專利名稱：分枝桿菌疫苗的制作方法
相關申請的交叉引用本申請要求享受于2001年11月14日提交的US臨時申請No.60/335,917的優(yōu)先權，其全部內容在此引用作為參考。
背景技術：
分枝桿菌屬比所有其它屬的細菌聯(lián)合起來引起的痛苦還要嚴重。分枝桿菌分為兩個大類。第一類，結核分枝桿菌(M.tuberculosis)復合體，包括結核分枝桿菌，牛分枝桿菌(M.bovis)，田鼠分枝桿菌(M.microtti)和非洲分枝桿菌(M.africanus)。第二類包括所有其它的種類并被稱為非肺結核分枝桿菌(NTM)或除了結核桿菌(tubercule bacilli)之外的分枝桿菌(MOTT)，其中包括堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)，海分枝桿菌(M.marinum)，猿分支桿菌(M.similae)，瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum)，斯氏分枝桿菌(M.Szulgai)，戈登分枝桿菌(M.gordonae)，鳥分枝桿菌(M.avium)，胞內分枝桿菌(M.intracellulare)，潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)，偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum)，龜分枝桿菌(M.Chelonae)，蟾分枝桿菌(M xenopi)，和瑪爾摩分枝桿菌(M.malmoense)。目前，超過60個分枝桿菌的種已經(jīng)被確定。在所有可培養(yǎng)的分枝桿菌中，只有結核分枝桿菌是一種專性病原體。
由結核分枝桿菌或牛分枝桿菌感染引起的肺結核(TB)仍然是人和動物[1-3]最嚴重的疾病之一，且其在人和動物健康和財力方面仍繼續(xù)給社會帶來巨大的代價(4-7)。目前唯一的可有效預防TB的疫苗是活減毒疫苗，卡介菌(BCG)，它獲自牛結核桿菌。BCG具有理想疫苗的許多特性其生產(chǎn)和給藥是廉價的，其是安全的并已被證明在許多情況下是有效的，特別是抵抗兒童的嚴重性和致死性肺結核(8)。然而，卡介菌已被發(fā)現(xiàn)在許多臨床試驗中產(chǎn)生可變化的效力。在英國醫(yī)學研究委員會進行的試驗中，BCG表現(xiàn)出77％的保護(9)，而另一個極端，在印度進行的大量臨床試驗中其顯示出零保護效力(10)。盡管BCG通常在成人中產(chǎn)生很差的抵抗肺結核的保護，但是其仍然保持“黃金-標準”，參照它來測定效力得到改善的候選TB疫苗。隨著HIV/AIDS廣泛流行的出現(xiàn)，對其的憂慮已經(jīng)超過了BCG的安全。因為BCG在免疫性降低或有缺陷的免疫中可能是病原體(11)，用BCG接種疫苗對于那些處于感染肺結核的最大危險中的個體來說可能是禁忌的。
圍繞BCG的通用效力和安全性缺乏的問題已經(jīng)使得人們更加努力地來發(fā)展新一代的結核菌苗。人們尋求的一種方法是產(chǎn)生需要接種在佐劑中的分枝桿菌的核酸、蛋白質或肽的亞單位疫苗。雖然單獨的蛋白質通常僅僅具有臨界的效力，然而蛋白質混合物的作用卻更好一些(12)，這表明對許多抗原的免疫是完全保護所需要的。這些得到了下列觀察的支持DNA與多價抗原一起接種疫苗對保護效力具有相加效應(13)。另一種方法利用分子遺傳工具來產(chǎn)生對免疫能力減小的宿主來說是減毒的和無毒性的TB復合體的突變型(14)。例如，與氨基酸和嘌呤生物合成有關的基因缺失產(chǎn)生了在有免疫能力的(15，16)和免疫能力嚴重減小的小鼠中均不能長久存留(17)的BCG的營養(yǎng)缺陷型變種。然而突變型能夠足夠長時間地存留來表達代謝性抗原并產(chǎn)生一定程度的保護性免疫。這已經(jīng)表明此種突變型可用于接種處于發(fā)展成免疫降低或免疫缺陷的個體的危險中(17)，盡管人們仍然指望在人或家畜中應用遺傳修飾的活疫苗(14，18)。
基于滅活的分枝桿菌的全細胞制劑的疫苗在傳統(tǒng)上賦予很少的作用，使得對隨后的毒性分枝桿菌的攻擊沒有特定的保護(19-22)，大概因為重要的保護性抗原僅僅當細菌是代謝活性的時候才表達(21，23，24)。對這一點來說有一些例外(25，26)且已經(jīng)提出，就產(chǎn)生的保護性免疫來說，呈遞的特定抗原可能不如它們呈遞的方式重要(27，28)。大多數(shù)用分枝桿菌的滅活制劑進行的接種疫苗研究采用熱作為滅活的方法。然而，這種處理可顯著地使重要的抗原變性且可解釋此疫苗的通常被觀察到的令人失望的結果(29)。
加熱滅活的替代方案為用福爾馬林處理。福爾馬林失活在20世紀20年代首次被用來解毒分離自白喉棒桿菌培養(yǎng)物的白喉毒素(30，31)；該方法仍然被用于疫苗的生產(chǎn)(32)。福爾馬林處理整個分枝桿菌具有生物滅活的優(yōu)點同時保持了所存在的許多蛋白質的抗原完整性(33)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于增強受試者的免疫性或給受試者接種抵抗分枝桿菌感染的疫苗的組合物和方法。尤其是，作為本發(fā)明的一部分，人們發(fā)現(xiàn)分枝桿菌例如，福爾馬林滅活的牛分枝桿菌制劑，與各種非磷脂脂質體助劑(Novasomes)混合，當通過皮下接種給藥于豚鼠時，賦予了對牛分枝桿菌的致死產(chǎn)氣攻擊的保護。相應地，本發(fā)明的組合物和方法包括福爾馬林滅活的分枝桿菌的培養(yǎng)物，例如，來自結核分枝桿菌復合體的分枝桿菌或來自NTM復合體的分枝桿菌，和一種Novasome佐劑。Novasome助劑，正如此處所定義的，為含有非磷脂、甾醇、油類和緩沖液的少層的(pauci lamellar)脂質體且被描述在US專利No.5,474,848中，在此全文引用作為參考。在一個優(yōu)選的實施方案中，Novasome佐劑為NAX M687。
如在此描述的研究所證明的，本發(fā)明的組合物可用于保護免受由分枝桿菌，諸如肺結核所引起的感染。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種含有經(jīng)福爾馬林滅活的分枝桿菌培養(yǎng)物和一種Novasome佐劑的組合物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種通過給受試者施用一種含有分枝桿菌的福爾馬林滅活培養(yǎng)物和Novasome佐劑的組合物，來增強受試者抵抗分枝桿菌的免疫力或給受試者接種抵抗分枝桿菌諸如牛分枝桿菌疫苗的方法。
可利用任意合適的給藥途徑將本發(fā)明的組合物給藥于受試者。典型地，通過注射以適當?shù)牧亢徒o藥方案將該組合物給藥來達到一種治療的效果。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點顯而易見地體現(xiàn)在下面的詳細說明和權利要求中。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于增強受試者的免疫力或給受試者接種抵抗分枝桿菌，諸如肺結核感染的疫苗的組合物和方法。本發(fā)明的組合物包括一種經(jīng)福爾馬林滅活的分枝桿菌培養(yǎng)物和一種Novasome佐劑。本發(fā)明的福爾馬林滅活的分枝桿菌包括結核分枝桿菌復合體的分枝桿菌以及非結核分枝桿菌復合體(NTM)的分枝桿菌二者。
來自結核分枝桿菌復合體的分枝桿菌的實例包括結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、非洲分枝桿菌、和卡介菌(BCG)。來自NTM復合體的分枝桿菌的實例包括，除了其它的以外，堪薩斯分枝桿菌，海分枝桿菌，猿分枝桿菌，瘰疬分枝桿菌，斯氏分枝桿菌，戈登分枝桿菌，鳥分枝桿菌，胞內分枝桿菌，潰瘍分枝桿菌，偶發(fā)分枝桿菌，龜分枝桿菌，蟾分枝桿菌，以及瑪爾摩分枝桿菌。
如這里描述的研究所證明的，正如通過在生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)并接種到嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)的小鼠中所測定的，發(fā)現(xiàn)福爾馬林滅活的培養(yǎng)物完全無活力。福爾馬林-滅活的制劑與一系列的Novasome助劑(由非磷脂，甾醇，油類和緩沖液組成的少層的脂質體)混合并給藥于豚鼠。該制劑在動物中沒有產(chǎn)生不良反應。事實上，許多被處理的豚鼠受到保護而免于被小劑量的活牛分枝桿菌的氣霧劑的攻擊。在某些情況下，保護的水平相當于用黃金-標準疫苗，活的巴氏BCG所達到的保護水平。
基于滅活的全分枝桿菌細胞制劑的疫苗具有其安全方面的優(yōu)點且事實上它們表現(xiàn)為蛋白和非蛋白抗原的復合體混合物。同樣，對滅活的分枝桿菌疫苗的免疫應答與用活的BCG相比較小地受到宿主遺傳學的限制(26)。然而，這種疫苗由于大量的研究報道了它們不能賦予保護性免疫(19-22)而沒有被廣泛地應用。當在研究中發(fā)現(xiàn)此種疫苗是有效的時，不得不應用油佐劑或通過不恰當?shù)耐緩?例如腹膜內)以多劑量服用該疫苗來達到保護(27，38-40)。當皮內給藥時，這樣的疫苗不能產(chǎn)生保護(41)。
本發(fā)明利用適度的福爾馬林固定結合利用新一代非磷脂脂質體助劑(Novasomes)來保持制劑的抗原性，該助劑先前已表明能引起Th1應答(42，43)。如下述研究所證明的，這些制劑提供了相當于用活的BCG達到的抵抗豚鼠中產(chǎn)氣的分枝桿菌攻擊的保護?？捎脝蝿┝康囊呙缃o藥例如皮下給藥，來達到這樣的保護。如對于結核分枝桿菌的報道(21)，滅活的無佐劑的卡介苗沒有賦予抵抗牛分枝桿菌攻擊的保護。然而，福爾馬林-滅活的牛分枝桿菌在沒有佐劑存在時賦予對肺的保護，其表明BCG缺乏可能由牛分枝桿菌表達的與細胞相關聯(lián)的保護性抗原的全部組成成份。
在一個特定的實施方案中，Novasome脂質體被設計成具有凈負電荷。帶負電荷的脂質體比中性的或帶正電荷的脂質體被更迅速地從循環(huán)中除去，更快速地在肝臟、脾和骨髓中定位，以及在肺中更有效地被捕獲(44)。
效力最小的佐劑是NAX 57，其僅僅只有Novasome佐劑而不包括MPL(單磷酰基脂質A)。已經(jīng)顯示MPL在各種分枝桿菌疫苗/攻擊模型中具有佐劑的特性(45-47)且脂質體中的脂質A激活巨噬細胞的抗原呈遞(48，49)。最好的疫苗/佐劑組合是福爾馬林-滅活的牛分枝桿菌加上NAXM687。這些賦予了在統(tǒng)計學上與活巴氏BCG或東京BCG相當?shù)牡挚狗魏推⒅信７种U菌的死亡和生長的保護。NAX M687含有MPL和鯊肝醇，后者同樣具有巨噬細胞激活特性(50)。Novasomes，尤其是NAX M687的佐劑活性，部分歸因于它們的靶向淋巴組織和肺，以及激活巨噬細胞的傾向。所有的Novasomes可通過存在于巨噬細胞中的氧化代謝過程而發(fā)生生物降解(51)，盡管脂質體的融合性影響到在亞細胞的水平上它們的貨物被運載到何處。融合性脂質體直接將它們的貨物呈遞到胞質液，使得抗原能有效地通過MHC I類分子呈遞到CD8+T細胞(52，53)。相比之下，非融合性脂質體將進入內體途徑，其中它們的抗原貨物將被降解，由MHC II類分子呈遞到CD4+T細胞(52，53)。NAX M687是此處描述的唯一的非融合性Novasome。
與所報道的活BCG的抵抗傳播性肺結核的保護能力相一致(54，55)，一些福爾馬林-滅活的BCG疫苗對脾產(chǎn)生顯著的保護，盡管所有的都不能保護肺。福爾馬林-滅活的牛分枝桿菌加NAX M687是唯一保護肺和脾二者免受細菌復制的滅活疫苗。這部分歸因于這樣的事實，不同的與細胞壁相關聯(lián)的抗原負責TB復合體分枝桿菌的組織特異性生長和傳播脂質結核菌醇dimycocerosate(PDIM)是在肺中而不是在脾或肝臟中生長所需要的(56)；且與肝素-結合的血細胞凝集素粘附素(HBHA)是膈肺外傳播所需要的(57)。因為PDIM和HBHA與分枝桿菌的細胞壁相關，針對這些分子(或其它類似的)的免疫應答決定了是否在肺或脾或二者中表現(xiàn)出保護。事實上，用抗HBHA的抗體包被的BCG削弱了鼻內感染之后的細菌的傳播(57)。
無論活的或福爾馬林-滅活的，兩個BCG菌株在抵抗牛分枝桿菌攻擊的效力方面沒有發(fā)現(xiàn)差異。這與早先在小鼠和人中進行的研究相反，巴氏BCG賦予的抵抗結核分枝桿菌的保護水平高于東京BCG(58，59)。巴氏BCG和東京BCG表達了不同量的細胞壁-相關聯(lián)的抗原，MPB83(60)。盡管這種抗原在天然的牛分枝桿菌感染中是免疫顯性的(61，62)且在小鼠中是一種保護性抗原，但是在此處所述的結果表明它不是BCG疫苗的顯性保護性抗原。
本發(fā)明的疫苗制劑在生產(chǎn)上是廉價和安全的(至少與BCG制劑相比)且在幼稚豚鼠中沒有反應原性。
通過下面的實施例對本發(fā)明進行進一步的說明，其不應被理解為是進一步的限制。本申請中引用的所有附圖
和所有參考文獻、專利和公開的專利申請的內容被通過參考文獻引用作為參考。本領域的技術人員應理解，或僅僅利用常規(guī)的試驗能夠確定與本發(fā)明此處描述的特定實施方案等價的方案。目的是此等價的方案被通過以下的實施例和權利要求所包含。
實施例材料和方法細菌菌株和福爾馬林處理巴氏BCG和東京BCG菌株獲自國家血清研究所，哥本哈根，丹麥。用于此研究的牛分枝桿菌菌株(2122/97)在1997年用結核菌素試驗反應器從母牛中分離出來且在VLAWeybridge進行增殖。通過離心來收集培養(yǎng)在添加了0.2％(v/v)甘油(BCG)或4.6mg/ml丙酮酸鈉(牛分枝桿菌)的M-ADC-TW肉湯中的所有菌株的4周齡培養(yǎng)物。以每毫升0.25g濕重的細菌細胞的濃度重新將細菌細胞懸浮在PBS中的1.5％(v/v)福爾馬林中。在4℃攪拌培養(yǎng)物96小時，然后通過在4℃下離心來進行收集。用PBS洗滌福爾馬林-處理的細胞一次并在4℃下保存直到需要使用時。
福爾馬林-失活的確認福爾馬林-處理的細胞的各制劑的等分試樣，代表大約2.5×107個CFU，被置于Middlebrook H10瓊脂+10％(v/v)Middlebrook OADC富集培養(yǎng)基上并培養(yǎng)6個星期。將另外的等量的等分試樣通過后頸皮下注射到3組5個SCID淺褐色小鼠(維持在CAMR)中。將小鼠監(jiān)控12周以觀察其疾病的臨床病征，在第12周時將它們殺死并檢查內臟中的結核損傷的存在。
含有助劑的制劑將各福爾馬林-處理的細胞的制劑與下列的帶負電的Novasome(非磷脂脂質體)助劑混合NAX 57(融合劑；用聚氧乙烯-2-鯨蠟基醚，例如，Brij 56制備)；NAX M57(融合劑；用聚氧乙烯-2-鯨蠟基醚加單磷?；|A(MPL)制備)；NAX M77(融合劑；用聚氧乙烯-2-硬脂?；眩?，Brij71，加MPL制備)；NAX M687(非融合性；用單硬脂酸甘油酯和鯊肝醇加MPL來制備)。利用裝有18規(guī)格針的結核菌素注射器把細胞重新懸浮在佐劑中，然后通過將懸浮液在兩個結核菌素注射器之間來回傳遞40次使細胞完全地均化。以同樣的方式生產(chǎn)各分枝桿菌的對照制劑，但使用無菌水來代替佐劑。
給豚鼠接種疫苗并進行攻擊重量在350-450g之間且無間發(fā)感染的雌性Dunkin Hartley豚鼠獲自Charles River UK Ltd，Margate，UK。將6個豚鼠的組用100μl的各種福爾馬林-處理的疫苗/佐劑制劑在后頸皮下注射免疫，另外6個豚鼠用5×104CFU東京BCG的活的懸浮液免疫。將另外兩個對照組的18只豚鼠單獨用5×104CFU活巴氏BCG或PBS接種。接種疫苗5周后，將所有豚鼠用活的牛分枝桿菌2122/97的懸浮液進行產(chǎn)氣攻擊來達到在大約10個生物體的肺中的吸入保持劑量(35)。用福爾馬林-處理的/水制劑接種給兩個其他的豚鼠疫苗但未攻擊以確定疫苗的無菌性。
豚鼠的尸體解剖在攻擊動物十周后或當個體的最大體重減少20％(人道的端點)時，通過腹膜給動物施用過量戊巴比妥鈉來殺死它，越早越好。死后立即進行檢查。身體狀況的外部評價之后進行頸部，和胸部的以及腹腔的大致的內部檢查。肺被沿著中線切割；將左肺置于5ml的無菌水中用于細菌學研究，將右肺置入到10％克式量濃度的緩沖鹽水中用于隨后的一般檢查。全部脾臟被無菌切掉并置于5ml的無菌蒸餾水中用于細菌學研究。
細菌計數(shù)使用轉動葉片浸漬機系統(tǒng)在5ml無菌蒸餾水中將肺和脾臟均質化。對浸泡物質的系列稀釋物進行活菌計數(shù)并37℃溫育4周后測定分枝桿菌的生長。
統(tǒng)計學分析選擇適當?shù)慕y(tǒng)計學試驗并使用InStat軟件包(版本3.00，GraphPad，San Diego，CA)分析所有的數(shù)據(jù)。費希爾精確檢驗對生存物的數(shù)據(jù)進行分析。由于經(jīng)檢驗并發(fā)現(xiàn)所分析的各組數(shù)據(jù)來自符合正態(tài)分布的群體，因此將不成對的t檢驗用于細菌學數(shù)據(jù)。
實施例1福爾馬林處理致使培養(yǎng)物無活力。
將100μl等分試樣，代表大約2.5×107CFU的福爾馬林處理的巴氏BCG，東京BCG和牛分枝桿菌2122/97，置于固體培養(yǎng)基上并注射到SCID淺褐色小鼠中以檢驗是否福爾馬林處理殺死了分枝桿菌。沒有培養(yǎng)出細菌且所有受攻擊的小鼠存活了12周并且沒有得病的臨床病征。通過尸體解剖，沒有在任何小鼠的內臟中觀察到損傷。
將兩個小鼠用福爾馬林-處理的在水中的牛分枝桿菌接種但不進行攻擊。15周后小鼠被殺死并檢查肺結核的病征。在任一動物的內臟中沒有觀察到損傷并且脾和肺中沒有培養(yǎng)出細菌。
實施例2福爾馬林滅活的Novasome佐劑疫苗保護豚鼠免受牛分枝桿菌的攻擊在已經(jīng)確定福爾馬林滅活疫苗無存活力以后，利用先前描述的豚鼠低劑量牛分枝桿菌氣霧劑攻擊模型來測試它們的保護效力(35)。在整個實驗期間在任何動物的接種位點都沒有觀察到不良反應。用牛分枝桿菌攻擊以后，在實驗結束之前各組中有不同數(shù)目的豚鼠不得不被殺死，因為它們已經(jīng)到達了人道的終點。表1顯示了各處理組中能幸存到實驗結束的動物數(shù)目。用于每種疫苗菌株的至少一個佐劑制劑與PBS對照組相比賦予了該組顯著多的幸存者。用巴氏BCG和東京BCG的活制劑接種也同樣帶來了顯著多的幸存者。
表1.疫苗保護豚鼠抵抗牛分枝桿菌的致死產(chǎn)氣感染的能力
每組動物的數(shù)目顯示在括號中。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(與PBS組相比較，利用費希爾精確檢驗)。ND，沒有進行。將來自每一豚鼠在死亡時的肺和脾臟的均漿進行平板培養(yǎng)，用于牛分枝桿菌的計數(shù)。表2和表3顯示了分別來自經(jīng)牛分枝桿菌產(chǎn)氣感染10周后的接種豚鼠的肺和脾的牛分枝桿菌的產(chǎn)量。只有基于牛分枝桿菌的福爾馬林滅活的制劑賦予了顯著地抵抗肺中的細菌復制保護作用(表2)。這些制劑中的一個(牛分枝桿菌-NAX M687)同樣賦予了對脾的顯著的保護作用(表3)。相比之下，4種福爾馬林-滅活的BCG疫苗賦予了對脾的顯著保護作用，盡管對肺沒有保護作用。用巴氏BCG和東京BCG的活制劑接種顯著地減少了在肺和脾臟二者中的細菌載荷。缺少佐劑的福爾馬林滅活疫苗沒有任何顯著的保護作用，但福爾馬林滅活的在水中的牛分枝桿菌產(chǎn)生小的(0.8log10)但顯著的(p＜0.05，t檢驗)從肺培養(yǎng)的細菌數(shù)目的減少，這是個例外。
表2.來自用牛分枝桿菌產(chǎn)氣感染10周后的接種豚鼠的肺的牛分枝桿菌的產(chǎn)量Log10CFU±SE疫苗/佐劑組合 沒有佐劑 NAX57NAXM57 NAXM77 NAXM687PBS6.34±0.17 ND ND ND ND活的巴氏BCG4.99±0.24 ND ND ND ND(1.34)***活的東京BCG4.92±0.25 ND ND ND ND(1.42)***福爾馬林-滅活的牛分枝桿菌 5.76±0.08 5.70±0.02 5.51±0.24 5.52±0.05 4.97±0.25(0.58)*(0.64) (0.83)*(0.82)*(1.37)**福爾馬林-滅活的巴氏BCG 6.50±0.19 6.07±0.31 6.05±0.10 5.73±0.14 5.68±0.32(-0.16)(0.27) (0.29) (0.60) (0.66)福爾馬林-滅活的東京BCG 5.61±0.325.90±0.18 5.58±0.30 6.32±0.10 6.33±0.16(0.73) (0.43) (0.76) (0.02) (0.01)與PBS組比較的Log10保護顯示在括號中。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(與PBS組相比較，利用t檢驗)。ND，沒有進行。
表3.來自用牛分枝桿菌產(chǎn)氣感染10周后的接種豚鼠的的脾的牛分枝桿菌的產(chǎn)量Log10CFU±SE疫苗/佐劑組合 沒有佐劑 NAX 57NAX M57 NAX M77 NAX M687PBS 5.32±0.20NDNDNDND活的巴氏BCG 3.38±0.24NDNDNDND(1.94)****活的東京BCG 3.87±0.38NDNDNDND(1.45)**福爾馬林-滅活的牛分枝桿菌 4.67±0.125.19±0.175.29±0.185.04±0.254.27±0.38(0.65)(0.13)(0.04)*(0.28)(1.05)*福爾馬林-滅活的巴氏BCG 4.37±0.265.63±0.214.74±0.053.85±0.174.20±0.32(0.59)(-0.38) (0.58)(1.47)***(1.12)*福爾馬林-滅活的東京BCG 4.51±0.334.65±0.193.81±0.414.95±0.153.97±0.45(0.81)(0.67)(1.51)**(0.37)(1.35)*與PBS組比較的Log10保護顯示在括號中。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001(與PBS組相比較，利用t檢驗)。ND，沒有進行。
通過稱重(固定之前)，通過計算肺的表面上的明顯可見的損害的數(shù)目并基于損害大小和嚴重性指定一個值(固定后)來評價每一動物右肺中的大致的肺結核的程度(36)。通過這些標準，沒有疫苗影響了大致的肺結核，包括兩個活的BCG疫苗(數(shù)據(jù)未顯示)在內。
相應的，至少一種基于牛分枝桿菌的福爾馬林滅活制劑賦予一種抵抗肺和脾二者中的細菌復制的保護作用。
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通過參考文獻引入在這里引用的所有專利、懸而未決的專利申請及其它的出版物被通過參考文獻整體引入作為參考。
等價的方案本領域的技術人員將會認識到，或僅僅利用常規(guī)的試驗就能夠確定本發(fā)明此處描述的特定實施方案的許多等價的方案。目的是這樣的等價方案被包含在下列的權利要求中。
權利要求
1.一種用于在哺乳動物中產(chǎn)生對分枝桿菌的體內T細胞-介導的免疫應答的加有佐劑的疫苗，所述疫苗包含有效量的福爾馬林滅活的分枝桿菌和一種佐劑，所述佐劑包括含油的非磷脂的少層的脂囊泡。
2.根據(jù)權利要求1的疫苗，其中所述的分枝桿菌選自結核分枝桿菌復合體和非結核分枝桿菌復合體(NTM)。
3.權利要求2的疫苗，其中所述的結核分枝桿菌選自結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、非洲分枝桿菌和卡介菌(BCG)。
4.權利要求2的疫苗，其中所述的NTM分枝桿菌選自堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、猿分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、斯氏分枝桿菌、戈登分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌、蟾分枝桿菌和瑪爾摩分枝桿菌。
5.根據(jù)前述任意一項權利要求的疫苗，其中所述的脂囊泡是帶負電荷的。
6.根據(jù)前述任意一項權利要求的疫苗，其中所述的脂囊泡進一步地包括MPL。
7.根據(jù)前述任意一項權利要求的疫苗，其中所述的脂囊泡進一步地包括鯊肝醇。
8.根據(jù)前述任意一項權利要求的疫苗，其中所述的脂囊泡是非融合性的。
9.根據(jù)前述任意一項權利要求的疫苗，其中所述的疫苗靶向受試者的淋巴組織或肺。
10.根據(jù)前述任意一項權利要求的疫苗，其中所述的疫苗激活受試者的巨噬細胞。
11.根據(jù)前述任意一項權利要求的疫苗，其中所述的疫苗啟動受試者體內的Thl免疫應答。
12.一種用于給受試者接種抵抗肺結核疫苗的方法，包括用前述任意一項權利要求的疫苗進行給藥。
13.根據(jù)權利要求12的方法，其中用氣霧劑形式的活分枝桿菌攻擊受試者。
14.根據(jù)權利要求13的方法，其中所述的分枝桿菌選自結核分枝桿菌復合體和非結核分枝桿菌復合體(NTM)。
15.根據(jù)權利要求14的方法，其中所述的結核分枝桿菌選自結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、非洲分枝桿菌和卡介菌(BCG)。
16.根據(jù)權利要求14的方法，其中所述的NTM分枝桿菌選自堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、猿分枝桿菌、瘰瘍分枝桿菌、斯氏分枝桿菌、戈登分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌、蟾分枝桿菌和瑪爾摩分枝桿菌。
17.根據(jù)權利要求12的方法，其中所述的給藥步驟保護了肺和脾免遭肺結核復制。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于增強受試者的免疫力或給受試者接種抵抗分枝桿菌感染的疫苗的組合物和方法。本發(fā)明提供了含有分枝桿菌，例如牛分枝桿菌(M.bovis)的福爾馬林滅活培養(yǎng)物和一種Novasome
文檔編號A61K9/127GK1612753SQ02826665
公開日2005年5月4日 申請日期2002年11月13日 優(yōu)先權日2001年11月14日
發(fā)明者C·D·賴特, J·布里斯克, M·A·錢伯斯 申請人:諾瓦瓦克斯有限公司