或哺乳期婦女。
(b)心血管，肺，腎或貧血相關(guān)疾病或精神病患者。
(c)排除不滿足上述標準，不遵守劑量給藥方案，或遺失數(shù)據(jù)的患者。
III.分組和治療(1)分組方法本研究包括總共135位滿足標準的患者?；颊唠S機打亂和分成A，B和C組。A組是有48位患者的治療組，而有42位患者的B組和有45位患者的C組是陽性對照組。各組患者的性別，年齡，和病歷被統(tǒng)計學(xué)分析為不顯著(p＞0.05)和認為是可比較的。
(2)治療方法每種治療方法持續(xù)4周。治療的持續(xù)時間是32周(8個療程)。
(a)A組患者在開始2個療程每天一次通過靜脈注射接受10ml用500ml 5％葡萄糖稀釋的YGK注射液(2安瓿)；貫穿8個療程每天三次接受6個YGK口服膠囊(220mg)；和在開始4個療程期間每天一次接受1片拉米夫定(100mg)。
(b)B組患者每天一次接受1片拉米夫定(100mg)，共8個療程。
(c)C組在開始4個療程期間每天一次通過靜脈注射接受10ml用500ml 5％葡萄糖稀釋的YGK注射液(2安瓿)；貫穿8個療程每天三次接受6個YGK口服膠囊。
IV.觀察和評估(1)觀察項(a)乙型肝炎生物學(xué)標記在治療前，治療期間第4，8，16和32周和治療終止后第24和48周分析血清HBV-DNA，HBeAg，抗-Hbe，HbsAg，抗-HBs。
使用9600 DNA擴增儀(PE公司，USA)和來自中國溫州，浙江E-li-kangBiotech.Corp.的試劑，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)測量血清HBV-DNA。使用自動快速微型免疫分析儀和來自Abbott Laboratories，USA的試劑，通過Imx法測定血清HBeAg，抗Hbe，HBsAg，和抗-HBs。
(b)肝功能在治療期間的第4，8，16和32周和治療終止后第24和48周監(jiān)視ALT。
(c)副作用貫穿整個治療期間醫(yī)務(wù)人員持續(xù)監(jiān)視患者的副作用。
(2)統(tǒng)計學(xué)分析通過x2測驗法(X2)和t-檢驗分析在治療期間第4，8，16，和32周和治療終止后第24和48周獲得的數(shù)據(jù)。將獲得的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果用來評估療效。
結(jié)果1.在治療期間的觀察-血清生物學(xué)標記(1)在1個療程(4周治療)后治療4周后的結(jié)果在表6中顯示。
表6.治療4周后治療效果的比較組患者數(shù) ALT HBV-DNA HBeAg的 抗-Hbe的 HBsAg 的(正常)的清除 血清轉(zhuǎn)化 血清轉(zhuǎn)化 血清轉(zhuǎn)化A組 48 4746 9 9 2B組 42 28**0**0**0**0C組 45 38*16**3 3 0*與A組比較P＜0.05**與A組比較P＜0.01從表5中，明顯的是在4周治療后患者的ALT水平顯著改善。與B組的66.6％(28/42，X2＝15.75，p＜0.01)和C組的84.4％(38/45，X2＝5.39，p＜0.05)相比，97.9％的A組患者(47/48)具有正常的ALT。在A組中HBV DNA血清轉(zhuǎn)陰(95.8％，46/48)顯著高于B組(X2＝82.35，p＜0.01)和C組(X2＝38.04，p＜0.01)。A組中HBeAg的血清轉(zhuǎn)陰(18.8％，9/48)顯著高于B組(X2＝8.55，p＜0.01)，但不顯著高于C組(X2＝3.07，p＞0.05)。A組中HBsAg的血清轉(zhuǎn)陰為4.2％(2/48)，其與B組和C組(分別X2＝1.80和1.95，p＞0.05)相比較高但在統(tǒng)計學(xué)上不顯著。拉米夫定陽性對照組(B組)中沒有一位患者顯示對HBV DNA血清轉(zhuǎn)化的任何效應(yīng)。
(2)在兩個療程(八周治療)后治療8周后的結(jié)果在表7中顯示。
表7.治療8周后治療效果的比較組患者數(shù)HBV-DNAHBeAg的抗-HBe的HBsAg的 抗-HBs的的清除 血清轉(zhuǎn)化 血清轉(zhuǎn)化血清轉(zhuǎn)化 血清轉(zhuǎn)化A組 48 48 18 18 9 0B組 42 0**0**0**0**0C組 45 16**11 11 0**0**與A組比較P＜0.01如表7所示，所有A組患者具有HBV DNA的完全清除，而B和C組保持不變。A組患者中HBeAg血清轉(zhuǎn)陰增加到37.5％(18/48)，其顯著高于B組(X2＝19.62，p＜0.01)但不顯著高于C組(X2＝1.86，p＜0.01)。A組患者中HBsAg的血清轉(zhuǎn)陰增加到18.7％(9/48)，而B和C組未顯示任何血清轉(zhuǎn)化，分別地X2＝8.55和9.39，p＜0.01。拉米夫定陽性對照組(B組)中沒有一位患者顯示對HBV DNA血清轉(zhuǎn)化的任何效應(yīng)。
(3)在4個療程(16周治療)后在第8周后已經(jīng)停止對A組患者的YGK注射液治療。16周治療后的發(fā)現(xiàn)在表8中顯示。
表8.在16周治療后療效比較組患者數(shù)HBV-DNAHBeAg的抗-HBe的HBsAg的抗-HBs的的清除 血清轉(zhuǎn)化 血清轉(zhuǎn)化血清轉(zhuǎn)化 血清轉(zhuǎn)化A組 48 48 23 23 18 5B組 42 26**2**0**0**0C組 45 36**14 14 6**0**與A組比較P＜0.01如表8所示，明顯的是，甚至在第8周后停止YGK注射液的條件下A組患者的HBV DNA保持陰性。對于B和C組，分別有61.9％(26/42)和80％(36/45)的患者顯示陰性HBV DNA。然而，這些仍然顯著(p＜0.01)低于A組(對于B和C組分別地X2＝22.32和10.60)。A組HBeAg的血清轉(zhuǎn)化已經(jīng)增加到47.9％(23/48)，其顯著(X2＝20.79，p＜0.01)高于B組的4.8％(2/42)但不顯著(X2＝2.79，p＞0.05)高于C組。A組HBsAg的血清轉(zhuǎn)化已經(jīng)增加到31.1％(18/48)，其顯著高于B和C組(分別地X2＝19.62和7.07，p＜0.01)。當與A組比較時，B組患者的HBV DNA已經(jīng)顯示相對有限的血清轉(zhuǎn)化。
(4)在8個療程(32周治療)后在16周后已經(jīng)停止對A組患者的拉米夫定片的治療和對C組患者YGK注射液的治療。
表9.在32周治療后療效比較組患者數(shù)HBV-DNA的HBeAg的抗-HBe的HbsAg的抗-HBs的清除 血清轉(zhuǎn)化 血清轉(zhuǎn)化血清轉(zhuǎn)化 血清轉(zhuǎn)化A組 48 48 39 39 24 12B組 42 38*4**4**1**1C組 45 42 28*28*16 7*與A組比較P＜0.05**與A組比較P＜0.01如表9所示，明顯的是，在32周結(jié)束時A組患者的HBV DNA繼續(xù)為陰性，即使他們只從第16周末開始服用YGK膠囊。B組HBVDNA陰性轉(zhuǎn)化已經(jīng)增加到90.5％(38/42)，其仍然顯著低于A組(X2＝4.77，p＜0.05)。C組HBV DNA轉(zhuǎn)化已經(jīng)增加到93.3％(42/45)，其可以比得上A組(X2＝3.35，p＞0.05)。A組HBeAg血清轉(zhuǎn)化繼續(xù)增加到81.3％(39/48)，其顯著高于B組(9.5％，4/42，X2＝46.26，p＜0.01)和C組(62.2％，28/45，X2＝4.19，p＜0.05)。A組的HBsAg血清轉(zhuǎn)化已經(jīng)增加到50％(24/48)，其顯著高于B組(X2＝25.38，p＜0.01)但不顯著高于C組(X2＝1.95，p＞0.05)。結(jié)果顯示A組和C組的HBVDNA陰性血清轉(zhuǎn)化遠比B組好。
2.副作用除了在靜脈注射時的常見疼痛和口干，A組患者沒有與治療方案有關(guān)的顯著副作用。
在16周的治療后，B組42位患者中的8位顯示副作用，如厭食，腹部不適和波動的ALT水平。然而，癥狀在再治療2周后消失。
在8周治療后，C組45位患者中的17位顯示口干，腹部不適和波動的ALT水平。然而，癥狀在繼續(xù)治療后消失，肝功能恢復(fù)正常。
3.后續(xù)治療表10.在治療終止后第24和48周時血清生物學(xué)標記組 患者HBV-DNAHBeAg的血清抗-HBe的HBsAg的抗-HBs的數(shù) 的清除 轉(zhuǎn)化 血清轉(zhuǎn)化血清轉(zhuǎn)化 血清轉(zhuǎn)化24W 48W 24W48W 24W 48W 24W 48W 24W48WA組 48 4848 42 4242422929 29 29B組 42 38*26**4**0**4**0**1**0**1**0**C組 45 4242 32*32*32*32*1818 11*11*[請證實]*與A組比較P＜0.05**與A組比較P＜0.01如表10所示，明顯的是，所有使用YGK注射液，YGK膠囊和拉米夫定的聯(lián)合治療的A組患者在治療終止24和48周后保持HBV DNA的陰性。除了在治療期間測試陰性的39位患者以外，另有3位患者已經(jīng)測試HBeAg陰性，導(dǎo)致血清轉(zhuǎn)化率增加6.2％至總共87.5％(42/48)。除了在32周治療期間測試陰性的24位患者以外，另有5位患者已經(jīng)測試HBsAg陰性，導(dǎo)致血清轉(zhuǎn)化率增加10.4％至總共60.4％(29/48)。
對于C組，在終止治療后未觀察到另外的HBV DNA血清轉(zhuǎn)化。4位更多的患者顯示HBeAg轉(zhuǎn)化，增加血清轉(zhuǎn)化率8.9％至總共71.1％，然而，這仍然顯著低于A組(X2＝3.91，p＜0.05)。另有2位患者顯示HBsAg轉(zhuǎn)化，增加血漿轉(zhuǎn)化率4.4％至總共40％，其與A組(X2＝3.81，p＞0.05)無顯著差異。
對于B組，在治療期間為HBV DNA陰性的、38位患者中的12位在治療終止后第48周已經(jīng)復(fù)發(fā)和顯示HBV DNA陽性?？傃遛D(zhuǎn)化率降低至61.9％(26/42)，其比32周治療結(jié)束時低28.6％。那些在32周治療結(jié)束時顯示HBeAG和HBsAg血清轉(zhuǎn)化的少數(shù)患者在治療終止后第48周全都復(fù)發(fā)為陽性。
結(jié)論和討論通過血清和肝組織中HBV-DNA的連續(xù)清除，HBsAg的清除和抗-HBs的生產(chǎn)，HBV復(fù)制的抑制，HBeAg的清除和抗-HBe的生產(chǎn)，如通過正常水平的血清轉(zhuǎn)氨酶顯示的肝組織損傷的顯著改善，死肝細胞的組織學(xué)檢查和減輕炎癥的指征評估治療方案對慢性乙型肝炎的療效。
因為復(fù)雜的病毒結(jié)構(gòu)和HBV的復(fù)制循環(huán)和患者免疫系統(tǒng)狀況和體內(nèi)病毒存在狀態(tài)之間的緊密關(guān)系，難以實現(xiàn)HBV的清除和病毒復(fù)制的抑制。因此，慢性乙型肝炎的有效治療方案必須攻擊病毒復(fù)制的每一可能的階段以阻止病毒復(fù)制和改善患者的免疫系統(tǒng)，包括破壞HBV的免疫耐受性和調(diào)整身體的免疫平衡。
本發(fā)明YGK和拉米夫定的聯(lián)合治療能夠?qū)崿F(xiàn)抑制病毒復(fù)制和改善患者免疫功能的雙重目標。作為第二代核苷酸類似物代表的拉米夫定對于HBV復(fù)制期間逆轉(zhuǎn)錄酶活性的抑制非常有效。6個月的拉米夫定治療有效降低血清中的HBV-DNA，患者轉(zhuǎn)陰率可高達90.4％。然而，拉米夫定治療存在缺點，即拉米夫定只在病毒復(fù)制循環(huán)的單一點切斷以致在拉米夫定治療后患者的HBeAg轉(zhuǎn)陰率極低(9.5％)，需要長期拉米夫定治療。實際上，本研究證實用拉米夫定治療的患者在治療完成后具有高HBeAg轉(zhuǎn)陽率。
兩種類型的YGK制劑，YGK靜脈注射液和YGK膠囊在治療HBV患者中有效。YGK靜脈注射液具有直接的抗HBV作用。按照現(xiàn)在正在進行的研究，YGK靜脈注射液可以阻止在病毒復(fù)制期間核苷酸的攝取以致病毒將變得虛弱和死亡。在另一方面，YGK膠囊有效用于肝細胞的保護和免疫功能調(diào)節(jié)。YGK靜脈注射液和膠囊兩種的結(jié)合使用可有效抑制HBV復(fù)制和刺激肝功能的恢復(fù)。
拉米夫定和YGK的聯(lián)合治療具有在HBV復(fù)制的多個階段提供多種抗病毒功能的優(yōu)勢。首先，拉米夫定抑制HBV復(fù)制期間逆轉(zhuǎn)錄酶的酶活。第二，YGK靜脈注射液阻止在DNA復(fù)制期間病毒對核苷酸的攝取。最后，YGK膠囊調(diào)節(jié)身體免疫功能以便刺激肝臟的恢復(fù)。
本研究的結(jié)果證明YGK和拉米夫定的聯(lián)合治療可以在8周內(nèi)清除血清HBV-DNA。這是基于事實即在8周后100％的患者顯示HBV-DNA陰性。兩種YGK制劑形式的結(jié)合使用另外暗示開發(fā)對HBV的治療方案。
盡管本發(fā)明已經(jīng)通過實施例的方式和在優(yōu)選實施例方面描述，應(yīng)當理解本發(fā)明不受限于公開的實施方案。相反，它意欲包含諸如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的各種變體。因此，后附權(quán)利要求的范圍應(yīng)當給予最廣泛的解釋以便包含所有的這些變體。
權(quán)利要求
1.一種用于治療肝病患者的方法，其包含向所述患者聯(lián)合給藥有效量的一種藥物組合物和拉米夫定，其中所述藥物組合物包含白花蛇舌草的整株，拳參的根莖，虎杖的根莖，和五味子的熟果的水性提取物。
2.按照權(quán)利要求1的方法，所述藥物組合物另外包含北豆根根莖，黃苓根，牛黃粉，郁金塊莖，山楂熟果和三七根的水性提取物。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其另外包含枸杞子的熟果，紅參根，玄參根，當歸根和黃芪根的水性提取物。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其中將所述藥物組合物口服給藥于所述患者。
5.按照權(quán)利要求4的方法，其中所述口服給藥的藥物組合物劑量為每人每日所述藥物組合物的約0.5-5g所述水性提取物。
6.按照權(quán)利要求5的方法，其中所述口服給藥的藥物組合物的所述劑量為每人每日所述藥物組合物的約1-3g所述水性提取物。
7.按照權(quán)利要求3的方法，其中所述藥物組合物是通過靜脈注射給藥。
8.按照權(quán)利要求7的方法，其中所述藥物組合物的劑量為每人每日所述藥物組合物的約1-10g所述水性提取物。
9.按照權(quán)利要求8的方法，其中所述藥物組合物的劑量為每人每日所述藥物組合物的約3-5g所述水性提取物。
10.按照權(quán)利要求3的方法，其中將所述藥物組合物同時口服和靜脈內(nèi)給藥。
11.按照權(quán)利要1的方法，其中所述拉米夫定是口服給藥。
12.按照權(quán)利要1的方法，其中所述拉米夫定是以每人每日50-500mg的劑量口服給藥。
13.按照權(quán)利要12的方法，其中所述拉米夫定是以每人每日100-200mg的劑量口服給藥。
14.按照權(quán)利要1的方法，其中所述肝病包含選自肝炎，肝硬化，和肝癌中的至少一種。
15.按照權(quán)利要1的方法，其中所述肝病是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所導(dǎo)致。
16.一種藥物組合，其包含權(quán)利要求3的所述藥物組合物的第一劑量單位和拉米夫定的第二劑量單位。
17.按照權(quán)利要求16的藥物組合，其中所述藥物組合物的所述第一劑量單位是選自所述藥物組合物的口服劑量形式和所述藥物組合物的靜脈注射液中的至少一種。
18.按照權(quán)利要求17的藥物組合，其中所述藥物組合物的口服劑量形式的用量為每次給藥約0.1-2g所述藥物組合物和約1天2-4次。
19.按照權(quán)利要求17的藥物組合，其中所述藥物組合物的所述靜脈注射液的用量為每次給藥約1-10g所述藥物組合物和約1天1次。
20.按照權(quán)利要求16的藥物組合，其中所述拉米夫定是每次給藥約50-500mg和約1天1次。
21.按照權(quán)利要求16的藥物組合，其中將所述藥物組合物用來治療肝病患者。
22.按照權(quán)利要求16的藥物組合，其中所述肝病是選自肝炎，肝硬化，和肝癌中的至少一種。
23.按照權(quán)利要求22的藥物組合，其中所述肝病是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所導(dǎo)致。
24.一種防止在拉米夫定治療停藥后患者肝炎復(fù)發(fā)方法，其包含在拉米夫定治療退出后向所述患者給藥一種藥物組合物；其中所述藥物組合物包含白花蛇舌草的整株，拳參的根莖，虎杖的根莖，和五味子的熟果的水性提取物。
25.按照權(quán)利要求24的方法，所述藥物組合物另外包含北豆根根莖，黃苓根，牛黃粉，郁金塊莖，山楂熟果和三七根的水性提取物。
26.按照權(quán)利要求25的方法，所述藥物組合物另外包含枸杞子的熟果，紅參根，玄參根，當歸根和黃芪根的水性提取物。
27.按照權(quán)利要求26的方法，其中所述藥物組合物是口服或靜脈內(nèi)給藥，或是口服和靜脈內(nèi)同時給藥。
28.按照權(quán)利要求24的方法，其中所述肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所導(dǎo)致。
29.一種用于抑制患者中拉米夫定耐藥性發(fā)展的方法，其包含向所述患者給藥一種藥物組合物；其中所述藥物組合物包含白花蛇舌草的整株，拳參的根莖，虎杖的根莖，和五味子的熟果的水性提取物。
30.按照權(quán)利要求29的方法，所述藥物組合物另外包含北豆根根莖，黃苓根，牛黃粉，郁金塊莖，山楂熟果和三七根的水性提取物。
31.按照權(quán)利要求30的方法，所述藥物組合物另外包含枸杞子的熟果，紅參根，玄參根，當歸根和黃芪根的水性提取物。
32.按照權(quán)利要求29的方法，其中所述藥物組合物是口服或靜脈內(nèi)給藥，或是口服和靜脈內(nèi)同時給藥。
33.按照權(quán)利要求29的方法，其中所述拉米夫定耐藥性是由患者中耐受拉米夫定乙型肝炎病毒(HBV)菌株的發(fā)展所導(dǎo)致。
全文摘要
本發(fā)明提供通過向患者聯(lián)合給藥一種藥物組合物和拉米夫定治療肝病患者的方法。藥物組合物是草藥組合物，其包含白花蛇舌草的整株，拳參的根莖，虎杖的根莖，和五味子的熟果的水性提取物作為核心成分。本發(fā)明還提供通過將本發(fā)明的藥物組合物提供給拉米夫定治療的患者，防止在拉米夫定治療已經(jīng)停止后患者肝炎復(fù)發(fā)和抑制患者中拉米夫定耐藥性發(fā)展的方法。
文檔編號A61K35/37GK1599617SQ02824119
公開日2005年3月23日 申請日期2002年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月5日
發(fā)明者鄔之盛 申請人:鄔之盛