專利名稱：監(jiān)測和治療肌萎縮性側(cè)索硬化癥的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)癥和免疫功能。更具體地說，本發(fā)明涉及活化單核細胞或異常巨噬細胞，并涉及ALS發(fā)展和治療的監(jiān)測，以及ALS患者的治療。
背景技術：
肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)，俗稱Lou Gehrig′s病，是一種神經(jīng)退行性疾病，其特征在于大腦和脊索內(nèi)上位和/或下位運動神經(jīng)元的選擇性喪失。患者表現(xiàn)出不同的癥狀，包括肌肉抽搐和痙攣，喪失對手和手臂的運動控制，手臂和腿功能殘缺，衰弱和疲勞，絆倒和跌倒，無法握持，口齒不清，以及呼吸或吞咽困難。ALS最終會導致死亡。
通常，ALS在神經(jīng)病理學上以腦干、脊索和腦皮層內(nèi)運動神經(jīng)元退化為特征。臨床上，ALS的特征包括肌肉進行性衰弱、機能喪失和震顫(痙攣)，并伴有僵直、反射亢進和病理性皮質(zhì)脊髓束病變。
興奮性中毒和氧化應激是參與ALS運動神經(jīng)元細胞死亡的至少兩項機制(Kalra等，(1999)，J.Neurol.Sci.，165S27-32)。支持興奮性中毒參與ALS這一觀點的發(fā)現(xiàn)之一是發(fā)現(xiàn)ALS患者腦脊髓液中谷氨酸水平升高，而且，患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中谷氨酸受體的數(shù)量和功能發(fā)生改變(Rothstein等，(1990)Ann.Neurol.，2818-25；Shaw等，(1995)Neurodegeneration，4209-216；Gredal等(1996)，J.Neurol.Sci.，143121-125；Virgo等(1995)，Brain Res.，676196-204)。氧化應激和反應性氧參與ALS的許多證據(jù)來自部分家族性ALS病例中發(fā)現(xiàn)了超氧化物歧化酶(SOD1)基因突變(Deng等，(1993)，Science，2611047-1051；Rosen等(1993)，Nature，36259-62)。已證明，表達人突變SOD1的轉(zhuǎn)基因小鼠的運動神經(jīng)元特別易受自由基的損傷(Gurney等(1994)，Science，2641772-1775)，并且，在ALS患者和SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠的CNS組織中都發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)、脂類和核酸的氧化性改變(Ferrante等(1997)，J.Neurochem，692064-2074；Hall等(1998)，J.Neurosci.Res.，5366-77；Ferrante等(1997)Ann.Neurol.，42326-334)。
免疫功能失調(diào)也被提出可能與ALS相關。例如，在ALS脊索內(nèi)發(fā)現(xiàn)有證據(jù)表明發(fā)生了細胞介導的應答。例如，ALS脊索內(nèi)發(fā)現(xiàn)有輔助T淋巴細胞和細胞毒T淋巴細胞，以及表達主組織相容性糖蛋白HLA-A、B、C和HLA-DR的反應性小神經(jīng)膠質(zhì)細胞(McGeer等，(1991)，Can.J.Neurol.Sci.，18376-379)。ALS患者肌肉活組織樣本中發(fā)現(xiàn)了主要由T淋巴細胞和巨噬細胞構(gòu)成的細胞浸潤(Troost等(1992)，Clin.Neuropathol.，11115-120)。萎縮肌肉纖維周圍的T細胞和巨噬細胞大多數(shù)高水平地表達HLA-DR，顯示細胞處于激活狀態(tài)，并且表明這些細胞參與了ALS相關性肌肉萎縮。此外，ALS患者外圍神經(jīng)的神經(jīng)內(nèi)膜中也發(fā)現(xiàn)了表達HLA-DR的Schwann細胞(Olivera等(1994)，Arq.Neuropsiquiatr.，52493-500)。
ALS可通過多種測試和檢查來診斷，其中包括肌肉和神經(jīng)活組織檢查、腰椎穿刺、X光、磁共振造影(MRI)和電診斷試驗，其中許多牽涉?zhèn)π赃^程或復雜的造影和分析。所以，仍需一項關于ALS疾病進程的簡易測定方法以用于疾病的監(jiān)測和ALS潛在治療方法的評價。
本發(fā)明參考了在此引用的所有專利和非專利公開文獻。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種監(jiān)測ALS治療效果的方法，包括檢測個體的外周血樣品中CD14+細胞的HLA-DR表達水平和/或異常巨噬細胞的水平。
因此，本發(fā)明內(nèi)容之一，比較治療前和治療期間外周血中CD14+細胞的HLA-DR表達水平和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量和/或CD14+細胞群中CD16+細胞所占百分比，由此確定ALS治療效果，CD14+細胞的HLA-DR表達水平和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量和/或CD14+細胞群中CD16+細胞所占百分比趨于降低表明有效。
本發(fā)明還提供監(jiān)測ALS患者病情發(fā)生、發(fā)展的方法，包括測定ALS患者外周血樣品中異常巨噬細胞水平。
因此，本發(fā)明另一內(nèi)容，比較病程的不同時刻外周血中CD14+細胞的HLA-DR表達水平和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量和/或CD14+細胞群中CD16+細胞所占百分比，由此監(jiān)測ALS發(fā)展，CD14+細胞的HLA-DR表達水平和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量和/或CD14+細胞群中CD16+細胞所占百分比升高表明病情加重和/或發(fā)展加速。
本發(fā)明還提供減少ALS患者體內(nèi)CD14+單核細胞，尤其是活化的循環(huán)性CD14+單核細胞的方法，包括給予減少CD14+單核細胞有效量的多胺類似物。
本發(fā)明還提供減少ALS患者體內(nèi)活化、循環(huán)單核細胞的方法，包括給予減少活化、循環(huán)單核細胞有效量的多胺類似物。
本發(fā)明還提供減少ALS患者體內(nèi)異常巨噬細胞的方法，是通過給予患者減少HLA-DR高表達CD14+細胞有效量的多肽類似物。
本發(fā)明還提供通過給予減少CD14+/CD16+細胞有效量的多胺類似物來減少ALS患者體內(nèi)異常巨噬細胞的方法。
本發(fā)明還提供篩選能有效減少ALS相關CD14+單核細胞尤其是活化循環(huán)單核細胞的藥物的方法。
本發(fā)明還提供篩選能有效減少ALS相關異常巨噬細胞的藥物的方法，是通過檢測候選藥物存在和不存在時HLA-DR高表達CD14+細胞活度的差異，所述HLA-DR高表達CD14+細胞獲自ALS患者血樣。
本發(fā)明還提供另一種篩選能有效減少ALS相關異常巨噬細胞的藥物的方法，是通過通過檢測候選藥物存在和不存在時CD14+/CD16+細胞活度的差異，所述CD14+/CD16+獲自ALS患者血樣。
本發(fā)明還提供輔助ALS診斷或預防的方法，是通過檢測個體血樣中CD14+的HLA-DR表達是否升高，和/或CD14+/CD16+細胞是否增加，和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比是否升高。某些實施例將以上異常巨噬細胞檢測與一項或多項其它疾病指標相結(jié)合來診斷ALS。
本發(fā)明還提供通過檢測血樣中異常巨噬細胞來輔助ALS診斷的方法，所述的檢測包括檢測HLA-DR高表達CD14+細胞。本發(fā)明還提供通過檢測血樣中異常巨噬細胞來輔助ALS診斷的方法，所述的檢測包括檢測CD14+/CD16+細胞。
本發(fā)明某些實施例中，檢測血樣中有否異常巨噬細胞需在采血后12小時內(nèi)完成。


圖1ALS患者(ALS)和非ALS患者(正常對照)外周血樣品中CD14+單核細胞上HLA-DR表達水平的柱形圖。
圖2ALS患者(ALS)和非ALS患者(正常對照)外周血樣品中CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比的柱形圖。
圖3收集在含肝素試管中和收集在含鈣螯合劑ACD試管中的ALS患者外周血樣品中CD14+單核細胞上HLA-DR表達水平的柱形圖。收集在含肝素試管中非ALS患者(正常)外周血樣品中的CD14+細胞HLA-DR表達水平中值以水平實線表示，該中值上、下的虛線表示標準偏差。
圖4收集在含肝素試管中和收集在含鈣螯合劑ACD試管中的ALS患者外周血樣品中CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比的柱形圖。收集在含肝素試管中非ALS患者(正常)外周血樣品中的CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比中值以水平實線表示，該中值上、下的虛線表示標準偏差。
圖51μM多胺類似物處理后外周血樣品中CD14+細胞殺傷百分比柱形圖。圖中樣品取自6名ALS患者(Pt1-Pt6)，一名多發(fā)性硬化癥患者(MSpt)，一名正常個體。
具體實施例方式
我們發(fā)現(xiàn)，與非ALS患者外周血樣品中的單核細胞相比，ALS患者外周血樣品中的循環(huán)單核細胞通常被活化和/或分化異常(與“活化循環(huán)單核細胞”和“異常巨噬細胞”同義)。我們還發(fā)現(xiàn)了這些細胞的增殖。由此，我們發(fā)現(xiàn)了監(jiān)測ALS癥發(fā)展和/或活性的方法以及監(jiān)測抗ALS藥物療效的方法。我們的發(fā)現(xiàn)還為治療性干預指示了一個潛在的重要靶標，因為這些異常細胞至少介導ALS癥的癥狀之一。
ALS患者外周血中存在活化單核細胞或異常巨噬細胞通常反映為CD14表達和HLA-DR總水平提高和/或CD14和CD16細胞表達，通常不伴有可測的T細胞活化。
我們還發(fā)現(xiàn)，用抗增殖藥物例如多胺類似物處理ALS患者的外周血單核細胞可減少患者外周血中的活化CD14+單核細胞(或異常巨噬細胞)。
所以，本發(fā)明提供監(jiān)測治療前、期間和/或之后，或無治療情況下ALS癥發(fā)展情況的方法，該方法是通過測定ALS患者的生物樣品尤其是血樣中異常巨噬細胞的水平。本發(fā)明還提供通過在給藥之前、期間或之后測定ALS患者的生物樣品尤其是血樣中異常巨噬細胞的水平來監(jiān)測抗ALS藥物或發(fā)案療效的方法。本發(fā)明還提供減少ALS患者體內(nèi)活化CD14+單核細胞的方法，該方法單用或與其它治療方法聯(lián)合可延遲和/或緩解ALS一種或多種癥狀。如后文所述，減少ALS患者體內(nèi)活化CD14+單核細胞的藥物優(yōu)選多胺類似物。
定義本文中，“巨噬細胞”和“單核細胞”同義，根據(jù)本領域常識，“單核細胞”一般用于描述表達CD14細胞表面標志的循環(huán)單核細胞，此類細胞在組織中歸為巨噬細胞。
本文中，“異常巨噬細胞”或“活化循環(huán)單核細胞”或“活化單核細胞”同義，指表達CD14(即CD14+)，高水平表達HLA-DR即II類主組織相容性抗原，和/或表達CD16(CD16+)的單核細胞。通常，異常巨噬細胞存在于外周血中，但也可能存在于其它生物樣品中。通常，在ALS患者中，此類異常巨噬細胞不伴有可測的T細胞活化。
本文中，“有異常巨噬細胞存在”一般表示檢測到一定水平的異常巨噬細胞。通常，異常巨噬細胞(或活化單核細胞)的水平表現(xiàn)為CD14+細胞群中的HLA-DR表達水平和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量，但是也可采用反映單核細胞活化、分化和/或增殖的其它指標。一般認為，無需測定絕對值甚至相對值，觀察到可測異常巨噬細胞即已足夠。
“肌萎縮性側(cè)索硬化”或“ALS”是本領域標準術語，在此表示一種進行性神經(jīng)退行性疾病，它影響到上位運動神經(jīng)元(腦中的運動神經(jīng)元)和/或下位運動神經(jīng)元(脊索中的運動神經(jīng)元)，造成運動神經(jīng)元死亡?！癆LS”在此包括所有本領域已知的ALS型，其中包括但不限于經(jīng)典ALS(即影響上位運動神經(jīng)元又影響下位運動神經(jīng)元)，原發(fā)性側(cè)索硬化(PLS，只影響上位運動神經(jīng)元)，進行性延髓性麻痹(PBP或延髓性發(fā)病，ALS的一種，一般由吞咽、咀嚼和說話困難開始)，進行性肌肉萎縮(PMA，一般只影響下位運動神經(jīng)元)和家族性ALS(一種遺傳性ALS)。
“增殖性巨噬細胞”是本領域標準術語，在此表示正在分裂的巨噬細胞。正常巨噬細胞是終極分化細胞，不具備進一步分裂的能力。在本發(fā)明中，“增殖性巨噬細胞”能夠進一步分裂，或者處于細胞周期的某一中間階段。檢測增殖性巨噬細胞的方法參見后文。
本文中，檢測“有否增殖性巨噬細胞存在”表示測定增殖性巨噬細胞的水平。一般認為，無需測定絕對值甚至相對值，觀察到可測的增殖性巨噬細胞即已足夠。
“個體”指脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物，尤其是人。哺乳動物包括但不限于畜養(yǎng)動物、比賽用動物、嚙齒動物、靈長動物和寵物?！癆LS個體”或“ALS患者”指表現(xiàn)出ALS相關癥狀因而被診斷或被疑患有ALS的個體?！胺茿LS患者”指沒有被診斷或被疑患有ALS的個體。ALS及其診斷方法是本領域已知的，本文亦對其進行了論述。
本文中，“生物樣品”包括采自某個體，可用于診斷或監(jiān)測試驗的多種類型的樣品，包括生物來源的血液或其它液體樣品，固體組織樣品，例如組織活檢樣本或組織培養(yǎng)物或其衍生所得的細胞，以及其子代。該術語還包括采集后已經(jīng)過處理的樣品，例如經(jīng)藥物處理、經(jīng)增溶或?qū)δ承┏煞掷绲鞍踪|(zhì)或聚核苷酸進行了富集?！吧飿悠贰卑ㄅR床樣品，也包括培養(yǎng)細胞、細胞上清液、細胞裂解液，血清，血漿，生物液和組織樣品。通常，所述樣品來自或就是外周血，所以可稱為“血樣”。有時，可事先利用例如玻璃或樹脂粘附富集血液中的巨噬細胞。
“血樣”即源自血液最好是外周血(或循環(huán)血)的生物樣品。血樣可以是例如全血、血漿或血清。
本文中，“輔助診斷”的方法表示輔助臨床確定ALS型或性質(zhì)的方法，其本身可能足以也可能尚不足以確診。所以，輔助診斷ALS的方法可包括檢測個體生物樣品中異常巨噬細胞水平和/或測定個體生物樣品中CD14+細胞HLA-DR表達水平的步驟，所述生物樣品以外周血樣品為佳。各種實施方式中，生物樣品尤其是外周血樣品中異常巨噬細胞水平可通過測定CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量來測定。
ALS的“發(fā)生”或“發(fā)展”在此表示疾病最初的顯現(xiàn)和/或其后的發(fā)展。ALS的發(fā)展可用標準臨床技術來檢測和評價，例如神經(jīng)和肌肉組織活檢和CNS掃描技術，例如MRI。然而，發(fā)展也包括無法測知的疾病發(fā)展。就本發(fā)明而言，發(fā)生或發(fā)展指疾病狀態(tài)的生物學過程?！鞍l(fā)生”包括發(fā)生、復發(fā)和發(fā)作。本文中，ALS“發(fā)作”或“發(fā)生”包括初次發(fā)生和/或復發(fā)。
本文中，“延遲ALS的發(fā)生”指阻礙、減緩、穩(wěn)定和/或推遲疾病的發(fā)生。延遲時間的長度各不相同，取決于患者的病史和/或臨床狀態(tài)。對本領域技術人員來說顯而易見的是，充分或顯著延遲包括有效避免個體發(fā)展成為可測的疾病。“延遲”疾病發(fā)展的方法，與不采用該方法相比，可在給定時間框內(nèi)減緩病情。雖然這種認定可能根據(jù)既往病例，但上述比較通常依賴于對數(shù)量達到統(tǒng)計學意義的個體進行的臨床研究。“延遲發(fā)展”可表示，與不給藥相比，不良臨床征兆的減輕和/或減少，和/或病程的減緩或延長。該術語還包括但不限于癥狀減輕，病情緩解，病情穩(wěn)定(即，不惡化)，疾病發(fā)展被延遲或減緩和可測或非可測的(全面或部分)痊愈。
本文中，“有效量”(的藥物)指可產(chǎn)生所需的和/或良性效果的量。有效量可一次或分多次給予。一些實施方式中，所謂有效量指足以降低ALS患者體內(nèi)異常巨噬細胞水平的量?！白阋越档彤惓＞奘杉毎降牧俊币詫⒃撍浇档?5％以上的為佳，50％以上、甚至75％以上，更甚至90％以上更好。這樣的降低會引起良好的隨同效應，例如病情減輕、消退、穩(wěn)定、好轉(zhuǎn)、減緩或延遲，延遲和/或甚至避免疾病發(fā)生。
另一些實施方式中，“足以降低CD14+細胞HLA-DR表達水平的量”優(yōu)選使HLA-DR表達水平降低25％以上的量，50％以上、甚至75％以上、更甚至90％更好。這樣的降低會引起良好的隨同效應，例如病情減輕、消退、穩(wěn)定、好轉(zhuǎn)、發(fā)展減緩或延遲，延遲和/或甚至避免疾病發(fā)生。
本文中，降低“異常巨噬細胞水平”表示降低異常巨噬細胞或活化單核細胞的數(shù)量和/或降低CD14+細胞群的HLA-DR表達水平。各種實施方式中，異常巨噬細胞水平可通過測定生物樣品中CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量來確定。一般認為，不必測定絕對值甚至相對值，觀察異常巨噬細胞的相對水平即可。
本文中，“藥物”指生物來源或化學來源的化合物，例如簡單或復雜的有機或無機分子，肽，蛋白質(zhì)或寡核苷酸。大量化合物可以各種不同的核心結(jié)構(gòu)為基礎人工合成，例如寡聚物，例如寡聚肽和寡核苷酸，以及合成有機化合物，這些也包括在“藥物”中。此外，化合物可來自各種天然來源，例如植物或動物提取物等。所述藥物包括但不限于多胺類似物。所述藥物可以單用，也可以聯(lián)用。
“調(diào)節(jié)”巨噬細胞增殖表示與不給藥相比改變了增殖的速度。例如，用多胺類似物“調(diào)節(jié)”巨噬細胞增殖表示，與不給予干擾天然多胺與DNA之間相互作用(包括但不限于干擾多胺生物合成路徑，干擾亞精胺、天然多胺與DNA相互作用的競爭物、抑制劑的胞內(nèi)濃度，干擾多胺代謝等)的藥物例如多胺類似物相比，改變了增殖速度。較好的是，“調(diào)節(jié)”巨噬細胞增殖表示增殖速度改變25％以上，50％以上、甚至75％以上、更甚至90％以上更好。通常，就本發(fā)明而言，“調(diào)節(jié)”巨噬細胞增殖表示，與不給藥相比，降低個體內(nèi)巨噬細胞增殖速度。然而，例如，在治療過程中，可能希望相對先前的測得值提高增殖速度。調(diào)節(jié)幅度可通過測定巨噬細胞的增殖來評價，后文對此有所論述，而且，這通常涉及在巨噬細胞群中檢測增殖標記，或檢測特定物質(zhì)例如BrdU或3H-胸苷的吸收(它們可提供增殖的定量指標)。而且，有可能的是，如果巨噬細胞增殖是遺傳變異(例如轉(zhuǎn)位、缺失或插入)所致，則上述改變可采用標準技術例如RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)來檢測。
多胺或多胺類似物的“靶標”指直接或間接與多胺或多胺類似物相互作用的物質(zhì)，例如DNA、RNA和/或生物膜。
“烷基”指直鏈、支鏈、環(huán)狀飽和脂族基團或其組合，其中含指定數(shù)量的碳原子，若不指定，則至多12個碳原子。“直鏈烷基”或“線型烷基”指既非環(huán)狀又無支鏈的烷基，常稱為“正烷基”。烷基的例子包括但不限于甲基，乙基，正丙基，異丙基，丁基，正丁基，異丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，正戊基，己基，庚基，辛基，壬基，癸基，十一烷基，十二烷基，新戊基，環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基和金剛烷基。環(huán)狀基團可由單環(huán)構(gòu)成，例如環(huán)庚基，由多個稠環(huán)構(gòu)成，例如金剛烷基或降冰片烷基。優(yōu)選的烷基包括C1-12，C1-10，C1-8，C1-6，C1-4，C1-2，C3-4和C4烷基。
“取代烷基”表示被一取代或多取代的烷基，取代基例如鹵素(氟、氯、溴、碘)，烷氧基，酰氧基，氨基，羥基，巰基，羧基，芐氧基，苯基，芐基，氰基，硝基，硫代烷氧基，羧基醛(carboxaldehyde)，羧基烷氧基(carboxalkoxy)和酰胺基，或可用保護基適當封閉的官能團。取代烷基的例子包括但不限于-CF3，-CF2-CF3，以及其它全氟和全鹵基團。
“羥基烷基”指被一個-OH基團取代的具有所述碳原子數(shù)的烷基。因此，“C3線型羥基烷基”指-CH2CH2CHOH-，-CH2CHOHCH2-和-CHOHCH2CH2-。
“烯基”指含有至少一個雙鍵(-C＝C-)的不飽和脂族基團，包括直鏈、支鏈或環(huán)狀及其組合，具有指定碳原子數(shù)，若無指定，則至多12個碳原子。烯基例如但不限于-CH2-CH＝CH-CH3和-CH2-CH2-環(huán)己烯基，其中的乙基可連接在任一可能價態(tài)的環(huán)己烯基部分上?！叭不敝负兄辽僖粋€三鍵(-C C-)的不飽和脂族基團，包括直鏈、支鏈或環(huán)狀及其組合，具有指定碳原子數(shù)，若無指定，則至多12個碳原子?！盁N鏈”或“烴基”指直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基的各種組合。“取代烯基”、“取代炔基”和“取代烴鏈”或“取代烴基”指被一個或多個取代基取代的代表性基團，取代基例如但不限于鹵素，烷氧基，酰氧基，氨基，羥基，巰基，羧基，芐氧基，苯基，芐基，氰基，硝基，硫代烷氧基，羧基醛(carboxaldehyde)，羧基烷氧基(carboxalkoxy)和酰胺基，或可用保護基適當封閉的官能團。
“芳基”或“Ar”表示具有單環(huán)(例如苯基)或多個稠環(huán)(例如萘基或蒽基)的取代和非取代芳香族碳環(huán)?！叭〈蓟敝副灰粋€或多個取代基取代的芳基，取代基例如烷基，烯基，炔基，烴鏈，鹵素，烷氧基，酰氧基，氨基，羥基，巰基，羧基，芐氧基，苯基，芐基，氰基，硝基，硫代烷氧基，羧基醛(carboxaldehyde)，羧基烷氧基(carboxalkoxy)和酰胺基，或可用保護基適當封閉的官能團。
“雜烷基”、“雜烯基”和“雜炔基”指含有指定數(shù)量碳原子(若無指定，則至多12個碳原子)，在其主鏈、支鏈或環(huán)狀鏈中含有一個或多個雜原子的烷基、烯基和炔基。所述雜原子包括但不限于N，S，O和P，優(yōu)選N和O。雜烷基、雜烯基和雜炔基可通過雜原子(如果價態(tài)允許)或通過碳原子與分子的其余部分相連。雜烷基例如但不限于-O-CH3-，-CH2-CH2-O-CH3，-S-CH2-CH2-CH3，-CH2-CH(CH3)-S-CH3，-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-，1-乙基-6-丙基哌啶子基，2-乙基硫代苯基和嗎啉代。雜烯基例如但不限于-CH＝CH-NH-CH(CH3)-CH2-?！半s芳基”指含有單環(huán)(如吡啶基、硫代苯基或呋喃基)或多個稠環(huán)(如咪唑基、中氮茚基或苯并噻吩基)，且環(huán)內(nèi)含有至少一個雜原子如N、O、P或S的芳香族碳環(huán)基團。除非另作說明，雜烷基、雜烯基、雜炔基和雜芳基含有1至5個雜原子和1至12個碳原子?！叭〈s烷基”、“取代雜烯基”、“取代雜炔基”和“取代雜芳基”指被一個或多個取代基取代的雜烷基、雜烯基、雜炔基和雜芳基，取代基例如但不限于烷基，烯基，炔基，烴鏈，鹵素，烷氧基，酰氧基，氨基，羥基，巰基，羧基，芐氧基，苯基，芐基，氰基，硝基，硫代烷氧基，羧基醛(carboxaldehyde)，羧基烷氧基(carboxalkoxy)和酰胺基，或可用保護基適當封閉的官能團。取代雜烷基例如但不限于氮原子上或碳原子上被苯基或芐基取代并通過碳原子或氮原子以可能的價態(tài)與分子其余部分相連的哌嗪基，-NH-SO2-苯基，-NH-(C＝O)O-烷基，-NH-(C＝)O-烷基-芳基和-NH-(C＝)-烷基。只要化學上允許，取代基可位于雜原子和碳原子上。如果化學上允許，雜原子可以是氧化形式的。
“烷芳基”指與一個、兩個或三個芳基相連的具有指定碳原子數(shù)的烷基。
“烴氧基”指具有指定碳原子數(shù)(若無指定則至多12個)的與氧原子相連的烷基、烯基、炔基或烴鏈。烴氧基例如但不限于甲氧基、乙氧基和叔丁氧基。
“鏈烷酸酯(或鹽)”指離子化羧酸基團，例如乙酸酯(鹽)(CH3C(＝O)-O(-l))，丙酸酯(鹽)(CH3CH2C(＝O)-O(-l))等?！版溚樗嵬轷ァ敝概c烷氧基酯化的羧酸，例如乙酸乙酯(CH3C(＝O)-O-CH2CH3)。“ω-鹵代鏈烷酸烷酯”指距離羧基最遠的鏈烷酸酯碳原子上具有一個鹵原子的鏈烷酸烷酯；因此，ω-溴代丙酸乙酯指3-溴丙酸乙酯，ω-氯正丁酸甲酯指4-氯正丁酸甲酯，等等。
“鹵素”在此指Cl，Br，F(xiàn)或I取代基。
以上定義中，優(yōu)選C1-12，C1-10，C1-8，C1-6，C1-4，C1-2(如果化學上允許)，C3-4和C4基團。
“保護基”指表現(xiàn)出以下特性的化學基團1)選擇性地與指定官能團反應，并以良好的得率生成對所處反應亦即保護所針對的反應來說穩(wěn)定的被保護基團；2)可選擇性地從被保護基團上去除從而得到所需的官能團；和3)可用與原先存在或在所經(jīng)歷的反應中生成的其它官能團相容的試劑去除且得率良好。合適的保護基的例子可參考Greene等(1991)，“有機合成中的保護基”，第三版(John Wiley&Sons，Inc.，NewYork)。氨基保護基包括但不限于均三甲苯磺?；?Mts)，芐氧基羰基(CBz或Z)，叔丁氧基羰基(Boc)，叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS或TBDMS)，9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)，甲苯磺酰基，苯磺酰基，2-吡啶基磺酰基，或合適的光敏性保護基，例如6-硝基藜蘆基氧基羰基(Nvoc)，硝基胡椒基，芘基甲氧基羰基，硝基芐基，二甲基二甲氧基偶苯酰，5-溴-7-硝基二氫吲哚基等。羥基保護基包括但不限于Fmoc，TBS，光敏性保護基(例如硝基藜蘆基氧基甲基醚(Nvom))，Mom(甲氧基甲基醚)和Mem(甲氧基乙氧基甲基醚)，NPEOC(4-硝基苯乙基氧基羰基)和NPEOM(4-硝基苯乙基氧基甲基氧基羰基)。
“多胺類似物”指結(jié)構(gòu)與多胺類似但不相同的有機陽離子，所述多胺例如精胺和/或亞精胺以及它們的前體，二胺腐胺?！岸喟贰敝父鞣N由氨基酸生物合成的脂族直鏈胺；Marton等(1995)，Ann.Res.Pharm.Toxicol.，3555-91中對幾種多胺進行了論述。尸胺和腐胺是二胺，分別由賴氨酸或鳥氨酸脫羧而得。通過添加氨基丙基，腐胺可轉(zhuǎn)化為亞精胺，亞精胺繼而轉(zhuǎn)換為精胺。該基團由S-腺苷甲硫氨酸脫羧而得。
“構(gòu)象限制”指多胺類似物中至少兩個氨基在空間構(gòu)型上彼此鎖閉或限制。兩個氨基的相對移動可能因為在兩個相鄰氮原子之間引入一個環(huán)狀或非飽和基團(例如三碳、四碳、五碳、六碳環(huán)，或雙鍵或三鍵，例如碳碳雙鍵或三鍵)而受到限制，所述相鄰氮原子不在所述受構(gòu)象限制基團內(nèi)。由于空間位阻限制構(gòu)象靈活性，但結(jié)構(gòu)上促進抗增殖效果的基團也可用于構(gòu)象限制?！笆軜?gòu)象限制”的多胺類似物可包含至少兩個彼此構(gòu)象受到限制的氨基，還可包含構(gòu)象不受限制的其它氨基。靈活分子，例如精胺和BE-444，可能具有多種構(gòu)象，因而是非構(gòu)象限制的。在多胺和多胺類似物中，不論構(gòu)象限制與否，所述氨基都是脂族而非芳族氨基。
本發(fā)明的方法本發(fā)明提供監(jiān)測ALS治療的方法，包括檢測個體外周血樣品中的CD14+細胞的HLA-DR表達水平和/或異常巨噬細胞水平和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量。本發(fā)明還提供監(jiān)測ALS患者ALS發(fā)生或發(fā)展的方法，包括測定個體外周血樣品中的異常巨噬細胞水平，和/或CD14+細胞的HLA-DR表達水平，和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比，和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量。本發(fā)明還提供減少ALS患者體內(nèi)CD14+單核細胞尤其是活化循環(huán)單核細胞的方法。本發(fā)明還提供篩選可減少ALS患者體內(nèi)CD14+單核細胞尤其是活化循環(huán)單核細胞的藥物的方法。
CD14+細胞的HLA-DR表達水平升高，和/或CD14+/CD16+細胞增加，和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比升高與ALS相關，因此，監(jiān)測這些水平可指示治療方法的最初反應性和/或效果以及合適的劑量。一般認為，監(jiān)測治療表示在不同時刻例如治療期間采集生物樣品，并彼此比較，與對照比較，和/或與理想值比較。實施例之一中，監(jiān)測治療包括測定外周血中CD14+細胞的HLA-DR表達水平。另一實施例中，監(jiān)測治療包括測定血樣尤其是外周血中HLA-DR高表達CD14+細胞的水平。另一實施例中，監(jiān)測治療包括測定血樣尤其是外周血中CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比。另一實施例中，監(jiān)測治療包括測定血樣尤其是外周血中CD14+/CD16+細胞數(shù)量。另一實施例中，治療期間和/或之后測定的異常巨噬細胞水平(不同實施方式中分別為HLA-DR高表達CD14+細胞，CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比，和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量)與對照和/或理想值比較。另一實施例中，監(jiān)測治療還包括監(jiān)測異常巨噬細胞增殖。
為了監(jiān)測ALS治療，采自接收治療的患者的樣品和/或治療結(jié)束后采集的樣品中的異常巨噬細胞水平通常與治療前采自該患者的樣品中的水平和/或在治療期間另一不同時刻采自患者的樣品中的水平相比較。例如，治療期間所采樣品中異常巨噬細胞水平相比治療前樣品中的或治療早期樣品中的降低，一般表明ALS治療有效。
實施方式之一中，為了監(jiān)測ALS治療，異常巨噬細胞水平通過測定血樣尤其是外周血樣品中CD14+細胞的HAL-DR表達水平來評價。例如，比較治療前和治療期間外周血中CD14+細胞的HAL-DR表達水平，由此確定治療的效果，HAL-DR表達水平趨于下降表明治療有效。
實施方式之一中，為了監(jiān)測ALS治療，異常巨噬細胞水平通過測定血樣尤其是外周血樣品中CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比來評價。例如，比較治療前和治療期間外周血中CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比，由此確定治療的效果，CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比趨于下降表明治療有效。
實施方式之一中，為了監(jiān)測ALS治療，異常巨噬細胞水平通過測定血樣尤其是外周血樣品中CD16+/CD14+細胞數(shù)量來評價。例如，比較治療前和治療期間外周血中CD16+/CD14+細胞數(shù)量，由此確定治療的效果，CD16+/CD14+細胞趨于減少表明治療有效。
在ALS患者中，檢測生物樣品尤其是外周血樣品中CD14+細胞的HAL-DR表達水平，和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比，和/或CD16+/CD14+細胞數(shù)量還有助于監(jiān)測疾病的發(fā)生或發(fā)展。因此，本發(fā)明還提供監(jiān)測ALS患者疾病發(fā)生或發(fā)展的方法，包括檢測個體外周血樣品中CD14+細胞的HAL-DR表達水平，和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比，和/或中CD16+/CD14+細胞數(shù)量，和/或異常巨噬細胞水平。較好的是，所述個體“患有”ALS(診斷為患有，表現(xiàn)出一種或多種臨床癥狀)。
因為CD14+細胞的HLA-DR表達水平升高和/或CD14+/CD16+細胞增加和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比升高與ALS相關，監(jiān)測這些水平可指示疾病發(fā)生或發(fā)展過程中的變化。一般認為，檢測ALS患者通常表示在數(shù)周、數(shù)月和/或數(shù)年內(nèi)在不同時刻采集生物樣品，然后彼此比較，與對照比較和/或與理想值比較。另一實施方式中，監(jiān)測疾病發(fā)展還包括檢測異常巨噬細胞增殖。在對ALS的監(jiān)測中，CD14+細胞的HLA-DR表達水平升高和/或CD14+/CD16+細胞增加和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比升高通常表明病情加重和/或發(fā)展加快。
對于那些ALS的高危疑患個體，測定其生物樣品CD14+細胞的HLA-DR表達水平和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量有助于警示該個體和/或醫(yī)生。所以，本發(fā)明還提供監(jiān)測ALS高危疑患的方法，包括測定該疑患生物樣品中CD14+細胞的HLA-DR表達水平和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量。較好的是，該個體表現(xiàn)出一種或多種ALS相關臨床癥狀，或有發(fā)生ALS的“危險性”(具有ALS高發(fā)遺傳背景、家族史或接觸到誘發(fā)ALS的因素)。在對ALS高危疑患的監(jiān)測中，CD14+細胞的HLA-DR表達水平升高和/或CD14+/CD16+細胞增加和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比升高通常表明ALS癥狀發(fā)生可能性升高。
一般認為，除非特例，監(jiān)測高危個體表示在數(shù)周、數(shù)月和/或數(shù)年內(nèi)在不同時刻采集生物樣品，然后彼此比較，與對照比較和/或與理想值比較。實施方式之一中，監(jiān)測高危個體包括檢測樣品中CD14+細胞的HLA-DR表達水平和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比和/或測定外周血中CD14+/CD16+細胞數(shù)量。另一實施方式中，監(jiān)測高危疑患包括監(jiān)測異常巨噬細胞的增殖。
就監(jiān)測治療、監(jiān)測疾病發(fā)展或監(jiān)測高危疑患而言，可將樣品中CD14+細胞的HLA-DR表達水平和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量與性別和/或年齡相當?shù)慕】祩€體或非ALS患者的平均值或中值相比?；蛘撸蓪y得的上述指標同一個體不同時刻測得值綜合所得平均值或中值比較。ALS樣品中CD14+細胞的HLA-DR表達水平和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量與非ALS樣品之間的差異或改變通常與疾病的發(fā)展或活性相關。例如，CD14+細胞的HLA-DR表達水平升高和/或CD14+/CD16+細胞增加和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比升高通常與ALS加重相關。
與一種或多種其它疾病指標一起，檢測CD14+細胞的HLA-DR表達水平和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量有助于診斷或預告ALS。不同的診斷包括診斷各種與ALS相關或者導致ALS或者由其所致的狀況，最后由主治醫(yī)師確診。所以，本發(fā)明包括協(xié)助ALS診斷的方法。此類方法一般包括檢測ALS疑患個體血樣中的CD14+細胞的HLA-DR表達水平和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量。
為了檢測HLA-DR表達水平是否升高，需測定同一ALS個體大量CD14+細胞上HLA-DR表達水平的平均值或中值?？捎嬎阊獦?或其它生物樣品)中HLA-DR分子數(shù)/細胞作為HLA-DR表達水平。更常見的是計算樣品中CD14+細胞群的HLA-DR檢測標記(例如熒光度)/細胞作為HLA-DR表達水平。可將所得值與同一個體不同時刻和/或不同狀態(tài)(例如治療前，不同劑量，等等)下測得的HLA-DR水平相比較。
一些實施方式將HLA-DR水平與非ALS標準個體CD14+細胞群HLA-DR表達水平的平均值或中值比較，所述非ALS標準個體例如一個或多個非ALS個體。HLA-DR表達水平比非ALS標準個體高約1.4倍表示ALS個體內(nèi)HLA-DR表達水平升高。通常，比非ALS標準個體的HLA-DR表達水平高約1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、5.0倍或10倍都表示ALS個體內(nèi)HLA-DR表達水平升高。
由CD14+單核細胞表達的HLA-DR即II類主組織相容性抗原的表達水平可用多種已知方法來檢測，例如普通流式細胞計數(shù)法，參見Current Protocols ofImmunology(J.E.，Coligan等，1999)。已知方法，包括普通流式細胞計數(shù)法，還可用來測定細胞包括CD14+細胞上的CD16+表達。通常，可用針對某一種或多種抗原的一種或多種抗體對個體血樣中的細胞就所述一種或多種抗原進行染色，所述抗體包括抗CD14抗體，抗CD16抗體和抗HLA-DR抗體。當分析細胞一種以上抗原的表達時，可同時或先后用抗原特異性抗體染色細胞?；蛘撸蓪⒈磉_某特定抗原的細胞從不表達該抗原的細胞中分離出來，然后對分離出的細胞群就其它抗原的表達進行染色。所述抗原特異性抗體可直接用熒光團標記，或采用與抗抗體抗體(例如第二抗體)偶聯(lián)的熒光團間接標記。與抗原特異性抗體反應并熒光標記后，用流式細胞計數(shù)儀，例如Becton Dickinson FACScan，分析細胞?？筛鶕?jù)流式細胞計數(shù)儀所得數(shù)據(jù)定量測定CD14+細胞HLA-DR表達水平，參見實施例1。還可根據(jù)流式細胞計數(shù)結(jié)果測定細胞上CD14+和CD16+的共表達。
也可用其它已知技術測定CD14+單核細胞的HLA+DR表達水平。例如，將CD14+細胞與其它血細胞和血液組分分離，例如采用基于抗體的細胞電子分選技術，參見例如Current Protocols of Immunology(J.E.，Coligan等，1999)。分離出的CD14+細胞的HLA-DR表達水平可通過分析細胞的mRNA和/或蛋白質(zhì)來測定?？捎酶鞣N已知技術測定CD14+細胞內(nèi)的HLA-DR RNA，例如S1核酶分析，核糖核酸酶蛋白質(zhì)試驗，引物延伸試驗，RNA印跡分析(例如Northern和/或斑點雜交)和定量RT-PCR，參見例如Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等，1987)。可用各種已知技術定量測定CD14+細胞中和/或表面的HLA-DR蛋白，這包括但不限于定量免疫試驗，例如放射免疫試驗、免疫熒光試驗、酶免疫試驗、化學發(fā)光試驗，ELISA或Western印跡試驗，參見例如Current Protocols ofImmunology(J.E.，Coligan等，1999)。以上技術還可用來檢測CD14+單核細胞內(nèi)或細胞上的CD16表達。
分析前，待分析生物樣品需保持在合適的條件下，從而確保樣品中可能存在的異常巨噬細胞在分析時可被測出。一些實施方式中，在容器中(可以是采集時所用的容器)用足量的非螯合鈣將待分析生物樣品中的細胞維持在保存培養(yǎng)基中，直至分析。但這并不表示不可以有鈣螯合劑存在或不可以有被螯合鈣存在。例如，一些實施方式中，鈣螯合劑與待分析生物樣品中的細胞共存，但其含量低到不至于干擾凝血。亦即，一些實施方式中，必須避免待分析細胞接觸其量足以干擾凝血的鈣螯合劑。一些實施方式中，待分析生物樣品中的細胞維持在沒有鈣螯合劑的條件下。例如實施例2，沒有鈣螯合劑存在下，ALS樣品中的CD14+/CD16+百分比比非ALS樣品中的高4倍。但是，生物樣品中的鈣螯合劑使得ALS樣品中的可測CD4+/CD16+細胞降低到了非ALS樣品中的水平。即，在這些外周血樣品中，鈣螯合劑的存在影響了CD14+/CD16+細胞數(shù)作為ALS指標的可用性。
一些實施方式中，CD14、CD16和/或HLA-DR表達的測定在采集生物樣品的當日進行(即“當日”分析)。另一些實施方式中，測定CD14、CD16和/或HLA-DR表達在采集生物樣品的次日進行(即“次日”分析)。一些實施方式中，測定CD14、CD16和/或HLA-DR表達約在采血后96、72、60、48、36、24、18、12、6、4或2小時內(nèi)進行。一些實施方式中，所述待分析生物樣品是血液，優(yōu)選外周血。一些實施方式中，外周血被采集在含有肝素的容器內(nèi)。
一些實施方式將CD14+/CD16+細胞數(shù)量和/或CD16+細胞在CD14+細胞中所占百分比與非ALS標準例如一名或多名非ALS個體的生物樣品中CD14+/CD16+細胞水平的平均值或中值相比較。樣品中CD16+細胞在CD14+細胞中所占百分比和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量比非ALS標準約高1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、3.0、4.0、5.0或10倍表示ALS個體內(nèi)CD14+/CD16+細胞增加。
通常，可在ALS個體或ALS疑患個體中測得上述異常巨噬細胞，同時不會測到伴隨CD14+單核細胞HLA-DR表達水平升高和/或CD14+/CD16+細胞增加和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比升高而發(fā)生的T細胞活化或T細胞活化水平降低。T細胞活化可用已知方法和標準來評價。例如，T細胞活化水平可通過測定細胞上的特定細胞活化標記例如CD4、CD8和/或CD38的表達，或通過檢測表達這些標記的細胞來測定。如實施例1，將ALS個體外周血中的T細胞群，表現(xiàn)為CD4/CD38和CD8/CD38細胞群，與正常(非ALS)個體的相比較。
如上所述，有時，HLA-DR高表達的CD14+細胞群包括增殖性巨噬細胞。而且，有時，CD14+/CD16+細胞群中包括增殖性巨噬細胞。增殖性巨噬細胞可用多種方法來檢測。本發(fā)明一些實施方式中，檢測異常巨噬細胞增殖是對外周血白細胞制備物中的全體循環(huán)巨噬細胞進行的。另一些實施方式中，增殖檢測是對固定組織中的巨噬細胞進行的，通常在組織切片上進行。增殖性巨噬細胞可通過分析細胞增殖標記例如PCNA、Ki67或溴脫氧尿苷(BrdU)或3H-胸苷攝入來檢測。這些標記與僅確認“活化”巨噬細胞(與增殖性巨噬細胞相反)的例如CD69和CD25不同。可對代表巨噬細胞的細胞亞群進行進一步鑒定，例如檢測CD14、CD68、CD16或非特異性酯酶等特定細胞特異性標記。檢測這些細胞類型和/或增殖標記可采用本領域的標準方法，例如染色和FACS分選和分析。此類方法可參見實施例3。也可以根據(jù)其它特征例如細胞密度(例如以PERCOLLTM梯度測定)來鑒別增殖性巨噬細胞。此類測定方法可利用本領域標準技術憑經(jīng)驗來建立。
本發(fā)明提供篩選能降低ALS患者體內(nèi)異常巨噬細胞水平的藥物的方法。例如，為了粗篩可有效降低ALS相關異常巨噬細胞水平的藥物，可分離ALS患者的外周血細胞。測定樣品中異常巨噬細胞的水平和/或活度，用候選藥物處理細胞樣品，然后將結(jié)果與非處理細胞相比。例如，處理后樣品中異常巨噬細胞水平和/或活度比非處理樣品低，表明候選藥物能夠有效降低ALS患者體內(nèi)的異常巨噬細胞水平和/或活度。對患者給藥后，通過比較治療前后的異常巨噬細胞水平來測定候選藥物的效果，異常巨噬細胞趨于減少表示有效。不同的實施方式中，測定異常巨噬細胞水平包括檢測樣品中的HLA-DR高表達CD14+單核細胞水平和/或CD14+/CD16+細胞數(shù)量和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比。通常，評價細胞活度例如CD14+細胞活度的方法和試劑是本領域所熟知的。
本發(fā)明提供篩選能減少ALS患者體內(nèi)CD14+單核細胞尤其是活化CD14+單核細胞和/或HLA-DR高表達CD14+單核細胞和/或減少CD14+/CD16+細胞和/或降低CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比的藥物的方法。ALS患者體內(nèi)例如CD14+細胞減少的標志包括但不限于生物樣品中細胞活度降低和/或細胞數(shù)量減少。例如，為了粗篩能夠有效減少ALS相關CD14+單核細胞的藥物，分離ALS患者的外周血細胞。測定樣品中的CD14+單核細胞數(shù)量，用候選藥物處理樣品，將結(jié)果與非處理細胞相比較。例如，處理后樣品中CD14+單核細胞比非處理樣品少表明候選藥物有效。給藥后，比較治療前后CD14+單核細胞尤其是活化CD14+單核細胞水平，CD14+單核細胞趨于減少表示有效。、本發(fā)明提供減少ALS患者體內(nèi)CD14+單核細胞尤其是活化CD14+單核細胞的方法，包括給予減少CD14+單核細胞尤其是活化CD14+單核細胞和/或HLA-DR高表達CD14+單核細胞和/或CD14+/CD16+細胞和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比有效量的多胺類似物、其鹽或其被保護衍生物?！皽p少CD14+單核細胞有效量”最好能使CD14+單核細胞減少約25％、50％、75％甚至90％。這樣的減少可能會引發(fā)良好的伴隨效應，例如疾病減輕、緩解、穩(wěn)定、好轉(zhuǎn)、發(fā)展減緩和/或延遲，疾病發(fā)生或發(fā)展的延遲甚至避免。
另一實施方式中，給予ALS患者的是調(diào)節(jié)巨噬細胞增殖有效量的含多胺類似物或其被保護衍生物的組合物。
本發(fā)明方法所用的化合物可取其游離堿或游離酸的形式(即化合物的非鹽游離形式)。此外，化合物的任何藥學上認可的鹽均可采用。藥學上認可的鹽即保留游離化合物的生物活性且無其它不良生物學或其它效果的鹽。堿性化合物的鹽可通過與酸反應來制備。無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸和磷酸。有機酸例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、磺酸和水楊酸。還可制備堿性化合物與氨基酸的鹽，例如天冬氨酸鹽和谷氨酸鹽。酸性化合物的鹽可通過與堿反應來制備。酸性化合物的無機鹽包括但不限于堿金屬和堿土金屬鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽；銨鹽；鋁鹽。酸性化合物的有機鹽包括但不限于普魯卡因、二芐基胺、N-乙基哌啶、N，N′-二芐基乙二胺和三乙基胺。還可制備酸性化合物與氨基酸的鹽，例如賴氨酸鹽。
本發(fā)明還可采用化合物的立體異構(gòu)體，包括對映體和非對映體，以及立體異構(gòu)體的混合物，包括但不限于外消旋物。除非在結(jié)構(gòu)式中明示立體化學特征，一個結(jié)構(gòu)式通常涵蓋所有可能的立體異構(gòu)體。
就本發(fā)明而言，適合多胺給藥的個體是已確診患ALS或被認為極有可能發(fā)生ALS的個體。“危發(fā)”或“高?！眰€體指具有特殊且明顯的發(fā)生ALS危險性的個體?！拔０l(fā)”或“高?！眰€體在接收本發(fā)明方法處理前可能有、可能沒有可測疾病，可能已經(jīng)或尚未表現(xiàn)出可測疾病?！案呶！?或“危發(fā)”)表示個體具有一種或多種所謂危險因素，即一些與疾病發(fā)生相關的可測指標。具有一種或多種所述危險因素的個體比沒有此類因素的個體更可能發(fā)生疾病。此類因素包括但不限于遺傳因素(包括家族史和遺傳標記)。一般認為，通常只要有一項危險因素就有高危險性。醫(yī)生，作為本領域熟練技術人員，能夠確定是否對危發(fā)個體進行某種藥物的治療。
另一實施方式中，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)ALS個體巨噬細胞增殖的方法，包括給予含有干擾多胺與增殖性巨噬細胞靶標例如DNA、RNA和/或視網(wǎng)膜相互作用有效量的藥物的組合物。干擾多胺與增殖性巨噬細胞靶標相互作用的藥物可以是干擾以下任一方面的藥物天然多胺的合成和/或代謝、胞內(nèi)濃度調(diào)節(jié)和/或功能(即與DNA的相互作用)。
減少CD14+單核細胞的藥物本發(fā)明部分實施方式中，降低異常巨噬細胞水平(即，ALS患者體內(nèi)HAL-DR高表達CD14+單核細胞和/或CD14+/CD16+單核細胞和/或CD16+細胞在CD14+細胞群中所占百分比)是用多胺類似物實現(xiàn)的。另一些實施方式中，任何可降低異常巨噬細胞增殖的藥物均可采用。此類抗增殖藥物是本領域已知的。就多胺類似物而言，包括它們的立體異構(gòu)體、鹽和被保護衍生物。
多胺類似物本發(fā)明所用多胺類似物包括結(jié)構(gòu)式1、2、3、4和5所示化合物及其立體異構(gòu)體、鹽和被保護衍生物 其中，R1，R2，R4，R6和R7各自選自H，烷基和芳基，R3和R5是烷基； 其中，R1，R2，R4，R6，R8和R9各自選自H，烷基和芳基，R3，R5和R7是烷基； 其中，R1，R2，R4，R6，R8，R10和R11各自選自H，烷基和芳基，R3，R5，R7和R9是烷基；
其中，R1和R5各自選自甲基，乙基，正丙基和異丙基；R2，R3和R4各自選自C1-6烷基，C2-6烯基，C3-6環(huán)烷基，C1-6烷基-C3-6環(huán)烷基-C1-6烷基，C3-10芳基和C1-6烷基-C3-10芳基-C1-6烷基；R6，R7，R8和R9各自選自H，甲基和乙基。
其中，R1和R6各自選自甲基，乙基，正丙基和異丙基；R2，R3，R4和R5各自選自C1-6烷基，C2-6烯基，C3-6環(huán)烷基，C1-6烷基-C3-6環(huán)烷基-C1-6烷基，C3-10芳基和C1-6烷基-C3-10芳基-C1-6烷基；R7，R8，R9和R10各自選自H，甲基和乙基。
一些實施方式中，多胺類似物包括如下結(jié)構(gòu)3化合物其中R3，R5，R7和R9各自是(CH2)x基團，其中x是2至6的整數(shù)，R4，R6和R8是氫原子。
一些實施方式中，多胺類似物包括如下結(jié)構(gòu)3化合物其中R3，R5，R7和R9各自是(CH2)x基團，其中x是2至6的整數(shù)，R4，R6和R8是氫原子，R1和R10是烷基，R2和R11是氫原子。
一些實施方式中，多胺類似物包括如下結(jié)構(gòu)3化合物其中R3，R5，R7和R9各自是(CH2)x基團，其中x是2至6的整數(shù)，R4，R6和R8是氫原子，R1和R10是烷基，R2和R11是氫原子，該多胺類似物的分子量低于500。
一些實施方式中，化合物包括如下結(jié)構(gòu)4化合物其中R6，R7，R8和R9是H；其中，R1和R5是乙基；其中，R6，R7，R8和R9是H，且，R1和R5是乙基；和/或其中，R2和R4各自選自C1-6烷基，且R3選自C1-6烷基，C2-6烯基，C3-6環(huán)烷基，C1-6烷基-C3-6環(huán)烷基-C1-6烷基，C3-10芳基和C1-6烷基-C3-10芳基-C1-6烷基。
本發(fā)明可用的多胺類似物還包括結(jié)構(gòu)式6所示化合物及其立體異構(gòu)體、鹽和被保護衍生物
其中，R4是C2-6正烯基，C3-6環(huán)烷基，C3-6環(huán)烯基，或C3-6芳基；R3和R5各自選自單鍵，C1-6烷基，或C1-6烯基；R2和R6各自選自C1-6烷基，C1-6烯基或C3-6環(huán)烷基，C3-6環(huán)烯基，或C3-6芳基；R1和R7各自選自H，C1-6烷基或C2-6烯基；R8，R9，R10和R11是H。
一些實施方式的結(jié)構(gòu)式6化合物中，R1和R7各自選自C1-6烷基或C2-6烯基。
本發(fā)明可用的多胺類似物還包括結(jié)構(gòu)式7所示化合物及其立體異構(gòu)體、鹽和被保護衍生物 其中，R4是C1-6正烯基或C1-6支鏈烷基；R3和R5各自選自單鍵或C1-6烷基；R2和R6各自選自C1-6烷基，C1-6烯基，C3-6環(huán)烷基，C3-6環(huán)烯基或C3-6芳基；R1和R7各自選自H，C1-6烷基或C2-6烯基；而且R8，R9，R10和R11是H。
一些實施方式的結(jié)構(gòu)式7化合物中，R1和R7各自選自C1-6烷基或C2-6烯基，R4是C1-6飽和正烴基或C1-6飽和支鏈烴基，R3和R5各自選自單鍵或C1-6飽和正烴基。
一些實施方式中，多胺類似物中的各氮原子分別是仲胺、叔胺、季銨基團。
一些實施方式中，本發(fā)明所用多胺類似物是構(gòu)象限制的。
有關環(huán)多胺化合物和環(huán)多胺類似物可參見WO02/10142。這些環(huán)多胺化合物中，一個或多個脂族氮原子構(gòu)成酰氨基的一部分。
本發(fā)明所用多胺類似物包括表現(xiàn)為能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)天然多胺水平的化合物。除理論之外，可能的機制包括多胺合成路徑中的競爭；多胺分解代謝物例如SSAT上調(diào)；影響多胺代謝等。
本發(fā)明尤其關注以下多胺類似物1，11-二(乙基)降精胺(norspermine)(1，11-二(乙基氨基)-4，8-二氮雜十一烷；BE-3-3-3)；1，8-二(乙基)亞精胺(BES)；1，12-二(乙基)精胺(BESm；DESPM(N1，N12-二乙基精胺；SunPharm)；1，14-二(乙基氨基)-5，10-二氮雜十四烷(BE-4-4-4)(二乙基高精胺(homospermine)，N1，N14-二乙基高精胺；DEHOP或DEHSPM；SunPharm)；二乙基降精胺(DENOP；SunPharm)；1，19--二(乙基氨基)-5，10，15-三氮雜十九烷(BE-4-4-4-4)；四鹽酸N-乙基-N′-(2-(3′-乙基氨基-丙基氨基甲基)-順-環(huán)丙基甲基-丙烷1，3-二胺(SL-11037)，S′LIL，Madison，Wisconsin提供；四鹽酸N-乙基-N′-(2-(3′-乙基氨基-丙基氨基甲基)-反-環(huán)丁基甲基-丙烷1，3-二胺(SL-11038)，S′LIL四鹽酸N-乙基-N′-(2-(3′-乙基氨基-丙基氨基甲基)-反-環(huán)丙基甲基-丙烷1，3-二胺(SL-11044)，S′LIL四鹽酸N，N′-二(3-乙基氨基丙基)-順-丁-2-烯-1，4-二胺(SL-11047，S′LIL)及其對應的反式異構(gòu)體(見WO95/18091)；(5，10，15，20，25，30，35，40-八氮雜四十四-22-烯-1，44-二胺，N，N′-二乙基，十鹽酸，(22E)-)(SL-11144)，S′LIL，化學摘要編號No.304911-07-7；(5，10，15，20，25，30，35，40-八氮雜四十四-22-烯-1，44-二胺，N，N′-二乙基，十鹽酸，(22Z)-)(SL-11150)，S′LIL，化學摘要編號No.304911-08-8。
SL-11037，SL-11038，SL-11044，SL-11047，SL-11144和SL-11150的結(jié)構(gòu)如下所示
此外，美國專利5,889,061，5,880,161和5,541,230，WO00/66587，WO00/66175和WO02/10142所述多胺類似物也可用于本發(fā)明。
支鏈或非支鏈多胺類似物包括但不限于BE4444(1，19-二(乙基氨基)-5，10，15-三氮雜十九烷)；BE-333(N1，N11-二乙基降精胺；DENSPM；1，11-二(乙基氨基)-4，8-二氮雜十一烷；thermine；Warner-Parke-Davis)；BE-33(N1，N17-二乙基降亞精胺(norspermidine))；BE-34(N1，N8-二乙基亞精胺)；BE-44(N1，N9-二乙基高精胺)；BE-343-(N1，N12-二乙基精胺)；二乙基精胺-N1-N12；DESPM)；BE-343-(N，N′-二(3-乙基氨基)丙基)-1，7-庚二胺，Merrel-Dow)；BE-444(N1，N14-二乙基高精胺；二乙基高精胺-N1-N14)；BE-3443(1，17-二(乙基氨基)-4，9，14-三氮雜十七烷)，BE-4334(1，17-二(乙基氨基)-5，9，13-三氮雜十七烷)；1，12-Me2-SPM(1，12-二甲基精胺)；WO98/17624和美國專利5,889,061所述各種多胺類似物；和WO00/66587和WO00/66175所述新多胺類似物，包括但不限于以下代號的化合物SL-11027，SL-11028，SL-11029，SL-11033，SL-11034，SL-11037，SL-11038，SL-11043，SL-11044，SL-11047，SL-11048，SL-11050，SL-11090，SL-11091，SL-11092，SL-11093，SL-11094，，SL-11098，SL-11099，SL-11100，SL-11101，SL-11102，SL-11103，SL-11104，SL-11105，SL-11108，SL-11114，SL-11118，SL-11119，SL-11121，SL-11122，SL-11123，SL-11124，SL-11126，SL-11127，SL-11128，SL-11129，SL-11130，SL-11132，SL-11133，SL-11134，SL-11136，SL-11137，SL-11141，，SL-11144，SL-11150，SL-11201和，SL-11202。其它多胺類似物是已知的，參見例如O′Sullivan等(1997)，Bioorg.Med.Chem.，52145-2155；和Mukhopadhyaya等(1995)Exp.Parasit.，8139-46；和美國專利4,935,449。
除此之外，也可使用上述化合物的立體異構(gòu)體、鹽或被保護衍生物。本發(fā)明還包括用有效量的任一上述化合物、其立體異構(gòu)體、鹽或被保護衍生物(或包含有效量上述物質(zhì)的組合物)降低ALS相關性異常巨噬細胞的數(shù)量或增殖的方法(或用于治療，或用于延遲ALS的發(fā)展)。本發(fā)明還包括以上多胺類似物、其立體異構(gòu)體、鹽或被保護衍生物用于制備治療ALS的組合物(即藥物)的用途。
任一上述化合物、其立體異構(gòu)體、鹽或被保護衍生物(或包含有效量上述物質(zhì)的組合物)可體外使用也可體內(nèi)使用。體外，即將合適的生物樣品(例如血樣，富集或未富集異常巨噬細胞群)與所述組合物接觸。體內(nèi)，即根據(jù)制造商/供應商的說明書進行所述組合物的給藥。通常，多胺類似物通過皮下或靜脈注射給藥，也可口服。
多胺類似物(其立體異構(gòu)體、鹽或被保護衍生物)的給藥量取決于多項變量，例如所用具體類似物(或其立體異構(gòu)體、鹽或被保護衍生物)，給藥程序，個體狀況，針對的疾病，疾病程度，劑次，劑量，是否服用其它藥物。通常，用量是按照制造商的推薦量和/或根據(jù)經(jīng)驗確定。如果是多胺類似物(其立體異構(gòu)體、鹽或被保護衍生物)，劑量一般約為1-300mg/m2/天，也可以是15-150mg/m2/天。一般采取間歇性給藥，即，一般隔至少1至2天給予一次多胺類似物(其立體異構(gòu)體、鹽或被保護衍生物)，然后在此后的至少1至2天內(nèi)不給藥，如此重復。實施方式之一中，多胺類似物每3周中有6天給藥。
給藥途徑取決于具體的多胺類似物(或其立體異構(gòu)體、鹽或被保護衍生物)，可以是例如口服或注射(皮下或靜脈)，一般采用靜脈或皮下注射給藥。
較好的是，將多胺類似物(或其立體異構(gòu)體、鹽或被保護衍生物)或其它能干擾多胺合成路徑、代謝和/或精胺胞內(nèi)濃度維持的藥物加在合適的藥物賦形劑中給藥。藥物賦形劑屬于本領域常識，可參見RemingtonThe Science and Practice ofPhamacy，第20版，Mack Publishing(200)。多胺類似物還可以與促進藥物向巨噬細胞傳遞或提高藥物對巨噬細胞特異性的其它物質(zhì)一同給藥。例如，可將藥物與脂質(zhì)體結(jié)合。脂質(zhì)體屬于本領域常識。然后，脂質(zhì)體再與靶向物質(zhì)例如IgGFc受體偶聯(lián)?？捎迷鰪娋奘杉毎淌勺饔玫奈镔|(zhì)例如酵母聚糖或四氯十氧(TCDO)和/或促進其活性的物質(zhì)例如MCSF、GMCSF或IL-3來提高抗增殖藥物的吸收率。
根據(jù)同期藥物治療(即目標結(jié)果，個體狀況和適應癥)，多胺類似物(或其立體異構(gòu)體、鹽或被保護衍生物)可單獨給藥，也可與其它物質(zhì)和/或治療聯(lián)合?！奥?lián)合”表示在其它物質(zhì)或治療之前、同時或之后給藥?？膳c本發(fā)明藥物聯(lián)合給藥的物質(zhì)例如但不限于riluzole(RILUTEK)。食品和藥物管理委員會許可的對Riluzole用于ALS治療的研究表明它對提高ALS患者存活率具有統(tǒng)計學顯著效果(Bensimon等(1994)，New Eng.J.Med.，330585-591；Lacomblez等(1996)，Lancet3471425-1431)。通常，ALS治療包括以控制癥狀為目的的治療。所以，可與本發(fā)明藥物聯(lián)用的針對ALS相關癥狀的物質(zhì)例如但不限于巴氯芬、地西泮、苯海索和/或阿米替林。
各種多胺類似物和酶抑制劑的作用機制可在特定細胞系中測定，至少部分是通過它們消除胞內(nèi)多胺聚集的能力。Kramer等(1995，Biochem.Pharmacol.，501433)描述了用4-氟-L-鳥氨酸監(jiān)測多胺生物合成路徑中的代謝通量。據(jù)測定，以氟化多胺產(chǎn)生速度表征的代謝通量反映了細胞的增殖狀態(tài)。美國專利5,498,522描述了用SSAT作為預示劑或腫瘤應答標記?？梢灾苯訙y定SSAT酶活性、SSAT酶蛋白或mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，或者測定與SSAT誘導相關的其它決定因子例如SSAT輔因子乙酰輔酶A(乙酰CoA)和SSAT產(chǎn)物N1-乙烯基精胺和N1-乙烯基亞精胺。為了進一步測定某多胺類似物給藥的效果，可監(jiān)測個體疾病(先兆疾病)發(fā)展和疾病(先兆疾病)生物化學和/或遺傳標記。就疾病發(fā)展而言，以確立了許多ALS的定級標準(即臨床功能指標)，屬于已知技術。
ALS相關癥狀屬于已知技術(參見例如Rowland等(2001)，N.Engl.J.Med.，3441688-1700)。此類癥狀包括但不限于肌肉衰弱，肌肉力度和協(xié)調(diào)性降低，麻痹，肌肉抽搐，聲音改變和/或沙啞，語言障礙，吞咽困難，易窒息，呼吸困難，肌肉攣縮，肌肉萎縮，尿頻/急，以及膝蓋、腳、腿腫脹。神經(jīng)肌肉檢查發(fā)現(xiàn)的ALS癥狀包括，例如四肢之一或附近部位(例如肩、臀)開始衰弱，肌肉震顫、痙攣、抽搐，肌萎縮，步態(tài)蹣跚，反射異常。
其它調(diào)節(jié)巨噬細胞增殖的藥物除了以上多胺類似物之外，適用于調(diào)節(jié)ALS相關性巨噬細胞的藥物還包括通用的抗增殖藥物(即增殖調(diào)節(jié)劑)。這些包括但不限于紅比霉素，絲裂霉素C，柔紅霉素，阿霉素，5-FU，阿糖胞苷，秋水仙堿，細胞松弛素B，博來霉素，長春新堿，長春堿，氨甲蝶啉，順鉑，蓖麻毒素，相思豆毒素，白喉毒素和saporin。
其它合適的還包括抑制或干擾多胺合成路徑的藥物或影響多胺代謝的藥物，以及影響密切調(diào)節(jié)亞精胺胞內(nèi)濃度的藥物。此類藥物的例子之一是MGBG(二鹽酸米托胍腙；XYRKAMINE；Ilex，Texas)，它抑制產(chǎn)生多胺所必需的腺苷甲硫氨酸脫氧酶。任何干擾多胺與增殖性巨噬細胞靶標之間相互作用的藥物都適用于本發(fā)明，所述靶標例如DNA、RNA和/或細胞膜。另一類適用藥物是干擾多胺與DNA相互作用的藥物。此類藥物可以通過任一前述效應(即，干擾多胺合成路徑和/或代謝，干擾精胺胞內(nèi)濃度，作為競爭物等)起作用，同時影響多胺與DNA相互作用的功能。根據(jù)常識，在確定上述藥物是否可用及用量時需考慮其毒理特性。
一般認為，上述藥物可以并的確被認為屬于多胺類似物。
關于給藥和其它問題可參見前文論述。
以下實施例僅是為了說明而非限定本發(fā)明。
實施例總的說來，本發(fā)明所用流式細胞計數(shù)法屬于本領域常規(guī)技術，可參見，例如“Flow CytometryA Practical Approach”，第2版，M.G.Ormerod編輯，OxfordUniversity Press(1997)；Handbook of Flow Cytometry Methods，J.Paul Robinson編輯，John Wiley&Sons(1993)；Current Protocols in Cytometry，J.Paul Robinson編輯，John Wiley&Sons(1997年10月，定期更新)；Becton Dickinson CytometrySource Book，Becton Dickinson Immunocytometry Systems(1998，定期更新)(SanJose，Calif.)。
實施例1ALS患者外周血中的異常單核細胞檢測檢查肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)患者和非ALS患者外周血單核細胞(PBMC)內(nèi)的共有細胞分化抗原表達。這些細胞分化抗原包括跟蹤單核細胞和淋巴細胞變化的特異性抗原。15名ALS患者血樣的分析結(jié)果與正常非ALS家族成員(3名)的分析結(jié)果，淋巴瘤患者(11名)的歷史數(shù)據(jù)分析結(jié)果和AIDS相關性癡呆患者(2名)的分析結(jié)果相比較。參試者或其代表都表示同意參見本試驗。
試驗中采用了以下針對所述抗原的熒光團標記的抗體熒光素偶聯(lián)的抗CD8(Becton Dickinson)；藻紅蛋白偶聯(lián)的抗HLA-DR(Becton Dickinson)；藻紅蛋白偶聯(lián)的抗CD38(Becton Dickinson)；多甲藻素葉綠素蛋白偶聯(lián)的抗CD4(Becton Dickinson)；多甲藻素葉綠素蛋白偶聯(lián)的抗IgG1(同種型對照，Becton Dickinson)；熒光素偶聯(lián)的抗CD14(DAKO Corp.)；藻紅蛋白偶聯(lián)的抗CD16(DAKO Corp.)；藻紅蛋白偶聯(lián)的抗PCNA(DAKO Corp.)；藻紅蛋白偶聯(lián)的抗Ki67(DAKO Corp.)；熒光素偶聯(lián)的抗IgG1(同種型對照，DAKO Corp.)；藻紅蛋白偶聯(lián)的抗IgG1(同種型對照，DAKO Corp.)。
10μL肝素化全血用一種或多種上述標記抗體室溫下避光染色20分鐘。加入2ml FACSLYSE溶液(Becton Dickinson，San Jose，CA)培養(yǎng)5分鐘以裂解紅細胞。細胞懸浮液以400×g離心5分鐘。細胞沉淀先后用1ml FACSLYSE和1ml 0.01M的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌。
沒有進行胞內(nèi)抗原染色的細胞用1ml含1％多聚甲醛+0.1％疊氮鈉的0.01MPBS固定。
進行胞內(nèi)抗原染色的細胞懸浮在0.5ml“透化溶液”(Becton Dickinson)中室溫培養(yǎng)10分鐘進行透化。然后，用2ml PBS洗滌細胞，離心，重懸于0.1ml PBS中。洗滌后的細胞用胞內(nèi)抗原特異性抗體室溫下避光染色30分鐘。用1ml PBS洗滌后，用1ml含1％多聚甲醛+0.1％疊氮鈉的0.01M PBS固定。
用FACSCAN流式細胞計數(shù)儀(Becton Dickinson)進行細胞計數(shù)。用流式細胞計數(shù)儀處理至少10,000細胞/份樣品以測定細胞的抗體染色情況。用CELLQUEST軟件(Becton Dickinson)分析表型。
將ALS患者的CD14+單核細胞表面的II類主組織相容性抗原(HLA-DR)表達水平與非ALS個體的相比。用Becton Dickinson Quatibrite試劑盒和熒光標準品定量測定CD14+細胞上HLA-DR表達水平。測定CD14+細胞群的熒光度/細胞平均值作為HLA-DR表達水平。用非配對T試驗進行統(tǒng)計學分析來比較非ALS個體的細胞和LAS個體的細胞。結(jié)果見表1。
表1CD14+PBMC內(nèi)HLA-DR的定量表達

如表1所示，ALS患者的CD14+細胞表面的HLA-DR表達水平顯著高于非ALS個體。根據(jù)定量測定，細胞表面的HLA-DR表達高出64％，具有統(tǒng)計學顯著性(P≤0.01)。
通常，當單核細胞活化并分化為組織巨噬細胞時會高水平表達HLA-DR，非受激循環(huán)單核細胞只低水平地表達HLA-DR。因此，以上數(shù)據(jù)表明ALS患者體內(nèi)的循環(huán)單核細胞被普遍活化并且正在分化為巨噬細胞。
如前所述，在采血后的次日(“次日”細胞)分析肝素化血樣的細胞標記表達。用增殖標記，即增殖細胞核抗原(PCNA)和Ki67活性，檢測ALS患者和非ALS個體的單核細胞增殖。用抗CD14和抗PCNA或抗Ki67染色PBMC，并如上所述進行分析。結(jié)果見表2。
表2CD14+PBMC內(nèi)的抗原表達

如表2所示，ALS患者的PCNA活性在正常范圍內(nèi)。但是，ALS患者體內(nèi)的Ki67陽性CD14+細胞似乎增多。Ki67和PCNA在細胞周期的多個不同階段表達。因此，ALS患者CD14+細胞的Ki67活性表明這些細胞進行有絲分裂。
還對PBMC進行了T淋巴細胞標記分析，結(jié)果見表3。
表3CD14+PBMC內(nèi)的淋巴細胞抗原表達

*P≤0.01如表3所示，對PBMC的T淋巴細胞標記分析沒有發(fā)現(xiàn)任何表明T淋巴細胞活化的證據(jù)。CD4和CD8水平都正常。根據(jù)CD4/CD38和CD8/CD38活性之比測定的淋巴細胞活化狀態(tài)也正常，表明免疫系統(tǒng)內(nèi)的這一組分普遍正常。
另一實驗中，20名ALS患者的血樣分析結(jié)果與20名正常非ALS個體的進行比較。在采血的當日(“當日”細胞)如上所述對肝素化全血進行細胞標記表達分析。圖1顯示當日血樣CD14+單核細胞上的HLA-DR表達水平。圖2顯示當日血樣中共表達CD16的CD14+細胞的百分比。
如圖1所示，ALS患者CD14+單核細胞的HLA-DR表達水平顯著高于非ALS個體。圖2顯示，ALS患者的CD14+細胞群中CD16+細胞百分比顯著高于非ALS個體。
總而言之，ALS患者的PBMC中的CD14+細胞表現(xiàn)出表面標記的改變，這些改變表明細胞活化、分化和增殖異常。例如，雖然沒有發(fā)現(xiàn)淋巴細胞活化狀態(tài)的重大變化，但是單核細胞表現(xiàn)出了活化跡象。
實施例2血液采集條件對ALS患者異常循環(huán)性巨噬細胞鑒定的影響對7份抽入含肝素試管的ALS患者血樣和抽入含鈣螯合劑檸檬酸葡萄糖的試管(ACD管)的血樣如前所述進行細胞標記表達分析。同時，在采血當日，對10份抽入含肝素管的正常非ALS個體的血樣也如前所述進行細胞標記表達分析。
圖3顯示采集在肝素管中的ALS血樣中的CD14+單核細胞上的HLA-DR表達水平與采集在ACD管中的比較。圖4顯示采集在肝素管中的ALS血樣中共表達CD16的CD14+單核細胞百分比與采集在ACD管中的比較。圖3和圖4中，采集在肝素管中的正常樣品的中值用水平實線表示，中值以上和以下的虛線表示標準偏差。
如圖3和圖4所示，當血樣中存在鈣螯合劑時，同日分析的ALS血樣中的HLA-DR表達水平和CD16+/CD14+細胞百分比都降至正常值。用EDTA作為螯合劑時獲得相似結(jié)果。這表明，細胞培養(yǎng)基中的鈣螯合劑造成ALS的異常巨噬細胞特征丟失；還表明，足量非螯合鈣對于檢測將ALS樣品區(qū)別于對照的兩項重要巨噬細胞活化參數(shù)來說是必需的。
實施例3多胺類似物對于ALS患者CD14+單核細胞的作用在密度1.087的Percoll(Pharmacia，Piseataway，NJ)上分層疊加肝素化全血，從中分離出外周血單核細胞(PBMC)，然后以800×g離心。收集Percoll/血漿界面的細胞，用0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌。然后，將分離所得細胞懸浮在加有10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，濃度約為1×106細胞/ml。將細胞分裝到聚乙烯培養(yǎng)管中，1ml/管。在3根培養(yǎng)管中加入多胺類似物，例如SL-11047，最終濃度分別為1.0，0.1和0.01mM。第4管，作為對照，不加任何藥物。全部培養(yǎng)管放入增濕培養(yǎng)箱中，37℃，5％二氧化碳，培養(yǎng)5天。
第5天，從培養(yǎng)箱中取出細胞，用PBS洗滌，重懸于PBS，0.1ml/管。用熒光素偶聯(lián)的抗CD14(DAKO Corp.，Carpenteria，CA)室溫下避光染色20分鐘以檢測單核細胞。另取一份平行樣品，以對照即熒光素偶聯(lián)的IgG1(同種型抗體對照，DAKO Corp.)染色，作為陰性染色對照。用PBS洗滌細胞，用1ml含1％多聚甲醛+0.1％疊氮鈉的PBS固定細胞。用FACSCAN流式細胞計數(shù)儀(Becton Dickison，San Jose，CA)和CELLQUEST軟件(Becton Dickison)處理至少20,000細胞/管來鑒定CD14+單核細胞。將藥物處理管的CD14+單核細胞數(shù)與非處理對照比較，并計算減少50％所需的藥物劑量(ED50)。
對6名ALS患者，1名多發(fā)性硬化癥(MS)患者和1名正常(非ALS)對照的CD14+循環(huán)單核細胞進行上述實驗。該實驗中，同一個體的細胞加或不加多胺類似物SL-11047培養(yǎng)6天，然后測定CD14+細胞存活率。圖5顯示各份細胞樣品在1.0μM SL-11047存在下的被殺細胞百分比。該實驗顯示，ALS患者的CD14+循環(huán)單核細胞對多胺類似物的殺傷易感性比正常個體或MS患者明顯高得多，這可能是因為多胺類似物對ALS患者循環(huán)性CD14+單核細胞中的異常巨噬細胞群所具有的殺傷力。所以，多胺類似物有望用于減少ALS患者的異常巨噬細胞。
權利要求
1.一種輔助ALS疾病診斷的方法，包括在個體血樣中檢測異常巨噬細胞，所述檢測包括檢測HLA-DR高表達CD14+細胞或CD14+/CD16+細胞。
2.如權利要求1所述的方法，所述檢測包括檢測HLA-DR高表達CD14+細胞。
3.如權利要求1所述的方法，所述檢測包括檢測CD14+/CD16+細胞。
4.如權利要求1所述的方法，所述檢測異常巨噬細胞在血樣采集后12小時內(nèi)進行。
5.一種篩選能夠減少ALS相關性異常巨噬細胞的藥物的方法，包括檢測候選藥物存在和不存在時HLA-DR高表達的CD14+細胞或CD14+/CD16+細胞的細胞活度差異，所述HLA-DR高表達的CD14+細胞或CD14+/CD16+細胞獲自ALS患者的血樣。
6.如權利要求5所述方法，檢測的是HLA-DR高表達的CD14+細胞的活度。
7.如權利要求5所述方法，檢測的是CD14+/CD16+細胞的活度。
全文摘要
本發(fā)明提供一種監(jiān)測肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)癥發(fā)展的方法和監(jiān)測ALS治療效果的方法，通過測定ALS患者外周血中CD14+單核細胞的HLA－DR表達水平和/或CD14+細胞群中CD16+細胞所占百分比和/或CD14+/CD16+細胞的數(shù)量來實現(xiàn)。本發(fā)明還涉及減少ALS患者體內(nèi)循環(huán)性CD14+單核細胞和/或CD14+/CD16+細胞群和/或CD14+/CD16+細胞的方法。本發(fā)明還涉及篩選能夠減少ALS患者體內(nèi)HLA－DR高表達CD14+單核細胞和/或CD14+/CD16+細胞群和/或CD14+/CD16+細胞的藥物的方法。
文檔編號A61P21/00GK1606694SQ02825591
公開日2005年4月13日 申請日期2002年11月18日 優(yōu)先權日2001年11月16日
發(fā)明者L·J·馬托諾, T·M·雷米希, S·斯科特, M·麥格拉斯 申請人:Slil生物醫(yī)學股份有限公司, Als治療發(fā)展基金會