專利名稱：：黃病毒疫苗輸送系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種改良的(improved)黃病毒復(fù)制子、包含該黃病毒復(fù)制子的表達(dá)載體、構(gòu)建體和系統(tǒng)。更具體地，本發(fā)明涉及一種可用作疫苗輸送系統(tǒng)的黃病毒表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)編碼異源性的免疫原性蛋白和肽，所述的蛋白和肽能夠誘導(dǎo)抗病毒感染和抗癌癥的保護(hù)性T細(xì)胞免疫。疫苗可通過DNA、RNA或病毒樣顆粒的形式而施用，其經(jīng)過在細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制而產(chǎn)生高水平表達(dá)的RNA和所編碼的蛋白。
背景技術(shù)：
：基于復(fù)制子的正鏈RNA病毒載體已經(jīng)被研發(fā)用于抗病毒疫苗和抗癌癥的疫苗(綜述見參考文獻(xiàn)25)。這些載體所具有的一些特征使其成為研發(fā)高效而安全的疫苗的一種合適的選擇。這些特征包括(i)由于復(fù)制子RNA具有自我擴(kuò)增的能力，因而可高水平表達(dá)所編碼的異源性基因(HG)，(ii)其僅在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，因此不會引起與細(xì)胞核內(nèi)剪切和/或染色體整合相關(guān)的問題，(iii)復(fù)制子RNA不會脫離轉(zhuǎn)染的(或感染的)細(xì)胞，因此限制了疫苗載體在被免疫的對象內(nèi)的播散，這使得這些載體具有生物學(xué)安全性，以及(iv)其基因組(7-9kb)相對較小，因此易于對其cDNA進(jìn)行處理并產(chǎn)生重組體?；趶?fù)制子的表達(dá)載體已經(jīng)被研發(fā)用于大多數(shù)典型的正鏈RNA病毒家族成員，包括α病毒、微小核糖核酸病毒(picomavirus)以及黃病毒(綜述見參考文獻(xiàn)25)。不過，絕大部分有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物的復(fù)制子載體的免疫原特性的數(shù)據(jù)來源于α病毒的復(fù)制子，例如新培斯病毒(Sindbisvirus，SIN)、塞姆利基森林病毒(SemlikiForestvirus，SFV)和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelanequineencephalitisvirus，VEE)(綜述見參考文獻(xiàn)47，更新的研究結(jié)果見參考文獻(xiàn)8，10，11，39)?？傮w而言，這些研究顯示，α病毒復(fù)制子載體可誘導(dǎo)針對其所編碼的免疫原的強(qiáng)烈的抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的應(yīng)答，且在大多數(shù)情況下，在適當(dāng)?shù)牟《净蚰[瘤攻擊實(shí)驗(yàn)中可保護(hù)被免疫的動物。三種輸送方式均是有效的，不過，VLP具有最高的輸送功效。將常規(guī)(非復(fù)制型)質(zhì)粒DNA載體與基于α病毒DNA的復(fù)制子載體進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn)，后者通常會誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答且所用的DNA濃度明顯更低(4，17)。但是，一些研究發(fā)現(xiàn)，由基于DNA的α病毒復(fù)制子所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的功效似乎取決于所編碼的免疫原的性質(zhì)，且針對免疫原的免疫與等量的常規(guī)質(zhì)粒DNA載體所誘導(dǎo)免疫效果相似或更低(10，23)。衍生自黃病毒Kunjin(KUN)的復(fù)制子載體在一些出版物中已經(jīng)有描述(26，28，52，53；國際申請WO99/28487)。KUN復(fù)制子表達(dá)系統(tǒng)，例如α病毒復(fù)制子系統(tǒng)，可以三種方式輸送復(fù)制子RNA，即以裸RNA、VLP和質(zhì)粒DNA(圖1A)(25，52，53)的方式。不同于同源性α病毒復(fù)制子包裝系統(tǒng)(6，33，41)，KUN復(fù)制子包裝系統(tǒng)利用了衍生自無關(guān)的SFV病毒的復(fù)制子表達(dá)載體來產(chǎn)生KUN結(jié)構(gòu)蛋白(28，52)。這樣可以消除可能存在與感染性重組材料污染VLP有關(guān)的問題。此外，與通常用于免疫接種研究的、對細(xì)胞具有高致病性的α病毒復(fù)制子載體不同，KUN復(fù)制子似乎不具有細(xì)胞致病性，因此能夠在體外和體內(nèi)長期表達(dá)HG(53)。盡管目前已經(jīng)存在非細(xì)胞致病性的α病毒復(fù)制子載體(1，12，40)，但還沒有有關(guān)其免疫原性特性的研究結(jié)果。已往的研究中，用包含非細(xì)胞致病性的、基于DNA的、表達(dá)β-半乳糖苷酶基因的KUN復(fù)制子載體的VLP免疫小鼠，可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗β-半乳糖苷酶的抗體應(yīng)答(53；國際申請WO99/28487)。但是，尚未證明KUN復(fù)制子載體系統(tǒng)可以輸送能夠誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的免疫原。發(fā)明目的本發(fā)明人在此首次描述了基于黃病毒復(fù)制子的疫苗的疫苗輸送系統(tǒng)，該疫苗輸送系統(tǒng)能夠通過抗體和T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答而提供長期的保護(hù)性免疫。此外，本發(fā)明人對用于產(chǎn)生VLP的黃病毒復(fù)制子和包裝系統(tǒng)進(jìn)行了修飾和改良。因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于輸送疫苗的、經(jīng)過改良的黃病毒復(fù)制子載體系統(tǒng)。
發(fā)明內(nèi)容因此本發(fā)明廣泛涉及一種黃病毒表達(dá)系統(tǒng)以及其中所用的黃病毒復(fù)制子、表達(dá)載體和表達(dá)構(gòu)建體。在一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種黃病毒疫苗輸送系統(tǒng)。在一個方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其包含(i)一種編碼不能產(chǎn)生感染性病毒的黃病毒復(fù)制子的核苷酸序列，其中所述的黃病毒復(fù)制子編碼一或多種突變的黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白；(ii)一個異源性核酸的插入位點(diǎn)；(iii)可操縱地連接于編碼所述的黃病毒復(fù)制子的核苷酸序列的啟動子；以及(iv)至少一種編碼自身蛋白酶(autoprotease)的核苷酸序列。在適當(dāng)條件下，相對于編碼相應(yīng)的野生型蛋白的黃病毒復(fù)制子而言，編碼突變的黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的黃病毒復(fù)制子能夠更有效地在動物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)持久的復(fù)制。優(yōu)選地，(i)中所述的突變的黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白選自(a)突變的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1；(b)突變的非結(jié)構(gòu)蛋白NS2A；以及(c)突變的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5。更優(yōu)選地，(i)中所述的突變的黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白選自(i)脯氨酸250突變?yōu)榱涟彼岬姆墙Y(jié)構(gòu)蛋白NS1；(ii)丙氨酸30突變?yōu)楦彼岬姆墙Y(jié)構(gòu)蛋白NS2A；(iii)天冬酰胺101突變?yōu)樘於彼岬姆墙Y(jié)構(gòu)蛋白NS2A；以及(iv)脯氨酸270突變?yōu)榻z氨酸的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，該種或每一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列編碼一種口蹄疫病毒2A自身蛋白酶。在一個具體的實(shí)施方案中，該表達(dá)載體包含一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列。該實(shí)施方案的實(shí)例被命名為SP6KUNrep5和pKUNrep5。在另一個具體實(shí)施方案中，該表達(dá)載體包含兩種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列，其中所述的至少兩種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列中的第一種位于所述的插入位點(diǎn)的5′，而所述的至少兩種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列中的第二種位于所述的插入位點(diǎn)的3′。該實(shí)施方案的實(shí)例被命名為SP6KUNrep6和pKUNrep6。在另一方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)構(gòu)建體，其包含(i)一種編碼不能產(chǎn)生感染性病毒的黃病毒復(fù)制子的核苷酸序列，其中所述的黃病毒復(fù)制子編碼一或多種突變的黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白；(ii)一種異源性核酸；(iii)可操縱地連接于編碼所述的黃病毒復(fù)制子的核苷酸序列的啟動子；以及(iv)至少一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列。在適當(dāng)條件下，相對于編碼相應(yīng)的野生型蛋白的黃病毒復(fù)制子而言，編碼突變的黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的黃病毒復(fù)制子能夠更有效地在動物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)持久的復(fù)制。優(yōu)選地，(i)中所述的突變的黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白選自(a)突變的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1；(b)突變的非結(jié)構(gòu)蛋白NS2A；以及(c)突變的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5。更優(yōu)選地，(i)中所述的突變的黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白選自(i)脯氨酸250突變?yōu)榱涟彼岬姆墙Y(jié)構(gòu)蛋白NS1；(ii)丙氨酸30突變?yōu)楦彼岬姆墙Y(jié)構(gòu)蛋白NS2A；(iii)天冬酰胺101突變?yōu)樘於彼岬姆墙Y(jié)構(gòu)蛋白NS2A；以及(iv)脯氨酸270突變?yōu)榻z氨酸的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，該種或每一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列編碼一種口蹄疫病毒2A自身蛋白酶。在一個實(shí)施方案中，所述的表達(dá)構(gòu)建體包含至少兩種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列，其中所述的至少一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列中的第一種位于所述的異源性核酸的5′，而所述的至少一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列中的第二種位于所述的異源性核酸的3′。在一個具體實(shí)施方案中，該方面提供了可自一種DNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄而來的一種RNA，其中所述的RNA包含(i)其中所述的黃病毒復(fù)制子編碼一或多種突變的黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白；以及(ii)一種編碼一種異源性蛋白的異源性RNA序列。在一個實(shí)施方案中，所述的啟動子能以可操縱的方式在體內(nèi)啟動RNA轉(zhuǎn)錄。更優(yōu)選地，所述的啟動子能以可操縱的方式在哺乳動物細(xì)胞中啟動RNA轉(zhuǎn)錄。一種優(yōu)選的在哺乳動物細(xì)胞中可操縱的啟動子的實(shí)例是CMV啟動子。在另一個實(shí)施方案中，所述的啟動子能以可操縱的方式在體外啟動RNA轉(zhuǎn)錄。一種優(yōu)選的能以可操縱的方式在體外啟動RNA轉(zhuǎn)錄的啟動子的實(shí)例是SP6啟動子。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體的非限制性實(shí)例包括用于體外RNA表達(dá)的包含SP6啟動子的RNALeuMpt、RNAProMpt、KUNRNAgag或用于細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)的包含CMV啟動子的DNALeuMpt、DNAProMpt、KUNDNAgag。在另一方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)系統(tǒng)，其包含(i)上述第一方面的表達(dá)載體或上述第二方面的表達(dá)構(gòu)建體；和(ii)至少另一種能夠表達(dá)一或多種蛋白的表達(dá)構(gòu)建體，所述的蛋白有助于將所述的表達(dá)載體或構(gòu)建體包裝入黃病毒病毒樣顆粒(VLP)。在具體的實(shí)施方案中，所述的另一種表達(dá)構(gòu)建體是一種包裝構(gòu)建體，其選自SFVMEC/L713P、SFVMEC/L713P/Neo或pSFV3L713PlacZNeo。這些構(gòu)建體在SFVnsP2基因中將亮氨酸713以脯氨酸進(jìn)行取代以降低細(xì)胞致病性。SFVMEC/L713P/Neo和pSFV3L713PlacZNeo特別適合用于產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系。在另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含可自一種黃病毒DNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄而來的一種RNA，其中所述的RNA編碼(i)一種不能產(chǎn)生感染性病毒的黃病毒復(fù)制子；和(ii)一種免疫原性蛋白質(zhì)。在另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含一種可在動物細(xì)胞中自其轉(zhuǎn)錄得到RNA的黃病毒DNA表達(dá)構(gòu)建體，其中所述的轉(zhuǎn)錄得到的RNA編碼(i)一種不能產(chǎn)生感染性病毒的黃病毒復(fù)制子；和(ii)一種免疫原性蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，根據(jù)上述的核酸組合物，所述的DNA和RNA表達(dá)構(gòu)建體包括一種編碼至少一種口蹄疫病毒2A自身蛋白酶的核苷酸序列。更優(yōu)選地，所述的DNA和RNA構(gòu)建體包括一種位于所述的編碼第一種所述口蹄疫病毒2A自身蛋白酶的異源性核酸的5′的核苷酸序列以及一種位于所述的編碼第二種所述口蹄疫病毒2A自身蛋白酶的異源性DNA的3′的核苷酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含由上述第三方面的表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的一或多種VLP。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物是免疫治療性組合物，或更優(yōu)選地，是疫苗。在另一方面，本發(fā)明提供了對動物進(jìn)行免疫的方法，其包括將上述任一方面所述的藥物組合物施用于所述的動物以便在所述的動物中誘導(dǎo)免疫。動物包括人、家畜、寵物、家禽和其他具有商業(yè)價值的動物，盡管并不限于這些。優(yōu)選地，所述的動物是哺乳動物。更優(yōu)選地，所述的動物是人。免疫可以是抗體介導(dǎo)的和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，例如T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。在一個實(shí)施方案中，T細(xì)胞免疫的特征在于是CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。優(yōu)選地，T細(xì)胞免疫的特征在于誘導(dǎo)一種長期的效應(yīng)細(xì)胞CD8+CTL應(yīng)答。在另一個實(shí)施方案中，T細(xì)胞免疫的特征在于是一種CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。在一個具體的實(shí)施方案中，所述的免疫方法誘導(dǎo)針對病毒的免疫。在另一個具體實(shí)施方案中，所述的免疫方法誘導(dǎo)針對癌癥例如黑色素瘤的免疫。在本文中，除非另有說明，“包含”取其包括而非排他的含義，因此所述及的整數(shù)或整數(shù)的組可以包括一或多個未被述及的其他的整數(shù)或整數(shù)的組。附圖和表格說明表1.貫序轉(zhuǎn)染Kunjin和SFV復(fù)制子RNA。表2.同時轉(zhuǎn)染Kunjin和非細(xì)胞致病性的SFV復(fù)制子RNA。表3.在以Kunjin復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染的SFVMECA12細(xì)胞系中產(chǎn)生分泌的VPL。表4.孵育溫度對以KUN-GAG復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染的SFVMECA12細(xì)胞系產(chǎn)生VLP的影響。表5.VLP在表達(dá)非細(xì)胞致病性的SFV復(fù)制子并以pSFVHelperCprME和KUN-GAGRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中的產(chǎn)生。表6.以KUNgagVLP進(jìn)行免疫后對rVVgag攻擊實(shí)驗(yàn)(challenge)的保護(hù)作用。表7.嘌呤霉素抗性BHK-KUN復(fù)制子細(xì)胞克隆No11和No20中的適應(yīng)性突變(adaptivemutations)。圖1.基于KUN復(fù)制子的復(fù)制子基因表達(dá)和輸送系統(tǒng)(A)和編碼鼠多表位(murinepolyepitope，Mpt)的KUN復(fù)制子構(gòu)建體(B)的示意圖。(A)可自摻入了噬菌體SP6啟動子的質(zhì)粒DNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到KUN復(fù)制子RNA并將其作為裸RNA通過轉(zhuǎn)染或注射進(jìn)行輸送(26，52)。還可以借助于細(xì)胞的RNA聚合酶II，自轉(zhuǎn)染的或注射的摻入了巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子的質(zhì)粒DNA進(jìn)行體內(nèi)合成得到KUN復(fù)制子RNA(53)。此外，可使用如前所述的包裝系統(tǒng)首先將KUN復(fù)制子RNA包裝入病毒樣顆粒(virus-likeparticles，VLP)中(28)，然后通過轉(zhuǎn)染而輸送(52)。無論輸送方式如何，一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，KUN復(fù)制子RNA即開始自我復(fù)制產(chǎn)生多個RNA拷貝，再由其進(jìn)行翻譯，引起所編碼的異源性基因(HG)產(chǎn)物的產(chǎn)生增加。CAP代表在體外轉(zhuǎn)錄過程中通過合成方法或在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄或KUNRNA復(fù)制過程中天然添加到復(fù)制子RNA分子5′端的帽結(jié)構(gòu)，其可確保有效起始翻譯過程。(B)KUN復(fù)制子構(gòu)建體含有KUNRNA復(fù)制所需的序列，即5′和3′非翻譯區(qū)(UTR)，編碼KUNC蛋白(C20)的前20個氨基酸和KUNE蛋白(E22)的最后22個氨基酸的序列，以及編碼KUN非結(jié)構(gòu)蛋白NS1(以NS1表示)、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、和NS5(以NS2-NS5表示)的完整的非結(jié)構(gòu)區(qū)。此外，構(gòu)建體還含有位于KUN5′UTR上游的SP6或CMV啟動子，以便在體外或體內(nèi)分別驅(qū)動RNA轉(zhuǎn)錄，以及插入到3′UTR下游的含有丁型肝炎病毒核酶(HDVr)的反基因組序列(antigenomicsequence)和來自猿猴病毒40的聚腺苷酸化信號(pA)，以確保產(chǎn)生具有有效起始復(fù)制所需的精確3′端的KUN復(fù)制子RNA分子。為了使Mpt肽能夠自KUNC20和E22肽釋放到細(xì)胞質(zhì)，所述構(gòu)建體含有2個拷貝的口蹄疫病毒2A自身蛋白酶(FMDV2A)，其分別位于該Mpt序列的上游和下游。Pro和Leu變體分別在KUNNS1基因的250位含有氨基酸Pro或Leu。圖2.編碼鼠多表位(polytope)的KUN復(fù)制子構(gòu)建體在轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞中復(fù)制的證據(jù)。(A)對以基于DNA或基于RNA的編碼Mpt的KUN復(fù)制子轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞進(jìn)行IF分析。以KUN復(fù)制子多表位DNA(DNALeuMpt和DNAProMpt)或RNA(RNALeuMpt和RNAProMpt)轉(zhuǎn)染位于蓋玻片上的細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后48小時通過IF分析KUNNS3蛋白的表達(dá)。(B)對來自以KUN復(fù)制子多表位DNA和RNA轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞的總RNA進(jìn)行Northern印跡分析。按照材料和方法中所述進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染、RNA分離和Northern印跡分析。左圖所示為以代表KUN3′非翻譯區(qū)的KUN-特異性探針進(jìn)行Northern印跡分析的結(jié)果，右圖所示為以代表Mpt序列的探針對同一張膜進(jìn)行再次雜交的Northern印跡分析的結(jié)果。來自DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的樣品含有6μg總RNA，而來自RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的樣品含有12μg總RNA。pKUNβRep2(dGDD)條帶顯示的是分離自以產(chǎn)生編碼β-半乳糖苷酶基因的非復(fù)制型KUN復(fù)制子RNA的pKUNβRep2(dGDD)DNA(53)轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞的RNA樣品。在左圖中該RNA的位置以星號示出。對照RNA為10ng體外轉(zhuǎn)錄的RNALeuMptRNA。圖3.以各種編碼Mpt免疫原的基于KUN復(fù)制子的載體進(jìn)行免疫所誘導(dǎo)的特異于YPHFMPTML(YPH)、RPQASGVYM(RPQ)、TYQRTRALV(TYQ)和SYIPSAEKI(SYI)表位的CTL應(yīng)答。(A)在以指定疫苗進(jìn)行免疫后對Balb/c小鼠(n＝4/組)的脾細(xì)胞進(jìn)行ELISPOT分析。(B)對經(jīng)過再次刺激的、來自以VLPProMpt進(jìn)行免疫的Balb/c小鼠(n＝3/組)的脾細(xì)胞群進(jìn)行51鉻(Cr)釋放分析。使用經(jīng)過指定的肽致敏(實(shí)心方塊)或未經(jīng)指定的肽致敏(空心方塊)的標(biāo)記的靶細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的6hCr釋放分析。圖4.以不同劑量的基于DNA的編碼Mpt的KUN復(fù)制子進(jìn)行免疫誘導(dǎo)的特異于SYIPSAEKI表位的CD8+CTL應(yīng)答。將DNALeuMpt和DNAProMpt以PBS進(jìn)行連續(xù)稀釋，并以指定劑量注射到Balb/c小鼠(n＝4/組)的四頭肌。2周后處死小鼠并以ELISPOT分析測定CD8+CTL應(yīng)答。圖5.A和B。接種RNALeuMpt疫苗后以重組痘苗病毒(vacciniavirus)和B16-OVA腫瘤進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn).(A)重組牛痘(vaccinia)攻擊實(shí)驗(yàn)。以RNALeuMptRNA或RNALeuControlRNA接種Balb/c小鼠(n＝6/組)一次，然后以rVVMpt攻擊。在感染后第4天測定卵巢內(nèi)的痘苗病毒滴度。(B)B16-OVA攻擊實(shí)驗(yàn)。Balb/c小鼠(n＝6/組)以RNALeuControlRNA或RNALeuMptRNA免疫兩次或者以編碼鼠多表位(rVVMpt)的重組牛痘免疫一次，然后以B16-OVA細(xì)胞進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)。上圖顯示的是三組小鼠中每組12個腫瘤部位的平均腫瘤面積。當(dāng)某一組中的第一個腫瘤的大小達(dá)到15×15mm時需要對動物處以安樂死(euthanisation)，腫瘤生長曲線隨即終止。下圖為三組小鼠的Kaplin-Meier存活曲線。當(dāng)腫瘤的大小達(dá)到15×15mm時對小鼠處以安樂死。圖5C.接種VLPLeuMpt疫苗后的B16-OVA腫瘤攻擊實(shí)驗(yàn)的Kaplan-Meier存活曲線。當(dāng)腫瘤的大小達(dá)到15×15mm時將小鼠處死。VLPLeuMpt與rVV相比，Logrank統(tǒng)計(jì)p＜0.01。圖6.含有1拷貝FMDV2A蛋白酶的表達(dá)載體pKUNrep4(已經(jīng)發(fā)表于參考文獻(xiàn)53)、pKUNrep5和SP6KUNrep5以及含有2拷貝FMDV2A蛋白酶的表達(dá)載體EMCVIRES、SP6KUNrep6和pKUNrep6的例子。通過自pKUNrep4缺失PAC基因而得到pKUNrep5。通過在pKUNrep5質(zhì)粒中以SP6啟動子取代CMV啟動子而制備SP6KUNrep5。pKUNrep5和SP6KUNrep5載體僅具有一個FMDV2A序列可供裂解釋放出具有一個鄰近真實(shí)N端(authenticN-terminus)的異源性基因產(chǎn)物。插入的異源性基因下游的EMCVIRES序列使得KUN非結(jié)構(gòu)基因可獨(dú)立起始轉(zhuǎn)錄，因此該異源性基因可具有一個終止密碼子因此也就具有一個真實(shí)C端。pKUNrep6載體是DNALeuMpt和DNAProMpt表達(dá)構(gòu)建體的基礎(chǔ)，而SP6KUNrep6是RNALeuMpt和RNAProMpt表達(dá)構(gòu)建體的基礎(chǔ)，如圖1B所示。圖7.構(gòu)建pSFVMECL713P。首先，將來自pSFV1載體(LifeTechnologies)的、含有塞姆利基森林病毒nsP2基因的SacI-XhoI片段連接到pBluescriptIIKS中，以誘導(dǎo)第713位氨基酸突變。這通過采用重疊PCR而進(jìn)行，重疊PCR在nsP2基因中產(chǎn)生了一個AvrI1位點(diǎn)，將第713位氨基酸由亮氨酸改變?yōu)楦彼帷Ｔ撏蛔僉713P可產(chǎn)生一種非細(xì)胞致病性的SFV株(59)。隨后將得到的質(zhì)粒命名為pBSKS/SFVSac-Xhofrt。然后，將此構(gòu)建體的RsrII-Bsu36I片段轉(zhuǎn)染到pSFVMEC105內(nèi)遺產(chǎn)生所述構(gòu)建體，pSFVMECL713P。圖8.構(gòu)建pSFVMECL713Pneo。用MluI和XbaI將EMCV內(nèi)部的核酶進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的序列和新霉素基因自pBS-CIN4IN切下。然后將IRES/Neo基因插入位于插入的Kunjin核心序列下游的pSFVMECL713P的BamHI位點(diǎn)。然后將此構(gòu)建體用于建立表達(dá)KUN結(jié)構(gòu)基因的穩(wěn)定細(xì)胞系。圖9.構(gòu)建pSFV3L713PlacZNeo。首先，使用來自pBS-CIN4IN的MluI-XhaI末端補(bǔ)平片段將IRES/Neo基因插入pSFV3LacZ，所述的來自pBS-CIN4IN的MluI-XhaI末端補(bǔ)平片段與將IRES/Neo克隆入pSFVMECL713Pneo所用的片段相同，該MluI-XhaI片段插入pSFV3LacZ的SmaI位點(diǎn)。隨后，以相同的限制性位點(diǎn)，將來自pSFVMECL713P的含有SFV非結(jié)構(gòu)蛋白1-4的SpeI-NotI片段轉(zhuǎn)移至pSFV3LacZNeo，以便引入產(chǎn)生SFV復(fù)制子非細(xì)胞致病性表型的L713P突變。圖10.構(gòu)建pSFVHelperprMEC。為了構(gòu)建用于在pSFV3L713PlacZNeo穩(wěn)定細(xì)胞系中表達(dá)Kunjin結(jié)構(gòu)基因的輔助質(zhì)粒，用MscI-SpeI位點(diǎn)將KUNprMEC基因盒自pSFVMEC105中切下，然后將該片段以相同的限制性位點(diǎn)插入pSFVHelper2(LifeTechnologies)并取代SFV結(jié)構(gòu)蛋白。應(yīng)當(dāng)注意的是，該構(gòu)建體中，prME和C被置于兩個單獨(dú)的26S啟動子的控制下。圖11.構(gòu)建pSFVHelperCprME。使用Pfu聚合酶和適當(dāng)?shù)囊铮⒁院腥LKunjincDNA(27)的FLSDX質(zhì)粒DNA作為模板，通過PCR產(chǎn)生兩端具有BglII位點(diǎn)的KunjinCprMEcDNA片段。然后將該CprME片段與含有同樣由PCR產(chǎn)生的并在兩端含有BamHI位點(diǎn)的pSFVHelper2載體的片段相連接。圖12.以KUNgagVLP(n＝6/組)和rVVgag(n＝3/組)免疫接種后引起小鼠產(chǎn)生的抗HIVgag抗體。以106PFU的KUNgagVLP或?qū)φ誎UNVLP(KUN對照)免疫接種小鼠2次，或以106PFU的rVVgag免疫接種小鼠1次。末次免疫接種后2-3周，用針對純化重組gag蛋白的ELISA分析小鼠血清的抗gag抗體。圖13.對來自以KUNgagVLP免疫接種的小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行T細(xì)胞增殖分析。HIV-1gag蛋白脈沖處理的脾細(xì)胞用于刺激脾細(xì)胞。SE＝標(biāo)準(zhǔn)誤。經(jīng)過和未經(jīng)過免疫接種的小鼠的刺激指數(shù)分別按照以HIV-1gag抗原刺激的計(jì)數(shù)(黑色條形)/無抗原刺激的計(jì)數(shù)(白色條形)計(jì)算出。圖14.KUN復(fù)制子VLP疫苗引起的長期免疫應(yīng)答(A)以KUNgagVLP單次免疫接種2周和6個月后，Balb/c小鼠(n＝4/組)中針對AMQ表位的ELISPOT應(yīng)答。(B)以編碼鼠多表位免疫原(mpt)的KUN復(fù)制子VLP2次免疫接種Balb/c小鼠(n＝8/組)(間隔4周)，6個月后對來自該小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行ELISPOT分析。顯示了針對由Mpt編碼的各個表位，即YPHFMPTML(YPH)、RPQASGVYM(RPQ)、TYQRTRALV(TYQ)和SYIPSAEKI(SYI)的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。(C)以KUNmptVLP間隔4周免疫接種Balb/c小鼠(n＝6/組)共2次，第二次免疫接種10個月后，以編碼mpt(rVVmpt)的重組痘苗病毒對小鼠進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)。感染后第4天，測定卵巢中痘苗病毒的滴度。圖15.來自KUN復(fù)制子RNA的β-半乳糖苷酶在不同的抗嘌呤霉素的BHK細(xì)胞克隆的第4代中的表達(dá)。圖16.適應(yīng)性突變對KUN復(fù)制子RNA在BHK21細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)持久復(fù)制的能力的影響。從左至右，培養(yǎng)盤為repPACβ-gal、repPACβ-galNS2A(A-P)、repPACβ-galNS2A(N-D)和repPACβ-galNS5(P-S).具體實(shí)施例方式本發(fā)明人描述了以表達(dá)鼠CTL多表位(polyepitope或polytope)(Mpt)和HIV-1gag的KUN復(fù)制子作為免疫原，并以裸RNA、VLP、或質(zhì)粒DNA的形式輸送從而對小鼠進(jìn)行免疫接種。所有這些免疫接種的方式均誘導(dǎo)了針對所編碼的表位的特異性CD8+CTL應(yīng)答，且在裸RNA和VLP的情況下，保護(hù)小鼠抵抗病毒和腫瘤攻擊實(shí)驗(yàn)。此外，將表達(dá)完整HIV-1gag基因的KUN復(fù)制子以VLP形式輸送從而對小鼠進(jìn)行免疫接種，誘導(dǎo)了特異于gag的抗體和CD4+T細(xì)胞應(yīng)答，并保護(hù)小鼠抵抗以表達(dá)所述gag基因的重組痘苗病毒進(jìn)行的攻擊實(shí)驗(yàn)。此外，KUN復(fù)制子經(jīng)過修飾(與WO99/28487相比)，在編碼異源性免疫原的序列的5′和3′插入了FMDV2A自身蛋白酶序列。這種修飾可引起所表達(dá)的融合蛋白發(fā)生自身蛋白裂解而釋放基本上無外來氨基酸序列的蛋白質(zhì)免疫原。進(jìn)一步的修飾包括使用編碼本發(fā)明的黃病毒復(fù)制子的NS1、NS2A和NS5蛋白成分中的一或多種的突變的核苷酸序列，該突變可更加有效地建立持久的復(fù)制。本發(fā)明還提供了一種新的、基于SFV的病毒包裝系統(tǒng)，其較國際申請WO99/28487所述的基于SFV的系統(tǒng)具有更低的細(xì)胞治病性。KUN復(fù)制子表達(dá)載體和構(gòu)建體術(shù)語“核酸”在此是指單鏈或雙鏈的mRNA、RNA、cRNA和DNA包括cDNA和基因組DNA。在此，“黃病毒”是指屬于黃病毒屬(genusFlavivirus)的黃病毒科(familyFlaviviridae)成員，其含有65或更多種相關(guān)的病毒。典型地，黃病毒是小的、有包膜RNA病毒(直徑大約45nm)，具有包含單一糖蛋白E的包膜突起。其他結(jié)構(gòu)蛋白稱為C(核心)和M(膜樣)。單鏈RNA具有感染性，典型地，其分子量為大約4×106，5′末端具有m7G帽，但在3′末端無poly(A)；其僅僅起到信使(messenger)的作用。黃病毒可感染很多種脊椎動物，其中多為節(jié)肢動物如蜱和蚊子所轉(zhuǎn)播，不過個別黃病毒群(group)通過未知載體(NKV)傳播。具體而言，黃病毒的非限制性實(shí)例為西尼羅河病毒(WestNilevirus)、Kunjin病毒、黃熱病毒(YellowFevervirus)、日本腦炎病毒(JapaneseEncephalitisvirus)、登革熱病毒(Denguevirus)、MontanaMyotis白質(zhì)腦炎病毒(MontanaMyotisleukoencephalitisvirus)、烏蘇土病毒(Usutuvirus)、和Alkhurma病毒(Alkhurmavirus)。盡管本發(fā)明的優(yōu)選的黃病毒復(fù)制子來自Kunjin病毒，但本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的表達(dá)載體、表達(dá)構(gòu)建體和表達(dá)系統(tǒng)可以采用任何黃病毒復(fù)制子。研究較為深入的黃病毒復(fù)制子的例子包括西尼羅河病毒I系(參考文獻(xiàn)61)和II系病毒株(參考文獻(xiàn)62)復(fù)制子。本發(fā)明所預(yù)期的黃病毒復(fù)制子包括任何來自黃病毒RNA的自我復(fù)制型成分，例如見國際申請WO99/28487所述。在此一般而言，黃病毒復(fù)制子衍生自黃病毒或者是黃病毒起源的。因此，在本說明書中，“編碼黃病毒復(fù)制子的核苷酸序列”是指一種DNA或RNA序列，其包含的來自黃病毒復(fù)制子或至少其一部分的序列信息足以進(jìn)行復(fù)制但不能產(chǎn)生感染性病毒。例如，本領(lǐng)域人員能夠明了，在此所指的本發(fā)明的基于DNA的構(gòu)建體包含復(fù)制子RNA的一個DNA拷貝，其互補(bǔ)于所述的復(fù)制子RNA或者是衍生于所述的復(fù)制子RNA。適當(dāng)?shù)?，所述的黃病毒復(fù)制子能夠復(fù)制但是“不能產(chǎn)生感染性病毒”。這意味著所述黃病毒復(fù)制子無法表達(dá)病毒包裝所需的一或多種結(jié)構(gòu)蛋白的完整分子或部分。國際申請WO99/28487詳細(xì)說明了如何修飾Kunjin黃病毒復(fù)制子以使其無法進(jìn)行病毒包裝。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述黃病毒復(fù)制子包含(i)5′和3′非翻譯(UTR)序列以及分別編碼C蛋白的前20個氨基酸(C20)和E蛋白的最后22個氨基酸(E22)的序列；和(ii)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5的核苷酸序列。在一個具體方面，所述的非結(jié)構(gòu)蛋白中的一或多種是突變的。在一個具體的實(shí)施方案中，NS1蛋白的脯氨酸殘基250被亮氨酸取代。在另一個具體實(shí)施方案中，非結(jié)構(gòu)蛋白NS2A中的丙氨酸30被脯氨酸取代。在另一個具體實(shí)施方案中，非結(jié)構(gòu)蛋白NS2A中的天冬酰胺101被天冬氨酸取代。在另一個具體實(shí)施方案中，非結(jié)構(gòu)蛋白NS5中的脯氨酸270被絲氨酸取代。還應(yīng)該理解，上述各種突變或取代可單獨(dú)出現(xiàn)或以組合形式出現(xiàn)于本發(fā)明的黃病毒復(fù)制子中。根據(jù)本發(fā)明，“表達(dá)載體”包含上述黃病毒復(fù)制子連同一或多種其他調(diào)節(jié)核苷酸序列。此類調(diào)節(jié)序列包括但不限于啟動子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)、用于插入一或多種異源性核酸的限制性酶切位點(diǎn)、聚腺苷酸化序列以及其他序列如丁型肝炎病毒核酶(HDVr)的反基因組序列以分別確保轉(zhuǎn)錄的終止和精確裂解3′端。應(yīng)該理解，本發(fā)明的表達(dá)載體和表達(dá)構(gòu)建體包括編碼至少一種自身蛋白酶的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述的核苷酸序列編碼至少一種口蹄疫病毒2A自身蛋白酶，或更優(yōu)選地，所述的核苷酸序列中的每種各自編碼一種相應(yīng)的口蹄疫病毒2A自身蛋白酶。優(yōu)選地，使用一種表達(dá)的融合蛋白，其包含一種兩翼分別為一種N-端口蹄疫病毒2A自身蛋白酶和一種C-端口蹄疫病毒2A自身蛋白酶的異源性蛋白。這種排列引起所述口蹄疫病毒2A自身蛋白酶裂解該融合蛋白以釋放出基本上不含其他氨基酸序列的該異源性蛋白。本發(fā)明的特定的KUN復(fù)制子載體的例子為編碼一種FMDV2A蛋白酶和EMCVIRES的pKUNrep5和SP6KUNrep5以及編碼兩種FMDV2A蛋白酶的SP6KUNrep6和pKUNrep6，如圖6所示。根據(jù)本發(fā)明，“表達(dá)構(gòu)建體”是一種表達(dá)載體，其中插入了一種異源性核酸以使得其能夠以RNA的形式和/或作為一種被編碼的蛋白而表達(dá)。所述的異源性核酸可編碼一或多種肽或多肽，或編碼一種基本上與靶序列相同或基本上與其互補(bǔ)的核苷酸序列。“蛋白質(zhì)”是指一種氨基酸聚合物。氨基酸可包括天然的(即遺傳學(xué)編碼的)、非天然的、D-氨基酸和L-氨基酸，皆為本領(lǐng)域所熟知?！半摹笔侵妇哂猩儆?0個氨基酸的蛋白質(zhì)?！岸嚯摹笔侵妇哂?0個或更多個氨基酸的蛋白質(zhì)。異源性核酸可編碼由致病生物體例如病毒、真菌、細(xì)菌、原蟲、無脊椎動物如寄生蟲和節(jié)肢動物所產(chǎn)生的或得到的蛋白質(zhì)，或者可編碼由包括動物和人在內(nèi)的動物所產(chǎn)生的或得到的突變的、致癌的或腫瘤性蛋白質(zhì)如腫瘤抗原。異源性核酸也可編碼合成的或人工蛋白質(zhì)如構(gòu)建的用來誘導(dǎo)免疫的免疫原性表位。在一個實(shí)施方案中，所述的異源性核酸編碼一或多種免疫原性肽或多肽，但不限于此。優(yōu)選地，所述一或多種免疫原性肽或多肽包含一或多種T細(xì)胞表位。在一個具體的實(shí)施方案中，所述的異源性核酸編碼多種肽表位(多表位)如一種鼠多表位(Mpt)，后者將在下文中做詳細(xì)說明。表位序列的例子包括YPHFMPTNL、RPQASGVYM、TYQRTRALOV、SYIPSAEKI和SIINFEKL，但不限于此。在另一個特定實(shí)施方案中，所述的異源性核酸編碼HIV-1gag基因或其片段。在本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體中，啟動子可操縱地連接于所述的黃病毒復(fù)制子?！翱刹倏v地連接于”是指所述的啟動子的位置可以在體外或體內(nèi)起始、調(diào)控或控制編碼所述的黃病毒復(fù)制子、所述的異源性核酸和促進(jìn)RNA剪切和蛋白質(zhì)表達(dá)的其他調(diào)控序列的RNA的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選地，所述啟動子位于所述黃病毒復(fù)制子的5′。用于在體外自所述的DNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄RNA的優(yōu)選的啟動子是SP6啟動子。用于在體內(nèi)自哺乳動物細(xì)胞中的所述的DNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄RNA的優(yōu)選的啟動子是巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子。不過，應(yīng)該理解的是本發(fā)明也預(yù)期了其他在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)具有活性的熟知的啟動子，包括SV40啟動子(一種人類延長因子α啟動子)和α晶體蛋白啟動子，但不限于此。在用本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的實(shí)施方案中，表達(dá)載體進(jìn)一步包含一種選擇標(biāo)記基因以便對轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞進(jìn)行篩選。選擇標(biāo)記基因是本領(lǐng)域熟知的，包括新霉素轉(zhuǎn)移酶和嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，但不限于此?？蓪⑦x擇標(biāo)記基因插入以取代缺失的結(jié)構(gòu)基因或插入至3′UTR區(qū)域。用于蛋白質(zhì)表達(dá)的合適的宿主細(xì)胞可以是任何能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)錄、翻譯以及蛋白質(zhì)表達(dá)所需的任何轉(zhuǎn)錄后和/或翻譯后處理或修飾的真核細(xì)胞系。可用于核酸轉(zhuǎn)染和蛋白質(zhì)表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞的典型的例子為COS、Vero、CV-1、BHK21、HEK293、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、NIH3T3、Jurkat、WEHI231、HeLa和B16黑色素瘤細(xì)胞，但不限于此。可通過本領(lǐng)域已知的方法實(shí)施轉(zhuǎn)染，如磷酸鈣沉淀、電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(lipofectamine)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(lipofectin)和其他親脂試劑、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖、微粒子轟擊法(microparticlebombardment)、微注射和原生質(zhì)體融合。本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體的例子包RNALeuMpt、RNAProMpt、KUNRNAgag、DNALeuMpt、DNAProMpt和UNDNAgag，將在下文中進(jìn)一步詳述。病毒包裝根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了一種黃病毒表達(dá)系統(tǒng)，其包含(i)上文中所述的黃病毒表達(dá)構(gòu)建體；和(ii)至少另一種能夠表達(dá)一或多種蛋白的表達(dá)構(gòu)建體，所述的蛋白有助于將第二方面所述的表達(dá)構(gòu)建體包裝入黃病毒病毒樣顆粒(VLP)?？墒褂萌魏畏屈S病毒衍生的載體來表達(dá)用于病毒包裝并產(chǎn)生VLP所需的一或多種結(jié)構(gòu)蛋白。例如，所述的另一種構(gòu)建體可衍生自另一種α病毒如塞姆利基森林病毒(SFV)或新培斯病毒(SIN)或衍生自DNA病毒如腺病毒、禽痘病毒(fowlpoxvirus)或痘苗病毒。下文將詳細(xì)描述可用于產(chǎn)生VLP以及制備并純化VLP的所述另一種構(gòu)建體(一種SFV衍生的構(gòu)建體)的一個例子。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了新的包裝系統(tǒng)，其提高了國際申請WO99/28487所述的系統(tǒng)的包裝功效并使之簡化。應(yīng)該理解的是，在一些寬泛的實(shí)施方案中，黃病毒包裝可通過以下方式實(shí)現(xiàn)(a)用一種黃病毒表達(dá)構(gòu)建體和能夠提供病毒包裝所需的結(jié)構(gòu)蛋白的所述另一種表達(dá)構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞(如上文中所述的)；(b)用一種黃病毒表達(dá)構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞已經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了一種能夠提供病毒包裝所需的結(jié)構(gòu)蛋白的包裝構(gòu)建體。就(a)來說，這些表達(dá)構(gòu)建體可以進(jìn)行共轉(zhuǎn)染或在一個時間框架內(nèi)分別轉(zhuǎn)染以實(shí)現(xiàn)的VLP最佳產(chǎn)生。上文中，“轉(zhuǎn)染”是為了方便起見所使用的一個通用術(shù)語，其涵蓋了將外源性遺傳物質(zhì)瞬時引入或穩(wěn)定引入到宿主細(xì)胞內(nèi)部。在一個具體的實(shí)施方案中，通過在nsP2基因中引入突變使得第713位的亮氨酸突變?yōu)楦彼?SFVMEC/L713P；圖7)，從而達(dá)到對衍生自SFV的包裝構(gòu)建體SFV-MEC105進(jìn)行修飾以降低其細(xì)胞致病性的目的。在另一個具體實(shí)施方案中，SFV-MEC/L713P構(gòu)建體含有一個IRES-Neo盒(SFVMEC/L713P/Neo；圖8)以便通過抗生素G418進(jìn)行選擇從而建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染入該細(xì)胞系的Kunjin復(fù)制子RNA可進(jìn)行復(fù)制并產(chǎn)生KunjinVLP。在另一個具體實(shí)施方案中，提供了一種非細(xì)胞致病性的SFV復(fù)制子RNA構(gòu)建體pSFV3L713PLacZNeo(圖9)，以擴(kuò)增轉(zhuǎn)染進(jìn)去的SFV輔助RNApSFVHelperprMEC(圖10)和pSFVHelperCprME(圖11)，由此可表達(dá)Kunjin結(jié)構(gòu)蛋白。所述的另一種構(gòu)建體(衍生自SFV的構(gòu)建體)、表達(dá)所述的衍生自SFV的構(gòu)建體的細(xì)胞系以及各種用于產(chǎn)生VLP的包裝方案和VLP的制備并純化將在下文中詳細(xì)闡述。藥物和免疫治療性組合物和疫苗本發(fā)明的一個具體方面涉及黃病毒表達(dá)構(gòu)建體和表達(dá)系統(tǒng)作為疫苗輸送系統(tǒng)的用途。不過，本發(fā)明更廣泛地提供了一種藥物組合物，其不限于用于疫苗輸送，而是包括免疫治療性組合物和疫苗，可包含(i)由本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的VLP；(ii)自本發(fā)明的DNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄得到的RNA；或(iii)在體內(nèi)指導(dǎo)復(fù)制型RNA轉(zhuǎn)錄的本發(fā)明的質(zhì)粒DNA表達(dá)構(gòu)建體。該藥物組合物可進(jìn)一步包含藥物學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑?？赏ㄟ^輸送此類組合物以產(chǎn)生針對病原體的免疫力，優(yōu)選為保護(hù)性免疫，所述的病原體例如為病毒、細(xì)菌、原蟲寄生蟲和無脊椎寄生蟲，但不限于此。在另一個替代性實(shí)施方案中，本發(fā)明意欲對癌癥例如黑色素瘤進(jìn)行免疫治療性治療?！八幬飳W(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑”是指能夠安全地用于全身施用的固體或液體的填充物、稀釋劑或包囊化物質(zhì)(encapsulatingsubstance)。根據(jù)特定的施用途徑，可以使用本領(lǐng)域熟知的多種載體。這些載體可以選自糖、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽、明膠、滑石粉、硫酸鈣、植物油、人造脂肪、多元醇、褐藻酸、磷酸緩沖液、乳化劑、等張鹽水和鹽類例如包括氯化物、溴化物和硫酸鹽在內(nèi)的無機(jī)酸鹽、有機(jī)酸例如乙酸鹽、丙酸鹽和丙二酸鹽以及無致熱原的水。介紹藥理學(xué)可接受的載體、稀釋劑和賦形劑的參考文獻(xiàn)Remington′sPharmaceuticalSciences(MackPublishingCo.N.J.USA，1991)，本文將其并入作為參考。可采用任何安全的施用途徑將本發(fā)明的組合物施用于患者。例如可采用經(jīng)口服、直腸、胃腸外、舌下、口腔、靜脈、關(guān)節(jié)內(nèi)、肌肉、皮內(nèi)、皮下、吸入、眼內(nèi)、腹腔內(nèi)、腦室內(nèi)、經(jīng)皮等等。例如，肌肉注射和皮下注射是施用免疫治療性組合物、蛋白質(zhì)疫苗和核酸疫苗的合適的方式。劑型包括片劑、分散劑(dispersion)、混懸劑、注射液、溶液、糖漿、錠劑、膠囊、栓劑、氣霧劑、經(jīng)皮貼劑等等。這些劑型可包括專門為此目的而設(shè)計(jì)的注入式或植入式控釋裝置、或其他經(jīng)過改良后可用于此目的的植入體。通過對治療劑進(jìn)行包被可實(shí)現(xiàn)治療劑的控釋，例如使用疏水性聚合物，包括丙烯酸樹脂、石蠟、高級脂族醇(higheraliphaticalcohols)、聚乳酸和聚乙二醇酸以及某些纖維素衍生物如羥丙基甲基纖維素(hydroxypropylmethylcellulose)。此外，也可采用其他聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球體以實(shí)現(xiàn)控釋。適于口服或胃腸外施用的本發(fā)明的藥物組合物可以是分散的單位如膠囊、小藥囊(sachets)或片劑，分別含有一個預(yù)先確定的量的本發(fā)明的一或多種治療劑，所述治療劑為粉劑或顆?；?yàn)樗砸骸⒎撬砸?、水包油乳劑或油包水液體乳劑質(zhì)的溶液或混懸劑。可通過任何制藥方法制備此類組合物，但所有的方法均包括將一或多種上述制劑與構(gòu)成一或多種必要成分的載體相結(jié)合的步驟。通常，所述組合物通過將本發(fā)明的制劑與液體載體或細(xì)分的固體載體進(jìn)行均勻地和密切地混合而制備，然后，如有必要，將產(chǎn)品制成所需的形狀。上述的組合物可以按照與劑量配方相適應(yīng)的方式施用，施用的量是藥物學(xué)有效劑量。根據(jù)本發(fā)明，施用于患者的劑量應(yīng)該足以在一段適當(dāng)?shù)臅r間后對患者產(chǎn)生有益的反應(yīng)。所施用的制劑的量取決于治療對象的情況，包括其年齡、性別、體重和一般健康狀況，這些因素由從業(yè)者進(jìn)行判定。本發(fā)明的免疫治療性組合物可用于對動物例如人進(jìn)行預(yù)防性或治療性免疫。不過，其他動物也適用，優(yōu)選地為脊椎動物，包括家畜如牲畜和寵物。如下文中將要詳細(xì)說明的，本發(fā)明的疫苗的形式可以是VLP、RNA或DNA。通過采用本發(fā)明的疫苗適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)免疫原性蛋白質(zhì)和肽表位包括多表位，可誘導(dǎo)針對病毒、腫瘤、細(xì)菌、原蟲以及其他無脊椎動物寄生蟲的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，所述免疫應(yīng)答涉及誘導(dǎo)抗體、CD8+CTL和/或CD4+T細(xì)胞。更優(yōu)選地，所述免疫應(yīng)答涉及誘導(dǎo)長期效應(yīng)細(xì)胞CD8+CTL。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明人證實(shí)了以編碼衍生自卵清蛋白的CTL表位的RNA和VLP疫苗進(jìn)行免疫，能夠在以表達(dá)卵清蛋白的B16黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行的攻擊實(shí)驗(yàn)中保護(hù)小鼠。在另一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明人以編碼完整HIV-1gag基因的VLP疫苗進(jìn)行免疫，能夠在以表達(dá)HIV-1gag基因的重組痘苗病毒進(jìn)行的攻擊實(shí)驗(yàn)中保護(hù)小鼠。還應(yīng)理解的是，本發(fā)明的免疫治療性組合物和疫苗可以在某些實(shí)施方案中包括一種佐劑。本領(lǐng)域可以理解，“佐劑”是指一或多種物質(zhì)，所述物質(zhì)可增強(qiáng)疫苗組合物的免疫原性和/或效力。合適的佐劑的非限制性實(shí)例包括異三十烷(squalane)和鯊烯(squalene)(或其他的動物來源油脂)；阻斷共聚物(blockcopolymers)；去垢劑如Tween-80；QuilA，礦物油如Drakeol或Marcol，植物油如花生油；衍生自棒桿菌屬(Corynebacterium)的佐劑如小棒桿菌(Corynebacteriumparvum)；衍生自丙酸桿菌屬(Propionibacterium)的佐劑如瘡皰丙酸桿菌(Propionibacteriumacne)；牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)(卡介苗或BCG)；白介素如白介素2和白介素12；單核因子如白介素1；腫瘤壞死因子；干擾素如γ-干擾素；一些組合形式如皂角苷-氫氧化鋁(saponin-aluminiumhydroxide)或Quil-A氫氧化鋁；脂質(zhì)體；ISCOM和ISCOMATRIX佐劑；分枝桿菌細(xì)胞壁提取物；合成的糖肽如胞壁酸二肽(muramyldipeptide)或其他衍生物；Avridine；脂質(zhì)A衍生物；硫酸葡聚糖；DEAE-葡聚糖或加上磷酸鋁；羧基聚亞甲基(carboxypolymethylene)如Carbopol′EMA；丙烯酸共聚物乳劑如NeocrylA640(如U.S.專利No.5,047,238)；牛痘或動物痘病毒蛋白；亞病毒顆粒佐劑如霍亂毒素，或其混合物。為了使得本發(fā)明能夠容易地被理解和付諸實(shí)踐，本領(lǐng)域人員可參照以下非限制性實(shí)施例。實(shí)施例1材料與方法質(zhì)粒?；赗NA(RNALeu)的和基于DNA(DNALeu)的KUN復(fù)制子載體具有2個拷貝的口蹄疫病毒(FMDV2A)的2A自身蛋白酶，一個位于克隆位點(diǎn)上游，另一個位于克隆位點(diǎn)下游，并在KUNNS1基因的第250位氨基酸處具有亮氨酸(Leu)(圖1B)。RNAPro和DNAPro載體在第250位氨基酸具有脯氨酸(Pro)而不是Leu，它們是通過將RNALeu和DNALeu載體中跨過完整NS1基因的SphI-SphI片段，以來自KUN全長cDNA質(zhì)粒250pro(16)的相應(yīng)的SphI-SphI進(jìn)行取代而構(gòu)建的。用引物Mpt-F(5′GCGACGCGTCTAGAGCCAGCAACGAGAA-3′)和Mpt-R(5′-GTAACGCGTCTAAGTCCTCGGGGCCGG-3′)，自質(zhì)粒pSTMPDV(50)中PCR擴(kuò)增鼠多表位(Mpt)序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)MM消化后克隆入上述4種載體中的每一種的MluI位點(diǎn)，以分別產(chǎn)生質(zhì)粒RNALeuMpt、RNAProMpt、DNALeuMpt和DNAProMpt(圖1B)。DNA和RNA轉(zhuǎn)染，IF和Northern印跡分析。為進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)染，使用LipofectaminePlus轉(zhuǎn)染試劑(LifeTechnologies，Melbourne，Australia)，按照制造商的說明，分別以2或0.4μg質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染6孔板中或蓋玻片上的BHK21細(xì)胞。如前所述(26)，以SP6RNA聚合酶，自XhoI線性化的基于RNA的質(zhì)粒DNA中體外轉(zhuǎn)錄RNA，并將其電穿孔至BHK21細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48小時，將載有轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蓋玻片固定于冷丙酮中，并如前所述(56)，用抗NS3抗體，通過間接免疫熒光法(IF)分析KUNNS3蛋白的表達(dá)。如前所述(26)，使用代表KUN3′UTR區(qū)域或Mpt序列的、32P標(biāo)記的cDNA探針，對來自轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA進(jìn)行Northern印跡分析。制備VLP。如前所述(28，52)制備VLP(VLPProMpt和VLPLeuMPT)。簡言之，2×106BHK21細(xì)胞以大約10-20μg體外轉(zhuǎn)錄的RNAProMpt或RNALeuMPtRNA進(jìn)行電穿孔，1.5kV，25μF，∝電阻，2次脈沖，中間間隔10秒。電穿孔后，將細(xì)胞稀釋于8mlDMEM/10％FCS中，并培養(yǎng)于60mm培養(yǎng)皿中，置于37℃，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。32小時后，將細(xì)胞胰蛋白酶化，用于以體外轉(zhuǎn)錄的表達(dá)KUN結(jié)構(gòu)蛋白(SFV-MEC105)(28)的SFV復(fù)制子RNA，在相同條件下進(jìn)行第二次電穿孔。第二次電穿孔后18小時，將培養(yǎng)基更換為3ml的DMEM/2％FCS，將細(xì)胞進(jìn)一步孵育22小時。收集培養(yǎng)基并在8000xg離心，然后按1ml進(jìn)行分裝，儲存于-70℃。以10倍系列稀釋的VLP感染BHK21細(xì)胞，并在感染后30-40小時進(jìn)行IF分析，計(jì)數(shù)NS3陽性細(xì)胞數(shù)，由此確定感染性VLP的滴度。對小鼠進(jìn)行免疫接種。雌性BALB/c(H-2d)小鼠(6-8周齡)由AnimalResourcesCentre(Perth，WesternAustralia)提供。用以下配方對小鼠進(jìn)行免疫(i)KUN復(fù)制子多表位DNA質(zhì)粒，編碼DNALeuMpt和DNAProMpt的、表達(dá)MptKUN復(fù)制子并注射至股四頭肌(100μg于100μlPBS中，i.m.，每處腿部各50μl)；(ii)將體外轉(zhuǎn)錄的編碼Mpt的KUN復(fù)制子RNA、RNALeuMpt和RNAProMpt溶于經(jīng)DEPC處理的PBS并按上述進(jìn)行注射(約30μg于100μl，i.m.，每處腿部50μl)；(iii)包裝于VLP的復(fù)制子RNA、RNAProMPt或RNALeuMPT(分別為VLPProMpt和VLPLeuMpt)以溶于DMEM/2％FCS的形式輸送，并i.p.注射(1ml中～5×105至106VLP)；(iv)常規(guī)質(zhì)粒DNA疫苗、編碼Mpt的pSTMPDV(100μg溶于100μl的PBS中，i.m.，每處股四頭肌50μl)(50)；和(v)一種編碼Mpt的重組痘苗病毒(107pfu，200μlRPMI1640，i.p.)，如前所述(51)。CTL分析。通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzymelinkedimmuno-spot(ELISPOT))，使用前述的最小CTL肽表位(31)計(jì)數(shù)分泌表位特異性IFN-γ的細(xì)胞。簡言之，以5μg/mL的大鼠抗小鼠IFN-γ抗體(克隆RA-6A2，BDPharMingen，SanDiego，USA)過夜包被平底96孔MultiScreen-HA纖維素酯膜微滴定板(MilliporeAustraliaLtd.，NorthRyde，Australia)。然后將經(jīng)過包被的平板以1％牛血清白蛋白(溶于PBS)在室溫下封閉1小時，并以含有0.05％Tween20(Sigma)的PBS洗滌3次。將脾細(xì)胞(1×106/孔)鋪于ELISPOT平板的第一排孔中，并按2倍進(jìn)行系列稀釋。加入重組人IL-2(由CetusCorp.，Emeryville，California，USA惠贈)(100IU/ml)和肽(Mimotopes，Clayton，Victoria，Australia)(1μg/ml)，將平板孵育18小時。裂解細(xì)胞，洗滌平板，并先以生物素化的抗小鼠IFN-γ抗體(克隆XMG1.2)(BDPharMingen)孵育，然后以streptavidin-堿性磷酸酶(BDPharMingen)和SigmaFastBCIP/NBT底物(Sigma)孵育，以檢測IFN-γ斑點(diǎn)。以KSELISPOT讀數(shù)器(CarlZeissVisionGmbH，Hallbergmoos，Germany)計(jì)數(shù)斑點(diǎn)。按照先前的方法(9)進(jìn)行51Cr釋放分析。簡言之，以VLPProMpt對小鼠進(jìn)行免疫，2-3周后處死小鼠，加入1μg/ml的肽(Mimotopes)對脾細(xì)胞在體外進(jìn)行再次刺激6天。將得到的效應(yīng)細(xì)胞群平分，并將等量的細(xì)胞以雙份的形式與肽致敏的和非致敏的51Cr標(biāo)記的P815靶細(xì)胞作用，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例是指定的。痘苗病毒保護(hù)分析。各組(n＝6)6-8周齡的雌性Balb/c小鼠以大約30μgRNALeuMpt或?qū)φ?RNALeuControl)RNA免疫接種一次，3周后，給每只小鼠腹腔注射107pfu的編碼鼠多表位(rVVMpt)(51)的重組痘苗病毒進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)。感染后第4天，取出雙側(cè)卵巢，洗滌并在1ml的PBS中以自動勻漿器進(jìn)行勻漿。將100μl的卵巢懸液與含有1mg/ml的胰蛋白酶(Sigma)的900μl的PBS混合，在37℃孵育30分鐘。將溶液簡單離心，10,000xg，以去除雜質(zhì)，將100μl上清液與900μl的RPMI/10％FCS培養(yǎng)基混合。然后通過在匯合的CV1細(xì)胞上進(jìn)行斑點(diǎn)分析以測定卵巢中的痘苗病毒的滴度。以Wilcoxanrank-sum檢驗(yàn)(7)計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對照組病毒滴度之間的差異的顯著性。腫瘤保護(hù)分析。表達(dá)卵清蛋白(B16-OVA)的B16黑色素瘤細(xì)胞(3)由DrK.Rock(Dana-FarberCancerInstitute，Boston，USA)惠贈。給各組C57BL/6小鼠(n＝6)肌注兩次～30μg的RNALeuMptRNA或?qū)φ誖NALeuControlRNA(間隔4周)或一次rVVMpt，進(jìn)行免疫接種，末次接種2周后，在小鼠背部兩處不同位置皮下注射B16-OVA細(xì)胞(每只小鼠105細(xì)胞)。注射前用電動剃刀去除注射部位周圍的毛發(fā)，以便觀察腫瘤的出現(xiàn)。監(jiān)測腫瘤的生長，當(dāng)腫瘤大小達(dá)到15mm×15mm時處死動物。在腫瘤攻擊實(shí)驗(yàn)后的指定天數(shù)計(jì)算每組的平均腫瘤面積。以方差分析(45)計(jì)算各組之間的平均腫瘤生長的差異。記錄動物被處死的時間并以Kaplan-Meier存活曲線(20)表示。以log-rank統(tǒng)計(jì)(20)計(jì)算存活曲線的差異。在以VLPLeuMpt進(jìn)行的腫瘤保護(hù)研究中，給雌性C57BL6(H-2b)小鼠(6-8周齡；n＝6)腹腔注射(i.p)這些VLP一次(VLPLeuMptx1)或兩次(VLPLeuMptx2，間隔兩周)；對照VLP(VLPLeucontrol)；或(iv)編碼Mpt的重組痘苗病毒(rVVMpt)，以進(jìn)行免疫接種。末次接種后2周，以5×105B16-OVA黑色素瘤腫瘤細(xì)胞皮下注射于2個不同部位對小鼠進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)。結(jié)果編碼鼠多表位的KUN復(fù)制子在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的有效復(fù)制。將編碼表達(dá)鼠多表位(Mpt)的KUN復(fù)制子cDNA的質(zhì)粒DNADNALeuMpt和DNAProMpt轉(zhuǎn)染至BHK21細(xì)胞，通過Northern印跡和IF分析測定相應(yīng)的復(fù)制子RNA在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制及其通過RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。通過電穿孔將體外合成的編碼Mpt的KUN復(fù)制子RNARNALeuMpt和RNAProMpt轉(zhuǎn)染至BHK21細(xì)胞，并分析其復(fù)制和表達(dá)。用KUN抗NS3抗體對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行IF分析顯示，在以基于DNA的復(fù)制子轉(zhuǎn)染后，～50％的細(xì)胞為陽性，而在以基于RNA的復(fù)制子進(jìn)行電穿孔后，～80％的細(xì)胞為陽性(圖2A)。在以前的用KUN復(fù)制子RNA進(jìn)行的電穿孔中，僅在這些RNA能夠復(fù)制的情況下(26，27)IF才能檢測到KUNNS3的表達(dá)。不過，轉(zhuǎn)染編碼KUNcDNA的質(zhì)粒DNA的確導(dǎo)致可通過IF檢測到KUN蛋白的表達(dá)，即使是在KUNRNA無法復(fù)制的情況下(30)。為確保細(xì)胞產(chǎn)生的來自轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNADNALeuMpt和DNAProMpt的復(fù)制子RNA是復(fù)制型的，我們通過用KUN特異性放射性標(biāo)記的cDNA探針進(jìn)行Northern印跡，對細(xì)胞總RNA進(jìn)行分析(圖2A)。將這些樣品中的放射性信號的強(qiáng)度與分離自以相同量的產(chǎn)生復(fù)制缺陷型KUN復(fù)制子RNA的對照質(zhì)粒DNApKUNβrep2(dGDD)(53)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的RNA樣品進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)以DNALeuMpt和DNAProMpt轉(zhuǎn)染的細(xì)胞所產(chǎn)生的KUN特異性RNA的量較以pKUNβrep2(dGDD)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞高大約5-10倍。以往對能夠復(fù)制的和復(fù)制缺陷型的基于DNA的KUN復(fù)制子構(gòu)建體的研究發(fā)現(xiàn)積聚的RNA的量存在相似的差異(53)。這些結(jié)果證實(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生的來自轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNADNALeuMpt和DNAProMpt的復(fù)制子RNA是能夠復(fù)制的。以KUN特異性cDNA探針對分離自以體外合成的RNARNALeuMpt和RNAProMpt電穿孔的細(xì)胞的總RNA進(jìn)行Northern印跡分析(圖2B)證實(shí)了IF的結(jié)果(圖2A)，它們共同證實(shí)KUN復(fù)制子RNA在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行有效的復(fù)制和積聚。請注意，RNA轉(zhuǎn)染的樣品的細(xì)胞總RNA在凝膠中的上樣量是DNA轉(zhuǎn)染的樣品的細(xì)胞總RNA上樣量的2倍以上(圖2B)，此外溴化乙啶凝膠染色發(fā)現(xiàn)相應(yīng)(RNA轉(zhuǎn)染的或DNA轉(zhuǎn)染的)樣品中核糖體RNA的濃度相似(數(shù)據(jù)未顯示)。為檢查復(fù)制子RNA在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過程中Mpt序列是否保留，以放射性標(biāo)記的特異于Mpt序列的cDNA探針對含有相同RNA樣品的膜(圖2B左側(cè))進(jìn)行再次分析。結(jié)果(圖2B右側(cè))與用KUN特異性探針得到的結(jié)果一致(圖2B左側(cè))，并明確證實(shí)，在復(fù)制子RNA在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的過程中，Mpt序列確實(shí)保留。產(chǎn)生含有Leu和Pro的構(gòu)建體的目的是評價KUNNS1基因的第250位氨基酸的此種突變對KUN復(fù)制子RNA的復(fù)制和積聚所可能產(chǎn)生的影響，且因此產(chǎn)生的對被編碼的HG在體外和體內(nèi)的表達(dá)水平的影響。以往發(fā)現(xiàn)，KUNNS1基因第250位氨基酸由Pro(野生型)突變?yōu)長eu導(dǎo)致NS1蛋白不能發(fā)生二聚化。這引起病毒在Vero細(xì)胞中的復(fù)制延遲并減弱病毒在小鼠中的復(fù)制(16)。以等量的含有Leu和含有Pro的病毒感染Vero細(xì)胞，在第一個24小時內(nèi)產(chǎn)生的含有Leu的病毒低于含有Pro的病毒大約100倍，但感染后48小時，含有Leu和含有Pro的病毒具有相似的產(chǎn)量。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，需要大約100倍以上的含有Leu的病毒才能在小鼠中產(chǎn)生類似的疾病的臨床癥狀(16)。在以KUN-Mpt復(fù)制子構(gòu)建體進(jìn)行的本研究中，以基于DNA的、含有Leu和含有Pro的復(fù)制子構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞中積聚的KUNRNA的量相似(比較圖2B中的DNALeuMpt和DNAProMpt)，而以體外轉(zhuǎn)錄的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)，以含有Leu的RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中RNA積聚的水平略微高于以含有Pro的RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(比較圖2B中的RNALeuMpt和RNAProMpt)。如上所述，由溴化乙啶染色判斷，核糖體RNA在相應(yīng)的樣品中是相似的。IF分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染RNALeuMptRNA同樣引起NS3陽性細(xì)胞比例輕度升高(圖2A)。引人注目的是，RNAProMptRNA轉(zhuǎn)染后可見圓形(死亡的)NS3陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯高于RNALeuMptRNA轉(zhuǎn)染(圖2A)，提示前者RNA具有更高的細(xì)胞致病性。以相應(yīng)的KUN復(fù)制子載體RNARNAPro和RNALeu進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，含有Pro的變體和含有Leu的變體之間在細(xì)胞致病性方面也存在類似的差異(數(shù)據(jù)未顯示)。以基于DNA、基于RNA以及基于VLP的、表達(dá)多表位免疫原的KUN復(fù)制子免疫接種誘導(dǎo)CTL應(yīng)答。鼠多表位免疫原(Mpt)含有4種結(jié)合的H-2d限制性CTL表位；其包括YPHFMPTNL(一種來自鼠巨細(xì)胞病毒pp89的H-2Ld限制性表位)、RPQASGVYM(來自LCMV核蛋白的H-2Ld限制性表位)、TYQRTRALV(來自流感病毒核蛋白的H-2Kd表位)以及SYIPSAEKI(來自伯氏瘧原蟲(P.Berghei)環(huán)子孢子蛋白的H-2Kd表位)。以編碼該Mpt免疫原的KUN復(fù)制子DNA、RNA和VLP免疫接種Balb/c小鼠一次，2-3周后，用IFN-γELISPOT測定針對該4種CTL肽表位中的每種的CTL應(yīng)答(圖3A)。由DNA、RNA或VLPKUN疫苗產(chǎn)生的應(yīng)答ELISPOT與由編碼相同多表位免疫原(rVVMpt)的重組痘苗病毒誘導(dǎo)的應(yīng)答相當(dāng)(圖3A)，而顯著高于由編碼相同免疫原的常規(guī)DNA疫苗(31)所誘導(dǎo)的應(yīng)答(見圖4)。以往已經(jīng)觀察到表位應(yīng)答具有層次(hierarchy)，RPQ特異性應(yīng)答較YPH應(yīng)答更有優(yōu)勢，而SYI應(yīng)答較TYQ應(yīng)答更有優(yōu)勢，據(jù)認(rèn)為這反映了亞優(yōu)勢表位的較低的MHC結(jié)合親和力(31)。盡管在轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞中含有Pro的復(fù)制子似乎較含有Leu的復(fù)制子具有更強(qiáng)的細(xì)胞致病性(見前文)，但在誘導(dǎo)CTL應(yīng)答方面這些變體之間沒有明顯差異(圖3A和圖4)。小鼠經(jīng)VLPProMpt免疫接種一次，通過51C釋放分析對誘導(dǎo)CTL應(yīng)答進(jìn)行分析。觀察到特異于每種表位的顯著的CTL活性(圖3B)。這些應(yīng)答同樣與以往用rVVMpt免疫接種一次的小鼠的應(yīng)答(51)相當(dāng)，并高于以常規(guī)的編碼多表位免疫原的DNA疫苗(50)免疫接種2次的小鼠的應(yīng)答。以十倍系列稀釋的基于DNA的KUN多表位復(fù)制子DNALeuMpt和DNAProMpt對小鼠進(jìn)行免疫接種說明，僅用0.1μg的KUN復(fù)制子DNA單次免疫接種仍然能檢測到CTL應(yīng)答(圖4)。由0.1μgKUN疫苗誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答的幅度與用100μg的常規(guī)質(zhì)粒DNA多表位疫苗免疫接種所誘導(dǎo)的應(yīng)答相當(dāng)(圖4)。本節(jié)的數(shù)據(jù)說明，以三種不同方式(DNA、RNA和VLP)之任一種方式輸送的KUN基于復(fù)制子的疫苗均能有效誘導(dǎo)CTL，其產(chǎn)生的應(yīng)答的幅度與基于重組痘苗病毒的載體相當(dāng)，而顯著高于常規(guī)的DNA疫苗。免疫接種編碼多表位的裸RNA或VLP保護(hù)小鼠對抗病毒和攻擊實(shí)驗(yàn)。為了確定免疫接種KUN復(fù)制子載體所誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答是否能夠產(chǎn)生抗病毒攻擊實(shí)驗(yàn)的保護(hù)作用，給小鼠免疫接種一次RNALeuMptRNA或RNALeuControlRNA(由RNALeu載體DNA制備得到)，然后以rVVMpt進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)。rVVMpt攻擊實(shí)驗(yàn)分析測定了由KUN疫苗呈遞的所有4種H-2d限制性表位介導(dǎo)的保護(hù)作用。單次RNALeuMptRNA免疫接種后，觀察到卵巢rVV滴度顯著下降(～70％)(圖5A；p＝0.03)。采用常規(guī)的DNA多表位疫苗，只有進(jìn)行2次免疫接種后才能得到與此相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用(50)。Mpt序列還編碼來自卵清蛋白的CTL表位，SIINFEKL(50，51)，因此可以用表達(dá)卵清蛋白的B16腫瘤細(xì)胞(B16-OVA)進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)以檢測KUN免疫接種的腫瘤保護(hù)作用。小鼠以RNALeuMpt和RNALeuControl免疫接種2次或以rVVMpt免疫接種一次，然后以B16-OVA進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)。與RNALeuControl免疫接種的動物相比，在RNALeuMpt免疫接種的小鼠中腫瘤生長的速度明顯較慢(p＜0.001)(圖5B，上圖)。此外，RNALeuMpt免疫接種的小鼠中腫瘤生長的平均速度也低于rVVMpt免疫接種的小鼠(p＝0.001)。同一實(shí)驗(yàn)還表示為Kaplan-Meier曲線(圖5B，下圖)，其顯示的是在指定時間點(diǎn)小鼠存活的百分?jǐn)?shù)。同樣，RNALeuMpt免疫接種的小鼠明顯優(yōu)于RNALeuControl免疫接種的動物(p＝0.015)以及rVVMpt免疫接種的動物(p＝0.016)。參照圖5C，數(shù)據(jù)顯示，與接種裸RNA相比，免疫接種VLPLeuMpt極大地提高了接受免疫的小鼠在B16-OVA腫瘤攻擊實(shí)驗(yàn)中的存活。還注意到，2次免疫接種VLP(VLPLeuMptx2)較1次免疫接種VLP(VLPLeuMptx1)可改善存活率。改良的病毒包裝系統(tǒng)的產(chǎn)生和評價采用三種不同方法以改良先前在國際申請WO99/28487中開發(fā)的Kunjin復(fù)制子RNA包裝系統(tǒng)，以便提高包裝效率并簡化包裝方案。(i)第一種方法涉及改良衍生自SFV的包裝構(gòu)建體SFV-MEC105，通過在第713位引入亮氨酸至脯氨酸的氨基酸突變以降低其致病性(SFVMEC/L713P；圖7)。這使得Kunjin結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)延長而對SFVRNA復(fù)制無不良影響，并通過同時轉(zhuǎn)染Kunjin和SFVMEC/L713PRNA而簡化了包裝方案。這些結(jié)果在表1和2中給出。以往試圖采用同時轉(zhuǎn)染Kunjin和SFV-MEC105RNA，結(jié)果完全抑制了KunjinRNA復(fù)制。(ii)第二種方法涉及產(chǎn)生一種穩(wěn)定的細(xì)胞系，其持續(xù)產(chǎn)生來自改良的非細(xì)胞致病性的SFV復(fù)制子RNA的Kunjin結(jié)構(gòu)蛋白。為此，本發(fā)明人將一種IRES-Neo盒插入至SFVMEC/L713P構(gòu)建體(SFVMEC/L713P/Neo；圖8)中，并通過抗生素G418篩選建立了一種穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞克隆。以Kunjin復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系使其能夠復(fù)制并產(chǎn)生相對高滴度的KunjinVLP(表3和4)。(iii)第三種方法是產(chǎn)生一種穩(wěn)定表達(dá)非細(xì)胞致病性的SFV復(fù)制子RNApSFV3L713PLacZNeo(圖9)的細(xì)胞系，以便用其擴(kuò)增轉(zhuǎn)染的SFV輔助RNApSFVHelperprMEC(圖10)和pSFVHelperCprME(圖11)以表達(dá)Kunjin結(jié)構(gòu)蛋白。當(dāng)這兩種輔助RNA之一與Kunjin復(fù)制子RNA一同轉(zhuǎn)染至pSFVL713PlacZNeo細(xì)胞系時，SFV輔助RNA和KUN復(fù)制子RNA均可被擴(kuò)增，這導(dǎo)致產(chǎn)生分泌型KunjinVLP，盡管滴度相對較低(表5)。細(xì)胞致病性和非細(xì)胞致病性的衍生自SFV的包裝構(gòu)建體之間產(chǎn)生KunjinVLP的相對效率。首先，以轉(zhuǎn)錄自構(gòu)建體如RNALeuMpt的Kunjin復(fù)制子RNA(含有異源性基因)對BHK21細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。然后，在32小時，用分別轉(zhuǎn)錄自pSFVMEC105或pSFVMECL713P的細(xì)胞致病性(cyto)或非細(xì)胞致病性的(noncyto)塞姆利基森林病毒RNA對這些KunjinRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。然后如表1所示，在第二次轉(zhuǎn)染后的不同時間收集此含有分泌型VLP的組織培養(yǎng)液?；蛘撸瑢unjin復(fù)制子RNA和非細(xì)胞致病性的SFVRNA同時轉(zhuǎn)染至BHK21細(xì)胞內(nèi)，并如表2所示，以不同的時間間隔收集此組織培養(yǎng)液。還應(yīng)該主要的是，如表1和2所示，選取KunjinRNA與SFVRNA的不同比例以便使得VLP表達(dá)水平達(dá)到最佳。Kunjin復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染后KunjinVLP在表達(dá)來自改良的非細(xì)胞致病性的衍生自SFV的包裝構(gòu)建體的Kunjin結(jié)構(gòu)蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系中的產(chǎn)生。穩(wěn)定細(xì)胞系SFVMECA12表達(dá)用于產(chǎn)生VLP的來自非細(xì)胞致病性的SFV復(fù)制子的Kunjin結(jié)構(gòu)蛋白。該細(xì)胞系表達(dá)編碼Kunjin結(jié)構(gòu)蛋白的非細(xì)胞致病性的SFV復(fù)制。為了建立該細(xì)胞系，以SFVMECL713PNeoRNA(圖8)轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，并通過在含有1mg/mlG418的培養(yǎng)基中孵育而選出一個克隆，A12。然后以編碼異源性基因如HIVGAG或鼠多表位(Mpt)的Kunjin復(fù)制子RNA進(jìn)行電穿孔以評價該細(xì)胞克隆。以Kunjin復(fù)制子RNA電穿孔后，在不同時間點(diǎn)收集組織培養(yǎng)液，并通過感染分析和免疫熒光法測算VLP的滴度(表3)。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中評價了不同孵育溫度對產(chǎn)生VLP的影響。也就是說，以Kunjin復(fù)制子RNA對SFVMECA12細(xì)胞進(jìn)行電穿孔后，將細(xì)胞孵育在37℃、33℃或37C/33℃(37℃過夜然后33℃)直至轉(zhuǎn)染后50小時(表4)。共轉(zhuǎn)染表達(dá)Kunjin結(jié)構(gòu)蛋白的SFVHelperRNA和Kunjin復(fù)制子RNA后，表達(dá)非細(xì)胞致病性的SFV復(fù)制子的穩(wěn)定細(xì)胞系產(chǎn)生KunjinVLP。使用構(gòu)建體pSFV3L713PlacZNeo建立表達(dá)非細(xì)胞致病性的SFV復(fù)制子和LacZ基因的穩(wěn)定細(xì)胞系。該細(xì)胞系表達(dá)具有L713P突變的非細(xì)胞致病性的SFV復(fù)制子、所編碼的Neo和LacZ基因。根據(jù)LacZ的表達(dá)監(jiān)測這些細(xì)胞中的表達(dá)水平和均一性。選擇不同的克隆進(jìn)一步分析VLP的產(chǎn)生，即克隆C5、C6和C11。同時以Kunjin復(fù)制子RNA和兩種SFV-Kunjin輔助RNA之一電穿孔每種細(xì)胞克隆。所述Kunjin復(fù)制子RNA編碼異源性基因如HIVGAG或鼠多表位(Mpt)。所述SFV-Kunjin輔助RNA編碼置于一種26S啟動子控制下的KunjinCprME基因盒(pSFVHelperCprME；圖10)或者是置于兩種不同26S啟動子控制下的KunjinprME和C基因(pSFVHelperprMEC；圖11)，均克隆入pSFVHelper2載體。在轉(zhuǎn)染后28小時和45小時收集組織培養(yǎng)液以檢測顆粒產(chǎn)生的水平(表5)。實(shí)施例2材料與方法質(zhì)粒?；赗NA的和基于DNA的KUN復(fù)制子載體(分別為C20UbHDVrep和pKUNrep1)在克隆位點(diǎn)的上游含有小鼠泛素基因并在克隆位點(diǎn)的下游含有FMDV2A自身蛋白酶序列，將其用于構(gòu)建含有HIV-1gag基因的質(zhì)粒。基本上，通過PCR自質(zhì)粒pBRDH2-neo擴(kuò)增完整的HIV-1gag基因，引物為gagBssHII-F(5′-ACCATGGGCGCGAGCATCGGTATTA-3′)和gagBssHII-R(5′-CTAAAGCGCGCCTTGTGACGAGGGGTC-3′)。將PCR產(chǎn)物以BssHII消化并分別插入至此兩種KUN載體的AscI位點(diǎn)以產(chǎn)生質(zhì)粒KUNRNAgag和KUNDNAgag。制備KUNgagVLP?；旧习凑涨笆龇椒ㄖ苽銿LP，不同之處在于用大約30μg體外轉(zhuǎn)錄的KUNgagRNA對3×106BHK21細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。電穿孔后32小時，將細(xì)胞以胰蛋白酶消化并進(jìn)行第二次電穿孔，電穿孔使用的是自構(gòu)建體SFVMEC105的一種細(xì)胞致病性較低的形式，即含有亮氨酸713被取代為脯氨酸的nsP2基因的SFVL713PMEC體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA。第二次電穿孔后，將細(xì)胞在37℃孵育18小時，然后將培養(yǎng)基更換為6ml的DMEM-5％FCS，將細(xì)胞在33℃進(jìn)一步孵育30小時。通過以10倍系列稀釋的VLP感染Vero細(xì)胞并在感染后30-40小時進(jìn)行免疫熒光分析計(jì)數(shù)NS3陽性細(xì)胞數(shù)量來確定感染性VLP的滴度。對小鼠進(jìn)行免疫接種。雌性BALB/c(H-2d)小鼠(6-8周齡)得自AnimalResourcesCentre(Perth，WesternAustralia)。將小鼠以下列之一進(jìn)行免疫接種(i)gagVLP溶于DMEM-5％FCS，腹腔內(nèi)注射(i.p.)，每只小鼠大約1×106感染單位，以及(ii)編碼HIV-1gag的重組痘苗病毒(107pfu，溶于200μl的RPMI1640，i.p.)。間接ELISA。將96孔板以1μg純化的重組p55抗原在4℃的抗原包被緩沖液中(15mMNa2CO3，35mMNaHCO3，pH9.6)包被過夜。然后將各孔在50μl封閉緩沖液(0.25％Gelatin/0.1％Tween-20溶于PBS)中37℃孵育1小時進(jìn)行封閉，并以洗滌緩沖液(0.05％Tween-20溶于PBS)洗滌3次。將來自經(jīng)過免疫的小鼠的血清稀釋于封閉緩沖液中，室溫孵育1-2小時，然后洗滌3次。以第二抗體，即1∶2000稀釋于封閉緩沖液中的綴合辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgG，在室溫下孵育30分鐘。洗滌3次，然后，以50μl的K-BlueTMB底物(GraphicScientific，Australia)在室溫下避光孵育10分鐘直至發(fā)生結(jié)合的綴合物得以顯色。加入50μl的2MH2SO4終止反應(yīng)，使用ELISA平板讀數(shù)器測定OD450吸光度讀數(shù)。KunjinVLP中和分析。將200μl含有衣殼化的KUN載體復(fù)制子RNA(5×105IU)的KUNVLP與20μl的來自KUNgagVLP免疫接種的小鼠的3種不同的血清樣品在37℃孵育1小時，所述小鼠經(jīng)ELISA測定顯示具有最高的gag抗體滴度。還將VLP在相同條件下進(jìn)行無抗體孵育以及與KUN抗E單克隆抗體(Mab)進(jìn)行孵育，作為分析的陽性和陰性對照。孵育后，通過用每種樣品的稀釋液感染Vero細(xì)胞而確定每種樣品的滴度。用KUN抗NS3抗體進(jìn)行IF分析并計(jì)數(shù)陽性點(diǎn)，計(jì)算滴度。痘苗病毒保護(hù)分析。按照每只小鼠～106IU的KUNgagVLP，對各組(n＝5-6)6-8周齡的雌性Balb/c小鼠進(jìn)行免疫接種(i)一次或兩次(間隔4周)，3周后進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)，即每只小鼠腹腔注射107PFU的編碼HIV-1gag(rVVgag(14))的重組痘苗病毒。感染后第4天，切除雙側(cè)卵巢，洗滌并使用電動研磨器在1ml的PBS中進(jìn)行勻漿。通過在匯合的CV1細(xì)胞上進(jìn)行斑點(diǎn)分析確定卵巢懸液中的痘苗病毒的滴度。采用Wilcoxonrank-sum檢驗(yàn)計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對照組的病毒滴度之間的差異的顯著性。測定CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。雌性Balb/c(H-2d)小鼠(6-8周齡)得自AnimalResourceCentre(Perth，WA)。小鼠(n＝4)經(jīng)腹腔內(nèi)注射(i.p)KUNgagVLP一次(KUNgagVLP)進(jìn)行免疫接種或保持未免疫狀態(tài)(原初(naive))。免疫后2周，將小鼠挑出并處死，取脾細(xì)胞(gag)或單純的培養(yǎng)基(Media)在最后18小時中脈沖式加入3H胸苷。收集細(xì)胞于玻璃纖維上，測定配對物和β-射線。Gag脈沖的原初脾細(xì)胞在分析前一天制備；以RBC裂解緩沖液處理來自原初小鼠的脾細(xì)胞，并以2μg/ml的HIV-1gag蛋白在體外脈沖過夜。結(jié)果接種表達(dá)HIV-1gag的KUN復(fù)制子后誘導(dǎo)針對HIVGag蛋白的抗體應(yīng)答。測定接種了2次KUNgagVLP(106IU每只小鼠)或1次編碼HIV-1gag的重組痘苗病毒(rVVgag；107PFU每只小鼠)的小鼠的血清中的抗gag抗體。接種gagVLP的8只小鼠中的6只和接種rVVgag的4只小鼠中的3只對免疫接種產(chǎn)生應(yīng)答，并在這些小鼠中檢測到顯著的抗gag抗體滴度(＞1∶12800)(圖12)。這些抗體應(yīng)答與免疫接種KUNgagVLP和rVVgag的小鼠的應(yīng)答相似。免疫接種KUN復(fù)制子VLP后未出現(xiàn)針對KUNVLP蛋白的中和抗體應(yīng)答。為了確定接種KUNgagVLP后是否出現(xiàn)針對KUNVLP表面的KUN包膜蛋白的中和抗體應(yīng)答，我們通過將來自免疫接種KUNgagVLP的和未免疫接種的小鼠的血清與含有衣殼化KUN載體復(fù)制子RNA的KUNVLP進(jìn)行孵育，進(jìn)行感染性中和分析。未與任何抗體孵育的KUNVLP的滴度是2.8×106IU/ml。與來自未免疫接種的小鼠的3種不同血清孵育的KUNVLP的平均滴度是2.1×106IU/ml。當(dāng)KUNVLP與針對KUNE蛋白的單克隆抗體孵育時，未觀察到感染性。與來自2次接種KUNgagVLP的小鼠的3種不同血清孵育的KUNVLP的平均滴度是6.3×105IU/ml。非參數(shù)非配對Mann-Whitney檢驗(yàn)顯示，未免疫接種的小鼠的血清相比，在用來自接種KUNgagRNA的小鼠的血清進(jìn)行的中和分析中，VLP滴度無顯著性差異(p＜0.1)。因此，2次免疫接種KUNgagVLP后，沒有觀察到針對VLP中的KUN蛋白的明顯的中和抗體應(yīng)答。以編碼HIV-1gag的KUN復(fù)制子進(jìn)行的VLP顆粒免疫接種保護(hù)小鼠抵抗實(shí)驗(yàn)性病毒攻擊實(shí)驗(yàn)。為了確定由免疫接種KUN復(fù)制子載體誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答是否能夠保護(hù)抵抗病毒攻擊實(shí)驗(yàn)，給各組的6只小鼠免疫接種1次或2次KUNgagVLP或者是不接種，然后以rVVgag進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)。1次免疫接種組中的6只小鼠中有3只(50％)而2次免疫接種組中的6只小鼠中有4只(67％)完全沒有攻擊實(shí)驗(yàn)病毒(表1)，說明產(chǎn)生完全的保護(hù)作用。KUNgagVLPx1組的1只小鼠攜帶的攻擊實(shí)驗(yàn)病毒的滴度幾乎與未免疫接種的小鼠(2×107)相同，提示免疫接種失敗。因此，接種1次和2次KUNgagVLP的其余2只產(chǎn)生應(yīng)答的小鼠的平均滴度分別為6.7×106IU/ml和1.3×105IU/ml，這說明在接種1次或2次的小鼠中，自107PFU的攻擊實(shí)驗(yàn)病毒rVVgag，病毒復(fù)制的減少高達(dá)超過6個對數(shù)級。本節(jié)的結(jié)果證實(shí)，編碼HIV-1gag基因的KUN基于復(fù)制子的疫苗誘導(dǎo)了HIV-1gag特異性的保護(hù)性CTL應(yīng)答，單次VLP免疫接種產(chǎn)生了較兩次免疫接種裸RNA更加有效的保護(hù)作用。編碼HIV-1gag的KunjinVLP引發(fā)gag特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)是要確定針對HIV-1gag的抗體產(chǎn)生是否伴有來自CD4+T細(xì)胞的T細(xì)胞輔助。圖13的數(shù)據(jù)指出，對于VLPgag免疫接種的小鼠，刺激指數(shù)(SI)為3.4，而對于原初小鼠，該SI為接近0。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了在免疫接種的小鼠中存在VLPgag誘導(dǎo)的特異性的CD4T細(xì)胞應(yīng)答。實(shí)施例3誘導(dǎo)長期的保護(hù)性CD8T細(xì)胞應(yīng)答方法制備VLP。VLP的制備基本上如前所述，不同之處在于，用大約30μg體外轉(zhuǎn)錄的KUNgagRNA對3×106BHK21細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。電穿孔32小時后，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用體外轉(zhuǎn)錄的編碼KUN結(jié)構(gòu)蛋白的非細(xì)胞致病性塞姆利基森林病毒復(fù)制子RNA(衍生自SFV-MEC105的SFV-L713PMEC105；ref28)進(jìn)行第二次電穿孔，并孵育48小時，然后收集分泌的VLP。通過以10倍系列稀釋的VLP感染Vero細(xì)胞，并在感染后30-40小時進(jìn)行IF分析計(jì)數(shù)NS3陽性細(xì)胞而確定感染性VLP的滴度。對小鼠進(jìn)行免疫接種。雌性BALB/c(H-2d)小鼠(6-8周齡)得自AnimalResourcesCentre(Perth，WesternAustralia)。小鼠以下列之一進(jìn)行免疫接種(i)100μg的KUNgagDNA，稀釋于100μlPBS，并肌注(i.m.)于每條后腿的四頭肌部位(每條腿50μl)，(ii)大約30μg的體外轉(zhuǎn)錄的KUNgagRNA，溶于100μl焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)處理的，并肌注(每條腿50μl)，(iii)KUNgagVLP溶于DulbeccomodifiedEaglemedium(DMEM)-5％FCS，注射于腹腔內(nèi)(i.p.)，每只小鼠大約～1×106感染單位，(iv)編碼鼠多表位的KUNVLP(KUNmptVLP)，其含有4個H-2d限制性表位YPHFMPTML(YPH)、RPQASGVYM(RPQ)、TYQRTRALOV(TYQ)、SYIPSAEKI(SYI)(60)，并按照(iii)注射，以及(v)編碼HIV-1gag(WRTK-)的重組痘苗病毒(rVVgag)(2×107pfu溶于200μlPBS，i.p.)。ELISPOT和鉻釋放分析。使用如前所述(34)的肽表位(Mimotopes，Clayton，Australia)通過ELISPOT分析計(jì)數(shù)表位特異性的分泌IFN-γCD8T細(xì)胞。采用非配對學(xué)生t檢驗(yàn)確定各組之間的差異的顯著性。使用免疫接種后2-3周處死的小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行51Cr釋放分析，且脾細(xì)胞以照射過的LPS母細(xì)胞(應(yīng)答細(xì)胞∶刺激細(xì)胞比例20∶1)在體外再刺激6天，該LPS母細(xì)胞以AMQMLKETI肽致敏(25μg/ml處理1小時，200μl培養(yǎng)基，37℃，隨后洗滌2次)。將得到的效應(yīng)細(xì)胞群平分，并將等量的細(xì)胞以雙份的形式與肽致敏的和非致敏的51Cr標(biāo)記的P815靶細(xì)胞作用，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例是指定的。痘苗病毒保護(hù)分析。給各組(n＝6)6-8周齡的雌性Balb/c小鼠(AnimalResourcesCentre，Perth，Australia)進(jìn)行免疫接種，且和對照進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)，即每只小鼠腹腔注射106pfu的編碼HIV-1gag(rVVgag)的重組痘苗病毒(WRTK-)或等量的rVVmpt(參考文獻(xiàn)31)。感染后第4天，切除雙側(cè)卵巢，洗滌并使用鋁網(wǎng)在1ml的PBS中進(jìn)行勻漿。通過在匯合的CV1細(xì)胞上進(jìn)行斑點(diǎn)分析確定卵巢中的痘苗病毒的滴度。采用非參數(shù)非配對t檢驗(yàn)計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對照組的病毒滴度之間的差異的顯著性。結(jié)果給小鼠接種一次KUNgagVLP僅免疫，然后在2周和6個月后通過ELISPOT分析AMQ特異性應(yīng)答。6個月時的應(yīng)答較2周時無明顯降低(p＝0.75，圖14A)，說明KUNgagVLP疫苗誘導(dǎo)了長期持續(xù)的CD8T細(xì)胞應(yīng)答。與此類似，使用一種編碼鼠多表位的KUNVLP(KUNmptVLP)，即一種編碼4種H-2d限制性CD8T細(xì)胞表位的疫苗進(jìn)行免疫接種后，觀察到存在長期的能夠分泌IFN-γ的表位特異性CD8T細(xì)胞。我們此前已經(jīng)說明了在接種KUNmptVLP2-3周后出現(xiàn)針對這4種表位的應(yīng)答，而現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)6個月后這些應(yīng)答沒有明顯地減弱(圖14B)，說明長期維持的CD8T細(xì)胞應(yīng)答并不局限于AMQ特異性CD8T細(xì)胞。此外，使用編碼同樣4種表位的重組痘苗病毒對10個月前接種KUNmptVLP的小鼠進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)，依舊明顯存在實(shí)質(zhì)性的保護(hù)作用(圖14C)。與對照小鼠相比，接種KUNmptVLP的小鼠的卵巢病毒滴度平均下降大約120倍(p＝0.015)，83％的接種KUNmptVLP的小鼠中攻擊實(shí)驗(yàn)病毒完全消失。實(shí)施例4選擇適于在BHK細(xì)胞中持久復(fù)制的KUN復(fù)制子突變體選擇攜帶持久復(fù)制型KUN復(fù)制子RNA的嘌呤霉素抗性BHK細(xì)胞克隆。以體外轉(zhuǎn)錄的repPACβ-galRNA對BHK21細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，repPACβ-galRNA具有與野生型KUNcDNA相同的序列，包括NS1中250位的Pro(參考文獻(xiàn)16)。通過在含有5μg/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基中孵育7天建立嘌呤霉素抗性細(xì)胞克隆。將各個細(xì)胞克隆挑出并在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中傳代4代。經(jīng)X-gal染色測定，細(xì)胞為100％β-gal陽性，通過β-半乳糖苷酶分析試劑盒(Promega)測定不同細(xì)胞克隆的β-gal表達(dá)情況。不同細(xì)胞克隆之間的β-gal表達(dá)水平具有很寬的范圍(圖15)。選出具有不同表達(dá)水平的兩種差別明顯的克隆No.11和No.20用于對KUN復(fù)制子RNA進(jìn)行測序分析。確定來自兩種選定的細(xì)胞克隆的KUN復(fù)制子RNA的適應(yīng)性突變。使用AbsolutelyRNA試劑盒(Qiagen)分離來自嘌呤霉素抗性細(xì)胞克隆No.11和No.20的KUN復(fù)制子RNA，RT-PCR擴(kuò)增，并使用BigDye測序試劑盒(PerkinElmer)通過測序分析來確定完整的KUN復(fù)制子序列(不包括β-gal基因)。在自克隆20分離的KUNRNA中發(fā)現(xiàn)一種適應(yīng)性突變(NS2A中的Asn101被Asp取代)，在分離自克隆11的KUNRNA中發(fā)現(xiàn)兩種適應(yīng)性突變(NS2A中的Ala30被Pro取代，以及NS5中的Pro270被Ser取代)(表7)。適應(yīng)性突變賦予在BHK細(xì)胞中達(dá)到持久復(fù)制的優(yōu)勢。通過定點(diǎn)PCR誘變，將由分離自克隆11和克隆20的KUN復(fù)制子RNA中鑒定出的適應(yīng)性突變分別引入最初的repPACβ-ga1構(gòu)建體以產(chǎn)生repPACβ-gal/NS2A(A-P)、repPACβ-gal/NS2A(N-D)和repPACβ-gal/NS5(P-S)。用野生型和突變的RNA對BHK細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，并在加入嘌呤霉素后第4天，通過嘌呤霉素抗性細(xì)胞克隆數(shù)目的差別評價適應(yīng)性突變的效果(圖16)。如圖16所見，與野生型復(fù)制子相比，轉(zhuǎn)染含有突變的RNA導(dǎo)致選擇出更多數(shù)量的嘌呤霉素抗性細(xì)胞克隆，其中NS2A中Ala30被Pro取代的突變產(chǎn)生了最為有效的在BHK細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的適應(yīng)性。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，相同的突變還產(chǎn)生了在HEK293細(xì)胞中達(dá)到持久復(fù)制的優(yōu)勢。綜合討論本發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)，KUN復(fù)制子載體單次免疫就能夠誘導(dǎo)針對其所編碼的免疫原的CTL。所用三種輸送模式，即裸RNA、質(zhì)粒DNA以及VLP，均可有效誘導(dǎo)CD8+CTL應(yīng)答。免疫接種裸復(fù)制子RNA和VLP同樣保護(hù)小鼠抵抗病毒和腫瘤攻擊實(shí)驗(yàn)。這些結(jié)果證實(shí)基于KUN復(fù)制子的疫苗載體能夠用于誘導(dǎo)包括CD8+CTL和CD4+T細(xì)胞的保護(hù)性T細(xì)胞應(yīng)答。與用重組痘苗病毒，即一種被廣泛視作能夠有效誘導(dǎo)CTL的載體的疫苗載體模型(44)相比，使用KUN復(fù)制子載體所得到的CTL應(yīng)答的程度與之相當(dāng)或更優(yōu)越。目前正在測試一些痘病毒疫苗載體在靈長類和人類誘導(dǎo)保護(hù)性CTL的能力；這些包括改良的安卡拉痘苗病毒(vacciniaAnkara)(48)、禽痘病毒(43)和ALVAC(15)。α病毒復(fù)制子已經(jīng)被廣泛用于在動物模型中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，同時衍生自VEE病毒的復(fù)制子最近已經(jīng)被批準(zhǔn)用于人類臨床前期試驗(yàn)(http//www.alphavax.com/ppinhouse.html)。這里的結(jié)果顯示KUN復(fù)制子可通過三種不同的模式輸送作為裸RNA、作為質(zhì)粒DNA以及作為VLP。僅僅以0.1μg的KUN基于DNA的復(fù)制子進(jìn)行免疫接種就足以誘發(fā)CTL應(yīng)答。而要達(dá)到相似的CTL誘導(dǎo)水平，則需要免疫接種劑量為1000倍以上(100μg)的常規(guī)質(zhì)粒DNA疫苗(圖4)。本發(fā)明的一個具體的方面涉及RNA免疫接種。裸RNA免疫接種可避免涉及DNA整合的問題，并具有優(yōu)于免疫接種VLP的其他的優(yōu)勢。不同于裸RNA，免疫接種VLP有可能導(dǎo)致誘導(dǎo)針對VLP結(jié)構(gòu)蛋白的中和抗體應(yīng)答，這一現(xiàn)象可能會限制VLP在個體中的使用次數(shù)?；赗NA的疫苗還較VLP更容易制造。最近的報道還提示RNA能夠被包囊化入微顆粒中，并通過以基因槍轟擊的方法施用于動物(37，54)。還發(fā)現(xiàn)包囊化的RNA能夠在4℃穩(wěn)定8-12個月。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，以KUN復(fù)制子疫苗進(jìn)行RNA免疫接種可誘導(dǎo)特異于所編碼的免疫原的CTL應(yīng)答，其效率堪與使用基于DNA的或基于VLP的KUN復(fù)制子進(jìn)行免疫接種所達(dá)到的效率相媲美(圖3A)。使用KUN或SIN復(fù)制子進(jìn)行RNA免疫接種還可在多種腫瘤模型中誘導(dǎo)顯著的抗腫瘤保護(hù)作用(圖5B)(58)。黃病毒的一個獨(dú)特的特征可證實(shí)使用其復(fù)制子作為安全的疫苗載體是有益的?？傮w而言，尚未發(fā)現(xiàn)黃病毒在天然存在的不同病毒或病毒株之間發(fā)生重組的跡象。我們以前使用缺陷型全長KUNRNA和復(fù)制子RNA作為輔助物進(jìn)行的多個補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)也沒有發(fā)現(xiàn)這兩種(全長和復(fù)制子)在同一細(xì)胞中共同復(fù)制的RNA之間有任何重組跡象，盡管兩種RNA存在具有高度相同性的長區(qū)域(總結(jié)于參考文獻(xiàn)29)。用在NS1基因中含有缺失的黃熱病毒RNA進(jìn)行的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)補(bǔ)充來自同源性(黃熱病病毒)或來自異源性(登革熱病毒)病毒的輔助NS1(34，35)時，也沒有檢測到導(dǎo)致恢復(fù)重組病毒的重組。黃病毒的這種特征不同于文獻(xiàn)中廣泛記載所α病毒RNA的重組能力(18，42，46)，因此當(dāng)個體在免疫接種之前或之后的一段時間感染同一種或其他黃病毒時，其為該個體提供的免疫接種具有高水平的安全性。此外，使用來自完全不相關(guān)的病毒SFV的、用于表達(dá)KUN結(jié)構(gòu)蛋白的、基于RNA的復(fù)制子載體的KUN復(fù)制子包裝系統(tǒng)的異源性特性，以及表達(dá)構(gòu)建體的特殊設(shè)計(jì)，使得KUNVLP制劑絕對安全，并且不含任何感染性重組病毒物質(zhì)(28，52)?；蛟SKUN復(fù)制子最具區(qū)別性的特征之一在于其復(fù)制不會引起明顯的細(xì)胞致病效應(yīng)(CPE)或凋亡(26，52，53)。有文獻(xiàn)報道，含有疫苗抗原的感染細(xì)胞的CPE或凋亡是一種有效的交叉誘導(dǎo)(crosspriming)方法，結(jié)果是疫苗抗原被輸送至樹突狀細(xì)胞(DC)并有效誘導(dǎo)CTL(2，58)。不過，盡管其在體外的細(xì)胞致病性水平很低或檢測不到(含有Leu的變體；圖2A)，KUN復(fù)制子可在小鼠中有效誘導(dǎo)CTL應(yīng)答(圖3和4)。此外，在含有Leu和含有Pro的KUN復(fù)制子載體變體所誘導(dǎo)的CTL中沒有觀察到顯著的區(qū)別(圖3和4)，而以兩者轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞則出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞致病性(圖2A)。因此，KUN復(fù)制子誘導(dǎo)CTL可能不依賴于凋亡介導(dǎo)的交叉誘導(dǎo)(5)和/或可能不需要交叉誘導(dǎo)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，黃病毒能夠直接感染、復(fù)制并激活DC(19，21，22，32，57)，提示KUN復(fù)制子可能同樣能夠在DC中復(fù)制并產(chǎn)生疫苗抗原。疫苗載體直接感染DC可能代表了一種較交叉誘導(dǎo)更為有效的CTL誘導(dǎo)策略(49)。最近發(fā)現(xiàn)，嗜淋巴細(xì)胞性VEE復(fù)制子顆粒以及DC適應(yīng)性SIN復(fù)制子顆粒能夠感染DC并表達(dá)由其編碼的疫苗抗原(14，36)。不過，α病毒復(fù)制子RNA的細(xì)胞致病性可引起抗原呈遞DC的凋亡并降低CTL的激活或誘導(dǎo)。與此不同，具有有限細(xì)胞致病性的KUN復(fù)制子可使得抗原在DC中長期表達(dá)，而不會引起凋亡；這一特征可以促使對CTL應(yīng)答產(chǎn)生長期的刺激。由于持續(xù)存在雙鏈RNA，而這被認(rèn)為可誘導(dǎo)危險信號并激活DC(13)，因此誘導(dǎo)耐受的可能性不大?；蛟S免疫接種KUNVLP的最不同尋常的結(jié)果持續(xù)存在長達(dá)6-10個月的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，能夠在rVV攻擊實(shí)驗(yàn)分析的4天內(nèi)引起立即分泌IFN-γ并介導(dǎo)保護(hù)作用(圖14)。長期存在能夠立即產(chǎn)生保護(hù)性活性的CD8T效應(yīng)細(xì)胞可以成為有效的抗HIV免疫接種的一個重要特征，這是因?yàn)椋魧?shí)驗(yàn)后自疫苗誘導(dǎo)的記憶性CD8T細(xì)胞庫中產(chǎn)生新的效應(yīng)細(xì)胞的確是太慢了，其可能無法有效對抗迅速擴(kuò)張的逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染?？傊?，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，KUN復(fù)制子是誘導(dǎo)長期的、具有保護(hù)性的CD8+T細(xì)胞的有效的疫苗載體，并代表了癌癥和HIV疫苗中的一種很有吸引力的新模式。本說明書的目的在于結(jié)合優(yōu)選實(shí)施方案對本發(fā)明作出說明，而非是要將本發(fā)明限制于任何一種實(shí)施方案或是各種特征的具體集合。在不脫離本發(fā)明的寬泛的精神和范圍的條件下，可以對在此所述的實(shí)施方案作出各種變動和改良。本說明書中引用的所有計(jì)算機(jī)程序、演算法、專利以及科技文獻(xiàn)均以其全文并入本文作為參考。表1表2表6組rVVGag滴度降低的倍數(shù)表7參考文獻(xiàn)1.Agapov，E.V.，1.Frolov，B.D.Lindenbach，B.M.Pragai，S.Schlesinger，andC.M.Rice.1998.NoncytopathicSindbisvirusRNAvectorsforheterologousgeneexpression.ProcNatlAcadSciUSA.9512989-12994.2.Albert，M.L.，B.Sauter，andN.Bhardwaj.1998.DendriticcellsacquireantigenfromapoptoticcellsandinduceclassI-restrictedCTLs.Nature.39286-89.3.Bellone，M.，D.Cantarella，P.Castiglioni，M.C.Crosti，A.Ronchetti，M.Moro，M.P.Garancini，G.Casorati，andP.Dellabona.2000.Relevanceofthetumorantigeninthevalidationofthreevaccinationstrategiesformelanoma.JImmunol.1652651-2656.4.Berglund，P.，C.Smerdou，M.N.Fleeton，I.Tubulekas，andP.Liljestrom.1998.EnhancingimmuneresponsesusingsuicidalDNAvaccines.NatBiotechnol16562-5655.Binder，R.J.，D.K.Han，andP.K.Srivastava.2000.CD91areceptorforheatshockproteingp96.NatImmunol.1151-155.6.Bredenbeek，P.J.，I.Frolov，C.M.Rice，andS.Schlesinger.1993.SindbisvirusexpressionvectorspackagingofRNArepliconsbyusingdefectivehelperRNAs.JVirol.676439-6446.7.Conover，W.J.1980.Practicalnoparametricsatistics.Wiley，NewYork.8.Davis，N.L.，I.J.Caley，K.W.Brown，M.R.Betts，D.M.Irlbeck，K.M.McGrath，M.J.Connell，D.C.Montefiori，J.A.Frelinger，R.Swanstrom，P.R.Johnson，andR.E.Johnston.2000.VaccinationofmacaquesagainstpathogenicsimianimmunodeficiencyviruswithVenezuelanequineencephalitisvirusrepliconparticles.JVirol.74371-378.9.Elliott，S.L.，S.Pye，T.Le，L.Mateo，J.Cox，L.Macdonald，A.A.Scalzo，C.A.Forbes，andA.Suhrbier.1999.PeptidebasedcytotoxicT-cellvaccines；deliveryofmultipleepitopes，help，me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quán)利要求1的表達(dá)載體，其中所述的編碼自身蛋白酶的核苷酸序列分別編碼一種口蹄疫病毒2A自身蛋白酶。4.權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其中(i)中所述的突變的黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白選自如下一組(i)脯氨酸250突變?yōu)榱涟彼岬姆墙Y(jié)構(gòu)蛋白NS1；(ii)丙氨酸30突變?yōu)楦彼岬姆墙Y(jié)構(gòu)蛋白NS2A；(iii)天冬酰胺101突變?yōu)樘於彼岬姆墙Y(jié)構(gòu)蛋白NS2A；以及(iv)脯氨酸270突變?yōu)榻z氨酸的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5。5.權(quán)利要求1的表達(dá)載體，進(jìn)一步包含分別編碼C蛋白的前20個氨基酸(C20)和E蛋白的最后22個氨基酸(E22)的核苷酸序列。6.權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其中所述的復(fù)制子包含一或多種分別編碼選自NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B或NS5的野生型黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列。7.權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其中所述的復(fù)制子衍生自Kunjin病毒。8.權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其是SP6KUNrep5或pKUNrep5。9.權(quán)利要求2的表達(dá)載體，其是SP6KUNrep6或pKUNrep6。10.一種表達(dá)構(gòu)建體，其包含(i)一種編碼不能產(chǎn)生感染性病毒的黃病毒復(fù)制子的核苷酸序列，其中所述的黃病毒復(fù)制子編碼一或多種突變的黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白；(ii)一種異源性核酸；(iii)可操縱地連接于編碼所述的黃病毒復(fù)制子的核苷酸序列的啟動子；以及(iv)至少一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列。11.權(quán)利要求10的表達(dá)構(gòu)建體，其包含至少兩種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列，其中所述的至少一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列中的第一種位于所述的異源性核酸的5′，而所述的至少一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列中的第二種位于所述的異源性核酸的3′。12.權(quán)利要求10的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述的編碼自身蛋白酶的核苷酸序列分別編碼一種口蹄疫病毒2A自身蛋白酶。13.權(quán)利要求10的表達(dá)構(gòu)建體，其中(i)中所述的突變的黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白選自如下一組(i)脯氨酸250突變?yōu)榱涟彼岬姆墙Y(jié)構(gòu)蛋白NS1；(ii)丙氨酸30突變?yōu)楦彼岬姆墙Y(jié)構(gòu)蛋白NS2A；(iii)天冬酰胺101突變?yōu)樘於彼岬姆墙Y(jié)構(gòu)蛋白NS2A；以及(iv)脯氨酸270突變?yōu)榻z氨酸的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5。14.權(quán)利要求10的表達(dá)構(gòu)建體，進(jìn)一步包含分別編碼C蛋白的前20個氨基酸(C20)和E蛋白的最后22個氨基酸(E22)的核苷酸序列。15.權(quán)利要求10的表達(dá)構(gòu)建體，進(jìn)一步包含分別編碼選自NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B或NS5的一種野生型黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列。16.權(quán)利要求15的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述的黃病毒復(fù)制子衍生自Kunjin病毒。17.權(quán)利要求10的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述的異源性核酸編碼一種免疫原性蛋白質(zhì)。18.權(quán)利要求17的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述的免疫原是一種具有表位序列YPHFMPTNL、RPQASGVYM、TYQRTRALOV、SYIPSAEKI和SIINFEKL中的一或多種的鼠多表位蛋白。19.權(quán)利要求17的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述的免疫原性蛋白質(zhì)是HIVgag蛋白。20.權(quán)利要求10的表達(dá)構(gòu)建體，其是一種RNA構(gòu)建體。21.權(quán)利要求20的表達(dá)構(gòu)建體，其是RNALeuMpt、RNAProMpt或KUNRNAgag。22.權(quán)利要求10的表達(dá)構(gòu)建體，其是一種DNA構(gòu)建體。23.權(quán)利要求22的表達(dá)構(gòu)建體，其是DNALeuMpt、DNAProMpt或KUNDNAgag。24.包含權(quán)利要求10的表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。25.一種表達(dá)系統(tǒng)，其包含(i)權(quán)利要求10的表達(dá)構(gòu)建體；和(ii)至少另一種能夠表達(dá)一或多種蛋白的表達(dá)構(gòu)建體，所述的蛋白有助于將所述的表達(dá)構(gòu)建體包裝入黃病毒病毒樣顆粒(VLP)。27.權(quán)利要求25的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述的另一種表達(dá)構(gòu)建體衍生自塞姆利基森林病毒(SFV)或新培斯病毒(SIN)。28.權(quán)利要求27的表達(dá)系統(tǒng)，其衍生自SFV。29.權(quán)利要求27的表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)一步包含SFV的突變的nsP2基因。30.權(quán)利要求29的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述的SFV的突變的nsP2基因編碼一個由亮氨酸713至脯氨酸的取代。31.權(quán)利要求30的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述的至少另一種表達(dá)構(gòu)建體是SFVMEC/L713P/Neo、pSFV3L713PLacZNeo或SFVMEC/L713P。32.一種宿主細(xì)胞，其包含選自SFVMEC/L713P/Neo、pSFV3L713PLacZNeo或SFVMEC/L713P的所述的至少另一種表達(dá)構(gòu)建體。33.權(quán)利要求32的宿主細(xì)胞，其是以SFVMEC/L713P/Neo或pSFV3L713PLacZNeo穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞。34.權(quán)利要求32的宿主細(xì)胞，其進(jìn)一步包含權(quán)利要求10的表達(dá)構(gòu)建體。35.權(quán)利要求34的宿主細(xì)胞，其產(chǎn)生一或多種包含編碼一種免疫原性蛋白質(zhì)的RNA的VLP。36.一種藥物組合物，包含一種可在動物細(xì)胞中自其轉(zhuǎn)錄得到RNA的黃病毒DNA表達(dá)構(gòu)建體和一種藥物學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，其中所述的轉(zhuǎn)錄得到的RNA編碼(i)一種不能產(chǎn)生感染性病毒的黃病毒復(fù)制子；和(ii)一種免疫原性蛋白質(zhì)。37.一種藥物組合物，包含一種可自黃病毒DNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄得到的RNA和一種藥物學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，所述RNA編碼(i)一種不能產(chǎn)生感染性病毒的黃病毒復(fù)制子；和(ii)一種免疫原性蛋白質(zhì)。38.權(quán)利要求36或37的藥物組合物，其中所述的黃病毒DNA表達(dá)構(gòu)建體包含(i)編碼一種不能產(chǎn)生感染性病毒的黃病毒復(fù)制子的DNA序列，其中所述的黃病毒復(fù)制子編碼一或多種突變的黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白；(ii)一種編碼所述免疫原性蛋白質(zhì)的異源性DNA；(iii)一種在動物細(xì)胞內(nèi)可操縱的啟動子，且該啟動子可操縱地連接于所述編碼黃病毒復(fù)制子的DNA序列；和(iv)至少一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列。39.權(quán)利要求36或37的藥物組合物，其中所述的黃病毒是Kunjin病毒。40.權(quán)利要求36或37的藥物組合物，其是一種疫苗。41.權(quán)利要求40的疫苗，其在施用于動物后能夠引發(fā)一種保護(hù)性T細(xì)胞應(yīng)答。42.權(quán)利要求41的疫苗，其中所述的T細(xì)胞應(yīng)答是CTL應(yīng)答。43.權(quán)利要求42的疫苗，其中所述的CTL應(yīng)答的特征在于一種長期的效應(yīng)細(xì)胞CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。44.權(quán)利要求43的疫苗，其中所述的免疫原是一種病毒蛋白質(zhì)。45.權(quán)利要求44的疫苗，其中所述的病毒蛋白質(zhì)是HIVgag。46.權(quán)利要求40的疫苗，其中所述的動物是一種哺乳動物。47.權(quán)利要求46的疫苗，其中所述的哺乳動物是人。48.一種疫苗，包含由權(quán)利要求20的表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的一或多種VLP，其中所述的VLP包括一種編碼所述的免疫原性蛋白質(zhì)的RNA。49.權(quán)利要求48的疫苗，其中所述的免疫原性蛋白質(zhì)是一種病毒蛋白質(zhì)。50.權(quán)利要求49的疫苗，其中所述的病毒蛋白質(zhì)是HIVgag。51.一種免疫動物的方法，包括將權(quán)利要求40或權(quán)利要求48的疫苗施用于所述的動物的步驟從而在所述的動物中誘導(dǎo)免疫。52.權(quán)利要求51的方法，其中所述的免疫是抗體介導(dǎo)的。53.權(quán)利要求51的方法，其中所述的免疫是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述的免疫是T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。55.權(quán)利要求54的方法，其中T細(xì)胞免疫的特征在于CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。56.權(quán)利要求55的方法，其中T細(xì)胞免疫的特征在于誘導(dǎo)一種長期的效應(yīng)細(xì)胞CD8+CTL應(yīng)答。57.權(quán)利要求56的方法，其中T細(xì)胞免疫的特征在于CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。58.權(quán)利要求51的方法，其中在所述的動物中誘導(dǎo)針對病毒感染的免疫。59.權(quán)利要求51的方法，其中在所述的動物中誘導(dǎo)腫瘤免疫。60.權(quán)利要求59的方法，其中在所述的動物中誘導(dǎo)針對黑色素瘤的免疫。61.權(quán)利要求51的方法，其中所述的動物是哺乳動物。62.權(quán)利要求60的方法，其中所述的哺乳動物是人。63.一種選自SFVMEC/L713P/Neo、pSFV3L713PLacZNeo或SFVMEC/L713P的包裝構(gòu)建體。64.一種包含權(quán)利要求63的包裝構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。65.權(quán)利要求64的宿主細(xì)胞，其是以SFVMEC/L713P/Neo或pSFV3L713PLacZNeo穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK21細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明提供了一種黃病毒表達(dá)載體、構(gòu)建體和系統(tǒng)，其均包含一種黃病毒復(fù)制子，該黃病毒復(fù)制子有助于進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制由此可高水平表達(dá)由一種異源性核酸編碼的RNA和蛋白。所述的黃病毒表達(dá)載體、構(gòu)建體和系統(tǒng)優(yōu)選地使用一種Kunjin病毒復(fù)制子，并特別適合用作一種疫苗輸送系統(tǒng)以促進(jìn)表達(dá)能夠誘導(dǎo)針對病毒感染和癌癥的保護(hù)性T細(xì)胞免疫的免疫原性蛋白質(zhì)和肽。疫苗可以DNA、RNA或病毒樣顆粒的形式進(jìn)行施用。文檔編號A61K35/76GK1671851SQ02827562公開日2005年9月21日申請日期2002年11月26日優(yōu)先權(quán)日2001年11月26日發(fā)明者亞歷山大·A.·赫羅梅赫,安德烈亞斯·祖爾比爾申請人:昆士蘭大學(xué),昆士蘭醫(yī)學(xué)研究所理事會