專利名稱：聚陽(yáng)離子水溶性共聚物和將聚陰離子大分子跨生物屏障傳遞的方法
將聚陰離子大分子跨生物屏障傳遞的方法發(fā)明背景1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及跨越生物屏障傳遞生物活性物質(zhì)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及強(qiáng)化聚陰離子大分子例如DNA，RNA，反義寡核苷酸和它們的類似物跨越生物屏障傳遞。
2.技術(shù)背景它們治療或治愈多種疾病的可能性高度促進(jìn)了基因治療和反義技術(shù)?；蛑委熡锌赡苤委熀芏嗖《炯膊『瓦z傳癥狀。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在原先不能治療的疾病例如癌癥，自身免疫疾病，囊纖維變性等起著作用的很多基因。隨著發(fā)現(xiàn)涉及的基因，研究人員確定通過阻斷超量表達(dá)的基因或通過提供功能障礙基因拷貝能治療疾病。這些治療經(jīng)常需要施用DNA，RNA，反義寡核苷酸，和它們的類似物，來(lái)實(shí)現(xiàn)期望的細(xì)胞內(nèi)作用。
證明這些治療策略阻斷基因表達(dá)或者在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生需要的蛋白質(zhì)。但是，這些有希望的治療的主要問題是體內(nèi)應(yīng)用它們的自適應(yīng)。對(duì)于一種是體內(nèi)有效的藥物的化合物，該化合物一定要容易送遞給患者，不從體內(nèi)很快地清除，具有可耐受的毒性水平，并且能達(dá)到需要它在體內(nèi)達(dá)到的位點(diǎn)。
但是，大分子例如DNA，RNA，反義寡核苷酸和它們的類似物都具有相似的顯著的藥學(xué)問題。如果口服時(shí)這些化合物一般沒有毒性，但是因?yàn)樗鼈儽幌痛x而達(dá)不到期望的位點(diǎn)。注射這些聚陰離子大分子延長(zhǎng)分子在體內(nèi)的時(shí)間，但是不靶向需要的特定區(qū)域。此外，使它們?cè)谘褐锌焖俳到獠⑶覐捏w內(nèi)清除。
因?yàn)镈NA，RNA，和寡核苷酸是聚陰離子大分子，它們不容易跨越生物屏障。將這些材料傳遞到活細(xì)胞中是它們作為治療藥物的用途的主要障礙。需要有效基因和寡核苷酸送遞系統(tǒng)與合適的細(xì)胞結(jié)合，通過胞吞作用內(nèi)在化，從溶酶體釋放，并且最后將完整游離的DNA或寡核苷酸送遞給細(xì)胞核或原生質(zhì)。換句話說(shuō)，因?yàn)榛蛑委熀头戳x治療大大依賴于實(shí)現(xiàn)核酸足量送遞，來(lái)校正作用位點(diǎn)，和為了期望的時(shí)間結(jié)構(gòu)。
對(duì)于有效送遞基因和寡核苷酸，已經(jīng)嘗試過很多不同的策略，包括病毒和非病毒系統(tǒng)。這些策略的每一個(gè)都有不同程度的成功。但是，它們中沒有一個(gè)安全并有效到足以臨床使用。毒性，轉(zhuǎn)染效率，核酸(NA)降解和自由NA釋放是對(duì)于所有的當(dāng)前非病毒基因送遞系統(tǒng)的引起爭(zhēng)論的問題，包括脂質(zhì)體和陽(yáng)離子聚合物。
在NA/載體復(fù)合體的穩(wěn)定性和載體在靶細(xì)胞中釋放NA的能力之間平衡非病毒送遞系統(tǒng)的特殊問題。NA/載體復(fù)合體一定足以穩(wěn)定來(lái)保持在循環(huán)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，但是還不足以穩(wěn)定到在靶位點(diǎn)釋放自由NA。
被用來(lái)使聚陰離子大分子進(jìn)入細(xì)胞胞質(zhì)的一個(gè)途徑是使聚陰離子大分子復(fù)合成高聚陽(yáng)離子聚合物，例如PEI。PEI是高聚陽(yáng)離子聚合物。多年來(lái)在在普通方法中例如紙生產(chǎn)，洗發(fā)劑生產(chǎn)，和水純化中使用它。最近，PEI變成在寡核苷酸和DNA送遞中使用的最成功的聚陽(yáng)離子載體之一。
已經(jīng)證明PEI在體外和體內(nèi)是送遞寡核苷酸和質(zhì)粒的高效載體。PEI是線性和支化形式。因?yàn)樗母哒姾擅芏?，作為PEI的銨基和核酸的磷酸根基團(tuán)之間的協(xié)同靜電相互作用的結(jié)果，PEI自發(fā)形成內(nèi)聚電解質(zhì)絡(luò)合物(聚離子絡(luò)合物)。充分確立了PEI轉(zhuǎn)染各種各樣的細(xì)胞的能力。與其他聚陽(yáng)離子載體相比，證明PEI在保護(hù)胞吞作用之后抗核酸降解和將核酸釋放到胞質(zhì)中是好得多的。
不同的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)揭示了轉(zhuǎn)染機(jī)理，但是仍然不十分清楚。絡(luò)合物或PEI緩沖溶酶體的酸性pH，保護(hù)核酸降解并且引起囊泡的滲透性溶脹/破裂。囊泡破裂將核酸釋放到胞質(zhì)中。假設(shè)細(xì)胞聚陰離子分子置換作用一般促進(jìn)游離核酸從陽(yáng)離子聚合物離解。相信PEI的質(zhì)子化導(dǎo)致聚合物網(wǎng)路由于分子內(nèi)電荷排斥而膨脹。
但是，PEI不是完美的轉(zhuǎn)染試劑。例如，PEI/NA絡(luò)合物通常在生理緩沖液中產(chǎn)生嚴(yán)重的聚集作用。此外，絡(luò)合物在血清的存在下表現(xiàn)出有限的穩(wěn)定性，并且在全身施用之后從血液中快速清除。此外，始終發(fā)現(xiàn)PEI在體外和體內(nèi)都是有毒性的。這些性質(zhì)顯著限制了PEI的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
為了部分克服PEI的毒性作用和PEI/NA絡(luò)合物在生物緩沖液中的聚集問題，將聚合物與親水性和疏水性基團(tuán)偶聯(lián)或者接枝。用PEG對(duì)PEIs接枝產(chǎn)生在含水緩沖液中能形成相對(duì)穩(wěn)定的DNA復(fù)合體的共聚物。但是，這些系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染活性比沒有修飾的PEI(25kDa)的轉(zhuǎn)染活性低得多。部分丙?；；木€性PEI(50kDa和200kDa)也表現(xiàn)出低毒性，但是這種修飾危害轉(zhuǎn)染活性。結(jié)合靶向基團(tuán)，例如轉(zhuǎn)鐵蛋白，甘露糖，和半乳糖，提高向靶組織的轉(zhuǎn)染效率，但是仍然沒有解決與高分子PEIs相關(guān)的內(nèi)在毒性問題，因?yàn)楦叻肿覲EIs被用作獲得有效轉(zhuǎn)染活性的前體。小的PEIs毒性小得多，但是令人遺憾的是發(fā)現(xiàn)低分子量PEIs(小于2,000道爾頓)在各種條件下不產(chǎn)生或者產(chǎn)生非常低的轉(zhuǎn)染活性。
著眼于上述情況，提供將聚陰離子大分子送遞到靶細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域是一個(gè)進(jìn)步。提供一種能有效地運(yùn)輸聚陰離子大分子跨越生物屏障的載體分子是另一個(gè)進(jìn)步。如果載體分子與現(xiàn)行可獲得的化合物相比具有減小的毒性，則實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的進(jìn)步。如果載體/大分子復(fù)合體穩(wěn)定表現(xiàn)出血清穩(wěn)定性，則是另一個(gè)進(jìn)步。如果載體/大分子復(fù)合體在靶細(xì)胞中容易解離，則是另一個(gè)進(jìn)步。提供能定向于特定組織或細(xì)胞類型的載體分子是另一個(gè)進(jìn)步。
本發(fā)明概述本發(fā)明提供一類新的能用作將聚陰離子大分子送遞給細(xì)胞的載體分子的聚陽(yáng)離子接枝生物相容共聚物。兩個(gè)或多個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物片段通過連接基團(tuán)(linkers)與生物相容親水性主鏈聚合物共價(jià)連接。與主鏈聚合物鍵合的聚陽(yáng)離子聚合物片段的數(shù)目可以在大約4至大約100范圍內(nèi)。發(fā)現(xiàn)大約8至大約15范圍內(nèi)聚陽(yáng)離子片段的數(shù)目能被成功地用來(lái)結(jié)合聚陰離子大分子，并且運(yùn)送聚陰離子大分子跨越生物屏障，例如細(xì)胞壁或質(zhì)膜。很多種生物相容聚合物可以被用作主鏈聚合物。主鏈聚合物可以是，例如，聚乙二醇(PEG)，聚(N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺)，或者其共聚物。同樣各種各樣的聚陽(yáng)離子聚合物可以連接主鏈聚合物。聚陽(yáng)離子聚合物可以是，例如，聚烷基胺(PAM)，聚氮丙啶(PEI)，聚賴氨酸(PL)，多肽，殼聚糖，多糖，或者其共聚物。
載體分子還可以包括至少一個(gè)與生物相容親水性主鏈或者與聚陽(yáng)離子聚合物連接的靶向部分(targeting moiety)?？梢赃x擇靶向部分來(lái)結(jié)合特定生物物質(zhì)或位點(diǎn)。因此，可以以它與特定細(xì)胞類型或特定組織中表達(dá)的分子結(jié)合的能力為基礎(chǔ)來(lái)選擇靶向部分，使得聚陰離子大分子選擇性送遞給細(xì)胞或組織。這樣的靶向部分可以包括配體，抗原，半抗原，生物素，凝集素，半乳糖，半乳糖胺，蛋白質(zhì)，組蛋白，多肽，脂質(zhì)，碳水化合物，維生素，和它們的組合。
載體分子還可以包括至少一種與生物相容親水性主鏈或者與聚陽(yáng)離子聚合物連接的裂解劑。可以選擇裂解劑分解生物膜，例如細(xì)胞，內(nèi)體，或者核膜，從而使聚陰離子大分子釋放到細(xì)胞的胞質(zhì)或細(xì)胞核中。這樣的裂解劑可以包括病毒肽，細(xì)菌毒素，溶菌作用肽(lyticpeptide)，aleveolysin，bifermentolysin，boutulinolysin，capriciolysin，cereolysin O，chauveolysin，histolyticolysinO，肺炎球菌溶血素，sealigerolysin，septicolysin O，sordellilysin，streptoslysin O，tenaolysin或蘇云金菌溶素O，及其活性片段。
如上所述，聚陽(yáng)離子聚合物通過連接基團(tuán)與生物相容主鏈聚合物共價(jià)連接。靶向部分和裂解劑還可以通過連接基團(tuán)與主鏈共聚物共價(jià)連接。這樣的連接基團(tuán)可以是烴鏈，PEG片段，多肽，含有酯鍵的線性聚合物，含有酰胺鍵的線性聚合物，含有二硫鍵的線性聚合物，含有腙鍵(hydrozone bond)的線性聚合物，含有肟鍵的線性聚合物，或者它們的組合。連接基團(tuán)可以是化合物或酶能裂解以從主鏈聚合物釋放聚陽(yáng)離子聚合物，靶向部分，或裂解劑的生物可降解肽。這樣的生物可降解肽的例子是GlyPheLeuGly(SEQ.ID.NO.1)和GlyPhePheGly(SEQ ID.NO.2)。連接基團(tuán)可以具有大約2至大約100個(gè)原子的長(zhǎng)度。也能使用具有大約3至大約30個(gè)原子長(zhǎng)度的連接基團(tuán)。
生物相容親水性主鏈可以具有經(jīng)選擇使聚陰離子大分子送遞給細(xì)胞最佳化的分子量。因此，在一些實(shí)施方案中，主鏈聚合物具有大約1,000至大約1,000,000范圍內(nèi)的分子量，也可以使用具有大約5,000至大約100,000范圍內(nèi)的分子量的主鏈聚合物。也可以使用具有大約20,000至大約40,000的分子量的生物相容親水性主鏈來(lái)將聚陰離子大分子送遞給細(xì)胞。
還可以選擇聚陽(yáng)離子聚合物的分子量來(lái)優(yōu)化聚陰離子大分子向靶細(xì)胞的送遞。分子量可以是大約100至大約100,000范圍內(nèi)?；蛘呔坳?yáng)離子聚合物的分子量可以是大約200至大約10,000范圍內(nèi)?？梢允褂镁哂写蠹s400至大約2,000范圍內(nèi)的分子量的聚陽(yáng)離子聚合物來(lái)將聚陰離子大分子送遞給細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及將聚陰離子大分子送遞給細(xì)胞的復(fù)合體。該復(fù)合體可以如上所述帶有與聚陰離子大分子絡(luò)合的載體分子?？梢詫?duì)動(dòng)物體內(nèi)或者對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物給予這種復(fù)合體。復(fù)合體使聚陰離子大分子送遞給動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞。
可以從用于治療疾病或者實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)的多種大分子中選擇聚陰離子大分子。在復(fù)合體的一些構(gòu)型中，聚陰離子大分子是核酸，例如RNA，DNA，或者其組合或衍生物，核酸可以是例如基因組DNA，質(zhì)粒DNA，合成DNA，或RNA?？梢耘c本發(fā)明的載體分子使用的核酸的其他類型是，例如，反義寡核苷酸，核酶，DNA酶，嵌合RNA/DNA寡核苷酸，硫代磷酸酯寡核苷酸，2’-O-甲基寡核苷酸，DNA-PNA偶聯(lián)物，DNA-嗎啉代-DNA偶聯(lián)物，及其組合。
本發(fā)明還提供運(yùn)送聚陰離子大分子跨越細(xì)胞的生物屏障的方法。生物屏障可以是細(xì)胞壁，質(zhì)膜，或類細(xì)胞膜。細(xì)胞可以是例如細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞?；蛘?，細(xì)胞可以是多細(xì)胞生物體例如植物或動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)胞可以是來(lái)自生物體的細(xì)胞，例如肝細(xì)胞，肝細(xì)胞，腎細(xì)胞，腦細(xì)胞，骨髓細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，心臟細(xì)胞，脾細(xì)胞，干細(xì)胞和上述細(xì)胞的共同培養(yǎng)物。此外，細(xì)胞可以來(lái)自建立的細(xì)胞系，如HepG Hep G2和Hela細(xì)胞。運(yùn)送聚陰離子大分子跨越屏障的方法包括聚陰離子大分子與本發(fā)明的載體分子絡(luò)合產(chǎn)生復(fù)合體。然后細(xì)胞接觸載體分子，將聚陰離子大分子送遞給細(xì)胞。然后通過例如胞吞作用，細(xì)胞吸收復(fù)合體，然后釋放到細(xì)胞胞質(zhì)中。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明參照后面附圖中詳細(xì)說(shuō)明的具體實(shí)施方案更具體地描述上文簡(jiǎn)要描述的本發(fā)明。這些附圖只是描述本發(fā)明的典型實(shí)施方案，并且不認(rèn)為限制其范圍。通過利用附圖，更具體而詳細(xì)地描述和解釋本發(fā)明，其中


圖1A是本發(fā)明的聚陽(yáng)離子接枝生物相容共聚物的一個(gè)實(shí)施方案的合成的圖示說(shuō)明。
圖1B是本發(fā)明的聚陽(yáng)離子接枝生物相容共聚物的另一個(gè)實(shí)施方案的合成的圖示說(shuō)明。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了新類型的能用作將聚陰離子大分子送遞給細(xì)胞的載體分子的聚陽(yáng)離子接枝生物相容共聚物。兩個(gè)或多個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物片段通過連接基團(tuán)隨機(jī)共價(jià)連接生物相容親水性主鏈聚合物。與主鏈聚合物結(jié)合的聚陽(yáng)離子聚合物片段的數(shù)目可以是大約4至大約100的范圍內(nèi)。發(fā)現(xiàn)大約8至大約15范圍內(nèi)聚陽(yáng)離子片段的數(shù)目能被成功地用來(lái)結(jié)合聚陰離子大分子并且運(yùn)送聚陰離子大分子跨越生物屏障。如這里使用的，生物相容指具有有限免疫原和變應(yīng)原能力的物質(zhì)。生物相容還意指物質(zhì)不引起顯著的不期望的生理反應(yīng)。生物相容物質(zhì)可以被生物降解。如這里使用的，生物可降解意思是物質(zhì)例如主鏈聚合物或聚陽(yáng)離子聚合物在體內(nèi)能被化學(xué)或酶學(xué)裂解或降解。生物可降解物質(zhì)當(dāng)分解時(shí)可以形成無(wú)毒成分。此外，生物可降解物質(zhì)可以是生物中性的，意思是它沒有特異結(jié)合性質(zhì)或生物識(shí)別性質(zhì)。
各種各樣的生物相容聚合物可以被用作主鏈聚合物。主鏈聚合物可以是，例如，聚乙二醇(PEG)，聚(N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺)，或者其共聚物。同樣，各種聚陽(yáng)離子聚合物可以連接主鏈聚合物。聚陽(yáng)離子聚合物可以是，例如，聚烷基胺(PAM)，聚氮丙啶(PEI)，聚賴氨酸(PL)，多肽，殼聚糖，多糖，或者其共聚物。
PEG具有很多性質(zhì)，使得它成為與本發(fā)明的載體聚合物使用的所期望的生物相容主鏈聚合物。首先，PEG商業(yè)上可獲得低分散度的各種分子量(Mw/Mn＜1.1)。以它們的分子大小為基礎(chǔ)，任意地將PEG聚合物分類為低分子量PEG(Mw＜20,000)和高分子量PEG(Mw＞20,000)。最近的研究發(fā)現(xiàn)給藥之后PEG的腎清除隨著分子量的提高而降低，靜脈給予后，MW是30,000時(shí)發(fā)生最大變化。血液中循環(huán)的PEG的半衰期(t1/2)也表現(xiàn)出伴隨的大的增加。例如，隨著分子量從6,000增加至50,000，PEG的t1/2從大約18分鐘延長(zhǎng)至16.5小時(shí)。結(jié)果，抗癌藥物與20,000或更大分子量的PEG偶聯(lián)能防止PEG-偶聯(lián)物質(zhì)的快速消除，并且使被動(dòng)腫瘤堆積。
載體分子還可以包括至少一個(gè)與生物相容親水性主鏈或者與聚陽(yáng)離子聚合物連接的靶向部分。可以選擇靶向部分，與特定生物物質(zhì)或者這里稱作受體的位點(diǎn)結(jié)合。因此，以它與特定細(xì)胞類型或特定組織中表達(dá)的受體分子結(jié)合的能力為基礎(chǔ)選擇靶向部分，使得聚陰離子大分子選擇性送遞給細(xì)胞或組織。靶向部分可以是被細(xì)胞膜受體識(shí)別的任何信號(hào)元件。因此，在一些實(shí)施方案中，靶向部分是含有與肝細(xì)胞或肝細(xì)胞瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的糖的半乳糖。含有糖的半乳糖可以選自乳糖和半乳糖。
靶向部分指與特定生物物質(zhì)或位點(diǎn)結(jié)合的那些部分。認(rèn)為生物物質(zhì)或位點(diǎn)是與之結(jié)合的靶向部分的靶物。配體是靶向部分的一個(gè)類型。配體對(duì)于已知為受體的另一種物質(zhì)具有選擇性(或特異性)親和性。因?yàn)榕潴w對(duì)于受體具有特異親和性，配體選擇性結(jié)合受體不而是其他分子。因此，當(dāng)與本發(fā)明的載體聚合物結(jié)合使用配體時(shí)，設(shè)計(jì)載體聚合物與特定細(xì)胞類型上的受體結(jié)合。這種選擇性結(jié)合使得聚陰離子大分子選擇性送遞給靶細(xì)胞。適合靶細(xì)胞的配體的例子是抗原，半抗原，生物素，生物素衍生物，凝集素，半乳糖，半乳糖胺，維生素和巖藻糖基胺部分，受體，底物，輔酶和輔因子。
當(dāng)對(duì)本發(fā)明的聚陽(yáng)離子接枝共聚物應(yīng)用時(shí)，配體包括能被其相應(yīng)的抗體或者其活性部分結(jié)合或者能與之結(jié)合的抗原或半抗原。還包括病毒抗原或血細(xì)胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶和核衣殼，包括來(lái)自任何DNA病毒，RNA病毒，HIV，肝炎病毒，腺病毒，α病毒，沙粒病毒，冠狀病毒，黃病毒，皰疹病毒，粘液病毒，致癌RNA病毒，乳多空病毒，副粘病毒，細(xì)小病毒，小RNA病毒，痘病毒，呼腸孤病毒，彈狀病毒，鼻病毒，披膜病毒，和viriods。配體可以選自任何細(xì)菌抗原，包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌，acinetobacter，無(wú)色桿菌，擬桿菌，梭狀芽孢桿菌，衣原體，腸桿菌，嗜血桿菌，乳酸桿菌，奈瑟氏菌，葡萄球菌，和鏈球菌的那些。其他合適的配體包括任何真菌抗原，例如曲霉屬，念珠菌屬，球孢子菌屬，霉菌屬(mycoses)，藻狀菌和酵母的那些。其他抗原，例如支原體屬抗原，立克次氏體抗原，原蟲抗原，和寄生蟲抗原，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中是合適的配體。人抗原包括血細(xì)胞，病毒感染細(xì)胞，遺傳標(biāo)記，致癌蛋白質(zhì)，血漿蛋白質(zhì)，補(bǔ)體因子，α胎蛋白，前列腺特異抗原(PSA)，惡性腫瘤標(biāo)記，和類風(fēng)濕病因子的那些也可以作為合適的配體。
有很多可以用作指導(dǎo)載體共聚物定向靶細(xì)胞的合適的配體的很多其他物質(zhì)。這些物質(zhì)其中有蛋白質(zhì)，組蛋白，激素，維生素，類固醇，前列腺素，合成的或天然的多肽，碳水化合物，脂質(zhì)，抗生素，藥物，地高辛，殺蟲劑，鎮(zhèn)靜劑，和神經(jīng)遞質(zhì)。配體還指對(duì)于通過重組DNA，遺傳工程和分子工程產(chǎn)生的物質(zhì)具有選擇性親和性的各種物質(zhì)。
在靶細(xì)胞的配體的選擇中重點(diǎn)考慮配體的受體。受體也可以稱作ligator，結(jié)合體，或者結(jié)合配偶體。這些受體作為選擇性結(jié)合配體的生物識(shí)別分子類型而起受體功能。受體是，一般情況下但是不是必須地，比結(jié)合它的配體大的分子。受體可以是蛋白質(zhì)，例如抗體或非蛋白結(jié)合體。如這里使用的，抗體指所有類型的抗體，包括單克隆抗體，嵌合抗體，F(xiàn)ab部分，及其衍生物。適合定向的其他受體包括特異性結(jié)合激素，維生素，藥物，抗生素，癌標(biāo)記，遺傳標(biāo)記，病毒，和組織相容性標(biāo)記的天然存在的受體，血細(xì)胞凝集素，和細(xì)胞膜和核衍生物。另一組受體包括RNA和DNA結(jié)合蛋白。用于定向的其他可能有用的受體是細(xì)胞表面酶例如神經(jīng)氨酸酶，血漿蛋白質(zhì)，抗生物素蛋白，鏈霉抗生物素蛋白，抑素，cavitands，甲狀腺球蛋白，內(nèi)在因子，球蛋白，螯合劑，表面活性劑，有機(jī)金屬物質(zhì)，葡萄球菌蛋白質(zhì)A，蛋白質(zhì)G，核糖體，噬菌體，細(xì)胞色素，凝集素，一些樹脂，和有機(jī)聚合物。受體還包括各種物質(zhì)，例如對(duì)于通過重組DNA，遺傳工程和分子工程產(chǎn)生的配體具有選擇性親和性的任何蛋白質(zhì)。
載體分子還可以包括至少一種與生物相容親水性主鏈或者與聚陽(yáng)離子聚合物連接的裂解劑。裂解劑可以是任何膜融合肽或蛋白質(zhì)?？梢赃x擇裂解劑分解生物膜，例如細(xì)胞，內(nèi)體，或者核膜，從而使聚陰離子大分子釋放到細(xì)胞的胞質(zhì)或細(xì)胞核中。作為存在裂解劑的結(jié)果，膜經(jīng)歷裂解作用，融合作用，或者兩者。這樣的裂解劑可以包括病毒肽，細(xì)菌毒素，溶菌作用肽，aleveolysin，bifermentolysin，boutulinolysin，capriciolysin，cereolysin O，chauveolysin，histolyticolysin O，肺炎球菌溶血素，sealigerolysin，septicolysin O，sordellilysin，streptoslysin O，tenaolysin或蘇云金菌溶素O，及其活性片段。溶菌作用肽是滲透膜從而喪失膜的結(jié)構(gòu)組織化和完整性的化學(xué)基團(tuán)。裂解劑還包括能裂解生物膜的病毒和合成化合物。本發(fā)明還可以使用提供內(nèi)體逃脫活性的上述裂解劑的片段。已知其他肽和蛋白質(zhì)引起生物膜或融合體的分解，并且可以用作本發(fā)明范圍內(nèi)的裂解劑。Jahn，R.&Sudhof，T.，Annu.Rev Biochem68863-911(1999)；Pecheur，E.I.，等，J Membrane Biol.1671-17(1999)。
如上所述，聚陽(yáng)離子聚合物通過連接基團(tuán)與生物相容主鏈聚合物共價(jià)連接。靶向部分和裂解劑也可以通過連接基團(tuán)與主鏈聚合物或鍵合的聚陽(yáng)離子聚合物共價(jià)連接。這樣的連接基團(tuán)可以是烴鏈，PEG片段，多肽，含有酯鍵的線性聚合物，含有酰胺鍵的線性聚合物，含有二硫鍵的線性聚合物，含有hydrozone鍵的線性聚合物，含有肟鍵的線性聚合物，或者它們的組合。連接基團(tuán)可以是生物可降解連接基團(tuán)或非生物可降解連接基團(tuán)。生物可降解連接基團(tuán)的例子是短肽和二硫鍵連接基團(tuán)(-(CH2)xSS(CH2)x-，其中x是2至8的整數(shù))。非生物可降解連接基團(tuán)包括烴連接基團(tuán)，例如-(CH2)n-或-(CH2CH2O)n-，其中n是2至50的整數(shù)。連接基團(tuán)可以具有大約2至大約100個(gè)原子的長(zhǎng)度。也可以使用具有大約3個(gè)原子至大約30個(gè)原子長(zhǎng)度的連接基團(tuán)。
可以組裝用來(lái)共價(jià)連接聚陽(yáng)離子聚合物和主鏈聚合物的連接基團(tuán)，使得從載體緩釋復(fù)合的聚陰離子大分子。緩釋指僅通過用來(lái)合成載體的連接基團(tuán)的裂解而從共聚物載體復(fù)合體釋放核酸或者其他聚陰離子大分子。因此，緩釋不包括通過擴(kuò)散直到鍵被裂解的聚陰離子大分子的釋放。
生物可降解連接基團(tuán)包括但不限于兩類鍵。第一類包括二硫鍵和酯鍵。二硫鍵和酯鍵對(duì)于藥物化合物與聚合物的共價(jià)偶聯(lián)是已知的。但是，這類鍵對(duì)于體內(nèi)送遞藥物化合物具有有限的價(jià)值，因?yàn)檫@些鍵在血液中裂解。第二類包括在進(jìn)入細(xì)胞之后一般裂解(胞內(nèi)裂解)的鍵。這類連接基團(tuán)在象溶酶體中發(fā)現(xiàn)的那些酸性條件下或者通過酶而可裂解，使得藥物化合物在細(xì)胞內(nèi)釋放。
酸性條件下裂解的鍵已知是酸敏感或酸可處理的鍵。酸敏感鍵的一個(gè)例子是腙鍵。Greenfield，等，Cancer Res.506600-6607(1990)。酶敏感連接基團(tuán)包括包含使得多肽呈疏水性的氨基酸序列的多肽。這些多肽通過特異酶例如主要在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的組織蛋白酶裂解。這樣的多肽可以是合成的或天然存在的肽。合適的生物可降解多肽連接基團(tuán)的例子是GlyPheLeuGly(SEQ.ID.NO.1)和GlyPhePheGly(SEQ.ID.NO.2)。另一種類型的生物可降解鍵是空間上抑制硫醇鹽離子反應(yīng)的″有位阻的″或″被保護(hù)的″二硫鍵。偶聯(lián)劑S-4-琥珀酰亞胺基氧羰基-.α-.硫代硫酸甲基芐酯(SMBT)和4-琥珀酰亞胺基氧羰基-.α-.甲基-.α.-(2-吡啶基二硫代)甲苯(SMPT)中發(fā)現(xiàn)這樣的被保護(hù)二硫鍵。
生物相容親水性主鏈可以具有經(jīng)選擇使聚陰離子大分子送遞給細(xì)胞最佳化的分子量。因此，在一些實(shí)施方案中，主鏈聚合物具有大約1,000至大約1,000,000范圍內(nèi)的分子量。也可以使用具有大約5,000至大約100,000范圍內(nèi)的分子量的主鏈聚合物。也可以使用具有大約20,000至大約40,000的分子量的生物相容親水性主鏈來(lái)將聚陰離子大分子送遞給細(xì)胞。
還可以選擇聚陽(yáng)離子聚合物的分子量來(lái)優(yōu)化聚陰離子大分子向靶細(xì)胞的送遞。分子量可以是大約100至大約100,000范圍內(nèi)?；蛘呔坳?yáng)離子聚合物的分子量可以是大約200至大約10,000范圍內(nèi)?？梢允褂镁哂写蠹s400至大約2,000范圍內(nèi)的分子量的聚陽(yáng)離子聚合物來(lái)將聚陰離子大分子送遞給細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及將聚陰離子大分子送遞給細(xì)胞的復(fù)合體。該復(fù)合體一旦送遞給細(xì)胞，載體分子就使得復(fù)合體跨越細(xì)胞壁和其他生物屏障，并且獲得進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。該復(fù)合體可以如上所述帶有與聚陰離子大分子絡(luò)合的載體分子。可以對(duì)動(dòng)物體內(nèi)或者對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物給與這種復(fù)合體。復(fù)合體使聚陰離子大分子送遞給動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞。
可以從用于治療疾病或者實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)的多種大分子中選擇聚陰離子大分子。在復(fù)合體的一些構(gòu)型中，聚陰離子大分子是核酸，例如RNA，DNA，或者其組合或衍生物。核酸可以是例如基因組DNA，質(zhì)粒DNA，合成DNA，或RNA?？梢耘c本發(fā)明的載體分子使用的核酸的其他類型是，例如，反義寡核苷酸，核酶，DNA酶，嵌合RNA/DNA寡核苷酸，硫代磷酸酯寡核苷酸，2’-O-甲基寡核苷酸，DNA-PNA偶聯(lián)物，DNA-嗎啉代-DNA偶聯(lián)物，及其組合。
本發(fā)明還提供運(yùn)送聚陰離子大分子跨越細(xì)胞的生物屏障的方法。細(xì)胞可以是例如細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞?；蛘?，細(xì)胞可以是多細(xì)胞生物體例如植物或動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)胞可以是來(lái)自生物體的細(xì)胞，例如肝細(xì)胞，肝細(xì)胞，腎細(xì)胞，腦細(xì)胞，骨髓細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，心臟細(xì)胞，脾細(xì)胞，干細(xì)胞和上述細(xì)胞的共同培養(yǎng)物。此外，細(xì)胞可以來(lái)自建立的細(xì)胞系，如HepG Hep G2和Hela細(xì)胞。
運(yùn)送聚陰離子大分子給細(xì)胞的方法包括聚陰離子大分子與本發(fā)明的載體分子絡(luò)合產(chǎn)生復(fù)合體。然后細(xì)胞接觸復(fù)合的載體分子，將聚陰離子大分子送遞給細(xì)胞。然后通過例如胞吞作用，載體復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞，然后從囊泡釋放，使得進(jìn)入細(xì)胞胞質(zhì)中。如果靶細(xì)胞在體外細(xì)胞培養(yǎng)物中，則通過提供含有聚陰離子大分子/載體復(fù)合體的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的細(xì)胞或者通過向生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入含有聚陰離子大分子/載體復(fù)合體的溶液，能使細(xì)胞接觸復(fù)合的載體分子。如果靶細(xì)胞在生物體內(nèi)，通過將復(fù)合體置于生物體中使得它進(jìn)入靶細(xì)胞，可以發(fā)生接觸。例如，通過將含有復(fù)合體的溶液注射到生物體的循環(huán)系統(tǒng)中，可以施用復(fù)合體。連接靶向部分的載體分子可以使得復(fù)合體定向于靶細(xì)胞，靶物相應(yīng)于靶向部分。通過肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，腹部?jī)?nèi)，皮下，靜脈內(nèi)和動(dòng)脈內(nèi)送遞，可以對(duì)生物體施用聚陰離子大分子/載體復(fù)合體。施用復(fù)合體的其他方法包括腸胃外，局部，經(jīng)皮，跨粘膜，吸入，插入到體腔中例如通過眼，陰道，口腔，經(jīng)尿道，直腸，鼻，口服，肺，和耳給藥。
當(dāng)本發(fā)明的聚合物載體分子與核酸或其他藥物復(fù)合時(shí)，它們形成聚合物微膠粒。靜脈內(nèi)給藥之后，發(fā)現(xiàn)這樣的聚合物微膠粒具有延長(zhǎng)的全身循環(huán)時(shí)間。這種延長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間是由于它們小的尺寸和親水性外殼，它使單核噬吞細(xì)胞系統(tǒng)的吸收最小化，和由于它們的高分子量，它防止腎排泄。加有聚合物微膠粒的藥物可以在腫瘤中累積到比自由藥物更大的程度，并且表現(xiàn)出減少分布到?jīng)]有定向的區(qū)域例如心臟。聚合物微膠粒在惡性或炎癥組織中的積累可能由于提高的血管滲透性和減小的淋巴系統(tǒng)排泄。腫瘤脈管更容易泄漏并且與正常的脈管選擇透性更小。幾項(xiàng)體內(nèi)研究表明聚合物微膠粒能改善抗癌藥物抗白血病和實(shí)體腫瘤的效力。研究表明PEG對(duì)于任何器官?zèng)]有表現(xiàn)出特異親和性，并且與聚合物的分子量和腫瘤所在位點(diǎn)無(wú)關(guān)，其在腫瘤組織中的積累主要受滲透性過高的腫瘤血管水平的支配(增強(qiáng)的滲透性保持或EPR作用)。
認(rèn)為EPR作用是被動(dòng)靶向方法，但是通過與靶向部分例如抗體或糖結(jié)合或者通過引導(dǎo)聚合物對(duì)溫度或pH變化的靈敏性能變化的藥物靶向。靶向微膠?；騪H靈敏微膠粒能用來(lái)將藥物送遞給腫瘤，炎癥組織或內(nèi)體區(qū)室(compartment)，因?yàn)樗鼈內(nèi)寂c比正常組織低的pH相關(guān)。
可以對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞或身體施用含有核酸或其他聚陰離子大分子的接枝共聚物溶液。載體分子有用性中的一個(gè)重要的考慮是有多少藥物能被加載到載體中。應(yīng)該考慮載體共聚物上氮與核酸上磷酸酯的摩爾比(N/P比)。大多數(shù)情況下，載體聚合物和核酸分子復(fù)合體中N/P之比在大約1至大約50的范圍內(nèi)。更具體地說(shuō)，預(yù)計(jì)對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用，復(fù)合體中的N/P之比在大約2至大約30之間的范圍內(nèi)。給出的這些范圍不排除本發(fā)明可以應(yīng)用的N/P之比。只要保持功能，這些范圍之外的加載量落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
參照?qǐng)D1A，詳細(xì)描述了本發(fā)明的載體共聚物的一般合成。獲得平均分子量的聚乙二醇(PEG)。PEG具有其主鏈上隨機(jī)接枝的側(cè)鏈丙酸基團(tuán)(PA)的″m″數(shù)。PEG-mPA和無(wú)水二氯甲烷在氬氣保護(hù)下反應(yīng)。然后向溶液中加入對(duì)-硝基苯酚和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。加入1-[3-二甲基氨基丙基]-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)，生成澄清的溶液。然后將乙酸加到澄清的混合物中。然后在氬氣保護(hù)下將澄清的反應(yīng)混合物與聚氮丙啶(PEI)的無(wú)水二甲基甲酰胺(DMF)溶液混合。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上將混合物濃縮，去除大部分DMF溶劑。將得到的產(chǎn)物純化并濃縮得到蠟狀產(chǎn)物。將蠟狀粗產(chǎn)物在凝膠過濾柱上進(jìn)一步純化，得到純化的PEG-mPA-PEI。
參照?qǐng)D1B，詳細(xì)描述了本發(fā)明的另一種載體共聚物的一般合成。這種載體共聚物通過生物可降解多肽連接基團(tuán)，GFLG，由PEG主鏈與PEI偶聯(lián)而形成。PEG-mPA作為原材料而獲得。然后將PEG-mPA轉(zhuǎn)化為PEG-mPA-ONp。通過在無(wú)水二氯甲烷中溶解PEG-mPA來(lái)合成PEG-mPA-ONp。然后加入對(duì)-硝基苯酚和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。然后加入1-[二甲基氨基丙基]-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)。接著向溶液中加入乙酸。然后加入對(duì)甲苯磺酸一水合物來(lái)中和DMAP催化劑。反應(yīng)得到白色產(chǎn)物，是PEG-mPA-ONp。
然后將PEG-mPA-ONp產(chǎn)物和GFLG四肽溶解于無(wú)水DMF。向該溶液中加入N，N-二異丙基乙基胺(DIPEA)。然后將反應(yīng)混合物濃縮去除過量溶劑。加入冷的乙醚將產(chǎn)物沉淀。然后純化PEG-mPA-GFLG產(chǎn)物。PEG-mPA-GFLG產(chǎn)物與聚氮丙啶反應(yīng)形成pEG-mPA-GLFG-pEI。
實(shí)施例給出下面的實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明范圍內(nèi)的各種實(shí)施方案。下面的實(shí)施例即不是徹底的也不是窮舉眾多類型的實(shí)施方案，它們可以根據(jù)本發(fā)明來(lái)制備。
材料和一般方法室溫下真空下將側(cè)鏈有丙酸基團(tuán)的PEG(PRG-8PA PEG-10PA，和PEG-15PA，Mw＝～20KD，SunBio，Inc.，Anyang City，South Korea)干燥過夜。PEI600(Mw＝600)，PEI1200(Mw＝1,200)，PEI2K(Mw＝1,800)和PEI10K(Mw＝10,000)購(gòu)自Polysciences，Inc.ofWarrington，PA。PEI400(Mn＝423)，PEI800(Mw＝800)和PEI25K(Mw＝25,000)購(gòu)自Aldrich Chemical Company，Inc.of Milwaukee，WI。其他化學(xué)品購(gòu)自Aldrich或VVR并且在得到之后不用進(jìn)一步純化即可使用。在裝備有Waters RI檢測(cè)器和Phenomenex Polysep-GPC-P3000柱的Waters系統(tǒng)上進(jìn)行HPLC分析。在Varian 400 MHz機(jī)上記錄1H-NMR。
實(shí)施例1-PEG20K-15PA-PEI400(15 PEI 400接枝PEG-20K)的合成氬氣保護(hù)下向干燥的50ml一口燒瓶中加入1.3g帶有15個(gè)側(cè)丙酸基團(tuán)的平均分子量大約20,000的聚乙二醇(PEG20K-15PA)(～0.75毫摩爾側(cè)-COOH，在P2O5干燥器中真空干燥過夜)和10ml無(wú)水二氯甲烷。向燒瓶中加入大約0.15g(1.1毫摩爾)對(duì)硝基苯酚和大約0.015g的4-二甲基氨基吡啶。室溫下攪拌混合物，形成澄清的溶液。然后一次加入大約0.20g(1.0毫摩爾)的細(xì)粉末1-[3-二甲基氨基丙基]-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)。在室溫下將混合物再攪拌大約2小時(shí)，接著溶解EDC。然后向澄清的混合物加入大約0.18ml(3.2毫摩爾)的乙酸。將混合物在室溫下又?jǐn)嚢?0分鐘。澄清的反應(yīng)溶液在氬氣保護(hù)下在劇烈攪拌下與20毫升無(wú)水二甲基甲酰胺(DMF)中20毫升線性PEI400(Aldrich 46，853-3，Mn＝～423)的溶液混合。將混合物在室溫下攪拌大約4小時(shí)，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮，去除大部分DMF溶劑。油混合物然后用水稀釋并且在凝膠過濾柱(Sephacryl S-100，2.5×90cm)上純化。HPLC分析之后將期望的共聚物級(jí)分合并在一起。獲得大約1.5g的純產(chǎn)物。1H-NMR分析表明，共聚物含有大約10％(w/w)PEI，表明共聚物的平均分子量是大約23,444，假設(shè)起始PEG15PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，·3.4-3.8(m，100(任意設(shè)置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，12，PEI的-CH2CH2N-)。
實(shí)施例2-PEG20K-15PA-PEI800(15 PEI 800接枝PEG20K)的合成根據(jù)實(shí)施例1的方法，1.0g帶有大約15個(gè)側(cè)丙酸基團(tuán)的平均分子量是大約20,000的聚乙二醇(PEG20K-15PA)與平均分子量是大約800的聚氮丙啶(PEI800，20克)反應(yīng)，得到大約1.1克的PEI20K-15PA-PEI800。1H-NMR分析表明共聚物含有大約30％(w/w)PEI，表明共聚物的平均分子量是大約28,400，假設(shè)起始PEG15PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，·3.4-3.8(m，100(任意設(shè)置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，43.0，PEI的-CH2CH2N-)。
實(shí)施例3-PEG20K-8PA-PEI800(8 PEI 800接枝PEG-20K)的合成根據(jù)實(shí)施例1的方法，1.0g帶有大約8個(gè)側(cè)丙酸基團(tuán)的平均分子量是大約20,000的聚乙二醇(PEG20K-8PA)與平均分子量是大約800的聚氮丙啶(PEI800，20克)反應(yīng)，得到大約1.2克的PEI20K-8PA-PEI800。1H-NMR分析表明共聚物含有大約11.5％(w/w)PEI，表明共聚物的平均分子量是大約22,607，假設(shè)起始PEG-8PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，·3.4-3.8(m，100(任意設(shè)置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，13.3，PEI的-CH2CH2N-)。
實(shí)施例4PEG-10PA-PEI1200(10PEI1200接枝PEG20K)的合成氬氣保護(hù)下向干燥的1000ml一口燒瓶中加入5.0g PEG20K-10PA(帶有10個(gè)側(cè)丙酸基團(tuán)的平均分子量大約20,000，在P2O5干燥器中干燥過夜)，0.56g對(duì)硝基苯酚和50毫升無(wú)水吡啶。向澄清的混合物加入0.77g 1-[二甲基氨基丙基]-3-乙基碳化二亞胺(EDC)。在室溫下將混合物攪拌大約5小時(shí)。加入乙酸(0.6ml)，在室溫下又?jǐn)嚢?0分鐘。室溫下混合物與200ml的無(wú)水吡啶中的100ml的PEI1200(Mw＝1,200)反應(yīng)過夜。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將混合物濃縮，去除吡啶溶劑。用去離子水將粘稠的溶液稀釋至大約1000ml。將溶液超濾至大約60ml，接著在裝有10K NMWC膜盒的Pall Filtron Minim滲濾系統(tǒng)(PallCorporation，East Hills，NY)上用2000ml去離子水滲濾。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮終產(chǎn)物，獲得大約4.5g蠟狀固體。通過從甲醇乙醚沉淀兩次進(jìn)一步純化蠟狀產(chǎn)物，獲得大約4.1g白的粉末PEG-10PA-PEI1200。1H-NMR分析表明，共聚物含有大約20％(w/w)PEI，表明共聚物的平均分子量是大約24,963，假設(shè)起始PEG10PA的平均分子量是20,000道爾頓。1H-NMR(D2O，400MHz)，·3.4-3.8(m，100(任意設(shè)置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，29，PEI的-CH2CH2N-)。
實(shí)施例5-PEG20K-8PA-PEI12K(8 PEI 1800接枝PEG-20K)的合成根據(jù)實(shí)施例1的方法，1.0g帶有大約8個(gè)側(cè)丙酸基團(tuán)的平均分子量是大約20,000的聚乙二醇(PEG20K-8PA)與平均分子量是大約1800的聚氮丙啶(PEI2K，20克)反應(yīng)，得到大約1.1克的PEI20K-8PA-PEI2K。1H-NMR分析表明共聚物含有大約27％(w/w)PEI，表明共聚物的平均分子量是大約27,490，假設(shè)起始PEG-8PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，·3.4-3.8(m，100(任意設(shè)置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，38.3，PEI的-CH2CH2N-)。
實(shí)施例6-PEG20K-15PA-GFLG-PEI400(帶有GFLG連接基團(tuán)的15PEI400接枝PEG20K)的合成現(xiàn)在參照?qǐng)D1B，根據(jù)圖示說(shuō)明合成PEG20K-15PA-GLFG-PEI400。通過在大約20ml無(wú)水二氯甲烷中溶解帶有大約15個(gè)側(cè)丙酸基團(tuán)的平均分子量大約20,000的聚乙二醇(PEG)(PEG20K-15PA)(2.0g，～1.5毫摩爾-COOH，)來(lái)合成PEG20K-15PA-ONp。然后向溶液中加入大約292mg(2.1毫摩爾，F(xiàn)w＝139)對(duì)硝基苯酚和大約26mg(0.2毫摩爾)4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。將混合物在室溫下攪拌，形成澄清溶液。然后加入大約402mg(2.1毫摩爾)的細(xì)粉末1-[二甲基氨基丙基]-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)。將混合物在室溫下攪拌大約3小時(shí)。接著，加入大約0.4ml的乙酸，將混合物再攪拌30分鐘。加入大約400mg(2.1毫摩爾，F(xiàn)w＝190.22)對(duì)甲苯磺酸一水合物來(lái)中和DMAP催化劑。室溫下攪拌混合物直到所有的固體都溶解。向溶液中加入大約40ml異丙醇。然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上真空去除大約20ml溶劑。從水浴中移開燒瓶，隨著在真空下冷卻旋轉(zhuǎn)的燒瓶，產(chǎn)品固化。然后在冰浴上將懸浮液冷卻1小時(shí)。氬氣保護(hù)下通過真空過濾收集白色固體。用總共20ml冰冷的10％甲醇/異丙醇接著用10ml室溫乙醚洗滌濾餅。將潮濕的產(chǎn)物溶解于20ml甲醇，然后在冰浴上緩慢加給40ml的冰冷的異丙醇。將白色固體過濾，用10ml冰冷的10％甲醇/異丙醇和10ml室溫乙醚洗滌。氬氣流下將產(chǎn)物簡(jiǎn)要干燥之后在P2O5干燥器中真空干燥過夜。獲得2.0g的白色PEG-15PA-ONp產(chǎn)物，通過UV吸光度測(cè)定，產(chǎn)物每個(gè)PEG-20K分子含有大約9.9ONp基團(tuán)(·401.5nm＝18,400，在0.1N NaOH溶液中)。
將大約2.0g(1.0毫摩爾ONp酯)的無(wú)水PEG20K-15PA-ONp和608mg(1.2當(dāng)量的ONp酯)的無(wú)水GFLG四肽(TFA鹽)溶解于20ml的無(wú)水DMF。向溶液中加入大約0.48ml(2.76毫摩爾，2當(dāng)量的GFLG)的N，N-二異丙基乙基胺(DIPEA)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌4小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮至大約10ml。向殘余物加入大約100ml的冷乙醚，沉淀產(chǎn)物。濾出白色固體，得到大約4g的粗產(chǎn)物。在凝膠過濾柱上純化(2.0×80cm的Sephadex G25，用0.1mM三乙胺/乙酸緩沖液洗滌(pH＝10))，得到1.75g的純產(chǎn)物。1H-NMR表明各個(gè)PEG20K共聚物分子含有大約9個(gè)GFLG四肽1H-NMR(D2O，400MHz)，7.2(d，2.62，Phe的ArH)，3.4-3.8(m，100(任意設(shè)置)，PEG的-CH2CH2O-)，0.78(d，38.3，Leu的CH3)。
純化的PEG30K-15PA-GFLG產(chǎn)物與PEI400反應(yīng)，生成PEG20K-15PA-GFLG-PEI400。大約1.0g的PEG20K-15PA-GFLG與大約20g的平均分子量大約400的聚氮丙啶(PEI400)如實(shí)施例1所述反應(yīng)。得到大約1.1g的PEG20K-15PA-GFLG-PEI2K。1H-NMR表明各個(gè)共聚物分子含有2,000 PEI和9.0分子的GFLG連接基團(tuán)，假設(shè)起始PEG15PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，87.2(m，2.5，Phe的ArH)，3.4-3.8(m，100(任意設(shè)置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，10，PEI的-CH2CH2N-)，0.78(d，2.6，Leu的CH3)。
實(shí)施例7-PEG20K-15PA-GFLG-PEI800(帶有GFLG連接基團(tuán)的15PEI800接枝PEG20K)的合成根據(jù)實(shí)施例5的方法，PEG20K-15PA與GFLG和聚氮丙啶800(PEI800)反應(yīng)，產(chǎn)生PEG20K-15PA-GFLG-PEI800。1H-NMR表明各個(gè)共聚物分子含有4,400PEI和9.0分子的GFLG連接基團(tuán)，假設(shè)起始PEG15PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，87.2(m，2.5，Phe的ArH)，3.4-3.8(m，100(任意設(shè)置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，22，PEI的-CH2CH2N-)，0.78(d，2.6，Leu的CH3)。
實(shí)施例8-PEG20K-8PA-GFLG-PEI400(帶有GFLG連接基團(tuán)的8PEI400接枝PEG20K)的合成根據(jù)實(shí)施例5的方法，PEG20K-8PA與GFLG和聚氮丙啶400(PEI400)反應(yīng)，產(chǎn)生PEG20K-8PA-GFLG-PEI400。1H-NMR表明各個(gè)共聚物分子含有1,087 PEI和3.8分子的GFLG連接基團(tuán)，假設(shè)起始PEG-8PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，87.2(m，1.1，Phe的ArH)，3.4-3.8(m，100(任意設(shè)置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，5.6，PEI的-CH2CH2N-)，0.78(d，1.1，Leu的CH3)。
實(shí)施例9-PEG20K-8PA-GFLG-PEI800(帶有GFLG連接基團(tuán)的8PEI800接枝PEG20K)的合成根據(jù)實(shí)施例5的方法，PEG20K-8PA與GFLG和聚氮丙啶800(PEI800)反應(yīng)，產(chǎn)生PEG20K-8PA-GFLG-PEI800。1H-NMR表明各個(gè)共聚物分子含有2,207 PEI和3.8分子的GFLG連接基團(tuán)，假設(shè)起始PEG15PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，87.2(m，1.1，Phe的ArH)，3.4-3.8(m，100(任意設(shè)置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，11.3，PEI的-CH2CH2N-)，0.78(d，1.1，Leu的CH3)。
實(shí)施例10-PEG20K-8PA-GFLG-PEI12K(帶有GFLG連接基團(tuán)的8PEI 12K接枝PEG20K)的合成根據(jù)實(shí)施例5的方法，PEG20K-8PA與GFLG和平均分子量是1800的聚氮丙啶(PEI12K)反應(yīng)，產(chǎn)生PEG20K-8PA-GFLG-PEI2K。1H-NMR表明各個(gè)共聚物分子含有6,297PEI和3.8分子的GFLG連接基團(tuán)，假設(shè)起始PEG-8PA的平均分子量是20,000。1H-NMR(D2O，400MHz)，87.2(m，1.1，Phe的ArH)，3.4-3.8(m，100(任意設(shè)置)，PEG的-CH2CH2O-)，2.4-3.2(m，26，PEI的-CH2CH2N-)，0.78(d，1.1，Leu的CH3)。
實(shí)施例11-使用共聚物將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染給培養(yǎng)細(xì)胞HT1080細(xì)胞接種到6-孔組織培養(yǎng)板中。在含有10％FBS的1.0ml的HyQ MEM/EBSS培養(yǎng)基中對(duì)每個(gè)孔接種大約100,000個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)板在37℃ 5％CO2溫育箱中溫育過夜。接著，吸除培養(yǎng)基并且向各個(gè)孔加入900微升新鮮培養(yǎng)基。
制備含有本發(fā)明的DNA和載體共聚物的復(fù)合體的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，得到載體共聚物溶液。在PBS緩沖液中將載體共聚物濃度標(biāo)準(zhǔn)化成大約0.6mg/mlPEI。接著向無(wú)菌試管中的大約100微升無(wú)血清培養(yǎng)基加入大約2.0微升至大約20微升范圍體積的載體共聚物溶液。得到的溶液在室溫下溫育大約10分鐘。然后將溶液與大約2.0微升的1.0微克/微升綠色熒光蛋白DNA(GFP)或紅色熒光蛋白DNA(RFP)溶液混合并且在室溫下溫育20分鐘，得到DNA/載體共聚物復(fù)合體。
向6孔板中的細(xì)胞滴加DNA/載體共聚物復(fù)合體。向細(xì)胞加復(fù)合體時(shí)，在所有的方向輕輕搖動(dòng)平板，是復(fù)合體與生長(zhǎng)培養(yǎng)基混合。然后在37℃ 5％CO2溫育箱中將細(xì)胞溫育至少24小時(shí)。用熒光顯微鏡或FACS細(xì)胞分離儀檢查細(xì)胞。吸除去除轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基并且向保留的細(xì)胞加入新鮮培養(yǎng)基。表1說(shuō)明使用本發(fā)明的各種載體和對(duì)照物和質(zhì)粒GFP DNA的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。加號(hào)表示成功轉(zhuǎn)染，減號(hào)表示沒有轉(zhuǎn)染。
實(shí)施例12-使用共聚物將寡核苷酸轉(zhuǎn)染給培養(yǎng)的細(xì)胞在96孔組織培養(yǎng)板上每孔接種大約2,500個(gè)細(xì)胞。在37℃ 5％CO2溫育箱中將細(xì)胞溫育過夜。然后吸出去除舊的培養(yǎng)基，并且加入50微升含有10％FBS的新鮮培養(yǎng)基。
制備含有本發(fā)明的寡核苷酸和載體共聚物的復(fù)合體的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。得到載體共聚物溶液。在PBS緩沖液中將載體共聚物濃度標(biāo)準(zhǔn)化成大約0.6mg/mlPEI。接著，向一定體積的無(wú)血清培養(yǎng)基加入大約2.0微升至大約20微升范圍體積的載體共聚物溶液，使得無(wú)菌試管中總的溶液體積為50微升。得到的溶液在室溫下溫育大約10分鐘。
然后將溶液與大約2.0微升的0.1mM寡核苷酸溶液(22-鏈節(jié)，～0.7mg/ml)混合。含有的寡核苷酸是帶有3’反轉(zhuǎn)和5’熒光標(biāo)記的22-鏈節(jié)磷酸二酯寡核苷酸。然后在室溫下將得到的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基溫育20分鐘。向96孔板的孔中加入轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。然后在37℃ 5％CO2溫育箱中將細(xì)胞溫育大約6小時(shí)。然后吸出去除轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并且用大約100微升無(wú)菌PBS將細(xì)胞洗滌兩次。
洗滌之后，向孔中加入大約100微升新鮮培養(yǎng)基，并且在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。熒光表明細(xì)胞已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染了寡核苷酸。表1給出使用本發(fā)明的不同載體和對(duì)照物和寡核苷酸的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。加號(hào)表示成功轉(zhuǎn)染，減號(hào)表示沒有轉(zhuǎn)染。
表1.共聚物結(jié)構(gòu)及其它們對(duì)質(zhì)粒DNA和寡核苷酸的轉(zhuǎn)染活性的總結(jié)。在Varian 400MHz儀上用1H-NMR仔細(xì)表征化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過所描述的凝膠位移分析測(cè)試DNA和寡核苷酸結(jié)合穩(wěn)定性。使用含有GFP報(bào)告基因的質(zhì)粒DNA測(cè)試基因轉(zhuǎn)染。使用帶有3’-末端反轉(zhuǎn)和5’-末端熒光標(biāo)記的22-鏈節(jié)磷酸二酯寡核苷酸測(cè)試寡核苷酸轉(zhuǎn)染。
總結(jié)總之，本發(fā)明提供新類型的聚陽(yáng)離子接枝聚合物載體分子。新的聚陽(yáng)離子接枝共聚物表現(xiàn)出大的水溶性和低水平毒性。本發(fā)明的一些實(shí)施方案使用PEG作為PEI片段或者其他聚陽(yáng)離子聚合物片段與之連接的主鏈聚合物。PEG是具有很多有用性質(zhì)的線性聚合物，象好的溶解性和好的排泄動(dòng)力學(xué)。另外，PEG是生物相容的，因?yàn)樗拘孕?，免疫原性和抗原性小。這些性質(zhì)使得PEG成為藥學(xué)研究中研究得最充分的藥物載體，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)國(guó)內(nèi)用藥。通過使聚陽(yáng)離子聚合物與生物相容聚合物例如PEG偶聯(lián)，聚陽(yáng)離子聚合物能使得更可溶并且毒性更小。另外，小的聚陽(yáng)離子聚合物片段毒性比大分子量陽(yáng)離子聚合物毒性低得多，并且容易從體內(nèi)清除。因此，通過使小陽(yáng)離子聚合物與生物相容主鏈聚合物偶聯(lián)能產(chǎn)生載體共聚物，該載體共聚物能將治療藥物例如聚陰離子大分子送遞給細(xì)胞。
本發(fā)明的載體聚合物還提供增強(qiáng)的復(fù)合的DNA/載體共聚物穩(wěn)定性。還證明本發(fā)明的載體聚合物與其他DNA載體聚合物相比具有增強(qiáng)的轉(zhuǎn)染活性。和當(dāng)與核酸復(fù)合時(shí)形成聚集的沉淀物的沒有修飾的聚陽(yáng)離子不一樣，本發(fā)明的共聚物通過離子相互作用結(jié)合核酸，形成象核心外殼一樣的微膠粒結(jié)構(gòu)。由于通過生物相容主鏈聚合物形成的中性親水性外殼，這種結(jié)構(gòu)在生物條件下是穩(wěn)定的和可溶的。該復(fù)合體在生物緩沖劑中是穩(wěn)定的，即使在血清的存在下。作為結(jié)果，轉(zhuǎn)染活性比沒有修飾的聚陽(yáng)離子載體，例如PEI，PLL或殼聚糖高得多。
本發(fā)明的載體能被用來(lái)對(duì)特定靶向細(xì)胞或組織送遞藥物和其他治療藥物。所述共聚物載體被用于核酸向細(xì)胞的緩釋和定向送遞。此外，通過靶向特定細(xì)胞或器官能提高藥物的藥效，從而減少藥物在健康組織中的積累并且使其毒性最小。這樣的特異靶向使得要施用的治療藥物劑量更高，如果需要，對(duì)非靶向細(xì)胞沒有不期望的作用。
序列表<110>薩盧斯治療公司<120>聚陽(yáng)離子水溶性共聚物和將聚陰離子大分子跨越生物屏障傳遞的方法<130>3302.2.1.1<150>09/996,507<151>2001-11-28<160>2<170>Patont In version 3.0<210>1<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>1Gly Phe Leu Gly1<210>2<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>2Gly Phe Phe Gly11權(quán)利要求
1.運(yùn)送聚陰離子大分子跨越細(xì)胞生物屏障的載體，包括生物相容親水性主鏈聚合物；和兩種或幾種通過連接基團(tuán)與生物相容親水性主鏈聚合物共價(jià)連接的聚陽(yáng)離子聚合物。
2.權(quán)利要求1的載體，其中所述生物相容親水性主鏈選自聚乙二醇(PEG)，聚(N-(2-羥基丙基)甲基丙烯酰胺)，及其共聚物。
3.權(quán)利要求2的載體，其中所述聚陽(yáng)離子聚合物是聚氮丙啶(PEI)。
4.權(quán)利要求1的載體，其中所述聚陽(yáng)離子聚合物選自聚烷基胺(PAM)，聚氮丙啶(PEI)，聚賴氨酸(PL)，多肽，殼聚糖，多糖，和其共聚物。
5.權(quán)利要求1的載體，進(jìn)一步包括至少一個(gè)與生物相容親水性主鏈或者與兩個(gè)或幾個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物中的一個(gè)連接的靶向部分。
6.權(quán)利要求5的載體，其中所述靶向部分選自配體，抗原，半抗原，生物素，凝集素，半乳糖，半乳糖胺，蛋白質(zhì)，組蛋白，多肽，脂質(zhì)，碳水化合物，維生素，和它們的組合。
7.權(quán)利要求1的載體，進(jìn)一步包括至少一個(gè)與生物相容親水性主鏈或者與兩個(gè)或幾個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物中的一個(gè)連接的裂解劑。
8.權(quán)利要求7的載體，其中所述至少一種裂解劑選自病毒肽，細(xì)菌毒素，溶菌作用肽，aleveolysin，bifermentolysin，boutulinolysin，capriciolysin，cereolysin O，chauveolysin，histolyticolysin O，肺炎球菌溶血素，sealigerolysin，septicolysin O，sordellilysin，streptoslysin O，tenaolysin或蘇云金菌溶素O，及其活性片段。
9.權(quán)利要求1的載體，其中所述連接基團(tuán)具有大約2至大約100個(gè)原子的長(zhǎng)度。
10.權(quán)利要求9的載體，其中所述連接基團(tuán)選自烴鏈，PEG片段，多肽，含有酯鍵的線性聚合物，含有酰胺鍵的線性聚合物，含有二硫鍵的線性聚合物，含有腙鍵的線性聚合物，含有肟鍵的線性聚合物。
11.權(quán)利要求9的載體，其中所述連接基團(tuán)的長(zhǎng)度在大約3個(gè)原子至大約30個(gè)原子的范圍內(nèi)。
12.權(quán)利要求1的載體，其中所述生物相容親水性主鏈具有大約1,000至大約1,000,000范圍內(nèi)的分子量，并且聚陽(yáng)離子聚合物具有大約100至大約100,000范圍內(nèi)的分子量。
13.權(quán)利要求12的載體，其中所述生物相容親水性主鏈的分子量是大約5,000至大約100,000范圍內(nèi)。
14.權(quán)利要求12的載體，其中所述生物相容親水性主鏈的分子量是大約20,000至大約40,000范圍內(nèi)。
15.權(quán)利要求12的載體，其中所述聚陽(yáng)離子聚合物的分子量是大約200至大約10,000范圍內(nèi)。
16.權(quán)利要求12的載體，其中所述聚陽(yáng)離子聚合物的分子量是大約400至大約2,000范圍內(nèi)。
17.權(quán)利要求1的載體，其中所述生物相容親水性主鏈?zhǔn)蔷垡叶疾⑶宜鼍坳?yáng)離子聚合物是聚氮丙啶。
18.權(quán)利要求17的載體，其中大約4至大約100個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物通過連接基團(tuán)與生物相容親水性主鏈聚合物共價(jià)連接。
19.權(quán)利要求17的載體，其中大約8至大約15個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物通過連接基團(tuán)與生物相容親水性主鏈聚合物共價(jià)連接。
20.權(quán)利要求17的載體，其中所述生物相容親水性主鏈的分子量是大約20,000至大約40,000范圍內(nèi)。
21.權(quán)利要求17的載體，其中所述聚陽(yáng)離子聚合物的分子量是大約400至大約2,000范圍內(nèi)。
22.權(quán)利要求17的載體，其中所述連接基團(tuán)選自烴鏈，PEG片段，多肽，含有酯鍵的線性聚合物，含有酰胺鍵的線性聚合物，含有二硫鍵的線性聚合物，含有腙鍵的線性聚合物，含有肟鍵的線性聚合物。
23.權(quán)利要求17的載體，進(jìn)一步包括至少一個(gè)與生物相容親水性主鏈或者與兩個(gè)或幾個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物中的一個(gè)連接的靶向部分。
24.權(quán)利要求23的載體，其中所述靶向部分選自配體，抗原，半抗原，生物素，凝集素，半乳糖，半乳糖胺，蛋白質(zhì)，組蛋白，多肽，脂質(zhì)，碳水化合物，維生素，和它們的組合。
25.權(quán)利要求17的載體，進(jìn)一步包括至少一個(gè)與生物相容親水性主鏈或者與兩個(gè)或幾個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物中的一個(gè)連接的裂解劑。
26.權(quán)利要求25的載體，其中所述至少一種裂解劑選自病毒肽，細(xì)菌毒素，溶菌作用肽，aleveolysin，bifermentolysin，boutulinolysin，capriciolysin，cereolysin O，chauveolysin，histolyticolysin O，肺炎球菌溶血素，sealigerolysin，septicolysin O，sordellilysin，streptoslysin O，tenaolysin或蘇云金菌溶素O，及其活性片段。
27.權(quán)利要求17的載體，其中所述連接基團(tuán)是生物可降解肽。
28.權(quán)利要求1的載體，其中大約4至大約100個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物通過連接基團(tuán)與生物相容親水性主鏈聚合物共價(jià)連接。
29.權(quán)利要求1的載體，其中大約8至大約15個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物通過連接基團(tuán)與生物相容親水性主鏈聚合物共價(jià)連接。
30.權(quán)利要求25的載體，其中所述生物可降解肽選自GlyPhePheGly和GlyPheLeuGly。
31.運(yùn)送聚陰離子大分子跨越細(xì)胞生物屏障的復(fù)合體，包括用于將聚陰離子大分子送遞給細(xì)胞的載體分子，所述載體分子包括生物相容親水性主鏈聚合物和兩個(gè)或幾個(gè)通過連接基團(tuán)與生物相容親水性主鏈聚合物連接的聚陽(yáng)離子聚合物；和與載體分子復(fù)合的聚陰離子大分子。
32.權(quán)利要求31的復(fù)合體，其中所述聚陰離子大分子是核酸。
33.權(quán)利要求32的復(fù)合體，其中所述聚陽(yáng)離子聚合物是PEI。
34.權(quán)利要求33的復(fù)合體，其中所述生物相容親水性主鏈聚合物是PEG。
35.權(quán)利要求33的復(fù)合體，其中所述生物相容親水性主鏈聚合物是HPMA。
36.權(quán)利要求32的復(fù)合體，其中所述核酸選自基因組DNA，質(zhì)粒DNA，合成DNA，和RNA。
37.權(quán)利要求32的復(fù)合體，其中所述核酸選自反義寡核苷酸，核酶，DNA酶，嵌合RNA/DNA寡核苷酸，硫代磷酸酯寡核苷酸，2’-O-甲基寡核苷酸，DNA-PNA偶聯(lián)物，DNA-嗎啉代-DNA偶聯(lián)物，及其組合。
38.權(quán)利要求31的復(fù)合體，其中所述生物相容親水性主鏈具有大約1,000至大約1,000,000范圍內(nèi)的分子量，并且聚陽(yáng)離子聚合物具有大約100至大約100,000范圍內(nèi)的分子量。
39.權(quán)利要求38的復(fù)合體，其中所述生物相容親水性主鏈的分子量是大約20,000至大約40,000范圍內(nèi)。
40.權(quán)利要求39的復(fù)合體，其中所述聚陽(yáng)離子聚合物的分子量是大約400至大約2,000范圍內(nèi)。
41.權(quán)利要求31的復(fù)合體，其中所述連接基團(tuán)選自烴鏈，PEG片段，多肽，含有酯鍵的線性聚合物，含有酰胺鍵的線性聚合物，含有二硫鍵的線性聚合物，含有腙鍵的線性聚合物，含有肟鍵的線性聚合物。
42.權(quán)利要求31的復(fù)合體，其中所述生物相容親水性主鏈選自聚乙二醇(PEG)，聚(N-(2-羥基丙基)甲基丙烯酰胺)，及其共聚物。
43.權(quán)利要求42的復(fù)合體，其中所述聚陽(yáng)離子聚合物選自聚烷基胺(PAM)，聚氮丙啶(PEI)，聚賴氨酸(PL)，多肽，殼聚糖，多糖，和其共聚物。
44.權(quán)利要求31的復(fù)合體，進(jìn)一步包括至少一個(gè)與生物相容親水性主鏈或者與兩個(gè)或幾個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物中的一個(gè)連接的靶向部分，所述靶向部分選自配體，抗原，半抗原，生物素，凝集素，半乳糖，半乳糖胺，蛋白質(zhì)，組蛋白，多肽，脂質(zhì)，碳水化合物，和它們的組合。
45.權(quán)利要求31的復(fù)合體，進(jìn)一步包括至少一個(gè)與生物相容親水性主鏈或者與兩個(gè)或幾個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物中的一個(gè)連接的裂解劑，至少一種所述裂解劑選自病毒肽，細(xì)菌毒素，溶菌作用肽，aleveolysin，bifermentolysin，boutulinolysin，capriciolysin，cereolysinO，chauveolysin，histolyticolysin O，肺炎球菌溶血素，sealigerolysin，septicolysin O，sordellilysin，streptoslysinO，tenaolysin或蘇云金菌溶素O，及其活性片段。
46.權(quán)利要求31的復(fù)合體，其中大約4至大約100個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物通過連接基團(tuán)與生物相容親水性主鏈聚合物共價(jià)連接。
47.權(quán)利要求31的復(fù)合體，其中大約8至大約15個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物通過連接基團(tuán)與生物相容親水性主鏈聚合物共價(jià)連接。
48.運(yùn)送聚陰離子大分子跨越細(xì)胞生物屏障的方法，包括使聚陰離子大分子與載體分子復(fù)合產(chǎn)生復(fù)合體，所述載體分子包括生物相容親水性主鏈聚合物和兩個(gè)或幾個(gè)通過連接基團(tuán)與生物相容親水性主鏈聚合物共價(jià)連接的聚陽(yáng)離子聚合物；并且使細(xì)胞接觸復(fù)合體。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述生物相容親水性主鏈選自聚乙二醇(PEG)，聚(N-(2-羥基丙基)甲基丙烯酰胺)，及其共聚物。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述聚陽(yáng)離子聚合物選自聚烷基胺(PAM)，聚氮丙啶(PEI)，聚賴氨酸(PL)，多肽，殼聚糖，多糖，和其共聚物。
51.權(quán)利要求48的方法，進(jìn)一步包括至少一個(gè)與生物相容親水性主鏈或者與兩個(gè)或幾個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物中的一個(gè)連接的靶向部分，所述靶向部分選自配體，抗原，半抗原，生物素，凝集素，半乳糖，半乳糖胺，蛋白質(zhì)，組蛋白，多肽，脂質(zhì)，碳水化合物，和它們的組合。
52.權(quán)利要求48的方法，進(jìn)一步包括至少一個(gè)與生物相容親水性主鏈或者與兩個(gè)或幾個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物中的一個(gè)連接的裂解劑，至少一種所述裂解劑選自病毒肽，細(xì)菌毒素，溶菌作用肽，aleveolysin，bifermentolysin，boutulinolysin，capriciolysin，cereolysinO，chauveolysin，histolyticolysin O，肺炎球菌溶血素，sealigerolysin，septicolysin O，sordellilysin，streptoslysinO，tenaolysin或蘇云金菌溶素O，及其活性片段。
53.權(quán)利要求48的方法，其中所述連接基團(tuán)具有大約2至大約100個(gè)原子的長(zhǎng)度。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述連接基團(tuán)選自烴鏈，PEG片段，多肽，含有酯鍵的線性聚合物，含有酰胺鍵的線性聚合物，含有二硫鍵的線性聚合物，含有腙鍵的線性聚合物，含有肟鍵的線性聚合物。
55.權(quán)利要求53的方法，其中所述連接基團(tuán)是生物可降解肽。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述生物可降解肽選自GlyPhePheGly和GlyPheLeuGly。
57.權(quán)利要求48的方法，其中所述生物相容親水性主鏈具有大約1,000至大約1,000,000范圍內(nèi)的分子量，并且聚陽(yáng)離子聚合物具有大約100至大約100,000范圍內(nèi)的分子量。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述生物相容親水性主鏈的分子量是大約20,000至大約40,000范圍內(nèi)。
59.權(quán)利要求57的方法，其中所述聚陽(yáng)離子聚合物的分子量是大約400至大約2,000范圍內(nèi)。
60.權(quán)利要求57的方法，其中所述生物相容親水性主鏈?zhǔn)蔷垡叶?，而且所述聚?yáng)離子聚合物是聚氮丙啶。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述生物相容親水性主鏈的分子量是大約20,000至大約40,000范圍內(nèi)。
62.權(quán)利要求60的方法，其中所述聚陽(yáng)離子聚合物的分子量是大約400至大約2,000范圍內(nèi)。
63.權(quán)利要求48的方法，其中大約4至大約100個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物通過連接基團(tuán)與生物相容親水性主鏈聚合物共價(jià)連接。
64.權(quán)利要求48的方法，其中大約8至大約15個(gè)聚陽(yáng)離子聚合物通過連接基團(tuán)與生物相容親水性主鏈聚合物共價(jià)連接。
全文摘要
本發(fā)明提供具有大的水溶性和低毒性的聚陽(yáng)離子接枝共聚物。所述共聚物被用來(lái)將藥物和其他治療物質(zhì)送遞給特異靶向細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1617928SQ02827640
公開日2005年5月18日 申請(qǐng)日期2002年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月28日
發(fā)明者王來(lái)新 申請(qǐng)人:薩盧斯治療公司