專利名稱：能作為抗白血病藥物的草藥分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用從萎葉(Piper betel)葉子提取物中分離到的綠原酸(CA)來治療急性和慢性髓細(xì)胞性白血病(AML和CML)和淋巴細(xì)胞性白血病(lymphoid leukemia)。急性髓細(xì)胞性白血病(AML)和慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)，和淋巴細(xì)胞性白血病都是致命的，尚無任何破壞白血病細(xì)胞的藥物，并且這些細(xì)胞對(duì)化學(xué)療法的反應(yīng)差，所述化學(xué)療法總是非特異性的并因此對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。用萎葉成分(綠原酸)治療的獨(dú)特性是殺傷髓細(xì)胞性癌細(xì)胞(myeloid cancercells)和淋巴細(xì)胞性癌細(xì)胞，而不影響其它正常細(xì)胞。
背景和已有技術(shù)參考髓細(xì)胞性白血病通常再分成兩種急性髓細(xì)胞性白血病(AML)和慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)。AML的特征是骨髓中骨髓細(xì)胞數(shù)量的增加和骨髓細(xì)胞的成熟被抑制。在美國(guó)，每年AML的發(fā)病率大約為每100,000人中有2.4人發(fā)病并且隨著年齡逐漸增長(zhǎng)，對(duì)于65歲或更大年齡的成人來說，AML的發(fā)生率最高達(dá)到每100,000人中有12.6人發(fā)病。CML是惡性造血干細(xì)胞克隆病癥。發(fā)病的中值年齡為53歲，但在所有年齡組包括兒童都可發(fā)生。CML的自然進(jìn)程是在3-5年或更短的時(shí)間內(nèi)從良性慢性階段發(fā)展到迅速爆發(fā)的致命性危象。盡管臨床醫(yī)學(xué)有了巨大進(jìn)展，但CML的預(yù)后較差(1)。CD33表示骨髓細(xì)胞分化進(jìn)程中特定的和有用的標(biāo)志(2)。近期的報(bào)告提示CD33與單克隆抗體的銜接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致體外AML和CML細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)抑制(2，3)。利用CD33的骨髓特異性表達(dá)，與抗癌藥物結(jié)合的人源化抗-CD33單克隆抗體已在AML病人中試驗(yàn)獲得巨大成功(4)。類似地，淋巴細(xì)胞性白血病也再分成兩種急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)和慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)。淋巴細(xì)胞性白血病可侵襲T和B細(xì)胞譜系并且流行于兒童。萎葉葉提取物的抗-髓細(xì)胞性活性已經(jīng)被要求保護(hù)(專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/IN00/00118，2000年12月12日)并且3-o-p-香豆?？崴?Coumaryl quinic acid，一種治療AML和CML的活性因子)在2002年5月30日美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/384,163(299/NF/2002.)中也要求了保護(hù)。
因此，申請(qǐng)人的早期發(fā)現(xiàn)與本專利關(guān)于從萎葉葉提取物中分離到的用于治療急性和慢性髓細(xì)胞性白血病和淋巴細(xì)胞性白血病的綠原酸(CA)是一致的。已知綠原酸具有抗-過敏活性(5)。CA也抑制肝和腎葡萄糖-6-磷酸酶系統(tǒng)(6)。CA是表皮lypoxygenase活性和TPA-誘導(dǎo)的耳炎癥抑制劑(7)。CA也對(duì)TPA-誘導(dǎo)的小鼠皮膚腫瘤助長(zhǎng)提供抑制作用(7)。CA的抗-HIV活性也已報(bào)道過(8)。盡管對(duì)腫瘤助長(zhǎng)的抑制作用歸功于CA，但尚未報(bào)道CA具有對(duì)已確定腫瘤的抗-腫瘤活性包括抗-白血病活性。在本專利申請(qǐng)中，首次提出要求保護(hù)CA的抗-白血病活性和抗-腫瘤活性。
萎葉葉具有很濃的刺激性芳香氣味并且在印度廣泛地咀嚼使用。通常停止生長(zhǎng)但尚未變脆的成熟或成熟過后的葉子用于咀嚼。咀嚼用的基本制劑由涂上熟石灰的萎葉葉子和加入了刮削下的檳榔果碎屑的兒茶組成；按照個(gè)人的口味使用調(diào)味劑如椰絲、丁香、小豆蔻、茴香、甘草粉、肉豆蔻和煙草。在某些地方，精制的萎葉葉制劑用銀質(zhì)或金質(zhì)薄膜包裹。作為咀嚼劑，它具有很多特性它是芳香的、有助消化的刺激物和驅(qū)風(fēng)劑。在醫(yī)學(xué)上，它用于卡他性感染和肺部感染；也適用于膏狀藥。含有檳榔果和其它添加劑的萎葉葉子咀嚼作用是刺激唾腺和刺激口腔粘膜。所產(chǎn)生的紅顏色是由于檳榔果中含有色素，它是檳榔果本身在石灰和兒茶中堿的作用下出現(xiàn)的。除了散發(fā)出令人愉快的氣味外，還產(chǎn)生輕度刺激，因而給人以溫暖感和舒服感。決定葉子芳香值的最重要的因素是含有的精油的量，特別是含有的精油的性質(zhì)。不同區(qū)域的萎葉氣味和味道不同。最刺激性的是Sanchi型，最淡和最芳香的來自Varanasi。
萎葉葉子含有精油，根據(jù)葉子的不同品種，油的含量在0.7-2.6％之間變化。油由酚和萜組成。酚油的比例越高，質(zhì)量越好。認(rèn)為稱作佳味備酚(萎葉酚；4-烷基-2-羥基-1甲氧基苯)的丁子香酚異構(gòu)體是萎葉油的特征性成分。印度型萎葉油含有大量酚性成分并以局部給藥或通過漱口劑形式用于治療各種呼吸問題。它具有驅(qū)風(fēng)劑的性質(zhì)。它對(duì)哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)顯示不同的作用。葉子的精油和提取物具有抗幾種革蘭氏-陽(yáng)性菌和革蘭氏-陰性菌活性，所述革蘭氏-陽(yáng)性菌和革蘭氏-陰性菌如化膿微球菌白色變種(Micrococcus pyogenes var.Albus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和巨大芽孢桿菌(B.Megaterium)、肺炎雙球菌(Diplococcus pneumoniae)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、大腸桿菌(Escherichia coli)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhosa)、逗號(hào)弧菌(Vibrio comma)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、普通變形菌(Proteus vulgaris)、茄伯克霍爾德氏菌(Pdseudomonas solanacaerum)、藤黃八疊球菌(Sarcina lutea)和胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotorora)。精油和葉子提取物也顯示抗黑曲霉(Asperigillus niger)和米曲霉(A.Oryzae)、新月彎孢霉(Curvularia lunata)和尖鐮孢(Fusariumoxysporum)的抗-真菌活性。所述精油被發(fā)現(xiàn)在約5分鐘內(nèi)使原生動(dòng)物，Paramaeceum caudatum死亡(5)。所述葉子的蒸餾物顯示抗結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tyberculosis)活性。
參考文獻(xiàn)1.Sawyers CL，The New England Journal of Medicine，340(17)1330-1340，1999.
2.Vitale，C；Romagnani，C等人，Proc.Natl.Acd.Sci.USA，96(26)15091-15096，1999.
3.Vitale，C等人，Proc.Natl.Acd.Sci，USA.，98(10)5764-5769，2001.
4.Sievers EL，Appelbaum，F(xiàn)R等人，Blood，933678-3684，1999.
5.Ito H，Miyazaki T，Ono M和Sakurai H.Bioorg.Med.Chem.6(7)1051-1056，1998.
6.Arion WJ等人Arch.Biochem.Biophys.351(2)279-285，1998.
7.Conney AH等人Adv.Enzyme Regul.31385-396，1991.
8.Supriyatna G等人Phytomedicine，7(Suppl.II)87，2000.
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供從萎葉葉提取物中或從任何其它原料中分離到的化合物綠原酸在治療急性和慢性髓細(xì)胞性白血病和淋巴細(xì)胞性白血病中的新的用途。
本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療急性和慢性髓細(xì)胞性白血病和淋巴細(xì)胞性白血病的包含載體和化合物綠原酸的藥物組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供從萎葉的葉或任何其它植物部分分離用于治療AML、CML和淋巴細(xì)胞性白血病的活性級(jí)分的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種簡(jiǎn)單的、從具有與治療AML、CML和淋巴細(xì)胞性白血病有關(guān)的生物活性的萎葉所有植物部分分離活性組分的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供來自萎葉的葉或任何其它植物部分、用于治療AML、CML和淋巴細(xì)胞性白血病的草藥產(chǎn)品。
本發(fā)明的另一目的是提供從萎葉的葉中提純的、用于治療AML、CML和淋巴細(xì)胞性白血病的草藥綠原酸。
本發(fā)明的另一目的是提供由萎葉的葉或任何其它植物部分制備用于治療AML、CML和淋巴細(xì)胞性白血病的提取物的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種簡(jiǎn)單的、由萎葉的葉或任何其它植物部分制備用于治療AML、CML和淋巴細(xì)胞性白血病的提取物的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供由萎葉葉制備用于治療AML、CML和淋巴細(xì)胞性白血病的綠原酸的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供從萎葉的葉或任何其它植物部分中提純的、用于治療實(shí)體瘤包括淋巴瘤的草藥綠原酸。
本發(fā)明的另一目的是提供綠原酸(由任何來源分離到的或通過合成方法制備的)在治療急性和慢性髓細(xì)胞性白血病、淋巴細(xì)胞性白血病和實(shí)體瘤包括淋巴瘤中新的用途。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供從萎葉葉提取物或從任何其它來源分離到的化合物綠原酸在治療急性和慢性髓細(xì)胞性白血病和淋巴細(xì)胞性白血病中的新的用途。另外，本發(fā)明提供用于治療動(dòng)物和人急性和慢性髓細(xì)胞性白血病的藥物組合物，所述組合物包含有效量的從萎葉的任何植物部分或任何其它天然或合成來源分離到的綠原酸(CA)和/或3-o-p-香豆?？崴?PCQ)和可藥用添加劑。
發(fā)明詳述因此，本發(fā)明提供用于治療動(dòng)物和人急性和慢性髓細(xì)胞性白血病的藥物組合物，所述組合物包含有效量的從萎葉的任何植物部分或任何其它天然或合成來源分離到的綠原酸(CA)和/或3-o-p-香豆?？崴?PCQ)和可藥用添加劑。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述添加劑選自營(yíng)養(yǎng)物如蛋白質(zhì)、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、淀粉-明膠糊和/或可藥用載體、賦形劑、稀釋劑或溶劑。
在另一實(shí)施方案中，所述組合物中存在的CA和PCQ之比在1∶0-1∶10范圍，它可有效地用于治療實(shí)體瘤包括淋巴瘤。
在另一實(shí)施方案中，所述組合物通過口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥。
在另一實(shí)施方案中，所述組合物以1-50mg/kg體重/天的劑量水平給藥至少4周。
在另一實(shí)施方案中，所述組合物給藥期為4-12周。
在另一實(shí)施方案中，在25μg/ml CA的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到20％。
在另一實(shí)施方案中，在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到4％。
在另一實(shí)施方案中，在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到44％。
在另一實(shí)施方案中，在25μg/ml CA劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到16.67。
在另一實(shí)施方案中，在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.08％。
在另一實(shí)施方案中，在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到50％。
在另一實(shí)施方案中，在25μg/ml CA劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞CML白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.38。
在另一實(shí)施方案中，在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔CML白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.38％。
在另一實(shí)施方案中，在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔CML白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到20.3％。
再一個(gè)實(shí)施方案提供組合物在治療急性和慢性髓細(xì)胞性白血病(AML和CML)和淋巴細(xì)胞性白血病中的用途，它是通過給予包含有效量的、從萎葉的任何植物部分或任何其它來源分離到的綠原酸(CA)和/或3-o-p-香豆酰奎尼酸(PCQ)，和/或與可藥用添加劑組合的藥物組合物進(jìn)行的。
下面本文參考實(shí)施例描述本發(fā)明，該描述僅僅是說明性的并不應(yīng)該解釋為以任何方式限制本發(fā)明范圍。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表示級(jí)分E的HPLC，它顯示分為三個(gè)區(qū)ZA、ZB和Zc的不同峰的保留時(shí)間(RE)。
圖1a.所述峰已編號(hào)(ZA含有4個(gè)主要峰，而ZB含有10個(gè)非常小-中等的峰并且Zc含有2個(gè)截然不同的峰)。
圖3表示綠原酸(CA)或3-咖啡酰奎尼酸的結(jié)構(gòu)。
圖4表示用CA治療后白血病細(xì)胞系、CML病人和正常供體PBMC的顯微照片。
實(shí)施例-1植物原料的采集登山者從不同地區(qū)和印度的孟加拉邦采集萎葉的葉和所有其它植物部分。憑證標(biāo)本存放在印度化學(xué)生物學(xué)研究所的藥物化學(xué)部，4 RajaS.C.Mullick Road，Kolkata-700 032。
實(shí)施例2化合物綠原酸的分離將4.7Kg新采集的萎葉葉用蒸餾水洗滌，然后切成小碎片。將小碎片的葉子收集在一起，與1.0升蒸餾水混合，并在混合物攪拌器中充分勻漿。將勻漿物通過致密的粗棉布濾出大的碎片并收集濾液。該過程重復(fù)2-3次以獲得最大收率。然后離心合并的濾液，收集等分試樣的澄清溶液并凍干得到大約110gm的半固體物料。
檢查所收集物料的生物活性，即白血病細(xì)胞的破壞作用。在觀察到其陽(yáng)性活性時(shí)，開始進(jìn)行提純。將10gm上述物料裝填到SephadexLH-20柱上并用水、水-甲醇(1∶1)和甲醇作為洗脫劑進(jìn)行層析。分別檢查三種不同溶劑系統(tǒng)獲得的三種不同級(jí)分的生物活性。該活性僅定位于級(jí)分2，即甲醇-水(1∶1)洗脫下來的級(jí)分并稱作級(jí)分E。然后級(jí)分E利用Intersil ODS-3分析柱進(jìn)行HPLC分析。該分析柱用甲醇-水-乙酸(23∶76∶1)平衡，流速保持在1.0ml/分鐘并且在280nm鑒定峰。根據(jù)保留時(shí)間(RE)，不同的峰可能分成三個(gè)區(qū)，ZA、ZB和Zc(圖1)。ZA含有4個(gè)主要峰，而ZB含有10個(gè)非常小-中等的峰并且Zc含有2個(gè)截然不同的峰。觀察AA、ZB和Zc三個(gè)區(qū)生物活性是適宜的，分別測(cè)試三個(gè)區(qū)對(duì)白血病細(xì)胞的破壞活性。三個(gè)區(qū)都顯示具有生物活性。
可以注意到Zc含有保留時(shí)間(Rt)分別為17.77和26.66分鐘的2個(gè)截然不同的峰。已證明Rt為17.77分鐘的峰有相當(dāng)大的活性并因此測(cè)定其結(jié)構(gòu)和提出專利申請(qǐng)(299/NF/2002；申請(qǐng)日期為2002年5月30日)。后者，即Rt為26.66分鐘的峰不顯示任何活性。
ZB區(qū)含有10個(gè)不同大小的峰(1-10)。已證明合并的1-10峰級(jí)分具有白血病細(xì)胞殺傷活性。為此，分別檢測(cè)所有不同峰的生物活性。其中主要的峰分別相當(dāng)于Rt為6.58、7.14、7.56和11.97的2、3、4和8并且它們中無一顯示具有活性。因此通過重復(fù)收集各峰的級(jí)分以便增加其中所存在的活性分子的量來分別檢測(cè)較小的峰。搜索這些峰，即分別相當(dāng)于Rt為5.16、8.34、9.16、9.86、13.94和14.68的1、5、6、7、9和10峰的活性。除峰6(Rt為9.16分鐘)外，其它峰均未顯示可檢測(cè)到的活性。將合并的峰6(Rt為9.16分鐘)級(jí)分凍干并重新進(jìn)行HPLC分析，尖的單峰指示其純度(圖2)。然后進(jìn)行IR、NMR和質(zhì)譜分析以測(cè)定其結(jié)構(gòu)。
KBrIR γmaxcm-1 3355(OH)，1689(CO)，1637，16041522，1443，1286，1189，1121，10821039，975和8541H-NMR(CD3OD) 7.57(1H)，7.06(1H)，6.96(1H)，6.79(1H)6.27(1H)，5.34(1H)，4.17(1H)，3.73(1H)和2.13(4H)13C NMR(CD3OD)176.00，167.65，148.56，146.08，145.79，126.78，121.98，115.46，114.24，75.11，72.45，70.96，70.26，37.75和37.19FABMS m/Z 355(M++H)和377(M++Na)
由此測(cè)定的結(jié)構(gòu)顯示為綠原酸或3-咖啡酰奎尼酸，m.p.205°-206℃[a]D-33.25(H2O)(圖3)。市場(chǎng)上可獲得綠原酸的純品。購(gòu)買并與萎葉葉中分離到的綠原酸比較，因此明確地證實(shí)所獲得的物質(zhì)為綠原酸。
早期申請(qǐng)專利的結(jié)構(gòu)是3-p-香豆?？崴幔@示具有對(duì)CD33+骨髓細(xì)胞的破壞作用，但對(duì)CD33-細(xì)胞沒有，并且這一點(diǎn)與綠原酸非常類似。除了在綠原酸芳香環(huán)C-3位的額外羥基外，其它結(jié)構(gòu)非常類似。因此提示綠原酸優(yōu)于3-p-香豆?？崴岬幕钚钥赡苁怯捎诜枷悱h(huán)C-3位存在羥基。已指出該特定差別在于綠原酸破壞CD33-和CD33+細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞的活性更廣泛和更強(qiáng)。
ZA區(qū)證明具有生物活性。它含有4個(gè)峰，分別相當(dāng)于Rt為0.65、1.32、1.8和2.55的1、2、3和4峰。由于ZA區(qū)各峰的分離困難，不能測(cè)定活性峰的確切位置。
實(shí)施例3制備髓細(xì)胞性白血病病人的外周血單核細(xì)胞(PBMC)采集先前診斷為髓細(xì)胞性白血病病人的全血(各10ml)，其中一個(gè)病人診斷為AML并且另一病人診斷為CML。通過Ficoll/hypaque密度梯度離心分離單核細(xì)胞。
實(shí)施例4紅白血病細(xì)胞系K562的培養(yǎng)物。該細(xì)胞系采自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)，VA，美國(guó)。該細(xì)胞系是CD33-。K562細(xì)胞在含有10％加熱滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中體外生長(zhǎng)。
實(shí)施例5幼單核細(xì)胞細(xì)胞系U937的培養(yǎng)物。該細(xì)胞系得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，VA，美國(guó)，并且如細(xì)胞系K562所述體外生長(zhǎng)。該細(xì)胞系是CD33+。
實(shí)施例6含有綠原酸(CA)的髓細(xì)胞性白血病病人PBMC的體外培養(yǎng)。
將髓細(xì)胞性白血病病人的PBMC(1×105-2×106/ml)與各種濃度的CA一起在37℃和5％CO2中培養(yǎng)48小時(shí)。然后洗滌細(xì)胞并計(jì)數(shù)存活率(viability)。
實(shí)施例7CD33+細(xì)胞系U937與CA一起培養(yǎng)。將U937細(xì)胞(1×105-2×106/ml)與各種濃度的CA一起在37℃和5％CO2中培養(yǎng)48小時(shí)。然后洗滌細(xì)胞并計(jì)數(shù)存活率。
實(shí)施例8CD33-細(xì)胞系K562與CA一起培養(yǎng)。將K562細(xì)胞(1×105-2×106/ml)與各種濃度的CA一起在37℃和5％CO2中培養(yǎng)48小時(shí)。然后洗滌細(xì)胞并計(jì)數(shù)存活率。
實(shí)施例9T-淋巴細(xì)胞系Molt-4的培養(yǎng)物。該細(xì)胞系得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，VA，美國(guó)，并且如細(xì)胞系K562所述體外生長(zhǎng)。
實(shí)施例10制備正常個(gè)體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。采集全血并通過Ficoll/Hypaque密度梯度離心分離單核細(xì)胞。
實(shí)施例11通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞凋亡。CML病人的PBMC在含有或不含CA(100.0μg/ml)并且補(bǔ)充有10％加熱滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃和5％CO2下培養(yǎng)48hr。細(xì)胞用40％經(jīng)500μg/ml Rnase A處理過的乙醇固定，然后如上所述通過流式細(xì)胞儀用69μM碘化丙錠(propidium iodide)分析DNA含量(Mitra等人，Molecular Medicine，6527-541，2000)。
實(shí)施例6、7和8的結(jié)果如表1所示，髓細(xì)胞性白血病病人的PBMC、CD33+幼單核細(xì)胞細(xì)胞系U937和CD33-紅白血病細(xì)胞系K562被綠原酸破壞。
實(shí)施例9和10的結(jié)果如表2所示，紅白血病細(xì)胞系K562、幼單核細(xì)胞細(xì)胞系U937和CML病人的白血病細(xì)胞被綠原酸破壞，T-淋巴細(xì)胞系Molt-4需要較高的劑量。相反，正常供體的PBMC實(shí)際上不受CA影響。在含有或不含CA下培養(yǎng)48小時(shí)后U937、K562、CML病人的PBMC、Molt-4和正常PBMC的顯微照片顯示于圖4。我們?cè)缙谡?qǐng)求保護(hù)的3-o-p-香豆?？崴?PCQ)具有抗髓細(xì)胞性白血病活性(299/NF/2002；2000年5月30日)。在此，我們顯示綠原酸(CA)和3-o-p-香豆酰奎尼酸以1∶1比例的組合體系比單一的CA或PCQ在破壞白血病細(xì)胞系或髓細(xì)胞性白血病病人的白血病細(xì)胞方面更有效，但對(duì)正常供體的PBMC無作用(表3)。
實(shí)施例11的結(jié)果細(xì)胞-周期分析證明培養(yǎng)2天后，濃度為100.0μg/ml的綠原酸引起體外CML病人白血病細(xì)胞的凋亡，因?yàn)榕c單獨(dú)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞相比，它們?cè)赟、G2或M期蓄積(表4)。
表-1綠原酸體外對(duì)病人白血病細(xì)胞和白血病細(xì)胞系的破壞

注釋1.PBMC*，外周血單核細(xì)胞2.所使用細(xì)胞的數(shù)量為1×105/ml/孔表2CA體外對(duì)白血病細(xì)胞系和CML病人白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制

注釋所使用的細(xì)胞數(shù)為1×105/ml/孔表3.綠原酸(CA)和3-o-p-香豆酰奎尼酸(PCQ)的組合體系體外破壞白血病細(xì)胞系及AML和CML病人的白血病細(xì)胞是更有效的

所使用的細(xì)胞數(shù)為2×105/ml/孔。這些化合物殺傷細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)依賴于每ml含有的細(xì)胞數(shù)。
表4用CA處理2天后細(xì)胞周期不同階段的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)

權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1、一種治療動(dòng)物和人急性和慢性髓細(xì)胞性白血病的協(xié)同藥物組合物，所述組合物包含有效量的、從萎葉的任何植物部分中或任何其它天然或合成來源分離到的綠原酸(CA)和3-o-p-香豆?？崴?PCQ)和可藥用添加劑。
2、權(quán)利要求1的組合物，其中添加劑選自營(yíng)養(yǎng)物如蛋白質(zhì)、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、淀粉-明膠糊和/或可藥用載體、賦形劑、稀釋劑或溶劑。
3、權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物中存在的CA和PCQ之比在1∶0-1∶10范圍，它可有效地用于治療實(shí)體瘤包括淋巴瘤。
4、權(quán)利要求1的組合物，所述組合物通過口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥。
5、權(quán)利要求1的組合物，以1-50mg/kg體重/天的劑量水平給藥至少4周。
6、權(quán)利要求1的組合物，給藥4-12周。
7、權(quán)利要求1的組合物，其中在25μg/ml CA劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到20％。
8、權(quán)利要求1的組合物，其中在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到4％。
9、權(quán)利要求1的組合物，其中在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到44％。
10、權(quán)利要求1的組合物，其中在25μg/ml CA劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到16.67。
11、權(quán)利要求1的組合物，其中在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.08％。
12、權(quán)利要求1的組合物，其中在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到50％。
13、權(quán)利要求1的組合物，其中在25μg/ml CA劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞CML白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.38。
14、權(quán)利要求1的組合物，其中在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔CML白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.38％。
15、權(quán)利要求1的組合物，其中在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔CML白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到20.3％。
16、權(quán)利要求1所述組合物的用途，通過給予包含有效量的、從萎葉的任何植物部分或任何其它來源分離到的綠原酸(CA)和/或3-o-p-香豆酰奎尼酸(PCQ)和/或可藥用添加劑的藥物組合物來治療急性和慢性髓細(xì)胞性白血病(AML和CML)和淋巴細(xì)胞性白血病。
17、權(quán)利要求16的用途，其中CA和PCQ都是從萎葉的任何植物部分中分離到的或通過合成方法制備的。
18、權(quán)利要求16的用途，其中受試者選自哺乳動(dòng)物優(yōu)選人。
19.權(quán)利要求16的用途，其中添加劑選自營(yíng)養(yǎng)物如蛋白質(zhì)、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、淀粉-明膠糊和/或可藥用載體、賦形劑、稀釋劑或溶劑。
20、權(quán)利要求16的用途，其中所述組合物中存在的CA和PCQ之比在1∶0-1∶10范圍，它可有效地用于治療實(shí)體瘤包括淋巴瘤。
21、權(quán)利要求16的用途，其中所述組合物通過口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥。
22、權(quán)利要求16的用途，以1-50mg/kg體重的劑量水平至少每天一次給藥4周。
23、權(quán)利要求16的用途，給藥4周-3個(gè)月。
24、權(quán)利要求16的用途，其中在25μg/ml CA劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到20％。
25、權(quán)利要求16的用途，其中在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到4％。
26、權(quán)利要求16的用途，其中在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到44％。
27、權(quán)利要求16的用途，其中在25μg/ml CA劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到16.67。
28、權(quán)利要求16的用途，其中在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.08％。
29、權(quán)利要求16的用途，其中在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到50％。
30、權(quán)利要求16的用途，其中在25μg/ml CA劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞CML白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.38。
31、權(quán)利要求16的用途，其中在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔CML白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.38％。
32.權(quán)利要求17的用途，其中在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔CML白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到20.3％。
權(quán)利要求
1.治療動(dòng)物和人急性和慢性髓細(xì)胞性白血病的藥物組合物，所述組合物包含有效量的、從萎葉的任何植物部分或任何其它天然或合成來源分離到的綠原酸(CA)和/或3-o-p-香豆?？崴?PCQ)，和可藥用添加劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中添加劑選自營(yíng)養(yǎng)物如蛋白質(zhì)、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、淀粉-明膠糊和/或可藥用載體、賦形劑、稀釋劑或溶劑。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物中存在的CA和PCQ之比在1∶0-1∶10范圍，它可有效地用于治療實(shí)體瘤包括淋巴瘤。
4.權(quán)利要求1的組合物，所述組合物通過口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥。
5.權(quán)利要求1的組合物，以1-50mg/kg體重/天的劑量水平給藥至少4周。
6.權(quán)利要求1的組合物，給藥4-12周。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中在25μg/ml CA劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到20％。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到4％。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到44％。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中在25μg/ml CA劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到16.67。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.08％。
12.權(quán)利要求1的組合物，其中在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到50％。
13.權(quán)利要求1的組合物，其中在25μg/ml CA劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞CML白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.38。
14.權(quán)利要求1的組合物，其中在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔CML白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.38％。
15.權(quán)利要求1的組合物，其中在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔CML白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到20.3％。
16.權(quán)利要求1所述組合物的用途，通過給予包含有效量的、從萎葉的任何植物部分或任何其它來源分離到的綠原酸(CA)和/或3-o-p-香豆酰奎尼酸(PCQ)和/或可藥用添加劑的藥物組合物來治療急性和慢性髓細(xì)胞性白血病(AML和CML)和淋巴細(xì)胞性白血病。
17.權(quán)利要求16的用途，其中CA和PCQ都是從萎葉的任何植物部分中分離到的或通過合成方法制備的。
18.權(quán)利要求16的用途，其中受試者選自哺乳動(dòng)物優(yōu)選人。
19.權(quán)利要求16的用途，其中添加劑選自營(yíng)養(yǎng)物如蛋白質(zhì)、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、淀粉-明膠糊和/或可藥用載體、賦形劑、稀釋劑或溶劑。
20.權(quán)利要求16的用途，其中所述組合物中存在的CA和PCQ之比在1∶0-1∶10范圍，它可有效地用于治療實(shí)體瘤包括淋巴瘤。
21.權(quán)利要求16的用途，其中所述組合物通過口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥。
22.權(quán)利要求16的用途，以1-50mg/kg體重的劑量水平至少每天一次給藥4周。
23.權(quán)利要求16的用途，給藥4周-3個(gè)月。
24.權(quán)利要求16的用途，其中在25μg/ml CA劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到20％。
25.權(quán)利要求16的用途，其中在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到4％。
26.權(quán)利要求16的用途，其中在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到44％。
27.權(quán)利要求16的用途，其中在25μg/ml CA劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到16.67。
28.權(quán)利要求16的用途，其中在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.08％。
29.權(quán)利要求16的用途，其中在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到50％。
30.權(quán)利要求16的用途，其中在25μg/ml CA劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞CML白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.38。
31.權(quán)利要求16的用途，其中在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔CML白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.38％。
32.權(quán)利要求17的用途，其中在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔CML白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到20.3％。
33.一種治療急性和慢性髓細(xì)胞性白血病(AML和CML)和淋巴細(xì)胞性白血病的方法，所述方法包括給予含有有效量的、從萎葉的任何植物部分中或任何其它來源分離到的綠原酸(CA)和/或3-o-p-香豆?？崴?PCQ)和/或可藥用添加劑的藥物組合物。
34.權(quán)利要求33的方法，其中，CA和PCQ都是從萎葉的任何植物部分分離到的或通過合成方法制備的。
35.權(quán)利要求33的方法，其中受試者選自哺乳動(dòng)物優(yōu)選人。
36.權(quán)利要求33的方法，其中，添加劑選自營(yíng)養(yǎng)物如蛋白質(zhì)、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鈣、淀粉-明膠糊和/或可藥用載體、賦形劑、稀釋劑或溶劑。
37.權(quán)利要求33的方法，其中所述組合物中存在的CA和PCQ之比在1∶0-1∶10范圍，它能有效地用于治療實(shí)體瘤包括淋巴瘤。
38.權(quán)利要求33的方法，其中所述組合物通過口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥。
39.權(quán)利要求33的方法，其中所述組合物以1-50mg/kg體重的劑量水平至少每天一次給藥4周。
40.權(quán)利要求33的方法，給藥4周-3個(gè)月。
41.權(quán)利要求33的方法，其中在25μg/ml CA劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到20％。
42.權(quán)利要求33的方法，其中在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到4％。
43.權(quán)利要求33的方法，其中在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型K562的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到44％。
44.權(quán)利要求33的方法，其中在25μg/ml CA劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到16.67。
45.權(quán)利要求33的方法，其中在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.08％。
46.權(quán)利要求33的方法，其中在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞型U937的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到50％。
47.權(quán)利要求33的方法，其中在25μg/ml CA劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔細(xì)胞CML白血病細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.38。
48.權(quán)利要求33的方法，其中在25μg/ml PCQ劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔CML白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到2.38％。
49.權(quán)利要求33的方法，其中在含有25μg/ml CA和25μg/ml PCQ的劑量水平下，白血病細(xì)胞系2×106/ml/孔CML白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用達(dá)到20.3％。
全文摘要
本發(fā)明涉及從萎葉葉提取物中或從任何其它來源分離到的化合物綠原酸在治療急性和慢性髓細(xì)胞性白血病和淋巴細(xì)胞性白血病中新的用途，并且本發(fā)明也提供含有綠原酸和可藥用添加劑的用于治療急性和慢性髓細(xì)胞性白血病和淋巴細(xì)胞性白血病的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61K47/42GK1646112SQ02829404
公開日2005年7月27日 申請(qǐng)日期2002年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月31日
發(fā)明者S·班德尤帕德亞伊, B·C·帕爾, S·巴特塔查爾亞, K·C·羅伊, G·班德尤帕德亞伊 申請(qǐng)人:科學(xué)及工業(yè)研究委員會(huì)