專利名稱：保存穩(wěn)定的纖維蛋白原溶液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及保存穩(wěn)定的、濃縮纖維蛋白原制劑和一種由此阻止失血、促進(jìn)傷口愈合、和許多其它治療性或非治療性用途的使用方法。
相關(guān)申請參考本申請要求2001年10月3日提交的美國臨時申請No.60/326,963的優(yōu)先權(quán)，此處將其全文引做參考。
背景技術(shù)：
纖維蛋白原是一種血漿蛋白，它在哺乳動物維持止血和防止失血的凝固最后階段中起重要作用。哺乳動物中的凝血塊形成，即血液凝結(jié)，是通過一個復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的，在級聯(lián)事件的最后步驟中，纖維蛋白原單體與凝血酶和激活因子XIII在鈣離子存在下反應(yīng)形成含有交聯(lián)血纖維蛋白聚合體的血纖維蛋白凝塊。
血漿蛋白中濃度為2～4克/升的纖維蛋白原單體，由三對經(jīng)二硫鍵相連的多肽鏈組成。這些多肽鏈稱作(Aα)2、(Bβ)2(分別表示α和β鏈的兩個小氨基末端肽)和γ2。凝血酶從纖維蛋白原切割血纖維蛋白肽A產(chǎn)生化合物血纖維蛋白I，之后切割血纖維蛋白肽B產(chǎn)生最終的化合物血纖維蛋白II。該切割僅輕微地將纖維蛋白原的分子量從340,000道爾頓降低為334,000，但是這一過程卻暴露出重要的形成匯聚且交聯(lián)的血纖維蛋白凝塊的聚合反應(yīng)位點。參見，Jackson，Ann.Rev.Biochem 49765-811(1980)；Furie等人，Cell 53505-518(1988)。
最近，已開發(fā)出含有纖維蛋白原、凝血酶和其它成分的生物膠粘劑，它模擬自然凝固的最后階段，從而產(chǎn)生血纖維蛋白凝塊。對所謂的血纖維蛋白封閉劑或組織封閉劑、生物封閉劑、血纖維蛋白膠或組織膠、對生物膠粘劑、或類似物(本文中都是指“血纖維蛋白封閉劑”)這些物質(zhì)的測試顯示出抗張強(qiáng)度與最終的纖維蛋白原濃度有正比關(guān)系(日本專利未審公開申請，Kokai No.Sho61-293443)。因此，濃縮纖維蛋白原的可獲得性對于常規(guī)的血纖維蛋白封閉劑的制備是重要的。
基于纖維蛋白原的組織膠粘劑是已知的，例如來自美國專利No.6,117,425(MacPhee等人)的。除了纖維蛋白原和因子XIII，這樣的配方也可以包含其它的蛋白質(zhì)，例如纖連蛋白和白蛋白，以及可任選地包含抗生素試劑、生長因子等等。所需的催化(凝血酶-介導(dǎo)的)活性可以由其所要應(yīng)用的宿主組織(受傷表面)產(chǎn)生，或者在應(yīng)用過程中以含凝血酶和Ca++離子的溶液或粉末的形式賦予組織膠粘劑。這樣的血纖維蛋白封閉劑已被用于人或動物組織或器官部分的無縫和/或有縫結(jié)合，用于創(chuàng)傷封口、止血及促進(jìn)傷口愈合，用于包埋假器官裝置，以及用于許多其它治療性或非治療性用途。
血纖維蛋白封閉劑中的纖維蛋白原成分來自收集的血漿，它常作為因子VIII制備過程中的廢棄物。通過冷沉淀作用，或使用其它各種不同試劑，例如，聚乙二醇、乙醚、乙醇、硫酸銨、或甘氨酸的已知方法產(chǎn)生沉淀作用，可將纖維蛋白原從血漿中濃縮。例如，Brennan，Blood Reviews 5240-244(1991)；Gibble等人，Transfusion 30741-747(1990)；Matras，J.Oral Maxillofac.Surg.43605-611(1985)；Lerner等人，J.Surg.Res.48165-181(1990)等對血纖維蛋白封閉劑進(jìn)行了綜述。
根據(jù)美國專利No.5,290,552，從制備的角度來看，早期的外科膠粘劑配方中必須包含高含量的纖維蛋白原(約8～10％)，很難由其制備凍干物。這樣的冷沉淀物是相對不穩(wěn)定的，需要在低于-20℃下保存直至使用。提高冷沉淀物穩(wěn)定性的配方包括添加纖溶酶原激活劑的抑制劑或白蛋白。
若纖維蛋白原濃度足夠高，該制劑在傷口愈合過程中提供有效止血、良好的傷口和/或組織區(qū)域的封閉粘合性、高強(qiáng)度的粘合性和/或傷口封閉性、以及膠粘劑的完全可再吸收能力。為了優(yōu)化粘合，更求在即可使用的組織膠粘劑溶液中的纖維蛋白原濃度為約15至60mg/ml(MacPhee，私人通信，1995)。
組織膠粘劑或者以深度冷凍溶液或者以凍干物的形式出售。這是因為作為液體溶液，已知高度濃縮的纖維蛋白原是高度不穩(wěn)定的(httpwww.tissuesealing.com/us/products/biological/monograph.cfm)，即，它會自發(fā)地凝結(jié)。所以，可商業(yè)獲得的凍干和/或深度冷凍的纖維蛋白原濃縮物，例如Tissucol，目前必須在使用前液化，即，在使用前慢慢地融解(“熔化”)或者從凍干形式重構(gòu)。然而，這兩個液化過程都使得產(chǎn)品在能夠使用之前非常費事以及造成相當(dāng)長的時間拖延，這會使受傷的病人處于生命受到威脅的境地。
深度冷凍濃縮物的“液化溫度”，例如，將制劑從冰凍固體轉(zhuǎn)化為液體的溫度點，要求緩慢升高溶液溫度——通常至少達(dá)25℃，更常見的是37℃以上，同時劇烈攪拌或振蕩多至30～60分鐘(http//www.tissuesealing.com/us/products/biological/monograph.cfm)。結(jié)果是，現(xiàn)有技術(shù)中的纖維蛋白原制劑的重構(gòu)需更使用水浴或者其它加熱裝置(典型地在37℃)以在可能的最短時間內(nèi)將深度冷凍材料轉(zhuǎn)化為即可使用的溶液。然而，由于例如為保證產(chǎn)品的無菌條件而所必需的雙層外包裝典型地使熱交換在整個困難且麻煩的融化步驟中更難進(jìn)行。例如，預(yù)填充、即用式、無菌一次性注射器中的深度冷凍的血纖維蛋白封閉劑制劑為保證無菌必須是用塑料膜雙層密封的。
從深度冷凍固體向液體狀態(tài)的轉(zhuǎn)變不是急劇發(fā)生的，而是通過連續(xù)的升溫步驟、經(jīng)膠狀及粘性過渡狀態(tài)后發(fā)生的。根據(jù)至少一種試驗，只有當(dāng)試管傾斜時形成一個水平的液體水平面，即，樣品流動后瞬間不會形成可見的突起，此時樣品才可被稱作“液體”。因此，為判斷樣品何時達(dá)到均勻的“液體”即用式狀態(tài)而對樣品進(jìn)行的測試使得在保存的現(xiàn)有纖維蛋白原制劑可以使用之前增加了額外的費時步驟。此外，操作者一定程度的不確定性以及可能的出錯顯然會影響纖維蛋白原產(chǎn)品的有用性和有效性。
凍干的纖維蛋白原的配制時間也在產(chǎn)品能夠使用前產(chǎn)生顯著的延誤，這成為目前可獲得的纖維蛋白原類止血劑使用中的一個實際問題。因此，已經(jīng)進(jìn)行了許多努力以改善凍干的纖維蛋白原制劑的溶解性能。例如，加熱過程中生產(chǎn)者需要在蛋白質(zhì)小瓶中使用磁性攪拌子以產(chǎn)生顯著的振蕩。與未經(jīng)顯著混合的相同產(chǎn)品相比，這會使其溶解時間更快，但也仍然需要30～60分鐘的制備時間以僅僅得到可以立即使用的纖維蛋白原。
病毒鈍化方法的使用常進(jìn)一步降低現(xiàn)有纖維蛋白原制劑的溶解度。這些方法優(yōu)選通過對凍干材料進(jìn)行熱處理的方式來實施，例如根據(jù)EP 0 159 311。
已知可以通過添加某些添加劑來改良對凍干物的重構(gòu)。因此，例如，EP-0345 246描述了一種凍干的纖維蛋白原制劑，其中除纖維蛋白原外進(jìn)一步包含至少一種生物學(xué)可接受的添加劑(表面活性劑)。表面活性劑的添加改進(jìn)了凍干物與溶劑的潤濕性，由此提高一定溫度下的溶解速率，但不是提高纖維蛋白原自身的溶解度。因此，這樣的制劑也必須在高于25℃，通常37℃的環(huán)境溫度下重構(gòu)。
為了克服凍干或深度冷凍的纖維蛋白原產(chǎn)品，尤其是濃縮制劑，在使用前必須重構(gòu)或液化這一要求，已經(jīng)有在室溫下可溶的某些纖維蛋白原制劑的介紹。然而，這樣的現(xiàn)有產(chǎn)品是呈細(xì)胞毒性的(Beriplast，Biocol，Bolheal HG-4)。
美國專利No.5,962,405提供了一種保存穩(wěn)定的的纖維蛋白原凍干制劑或深度冷凍的纖維蛋白原液體制劑，它可以重構(gòu)和液化為即用式的纖維蛋白原和/或組織膠粘劑溶液——優(yōu)選不使用附加手段，例如加熱和/或攪拌裝置，來產(chǎn)生纖維蛋白原濃度至少為70mg/ml的即用式組織膠粘劑溶液。然而，該制劑含有纖維蛋白原和至少一種改進(jìn)制劑溶解度、和/或降低其液化溫度、以及降低室溫下即用式組織膠粘劑溶液粘度的附加物質(zhì)。這一提高溶解度的物質(zhì)選自以下物質(zhì)中的一種或多種苯、吡啶、哌啶、嘧啶、嗎啉、吡咯、咪唑、吡唑、呋喃、噻唑、嘌呤化合物或維生素、核堿基、核苷或核苷酸，添加比率為0.03～1.4mmol/克纖維蛋白原，盡管推薦使用相對更高的物質(zhì)/纖維蛋白原比率。也可以另外添加其它蛋白質(zhì)、佐劑和添加劑。然而，由于降低了液化溫度，′405專利聲明對深度冷凍、濃縮的纖維蛋白原溶液的液化在20～23℃(室溫)的環(huán)境溫度下是有利的，與前述37℃的加溫條件相反。盡管如此，該方法仍然要求在深度冷凍的條件下保存(溫度維持在-25℃至-15℃以下)，且制劑仍需要15分鐘進(jìn)行液化。
關(guān)于解決用于組織封閉劑制劑中的纖維蛋白原溶液早期凝固問題的另一種方式，美國專利No.5,985,315提供了一種穩(wěn)定的生物預(yù)活化膠粘劑，其含有纖維蛋白原和至少一種活化的凝固因子，該凝固因子的活化不依賴鈣離子。該預(yù)活化的膠粘劑在水溶液中是穩(wěn)定的，即，該溶液在20℃下至少一小時內(nèi)不會自發(fā)凝固；但是可以簡單地通過添加鈣離子而在5分鐘內(nèi)凝固。不需要額外的激活劑。因此，所得的生物膠粘劑實現(xiàn)凝固既不需要添加凝血酶也不需要添加凝血酶原。然而不幸的是，這種緩慢的凝固時間使得將所得的血纖維蛋白封閉劑用于任何類型的流血和搏動傷口都是不切實際的。
因此從醫(yī)療的角度來看，重要的是即用式、生物學(xué)的、組織膠粘劑的快速可獲得性，尤其是在外科緊急情況下。此外，要求制備即用式血纖維蛋白封閉劑溶液的操作盡可能得少，以使輔助人員的負(fù)擔(dān)降至最小。血纖維蛋白封閉劑制劑需要保存的纖維蛋白原組分，但是目前纖維蛋白原只能以凍干物、深度冷凍濃縮物、或與其它組分混合物的形式獲得，這些其它組分可能會對基于纖維蛋白原的組織膠粘劑的效果或?qū)Σ∪嘶蚴茉囌叩陌踩褂卯a(chǎn)生不利影響。因此，仍然需要一種保存穩(wěn)定的、即用式纖維蛋白原溶液，盡管其是高濃度的也仍保持流體形式，且能夠快速簡易地加工成組織膠粘劑制劑。
發(fā)明概述本發(fā)明包括穩(wěn)定保存即用式、生物相容性哺乳動物纖維蛋白原的方法，不論其濃度也仍保持流體形式，且能夠快速簡易地加工成組織膠粘劑制劑。還提供了由本發(fā)明方法的應(yīng)用而得到的無菌、保存穩(wěn)定的含水纖維蛋白原產(chǎn)品，其中纖維蛋白原保持即用的液體形式，未自發(fā)凝結(jié)(即，甚至在無激活劑，例如凝血酶/Ca++的存在下就形成凝塊)，并保持其生物活性(即，一旦暴露于凝血酶和Ca++中并與之劇烈混合后快速形成血纖維蛋白凝塊的能力)。本發(fā)明的濃縮保存的、即用式的、生物可相容的哺乳動物纖維蛋白原是完全溶解的，溶液是含水的，并且其穩(wěn)定性是pH和溫度依賴性的。產(chǎn)品可以冷凍、融解、再冷凍及再融解，且不影響組合物的凝結(jié)特性。例證的哺乳動物纖維蛋白原是牛的，但本發(fā)明并不受其限制，可以是任何哺乳動物的纖維蛋白原。
本發(fā)明的方法提供了一種穩(wěn)定、濃縮的、即用式、生物相容性哺乳動物的纖維蛋白原溶液，其穩(wěn)定性保持期限是在最初制備后至少一(1)天至一年或更多年。
根據(jù)一種優(yōu)選方法，本發(fā)明提供一種新鮮制備、或新鮮分離純化自血漿、或為上述任一種的冷凍制劑的即用式纖維蛋白原溶液，其在室溫或冷藏溫度(約4℃)下于適宜容器中無菌保存，pH范圍是6.5至8.2。穩(wěn)定性至少保持一年或更長。進(jìn)一步提供的是根據(jù)本發(fā)明方法保存的即用式、無菌、穩(wěn)定的含水纖維蛋白原溶液。
根據(jù)另一種優(yōu)選方法，本發(fā)明提供向上述即用式纖維蛋白原溶液中添加蛋白酶抑制劑以提高它們的保存穩(wěn)定性。相應(yīng)地，本發(fā)明提供一種在即用式、水溶液中穩(wěn)定保存哺乳動物纖維蛋白原的方法，包括新鮮制備纖維蛋白原溶液，或在無菌條件下從血漿中新鮮分離純化纖維蛋白原溶液；向纖維蛋白原溶液中添加有效量的蛋白酶抑制劑以防止纖維蛋白原樣品酶解；以及保存纖維蛋白原溶液于(i)約4℃至約23℃間的一個恒定溫度下，其中纖維蛋白原溶液保持為液態(tài)；(ii)pH范圍在6.31至8.1之間；(iii)纖維蛋白原的生物相容性和生物活性得以保持的條件下。穩(wěn)定性至少保持一年或更長。進(jìn)一步提供的是根據(jù)本發(fā)明方法保存的即用式、無菌、穩(wěn)定的含水纖維蛋白原溶液。
在某些實施方案中還向上述保存穩(wěn)定的、即用式纖維蛋白原溶液中添加其它添加劑或組分以增強(qiáng)所得纖維蛋白原在后述用途、或產(chǎn)品或由其制備的材料中的效果。進(jìn)一步提供的是根據(jù)這樣的替代方法保存的即用式、無菌、穩(wěn)定的含水纖維蛋白原溶液。
如此制備并保存的即用式、濃縮的哺乳動物纖維蛋白原溶液可被中和且不經(jīng)額外的步驟或處理而用于制備生物組織膠粘劑或封閉劑，包括即溶的血纖維蛋白封閉劑制劑，以及用于其它藥理或化妝用途，包括，例如，傷口愈合、凝固、纖維蛋白原血癥、手術(shù)或術(shù)后后遺癥的抑制、人工血管包埋、或注輸目的，以及用于其它補(bǔ)充或非補(bǔ)充的體內(nèi)或體外治療性或非治療性用途。
本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點或新穎特征將在下面的說明書、實施例和附圖中得到部分闡明，而且對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說經(jīng)過對下述內(nèi)容進(jìn)行審查，其中部分內(nèi)容將是顯而易見的，或者是通過對本發(fā)明的實踐可以得知的。


與附圖一起閱讀能更好的理解前面的發(fā)明概述以及下面的發(fā)明詳述。為闡明本發(fā)明，附圖中顯示了當(dāng)前優(yōu)選的某些實施方式。然而，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所示的確切安排和手段。
圖1A和1B是牛纖維蛋白原樣品于室溫下保存44天后的非還原(圖1A)和還原的SDS PAGE(圖1B)圖。兩塊膠中的泳道相同。1＝MW標(biāo)準(zhǔn)；2＝牛纖維蛋白原對照；3＝用pH為7.24組氨酸緩沖的樣品；4＝用pH為9.31甘氨酸緩沖的樣品；5＝用pH為9.05碳酸鹽緩沖的樣品；6＝用pH為9.86碳酸鹽緩沖的樣品；7＝牛纖維蛋白原對照。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供穩(wěn)定保存即用式纖維蛋白原的方法，該即用式纖維蛋白原不論其濃度仍然保持流體形式，并可以快速簡易的加工成組織膠粘劑制劑。本發(fā)明還提供了用本發(fā)明的方法得到的保存穩(wěn)定的、含水纖維蛋白原產(chǎn)品。
本發(fā)明的即用式、含水纖維蛋白原溶液是“保存穩(wěn)定的”，保存一定天數(shù)后仍保持液體形態(tài)，未自發(fā)凝結(jié)(即，甚至在無激活劑，例如凝血酶/Ca++的存在下就形成凝塊)，并保持其生物活性(即，一旦暴露于凝血酶和Ca++中并與之充分混合后快速形成血纖維蛋白凝塊的能力)。所公開的方法給出了纖維蛋白原長時間內(nèi)在即用式、含水溶液中保持活性和穩(wěn)定性(保存穩(wěn)定的)的條件。
本文所使用的保存穩(wěn)定的纖維蛋白原溶液的“活性”是指蛋白質(zhì)的“生物活性”，且“生物活性”是指已知與纖維蛋白原或其亞群(subset)有關(guān)的一種或多種體外和/或體內(nèi)的活性，例如上述快速形成血纖維蛋白凝塊的能力。評價生物活性的方法是那些本領(lǐng)域已知的方法。
本公開文本中，除非特別定義，文中所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。
本發(fā)明的保存方法適用于任何纖維蛋白原制劑，無論其是分離純化自血漿、或經(jīng)重組制備、或新鮮分離、或新鮮制備自凍干或深度冷凍制劑。本發(fā)明的方法適用于任何時間長度的凍干或深度冷凍的纖維蛋白原制劑，只要新鮮制備的纖維蛋白原溶液的生物活性與對比的分離純化自血漿的纖維蛋白原樣品相當(dāng)，且溶液中未自發(fā)凝結(jié)成塊。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案適用于制備過程中的粗纖維蛋白原產(chǎn)品，或具有大于90％的蛋白質(zhì)純度及大于95％的可凝結(jié)蛋白質(zhì)的最終的濃縮纖維蛋白原制劑，或介于兩者之間的任一纖維蛋白原濃度。例如，在以下實施例中，牛纖維蛋白原制劑的蛋白質(zhì)純度為61％及可凝結(jié)蛋白質(zhì)為97％，而在本發(fā)明人用人纖維蛋白原實施的其它實施例(數(shù)據(jù)未給出)中，制劑的蛋白質(zhì)純度為53％及可凝結(jié)蛋白質(zhì)為95％。然而，本發(fā)明的方法對兩者都適用。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選且為代表性的實施方案中，保存方法適用于濃縮的牛纖維蛋白原制劑。本發(fā)明的保存穩(wěn)定的纖維蛋白原制劑，盡管是高度濃縮的，在水溶液中保持溶解狀態(tài)使纖維蛋白原特別適于制備補(bǔ)充或非補(bǔ)充性的、即用式生物組織膠粘劑。纖維蛋白原用于制備即用式組織膠粘劑制劑時，理想地以10～85mg/ml的濃度保存，更優(yōu)選濃度為15～75mg/ml，甚至更優(yōu)選濃度為30～70mg/ml，和最優(yōu)選濃度為40～65mg/ml。
此外，本發(fā)明保存穩(wěn)定的水溶液中纖維蛋白原、或含纖維蛋白原的蛋白質(zhì)的濃度范圍一般是2至10w/v％，優(yōu)選4至7w/v％。測定280nm下的蛋白質(zhì)吸收來檢測纖維蛋白原的濃度(用14作為1％纖維蛋白原溶液的消光系數(shù))。
本發(fā)明保存穩(wěn)定的纖維蛋白原是完全溶解于含水溶液中的，即，基于水的溶液。理想的制劑溫度和pH可以根據(jù)本發(fā)明得知，也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員用已知方法快速測定。然而，水基凝膠也可用于本發(fā)明，只要這樣的材料允許其中所包含的纖維蛋白原完全溶解，以及只要制劑具有足夠的流動性能允許快速制備根據(jù)本文所公開方法進(jìn)行保存之后的即用式生物組織膠粘劑或其它應(yīng)用。本發(fā)明的一個關(guān)鍵是這樣一個事實，即，纖維蛋白原溶液是以立即可用的流體形式穩(wěn)定保存的；它既不是以凍干制劑也不是以深度冷凍狀態(tài)保存的。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，盡管典型的新鮮纖維蛋白原溶液的粘度大于水，但它們是自由流動的液體，可以容易地沿倒置的試管流動。具生物活性的(即，在凝血酶和Ca離子存在下凝結(jié))保存樣品具有本質(zhì)上與新鮮樣品相同的物理特征。制備并使用組織膠粘劑時，這種類型的凝結(jié)產(chǎn)生用活性纖維蛋白原形成的可控凝塊。為進(jìn)行討論，本文中這種類型的凝塊僅僅指“血纖維蛋白凝塊”以使這一過程與“自發(fā)凝塊”相區(qū)別，其中后者出現(xiàn)在甚至不含凝血酶或其它激活劑的、不穩(wěn)定的濃縮纖維蛋白原溶液中。
然而，本文所用術(shù)語僅用于區(qū)分保存穩(wěn)定的纖維蛋白原溶液的所需用途與代表現(xiàn)有纖維蛋白原溶液中不穩(wěn)定性的自凝塊，其中保存穩(wěn)定的纖維蛋白原溶液的活性通過將等量纖維蛋白原與凝血酶/Ca++劇烈混合時血纖維蛋白凝塊的迅速形成來證明。已知新鮮制備的纖維蛋白原水溶液是高度不穩(wěn)定的，且傾向于在保存時自發(fā)凝結(jié)，現(xiàn)有技術(shù)中的這一事實使纖維蛋白原以立即可用的液體形式用公知方法保存甚至一或兩天都是不切實際的。
自發(fā)凝結(jié)可通過粘度的提高來識別(未暴露于激活劑，例如凝血酶和Ca離子)，混合后導(dǎo)致可見的移動性(流動性)降低?，F(xiàn)有技術(shù)中新鮮制備的、含水纖維蛋白原溶液經(jīng)常在不到一天，通常僅僅在幾個小時或更短的時間內(nèi)發(fā)生自發(fā)凝結(jié)。該過程是不可逆的，導(dǎo)致纖維蛋白原在例如血纖維蛋白封閉劑的制備中毫無用處。該不穩(wěn)定性使得通過現(xiàn)有方法以即用形式保存纖維蛋白原的時間長度完全不可預(yù)測，因而也就不可靠。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，保存穩(wěn)定的纖維蛋白原保存于聚合物、塑料或基于塑料的容器中，盡管更優(yōu)選的塑料容器是聚丙烯。不能用玻璃制品保存纖維蛋白原或血小板因為玻璃制品促進(jìn)自凝塊的形成。
添加了凝血酶和鈣離子也不凝結(jié)并保持流動(具有與水相似的粘度)的保存的即用式纖維蛋白原溶液稱作“凝血酶不敏感”。然而，用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)對這樣的凝血酶不敏感的纖維蛋白原樣品所進(jìn)行的分析顯示，纖維蛋白原蛋白質(zhì)已經(jīng)不可逆的降解為小分子量片段。因此，該制劑不再包含具有活性的纖維蛋白原，也就不是本發(fā)明的主題。
向纖維蛋白原溶液中添加凝血酶/Ca++后，所觀察到的粘度迅速增加和液體流動性的迅速減弱稱作“凝膠”。處于凝膠狀態(tài)時，纖維蛋白原溶液不再自由流動，但是可以通過攪拌被迫移動。盡管測量是主觀的，但是估計誤差僅僅是±2秒。
“凝塊”形成是纖維蛋白原溶液的瞬時固化，固化后攪拌不能迫使液體從固化的材料中流出。該不可移動材料通常呈可見的不透明白色和粘塑狀。例如，在Redl等人的Medizinische Welt 36769～76(1985)中顯示了對典型的生理或非生理血纖維蛋白凝塊的掃描電子顯微圖(SEM)照片。凝塊通常粘附于試管壁，而且在固體表面上快速敲擊試管也不能將其移動。這一測定比凝膠形成受主觀性影響小，對快速穩(wěn)定的樣品(8～12秒)所估計的不確定性僅為±1秒，盡管對凝結(jié)較慢樣品(＞100秒)的估計不確定性可能略高。
不特別限制保存期間的溶液溫度，只要其中所含的纖維蛋白原保持穩(wěn)定(即，既不失活也不自發(fā)凝結(jié))。本發(fā)明纖維蛋白原溶液的優(yōu)選保存溫度范圍是從1℃至25℃，更優(yōu)選從約4℃至約23℃。冷藏時，理想溫度為約4℃±1℃。室溫下保存時，理想的溫度范圍是從約20℃至25℃，更優(yōu)選從約22℃至24℃，最優(yōu)選的溫度是約23℃±1℃。
為評定冷凍后凝塊的形成效果，還在測試前將纖維蛋白原溶液冷凍并融化，結(jié)果是，一個或多個冷凍/融化循環(huán)對甚至在冷凍前于4℃保存了5個月的哺乳動物纖維蛋白原溶液的凝結(jié)能力沒有表現(xiàn)出不利影響。同時，這些數(shù)據(jù)還充分表明，可以很容易的配制保存期至少一年的液態(tài)纖維蛋白原產(chǎn)品，而且如果該液態(tài)纖維蛋白原最初是冷凍的則保存期還可能再多幾年。
含水纖維蛋白原溶液的pH在保存期間優(yōu)選調(diào)至約pH為5至8，更優(yōu)選pH為6.2～7.5。如以下實施例中的附表所示，保存特定纖維蛋白原溶液的理想pH值部分取決于該材料的保存溫度。然而，根據(jù)這里所提供的信息，知道決定因素是其中所含的蛋白質(zhì)是否穩(wěn)定(即，既不失活也不自發(fā)凝結(jié))，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠根據(jù)計劃的保存溫度和條件為纖維蛋白原溶液選擇理想的pH值。
例如，于室溫下(約23℃)保存的即用式牛纖維蛋白原(不合蛋白酶抑制劑)理想地維持于pH為6.5至9.0，優(yōu)選約pH為6.5至8.2，以保持將保存的制劑中和并暴露于凝血酶/Ca++中后快速形成凝塊的能力。當(dāng)即用式牛纖維蛋白原(不含蛋白酶抑制劑)保存于冷藏溫度(約4℃)時，理想pH也維持在65至9.0，優(yōu)選約pH為6.5至8.2，更優(yōu)選pH為6.5至7.07，以保持將保存的制劑中和并暴露于凝血酶/Ca++中時快速形成凝塊的能力(參見表2)。
保存穩(wěn)定的纖維蛋白原溶液的pH由其中的緩沖液決定。例如，在下面的實施例中，牛纖維蛋白原溶液(50mg蛋白質(zhì)/mL)是在下列其中一種0.1M緩沖液中新鮮制備的組氨酸，pH＝7.24；甘氨酸，pH＝9.31；或碳酸鹽，pH＝9.05或pH＝9.86。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，保存穩(wěn)定的牛纖維蛋白原溶液制備于組氨酸緩沖液中，盡管其它本領(lǐng)域已知的生理可接受的緩沖液也可用于制備該保存穩(wěn)定的纖維蛋白原，只要所得的纖維蛋白原溶液的pH維持在前述范圍內(nèi)，以保持其生物活性但不自發(fā)凝結(jié)。
目前可獲得的商業(yè)纖維蛋白原包含純化分離過程中所用的鹽。如實施例中說明的，它包括檸檬酸鈉和氯化鈉，作為纖維蛋白原純化過程的部分殘余的這類鹽的存在并不影響所得制劑的保存穩(wěn)定性。由于本發(fā)明的目的是生產(chǎn)一種保存穩(wěn)定的、即用式、纖維蛋白原溶液，它能保持與新鮮制備的纖維蛋白原溶液相當(dāng)?shù)奶匦裕虼死w維蛋白原純化過程的效果對兩者來說是相同的。然而，高濃度的檸檬酸鹽和/或鈉可能影響保存的纖維蛋白原制劑的凝結(jié)。因此，即使在新鮮制備的溶液中存在鑒定到的鹽或其它螯合劑，本方法也是有效的，而且該保存穩(wěn)定的制劑將保持與新鮮制備的溶液相當(dāng)?shù)奶卣骱突钚?，只要在保存期間活性得以維持且沒有被其它鹽或螯合劑誘導(dǎo)產(chǎn)生自發(fā)凝結(jié)即可。
為下列實施例的目的，向各樣品中添加疊氮化鈉(0.025％)作為抗微生物劑。盡管抗微生物劑在某種程度上會誘導(dǎo)自發(fā)凝結(jié)，但還未出現(xiàn)這種效果。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，未添加抗微生物劑，并用已知技術(shù)保持無菌。然而，在另一種替代實施方式案中，為避免長期保存過程中微生物污染纖維蛋白原溶液，根據(jù)例子中給出的程度添加了抗微生物劑。任何經(jīng)過檢驗的生理抗微生物劑可用于本發(fā)明的目的，只要在整個保存期間纖維蛋白原溶液的活性得以維持且不誘導(dǎo)自發(fā)凝結(jié)。
本發(fā)明的保存穩(wěn)定的纖維蛋白原溶液中可以補(bǔ)充以下物質(zhì)，并作為以下物質(zhì)的載體媒介生長因子、藥物或其它化合物或其混合物，只要如同上面所指出的在整個保存期間纖維蛋白原溶液的活性得以維持且不誘導(dǎo)自發(fā)凝結(jié)。例如，通過向纖維蛋白原制劑中補(bǔ)充生長因子，當(dāng)即用式纖維蛋白原被用于制備血纖維蛋白封閉劑或組織膠粘劑制劑時它能夠加速、促進(jìn)或改善傷口愈合、組織生長。這種補(bǔ)充制劑也可以含有其它組分，例如，藥物、抗體、抗凝劑及其它化合物(1)能加強(qiáng)、刺激或介導(dǎo)生長因子或其它添加劑或組分生物活性的化合物；(2)能降低補(bǔ)充有生長因子的纖維蛋白原或由其制備的血纖維蛋白封閉劑或組織膠粘劑的一種或多種添加劑或化合物活性的化合物，其中這種活性會抑制或破壞制劑中的生長因子；(3)允許從制劑，例如用本發(fā)明的即用式纖維蛋白原溶液制成的血纖維蛋白封閉劑或組織膠粘劑中長期運輸添加劑或組分的化合物；和(4)具有其它所需特性的化合物?？紤]的添加劑或補(bǔ)充物還有意包括它們的任何突變體、衍生物、縮截物或其它由其修飾的形式，它們具有與它們所衍生自的化合物或組合物相似或部分相似的生物活性。
本發(fā)明的保存穩(wěn)定的纖維蛋白原溶液中可以同時添加或補(bǔ)充不只一種添加劑或組分。盡管這些添加劑和/或組分的濃度將依賴于目的而在纖維蛋白原溶液中有所變化，但是濃度必須足夠充足以使這些化合物和/或組合物得以完成它們的有意或既定目的。這些添加的補(bǔ)充物的量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗通過測試不同濃度并選擇那些對預(yù)期的目的和應(yīng)用部位有效的量來決定。例如，也可以添加染料、示蹤物、標(biāo)記等，以檢查添加了纖維蛋白原的材料隨后的運輸。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，蛋白酶抑制劑(PI)，例如但不限于抑酶肽(例如，5μg/ml終濃度)或PPACK(例如，25μM終濃度)以有效量添加至保存的含水纖維蛋白原溶液中。其它蛋白酶抑制劑(PI)是本領(lǐng)域已知的，并且也可以替換實施例2中所公開的抑酶肽和PPACK。值得注意的是，抑酶肽用于商業(yè)可獲得的Tisseal產(chǎn)品中。蛋白酶抑制劑的“有效量”意指阻止纖維蛋白原樣品酶解的PI量。這個量可以根據(jù)所用的PI或PI組合而變化，但是可從由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地決定。然而，盡管保存的纖維蛋白原溶液可以在PI存在下更長時間的保持穩(wěn)定，但公知PI的效果隨時間衰減。
例如，盡管向保存穩(wěn)定的牛纖維蛋白原制劑中添加PI可阻止蛋白質(zhì)在約4℃下長期保存時形成不想要的自發(fā)凝塊，但添加PI看來對，例如在149天時，生產(chǎn)快速的纖維蛋白原/凝血酶產(chǎn)品(血纖維蛋白凝塊)并不有效。然而，室溫(約23℃)、pH為6.3至7.07至少維持149天的保存穩(wěn)定的、牛纖維蛋白原溶液樣品中觀察到了快速纖維蛋白原/凝血酶凝塊的形成。
如表2和表3所示，“抑制”等同于“阻止”，即，在當(dāng)前公開的條件下PI最初是有活性的(即，凝結(jié)被抑制/阻止)，但是然后PI的活性衰減了，此后抑制效應(yīng)減小并最終停止。纖維蛋白原溶液中PI活性衰減的速率是pH和溫度依賴性的。
本公開文本隨后的實施例通過連續(xù)的觀察和測試表明，在優(yōu)選條件下本發(fā)明的纖維蛋白原溶液在pH為6.5至9.0、室溫(～23℃)下保存時保持穩(wěn)定(活性但不自發(fā)凝結(jié))至少97天，且在蛋白酶抑制劑存在下于pH為6.5至8.1、約4℃下保存時保持至少149天，但在無PI時僅為7天。因此，本發(fā)明優(yōu)選實施方案的纖維蛋白原溶液包括纖維蛋白原和PI，在室溫下保持穩(wěn)定達(dá)幾年，在無PI時為數(shù)月。
根據(jù)已證實的牛纖維蛋白原溶液的穩(wěn)定性，與經(jīng)保存但未顯著喪失活性(即，混合后仍然迅速形成纖維蛋白原/凝血酶血纖維蛋白凝塊)的濃縮蛋白質(zhì)的深度冷凍或凍干制劑相比，該產(chǎn)品很長時間都是穩(wěn)定的，甚至在纖維蛋白原產(chǎn)品最初保存后的幾年。因此，“長期保存”是指在本發(fā)明公開的條件下以立即可用的形式在至少3天、優(yōu)選至少3周、更優(yōu)選至少13周、甚至更優(yōu)選至少149天、甚至更優(yōu)選至少1年、以及最優(yōu)選長于1年的時間內(nèi)保存纖維蛋白原溶液而沒有顯著喪失蛋白質(zhì)活性。此外，除以立即可用形式保存的時間段外該術(shù)語還進(jìn)一步包括冷凍保存的時間段，這就使產(chǎn)品的保存期又增加了幾年。
本發(fā)明涉及任一種纖維蛋白原制劑，但是本發(fā)明的方法涉及源自任一哺乳動物種的即用式、含水纖維蛋白原溶液的穩(wěn)定保存。盡管以牛纖維蛋白原為例進(jìn)行描述，但是發(fā)明無意作如此限制。將保存的纖維蛋白原用于其它哺乳動物種似乎不存在種間相容性問題。例如，受檢牛纖維蛋白原于含水溶液中保存后可用于制備，例如，任一哺乳動物種的生物相容性組織膠粘劑制劑。
作為一種血漿蛋白，纖維蛋白原常常伴有被血液傳播性病原體污染的風(fēng)險，例如可能污染血漿蛋白的那些，尤其是，肝炎病毒或HIV。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難制備纖維蛋白原以除去潛在感染物質(zhì)。達(dá)到此目的的常規(guī)技術(shù)包括但不限于，超濾、巴氏消毒(加熱)、溶劑去污劑處理、放射照射和紫外線處理。盡管用高溫加熱或蒸氣方法進(jìn)行病毒滅活對生物活性蛋白溶液(包括本發(fā)明的纖維蛋白原溶液)來說是不實際的，但納米過濾是一種可選擇的在將本發(fā)明纖維蛋白原溶液置于無菌保存容器中之前對其進(jìn)行處理的方法。
然而，盡管纖維蛋白原是對熱不穩(wěn)定的且因此會在常規(guī)的液體加熱過程中失活，但已開發(fā)出加熱纖維蛋白原的方法以滅活任何潛在的污染病毒，例如，肝炎病毒或HIV，而本質(zhì)上不使纖維蛋白原失活。美國專利No.5 116 950(Miyano等人，5月26日，1992年發(fā)表)提供了一種加熱纖維蛋白原的方法，包括在至少一種糖、氨基酸和鎂鹽存在下加熱含有纖維蛋白原的含水溶液直到可能污染所述纖維蛋白原的病毒被滅活。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，這樣加熱的纖維蛋白原水溶液，如果需要，可以用常規(guī)方式例如透析、滅菌或過濾進(jìn)行進(jìn)一步純化和處理。也可以使用各種洗滌步驟用本領(lǐng)域公知的方法除去穩(wěn)定化的添加劑。
本發(fā)明的纖維蛋白原溶液理想地適于在暴露于激活劑溶液時形成一種生理血纖維蛋白結(jié)構(gòu)，并迅速形成血纖維蛋白凝塊。如后面實施例中所闡明的，這由將保存的纖維蛋白原溶液與等體積的凝血酶/CaCl2溶液(含有，例如，2.5單位凝血酶/mg纖維蛋白原(100單位/ml)，和相對檸檬酸鹽或可以加到溶液中的其它螯合劑過量3～6mM的CaCl2)混合得到證實。如果所得到的凝塊展現(xiàn)一種生理的血纖維蛋白結(jié)構(gòu)，它將具有典型的、空間支化的原纖維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是生理條件，即離子強(qiáng)度約為0.15和約中性pH下凝血酶對新鮮制備或新鮮分離純化的牛纖維蛋白原作用形成的凝塊所顯示的結(jié)構(gòu)。
纖維蛋白原和凝血酶濃度指示凝塊形成時間、凝塊強(qiáng)度、凝塊粘附、及由此的止血。
此外，根據(jù)本發(fā)明的纖維蛋白原制劑和/或其所要加入的基于纖維蛋白原的組織膠粘劑用作組織膠粘劑時是沒有細(xì)胞毒性的，即，它是“生物可相容的”，這意味著它得到細(xì)胞的良好耐受、允許細(xì)胞的良好生長并為隨之的傷口愈合提供良好的先決條件。這通過用等體積半滲或等滲氯化鈉溶液稀釋組織膠粘劑并將其加入成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基中證實。未檢測到對成纖維細(xì)胞的破壞效應(yīng)(參見Redl等人，1985)。
因此，本發(fā)明保存穩(wěn)定的、即用式纖維蛋白原溶液是以滿足組織膠粘劑所有需求的方式制備的，即生物相容性、病毒安全性和高粘附強(qiáng)度，它還具有從即用式纖維蛋白原產(chǎn)品簡易快速制備的優(yōu)點。因此從本發(fā)明保存穩(wěn)定的纖維蛋白原制備而來的組織膠粘劑可以任何已知的方式使用，其中使用了生物制備的、補(bǔ)充或非補(bǔ)充的組織膠粘劑，例如，藥理或化妝用途，包括用于輸入目的，例如抗生素、抗腫瘤藥、麻醉劑及其類似物的輸送；用于傷口愈合、凝固和纖維蛋白原血癥；用于抑制手術(shù)或術(shù)后的后遺癥；用于假肢包埋；用于可敷貼的傷口封閉和安全持久止血，即封閉流體和/或氣體的泄露，以及病人身上的類似用途。
本發(fā)明通過實施例得以進(jìn)一步描述。然而，提供實施例的目的是向本領(lǐng)域技術(shù)人員闡明發(fā)明，而并不試圖限制本發(fā)明。此外，實施例不解釋為對所附權(quán)利要求范圍的限制。因此，本發(fā)明決不以限制于以下實施例的方式進(jìn)行解釋，而應(yīng)當(dāng)解釋為包含任何和所有根據(jù)其中所給出的教導(dǎo)來說是顯而易見的變化。
實施例為評估本發(fā)明纖維蛋白原溶液的保存穩(wěn)定性，評定了不同保存條件范圍下纖維蛋白原溶液的穩(wěn)定性、溶解度和凝結(jié)活性，這些保存條件具有不同的緩沖液(pH值)、溫度、和添加劑，例如蛋白酶抑制劑。牛纖維蛋白原、牛凝血酶、抑酶肽、緩沖液溶液、氯化鈣、氫氧化鈉和鹽酸購自Sigma Chemical Company，St.Louis，MO。PPACK由Calbiochem，San Diego，CA提供。牛纖維蛋白原經(jīng)鑒定包含61％蛋白質(zhì)(97％可凝結(jié))以及39％鹽類。
標(biāo)準(zhǔn)研究等級的纖維蛋白原包含分離純化過程中所用的鹽類。這包括檸檬酸鈉和氯化鈉。因此，例如，40mg/ml纖維蛋白原溶液中除纖維蛋白原外還包含54mM檸檬酸鈉和419mM氯化鈉。此外各樣品中加入疊氮化鈉(0.025％)作為抗微生物試劑。
根據(jù)與Kasper，Proc.Symposium on Recent Advances in Hemophilia Care，Los Angeles，CA，4月13-15號，1989(in Liss，New York，1990)基本一致的以下方法完成凝結(jié)檢測。將等份量的(100μl)各纖維蛋白原樣品加入4ml聚丙烯試管中。各樣品用0.1M氫氧化鈉、0.2M組氨酸緩沖液(pH 6.0)或0.1M鹽酸中和(pH 7.0～7.3)(在預(yù)備試驗中以更大的體積進(jìn)行檢測)。1M氯化鈣與200單位/ml的凝血酶一起配制(在纖維蛋白原制劑中鈣比檸檬酸鈉過量3～6mM)。之后用0.1M組氨酸(pH 7.2)將凝血酶制劑稀釋至凝血酶終濃度為100單位/ml(每毫克纖維蛋白原有2.5單位凝血酶)。所有樣品在室溫(23±2℃)下檢測。
通過對向纖維蛋白原樣品(100μl)中加入100μl凝血酶、并將混合物劇烈攪拌時所發(fā)生的反應(yīng)計時來測定凝固。記錄溶液轉(zhuǎn)變?yōu)檎承阅z(混合液體急劇減緩)以及固體凝塊(混合后所有液體停止流動的時間點)的時間。固體凝塊形成的時間常為凝膠形成時間的兩倍。
實施例1.在室溫、pH 7-10保存的含水牛纖維蛋白原的穩(wěn)定性為評估在室溫下長期保存本發(fā)明纖維蛋白原溶液的能力，評估了纖維蛋白原溶液在20～25℃恒溫下保存至少149天(21周)后的穩(wěn)定性、溶解度和凝結(jié)能力。保存期的第一天在下列0.1M緩沖液中新鮮制備牛纖維蛋白原溶液(50mg蛋白質(zhì)/ml)組氨酸，pH為7.24；甘氨酸，pH為9.31；或碳酸鹽，pH為9.05或pH為9.86。
觀察溶液的澄清度和自發(fā)的凝結(jié)。25℃下將溶液中和至pH為7.0～7.5、及添加凝血酶(125單位/mg纖維蛋白原)和纖維蛋白原溶液中與檸檬酸鹽相比過量3～5mM的CaCl2，完成人工凝結(jié)檢測。劇烈混合該制劑，如上所述測定并記錄形成凝塊所需時間。
室溫(～23℃)下保存的pH為7.24組氨酸緩沖液中的牛纖維蛋白原的凝結(jié)結(jié)果示于表1。在所有樣品中，從第1天到第149天，纖維蛋白原溶液保持清澈并且不凝結(jié)，直至添加了凝血酶。
表1

NT＝未測在第44天用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)評定纖維蛋白原配方的蛋白質(zhì)完整性。(標(biāo)準(zhǔn)的SDS PAGE條件描述于，例如，Laemmli，Nature 227680-685(1970))。SDS-PAGE分析顯示在pH 7.24(圖1，泳道3)下保存的牛纖維蛋白原樣品在非還原和還原凝膠中以基本與新鮮制備的牛纖維蛋白原(BFG)對照(圖1，泳道2和7)相同的速率遷移。相比之下，在更高pH下保存的樣品(示于圖1，泳道4、5和6)表現(xiàn)出降解和/或聚集。pH為9.05～9.31(圖1，泳道4和5)下的降解最嚴(yán)重，pH為9.86中的樣品降解稍弱但聚集更多(凝結(jié))。
關(guān)注pH為7.24下的牛纖維蛋白原溶液，樣品在室溫下保存至第149天保持清澈和不凝結(jié)。然而，在一個個別的凝結(jié)檢測中，pH為7.24的樣品在加入凝血酶后不凝結(jié)。pH為7.24樣品的pH值在加入凝血酶后檢測為6.98。中性pH對凝血酶是最適宜的。然而，樣品在第73天和第147天之間似乎喪失了凝結(jié)能力。
因此，得出結(jié)論，在pH為7.24的組氨酸緩沖液中制備的牛纖維蛋白原含水溶液在室溫下保存10周以上是穩(wěn)定的。然而，在第21周似乎不能凝結(jié)。
實施例2.兩種溫度下保存的、加或不加蛋白酶抑制劑的含水纖維蛋白原溶液的穩(wěn)定性為進(jìn)一步評估長期保存含水纖維蛋白原溶液的能力，評估了牛纖維蛋白原溶液在室溫(～23℃)或冷藏溫度(4℃)下、加或不加蛋白酶抑制劑(PI)時、在5種pH值(pH 6.50至pH 9.87)范圍中保存至少149天(超過21周)后的穩(wěn)定性、溶解度和凝結(jié)活性。在保存期的第一天在下列0.1M緩沖液中新鮮制備兩份牛纖維蛋白原溶液(39mg蛋白質(zhì)/ml)組氨酸，pH為6.0或7.2；三羥甲基氨基甲烷，pH 8.16；甘氨酸，pH為9.3；或碳酸鹽，pH為9.1或pH為9.9。保存前先向一半樣品中添加蛋白酶抑制劑PPACK(25μM終濃度)和抑酶肽(5μg/mL終濃度)。
為評估凝結(jié)能力，根據(jù)前述預(yù)定程序中和樣品，并隨之如實施例1穩(wěn)定性研究中所述的檢測凝結(jié)。
各條件下牛纖維蛋白原的凝結(jié)結(jié)果示于表2。
表2.無蛋白酶抑制劑時，在23℃和4℃下保存的牛纖維蛋白原凝結(jié)時間

注“凝結(jié)”是指在未添加凝血酶時的自發(fā)凝結(jié)。
至第22天，4℃的牛纖維蛋白原樣品全部自發(fā)凝結(jié)。相比之下，除了最高pH外，第97天檢測的室溫保存的牛纖維蛋白原多數(shù)是清澈的。
表3.蛋白酶抑制劑存在時，于23℃和4℃下保存的牛纖維蛋白原凝結(jié)時間

NT＝未測。“凝結(jié)”是指在未添加凝血酶時的自發(fā)凝結(jié)。
保存于23℃或4℃的含PI(PPACK或抑酶肽)樣品的評估結(jié)果顯示出pH-依賴性。減弱的凝結(jié)能力似乎是由于纖維蛋白原溶液中PI殘余的抑制所加入的凝血酶的能力。因此，4℃下較短期的保存(4～22天)導(dǎo)致對凝血酶依賴型的凝結(jié)有效的抑制，即，加入凝血酶后樣品不凝結(jié)是因為凝血酶活性被殘留在溶液中的PI抑制劑抑制了。
然而，PI成分隨時間衰減，它們的活性也相應(yīng)減弱。經(jīng)過一段較長時間(22～149天)的保存后，PI活性已經(jīng)衰減了，從而允許通過凝血酶的添加來引發(fā)纖維蛋白原樣品的凝結(jié)。該反應(yīng)也是pH-依賴型的。
所以，得出以下結(jié)論保存至少149天后，在水溶液中保存牛纖維蛋白原的最佳條件是蛋白酶抑制劑存在下，室溫、pH范圍自6.31至7.07，或4℃、pH范圍自6.31至8.10。
前述說明書中所引用的各個及每個專利、專利申請和公開全文引入本文作為參考。
盡管前述說明書中已經(jīng)就某些優(yōu)選實施方式進(jìn)行了描述，并且為舉例說明而給出了許多細(xì)節(jié)，但是顯然對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說本發(fā)明可以接受各種不同的修改和附加實施方案，并且確信本文中所描述的細(xì)節(jié)可以在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下進(jìn)行很大的變化。這樣的修改、等價的改變以及附加的實施方式也意圖落入本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種保存穩(wěn)定的、濃縮、即用式、生物相容性的哺乳動物纖維蛋白原溶液，其中纖維蛋白原溶液的穩(wěn)定性是pH和溫度依賴性的。
2.權(quán)利要求1的纖維蛋白原溶液，其中纖維蛋白原是完全溶解的，且其中溶液是含水的。
3.權(quán)利要求1或2的纖維蛋白原溶液，其中在最初制備后其穩(wěn)定性可保持從至少一天至一年或更多年的時間。
4.權(quán)利要求1～3之一的纖維蛋白原溶液，其中纖維蛋白原溶液含有選自組氨酸、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸或碳酸鹽的控制pH的緩沖液。
5.權(quán)利要求1～4之一的纖維蛋白原溶液，其中溶液的pH用緩沖液調(diào)節(jié)至自6.5至8.2的pH范圍內(nèi)，且保存溫度保持在約4℃的冷藏溫度。
6.權(quán)利要求5的纖維蛋白原溶液，其中保存的緩沖液是組氨酸。
7.權(quán)利要求1～5之一的纖維蛋白原溶液，其中穩(wěn)定性至少保持約10周。
8.權(quán)利要求1～4之一的纖維蛋白原溶液，其中溶液的pH用緩沖液調(diào)節(jié)至自6.5至8.2的pH范圍，且保存溫度維持在室溫。
9.權(quán)利要求8的纖維蛋白原溶液，其中穩(wěn)定性至少保持7天。
10.權(quán)利要求8的纖維蛋白原溶液，其中穩(wěn)定性至少保持22天。
11.權(quán)利要求1～4之一的纖維蛋白原溶液，其中溶液的pH用緩沖液調(diào)節(jié)至pH為6.31至8.1，保存溫度維持在自約4℃至約23℃的溫度范圍，并在保存前向纖維蛋白原溶液中加入有效量的蛋白酶抑制劑以防止纖維蛋白原樣品發(fā)生蛋白水解。
12.權(quán)利要求11的纖維蛋白原溶液，其中穩(wěn)定性至少保持7天。
13.權(quán)利要求11的纖維蛋白原溶液，其中穩(wěn)定性至少保持22天。
14.權(quán)利要求11的纖維蛋白原溶液，其中穩(wěn)定性至少保持97天。
15.權(quán)利要求11的纖維蛋白原溶液，其中穩(wěn)定性至少保持149天。
16.權(quán)利要求1～15之一的纖維蛋白原溶液，其中哺乳動物的纖維蛋白原是牛的。
17.一種在即用式、含水溶液中穩(wěn)定保存哺乳動物纖維蛋白原的方法，包括在無菌條件下準(zhǔn)備新鮮制備的纖維蛋白原溶液或新鮮分離純化自血漿或冷凍的纖維蛋白原制劑的纖維蛋白原溶液；無菌保存新鮮制備或新鮮分離純化的纖維蛋白原溶液，并將保存的纖維蛋白原溶液維持在冷藏溫度，其中纖維蛋白原溶液保持液態(tài)，pH值范圍自6.5至8.2，且處于纖維蛋白原的生物相容性和生物活性得以維持的條件下。
18.權(quán)利要求17的纖維蛋白原溶液，進(jìn)一步包括自最初制備后維持穩(wěn)定性從至少一天到一年或更多年。
19.權(quán)利要求17～18之一的方法，其中冷藏溫度維持在約4℃。
20.權(quán)利要求17～19之一的方法，其中穩(wěn)定性至少保持7天。
21.一種在即用式、含水溶液中穩(wěn)定保存哺乳動物纖維蛋白原的方法，包括在無菌條件下保存新鮮制備或新鮮分離純化的纖維蛋白原溶液或由冷凍的纖維蛋白原制劑制備的纖維蛋白原溶液，及將保存的纖維蛋白原溶液維持在室溫下，其中纖維蛋白原溶液保持液態(tài)，pH值范圍自6.5至8.2，且處于纖維蛋白原的生物相容性和生物活性得以維持的條件下。
22.權(quán)利要求21的纖維蛋白原溶液，進(jìn)一步包括自最初制備后維持穩(wěn)定性從至少一天到一年或更多年。
23.權(quán)利要求22的方法，其中穩(wěn)定性至少保持7天。
24.權(quán)利要求22的方法，其中穩(wěn)定性至少保持22天。
25.一種在即用式、含水溶液中穩(wěn)定保存哺乳動物纖維蛋白原的方法，包括在無菌條件下新鮮制備纖維蛋白原溶液，或自血漿或冷凍的纖維蛋白原制劑新鮮分離純化纖維蛋白原溶液；向纖維蛋白原溶液中加入有效量的蛋白酶抑制劑以防止纖維蛋白原樣品的蛋白水解；及保存纖維蛋白原溶液于(i)約4℃至約23℃間的一個恒定溫度下，其中纖維蛋白原溶液保持液態(tài)；(ii)pH范圍在6.31至8.1之間；(iii)纖維蛋白原的生物相容性和生物活性得以保持的條件下保存。
26.權(quán)利要求25的方法，進(jìn)一步包括自最初料備后維持穩(wěn)定性從至少一天到一年或更多年。
27.權(quán)利要求26的方法，其中穩(wěn)定性至少保持7天。
28.權(quán)利要求26的方法，其中穩(wěn)定性至少保持22天。
29.權(quán)利要求26的方法，其中穩(wěn)定性至少保持97天。
30.權(quán)利要求26的方法，其中穩(wěn)定性至少保持149天。
全文摘要
提供了穩(wěn)定保存即用式、生物相容性的哺乳動物纖維蛋白原的方法，不論其濃度，仍然保持流體形式，且長期允許快速簡易加工成組織膠粘劑制劑。還提供了用本發(fā)明的方法得到的無菌、保存穩(wěn)定的含水纖維蛋白原產(chǎn)品，其中纖維蛋白原長期保持即用的液體形式，未自發(fā)凝結(jié)(即，甚至在無激活劑，例如凝血酶/Ca
文檔編號A61P17/02GK1606447SQ02824194
公開日2005年4月13日 申請日期2002年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月3日
發(fā)明者克里斯托弗·J·伍爾弗頓 申請人:克里斯托弗·J·伍爾弗頓