專利名稱：高濃度蛋白制劑及其制備方法
背景技術(shù)：
某些蛋白尤其是免疫球蛋白用于治療時需要使用大劑量。由于免疫球蛋白能夠特異識別并結(jié)合專一靶標(biāo)，其用于治療諸如癌癥及關(guān)節(jié)炎等疾病很有前景。然而，使用免疫球蛋白治療有一些缺點，包括這些球蛋白分子量一般都很大導(dǎo)致量效比低、在水中溶解度較低以及有效期短。例如，典型的單克隆IgG抗體分子量約150kDa，在水中的溶解度低于50mg/mL，而且長期儲藏必須凍干。
同樣地，由于顯著的低效，商品化的治療抗體的每劑需要100mg～1000mg。其在水中的低溶解度意味著每劑用量需數(shù)毫升抗體溶液。即使假定抗體溶解度高達50mg/mL，100mg劑量也需要使用溶液2mL，而1000mg的劑量則需要使用20mL溶液。對諸如皮下(SC)、肌肉(IM)、腫瘤內(nèi)(IT)及關(guān)節(jié)內(nèi)(IA)應(yīng)用，這些體積太大，而通常這些部位的注射液體積限制在1mL。因而必須以IV輸注液的形式使用這些藥物。而這些IV輸注液費時且不便于醫(yī)患雙方的使用。
此外，抗體蛋白較低的溶解度將限制其產(chǎn)量。大量發(fā)酵后，為了將幾批合并以制備大量產(chǎn)品，通常希望保存中間體階段的物質(zhì)。為便于在制備設(shè)備中儲藏，中間體的體積必須足夠小。透析濾過稀溶液可引起沉淀及透析膜污染。大規(guī)模冷凍干燥需要在廠房、資金設(shè)備及操作成本上進行大量投入。
為了制備高濃度的抗體溶液，在仔細控制pH、離子強度及緩沖液的類型等方面已經(jīng)作出努力，然而，許多抗體及其它蛋白即使在最佳條件下也不能制得高濃度溶液。同樣地，即使能夠制備高濃度的抗體溶液，其長期穩(wěn)定儲藏仍然是非常困難的。特別是，隨著溶液蛋白濃度的增加，生成非期望的改性聚合物的風(fēng)險也將增加。此外，一些高濃度抗體溶液的高粘度常常使制備過程中的實際處理變得復(fù)雜，有時甚至無法進行。
由于產(chǎn)物穩(wěn)定性的原因，當(dāng)前用于臨床的治療抗體為凍干形式。凍干小瓶冷藏，使用前必須重建。由于凍干塊不能很快重建，重建過程費時。而且，由于形成泡沫及變性，重建可導(dǎo)致治療蛋白降解。因而重建過程可引起治療藥物的用量及相對活性/免疫原性的改變。
非常需要改進的高濃度蛋白制劑，特別是適合用于諸如SC、IM、IT及IA注射的抗體制劑。同時，在生產(chǎn)蛋白產(chǎn)品及抗體時非常需要改進加工及儲藏中間產(chǎn)物的技術(shù)。也需要長期儲藏抗體及其它蛋白的技術(shù)，從而能夠降低并消除凍干產(chǎn)品重建過程中的難題。
發(fā)明概述本發(fā)明發(fā)現(xiàn)無需凍干即可制備穩(wěn)定的濃縮蛋白制劑。濃縮蛋白制劑是沉淀的蛋白與液體介質(zhì)的混合物，介質(zhì)一般為水性介質(zhì)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)濃縮混合物中的沉淀蛋白是高度穩(wěn)定的，且有利于長期儲藏而無凍干過程的花費及繁瑣。同時，該濃縮混合物易于稀釋而重建為沉淀蛋白的更稀形式的制劑，這一點有利于進一步地處理或使用。在制備濃縮混合物和/或其隨后的稀釋時，可加入諸如蛋白穩(wěn)定劑及表面活性劑之類的添加劑，以獲得期望的藥物組合物特征。
本發(fā)明特別適用于高分子蛋白，尤其是抗體，其通常難于制備成用于諸如IM、SC、IT或IA的足夠濃度的注射劑。本發(fā)明制備了蛋白，尤其是抗體的濃縮注射懸浮液，其適于經(jīng)諸如IM、SC、IT或IA途徑給藥。
本發(fā)明一方面提供了一種制備包括蛋白的藥物組合物的方法。該藥物組合物既可為最終使用的組合物，也可為能夠延長儲藏等待進一步處理或稀釋可制備成最終使用的組合物而設(shè)計成的中間體組合物。在特別有利的應(yīng)用中，本方法包括將蛋白溶液與合適的沉淀試劑接觸沉淀出感興趣的蛋白，然后從所得混合物中除去足量液體以制備包含至少8％重量，優(yōu)選至少10％重量的沉淀蛋白的濃縮混合物。同時，為便于沉淀蛋白的儲備及重建，濃縮混合物優(yōu)選包含至少20％重量的水，更優(yōu)選包含至少30％重量的水。與凍干塊包含一般遠小于10％重量的水且使用時很難重建形成了鮮明的對照。
在本發(fā)明的該方面一個特別優(yōu)選的實施方案中，沉淀試劑為生物相容性聚合物，優(yōu)選為逆熱膠凝聚合物。生物相容性聚合物不僅引起蛋白的沉淀，而且由于其在濃縮混合物中的存在為濃縮混合物的長期儲藏提供了穩(wěn)額外的保護。
在所述方法的一種應(yīng)用中，濃縮混合物設(shè)計為感興趣蛋白的長期儲藏穩(wěn)定形式。在這種情況下，濃縮混合物一般包含至少40％重量的沉淀蛋白，優(yōu)選更高濃度的蛋白。
在一個改進方法中，加入了諸如蔗糖、海藻糖或甘露醇之類的蛋白穩(wěn)定劑以進一步增加長期儲藏的濃縮混合物中沉淀蛋白的穩(wěn)定性。還可以將多羥基化合物和/或表面活性劑，如甘露醇或聚山梨醇酯加入至濃縮混合物中，以有利于增加最終藥物組合物的注射特性。
本發(fā)明一方面提供了一種制備藥物組合物的方法，其一般用于供使用的最終制劑。該方法包括，稀釋沉淀蛋白的濃縮混合物，以制備較稀的沉淀蛋白混合物。一般地，稀釋應(yīng)以避免蛋白的基本成分溶于稀釋混合物的液體介質(zhì)中。通過將溶解蛋白控制在少量或不顯著的數(shù)量，形成非需要的改性聚合物的可能性將顯著降低，這有利于制劑的長期保持穩(wěn)定。
本發(fā)明另一方面提供了一種長期儲藏蛋白的方法，一般地至少一個月，通常3個月或更長。蛋白以沉淀形式存在于濃縮混合物中。為進一步增加儲藏時的穩(wěn)定性，可將濃縮混合物冷凍。在另一個實施方案中，當(dāng)濃縮混合物包含足量的生物相容性逆熱膠凝聚合物(reverse-thermal gelationpolymer)時，可將濃縮混合物制成凝膠形式。
本發(fā)明的另一方面提供了一種包裝蛋白的方法。所述方法包括將一定量的沉淀蛋白的濃縮混合物密封于容器中。在一個優(yōu)選實施方案中，包裝量包括單劑量使用蛋白，更優(yōu)選地，包裝體積不超過1mL。
本發(fā)明另一方面提供了一種包括沉淀蛋白的濃縮混合物的藥物組合物。在一個優(yōu)選實施方案中，該組合物包含高濃度的蛋白，以及有效量的水以利于沉淀蛋白的重建為較稀的制劑。在一個實施方案中，組合物設(shè)計為供使用的最終組合物，優(yōu)選易于注射，可采用諸如IM、SC、IT或IA注射技術(shù)使用的組合物。在一個實施方案中，將藥物組合物進行包裝以使包括單劑量沉淀蛋白的藥物組合物包含在密封容器中，如小瓶或瓶。當(dāng)采用諸如IM、SC、IT或IA注射給藥時，藥物組合物的量優(yōu)選不超過1mL。在另一個實施方案中，藥物組合物包裝于諸如注射器之類的注射裝置中。
本發(fā)明另一方面提供了一種注射使用藥物組合物的方法，優(yōu)選采用IM、SC、IT或IA注射途徑?；颊呖蔀槿嘶騽游?。
上述概述及隨后的詳述，包括列舉的實施例用于闡釋本發(fā)明。從隨后的本發(fā)明的詳細描述中，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員很容易理解本發(fā)明的其它方面及新特征。
附圖概述

圖1為一個通用制備方法的方框圖，其描述了制備包含高濃度沉淀蛋白的濃縮混合物的本發(fā)明方法的一個實施方案。
圖2為一個通用制備方法的方框圖，其描述了本發(fā)明方法的一個實施方案，將沉淀蛋白的濃縮混合物制成凝膠形式以供長期儲藏。
圖3為一個通用制備方法的方框圖，其描述了本發(fā)明方法的一個實施方案，將沉淀蛋白的濃縮混合物冷凍以穩(wěn)定儲藏。
圖4為一個通用制備方法的方框圖，其描述了本發(fā)明方法的一個實施方案，將沉淀蛋白的濃縮混合物經(jīng)稀釋后制成更稀的沉淀蛋白混合物。
圖5為一個通用制備方法的方框圖，其描述了本發(fā)明方法的一個實施方案，將沉淀蛋白的濃縮混合物包裝。
發(fā)明詳述本發(fā)明一方面提供了一種制備藥物組合物的方法，該組合物為蛋白濃縮制劑。參照圖1，其描述了一種通用制備方法的實施方案。如圖1所示，第一步是將蛋白溶解于液體溶媒中的溶液配制102。溶液配制102后，在蛋白沉淀104過程沉淀蛋白，其中蛋白溶液與沉淀試劑接觸使蛋白自溶液中沉淀出來。蛋白沉淀104產(chǎn)生包括沉淀蛋白與液體溶媒的混合物。蛋白沉淀104后，在液體分離步驟108中將液體自混合物中分離以制備分離液體110及濃縮混合物112。濃縮混合物112包括高濃度的沉淀蛋白。沉淀蛋白指在蛋白沉淀104過程中以顆粒形式沉淀出來的蛋白。沉淀的蛋白是完全可逆的，且蛋白分子的二級結(jié)構(gòu)基本上沒有被破壞。這與非需要的不可逆聚合物不同，該聚合物自溶液中析出且包含二級結(jié)構(gòu)基本上已變性的蛋白。
溶液配制102可以任何方式將蛋白溶于合適液體溶媒制得。液體溶媒一般為具有適合鹽分、pH及離子強度的水性液體，可將相關(guān)蛋白溶解至期望的濃度。溶液中蛋白的濃度視具體處理的蛋白而異。然而，溶液中蛋白的濃度不一定很高。相反，為便于配制以及處理溶液，通常優(yōu)選較低濃度的蛋白溶液。這種相對較低濃度蛋白溶液會經(jīng)常在生產(chǎn)操作中制備。絕大多數(shù)情況下，蛋白溶液的濃度不超過50mg/mL，更一般地不超過25mg/mL，甚至更一般地不超過10mg/mL。非常大的蛋白，如抗體尤其優(yōu)選極低濃度。
本發(fā)明方法中使用的蛋白可以是任何需要高濃度制劑的蛋白。一般地，蛋白的分子量為15kD或更高。本發(fā)明優(yōu)選使用較高分子量的蛋白，其分子量至少100kD，因而制備其高濃度溶液通常非常困難或不可能。這些較高分子量的蛋白此處稱為高分子蛋白。然而，較低分子量的蛋白也可便利地以本發(fā)明方法制備。甚至在水中有高溶解度的較低分子量的蛋白也可便利地獲得本發(fā)明所述的穩(wěn)定沉淀狀態(tài)。改進的制劑穩(wěn)定性特別有利于蛋白的長期儲藏，可用于生產(chǎn)中的某些處理操作。本發(fā)明使用的具體蛋白實例列于美國專利6,267,958中，其全部內(nèi)容此處引入一如其在此處全部公開。一些本發(fā)明優(yōu)選使用的蛋白包括生長因子、可溶性受體、細胞因子、血友病因子及抗體。
具有150kD或更高分子量的抗體特別優(yōu)選作為本發(fā)明使用的蛋白。本發(fā)明可使用任何抗體。美國專利6,267,958討論了一些用于本發(fā)明的具體抗體。例如，抗體可以是或包括單克隆抗體，具有多抗原表位特異性的組合物、雙特異性抗體、雙特異性抗體、單鏈分子及抗體片段。
在一個優(yōu)選實施方案中，蛋白應(yīng)當(dāng)基本純凈，應(yīng)當(dāng)基本上不含污染的蛋白。在溶液配制102前，優(yōu)選蛋白純度為90％重量，更優(yōu)選至少95％重量純度，甚至優(yōu)選至少99％重量純度。
此外，在溶液配制102、蛋白沉淀104或液體分離108步驟中，蛋白一般不經(jīng)純化。本方法優(yōu)選基本上僅影響沉淀形式的蛋白濃度，而并非純化蛋白。在一個優(yōu)選實施方案中，沉淀蛋白的純度與蛋白沉淀104過程中的蛋白溶液基本上一樣。
在蛋白沉淀104過程中，與蛋白溶液接觸的沉淀試劑可以是能夠引起至少部分蛋白沉淀，優(yōu)選絕大部分或基本上所有蛋白沉淀的物質(zhì)。一般至少80％重量，優(yōu)選至少90％重量，甚至更優(yōu)選至少95％重量，甚至優(yōu)選至少99％重量的蛋白在蛋白沉淀104過程中被沉淀。相應(yīng)地，優(yōu)選地蛋白沉淀104后優(yōu)選保留少量蛋白溶于液體溶媒中。一般地在蛋白沉淀104后，不超過20％重量，優(yōu)選不超過10％重量，甚至更優(yōu)選不超過5％重量，甚至更優(yōu)選不超過2％重量以及最優(yōu)選不超過1％重量的蛋白殘留于溶媒中。沉淀盡量多的蛋白對于提高濃縮混合物112的穩(wěn)定性是重要的，有利于長期儲藏。
為提高效果，沉淀試劑應(yīng)當(dāng)為生物相容性的，由于至少部分沉淀試劑將殘留于濃縮混合物112中，即使不是全部情況下，在絕大多數(shù)情況下應(yīng)當(dāng)考慮至少部分沉淀試劑將殘留于患者使用的沉淀蛋白中。生物相容性指物質(zhì)對宿主的生物機能無毒性或損傷作用。
優(yōu)選的沉淀試劑為生物相容性聚合物或其混合物，在蛋白沉淀104過程中，當(dāng)其與蛋白溶液接觸時可從溶液中生成理想的蛋白沉淀。生物相容性聚合物可以是任何與蛋白溶液接觸產(chǎn)生理想蛋白沉淀的生物相容性聚合物。生物相容性聚合物一般可溶于溶液中，一般地為水性液體溶液，可與蛋白溶液單獨地制備。然后，在蛋白沉淀104過程中將聚合物溶液與蛋白溶液混合，或者是將聚合物溶液加入至蛋白溶液中，或者是將蛋白溶液加入至聚合物溶液中，優(yōu)選后者。
本發(fā)明優(yōu)選用作沉淀試劑的生物相容性聚合物為逆熱膠凝聚合物。在一個實施方案中，選擇了生物相容性聚合物并制備了聚合物及蛋白溶液，以致最終混合物及濃縮混合物112中也有一定濃度的生物相容性聚合物，因而，至少是相應(yīng)混合物的液體部分在至少一定溫度范圍內(nèi)顯示逆熱粘度行為特征，溫度范圍優(yōu)選40℃以下，更優(yōu)選37℃以下以及更優(yōu)選10℃～37℃。典型地，液體在1～20℃范圍內(nèi)的某個范圍內(nèi)顯示逆熱粘度行為特征。由于濃縮混合物112中液體的逆熱粘度行為特征，濃縮混合物112可在較低的溫度下施用于宿主，此時組合物具有較低的粘度。當(dāng)濃縮混合物112具有逆熱膠凝特征時，濃縮混合物112的液體至少在第一溫度為流動溶媒的形式，在高于第一溫度的第二溫度呈凝膠狀。優(yōu)選第一及第二溫度均低于40℃，更優(yōu)選第二溫度不高于37℃。優(yōu)選當(dāng)?shù)谝粶囟葹?℃～20℃時，第二溫度在25℃～37℃。
在一個實施方案中，蛋白沉淀后混合物中的液體及濃縮混合物112中的液體均包含一定濃度的逆熱膠凝聚合物，以致液體具有逆熱膠凝性質(zhì)，優(yōu)選具有逆熱液體凝膠轉(zhuǎn)變溫度，以致當(dāng)濃縮混合物112施用于宿主時，生物相容性聚合物在體內(nèi)由液體轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀。在另一個實施方案中，逆熱膠凝聚合物的濃度不夠大到能在儲藏、使用時或使用后成凝膠形式。IM、SC、IT或IA注射途徑通常優(yōu)選后者。
此處使用的術(shù)語“逆熱粘度特性”及“逆熱粘度行為”均指某一或某些成分的特性，特別是生物相容性聚合物/水的組合在跨越至少某些溫度范圍時經(jīng)歷的粘度隨溫度增加而增加的性質(zhì)?！澳鏌崮z凝特性”指某一或某些成分的特性，特別是生物相容性聚合物/水的組合在溫度自低升高到逆熱液體凝膠轉(zhuǎn)變溫度以上時，產(chǎn)生的從液體形式向凝膠形式的轉(zhuǎn)變?！澳鏌嵋后w凝膠轉(zhuǎn)變溫度”指在某溫度或溫度范圍，在該溫度或溫度范圍某一或某些成分的特性特別是生物相容性聚合物/水的組合隨著溫度升高產(chǎn)生的從液體形式向凝膠形式的物理轉(zhuǎn)變?！澳鏌崮z凝聚合物”指能夠與液體溶媒，特別是水相互作用的聚合物，以致聚合物/液體溶媒組合至少在某些比例的聚合物和液體介質(zhì)下顯示逆熱膠凝性質(zhì)。
一些生物相容性逆熱膠凝聚合物的非限制性實例包括某些多聚醚(優(yōu)選聚氧化亞烷基(polyoxyalkylene)嵌段共聚物，更優(yōu)選聚氧化亞烷基嵌段共聚物包括聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，此處稱為POE-POP嵌段聚合物，如PluronicTMF68、PluronicTML127、PluronicTML101、TetronicTMT1501)；某些纖維素聚合物，如乙基羥乙基纖維素；某些聚醚-酯嵌段共聚物(如美國專利5,702,717所公開的那些，此處引入一如其在此處全部公開)。PluronicTM及TetronicTM為BASF公司的商標(biāo)。此外，聚合物溶液可包含不止一個這些和/或其它生物相容性聚合物。此外，聚合物溶液和/或蛋白溶液中可包括其它聚合物和/或其它添加劑，直至不超出本發(fā)明的操作方法或濃縮混合物112的性能要求。此外，這些聚合物可以和其它聚合物或添加劑，如糖典型地在水性液體溶液中相混合以改變熱逆熱膠凝的轉(zhuǎn)變溫度。聚氧化亞烷基嵌段聚合物一般被視為可用作沉淀試劑的生物相容性材料。聚氧化亞烷基嵌段共聚物為包括至少第一種聚氧化亞烷基的一個嵌段(即共聚物片段)及第二個聚氧化亞烷基的至少一個嵌段的共聚物，但也可同時包含其它嵌段。POE-POP嵌段共聚物是一類制備生物相容性聚合物，優(yōu)選用作生物相容性逆熱膠凝聚合物。POE-POP嵌段共聚物包括至少一個聚氧乙烯(polyoxy-ethylene)嵌段，一個聚氧丙烯(polyoxypropylene)嵌段，當(dāng)然也可同時包含其它嵌段。聚氧乙烯嵌段通常以通式(C2H4O)b表示，b為整數(shù)。聚氧丙烯嵌段通常以通式(C3H6O)a表示，a為整數(shù)。聚氧丙烯嵌段可如(CH2CH2CH2O)a，或可如
幾個POE-POP嵌段共聚物已知可顯示逆熱膠凝性質(zhì)，特別優(yōu)選這些聚合物以賦予濃縮混合物112以逆熱粘度和/或逆熱膠凝性質(zhì)。POE-POP嵌段共聚物的實例包括Pluronic F68、Pluronic F127、Pluronic L121、PluronicL101、及TetronicTMT1501。TetronicTMT1501為POE-POP嵌段共聚物的一個實例，除聚氧乙烯及聚氧丙烯外，該聚合物至少還具有一個聚合物片段。TetronicTMT1501為BASF公司報道的一種嵌段共聚物，包括聚合物片段，或氧化乙烯、氧化丙烯及乙二胺嵌段。
應(yīng)當(dāng)明白，任何當(dāng)前或此后存在的可用作沉淀試劑的生物相容性聚合物，當(dāng)摻入用來制備生物相容性聚合物時均在本發(fā)明的考慮范圍之內(nèi)。
一些優(yōu)選POE-POP嵌段共聚物具有通式HO(C2H4O)a(C3H6O)a(C2H4O)bHI在優(yōu)選實施方案中，其在環(huán)境溫度或較低的溫度下具有液體性質(zhì)，在哺乳動物體溫下以半固體凝膠存在，其中為a和b分別為15～18及50～150范圍內(nèi)的整數(shù)。本發(fā)明使用特別優(yōu)選的POE-POP嵌段共聚物具有如下通式HO(CH2CH2O)b(CH2(CH3)CHO)a(CH2CH2O)bHII其中為a和b為整數(shù)，(CH2(CH3)CHO)a表示的疏水基的分子量為約4,000，疏水性由羥基數(shù)目決定。聚氧乙烯鏈構(gòu)成了分子中單體單元的70％，其中共聚物的平均分子量約12,600。PluronicTMF127，又稱作Poloxamer407即是此類物質(zhì)。此外，也可施用結(jié)構(gòu)類似物PluronicTMF68。
相對于使用非聚合的沉淀試劑，使用生物相容性聚合物的一個優(yōu)點在于生物相容性聚合物有助于保護及穩(wěn)定濃縮混合物112中的蛋白。當(dāng)使用逆熱膠凝聚合物尤其如此，如優(yōu)選的聚氧化亞烷基聚合物。在另一方面，當(dāng)存在一定濃度的逆熱膠凝聚合物時，將賦予逆熱膠凝性質(zhì)，隨著溫度的升高，生成的凝膠又進一步保護蛋白免于降解。
一些非聚合性的沉淀試劑，本發(fā)明并不優(yōu)選使用，包括某些鋅鹽、硫酸銨、乙酸鹽及乙醇。由于其并非生物相容性良好的聚合物，不優(yōu)選使用這些沉淀試劑。
在蛋白沉淀104過程中，沉淀試劑可以任何引起需要的蛋白沉淀方式與蛋白溶液接觸。一般地，沉淀試劑可以溶于加入蛋白溶液中的另一種溶液中，或者，一般在攪拌條件下或在其它有效的混合形式下將蛋白溶液加入該溶液中。
在蛋白沉淀104過程中，沉淀試劑的用量足以產(chǎn)生需要的沉淀。例如，生物相容性聚合物沉淀試劑一般可分開制成包含生物相容性聚合物溶液，溶液中生物相容性聚合物濃度的一般至少5％重量，一般不超過40％重量。在蛋白沉淀104過程之前，優(yōu)選生物相容性聚合物完全溶于聚合物溶液中。在蛋白沉淀過程中將聚合物溶液與蛋白溶液混合后，所得混合物中聚合物的濃度一般至少為5％重量，一般不超過30％重量。蛋白沉淀后有些生物相容性聚合物將殘留于液相中，有些隨同沉淀的蛋白殘留于固相中。在絕大多數(shù)情況下，隨同蛋白沉淀的固體物質(zhì)一般僅為總體混合物的一小部分，該固體物質(zhì)一般為所得的混合物的1％重量～10％重量。
在本發(fā)明的一個改進方法中，處理過程除蛋白及沉淀試劑外可加入一或多種添加劑。一種特別有用的添加劑為蛋白穩(wěn)定劑，其有助于進一步穩(wěn)定濃縮混合物112中的蛋白。當(dāng)用于濃縮組合物112時，蛋白穩(wěn)定劑為任何可以顯著阻止或降低蛋白化學(xué)的或物理不穩(wěn)定性的分子。一些本發(fā)明使用的蛋白穩(wěn)定劑的實例包括通常用于穩(wěn)定凍干蛋白的物質(zhì)。一些所謂的凍干保護劑如美國專利6,267,958所述。本發(fā)明優(yōu)選使用的蛋白穩(wěn)定劑是糖。具體優(yōu)選使用的糖為蔗糖及海藻糖。另一個優(yōu)選的蛋白穩(wěn)定劑為甘露醇。
蛋白穩(wěn)定劑在使用時可用作蛋白溶液的一部分、聚合物溶液的一部分或與蛋白及聚合物溶液分開。優(yōu)選蛋白穩(wěn)定劑在液體分離108過程之前加入，更優(yōu)選蛋白穩(wěn)定劑共溶于至少一種蛋白溶液及聚合物溶液中。
加入蛋白穩(wěn)定劑有助于提高濃縮混合物112的蛋白的穩(wěn)定性。由于無凍干的繁瑣及花費，濃縮混合物112的穩(wěn)定特征特別有利。
另一種在生產(chǎn)中或生產(chǎn)后加入的有利添加劑為一種可改善濃縮混合物112流動性質(zhì)如可注射能力的添加劑。表面活性劑及多羥基化合物為此類可增加流動能力的添加劑實例。加入表面活性劑及多羥基化合物特別有利于改善濃縮混合物112的可注射能力，特別是當(dāng)濃縮混合物112具有極高的蛋白濃度時。優(yōu)選非離子生物相容性表面活性劑及多羥基化合物。所述的多羥基化合物和/或表面活性劑的非限制性實施例見美國專利6,267,958。優(yōu)選用作本發(fā)明的表面活性劑為聚山梨醇酯。一些優(yōu)選多羥基化合物包括甘露醇及甘油。一個優(yōu)選聚山梨醇酯類表面活性劑為商標(biāo)為TweenTM的Uniqema(ICI Group)產(chǎn)品。其它優(yōu)選的表面活性劑包括山梨醇酯，如商標(biāo)為SpanTM的Uniqema(ICI Group)產(chǎn)品。有時由表面活性劑和/或多羥基化合物增加的注射能力是特別顯著且有利的，特別是使用極高濃度的IM、SC、IT或IA注射劑時。
在液體分離108過程中，應(yīng)從蛋白沉淀除去中至少一部分，一般是大部分的液體。分離過程可以使用任何液固分離技術(shù)?？赡艿姆蛛x技術(shù)包括經(jīng)蛋白沉淀靜止后傾析上層液、離心、過濾及旋流。優(yōu)選蛋白沉淀靜止后傾析上層液的方法，由于相對易于保持操作時的無菌環(huán)境。液體分離110一般放棄。濃縮混合物112將便利地包含沉淀蛋白及殘留液體的濃縮制品。在液體分離108中，除去足量的液體以在濃縮混合物112中提供理想濃度的沉淀蛋白。沉淀蛋白的理想濃度將視具體處理的蛋白及具體情況而定。本發(fā)明的一個顯著優(yōu)點為可制備成不同濃度蛋白沉淀的濃縮混合物112，在可視具體應(yīng)用情況具體地制備理想沉淀蛋白濃度的濃縮混合物112具有很大的靈活性。然而，濃縮混合物112中的沉淀蛋白的濃度一般在8％重量～80％重量，更一般地，優(yōu)選7％重量～70％重量。在列舉的沉淀蛋白濃度范圍的下限，沉淀蛋白的濃度應(yīng)當(dāng)足以滿足IM、SC、IT及IA注射技術(shù)給藥。在列舉的沉淀蛋白濃度范圍的上限，保持至少足量的水是重要的，以使?jié)饪s混合物112此后易于以水稀釋而重建成較低濃度的沉淀蛋白用于給藥。優(yōu)選的濃縮混合物112包含水的下限為10％重量，更一般為20％重量，甚至更典型為30％重量，上限典型地為92％重量并更典型地為90％重量。若在液體分離108中除去太多的水，重建時會遇到凍干蛋白重建時出現(xiàn)的問題。通過在濃縮混合物112保持顯著濃度的水，將使?jié)饪s混合物112易于稀釋而重建為適合使用或進一步處理需要的更稀的沉淀蛋白混合物。除水及沉淀蛋白外，濃縮混合物112也至少包括一些沉淀試劑，也可包括其它一些添加劑，如表面活性劑，多羥基化合物和/或蛋白穩(wěn)定劑。濃縮混合物112中的沉淀試劑的濃度將視使用的具體沉淀試劑及沉淀條件而定。當(dāng)使用生物相容性聚合物沉淀試劑時，濃縮混合物112一般包括至少5％重量的生物相容性聚合物，一般不超過50％重量，生物相容性聚合物的濃度更普遍在10％重量～30％重量。當(dāng)使用表面活性劑時，在加工過程中加入，加入量一般至少為蛋白的0.001％重量，更一般地不超過蛋白的的1％重量，此外，其在濃縮混合物112中的濃度也大致相當(dāng)。當(dāng)使用的時候，蛋白穩(wěn)定劑一般在加工過程中加入，加入量一般至少為蛋白的10％重量，更一般地不超過蛋白的的1000％重量，此外，其在濃縮混合物112中的濃度也大致相當(dāng)。
若濃縮混合物112將用作給藥的最終的藥學(xué)制劑，則沉淀蛋白的濃度優(yōu)選地應(yīng)當(dāng)足夠高以使1mL注射劑即可施用全部的蛋白，當(dāng)使用IM、SC、IT及IA注射技術(shù)的時候。在這種情況下，特別是抗體，濃縮混合物112含有的沉淀蛋白的濃度下限一般為8％重量，更一般為10％重量，通常為20％重量，上限一般為50％重量，更一般為40％重量，甚至更一般為35％重量，通常為30％重量。相應(yīng)地，濃縮混合物112中包含的水量的下限為50％重量，更一般為60％重量，甚至更一般為65％重量，通常為的70％重量，上限一般為92％重量，更一般為90％重量的濃縮混合物112。用于經(jīng)IM、SC、IT及IA注射的特別優(yōu)選沉淀蛋白的濃度范圍為10％重量～30％重量，這為許多抗體的使用提供了較大的靈活性。許多抗體需要的濃度范圍為20％重量～30％重量的濃縮混合物112。然而，以IM、SC、IT或IA注射時，濃縮混合物具有足夠的注射能力是重要的，在本發(fā)明中通?？梢詫崿F(xiàn)。
本發(fā)明的一個具體優(yōu)點是濃縮混合物112用作中間產(chǎn)品時，在蛋白生產(chǎn)操作的處理步驟之間易于延長儲藏時間。此時，通常希望在液體分離104過程中除去絕大多數(shù)的液體以致濃縮混合物112具有高濃度的沉淀蛋白以大幅降低體積，在等待進一步處理的時候必須進行處理和儲藏。在這種情況下，特別是抗體，濃縮混合物112具有的沉淀蛋白的濃度下限一般為20％重量，更一般為30％重量，甚至更一般為40％重量及最典型地為50％重量，上限一般為90％重量，更一般為80％重量，甚至更一般為70％重量。相應(yīng)地，濃縮混合物112中包含的水量的下限為10％重量，更一般為20％重量，甚至更一般為30％重量，上限一般為80％重量，更一般為70％重量，甚至更一般為60％重量，最典型地為50％重量。中間體儲藏應(yīng)用的沉淀蛋白的濃度的具體優(yōu)選范圍為濃縮混合物112的50％重量～70％重量。
從所述討論中應(yīng)當(dāng)明白，在絕大多數(shù)情況下，液體分離108過程中將大多數(shù)液體從沉淀蛋白中分離而制備濃縮混合物112。即使在當(dāng)濃縮混合物112被作為最終使用的制劑時的情況下，在液體分離108過程中，一般至少除去50％重量的液體，更典型至少75％重量及甚至更典型至少90％重量的液體。在一些情況下，在液體分離108過程中，除去至少95％重量或甚至98％重量或更多的液體。當(dāng)希望極大濃度的蛋白沉淀時，離心是一種優(yōu)選的液固分離技術(shù)。
從上述討論中還應(yīng)當(dāng)明白，濃縮混合物112包含的沉淀蛋白的濃度要遠高于溶液配制102中蛋白溶液中蛋白的濃度。一般地，濃縮混合物112包含的沉淀蛋白的濃度(基于重量)至少是原蛋白溶液中溶解的蛋白濃度的2倍，更一般至少為5倍，甚至更一般至少10倍。在某些情況下，可達20倍，甚至40倍或更高。當(dāng)濃縮混合物112作為使用的最終制劑時，在絕大多數(shù)情況下，一般至少為5倍，更一般在5～40倍范圍內(nèi)。當(dāng)濃縮混合物112作為進一步處理的中間體時，一般至少為25倍，甚至更一般至少50倍，盡管在某些情況下，可達75倍，甚至100倍或更高。
本發(fā)明一個重要方面為濃縮混合物112是穩(wěn)定的，可儲藏較長時間而基本上沒有降解。當(dāng)使用的沉淀試劑為生物相容性材料時尤其如此，當(dāng)生物相容性材料為逆熱膠凝聚合物時就更是如此。穩(wěn)定性好一方面是因為濃縮混合物112的殘留液體的溶液里包含極少的蛋白，因為大多數(shù)或基本上所有的蛋白通常在蛋白沉淀過程中沉淀出來。由于沉淀的蛋白較之于溶解的蛋白更不易降解及變性，這一點非常重要且有利。溶解于水性液體中的蛋白極易形成不希望的改性聚合物。由于濃縮混合物112保留至少有效量的液體溶媒，因而在蛋白沉淀104過程沉淀盡量多的蛋白非常重要，以使很少蛋白殘留于溶液中而易于形成改性聚合物。濃縮混合物112溶液中殘留的溶解蛋白一般占濃縮混合物112的總蛋白不超過5％重量，優(yōu)選不超過2％重量，更優(yōu)選不超過1％重量，甚至更優(yōu)選不超過0.5％重量，最優(yōu)選不超過0.2％重量。相應(yīng)地，濃縮混合物112中沉淀蛋白一般占總蛋白至少95％重量，優(yōu)選至少98％重量，更優(yōu)選至少99％重量，甚至更優(yōu)選至少99.5％重量，最優(yōu)選至少99.8％重量。濃縮混合物112殘留的生物相容性聚合物可進一步提供儲藏的穩(wěn)定性。生物相容性聚合物似乎保護了沉淀蛋白，并且其存在防止沉淀蛋白重新溶解于殘留溶液中。此外，在生產(chǎn)中加入蛋白穩(wěn)定劑可進一步增加濃縮混合物112的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的一個重要方面為濃縮混合物可長期儲藏而無凍干過程的花費及繁瑣。濃縮混合物112的儲藏一般都需要標(biāo)準(zhǔn)的冷凍。然而，在一個實施方案中，濃縮混合物112包括足量的生物相容逆熱膠凝聚合物以致當(dāng)溫度高于蛋白沉淀104過程中操作溫度時，聚合物將以凝膠形式存在，如上所述逆熱液體凝膠轉(zhuǎn)變溫度一般不超過37℃?，F(xiàn)參照圖2，其為描述了本發(fā)明從濃縮混合物112進行膠凝116的通用方法的方框圖。在膠凝116過程中，濃縮混合物112的溫度從逆熱液體凝膠轉(zhuǎn)變溫度以下升高至轉(zhuǎn)變溫度以上，聚合物將從液體變成凝膠形式。從濃縮混合物112得到的凝膠形式118后即可儲藏。儲藏后，濃縮混合物112得到的凝膠形式118的溫度降低至逆熱液體凝膠轉(zhuǎn)變溫度以下，又將聚合物轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w形式以進行進一步的處理或應(yīng)用。以凝膠形式儲藏的濃縮混合物112降低了冷凍成本及設(shè)備要求，易于操作、運輸。
在另一個實施方案中，濃縮混合物112可便利地長期凍藏。這尤其適用于生產(chǎn)的中間產(chǎn)物的長期儲藏，如處理操作步驟間的一批需延期放置的蛋白。與冷凍稀溶液或更稀的懸液相比，由于濃縮混合物112包含基本上減少的需冷凍的水體積，因而冷凍是有利的。現(xiàn)參照圖3，其為描述了本發(fā)明從濃縮混合物112到冷凍120的通用方法的方框圖。在冷凍120過程中，濃縮混合物112的溫度降低至濃縮混合物112中液體溶媒凝固點以下。一般地，濃縮混合物112的溫度降低至-20～-80℃。所得的濃縮混合物112的冷凍形式122可長期儲藏。儲藏后，可將濃縮混合物112溶媒融解為流動性更好的形式以進行進一步的處理或應(yīng)用。冷凍濃縮混合物112不需凍干，本發(fā)明這一點很重要，由于凍干將顯著增加處理成本并且沉淀蛋白更難以重建為更稀的制劑。
本發(fā)明的一個顯著優(yōu)點是改變濃縮混合物112的沉淀蛋白的濃度很靈活，在生產(chǎn)濃縮混合物112的過程中可加入一些添加劑以及其它一些可用的儲藏及處理手段。另一個優(yōu)點是濃縮混合物112可經(jīng)進一步處理而賦予最終產(chǎn)品一些所需的其它特征。例如，若在溶液配制102或蛋白沉淀104過程中沒有加入蛋白穩(wěn)定劑及表面活性劑，可在液體分離108過程后加入以改變濃縮混合物112的性質(zhì)。濃縮混合物進一步處理地的一個特別重要的實施方案是再加入液體溶媒以制備更稀的蛋白制劑。這是有利的，例如，這對于濃縮混合物112長期儲藏后再制備為更稀的具有改進特征的產(chǎn)品。
現(xiàn)參照圖4，其為描述了本發(fā)明從濃縮混合物112到稀釋128以制備稀釋混合物130的通用方法的方框圖。在稀釋128過程中，將起稀釋作用的液體溶媒加入至濃縮混合物112中以降低稀釋混合物130中蛋白的濃度。稀釋溶媒一般為水性液體，其與濃縮混合物112中已經(jīng)存在的水性液體相容。盡管在一些情況下加入起稀釋作用的液體溶媒將導(dǎo)致一些沉淀蛋白的溶解，但是稀釋128后，當(dāng)溶解于稀釋混合物130中的蛋白濃度達到平衡時溶解的量很小，以致稀釋混合物130中溶解的蛋白濃度不超過其中總蛋白的20％重量，更常見不超過10％重量。相應(yīng)地，稀釋混合物130總蛋白一般至少80％重量，更常見至少90％重量仍然保留為沉淀蛋白的形式。
在絕大多數(shù)情況下，希望在稀釋128過程中，起稀釋作用的液體溶媒具有不溶解任何顯著量的濃縮混合物113中的沉淀蛋白的性質(zhì)。因而，稀釋128過程后，溶解于稀釋混合物130中的蛋白濃度達到平衡時，更典型地不超過5％重量，優(yōu)選不超過2％重量，更優(yōu)選不超過1％重量，甚至更優(yōu)選不超過0.5％重量，最優(yōu)選不超過0.2的濃縮混合物112中的總蛋白溶解于稀釋混合物130的液體溶媒中。相應(yīng)地，更典型地，稀釋混合物130總蛋白的至少95％重量，優(yōu)選至少98％重量，更優(yōu)選至少99％重量，甚至更優(yōu)選99.5％重量，以及最優(yōu)選99.8％重量仍然保留為沉淀蛋白的形式。
為抑制稀釋128過程中的蛋白的溶解，起稀釋作用的液體溶媒里面應(yīng)當(dāng)已經(jīng)溶解了一些沉淀試劑或其它具有抑制或甚至完全防止蛋白再溶解的試劑。然而，當(dāng)使用時，起稀釋作用的液體溶媒里沉淀試劑的濃度通常小于濃縮混合物112中液體溶媒中沉淀試劑的濃度，因而，與濃縮混合物112相比，降低了稀釋混合物130中沉淀試劑的濃度。這對于降低制劑的粘度以改善注射能力是有益的。當(dāng)以生物相容性聚合物為沉淀試劑時，粘度的降低源于稀釋混合物130中存在較大比例的液體及生物相容性聚合物濃度的降低。在一個實施方案中，起稀釋作用的液體溶媒基本上不含有生物相容性聚合物，顯著稀釋了稀釋混合物130的生物相容性聚合物濃度。然而，此時沉淀蛋白的再溶解可能依賴于具體使用的起稀釋作用的溶媒。為防止沉淀蛋白的顯著溶解，應(yīng)當(dāng)加入足量的生物相容性聚合物或其它一些有效預(yù)防再溶解的化學(xué)試劑。即使起稀釋作用的液體溶媒不含有生物相容性聚合物，稀釋混合物130也將仍然包含至少少量的生物相容性聚合物，一般至少包含0.1％重量的生物相容性聚合物。
濃縮混合物112的一個顯著優(yōu)點是沉淀蛋白易于重建以制備稀釋混合物130。為易于重建，濃縮混合物112優(yōu)選包括至少20％重量的水，更優(yōu)選至少30％重量的水。制備濃縮混合物時特別優(yōu)選應(yīng)用生物相容性聚合物作為沉淀試劑，以使蛋白易于重建而制備稀釋混合物(或希望再溶解蛋白時)。稀釋混合物130中水的濃度典型地至少比濃縮混合物112中水的濃度高10％重量(例如，從濃縮混合物112中含有30％重量的水增加至稀釋混合物130中含有至少40％重量的水)。相應(yīng)地，稀釋混合物130中沉淀蛋白的濃度典型地至少比濃縮混合物112低至少10％重量(例如，從濃縮混合物中含有60％重量的沉淀蛋白降低至稀釋混合物130中不超過50％重量的沉淀蛋白)。在稀釋128過程中，通常向濃縮混合物112加入起稀釋作用的液體溶媒的量至少與濃縮混合物112的液體溶媒一樣大或大數(shù)倍。例如，當(dāng)濃縮混合物112中沉淀蛋白的濃度很高需要臨時儲藏時尤其如此(例如，在濃縮混合物112中也許含有40％重量～70％重量的沉淀蛋白)，稀釋128步驟意在將制劑中的沉淀蛋白濃度稀釋至較低的濃度(例如，將稀釋混合物130的沉淀蛋白稀釋至10％重量～30％重量)，以增加注射能力或最終藥物組合物中期望的其它性質(zhì)，如適于IM、SC、IT或IA注射使用。
在制備蛋白組合物的生產(chǎn)操作步驟之間，通常需要長期儲藏，能夠制備濃縮混合物112以長期穩(wěn)定儲藏蛋白是特別有利的。例如，許多治療用途的蛋白以發(fā)酵方法大量制備。然后將蛋白純化。純化過程一般在低蛋白濃度下操作。在這些操作中，有時希望將不同純化階段的處理后物質(zhì)儲藏。利用本發(fā)明，蛋白可濃縮成濃縮混合物112進行儲藏，此后通過稀釋128重建為具有較低濃度沉淀蛋白的稀釋混合物130。而且，不僅僅是稀釋，若需進一步處理沉淀蛋白可將其再溶解，但一般無需此種操作。為重新溶解沉淀的蛋白，應(yīng)當(dāng)加入足量的基本上不含有沉淀試劑或諸如此類的試劑的水溶媒以完全溶解沉淀的蛋白。在有些情況下，為完全再溶解沉淀蛋白，必要時，可多次加入或分出水性液體以使殘留的沉淀試劑降低至極低水平。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的沉淀蛋白混合物(如，濃縮混合物112或稀釋混合物130)可以被包裝成諸如包含單位劑量沉淀蛋白的小瓶或大瓶?，F(xiàn)參照圖5，其為一方框圖，描述了本發(fā)明從濃縮混合物112通過包裝134步驟制得經(jīng)包裝的藥物136的通用方法。在包裝134中，將既定量的濃縮混合物112置于容器內(nèi)，容器被密封以防運輸及儲藏過程中被污染。在一個優(yōu)選實施方案中，密封于每個容器內(nèi)的濃縮混合物112的量為使用的沉淀蛋白的單位劑量。在一個甚至更加優(yōu)選的實施方案中，包含單位劑量濃縮混合物112的體積不超過1mL，同時優(yōu)選具有足夠的注射能力，可采用IM、SC、IT或IA注射技術(shù)。
本發(fā)明的另一方面提供了包括沉淀蛋白及液體溶媒的藥物組合物。該藥物組合物為濃縮的沉淀蛋白，但也包括有效量的液體溶媒，溶媒典型地為上述討論的水性液體。藥物組合物一般也至少包括一些沉淀試劑及其它添加劑，如蛋白穩(wěn)定劑和/或表面活性劑。所有上述關(guān)于不同組分的類型及相對量的討論此處同樣適用，尤其是圖1-5所述的濃縮混合物112及稀釋混合物的相關(guān)性質(zhì)。藥物組合物可以是例如，圖1-5所述的濃縮混合物112或稀釋混合物130，或可以是包括任何相對數(shù)量的具有上述任何相關(guān)性質(zhì)的任何組分的其它產(chǎn)物。藥物組合物成分的相對數(shù)量將視具體情況而定，例如，視組合物中包含的具體蛋白、組合物是否是為了中間儲藏或為最終制劑而定。
如上所述，藥物組合物包括至少顯著數(shù)量的液體溶媒以有利于沉淀蛋白的重建，這對制備必要的更稀制劑是有益的。因而，優(yōu)選組合物中的沉淀蛋白沉淀后應(yīng)保持制劑包含至少10％重量，優(yōu)選至少20％重量，更優(yōu)選30％重量的水，盡管更高的含水濃度也是常見的，如上述關(guān)于圖1-5的討論。與上述關(guān)于圖1-5討論相一致，藥物組合物通常至少包括8％重量，優(yōu)選至少10％重量及通常更高濃度的沉淀蛋白，以及至少0.1％重量，優(yōu)選至少5％重量及甚至更高濃度的生物相容性聚合物。當(dāng)使用的時候，蛋白穩(wěn)定劑的濃度通常為沉淀蛋白的10％重量～1000％重量。當(dāng)使用表面活性劑時，其濃度通常是沉淀蛋白的0.1％重量～1％重量。當(dāng)添加劑的用量此處定為沉淀蛋白的重量百分比時，其指添加劑用量為沉淀蛋白的相對重量百分比。
在一個實施方案中，如上所述，藥物組合物密封于容器內(nèi)，優(yōu)選包含于密封容器內(nèi)的藥物組合物的總體積不超過1mL。包含于密封容器內(nèi)的藥物組合物的量也優(yōu)選包括供施用的單位劑量沉淀蛋白。
在一個實施方案中，藥物組合物為足夠可注射形式以供注射施用。在一個優(yōu)選實施方案中，藥物組合物以IM、SC、IT或IA技術(shù)注射施用，優(yōu)選通過不大于18號皮下注射針施用。當(dāng)注射施用時，藥物組合物包裝于注射裝置中，例如注射器，優(yōu)選使用帶有不大于18號皮下注射針的注射器。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種使用藥物組合物將沉淀蛋白施用于患者的方法。優(yōu)選上述的注射使用方式。優(yōu)選單位劑量的沉淀蛋白，其藥物組合物的體積不超過1mL。在一個優(yōu)選實施方案中，藥物組合物包括表面活性劑，該表面活性劑能提高藥物組合物的可注射性能。
本發(fā)明另一方面提供了一種使用藥物組合物的方法，該組合物利于沉淀蛋白的長期儲藏。在一個優(yōu)選實施方案中，藥物組合物將包括至少一種利于長期儲藏應(yīng)用的蛋白穩(wěn)定劑。
實施例本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員審視了下述實施例后，易于明白本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點及新特征，實施例意在進一步描述及幫助了解本發(fā)明，而不能從任何方面限制本發(fā)明的范圍。
實施例1將在生理鹽水中制得的20mL均勻的10mg/mL牛免疫球蛋白(B-IgG)(CalBiochem，cat#345876)冷卻至2-8℃，其制備方法為將干燥的B-IgG溶解于150mM NaCl，0.1％NaN3溶液中。30％(重量體積)PluronicTMF127(BASF)去離子水儲備液的制法如下將聚合物溶于冷卻至2-8℃的水中，輔以周期攪拌直至形成均勻溶液。將20mL PluronicTM儲備液置于帶有磁力攪拌器的玻璃容器內(nèi)，保持于2-8℃攪拌。攪拌下，將B-IgG溶液緩慢加入PluronicTM溶液中。所得混合物立即生成沉淀。于2-8℃攪拌混合物30分鐘。所得懸液以1300rmp的轉(zhuǎn)速離心15分鐘。傾析出大約39mL上清液，分析其中蛋白含量。得到致密柔軟的沉淀物質(zhì)(濃縮混合物)。
實施例2B-IgG溶液及PluronicTMF127的制備如實施例1所述。將500μLB-IgG溶液加入至500μL的F127溶液中。所得混合物于2-8℃首尾交互倒置(end-to-end inversion)振搖30分鐘。離心分離沉淀，傾析出上清流體。將離心沉淀物(濃縮混合物)再溶于1mL生理鹽水中。生理鹽水/沉淀物的混合物于2-8℃溫育約16小時后，簡單渦得到無水透明溶液。
實施例3除了B-IgG溶液包括10％(重量體積)的甘露醇溶液外，牛免疫球蛋白及PluronicTMF127溶液的制備如實施例1所述。然后，將B-IgG溶液加入至PluronicTM溶液進行混合。所得混合物于2-8℃首尾交互倒置振搖30分鐘。離心分離沉淀，分離的沉淀(濃縮混合物)為粘稠流體。分離的沉淀物(濃縮混合物)具有足夠的注射能力，將其置于lcc塑料注射器中，極易分散通過22號皮下注射針。
實施例4除加入0.005％TweenTM而非10％甘露醇外，其它完全同實施例3。所得沉淀(濃縮混合物)也很柔軟，推動下可通過27號皮下注射針。
實施例5除加入10％海藻糖、10％葡萄糖、10％果糖或10％PEG600(聚乙二醇)而非甘露醇外，其它完全同實施例3。所得沉淀(濃縮混合物)堅硬，推動不能通過18號皮下注射針。
實施例6以5mL生理鹽水重建凍干塊(Cappel，Cat#55304)制備15mg/mL的多克隆兔抗卵白蛋白溶液，將所得溶液冷卻至2-8℃。如實施例1所述制備30％(重量體積)PluronicTMF127溶液。將250μL的抗體溶液加入至250μL的聚合物溶液中。所得混合物于2-8℃首尾交互倒置振搖30分鐘。離心分離沉淀，傾析出上清流體。將沉淀物(濃縮混合物)如實施例2所述再溶于生理鹽水中。分析非特異低聚反應(yīng)的程度及再溶解的抗體的反應(yīng)親和力，分析分別以大小(size)排阻色譜法及ELISA進行。分析發(fā)現(xiàn)，初始的及再溶解的蛋白物質(zhì)分析沒有變化。
實施例7除了將沉淀物(濃縮混合物)于2-8℃保持2個月其它完全同實施例6，無顯著的非特異低聚反應(yīng)和/或反應(yīng)親和力變化，表明濃縮混合物的蛋白長期儲藏是穩(wěn)定的。
實施例8除了將0.005％TweenTM加入至兔抗卵白蛋白溶液中，所得濃縮混合物于2-8℃保持2個月，其它完全同實施例7，無顯著的非特異低聚反應(yīng)和/或反應(yīng)親和力變化，表明濃縮混合物的蛋白長期儲藏是穩(wěn)定的。
實施例9將10％(重量體積)甘露醇加入至兔抗卵白蛋白溶液中，所得濃縮混合物于2-8℃保持2個月，其它完全同實施例7，無顯著的非特異低聚反應(yīng)和/或反應(yīng)親和力變化，表明濃縮混合物的蛋白長期儲藏是穩(wěn)定。
實施例10將0.005％TweenTM加入至兔抗卵白蛋白溶液中，所得的濃縮混合物于-20℃或-80℃的冷凍狀態(tài)保持2周，并進行一個冷凍/融解循環(huán)，其它完全同實施例6。無顯著的非特異低聚反應(yīng)和/或反應(yīng)親和力變化，表明濃縮混合物的蛋白經(jīng)過冷凍/融解循環(huán)后是穩(wěn)定的。
實施例11除將所得濃縮混合物以包含30％、22.5％或15％(重量體積)PluronicTMF127的250μL水性液體溶液覆蓋外，其它完全同實施例6。每份標(biāo)本升溫至40℃并保持3周。每份標(biāo)本的低聚反應(yīng)有所增加，但蛋白的反應(yīng)親和力無差異，表明一些蛋白已經(jīng)發(fā)生降解。
實施例12除將10mM或100mM氯化鋅加入至兔抗卵白蛋白溶液中，其它完全同實施例6。濃縮混合物中的沉淀蛋白不易再溶解于生理鹽水中。
為闡釋及描述本發(fā)明進行了上述討論。上述內(nèi)容不能理解為將本發(fā)明僅限于此處具體公開的形式。盡管本發(fā)明的說明書包括一個或多個實施方案以及一些變動及更改，其它一些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動及更改，例如，理解了本發(fā)明公開后屬于本領(lǐng)域的技術(shù)及知識范圍的變動及更改。意指包括允許程度的替代性實施方案，包括要求保護的那些內(nèi)容的替代、互變的和/或等價的結(jié)構(gòu)、功能、范圍或步驟，無論這些替代的、互變的和/或等價的結(jié)構(gòu)、功能、范圍或步驟此處是否公開，目的不在于詳盡公開任何可專利的主題。此外，任何一個公開的實施方案中所述的任一特征可與其它任何一個或多個實施方案的特征以任何組合方式相組合。例如，在圖1-5的處理實施方案中任何一個公開的處理過程中或以后的任何一處，可增加處理步驟，只要這些處理步驟不與公開的步驟相沖突。此外，圖1-5任何一個公開的處理步驟可與圖1-5中公開的其它處理步驟相組合。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，該組合物包括至少10％重量的沉淀蛋白，該沉淀蛋白以生物相容性聚合物沉淀試劑自水性液體溶液中沉淀制得；以及至少10％重量的水。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，該組合物包括至少20％重量的水；以及其中沉淀蛋白自沉淀后一直保持在包含不少于20％重量水的制劑中。
3.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中水經(jīng)冷凍。
4.權(quán)利要求1的藥物組合物，該組合物包括至少10％～50％重量的沉淀蛋白以及50％～90％重量的水。
5.權(quán)利要求1的藥物組合物，該組合物包括至少0.1％重量的生物相容性聚合物。
6.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中藥物組合物中的生物相容性聚合物的濃度低于沉淀過程中的生物相容性聚合物的濃度。
7.權(quán)利要求1的藥物組合物，該組合物包括至少10％重量的生物相容性聚合物。
8.權(quán)利要求1的藥物組合物，該組合物包括10％～30％重量的生物相容性聚合物。
9.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中沉淀蛋白包括至少95％重量的組合物總蛋白。
10.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中沉淀蛋白包括至少99％重量的組合物總蛋白。
11.權(quán)利要求10的藥物組合物，該組合物包括至少5％重量的生物相容性聚合物。
12.權(quán)利要求11的藥物組合物，其中生物相容性聚合物為聚氧化亞烷基嵌段共聚物。
13.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中生物相容性聚合物為逆熱膠凝聚合物。
14.權(quán)利要求9的藥物組合物，其中該組合物至少包括一些生物相容性聚合物，藥物組合物中生物相容性聚合物的濃度沒有大至藥物組合物顯示逆熱膠凝的水平。
15.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中生物相容性聚合物包括聚氧化亞烷基嵌段共聚物。
16.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中蛋白為高分子蛋白。
17.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中蛋白為抗體。
18.權(quán)利要求1的藥物組合物，該組合物包括蛋白穩(wěn)定劑。
19.權(quán)利要求1的藥物組合物，該組合物包括表面活性劑。
20.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中該組合物為包裝于注射裝置中的可注射形式。
21.權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中注射裝置包括注射器。
22.權(quán)利要求21所述的藥物組合物，其中注射器帶有針口不大于18號的皮下注射針。
23.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中藥物組合物包裝于密封的容器內(nèi)。
24.權(quán)利要求23所述的藥物組合物，其中藥物組合物的總體積不超過1mL。
25.一種制備包括濃縮蛋白的藥物組合物的方法，包括自蛋白水性溶液中沉淀蛋白以形成包括沉淀蛋白及水性液體的混合物，沉淀步驟包括將溶液與生物相容性蛋白聚合物沉淀試劑相接觸；濃縮沉淀蛋白，包括自混合物中除去足量水性液體以制備包括至少10％重量的沉淀蛋白以及至少10％重量的水的濃縮混合物。
26.權(quán)利要求25的方法，包括濃縮后將濃縮混合物中的水冷凍。
27.權(quán)利要求26的方法，包括冷凍后，以冷凍狀態(tài)儲存濃縮混合物；以及儲藏后，融化濃縮混合物中的水。
28.權(quán)利要求27的方法，包括融化后稀釋濃縮混合物，稀釋過程包括將水性稀釋液體溶液與濃縮混合物相混合形成稀釋混合物，該稀釋混合物包括其濃度比濃縮混合物中沉淀蛋白的濃度至少低10％重量的沉淀蛋白。
29.權(quán)利要求28的方法，其中稀釋后，當(dāng)稀釋混合物中蛋白濃度達到平衡時，稀釋混合物中不超過5％重量的蛋白溶解于稀釋混合物的水性液體中。
30.權(quán)利要求27的方法，包括融化后將自沉淀蛋白中得到的蛋白溶于水性液體中。
31.權(quán)利要求25的方法，其中濃縮混合物中沉淀蛋白的濃度為沉淀蛋白的第一濃度，濃縮混合物中水的濃度為水的第一濃度；以及濃縮后，制備沉淀蛋白的稀釋混合物，稀釋混合物包括水的第二濃度，其比水的第一濃度大至少10個重量百分點，并包括沉淀蛋白的第二濃度，至少比沉淀蛋白的第一濃度小10個重量百分點。
32.權(quán)利要求31的方法，其中濃縮混合物包括生物相容性聚合物的第一濃度，并且稀釋混合物包括生物相容性聚合物的小于第一濃度的第二濃度。
33.權(quán)利要求32的方法，其中制備過程包括將稀釋水性液體與濃縮混合物相混合。
34.權(quán)利要求33的方法，其中水性液體基本上不含有生物相容性聚合物。
35.權(quán)利要求33的方法，其中稀釋水性液體包括的生物相容性聚合物的濃度低于濃縮混合物中生物相容性聚合物的濃度。
36.權(quán)利要求25的方法，包括沉淀后，將沉淀蛋白包裝于密封容器內(nèi)，當(dāng)沉淀蛋白密封于容器內(nèi)時，包含該沉淀蛋白的藥物組合物包括至少10％重量的沉淀蛋白以及至少20％重量的水的混合物。
37.權(quán)利要求36的方法，包括在沉淀及包裝過程之間，將沉淀蛋白保持在包括至少20％重量水的制劑里。
38.權(quán)利要求28所述的方法，其中容器里產(chǎn)品混合物的體積不超過1mL。
39.一種儲藏蛋白的方法，該方法包括冷凍包括沉淀蛋白、水及生物相容性聚合物的混合物；其中混合物包括至少10％重量的沉淀蛋白、至少10％重量的水以及至少0.1％重量的生物相容性聚合物。
40.權(quán)利要求31的方法，其中生物相容性聚合物為逆熱膠凝聚合物。
41.權(quán)利要求32的方法，其中生物相容性聚合物為聚氧化亞烷基嵌段共聚物。
42.權(quán)利要求39的方法，其中混合物包括至少5％重量的生物相容性聚合物。
43.權(quán)利要求42的方法，其中混合物包括至少30％重量的沉淀蛋白。
44.權(quán)利要求43的方法，其中混合物包括至少10％重量的聚合物以及至少40％重量的沉淀蛋白。
45.一種制備包含濃縮蛋白的組合物的方法，該方法包括稀釋包括蛋白及水性液體的濃縮混合物，以形成蛋白濃度比濃縮混合物蛋白濃度低的稀釋混合物，稀釋過程包括將濃縮混合物與起稀釋作用的水性液體相混合；濃縮混合物包括至少20％重量的蛋白以及10％重量的水，濃縮混合物中至少95％重量的總蛋白以沉淀形式存在，濃縮混合物中不超過5％重量的總蛋白溶于水中；以及當(dāng)溶于稀釋混合物水性液體的蛋白濃度達到平衡時，稀釋混合物中至少80％重量的總蛋白以沉淀形式存在，稀釋混合物中不超過20％重量的總蛋白溶于稀釋混合物的水性液體中。
46.權(quán)利要求45的方法，其中濃縮混合物中至少99％重量的總蛋白以沉淀形式存在；以及當(dāng)溶于稀釋混合物水性液體的蛋白濃度達到平衡時，稀釋混合物中至少95％重量的總蛋白以沉淀形式存在。
47.權(quán)利要求45的方法，其中稀釋混合物中的蛋白濃度比濃縮混合物中蛋白濃度至少低10％重量。
48.權(quán)利要求47的方法，其中濃縮混合物至少包括40％重量的蛋白。
49.權(quán)利要求48的方法，其中稀釋混合物至少包括10％～30％重量的蛋白。
50.權(quán)利要求45的方法，其中濃縮混合物與稀釋混合物都包括抑制沉淀蛋白溶解的沉淀試劑。
51.權(quán)利要求50的方法，其中沉淀試劑包括生物相容性聚合物。
52.權(quán)利要求51的方法，其中生物相容性聚合物為聚氧化亞烷基嵌段共聚物。
53.權(quán)利要求52的方法，其中濃縮混合物至少包括5％重量的生物相容性聚合物。
54.一種施用蛋白的方法，包括向患者注射權(quán)利要求1的藥物組合物。
55.權(quán)利要求1的藥物組合物在蛋白儲藏中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種包括沉淀蛋白及液體溶媒的濃縮混合物及其制備方法。濃縮混合物的制備方法為，以生物相容性聚合物沉淀試劑沉淀蛋白，然后除去足量液體并將所得混合物濃縮到所需程度。沉淀蛋白可以濃縮混合物的形式儲藏相當(dāng)長時間，如可用于生產(chǎn)操作時各步驟的中間體。
文檔編號A61K9/14GK1604788SQ02825185
公開日2005年4月6日 申請日期2002年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月16日
發(fā)明者杰弗里·B·埃特, 阿德里安·C·薩馬尼戈, 約翰·F·卡彭特 申請人:里克斯金蒂克斯公司, 科羅拉多大學(xué)董事會