專(zhuān)利名稱(chēng)：：因子Ⅶ多肽的液體組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含因子VII多肽的液體含水組合物以及制備和使用該組合物的方法。本發(fā)明更特別涉及對(duì)化學(xué)和/或物理降解穩(wěn)定的液體組合物。
背景技術(shù)：
：已經(jīng)鑒定了凝血過(guò)程涉及的多種因子，包括血漿糖蛋白因子VII(FVII)。血管壁受損后，暴露于循環(huán)血中的組織因子(TF)與循環(huán)中存在的、相當(dāng)于約1％FVII蛋白質(zhì)總量的FVIIa之間形成復(fù)合物，從而啟動(dòng)止血。FVII主要以單鏈酶原存在于血漿中，由FXa斷裂成雙鏈活化形式FVIIa。重組的活化因子VIIa(rFVIIa)已開(kāi)發(fā)為前止血?jiǎng)?pro-haemostaticagent)。因抗體形成而不能利用其它凝血因子產(chǎn)品治療的出血血友病受試者，給予rFVIIa可產(chǎn)生快速、高效的前止血反應(yīng)(pro-haemostaticresponse)。FVIIa也可以成功治療因子VII缺陷受試者、或凝血系統(tǒng)正常但過(guò)量流血的受試者的出血。希望有適合保存和輸送的給藥形式的因子VIIa。理想上藥物產(chǎn)品以液體保存和給藥?；蛘?，藥物產(chǎn)品是凍干的，例如冷凍干燥，然后就在患者使用之前加入合適稀釋劑重新溶解。理想上藥物產(chǎn)品具有足夠穩(wěn)定性，可以長(zhǎng)期保存，即6個(gè)月以上。通常根據(jù)蛋白質(zhì)藥物在給藥形式中的穩(wěn)定性，來(lái)決定使最終藥物產(chǎn)品保持液體抑或凍干。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性特別受到以下因素影響，例如離子強(qiáng)度、pH、溫度、冷凍/融化的重復(fù)循環(huán)以及受到剪切力。活性蛋白質(zhì)可因物理不穩(wěn)定性包括變性和凝聚(可溶性及不可溶性凝聚物形成)、以及化學(xué)不穩(wěn)定性包括例如水解、脫酰胺作用和氧化作用而喪失，僅舉幾個(gè)例子。蛋白質(zhì)藥物穩(wěn)定性的一般綜述參見(jiàn)例如Manning等人，PharmaceuticalResearch6903-918(1989)。雖然廣泛理解可能發(fā)生蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性，但不可能預(yù)測(cè)特定蛋白質(zhì)的特定不穩(wěn)定性問(wèn)題。以上任何不穩(wěn)定性均可導(dǎo)致形成活性降低、毒性增加和/或免疫原性提高的蛋白質(zhì)副產(chǎn)品、或衍生物。實(shí)際上，蛋白質(zhì)沉淀可能引起血栓形成、劑量形式和數(shù)量的不均一性以及注射器阻塞。此外，翻譯后修飾例如某些N端谷氨酸殘基的γ羧基化以及添加糖側(cè)鏈產(chǎn)生可能在保存期間對(duì)修飾敏感的潛在位點(diǎn)。因子VIIa特異性的絲氨酸蛋白酶也可能因自身催化而發(fā)生片段化(酶促降解)。因此，任何蛋白質(zhì)組合物的安全和效率與其穩(wěn)定性直接相關(guān)。液體形式保持穩(wěn)定性通常與凍干形式不同，因其分子運(yùn)動(dòng)大大增加，從而提高了分子相互作用的幾率。濃縮形式保持穩(wěn)定性也不同，因?yàn)楦叩鞍踪|(zhì)濃度易于形成凝聚物。開(kāi)發(fā)液體組合物時(shí)，要考慮很多因素。短期，即6個(gè)月以下，液體穩(wěn)定性一般取決于避免總體結(jié)構(gòu)性變化，例如變性和凝聚。文獻(xiàn)中描述了針對(duì)許多蛋白質(zhì)的的這類(lèi)方法，也存在許多穩(wěn)定劑的例子。眾所周知，有效穩(wěn)定某一蛋白質(zhì)的試劑實(shí)際上使另一種不穩(wěn)定。一旦使蛋白質(zhì)的總體結(jié)構(gòu)性變化穩(wěn)定，形成長(zhǎng)期穩(wěn)定(例如超過(guò)6個(gè)月)的液體組合物則取決于進(jìn)一步穩(wěn)定蛋白質(zhì)不受特異性針對(duì)該蛋白質(zhì)的各類(lèi)降解。更特異性的各類(lèi)降解可能包括，例如二硫鍵錯(cuò)亂、某些殘基氧化、脫酰胺作用、環(huán)化。盡管未必可能確切指出各個(gè)降解種類(lèi)，但發(fā)展了測(cè)定方法來(lái)監(jiān)控精細(xì)變化，以便監(jiān)控特定賦形劑獨(dú)特穩(wěn)定目的蛋白質(zhì)的能力。除了穩(wěn)定性考慮之外，通常選擇由各個(gè)世界醫(yī)學(xué)管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的賦型劑。希望組合物的pH在注射/輸注時(shí)位于生理合適范圍內(nèi)，否則可能引起疼痛和不適。蛋白質(zhì)組合物的綜述參見(jiàn)例如Cleland等人ThedevelopmentofstableproteincompositionsAcloserlookatproteinaggregation，deamidationandoxidation，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1993(4)307-377以及Wang等人，ParenteralcompositionsofproteinsandpeptidesStabilityandstabilizers，JournalofParenteralScienceandTechnology1988(增刊)，42(2S)。有關(guān)蛋白質(zhì)穩(wěn)定的其它出版物如下。U.S.20010031721A1(AmericanHomeProducts)涉及高度濃縮、凍干及液體因子IX組合物。U.S.5,770,700，700(GeneticsInstitute)涉及液體IX組合物。WO97/19687(AmericanRedCross)涉及血漿蛋白質(zhì)的液體組合物，特別是因子VIII和因子IX。U.S.4,297,344，344公開(kāi)了通過(guò)加入所選氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、羥脯氨酸、谷氨酰胺和氨基丁酸以及糖類(lèi)例如單糖、寡糖或糖醇，使凝血因子II和VIII、抗凝血酶III及纖溶酶原對(duì)熱穩(wěn)定。因子VIIa經(jīng)歷若干降解途徑，特別是聚集(二聚)、氧化和自溶型斷裂(肽主鏈剪切)。此外，可能發(fā)生沉淀。從蛋白質(zhì)中去除水分可以顯著降低上述許多反應(yīng)。然而，形成因子VIIa的含水組合物的好處在于，消除重新溶解失誤而提高了給藥準(zhǔn)確性，并且簡(jiǎn)化了產(chǎn)品的臨床使用，從而增加了患者合作。理想上因子VIIa組合物應(yīng)在各種蛋白質(zhì)濃度下穩(wěn)定6個(gè)月以上。這提供了給藥方法的靈活性。一般而言，較高度濃縮的形式可以給予較低的體積，從患者觀點(diǎn)極其希望如此。液體組合物較之冷凍干燥產(chǎn)品在易于給藥和使用方面具有很多優(yōu)點(diǎn)。如今，唯一商品化重組制備的FVII多肽組合物是冷凍干燥的因子FVIIa產(chǎn)品，在使用前重新溶解，包含相對(duì)較低的因子VIIa濃度，例如約0.6mg/ml。一瓶(1.2mg)NovoSeven(NovoNordiskA/S，Denmark)包含1.2mg重組人因子VIIa、5.84mgNaCl、2.94mgCaCl2、2H2O、2.64mgGlyGly、0.14mg聚山梨酯(polysorbate)80和60.0mg甘露醇；利用2.0ml注射用水(WFI)重新溶解到pH5.5。重新溶解后，蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定使用24小時(shí)。因此，目前沒(méi)有商品化的液體即用型或濃縮的因子VII產(chǎn)品。故而本領(lǐng)域需要提高因子VII多肽包括人因子VIIa穩(wěn)定性(化學(xué)和/或物理穩(wěn)定性)、增加濃度、保持活性水平以及提供適于保存的液體組合物的方法。因此，本發(fā)明目的在于提供含水因子VII多肽組合物，對(duì)化學(xué)和/或物理降解產(chǎn)物例如酶促降解或自身催化產(chǎn)物提供合適控制。發(fā)明概述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，因子VII或其類(lèi)似物(″因子VII多肽″)與緩沖劑、濃度至少15mM的鈣或鎂鹽或其混合物一起配制成含水溶液時(shí)，在pH約4-約8范圍內(nèi)穩(wěn)定。一方面，本發(fā)明提供了一種液體含水組合物，其包含(i)因子VII多肽，(ii)適于使pH保持在約4.0-約8.0的試劑；(iii)選自以下的試劑鈣鹽、鎂鹽或其混合物，其中(iii)的濃度為至少15mM。在不同實(shí)施方案中，試劑(iii)存在的濃度為至少約25mM、50mM、100mM、200mM、400mM、800mM、900mM或至少1000mM。在另一實(shí)施方案中，該組合物另外包含(iv)離子強(qiáng)度改變劑。在不同實(shí)施方案中，該離子強(qiáng)度改變劑選自中性鹽例如氯化鈉；氨基酸；或小肽，或至少兩種所述改變劑的混合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該離子強(qiáng)度改變劑是氯化鈉。在不同實(shí)施方案中，試劑(iv)存在的濃度為至少約5mM、10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、400mM、800mM、1000mM、1200mM、1500mM、1800mM、2000mM或至少2200mM。在一系列實(shí)施方案中，試劑(iii)(鈣和/或鎂鹽)存在的濃度為約15mM-約1000mM，例如約25mM-約1000mM、約50mM-約1000mM、約100mM-約1000mM、約200mM-約1000mM、約300mM-約1000mM、約400mM-約1000mM、約500mM-約1000mM、約600mM-約1000mM、約700mM-約1000mM；約15mM-約800mM、約25mM-約800mM、約50mM-約800mM、約100mM-約800mM、約200mM-約800mM、約300mM-約800mM、約400mM-約800mM、約500mM-約800mM；約15mM-約600mM、約25mM-約600mM、約50mM-約600mM、約100mM-約600mM、約200mM-約600mM、約300mM-約600mM；約15mM-約400mM、約25mM-約400mM、約50mM-約400mM或約100mM-約400mM。在一系列實(shí)施方案中，試劑(iv)(離子強(qiáng)度改變劑)存在的濃度為約5mM-約2200mM，例如約25mM-約2200mM、約50mM-約2200mM、約100mM-約2200mM、約200mM-約2200mM、約400mM-約2200mM、約600mM-約2200mM、約800mM-約2200mM、約1000mM-約2200mM、約1200mM-約2200mM、約1400mM-約2200mM、約1600mM-約2200mM、約1800mM-約2200mM或約2000mM-約2200mM；約5mM-約1800mM、約25mM-約1800mM、約50mM-約1800mM、約100mM-約1800mM、約200mM-約1800mM、約400mM-約1800mM、約600mM-約1800mM、約800mM-約1800mM、約1000mM-約1800mM、約1200mM-約1800mM、約1400mM-約1800mM、約1600mM-約1800mM；約5mM-約1500mM、約25mM-約1400mM、約50mM-約1500mM、約100mM-約1500mM、約200mM-約1500mM、約400mM-約1500mM、約600mM-約1500mM、約800mM-約1500mM、約1000mM-約1500mM、約1200mM-約1500mM；約5mM-約1200mM、約25mM-約1200mM、約50mM-約1200mM、約100mM-約1200mM、約200mM-約1200mM、約400mM-約1200mM、約600mM-約1200mM或約800mM-約1200mM。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，試劑(iii)和(iv)的總濃度為約50mM-約2500mM，例如約100mM-約2500mM、約200mM-約2500mM、約400mM-約2500mM、約600mM-約2500mM、約800mM-約2500mM、約1000mM-約2500mM、約1200mM-約2500mM、約1400mM-約2500mM、約1600mM-約2500mM、約1800mM-約2500mM或約2000mM-約2500mM；約50mM-約2000mM、約100mM-約2000mM、約200mM-約2000mM、約400mM-約2000mM、約600mM-約2000mM、約800mM-約2000mM、約1000mM-約2000mM、約1200mM-約2000mM、約1400mM-約2000mM或約1600mM-約2000mM；約50mM-約1600mM、約100mM-約1600mM、約200mM-約1600mM、約400mM-約1600mM、約600mM-約1600mM、約800mM-約1600mM、約1000mM-約1600mM或約1200mM-約1600mM。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑(iii)和(iv)存在的濃度為約600-約800mM的(iii)以及0-約5mM的(iv)；在另一實(shí)施方案中，試劑(iii)和(iv)存在的濃度為約300-約500mM的(iii)以及約1100-約1300mM的(iv)；在另一實(shí)施方案中，試劑(iii)和(iv)存在的濃度為約100-約300mM的(iii)以及約1500-約1900mM的(iv)；在另一實(shí)施方案中，試劑(iii)和(iv)存在的濃度為約50-約150mM的(iii)以及約1800-約2300mM的(iv)。在不同實(shí)施方案中，該組合物的離子強(qiáng)度為至少50，例如至少75、100、150、200、250、400、500、650、800、1000、1200、1600、2000、2400、2800或至少3200。在不同實(shí)施方案中，鈣鹽選自氯化鈣、乙酸鈣、葡萄糖酸鈣和乙酰丙酸鈣。在不同實(shí)施方案中，鎂鹽選自氯化鎂、乙酸鎂、硫酸鎂、葡萄糖酸鎂、乙酰丙酸鎂及強(qiáng)酸鹽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，試劑(iii)選自氯化鈣、乙酸鈣、氯化鎂、乙酸鎂、硫酸鎂或其混合物；并且離子強(qiáng)度改變劑(iv)是氯化鈉。在另一實(shí)施方案中，鈣組合物另外包含(v)張力改變劑。在不同實(shí)施方案中，該張力改變劑(v)選自中性鹽；單-、雙-或多糖；糖醇；氨基酸；或小肽，或至少兩種所述改變劑的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該張力改變劑(v)存在的濃度為約1-約500mM；約1-約300mM；約10-約200mM；或約20-約150mM。在另一實(shí)施方案中，該組合物另外包含(vi)非離子表面活性劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該非離子表面活性劑存在的量為按重量約0.005-約2.0％。在另一實(shí)施方案中，該非離子表面活性劑是聚山梨酯、或泊洛沙姆(poloxamer)、或聚氧乙烯烷基醚，優(yōu)選泊洛沙姆188、或泊洛沙姆407、或聚山梨酯20、或聚山梨酯80、或聚氧23十二烷基醚。在另一實(shí)施方案中，該組合物另外包含(vii)抗氧化劑。在不同實(shí)施方案中，該抗氧化劑是D-或L-甲硫氨酸；甲硫氨酸類(lèi)似物；包含甲硫氨酸的肽；抗壞血酸；半胱氨酸；甲硫氨酸同系物，例如高半胱氨酸；谷胱甘肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗氧化劑是L-甲硫氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗氧化劑存在的濃度為約0.1-約5.0mg/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物的pH保持在約4.0-約7.0；例如約4.5-約7.0；約5.0-約7.0；約5.5-約7.0；或約6.0-約7.0。在一個(gè)實(shí)施方案中，適于將pH保持在約4.0-約8.0的試劑是選自下列酸和其鹽的緩沖劑檸檬酸、乙酸、組氨酸、蘋(píng)果酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、MES、HEPES、咪唑、TRIS、乳酸、glycylglycin、PIPES、glycin或至少兩種所述緩沖劑的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該緩沖劑的濃度為約1mMto100mM；1mM-約50mM；約1mM-約25mM；約2mM-約20mM；或約10mM。在另一實(shí)施方案中，該組合物還包含(viii)防腐劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該防腐劑選自苯酚、苯甲醇、鄰甲酚(orto-cresol)、間甲酚、對(duì)甲酚、羥苯甲酸甲酯、對(duì)羥苯甲酸丙酯、benzalconiumchloride和benzaethoniumchloride。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物是等滲的；在另一實(shí)施方案中，它是高滲的。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物配制成用于給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物在2-8℃穩(wěn)定和/或穩(wěn)定至少6個(gè)月。在不同實(shí)施方案中，該因子VII多肽是人因子VIIa；重組人因子VIIa；因子VII相關(guān)多肽；因子VII序列變體；或因子VII多肽，其中在本說(shuō)明書(shū)所述′體外蛋白質(zhì)水解分析′的測(cè)試中，該因子VII多肽活性和天然人因子VIIa多肽(野生型FVIIa)活性至少約1.25，優(yōu)選至少約2.0或4.0，最優(yōu)選至少約8.0。在一個(gè)實(shí)施方案中，該因子VII多肽的糖基化不同于野生型人因子VII。在不同實(shí)施方案中，該因子VII多肽存在的濃度為約0.1mg/ml-約10mg/ml；約0.5mg/ml-約5.0mg/ml；約0.6mg/ml-約4.0mg/ml；約1.0mg/ml-約4.0mg/ml；約0.1mg/ml-約5mg/ml；約0.1mg/ml-約4.0mg/ml；約0.1mg/ml-約2mg/ml；或約.1mg/ml-約1.5mg/ml。在另一方面，本發(fā)明還提供了制備因子VII多肽的液體含水組合物的方法，其包含提供因子VII多肽溶液的步驟，該溶液包含(i)因子VII多肽；(ii)適合保持pH在約4.0-約8.0的試劑；(iii)選自以下的試劑鈣鹽、鎂鹽或其混合物；其中(iii)的濃度為至少15mM。在另一方面，本發(fā)明還涉及該組合物在制備用于治療對(duì)因子VII有反應(yīng)的綜合征的藥物中的用途。在另一方面，本發(fā)明涉及治療對(duì)因子VII有反應(yīng)的綜合征的方法，該方法包含在引起出血減少和/或凝血增加的條件下，給予有此需要的受試者有效量的含水液體組合物，其包含(i)因子VII多肽，(ii)適合保持pH在約4.0-約8.0的試劑；(iii)選自以下的試劑鈣鹽、鎂鹽或其混合物；其中(iii)的濃度為至少15mM。在不同實(shí)施方案中，該綜合癥選自血友病A、血友病B、因子X(jué)I缺陷、因子FVII缺陷、血小板減少、血管性血友病(vonWillebrand′sdisease)、存在凝血因子抑制劑、手術(shù)、腦內(nèi)出血、創(chuàng)傷和抗凝劑治療。發(fā)明詳述本發(fā)明的組合物可用作因子VII多肽的穩(wěn)定、優(yōu)選即用型組合物。在2-8℃溫度下保存時(shí)，該組合物可穩(wěn)定至少6個(gè)月，優(yōu)選高達(dá)36個(gè)月。在2-8℃保存至少6個(gè)月時(shí)，該組合物化學(xué)和/或物理穩(wěn)定，特別是化學(xué)穩(wěn)定?！宸€(wěn)定″是指該組合物在2-8℃保存至少6個(gè)月后，按基本如WO92/15686(實(shí)施例II)所述一段式凝結(jié)分析(one-stageclotassay)測(cè)定，保持至少50％最初的生物活性。簡(jiǎn)言之，在50mMTris(pH7.5)、0.1％BSA中稀釋待測(cè)樣品，將100μl樣品與100μl因子VII缺陷血漿和200μl包含10mMCa2+的促凝血酶原激酶C溫育。測(cè)定凝結(jié)時(shí)間，與使用系列稀釋的參考標(biāo)準(zhǔn)或檸檬酸抗凝的正常人血漿混合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較。優(yōu)選在2-8℃保存至少6個(gè)月以后，該穩(wěn)定組合物保持至少80％的最初活性。術(shù)語(yǔ)″使穩(wěn)定″可能與″相對(duì)穩(wěn)定″交互使用，是指在2-8℃保存至少6個(gè)月以后，相對(duì)于在類(lèi)似條件下保存類(lèi)似時(shí)間的重新溶解的NovoSeven產(chǎn)品溶液所包含的對(duì)應(yīng)降解產(chǎn)物的數(shù)量，該組合物包含較低數(shù)量的至少一種下列降解產(chǎn)物(i)酶促降解產(chǎn)物，(ii)凝聚物(二聚物、寡聚物和多聚物)，(iii)氧化形式，(iv)脫酰胺形式。術(shù)語(yǔ)″物理上穩(wěn)定″是用來(lái)指保持視覺(jué)上澄清的組合物。該組合物在不同溫度下保存不同時(shí)間以后，利用視覺(jué)檢查和混濁度的方法，評(píng)價(jià)該組合物的物理穩(wěn)定性。在黑背景下清晰聚焦的光線中進(jìn)行組合物的視覺(jué)檢查。組合物顯示視覺(jué)可見(jiàn)的混濁則定為物理上不穩(wěn)定。因子VII多肽的術(shù)語(yǔ)″物理穩(wěn)定性″涉及在形成二聚、寡聚和多聚形式的因子VII多肽的不可溶性和/或可溶性凝聚物以及該分子的任何結(jié)構(gòu)性破壞和變性。術(shù)語(yǔ)″化學(xué)上穩(wěn)定″是用來(lái)指該組合物在2-8℃保存6個(gè)月后，按基本如WO92/15686所述一段式凝結(jié)分析測(cè)定，保持至少50％最初的生物活性。術(shù)語(yǔ)″化學(xué)穩(wěn)定性″是用來(lái)涉及溶液在加速(accelerated)條件下保存時(shí)形成因子VII多肽的任何化學(xué)變化。例如導(dǎo)致因子VII多肽片段形成的水解、脫酰胺和氧化以及酶促降解。特別是含硫氨基酸傾向于氧化形成相應(yīng)的亞砜。該組合物包含因子VII多肽、鈣和/或鎂離子、緩沖劑并任選其它可進(jìn)一步穩(wěn)定因子VII多肽的賦形劑，包括離子強(qiáng)度改變劑和張力改變劑。因子VII多肽濃度為約0.1-約10mg/mL。此處所用術(shù)語(yǔ)″離子強(qiáng)度改變劑″包括影響溶液離子強(qiáng)度的試劑。該試劑包括但不限于中性鹽，例如氯化鈉或氯化鉀；氨基酸；小肽(例如具有2-5個(gè)氨基酸殘基，例如甘氨酰甘氨酸)，或至少兩種所述改變劑的混合物。優(yōu)選試劑為氯化鈉。該離子強(qiáng)度改變劑的存在濃度至少約5mM、10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、400mM、800mM、1000mM、1200mM、1500mM、1800mM、2000mM或至少2200mM。此處所用術(shù)語(yǔ)″張力改變劑″包括有助于溶液的重量摩爾滲透壓濃度(osmolality)的試劑。張力改變劑包括但不限于氨基酸；小肽(例如具有2-5個(gè)氨基酸殘基)；中性鹽；單-或二糖；多糖；糖醇，或至少兩種所述改變劑的混合物。張力改變劑的例子包括但不限于氯化鈉、氯化鉀、乙酸鈉、蔗糖、葡萄糖、甘氨酰甘氨酸和甘露醇。通常，該改變劑存在濃度為約1-約500mM；約1-約300mM；約10-約200mM；或約20-約150mM，取決于存在的其它成分?？赡苁褂弥行喳}例如氯化鈉或氯化鉀?！逯行喳}″是指溶解于溶液中時(shí)既非酸性也非堿性的鹽。術(shù)語(yǔ)″適合保持pH為約4.0-約8.0的試劑″包括使溶液pH保持在約4.0-約8.0(例如約4.0-約7.0、約4.5-約7.0、約5.0-約7.0、約5.0-約6.5、約5.5-約7.0、約5.5-約6.5、約6.0-約7.0、約5.0-約6.0、約6.4-約6.6、或約6.5、約5.2-約5.7、或約5.5)合適范圍內(nèi)的試劑。該術(shù)語(yǔ)可能與″緩沖劑″交互使用。其可能包括但不限于酸和其鹽檸檬酸(鈉或鉀)、乙酸(銨、鈉或鈣)、組氨酸(L-組氨酸)、蘋(píng)果酸、磷酸(鈉或鉀)、酒石酸、琥珀酸、MES、HEPES、咪唑、TRIS、乳酸、谷氨酸、glycylglycin、PIPES、glycin或至少兩種所述緩沖劑的混合物。選擇緩沖劑濃度范圍，以保持溶液的優(yōu)選pH。緩沖劑也可能是至少兩種緩沖劑的混合物，其中該混合物能夠提供特定范圍的pH值。在另選實(shí)施方案中，該緩沖劑的濃度范圍為約1mM-100mM；1mM-約50mM；約1mM-約25mM；約2mM-約20mM；或約10mM。任選該組合物還可能包含表面活性劑或去污劑?！灞砻婊钚詣寤颉迦ノ蹌逋ǔ０ūＷo(hù)蛋白質(zhì)防止空氣/溶液界面所致應(yīng)力以及溶液/表面所致應(yīng)力(例如引起蛋白質(zhì)凝聚)的試劑。去污劑優(yōu)選非離子去污劑，包括但不限于聚山梨酯(例如Tween)，例如聚山梨酯20或80；聚乙烯烷基醚或泊洛沙姆，例如泊洛沙姆188或407(例如Pluronic多元醇)及其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物，或聚乙二醇(PEG)例如PEG8000。表面活性劑的存在量為約0.005-約2.0％。任選該組合物可能包括抗氧化劑?？寡趸瘎┌ǖ幌抻诳箟难帷腚装彼?、高半胱氨酸、胱氨酸、胱硫醚(cysstathionine)、甲硫氨酸、谷胱甘肽及其它包含半胱氨酸或甲硫氨酸的肽，特別是具有2-5個(gè)氨基酸殘基的肽，其中至少一個(gè)殘基是甲硫氨酸或半胱氨酸殘基；優(yōu)選甲硫氨酸、特別是L-甲硫氨酸。包含抗氧化劑的濃度為0.1-5mg/ml，例如0.1-4、0.1-3、0.1-2或0.5-2mg/ml。該組合物中可能包括防腐劑，以阻止微生物生長(zhǎng)，從而提供FVII多肽的″多次使用″包裝。防腐劑包括酚、苯甲醇、鄰甲酚、間甲酚、對(duì)甲酚、羥苯甲酸甲酯、對(duì)羥苯甲酸丙酯、benzalconiumchloride或benzaethoniumchloride。一般包含防腐劑的濃度為0.1-20mg/ml，取決于pH范圍和防腐劑類(lèi)型。任選該組合物也可能包括能夠抑制脫酰胺作用的試劑。此處所用的特定量可理解為±約10％，例如約50mM包括50mM±5mM；例如4％包括4％±0.4％等。涉及溶于溶液中的固體以及混入溶液中的液體時(shí)，均為百分比(重量/重量)。例如，對(duì)于Tween，即為100％儲(chǔ)液重量/溶液重量。術(shù)語(yǔ)″離子強(qiáng)度″為溶液的離子強(qiáng)度(μ)，由下式定義μ＝1/2∑([i](Zi2))，其中μ是離子強(qiáng)度，[i]是某一離子的摩爾濃度，Zi是該離子的電荷(+或-)(JamesFritzandGeorgeSchenkQuantitativeAnalyticalChemistry，1979)。在本發(fā)明不同實(shí)施方案中，該組合物的離子強(qiáng)度為至少50，例如至少75、100150、200、250、400、500、650、800、1000、1200、1600、2000、2400、2800或至少3200。術(shù)語(yǔ)″等滲″是指″與血清等滲″，即約300±50毫滲(milliosmol)/kg。張力是指測(cè)定給藥前溶液的重量摩爾滲透壓濃度。術(shù)語(yǔ)″高滲″是指高于血清生理水平的重量摩爾滲透壓濃度水平，例如高于300±50毫滲/kg的水平。術(shù)語(yǔ)″藥物有效量″或″有效量″是由有資格的專(zhuān)業(yè)人員(qualifiedpractitioner)確定的有效劑量，他可能滴定以獲得所需反應(yīng)的劑量。劑量的考慮因素包括效力、生物利用度、所需藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)特征、治療條件、患者相關(guān)因素(例如重量、健康、年齡等)、存在共同給予的藥劑(例如抗凝劑)、給藥時(shí)間或醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)人員已知的其它因素。術(shù)語(yǔ)″治療″定義為，為了對(duì)抗疾病、病態(tài)或紊亂而處理和照料受試者，例如哺乳動(dòng)物，特別是人，包括給予因子VII多肽，以防止癥狀或并發(fā)癥發(fā)作，或減輕癥狀或并發(fā)癥，或消除疾病、病態(tài)或紊亂。本發(fā)明包含因子VII多肽的藥物組合物可能經(jīng)非腸道途徑給予需要該治療的受試者?？赡芾米⑸淦?、可選筆式注射器，通過(guò)皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行非腸道給藥。或者，利用輸注泵進(jìn)行非腸道給藥。因子VIIa的濃度以mg/mL或IU/mL表示，1mg通常代表43000-56000IU或以上。使用方法本發(fā)明的制劑可能用于治療任何對(duì)因子VII有反應(yīng)的綜合征，例如出血性疾病，包括而非限制，由凝血因子缺陷(例如血友病A和B，或凝血因子X(jué)I或VII缺陷)、血小板減少或血管性血友病、或凝血因子抑制劑、或任何原因的過(guò)量出血所致出血性疾病。該制劑也可能給予與手術(shù)或其它創(chuàng)傷有關(guān)的患者，或給予接受抗凝劑治療的患者。根據(jù)本發(fā)明配制的因子VII多肽術(shù)語(yǔ)″人因子VII″或″FVII″表示利用包括天然來(lái)源提取和純化、以及重組細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)在內(nèi)的方法產(chǎn)生的人因子VII。其序列和特征如例如美國(guó)專(zhuān)利4,784,950所述。該術(shù)語(yǔ)也包括生物學(xué)活性的人因子VII等價(jià)物，例如全序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸不同。此外，本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)是用來(lái)包括因子VII的置換、缺失和插入氨基酸變體、或翻譯后修飾。此處所用″因子VII多肽″包括而非限制，因子VII以及因子VII相關(guān)多肽。因子VII相關(guān)多肽包括而非限制，具有相對(duì)于人因子VII化學(xué)修飾的、和/或包含一個(gè)或多個(gè)相對(duì)于人因子VII的氨基酸序列改變(即因子VII變體)、和/或包含相對(duì)于人因子VII的截短的氨基酸序列(即因子VII片段)的因子VII多肽。該因子VII相關(guān)多肽可能具有相對(duì)于人因子VII的不同性質(zhì)，包括穩(wěn)定性、磷脂結(jié)合、改變的比活性等。術(shù)語(yǔ)″因子VII″是用來(lái)包括未斷裂(酶原)形式的因子VII多肽，以及經(jīng)過(guò)蛋白水解加工產(chǎn)生相應(yīng)生物活性形式的因子VII多肽，可能稱(chēng)作因子VIIa。因子VII典型在殘基152和153之間斷裂，產(chǎn)生因子VIIa。術(shù)語(yǔ)″因子VII″還用來(lái)包括而非限制，具有野生型人因子VII(如美國(guó)專(zhuān)利4,784,950公開(kāi))1-406氨基酸序列的多肽，以及來(lái)源于其它物種的野生型因子VII，例如牛、豬、犬、鼠和鮭魚(yú)的因子VII。另外包括可能在個(gè)體之間存在和發(fā)生的因子VII的天然等位基因變體。并且，糖基化或其它翻譯后修飾的程度和定位可能因所選宿主細(xì)胞及宿主細(xì)胞環(huán)境的性質(zhì)而改變。此處所用″因子VII相關(guān)多肽″包括而非限制，表現(xiàn)與野生型人因子VII基本類(lèi)似或提高的生物學(xué)活性的多肽。這些多肽包括而非限制，化學(xué)修飾的因子VII或因子VIIa，以及因子VII變體，其中引入了可修飾或破壞該多肽生物活性的特定氨基酸序列改變。其另外包括帶有略微修飾的氨基酸序列的多肽，例如具有包括N端氨基酸缺失或添加的修飾N端的多肽，和/或相對(duì)于人因子VIIa化學(xué)修飾的多肽。表現(xiàn)與野生型因子VII基本相同或更好生物活性的因子VII相關(guān)多肽、包括多肽變體，包括而非限制，通過(guò)插入、缺失或置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸而具有不同于野生型因子VII的氨基酸序列的多肽。具有與野生型因子VIIa基本相同或提高的生物學(xué)活性的因子VII相關(guān)多肽、包括變體，包括那些在本說(shuō)明書(shū)所述一種或多種凝結(jié)分析、蛋白水解分析或TF結(jié)合分析中進(jìn)行測(cè)試時(shí)，表現(xiàn)至少約25％、優(yōu)選至少約50％、更優(yōu)選至少約75％、更優(yōu)選至少約100％、更優(yōu)選至少約110％、更優(yōu)選至少約120％、最優(yōu)選至少約130％的產(chǎn)生于相同類(lèi)型細(xì)胞的野生型因子VIIa的比活性的變體。在某些實(shí)施方案中，該因子VII多肽是因子VII相關(guān)多肽、特別是變體，其中在″體外蛋白水解分析″(參見(jiàn)下文″分析″)中進(jìn)行測(cè)試時(shí)，所述因子VII多肽的活性與天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之比至少約1.25；在其它實(shí)施方案中，該比值至少約2.0；在另外實(shí)施方案中，該比值至少約4.0。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，該因子VII多肽是因子VII等價(jià)物、特別是變體，其中在″體外蛋白水解分析″(參見(jiàn)下文″分析″)中進(jìn)行測(cè)試時(shí)，所述因子VII多肽的活性與天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之比至少約1.25；在其它實(shí)施方案中，該比值至少約2.0；在另外實(shí)施方案中，該比值至少約4.0；在另外實(shí)施方案中，該比值至少約8.0。在某些實(shí)施方案中，該因子VII多肽是人因子VII，例如美國(guó)專(zhuān)利4,784,950所公開(kāi)(野生型因子VII)。在某些實(shí)施方案中，該因子VII多肽是人因子VIIa。在一系列實(shí)施方案中，因子VII多肽包括表現(xiàn)至少約90％、優(yōu)選至少約100％、優(yōu)選至少約120％、更優(yōu)選至少約140％、最優(yōu)選至少約160％的人因子VIIa的生物學(xué)比活性的多肽。在某些實(shí)施方案中，該因子VII多肽通過(guò)插入、缺失或置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸而具有不同于野生型因子VII的氨基酸序列。在一系列實(shí)施方案中，因子VII多肽包括表現(xiàn)與野生型因子VII(如美國(guó)專(zhuān)利4,784,950所公開(kāi))的序列至少約70％、優(yōu)選至少約80％、更優(yōu)選至少約90％、最優(yōu)選至少約95％一致性的多肽。使用合適的供序列比對(duì)的計(jì)算機(jī)程序，例如ClustalW程序1.8，1999版(Thompson等人，1994，NucleicAcidRe-search，224673-4680)，可以從比對(duì)的序列中方便確定氨基酸序列的同源性/一致性。具有與野生型因子VII基本相同或提高的生物學(xué)活性的因子VIIVII變體的非限制性例子包括，S52A-FVII、S60A-FVII(lino等人，Arch.Biochem.Biophys.352182-192，1998)；L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374PFVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII和S336G-FVII；WO01/83725和WO02/22776公開(kāi)的表現(xiàn)提高的TF非依賴性活性的FVIIa變體；美國(guó)專(zhuān)利5,580,560公開(kāi)的表現(xiàn)提高的蛋白水解穩(wěn)定性的FVIIa變體；在殘基290和291之間或殘基315和316之間經(jīng)蛋白水解斷裂的FactorVIIa(Mollerup等人，Biotechnol.Bioeng.48501-505，1995)；以及氧化形式的FactorVIIa(Korn-felt等人，Arch.Biochem.Biophys.36343-54，1999)。因子VII多肽的生物學(xué)活性因子VIIa在凝血中的生物學(xué)活性來(lái)源于其能夠(i)結(jié)合組織因子(TF)以及(ii)催化因子IX或因子X(jué)的蛋白水解斷裂，產(chǎn)生活化的因子IX或X(分別為因子IXa或Xa)。為了本發(fā)明，可能使用因子VII缺陷血漿和促凝血酶原激酶，通過(guò)測(cè)定某一制劑促進(jìn)凝血的能力，來(lái)定量因子VII多肽的生物學(xué)活性(″因子VII生物學(xué)活性″)，如美國(guó)專(zhuān)利5,997,864或WO92/15686所述。在該分析中，將生物學(xué)活性表示為相比對(duì)照樣品凝結(jié)時(shí)間的減少，并通過(guò)與包含1個(gè)單位/ml因子VII活性的混合人血清標(biāo)準(zhǔn)作比較，轉(zhuǎn)換為″因子VII單位″?；蛘?，可能如下定量因子VIIa的生物學(xué)活性-在包含TF(包埋于脂膜中)和因子X(jué)的體系中，測(cè)定因子VIIa或因子VII相關(guān)多肽產(chǎn)生活化因子X(jué)(因子X(jué)a)的能力(Persson等人，J.Biol.Chem.27219919-19924，1997)；-在含水體系中測(cè)定因子X(jué)水解作用(″體外蛋白水解分析″，參見(jiàn)下文)；-使用基于表面胞質(zhì)基因共振(Surfaceplasmonresonance)的儀器，測(cè)定因子VIIa或因子VII相關(guān)多肽與TF的物理結(jié)合(Persson，F(xiàn)EBSLetts.413359-363，1997)；以及-測(cè)定因子VIIa和/或因子VII相關(guān)多肽對(duì)合成底物的水解作用(″體外水解分析″，參見(jiàn)下文)；以及-在TF非依賴性體外系統(tǒng)中測(cè)定凝血酶的產(chǎn)生。適于測(cè)定因子VII多肽生物學(xué)活性的分析通過(guò)簡(jiǎn)單初步的體外測(cè)試進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆治?，可能選擇用于本發(fā)明的因子VII多肽。因此，本說(shuō)明書(shū)公開(kāi)了因子VII多肽活性的簡(jiǎn)單測(cè)試(名為″體外水解分析″)。體外水解分析(分析1)可能分析天然(野生型)因子VIIa和因子VII多肽(此處均稱(chēng)為″因子VIIa″)的比活性。也可能平行分析，以直接比較其比活性。該分析在微孔板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)中進(jìn)行。將生色底物D-Ile-Pro-Arg-對(duì)硝基酰苯胺(p-nitroanilide)(S-2288，Chromogenix，Sweden)(終濃度1mM)加入處于50mMHepes，pH7.4(其中包含0.1MNaCl、5mMCaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白)的因子VIIa(終濃度100nM)中。在SpectraMaxTM340平板讀取儀(MolecularDevices，USA)中，連續(xù)測(cè)定405nm吸光度。使用溫育20分鐘產(chǎn)生的吸光度，減去不含酶的空白孔的吸光度，計(jì)算因子VII多肽與野生型因子VIIa的活性之比比值＝(A405nm因子VII多肽)/(A405nm因子VIIa野生型)基于此，可能鑒定活性低于、相當(dāng)于或高于天然因子VIIa的因子VII多肽，例如因子VII多肽與天然因子VII(野生型FVII)的活性比值為1.0上下的因子VII多肽。使用生理學(xué)底物，例如適當(dāng)濃度100-1000nM的因子X(jué)(″體外蛋白水解分析″)，在加入合適生色底物(例如S-2765)之后測(cè)定所產(chǎn)生的因子X(jué)a，也可能測(cè)定因子VII多肽活性。此外，可能在生理溫度下進(jìn)行活性分析。體外蛋白水解分析(分析2)可能平行分析天然(野生型)因子VIIa和因子VII多肽(此處均稱(chēng)為″因子VIIa″)，直接比較其比活性。該分析在微孔板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)中進(jìn)行。將處于100μL50mMHepes，pH7.4(包含0.1MNaCl、5mMCaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白)中的因子VIIa(10nM)和因子X(jué)(0.8μM)溫育15分鐘。然后通過(guò)加入含有0.1MNaCl、20mMEDTA和1mg/ml牛血清白蛋白的50μL50mMHepes，pH7.4，來(lái)終止因子X(jué)的斷裂。通過(guò)加入生色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-對(duì)硝基酰苯胺(S-2765，Chromogenix，Sweden)(終濃度0.5mM)，測(cè)定所產(chǎn)生的因子X(jué)a的數(shù)量。在SpectraMaxTM340平板讀取儀(MolecularDevices，USA)中，連續(xù)測(cè)定405nm處吸光度。使用10分鐘產(chǎn)生的吸光度，減去不含F(xiàn)VIIa的空白孔的吸光度，計(jì)算因子VII多肽與野生型因子VIIa的蛋白水解活性之比比值＝(A405nm因子VII多肽)/(A405nm因子VIIa野生型)基于此，可能鑒定活性低于、相當(dāng)于或高于天然因子VIIa的因子VII多肽，例如因子VII多肽與天然因子VII(野生型FVII)的活性比值為1.0上下的因子VII多肽。在包含生理濃度的所有相關(guān)凝血因子和抑制劑(模擬血友病A狀況時(shí)缺少因子VIII)以及激活的血小板的分析中(分析4)，也可以測(cè)定因子VIIa或因子VII多肽產(chǎn)生凝血酶的能力(如Monroe等人(1997)Brit.J.Haematol.99，542-547中543頁(yè)所述，在此引入以供參考)。使用基本如WO92/15686或US5,997,864所述一段式凝結(jié)分析(分析4)，也可能測(cè)定因子VII多肽的活性。簡(jiǎn)言之，在50mMTris(pH7.5)、0.1％BSA中稀釋待測(cè)樣品，將100μl樣品與100μl因子VII缺陷血漿和200μl包含10mMCa2+的促凝血酶原激酶C溫育。測(cè)定凝結(jié)時(shí)間，與使用系列稀釋的參考標(biāo)準(zhǔn)或檸檬酸抗凝的正常人血漿混合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較。因子VII多肽的制備與純化優(yōu)選通過(guò)DNA重組技術(shù)，例如Hagen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA832412-2416，1986或歐洲專(zhuān)利200.421(ZymoGenetics，Inc.)所述，制備適用于本發(fā)明的純化的人因子VIIa。也可能利用Broze和Majerus，J.Biol.Chem.255(4)1242-1247，1980以及Hedner和Kisiel，J.Clin.Invest.711836-1841，1983所述方法制備因子VII。這些方法產(chǎn)生不含可檢測(cè)量其它凝血因子的因子VII。包括另外的凝膠過(guò)濾作為最后純化步驟，可能獲得甚至更純的因子VII制劑。然后通過(guò)已知方法，例如利用若干不同的血漿蛋白質(zhì)，諸如因子X(jué)IIa、IXa或Xa，將因子VII轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨蜃覸IIa?；蛘撸鏐joern等人(ResearchDisclosure，269September1986，564-565頁(yè))所述，將其通過(guò)離子交換層析柱例如MonoQ(PharmaciafineChemicals)等、或在溶液中自身活化，可能活化因子VII。因子VII相關(guān)多肽也可能通過(guò)修飾野生型因子VII、或通過(guò)重組技術(shù)而制備。利用已知方法，例如位點(diǎn)特異性誘變，通過(guò)在編碼天然因子VII的核酸中改變氨基酸密碼子或去除某些氨基酸密碼子而修飾編碼野生型因子VII的核酸序列，可能制備與野生型因子VII相比具有改變的氨基酸序列的因子VII相關(guān)多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，可以在因子VIIa分子的功能決定性區(qū)之外造成置換，而仍產(chǎn)生活性多肽?？赡芾帽绢I(lǐng)域已知的方法，例如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(參見(jiàn)例如Cunningham和Wells，1989，Science2441081-1085)，來(lái)鑒定為因子VII多肽活性所必需的氨基酸殘基，從而優(yōu)選不進(jìn)行置換。后一技術(shù)在分子中的每一正電殘基處引入突變，測(cè)試所得突變分子作為促凝劑的各自交聯(lián)活性，以鑒定為該分子活性所必需的氨基酸殘基。通過(guò)分析由諸如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記技術(shù)所確定的三維結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)例如deVos等人，1992，Science255306-312；Smith等人，1992，JournalofMolecularBiology224899-904；Wlodaver等人，1992，F(xiàn)EBSLetters30959-64)，也可以測(cè)定底物-酶相互作用位點(diǎn)。使用本領(lǐng)域已知的任何方法，可能通過(guò)定點(diǎn)誘變?cè)诤怂嵝蛄兄幸胪蛔?，使一個(gè)核苷酸交換為另一核苷酸。特別有用的方法是利用帶有目的插入序列的超螺旋雙鏈DNA載體以及包含所需突變的兩條合成引物。寡核苷酸引物分別與載體的相反鏈互補(bǔ)，利用PfuDNA聚合酶在溫度循環(huán)期間延伸。摻入引物后，產(chǎn)生包含交錯(cuò)切口的突變質(zhì)粒。溫度循環(huán)之后，利用特異性針對(duì)甲基化和半甲基化DNA的Dpnl處理產(chǎn)物，消化親本DNA模板，選擇包含突變的合成DNA。也可能使用本領(lǐng)域已知的形成、鑒定和分離變體的其它方法，例如基因改組或噬菌體展示技術(shù)?？赡芾帽绢I(lǐng)域已知的任何方法從其起源細(xì)胞中分離多肽，包括而非限制，從粘附細(xì)胞培養(yǎng)物中移出包含目的產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)基；離心或過(guò)濾去除未粘附細(xì)胞等。任選可能進(jìn)一步純化因子VII多肽。可能使用本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行純化，包括而非限制，親和層析例如因子抗因子VII抗體柱(參見(jiàn)例如Wakabayashi等人，J.Biol.Chem.26111097，1986；以及Thim等人，Biochem.277785，1988)；疏水相互作用層析；離子交換層析；大小排阻層析；電泳方法(例如制備型等電聚焦(IEF))、不同溶解度(例如硫酸銨沉淀)或提取等。通常參見(jiàn)Scopes，ProteinPurification，Springer-Verlag，NewYork，1982以及ProteinPurification，J.C.Janson和LarsRyden編者，VCHPublishers，NewYork，1989。純化以后，制備物優(yōu)選包含按重量計(jì)少于約10％、更優(yōu)選少于約5％、最優(yōu)選少于約1％的來(lái)源于宿主細(xì)胞的非因子VII多肽?？赡苁褂靡蜃覺(jué)IIa或具有胰蛋白酶樣特異性的其它蛋白酶，例如因子IXa、激肽釋放酶、因子X(jué)a和凝血酶，通過(guò)蛋白水解斷裂而活化因子VII多肽。參見(jiàn)例如Osterud等人，Biochem.112853(1972)；Thomas，美國(guó)專(zhuān)利4,456,591；以及Hedner等人，J.Clin.Invest.711836(1983)?；蛘?，將其通過(guò)離子交換層析柱例如MonoQ(Pharmacia)等、或在溶液中自身活化，可能活化因子VII多肽。所得活化因子VII多肽然后可能如本申請(qǐng)所述配制和給藥。附圖描述圖1顯示在2-8℃保存3個(gè)月以后，F(xiàn)VII凝聚物和FVII片段的含量。以下實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施。這些實(shí)施例僅為說(shuō)明目的，并非意在以任何方式限制本發(fā)明所要求的范圍。實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例實(shí)施例1分析方法利用非變性大小排阻HPLC測(cè)定凝聚物含量。由RP-HPLC測(cè)定氧化形式的含量。由RP-HPLC測(cè)定酶促降解形式的含量。在WatersProteinPak300SW柱7,5×300mm上，使用0.2M硫酸銨、5％2-丙醇pH7,0為流動(dòng)相，進(jìn)行非變性大小排阻層析。流速0.5ml/分鐘。檢測(cè)215nm。上樣25μgFVIIa。在粒子大小5μm、孔徑300的專(zhuān)利4,5×250mm丁基鍵合硅柱上進(jìn)行反相HPLC。柱溫70℃。A-緩沖液0.1％v/v三氟乙酸。B-緩沖液0.09％v/v三氟乙酸、80％v/v乙腈。利用30分鐘內(nèi)從X至(X+13)％B的線性梯度洗脫柱子。調(diào)整X，以便FVIIa在保留時(shí)間約26分鐘洗脫。流速1.0ml/分鐘。檢測(cè)214nm。上樣25μgFVIIa。實(shí)施例2組合物制備一般而言，通過(guò)凝膠過(guò)濾柱交換緩沖液，從純化的原液中制備供這些實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例分析的含水FVIIa組合物樣品。組合物添加劑按最終比例包含于洗脫緩沖液中、或加入洗脫物中。所得溶液使用無(wú)菌膜濾器(0.2μm孔徑或相當(dāng))無(wú)菌過(guò)濾，裝入無(wú)菌玻璃瓶，利用丁基橡膠塞和flip-off型鋁帽蓋緊并密封。實(shí)施例3pH對(duì)化學(xué)/物理穩(wěn)定性的作用rFVIIa含水組合物的小瓶包含1.4mgrFVIIa/mL、50mM氯化鈉、10mM氯化鈣以及調(diào)到pH3、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0的10mM甘氨酰甘氨酸、乙酸和組氨酸混合物，于溫度2-8℃、或升高的保存溫度30℃下溫育，然后在不同時(shí)間點(diǎn)取出，利用RP-HPLC和GP-HPLC分析pH和化學(xué)穩(wěn)定性的變化。2-8℃保存長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月之后，該含水組合物顯示pH變化不顯著。對(duì)2-8℃保存長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月的樣品進(jìn)行非變性大小排阻HPLC，顯示該藥物產(chǎn)品在pH≥5.5未顯著凝聚(圖1)。對(duì)這些樣品進(jìn)行RP-HPLC，顯示在pH4.5-5.5范圍內(nèi)該蛋白質(zhì)的片段化或氧化未顯著增加。圖1顯示2-8℃保存3個(gè)月后的數(shù)據(jù)。開(kāi)始的凝聚物含量約0.5％，開(kāi)始的片段含量約9％。實(shí)施例4不同緩沖液的緩沖容量rFVIIa含水組合物的小瓶包含1.4mgrFVIIa/mL、50mM氯化鈉、10mM氯化鈣以及濃度為10mM的一種下列緩沖物質(zhì)甘氨酰甘氨酸、蘋(píng)果酸、組氨酸、谷氨酸和檸檬酸，于溫度2-8℃、或升高的保存溫度30℃下溫育長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月。調(diào)整零時(shí)的pH為5.5，因該pH產(chǎn)生的降解產(chǎn)物量最低(圖1)。測(cè)定包含甘氨酰甘氨酸的組合物的pH，顯示在保存期間升高到6.2。其它組合物在同一時(shí)期顯示5.5+/-0.1的穩(wěn)定值。實(shí)施例5包含不同去污劑的含水組合物的物理穩(wěn)定性制備了12種不同的組合物。該組合物為rFVIIa0.75mg/mlNaCl2.92mg/mlCaCl2，2H2O1.47mg/ml甘氨酰甘氨酸1.32mg/ml去污劑/溶解劑xmg/mlpH5.5所測(cè)試的去污劑/溶解劑(solubiliser)的濃度如下表所述。從rFVIIa的液體原液中制備該組合物。在包含上述濃度的NaCl、CaCl2，2H2O和甘氨酰甘氨酸的緩沖液中制備去污劑/溶解劑的儲(chǔ)液。將rFVIIa原液和去污劑溶液混合，調(diào)整溶液pH到5.5。將組合物過(guò)濾(0.2μm)，并裝入小瓶(1ml溶液/瓶)。通過(guò)視覺(jué)檢查測(cè)定組合物外觀，并測(cè)定組合物400nm處吸光度。然后小瓶在室溫下振搖19小時(shí)(800/分鐘)。振搖完成后，測(cè)定外觀及400nm處吸光度。結(jié)果如下表所列?！錚art.″＝″顆粒″該結(jié)果表明，參照(未加任何去污劑/溶解劑)在振搖時(shí)變得視覺(jué)可見(jiàn)的渾濁，觀察到400nm處吸光度顯著升高。加入Tween20(＝聚山梨酯20)、Tween80(＝聚山梨酯80)、泊洛沙姆188、PluronicF127(＝泊洛沙姆407)、Brij35(＝聚乙二醇23十二烷基醚)和LPCM(＝α-十四烷酰溶血卵磷脂)幾乎完全防止?jié)岫群臀舛壬撸^察到Myrj59(＝硬脂酸100聚羥氧基酯)和Myrj52(＝硬脂酸40聚羥氧基酯)的濁度略微升高(相比參照)。甘油、聚乙二醇400或聚乙二醇4000在本實(shí)驗(yàn)所用濃度下不能防止?jié)岫壬?。?shí)施例6包含抗氧化劑甲硫氨酸的含水組合物的化學(xué)穩(wěn)定性制備了3種不同的組合物。該組合物為rFVIIa0.75mg/mlNaCl2.92mg/mlCaCl2，2H2O1.47mg/ml甘氨酰甘氨酸1.32mg/ml甲硫氨酸0或0.25或1.0mg/mlpH6.5從rFVIIa的液體原液中制備該組合物。將甲硫氨酸溶解于包含上述濃度NaCl、CaCl2，2H2O和甘氨酰甘氨酸的緩沖液中。將rFVIIa原液和甲硫氨酸溶液混合，調(diào)整溶液pH到6.5。將組合物過(guò)濾(0.2μm)，并裝入小瓶(1ml溶液/瓶)。將小瓶保存于5℃、25℃和40℃。取出樣品，在下表所述時(shí)間點(diǎn)分析其氧化形式的含量(利用RP-HPLC)。下表顯示氧化形式的含量(％)。該結(jié)果表明，加入甲硫氨酸減慢了組合物的氧化速率。實(shí)施例7包含氯化鈣的含水組合物的化學(xué)穩(wěn)定性制備了4種不同的組合物。該組合物為rFVIIa1.0mg/mlNaCl2.92mg/mlCaCl2，2H2O分別為1.47mg/ml(10mM)、29.4mg/mL(200mM)、58.8mg/mL(400mM)以及117.6mg/mL(800mM)甘氨酰甘氨酸1.32mg/mlpH7.0從rFVIIa的液體原液中制備該組合物。將氯化鈣溶解于包含NaCl和甘氨酰甘氨酸的緩沖液中，在與rFVIIa原液混合后產(chǎn)生上述濃度。混合后調(diào)整溶液的pH到7.0。將組合物過(guò)濾(0.2μm)，并裝入小瓶(1ml溶液/瓶)。小瓶于5℃保存。利用凝結(jié)分析測(cè)定因子VII活性(IU/ml)。權(quán)利要求1.一種液體含水組合物，其包含(i)因子VII多肽；(ii)適合保持pH在約4.0-約8.0范圍內(nèi)的試劑；(iii)選自以下的試劑鈣鹽、鎂鹽或其混合物；其中(iii)的濃度至少15mM。2.權(quán)利要求1的組合物，其還包含(iv)離子強(qiáng)度改變劑。3.權(quán)利要求2的組合物，其中該離子強(qiáng)度改變劑(iv)選自中性鹽例如氯化鈉；氨基酸；或小肽，或至少兩種所述改變劑的混合物。4.權(quán)利要求3的組合物，其中該離子強(qiáng)度改變劑(iv)是氯化鈉。5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的組合物，其中試劑(iii)存在的濃度為至少約25mM，例如至少約50mM、100mM、200mM、400mM或至少約800mM。6.權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)的組合物，其中試劑(iv)存在的濃度為至少約5mM，例如至少約10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、400mM、800mM、1000mM、1200mM、1500mM、1800mM、2000mM或至少約2200mM。7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物，其中鈣鹽選自氯化鈣、乙酸鈣、葡萄糖酸鈣和乙酰丙酸鈣。8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的組合物，其中鎂鹽選自氯化鎂、乙酸鎂、硫酸鎂、葡萄糖酸鎂和乙酰丙酸鎂。9.權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的組合物，其中試劑(iii)選自氯化鈣、乙酸鈣、氯化鎂、乙酸鎂、硫酸鎂或其混合物；并且其中該離子強(qiáng)度改變劑(iv)是氯化鈉。10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的組合物，其還包含(v)張力改變劑。11.權(quán)利要求10的組合物，其中該張力改變劑(v)選自中性鹽；單-、雙-或多糖；糖醇；氨基酸；或小肽，或至少兩種所述改變劑的混合物。12.權(quán)利要求10或11的組合物，其中該張力改變劑(v)存在的濃度為1mM-500mM。13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述濃度為10-250mM。14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的組合物，其還包含(vi)非離子表面活性劑。15.權(quán)利要求14的組合物，其中該非離子表面活性劑是聚山梨酯或泊洛沙姆或聚氧乙烯烷基醚，例如泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、聚山梨酯20、聚山梨酯80或聚氧23十二烷基醚。16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的組合物，其還包含(vii)抗氧化劑。17.權(quán)利要求16的組合物，其中該抗氧化劑(vii)選自L-或D-甲硫氨酸、甲硫氨酸類(lèi)似物、包含甲硫氨酸的肽、甲硫氨酸同系物、抗壞血酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、胱氨酸和胱硫醚。18.權(quán)利要求17的組合物，其中該抗氧化劑為L(zhǎng)-甲硫氨酸。19.權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)的組合物，其中該抗氧化劑存在的濃度為約0.1-約5.0mg/ml，例如約0.1-約4mg/ml、約0.1-約3mg/ml、約0.1-約2mg/ml、或約0.5-約2mg/ml。20.權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的組合物，其中pH保持在約4.0-約7.0范圍內(nèi)，如約4.5-約7.0、約5.0-約7.0、約5.5-約7.0、或約6.0-約7.0。21.權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的組合物，其中適于將pH保持在約4.0-約7.0范圍內(nèi)的試劑選自下列酸和其鹽檸檬酸、乙酸、組氨酸、蘋(píng)果酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、MES、HEPES、咪唑、TRIS、乳酸、glycylglycin、PIPES、glycin或至少兩種所述試劑的混合物。22.權(quán)利要求21的組合物，其中該試劑的濃度為約1mM-約50mM。23.權(quán)利要求22的組合物，其中緩沖液濃度約10mM。24.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的組合物，其還包含(viii)防腐劑，例如苯酚、苯甲醇、鄰甲酚、間甲酚、對(duì)甲酚、羥苯甲酸甲酯、對(duì)羥苯甲酸丙酯、benzalconiumchloride或benzaethoniumchloride。25.權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的組合物，它是等滲的。26.權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的組合物，它配制成用于給藥。27.權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的組合物，它在2-8℃穩(wěn)定至少6個(gè)月。28.權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)的組合物，其中因子VII多肽是人因子VIIa，優(yōu)選重組制備的人因子VIIa。29.權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)的組合物，其中因子VII多肽是因子VII序列變體。30.權(quán)利要求29的組合物，按本說(shuō)明書(shū)所述″體外蛋白水解分析″測(cè)試時(shí)，其中因子VII多肽活性與天然人因子VIIa(野生型FVIIa)活性之比為至少約1.25，優(yōu)選至少約2.0或4.0，最優(yōu)選至少約8.0。31.權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)的組合物，其中該因子VII多肽存在的濃度為約0.1-約10mg/ml，例如約0.5-約5.0mg/ml、約0.6-約4.0mg/ml、或約1.0-約4.0mg/ml。32.制備因子VII多肽的液體含水組合物的方法，其包括提供在溶液中的因子VII多肽的步驟，該溶液包含(ii)適合保持pH在約4.0-約8.0范圍內(nèi)的試劑；(iii)選自以下的試劑鈣鹽、鎂鹽或其混合物，其中(iii)的濃度為至少15mM。33.權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)的組合物在制備用于治療對(duì)因子VII有反應(yīng)的綜合征的藥物中的用途。34.治療對(duì)因子VII有反應(yīng)的綜合征的方法，該方法包括給予有此需要的受試者有效量的含水液體組合物，其包含(i)因子VII多肽，(ii)適合保持pH在約4.0-約8.0范圍內(nèi)的試劑；(iii)選自以下的試劑鈣鹽、鎂鹽或其混合物，其中(iii)的濃度為至少15mM。全文摘要一種液體含水組合物，其包含(i)因子VII多肽，(ii)適合保持pH約4.0－8.0的試劑；(iii)選自以下的試劑鈣鹽、鎂鹽或其混合物，其中(iii)的濃度至少15mM。文檔編號(hào)A61K47/16GK1607958SQ02825877公開(kāi)日2005年4月20日申請(qǐng)日期2002年12月20日優(yōu)先權(quán)日2001年12月21日發(fā)明者B·L·漢森,M·B·延森,T·科恩費(fèi)爾特申請(qǐng)人:諾和諾德醫(yī)療保健公司