專利名稱：包含紅細(xì)胞生成素的穩(wěn)定的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定的包含紅細(xì)胞生成素(EPO)的新型藥物組合物。
EPO是一種控制哺乳動物紅細(xì)胞形成的糖蛋白激素。其可以作為骨髓中的紅細(xì)胞系祖細(xì)胞的生長和/或分化因子并且可以使其增殖和分化成紅細(xì)胞。
背景技術(shù)：
天然存在的人EPO是由腎產(chǎn)生的并且是刺激血紅細(xì)胞產(chǎn)生的體液血漿因子。其刺激骨髓中定向紅細(xì)胞系祖細(xì)胞的分裂和分化。(Goldwasseret等人，J.Biol.Chem.，249，4202-4211，1974，Sherwoodet等人，Endocrinology，103，866-870，1978)。其是在成人的腎(Sherwood等人，Endocrinology，103，866-870，1978)和胎兒的肝(Zanjani等人，J.Lab.Clin.Med.，89，640-644，1977)中產(chǎn)生的。
將EPO的藥物組合物給藥于生物體可以刺激和/或加速紅細(xì)胞的產(chǎn)生。EPO的藥物組合物被用來治療慢性腎衰、癌癥化療繼發(fā)的貧血和與人免疫缺陷病毒感染的齊多夫定治療有關(guān)的貧血及其它類型的貧血(Danna等人，臨床應(yīng)用中的紅細(xì)胞生成素-國際展望。紐約，NYMarcel Dekker；301-324，1990；Eschbach in sod.，N.England J.of Med.，316，2，73-78，1987；Krane，Henry Ford Hosp.Med.J.，31，3，177-181，1983)。
人EPO基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的產(chǎn)物——重組EPO被用于EPO藥物組合物中(EP 148605，EP 205564，EP 255231)。在現(xiàn)有技術(shù)中還對一些EPO類似物和衍生物進(jìn)行了描述EP 640619、EP 668351、WO9412650、EP 1064951、WO 0232957、WO 9533057、US 5916773、WO09902710、US 5580853、US 5747446、US 5919758和US 6107272。
在EP 178665、EP 178576、US 5661125、WO 0061169中對包含人血清白蛋白的EPO藥物組合物進(jìn)行了描述。人血清白蛋白可能會造成變態(tài)反應(yīng)(Stafford CT等人，Ann Allergy，61(2)，85-88，1988)。此外，當(dāng)藥物組合物包含人血液產(chǎn)品時還存在病毒感染的危險。因此，需要穩(wěn)定并且不含人血液產(chǎn)品如白蛋白的EPO藥物制劑。
EP 306824、EP 607156、EP 528313和EP 528314描述了用脲作為EPO穩(wěn)定劑的藥物組合物。
EP 306824、EP 178665、GB 2171304、EP 528314、EP 528313和EP1002547描述了EPO的冷凍干燥制劑。
US 5376632描述了一種使用α和β環(huán)糊精的藥物制劑。
EP 607156、EP 528313和EP 178665描述了包含抗菌的防腐劑如芐醇、尼泊金酯類、苯酚類、以及其混合物的水性EPO藥物組合物。
EP 909564、EP 528314、EP 430200和WO 0061169描述了氨基酸和/或氨基酸和非離子洗滌劑的組合作為穩(wěn)定劑的應(yīng)用。
WO 0187329描述了不同的聚乙二醇化的EPO類似物的藥物組合物。所描述的藥物組合物實(shí)際上是以硫酸鹽緩沖劑的應(yīng)用為基礎(chǔ)的。
RU 2128517、WO 0061169、EP 528313、EP 607156、EP 528314、EP178665中所描述的藥物組合物是在枸櫞酸鹽緩沖劑中進(jìn)行制備的。
本發(fā)明的概述本發(fā)明的目的是提供一種能有益地穩(wěn)定EPO的包含EPO的藥物組合物。
本發(fā)明提供了一種如權(quán)利要求1所述的包含EPO的穩(wěn)定的新型藥物組合物。在從屬權(quán)利要求中對優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了敘述。本發(fā)明還提供了如權(quán)利要求17所述的應(yīng)用、如權(quán)利要求18所述的方法、以及如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用。
該藥物組合物是用可藥用的pH緩沖系統(tǒng)來進(jìn)行制備的，并且用聚維酮(聚乙烯吡咯烷酮；PVP)作為穩(wěn)定劑。本發(fā)明的組合物穩(wěn)定了EPO，同時優(yōu)選不含除EPO之外的來源于人或動物的添加劑(例如血清蛋白)。該藥物組合物還任選地包含等張調(diào)節(jié)劑和/或一種或多種可藥用的賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物適用于人和獸藥，并且是以適于給藥的形式藥用的，其中所說的適于給藥的形式尤其是適于胃腸外應(yīng)用，例如肌內(nèi)、皮下和/或靜脈內(nèi)應(yīng)用的形式。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是液體，優(yōu)選地是水性形式。


圖1表示在40℃(±2℃)下儲存1個月后包含EPO的本發(fā)明樣品和參照樣品的SDS-PAGE分析。
圖2表示在40℃(±2℃)下存儲1個月與在冰箱中儲存1個月相比包含EPO的參照樣品的SDS-PAGE分析。
圖3表示在40℃(±2℃)下存儲1個月與在冰箱中儲存1個月相比包含EPO的本發(fā)明樣品和參照樣品的SDS-PAGE分析。
圖4表示在冰箱中儲存10個星期時包含EPO的本發(fā)明樣品和參照樣品的SDS-PAGE分析。
圖5表示在25℃(±2℃)下儲存10個星期時包含EPO的本發(fā)明樣品和參照樣品的SDS-PAGE分析。
圖6表示在40℃(±2℃)下儲存1個月時(40)與將各樣品在冰箱中儲存1個月時(HL)本發(fā)明樣品和參照樣品的相對響應(yīng)EPO-ELISA(％)。
圖7表示在25℃(±2℃)下儲存10個星期時(25)與將各樣品在冰箱中儲存10個星期時(HL)本發(fā)明樣品和參照樣品的相對響應(yīng)EPO-ELISA(％)。
本發(fā)明以及優(yōu)選實(shí)施方案的描述現(xiàn)已令人吃驚地發(fā)現(xiàn)包含PVP并優(yōu)選不包含除EPO之外的來源于人和/或動物的添加劑的藥物組合物有益地穩(wěn)定了EPO。
本發(fā)明提供了一種EPO藥物組合物，其包含a.治療有效量的EPO，
b.可藥用的pH緩沖系統(tǒng)，和c.PVP。
本發(fā)明還提供了除組分a-c之外還任選地包含下述組分的EPO藥物組合物d.等張調(diào)節(jié)劑和/或e.一種或多種其它可藥用的賦形劑。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選不含來源于人或動物的添加劑。(注意在此的添加劑因此是廣義的)術(shù)語‘紅細(xì)胞生成素(EPO)’指的是具有引起骨髓細(xì)胞增加網(wǎng)織紅細(xì)胞和血紅細(xì)胞生產(chǎn)的體內(nèi)生物學(xué)活性的蛋白，并且選自人EPO和下面所定義的衍生物以及類似物。
術(shù)語‘EPO的治療有效量’指的是能夠產(chǎn)生EPO的治療作用的EPO量。
術(shù)語‘穩(wěn)定劑’指的是對EPO具有穩(wěn)定作用的可藥用的賦形劑。
術(shù)語‘EPO的穩(wěn)定性’指的是維持EPO的含量和維持EPO的生物學(xué)活性。EPO的穩(wěn)定性特別是可受到下面過程的影響EPO吸附到容器壁上、EPO的變性或降解和形成聚集體例如EPO二聚物和/或EPO多聚體和/或更高分子量的類似分子。這些過程可能是由于樣品與不同的條件相接觸而發(fā)生的，例如高溫、不適宜的容器、使用了錯誤的EPO穩(wěn)定劑、光照、不適宜的儲存方法和/或不適宜的分離過程。
術(shù)語“不含來源于人和/或動物的添加劑”是指不有意地向組合物中加入得自人和/或動物并且不同于EPO的添加劑，如血清白蛋白如HSA或BSA，或者如果它們在開始時存在于EPO制劑中的話，在EPO的純化和/或分離過程中已經(jīng)被分離或降低至不可避免的痕量水平，優(yōu)選被降低至用標(biāo)準(zhǔn)的分析方法一般檢測不到的水平。
已經(jīng)令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明組合物中所配制的EPO在高于冰箱溫度的溫度下(例如2-8℃)、尤其是在室溫下(即低于25℃)并且甚至在更高的溫度(例如40℃)下改善了其穩(wěn)定性。這意味著該組合物可以不需要進(jìn)行冷卻地長期儲存(在室溫下儲存10星期以上)，其活性不會顯著降低并且不會顯著降解。
在本發(fā)明的藥物組合物中，除pH緩沖系統(tǒng)和任選地除等張調(diào)節(jié)劑和/或另外的可藥用賦形劑外，可以單獨(dú)用PVP作為有效的EPO穩(wěn)定劑并不需要再使用另外的穩(wěn)定劑來穩(wěn)定EPO。因此，可以用PVP代替已知的用于維持現(xiàn)有技術(shù)所述的EPO藥物組合物中的EPO穩(wěn)定性的不同穩(wěn)定劑的組合。從經(jīng)濟(jì)的角度來看，制備僅包含一種有效的穩(wěn)定劑而不是包含兩種或多種穩(wěn)定劑的藥物組合物制劑是更好的。其制備更易于進(jìn)行，成本更低，制備所花費(fèi)的時間更少并且患者的生物體中接受的添加劑更少。雖然并不受到這種方式的限制，但本發(fā)明的藥物組合物可以因此優(yōu)選地僅由上述組分a.-c.組成，或任選地僅由a.-d.、a.-c.加e.或a.-e.所組成。
在現(xiàn)有技術(shù)已知的一些藥物組合物中，用非離子去污劑如聚山梨醇酯80作為EPO的穩(wěn)定劑。使用PVP比使用聚山梨醇酯類更有利，這是因?yàn)榭梢杂媚z過濾法作為測定EPO二聚物、EPO多聚體以及由EPO分子的聚集而產(chǎn)生的相關(guān)高分子量物質(zhì)的分析方法。聚山梨醇酯類物質(zhì)會與EPO二聚物一起被洗脫下來。因此，不能用凝膠過濾法作為包含聚山梨醇酯類物質(zhì)的藥物組合物中EPO二聚物的檢測方法。因此，使用PVP有助于更容易地檢測EPO的穩(wěn)定性、增加安全性和使得可以更容易地對EPO藥物組合物的質(zhì)量進(jìn)行控制。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選地是一種液體并且特別是一種水性藥物組合物。該類液體組合物可以不需要進(jìn)行會降低EPO的生物學(xué)活性或甚至使其活性喪失的重建、稀釋或另外的制備步驟地直接用于胃腸外應(yīng)用如皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)應(yīng)用，并且還有助于避免應(yīng)用時發(fā)生的其它技術(shù)問題。因此，使用液體藥物組合物比使用冷凍干燥制劑更實(shí)用。對于EPO臨床制劑的制備而言，與冷凍干燥制劑相比，一般優(yōu)選液體并且特別是水性EPO制劑，這是因?yàn)槔鋬龈稍锝M合物的重建過程費(fèi)時、有造成蛋白制劑不適當(dāng)處理的風(fēng)險、或者可能被不適當(dāng)?shù)刂亟?，并且通常需要用某些添加劑如穩(wěn)定劑來保留足夠的藥物活性。
本發(fā)明的藥物組合物最優(yōu)選不含來源于人或動物的添加劑如人血清蛋白(盡管進(jìn)行了血液篩查，但是其仍然有被可傳播物質(zhì)感染的危險)。此外，雖然重組的EPO一般可以被很好地耐受，但是偶然會觀察到皮疹和蕁麻疹，這表明對于該EPO制劑的一些組分，如人血清白蛋白具有高過敏性。
本發(fā)明的藥物組合物適宜地是在等滲溶液中制備的并且預(yù)期其是可藥用的，不會造成副作用如超敏性。
不考慮EPO的生物學(xué)活性，也不考慮其合成或制造方法，本發(fā)明的藥物組合物可以用于所有形式的EPO，包括EPOα、EPOβ、EPOω和具有不同同種型的其它EPO、以及特定的EPO同種型、EPO突變蛋白、EPO片斷、EPO類似物如EPO二聚物、NESP(重組人EPO的高糖基化類似物)、基因活化的EPO、聚乙二醇化的EPO、含有EPO的雜種分子、EPO片斷、含有EPO的融合蛋白(低聚物和多聚體)、具有改性的糖基化特性的EPO，所說的合成或制造方法非限制性地包括天然EPO和重組EPO(由cDNA或者基因組DNA制造的)的分離、合成、轉(zhuǎn)基因和基因活化法。
本發(fā)明藥物組合物的每個劑量可以包含500至100000單位或更多的EPO(1IU相當(dāng)于約10納克重組EPO)，優(yōu)選地每個劑量包含1000至40000IU。一般而言，認(rèn)為有效量為1至500IU/kg體重，并且更優(yōu)選地為50至300IU/kg體重，當(dāng)將EPO皮下給藥時尤其如此。所說的有效量還進(jìn)一步取決于被治療個體的種屬和大小、被治療的特定情況或疾病以及其嚴(yán)重程度和給藥途徑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將藥物量制備成每個劑量提供選自約1000IU、約2000IU、約3000IU、約4000IU、約10000IU、約20000IU、約25000IU和約40000IU的量。
本發(fā)明的藥物組合物可以被填充到安瓿、注射器和注射小瓶中。其使得可以以每單位劑量0.2至20ml的適宜體積來進(jìn)行應(yīng)用。
該溶液的優(yōu)選pH范圍為約6至約8，更優(yōu)選為約6.8至約7.5，并且最優(yōu)選為約7.0。優(yōu)選使用磷酸鹽緩沖劑系統(tǒng)，尤其是磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉如NaH2PO4×2H2O/Na2HPO4×2H2O。用于維持約6至約8的理想pH范圍的其它適宜緩沖劑系統(tǒng)非限制性地包括枸櫞酸鈉/枸櫞酸、醋酸鈉/醋酸、和任何其它現(xiàn)有技術(shù)中已知的可藥用pH緩沖劑。枸櫞酸鹽緩沖劑可能會造成注射部位疼痛。因此，對于胃腸外應(yīng)用更優(yōu)選磷酸鹽緩沖劑。
pH緩沖劑系統(tǒng)、尤其是磷酸鹽緩沖劑的濃度取決于制劑的所需pH。優(yōu)選的濃度范圍為10至50mM，更優(yōu)選為15至35mM，最優(yōu)選地為15至25mM。可以加入pH-調(diào)節(jié)劑，例如但不限于HCl、NaOH、枸櫞酸或枸櫞酸鈉。
本發(fā)明的藥物組合物包含作為EPO穩(wěn)定劑的PVP。在本發(fā)明的含義中，PVP是由聚[1-(2-氧代-1-吡咯烷基)乙烯]的標(biāo)準(zhǔn)形式來表示的，其也被稱為聚維酮或聚乙烯吡咯烷酮。優(yōu)選使用低分子量的PVP，特別是PVPK12至K18，并且最優(yōu)選使用PVP K12。本發(fā)明組合物中PVP的含量應(yīng)當(dāng)能對EPO提供穩(wěn)定作用，其量適宜地為至少0.001％(w/v)。PVP的濃度優(yōu)選為約0.01％至約5.0％，更優(yōu)選為0.1至1.0％，最優(yōu)選為約0.5％(w/v)。
本發(fā)明的藥物組合物還任選地包含能使本發(fā)明的制劑與人的血液等滲的物質(zhì)。典型的適宜等張調(diào)節(jié)劑在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的，并且非限制性地包括選自無機(jī)鹽如NaCl、CaCl2、甘露醇、甘氨酸、葡萄糖和山梨醇的物質(zhì)。在本發(fā)明的制劑中優(yōu)選用NaCl作為等張調(diào)節(jié)劑。
雖然如上所述的那樣，優(yōu)選用PVP作為唯一有效的穩(wěn)定劑的制劑，但是如果需要的話，本發(fā)明的藥物組合物除上述組分a.、b.和任選的d.和e.外還可以任選地包含一種以上類型的穩(wěn)定劑。這種另外的穩(wěn)定劑優(yōu)選選自表面活性劑如脫水山梨醇衍生物/聚山梨醇酯類如例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、和泊洛沙姆類物質(zhì)如Pluronic 68。其中，特別優(yōu)選Pluronic F68，并且其應(yīng)用濃度適宜地為約1％或低于1％，其濃度更優(yōu)選為0.05至0.2％。
本發(fā)明的藥物組合物還可以任選地包含一種或多種可藥用的賦形劑。適宜的可藥用賦形劑包括多元醇(選自甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇)、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚乙二醇酯和醚、甘醇酯和甘油酯、氨基酸如甘氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酸、L-2-苯基丙氨酸、L-蘇氨酸。
本發(fā)明的組合物可用于制備治療和/或預(yù)防EPO適用的疾病的藥物。醫(yī)學(xué)應(yīng)用的實(shí)例包括其中需要刺激血紅細(xì)胞(RBC)增殖、存在內(nèi)源性激素不足、失血或患者具有貧血的指征、或者骨髓對內(nèi)源性激素響應(yīng)能力低下的各種治療。這些醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥有例如惡性疾病(即任何類型的實(shí)體癌，或血液癌，包括白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤)的貧血、由惡性疾病的化療/放療導(dǎo)致的貧血、慢性疾病(包括例如自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和肝炎)的貧血、AIDS患者，尤其是這些用AZT治療的患者的貧血、早產(chǎn)兒貧血、與(慢性)腎衰有關(guān)的貧血、地中海貧血、自身免疫性溶血性貧血、再生障礙性貧血、和與手術(shù)(用于改善用于自體輸血的手術(shù)前獻(xiàn)血以刺激和增加血紅蛋白水平以對抗大量失血或增加骨髓移植個體紅細(xì)胞生成水平)、疲勞、疼痛、慢性心衰、節(jié)律障礙或癡呆的治療有關(guān)的貧血、用來降低非血管和非心臟手術(shù)同種異體輸血需要的手術(shù)前應(yīng)用以及EPO適用的其它適應(yīng)癥。
用下面的實(shí)施例來對本發(fā)明進(jìn)行說明，但是并不是要用其對本發(fā)明進(jìn)行限制。
實(shí)施例分析方法用下面的分析方法來對本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)行分析使用免疫檢測的SDS-PAGE、分子排阻色譜法(SEC)、EPO-ELISA和使用小鼠進(jìn)行的體內(nèi)生物學(xué)活性試驗(yàn)。
使用免疫檢測的SDS-PAGE加載的樣品是用不含還原劑的加載緩沖液制備的。使用垂直的SDS-PAGE凝膠NuPAGE Bis-Tris 12％，8×8cm，1.0mm厚，在MOPS SDS電泳緩沖液(Invitrogen)中15個泳道(Invitrogen)。電泳在200V的恒定電壓下進(jìn)行1小時。在從該凝膠電遷移到硝酸纖維素膜后，分兩步進(jìn)行免疫檢測。在第一步中使用一級抗體(抗-huEPO，小鼠，單克隆)。在第二步中，使用軛合到辣根過氧化物酶上的二級抗體(抗-小鼠IgG，兔，多克隆)。加入過氧化物酶底物引發(fā)了形成藍(lán)色復(fù)合物的酶反應(yīng)。
EPO-ELISASystem EPO-ELISA QuantiKine IVD，R&D Systems是以雙抗體夾心法為基礎(chǔ)的。用預(yù)涂了對EPO具有特異性的單克隆(鼠科動物)抗體的微量滴定板孔來對樣品或標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行培養(yǎng)。EPO結(jié)合到該板上所固定的抗體上。在除去樣品或標(biāo)準(zhǔn)品后，將該孔用與辣根過氧化物酶軛合的抗-EPO多克隆(兔)抗體培養(yǎng)。在第二次培養(yǎng)期間，該抗體-酶軛合物結(jié)合到被固定的EPO上。向這些孔中加入色原并通過酶反應(yīng)對其進(jìn)行氧化從而形成一種藍(lán)色復(fù)合物。所產(chǎn)生顏色的量直接與結(jié)合成EPO抗體復(fù)合物的軛合物的量成比例，而軛合物的量又直接與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中EPO的量成比例。
SEC用SEC來確定得自FP1至FP8的EPO含量為2000IU/ml至10000IU/ml的樣品中EPO二聚物和相關(guān)高分子量物質(zhì)的比例。使用歐洲藥典方案的極限試驗(yàn)(歐洲藥典2002，第4版，紅細(xì)胞生成素濃溶液)。
體內(nèi)生物學(xué)活性使用歐洲藥典中所述的缺氧小鼠進(jìn)行的體內(nèi)生物學(xué)活性測定方案。生物學(xué)活性的估算也是根據(jù)歐洲藥典的方案進(jìn)行的(歐洲藥典-1997；生物學(xué)分析和試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計分析；平行線模型)。根據(jù)歐洲藥典的要求，所估算的生物活性值應(yīng)當(dāng)在所標(biāo)活性的80％至120％之間。該方法的目標(biāo)是所注射的EPO含量(值)(10000IU/ml)達(dá)到80％至120％之間并且所得的結(jié)果代表了生物學(xué)活性的估計值而不是其精確值。置信限應(yīng)當(dāng)在標(biāo)示活性64％至156％之間的范圍內(nèi)。
對EPO藥物組合物的穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)的條件HL-參照 2至8℃，冰箱40 40℃±2℃，75％±5％相對濕度，恒溫恒濕箱25 25℃±2℃，60％±5％相對濕度，恒溫恒濕箱實(shí)施例1穩(wěn)定性試驗(yàn)制備下面的制劑組合物FP1至FP8FP1聚山梨醇酯80(0.03％(重量/體積(w/v)))，甘氨酸(0.5％(w/v))，磷酸鹽緩沖劑(20mmol/l)，NaCl(100mmol/l)FP2甘氨酸(0.5％(w/v))，甘油(1.4％(w/v))，磷酸鹽緩沖劑(32mmol/l)FP3甘氨酸(0.5％(w/v))，Pluronic F68(0.1％(w/v))，磷酸鹽緩沖劑(20mmol/l)，NaCl(90.6mmol/l)FP4山梨醇(4.5％(w/v))，Pluronic F68(0.1％(w/v))，磷酸鹽緩沖劑(20mmol/l)FP5葡聚糖70(1％(w/v))，NaCl(123mmol/l)，磷酸鹽緩沖劑(20mmol/l)FP6甘油(2％(w/v))，Pluronic F68(0.1％(w/v))，NaCl(17.1mmol/l)磷酸鹽緩沖劑(20mmol/l)FP7甘油(2％(w/v))，PVP K12(0.5％(w/v))，磷酸鹽緩沖劑(20mmol/l)FP8PVP K12(0.5％(w/v))，NaCl(123mmol/l)，磷酸鹽緩沖劑(20mmol/l)如下所述的那樣，制劑中的EPO含量被設(shè)定為2000IU/ml或10000IU/ml。
將各自EPO含量為10000IU/ml的樣品FP1至FP8在40℃(±2℃)下儲存1個月(40)。用在40℃(±2℃)下儲存了1個月的磷酸鹽緩沖液中的EPO原藥作為陽性對照(PK)用于測定EPO二聚物的含量。將該樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析；各泳道的樣品裝載量為0.4μg。圖1顯示了其結(jié)果。
圖1的圖例說明泳道 樣品1空泳道2預(yù)著色的SDS-PAGE MW標(biāo)準(zhǔn)品，低程，Bio-Rad，4μl裝載量3空泳道4EPO-BRP(歐洲藥典的EPO標(biāo)準(zhǔn)品)5FP1 40
6 FP2 407 FP3 408 FP4 409 FP5 4010FP6 4011FP7 4012FP8 4013PK14空泳道15預(yù)著色的SDS-PAGE MW標(biāo)準(zhǔn)品，低程，Bio-Rad，4μl裝載量圖2顯示了在冰箱(HL)中和在40℃(±2℃)(40)下儲存1個月的各自EPO含量為10000IU/ml的樣品FP1至FP4的SDS-PAGE。用在40℃(±2℃)下儲存了1個月的磷酸鹽緩沖液中的EPO原藥作為陽性對照(PK)用于測定EPO二聚物的含量。各泳道的樣品裝載量為0.4μg。
圖2的圖例說明泳道 樣品1 空泳道2 預(yù)著色的SDS-PAGE MW標(biāo)準(zhǔn)品，低程，Bio-Rad，4μl裝載量3 空泳道4 EPO-BRP(歐洲藥典的EPO標(biāo)準(zhǔn)品)5 FP1 HL6 FP2 HL7 FP3 HL8 FP4 HL9 FP1 4010FP2 4011FP3 40
12FP4 4013PK14空泳道15預(yù)著色的SDS-PAGE MW標(biāo)準(zhǔn)品，低程，Bio-Rad，4μl裝載量圖3顯示了在冰箱(HL)中和在40℃(±2℃)(40)下儲存1個月的各自EPO含量為10000IU/ml的樣品FP5至FP8的SDS-PAGE。用在40℃(±2℃)下儲存了1個月的磷酸鹽緩沖液中的EPO原藥作為陽性對照(PK)用于測定EPO二聚物的含量。各泳道的樣品裝載量為0.4μg。
圖3的圖例說明泳道 樣品1 空泳道2 預(yù)著色的SDS-PAGE MW標(biāo)準(zhǔn)品，低程，Bio-Rad，4μl裝載量3 空泳道4 EPO-BRP(歐洲藥典的EPO標(biāo)準(zhǔn)品)5 FP5 HL6 FP6 HL7 FP7 HL8 FP8 HL9 FP5 4010FP6 4011FP7 4012FP8 4013PK14空泳道15預(yù)著色的SDS-PAGE MW標(biāo)準(zhǔn)品，低程，Bio-Rad，4μl裝載量圖4顯示了在冰箱(HL)中儲存10個星期的各自EPO含量為10000IU/ml的樣品FP1至FP8的SDS-PAGE。用在40℃(±2℃)下儲存了1個月的磷酸鹽緩沖液中的EPO原藥作為陽性對照(PK)用于測定EPO二聚物的含量。各泳道的樣品裝載量為0.4μg。
圖4的圖例說明泳道 樣品1 空泳道2 預(yù)著色的SDS-PAGE MW標(biāo)準(zhǔn)品，低程，Bio-Rad，4μl裝載量3 空泳道4 EPO-BRP(歐洲藥典的EPO標(biāo)準(zhǔn)品)5 FP1 HL6 FP2 HL7 FP3 HL8 FP4 HL9 FP5 HL10FP6 HL11FP7 HL12FP8 HL13PK14空泳道15預(yù)著色的SDS-PAGE MW標(biāo)準(zhǔn)品，低程，Bio-Rad，4μl裝載量圖5顯示了在25℃(±2℃)下儲存10個星期(25)的各自EPO含量為10000IU/ml的樣品FP1至FP8的SDS-PAGE。用在40℃(±2℃)下儲存了1個月的磷酸鹽緩沖液中的EPO原藥作為陽性對照(PK)用于測定EPO二聚物的含量。各泳道的樣品裝載量為0.4μg。
圖5的圖例說明泳道 樣品1 空泳道2 預(yù)著色的SDS-PAGE MW標(biāo)準(zhǔn)品，低程，Bio-Rad，4μl裝載量3 空泳道4 EPO-BRP(歐洲藥典的EPO標(biāo)準(zhǔn)品)5 FP1 256 FP2 257 FP3 258 FP4 259 FP5 2510FP6 2511FP7 2512FP8 2513PK14空泳道15預(yù)著色的SDS-PAGE MW標(biāo)準(zhǔn)品，低程，Bio-Rad，4μl裝載量圖6顯示了相對于在冰箱中存儲1個月(HL)的樣品FP1至FP8而言，在40℃(±2℃)下存儲1個月(40)的各自EPO含量為10000IU/ml的樣品FP1至FP8的相對EPO-ELISA響應(yīng)(％)。
圖7顯示了相對于在冰箱中存儲10個星期(HL)的樣品FP1至FP8而言，在25℃(±2℃)下存儲10個星期(25)的各自EPO含量為10000IU/ml的樣品FP1至FP8的相對EPO-ELISA響應(yīng)(％)。
穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果使用免疫檢測的SDS-PAGE表明在室溫下，在本發(fā)明的藥物組合物(FP7和FP8)中不會出現(xiàn)EPO聚集體例如EPO二聚物和相關(guān)的高分子量物質(zhì)(圖1-5)。在升高的溫度下，它們以少量存在。將本發(fā)明的藥物組合物與其中使用聚山梨醇酯類物質(zhì)和氨基酸(甘氨酸)的組合的藥物組合物FP1在升高的溫度下(在40℃下一個月)的EPO穩(wěn)定性進(jìn)行比較(圖1、2、3)，顯示在FP1中形成了EPO二聚物。EPO二聚物的形成是EPO穩(wěn)定性的重要因素之一。所測量到的EPO聚集體，例如EPO二聚物和相關(guān)的高分子量物質(zhì)在使用后還可能造成不希望出現(xiàn)的副作用并且可能會使用該藥物組合物進(jìn)行治療的患者感到不舒服。這些聚集體還可能引起有機(jī)體的免疫響應(yīng)，從而使得必需停止用EPO進(jìn)行的治療。
在升高的溫度下(40℃，1個月；圖6)，與所制備的其它藥物組合物(FP1-FP7)相比，僅包含PVP作為有效的穩(wěn)定劑的本發(fā)明藥物組合物(FP8)表現(xiàn)為當(dāng)與其它制劑相比時，被吸附到FP8的小瓶上的EPO低于或等于其它制劑。在室溫下，該吸附作用相當(dāng)或更好(圖7)。吸附到小瓶上的量增加將降低EPO的穩(wěn)定性，從而將降低整體生物學(xué)活性。
在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)用氨基酸作為制劑中EPO的穩(wěn)定劑。但是，氨基酸并不是總能表現(xiàn)出穩(wěn)定EPO的作用。在圖6和7中，可以看出在升高的溫度下(40℃下1個月)，包含甘氨酸的藥物組合物FP2和FP3的穩(wěn)定性比不包含甘氨酸的藥物制劑FP4、FP5、FP6和FP8的穩(wěn)定性低，并且也比包含甘氨酸的FP1低。使用不同穩(wěn)定劑的正確組合可以得到高EPO穩(wěn)定性，但是并不能預(yù)見到其適宜的組合。通過本發(fā)明的藥物組合物，令人吃驚地發(fā)現(xiàn)PVP穩(wěn)定了EPO。
將用SEC測量的EPO二聚物和相關(guān)高分子量物質(zhì)的比例與樣品的稀溶液(濃度為2％)進(jìn)行比較。該極限試驗(yàn)的結(jié)果如下面的表1所示
表1

*表示由于安慰劑中的聚山梨醇酯類物質(zhì)，不能測定二聚物的比例**表示由于葡聚糖，不能測定二聚物的比例。
在大多數(shù)樣品中還檢測到了少量高分子量的相關(guān)物質(zhì)，但是在該表述中并沒有包括該物質(zhì)。
體內(nèi)生物學(xué)活性是用在25℃下儲存10個星期或者在冰箱中儲存4個月的EPO含量為10000IU/ml的樣品FP8來測量的。
所得結(jié)果如下面的表2所示
表2

該結(jié)果表明所估算的生物學(xué)活性在所需范圍內(nèi)并且符合歐洲藥典的要求。該置信限也在所需的范圍內(nèi)。
實(shí)施例2和3EPO藥物組合物的組成在表3和4中分別敘述了本發(fā)明實(shí)施例2和3的組合物(以藥物組合物形式存在)。
表3

表4


物質(zhì)的品質(zhì)EPO歐洲藥典所要求的質(zhì)量(歐洲藥典質(zhì)量)，聚維酮K12(聚[1-(2-氧代-1-吡咯烷基)乙烯]，聚維酮或聚乙烯吡咯烷酮，PVP)歐洲藥典質(zhì)量，也符合美國藥典要求(USP質(zhì)量)，購自BASF，Ludwigshafen，德國，NaCl、Na2HPO4×2H2O、NaH2PO4×2H2O、NaOH、注射用水歐洲藥典質(zhì)量。
包含EPO的藥物組合物的制備含有PVP K12的安慰劑溶液的制備在室溫下，通過在磁力攪拌器上進(jìn)行混合將緩沖劑(Na2HPO4×2H2O，NaH2PO4×2H2O)、NaCl和穩(wěn)定劑PVP K12溶解于注射用水中。然后用1M NaOH將其pH調(diào)節(jié)至7.0-7.1。
得到一種澄清的無色溶液。
EPO溶液的制備將所計算體積的EPO溶液(是根據(jù)EPO活性來進(jìn)行計算的)加入到安慰劑溶液中。就在這一步之前，取出相同體積的安慰劑溶液。用磁力攪拌器在低轉(zhuǎn)速下對該溶液進(jìn)行攪拌。得到一種澄清的無色溶液。
然后，將兩種濃度的包含EPO的藥物組合物溶液用使用孔徑為0.2μm的PVDF(聚偏二氟乙烯)膜的膜濾器無菌過濾滅菌(空氣潔凈水平為100級)PVDF。將0.8ml濾液填充到2ml的進(jìn)行了洗滌和滅菌的小瓶中(所說的小瓶是由無色的管狀I(lǐng)型水解玻璃形成的)，用由溴丁基橡膠制成的彈性塞將其封閉，并用鋁帽將其密封。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定的紅細(xì)胞生成素(EPO)藥物組合物，其包含a.治療有效量的EPOb.可藥用的pH緩沖系統(tǒng)，和c.聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其不含來源于人和/或動物的添加劑。
3.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其還任選地包含d.等張調(diào)節(jié)劑和/或e.一種或多種可藥用的賦形劑。
4.如權(quán)利要求1至3中任意一項所述的組合物，其中所說的組合物是水性的。
5.如權(quán)利要求1至4中任意一項所述的組合物，其中用藥用量的EPO進(jìn)行配制從而使得每個劑量提供的EPO量為約500至約100000IU EPO。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所說的藥用量被配制成每個劑量可以提供選自約1000IU、約2000IU、約3000IU、約4000IU、約10000IU、約20000IU、約25000IU和約40000IU量的EPO。
7.如權(quán)利要求1至6中任意一項所述的組合物，其中所說的pH緩沖系統(tǒng)提供了約6至約8的pH范圍。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所說的pH緩沖系統(tǒng)提供了約6.8至約7.5的pH范圍。
9.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所說的pH緩沖系統(tǒng)提供了約7.0的pH。
10.如權(quán)利要求1至9中任意一項所述的組合物，其中所說的pH緩沖系統(tǒng)是磷酸鹽緩沖劑。
11.如權(quán)利要求1至10中任意一項所述的組合物，其中含有約0.01％至約1％的PVP。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中含有約0.1％至約1％的PVP。
13.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所說的PVP濃度為約0.5％。
14.如權(quán)利要求1至13中任意一項所述的組合物，其中所說的PVP的K值為K12至K18。
15.如權(quán)利要求1至14中任意一項所述的組合物，其中所說的等張調(diào)節(jié)劑選自無機(jī)鹽。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中所說的等張調(diào)節(jié)劑是NaCl。
17.PVP用于穩(wěn)定水溶液中的紅細(xì)胞生成素(EPO)的應(yīng)用。
18.一種制備包含紅細(xì)胞生成素(EPO)的組合物的方法，其包括將EPO與PVP進(jìn)行混合。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中制備了如權(quán)利要求1至16中任意一項所述的組合物。
20.如權(quán)利要求1至16中任意一項所述的組合物在制備用于治療和/或預(yù)防紅細(xì)胞生成素(EPO)適用的疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用PVP穩(wěn)定的新型的穩(wěn)定紅細(xì)胞生成素(EPO)藥物組合物。
文檔編號A61K9/00GK1638791SQ02829329
公開日2005年7月13日 申請日期2002年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月17日
發(fā)明者A·武克米羅維奇, T·羅茲蔓, J·斯韋泰克, A·帕里斯 申請人:力奇制藥公司