專利名稱：預(yù)防和治療微生物介導(dǎo)的上皮紊亂的物質(zhì)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于對(duì)諸如腸源性敗血癥(gut-derived sepsis)等微生物介導(dǎo)的上皮紊亂進(jìn)行預(yù)防或治療的物質(zhì)和方法。
背景技術(shù)：
微生物介導(dǎo)的上皮紊亂，或者異常狀態(tài)，對(duì)人類和動(dòng)物的健康具有重大威脅，并對(duì)世界范圍內(nèi)的衛(wèi)生保健系統(tǒng)造成負(fù)擔(dān)。該類紊亂的一個(gè)實(shí)例是腸源性敗血癥，其是諸如人類患者等生物體由于罹患燒傷、新生兒小腸結(jié)腸炎、嚴(yán)重嗜中性白血球減少癥、炎性腸疾病、以及移植后器官排斥等多種疾病、紊亂、以及病痛等中的任一種病癥而造成死亡的一個(gè)主要原因。長(zhǎng)期以來已經(jīng)認(rèn)識(shí)到腸道囊池有可能成為諸如患有嚴(yán)重疾病的住院病人中的微生物介導(dǎo)的敗血癥的致死病灶。諸如假單胞菌(例如，綠膿桿菌)等微生物病原體具有擾亂小腸上皮屏障的調(diào)節(jié)功能的能力，這種能力可能是在能引致腸源性敗血癥的條件性生物體之中的定義性特征。在許多該類感染中，已經(jīng)鑒別出綠膿桿菌為致病性病原體。值得注意的是，已經(jīng)證實(shí)腸道為諸如綠膿桿菌等條件性病原體建群的首要位點(diǎn)。
對(duì)諸如腸源性敗血癥等微生物介導(dǎo)的上皮紊亂進(jìn)行預(yù)防和治療的常規(guī)治療方法并不完全成功?；诳股氐姆椒ǖ娜毕菰谟陔y以為小腸病原體定制抗生素而不使抗生素影響其余腸道菌群。此外，以綠膿桿菌為代表的許多小腸病原體通常對(duì)抗生素具有抗性，從而使得預(yù)防或治療該類病原體的方法具有費(fèi)用昂貴、進(jìn)行性以及不完全成功等特點(diǎn)。免疫治療方法也存在問題。特別地，諸如綠膿桿菌等許多小腸病原體具有免疫回避性，從而使得該種治療方法療效極微。
用于治療或預(yù)防諸如腸源性敗血癥等紊亂的另一種方法為腸道灌洗。在過去的幾年里，曾嘗試采用聚乙二醇(PEG)溶液來進(jìn)行腸道灌洗，并有一些軼事性報(bào)道指出，PEG在多種臨床和實(shí)驗(yàn)性環(huán)境下治療腸源性敗血癥時(shí)顯示出些許前景。這些溶液中PEG的平均分子量為3,500道爾頓，并且該溶液可以商購(例如，Golytely)。這些較低分子量(LMW)的PEG溶液在預(yù)防或治療腸源性敗血癥時(shí)表現(xiàn)出療效的機(jī)理尚不清楚。一般說來，這些溶液用于對(duì)生物體中處于可能發(fā)展為腸源性敗血癥危險(xiǎn)之中的腸道或者罹患有腸源性敗血癥的腸道進(jìn)行洗滌或沖洗。對(duì)所述腸道施用所述LMW PEG溶液可使受治療腸道的菌群組成發(fā)生不定的改變，所述改變依賴于方法中所用化合物的濃度和分子量等。例如，濃度高于約20％的PEG溶液可產(chǎn)生殺滅微生物的作用，從而會(huì)清除應(yīng)激宿主的腸道中具有潛在保護(hù)性的微生物。而且，低分子量PEG的溶液盡管保護(hù)了腸道但在削弱特定生物體的毒性時(shí)可能會(huì)失去功效。因此，現(xiàn)有技術(shù)中需要一種溶液，該溶液能夠抑制微生物的毒性表達(dá)(微生物的有害特性)，并且同時(shí)不殺滅微生物或者相鄰的微生物，從而能夠提供保持腸道微生物群落的自然生態(tài)系統(tǒng)的益處。例如，對(duì)天然菌群組成的保持將帶來其與條件性病原體的競(jìng)爭(zhēng)，如無該競(jìng)爭(zhēng)，則所述病原體會(huì)在腸道中建群。
隨著菌群組成的改變，生物體發(fā)生生理學(xué)改變。這些生理學(xué)改變可通過對(duì)諸如乳酸脫氫酶水平等許多特征性酶活性進(jìn)行檢測(cè)而得到監(jiān)控。因此，對(duì)腸道進(jìn)行LMW PEG治療將在受治療生物體的生理學(xué)方面產(chǎn)生很大的變化，并對(duì)受治療生物體的健康安寧產(chǎn)生不可預(yù)料的、由此可能有害的、長(zhǎng)期的后果。而且，該治療在如住院病人等重病生物體中會(huì)激發(fā)大量腸道排泄(massive intestinalvoiding)形式的生理需求反應(yīng)。
因此，現(xiàn)有技術(shù)中仍然需要提供一種可有效預(yù)防或治療微生物介導(dǎo)的上皮紊亂(例如，腸源性敗血癥)和/或與該類紊亂相關(guān)癥狀的組合物，以及能夠達(dá)到所述預(yù)防/治療效果的方法，所述方法應(yīng)不顯著改變受治療生物體的生理狀況，因此不會(huì)產(chǎn)生繼發(fā)的并發(fā)癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過提供一種高分子量(HMW)的聚乙二醇組合物而滿足了現(xiàn)有技術(shù)中的前述需求，所述組合物可提供對(duì)異常狀態(tài)的有效保護(hù)，所述異常狀態(tài)的特征在于，上皮表面處于可能發(fā)展為微生物介導(dǎo)的紊亂的危險(xiǎn)之中。所述異常狀態(tài)的實(shí)例包括腸源性敗血癥，以及其它由腸道病原體導(dǎo)致的與腸道菌群相關(guān)的腸內(nèi)紊亂/疾病，所述腸道病原體包括，但不限于綠膿桿菌。HMW PEG抑制或阻斷諸如綠膿桿菌等病原體與腸道上皮表面相接觸。此外，高分子量PEG還能夠抑制這些病原體(例如，綠膿桿菌)在響應(yīng)可能涉及群體感應(yīng)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的多種信號(hào)時(shí)的毒性表達(dá)。HMWPEG在腸道病原體和腸內(nèi)上皮之間的感染性界面處的阻斷能力為預(yù)防或治療腸源性敗血癥(例如在代謝應(yīng)激后)提供了一種替代方法。更重要的是，采用HMW PEG進(jìn)行治療將節(jié)省費(fèi)用，其施用方法對(duì)人類患者以及諸如有農(nóng)業(yè)價(jià)值的家畜(例如，牛、豬、山羊、綿羊、馬、雞、火雞、鴨、鵝等)、寵物、動(dòng)物園內(nèi)動(dòng)物等其它各種生物體相對(duì)簡(jiǎn)單。
本發(fā)明一方面提供了一種降低呈異常狀態(tài)的動(dòng)物的死亡率的方法，所述異常狀態(tài)包括疾病狀態(tài)，該疾病狀態(tài)包括上皮表面處于可能發(fā)展為微生物介導(dǎo)的紊亂的危險(xiǎn)之中，所述微生物介導(dǎo)的紊亂選自腸源性敗血癥、燒傷、新生兒小腸結(jié)腸炎、嚴(yán)重嗜中性白血球減少癥、毒性大腸炎、炎性腸疾病、腸病、移植排斥、慢性腸炎以及豬腹病(pig belly)等，所述方法包括給需要給藥的動(dòng)物施用有效量的聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG的平均分子量至少為5,000道爾頓。適宜的動(dòng)物包括但不限于狗、貓、綿羊、山羊、牛、豬以及人。在前述方法中，所述PEG的平均分子量?jī)?yōu)選為至少15,000道爾頓，優(yōu)選在5,000道爾頓～20,000道爾頓之間，或者在15,000道爾頓～20,000道爾頓之間。還優(yōu)選PEG的平均分子量為6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000以及25,000道爾頓。另外，所述PEG可以為包含5％-20％PEG的水溶液，優(yōu)選為包含10％-20％PEG(例如，10％PEG)的水溶液。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述狀態(tài)與腸中綠膿桿菌生物體的存在相關(guān)，并且這種綠膿桿菌的細(xì)胞膜完整性并未發(fā)生可檢測(cè)的改變。在該方法的另一實(shí)施方案中，所述綠膿桿菌的生長(zhǎng)模式未發(fā)生可檢測(cè)的改變。
本發(fā)明另一方面涉及抑制腸源性敗血癥的方法，所述方法包括使哺乳動(dòng)物的上皮例如腸，與聚乙二醇(PEG)相接觸，其中所述PEG的平均分子量至少為5,000道爾頓，優(yōu)選至少為15,000道爾頓。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物的腸與所述PEG相接觸至少30分鐘。
本發(fā)明進(jìn)一步包括對(duì)諸如腸道病原體等上皮細(xì)胞病原體中的PA-I凝集素/粘附素的表達(dá)進(jìn)行抑制的方法，所述方法包括給需要給藥的動(dòng)物施用有效量的聚乙二醇；對(duì)PA-I凝集素/粘附素的上皮誘導(dǎo)(例如，腸道上皮誘導(dǎo))活化進(jìn)行抑制的方法，該方法包括給需要給藥的動(dòng)物施用有效量的聚乙二醇；對(duì)上皮細(xì)胞病原體(例如，腸道病原體)的由C4-HSL誘導(dǎo)的形態(tài)變化進(jìn)行抑制的方法，該方法包括給需要給藥的動(dòng)物施用有效量的聚乙二醇；減少上皮細(xì)胞病原體(例如，腸道病原體)中的毒性表達(dá)的方法，該方法包括給需要給藥的動(dòng)物施用有效量的聚乙二醇；減少或防止上皮表面與微生物毒性因子相互作用的方法，該方法包括給需要給藥的動(dòng)物施用有效量的聚乙二醇；通過防止致病性群體感應(yīng)活化的形成來改善上皮(例如，腸道)發(fā)病機(jī)理的方法，該方法包括給需要給藥的動(dòng)物施用有效量的聚乙二醇；以及對(duì)脊椎動(dòng)物的上皮(例如，腸道上皮)和諸如假單胞菌(例如，綠膿桿菌)等細(xì)菌之間的相互作用進(jìn)行抑制的方法，該方法包括使上皮與聚乙二醇相接觸。在本發(fā)明的所有這些方面中，所述PEG的平均分子量至少為5,000道爾頓，優(yōu)選至少15,000道爾頓。
本發(fā)明另一方面提供了對(duì)諸如腸道上皮層等哺乳動(dòng)物上皮層的由綠膿桿菌誘導(dǎo)的跨上皮電阻降低進(jìn)行抑制的方法，該方法包括使(腸道)上皮層與聚乙二醇相接觸，其中所述PEG的平均分子量至少為5,000道爾頓，優(yōu)選至少15,000道爾頓。PEG優(yōu)選具有15,000道爾頓～20,000道爾頓的平均分子量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物(諸如綠膿桿菌)膜的完整性未發(fā)生可檢測(cè)的變化。
本發(fā)明又一方面提供了抑制細(xì)菌細(xì)胞粘附于諸如哺乳動(dòng)物的腸等哺乳動(dòng)物的上皮的方法，所述方法包括使所述腸與聚乙二醇相接觸，其中所述PEG的平均分子量至少為5,000道爾頓，優(yōu)選至少15,000道爾頓。采用該方法時(shí)，還優(yōu)選PEG的平均分子量為15,000道爾頓～20,000道爾頓。所述PEG可以為包含5％-20％PEG的水溶液，優(yōu)選為包含5％～10％PEG的水溶液。以本方法對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的粘附進(jìn)行抑制時(shí)，預(yù)期可抑制的示例性細(xì)菌細(xì)胞是假單胞菌，例如綠膿桿菌。
本發(fā)明另一方面涉及減少細(xì)菌細(xì)胞中PA-I凝集素/粘附素的表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)菌細(xì)胞與聚乙二醇相接觸，其中所述PEG的平均分子量至少為5,000道爾頓，優(yōu)選至少15,000道爾頓，還優(yōu)選PEG的平均分子量為15,000道爾頓～20,000道爾頓。所述PEG可以為包含5％-20％PEG的水溶液，優(yōu)選為包含5％～10％PEG的水溶液。
本發(fā)明另一方面提供了一種降低患有微生物介導(dǎo)的上皮紊亂的動(dòng)物的死亡率的方法，所述微生物介導(dǎo)的上皮紊亂選自腸源性敗血癥、燒傷、新生兒小腸結(jié)腸炎(NEC)、嚴(yán)重嗜中性白血球減少癥、毒性大腸炎、炎性腸疾病、腸病(例如，在重病患者中)、移植排斥、慢性腸炎以及豬腹病等，所述方法包括施用有效量的化合物(例如，PEG)，該化合物能夠粘附于選自哺乳動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞和腸道細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞，其中所述化合物以形態(tài)不對(duì)稱(topographically asymmetrical)的方式粘附于細(xì)胞，從而抑制哺乳動(dòng)物的腸道上皮細(xì)胞與細(xì)菌細(xì)胞之間的相互作用。優(yōu)選的化合物為表面活性劑。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物為PEG，優(yōu)選該P(yáng)EG具有至少15,000道爾頓的平均分子量。在該方法的另一實(shí)施方案中，通過原子力顯微鏡來確定所述抑制作用。在該方法的另一實(shí)施方案中，所述細(xì)菌細(xì)胞為腸道病原體，并且其生長(zhǎng)特性未發(fā)生可檢測(cè)的變化。在相關(guān)方面，該方法進(jìn)一步包括向該動(dòng)物的腸道中引入有效量的右旋糖苷和/或引入有效量的L-谷氨酰胺、右旋糖苷包衣的L-谷氨酰胺、右旋糖苷包衣的菊粉、右旋糖苷包衣的丁酸、一種或多種果糖-低聚糖、N-乙酰基-D-半乳糖胺、右旋糖苷包衣的甘露糖和半乳糖、乳果糖、以及現(xiàn)有技術(shù)已知的平衡緩沖液和穩(wěn)定劑。當(dāng)以單一組合物一同施用時(shí)，施用這種多成分的單一溶液將處理該腸道，并使該腸道作好對(duì)預(yù)期將要發(fā)生的腸道菌群和腸的屏障功能受破壞的準(zhǔn)備，所述腸道菌群和腸道屏障功能受破壞是例如在嚴(yán)重分解代謝型應(yīng)激、外科手術(shù)型應(yīng)激以及創(chuàng)傷型應(yīng)激后發(fā)生的情況。
本發(fā)明另一方面涉及一種改善以下所述癥狀的方法，所述癥狀是與由上皮的異常狀態(tài)所引起或以上皮的異常狀態(tài)為特征的任何疾病或病癥有關(guān)的癥狀，諸如腸源性敗血癥，所述方法包括給腸道施用聚乙二醇，其中所述PEG的平均分子量至少為5,000道爾頓，優(yōu)選至少15,000道爾頓，還優(yōu)選PEG的平均分子量為15,000道爾頓～20,000道爾頓。所述PEG可以為包含5％-20％PEG的水溶液，優(yōu)選為包含5％～10％PEG的水溶液。本發(fā)明包括改善與本文公開的任何疾病或病癥相關(guān)的癥狀的方法。
本發(fā)明又一方面涉及一種預(yù)防呈異常狀態(tài)的動(dòng)物喪失產(chǎn)乳能力的方法，所述異常狀態(tài)為乳腺上皮表面處于可能發(fā)展為微生物介導(dǎo)的紊亂的危險(xiǎn)之中，該紊亂影響產(chǎn)奶量，所述方法包括給乳腺上皮表面(例如局部)施用有效量的至少5,000道爾頓、優(yōu)選至少15,000道爾頓的聚乙二醇。動(dòng)物的實(shí)例包括諸如綿羊、山羊、母牛、豬、馬以及人等哺乳動(dòng)物。在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了一種對(duì)動(dòng)物產(chǎn)乳能力的喪失進(jìn)行治療的方法，所述產(chǎn)乳能力的喪失以乳腺上皮表面發(fā)生微生物介導(dǎo)的紊亂而影響產(chǎn)奶量為特征，所述方法包括對(duì)乳腺(例如局部)施用有效量的至少5,000道爾頓、優(yōu)選至少15,000道爾頓的聚乙二醇。在另一相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了一種預(yù)防微生物介導(dǎo)的上皮紊亂在喂乳期動(dòng)物中發(fā)展的方法，所述方法包括給該動(dòng)物施用有效量的至少5,000道爾頓、優(yōu)選至少15,000道爾頓的聚乙二醇。適宜的動(dòng)物包括諸如人、家畜、家養(yǎng)寵物以及動(dòng)物園動(dòng)物等哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，將PEG與本領(lǐng)域公知的任意嬰兒配方奶粉相混合。
本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)方面是包含嬰兒配方奶粉和聚乙二醇(PEG)的組合物，其中所述PEG的平均分子量至少為5,000道爾頓。此外，可使用本領(lǐng)域公知的任何嬰兒配方奶粉，包括基于諸如牛奶、山羊奶等哺乳動(dòng)物奶的配方奶粉，也包括基于豆奶的配方奶粉。所述配方奶粉可以富含任意的維生素和/或元素，包括以鐵強(qiáng)化的配方奶粉。PEG的平均分子量?jī)?yōu)選為至少15000道爾頓，其與嬰兒或兒童配方奶粉重新配合或水合時(shí)優(yōu)選以5％～20％的范圍存在。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種為動(dòng)物、優(yōu)選為喂乳期動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)的方法，所述方法包括給動(dòng)物施用有效量的包含嬰兒配方奶粉和PEG的組合物。
本發(fā)明的另一方面提供了一種藥物組合物，所述組合物包含平均分子量為至少5000道爾頓、優(yōu)選為至少15000道爾頓的聚乙二醇以及適宜的佐劑、載體或者稀釋劑。在一個(gè)相關(guān)方面中，所述組合物進(jìn)一步包含選自下述物質(zhì)的化合物右旋糖苷包衣的L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的菊粉、右旋糖苷包衣的丁酸、一種或多種果糖-低聚糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、右旋糖苷包衣的甘露糖和半乳糖、乳果糖以及現(xiàn)有技術(shù)已知的平衡緩沖液和穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的另一方面提供了一種試劑盒，所述試劑盒用于對(duì)異常狀態(tài)進(jìn)行治療或預(yù)防，所述異常狀態(tài)的特征在于，上皮表面處于可能發(fā)展為諸如腸源性敗血癥等微生物介導(dǎo)的紊亂的危險(xiǎn)之中，所述試劑盒包括上述的藥物組合物之一，以及描述所述組合物在治療或預(yù)防所述異常狀態(tài)時(shí)的用法的方案。試劑盒中適宜包括的方案可描述本文公開的任何一種治療或預(yù)防方法。
本發(fā)明另一方面描述了對(duì)異常狀態(tài)以及疾病進(jìn)行預(yù)防的方法，所述異常狀態(tài)以及疾病的特征在于，上皮表面處于可能發(fā)展為微生物介導(dǎo)的紊亂的危險(xiǎn)之中。例如，本發(fā)明包括對(duì)疾病或異常狀態(tài)進(jìn)行預(yù)防的方法，該方法包括給動(dòng)物施用一種組合物，所述組合物包括有效量的聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG具有至少5000道爾頓的平均分子量。適用于本發(fā)明的預(yù)防方法的疾病或者異常狀態(tài)選自游泳耳、急性中耳炎、慢性中耳炎、呼吸器相關(guān)性肺炎、腸源性敗血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎、抗生素誘導(dǎo)的腹瀉、假膜性結(jié)腸炎、炎性腸疾病、過敏性腸疾病、嗜中性小腸結(jié)腸炎、胰腺炎、慢性疲勞綜合癥、菌群失調(diào)綜合癥、微小結(jié)腸炎、慢性尿道感染、性傳播疾病以及感染等。適合作為該類預(yù)防方法對(duì)象的動(dòng)物選自狗、貓、綿羊、山羊、牛、豬、雞、馬以及人。PEG的平均分子量?jī)?yōu)選為至少15000道爾頓；還優(yōu)選PEG的平均分子量介于15,000道爾頓～20,000道爾頓之間。而且，所述PEG可以為包含10％-20％PEG的水溶液，優(yōu)選為包含10％PEG的水溶液。待施用的組合物可以進(jìn)一步包含賦形劑，所述賦形劑選自液態(tài)溶液、局部用凝膠以及適于噴霧的溶液。另外，所述組合物可以進(jìn)一步包含選自下述物質(zhì)的化合物右旋糖苷包衣的L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的菊粉、右旋糖苷包衣的丁酸、果糖-低聚糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、右旋糖苷包衣的甘露糖、半乳糖以及乳果糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含PEG、右旋糖苷包衣的L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的菊粉、右旋糖苷包衣的丁酸、果糖-低聚糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、右旋糖苷包衣的甘露糖、半乳糖以及乳果糖。
本發(fā)明另一方面公開了一種預(yù)防皮膚感染的方法，所述方法包括將一種組合物施用至動(dòng)物的步驟，所述組合物包含有效量的聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG的平均分子量至少為5000道爾頓。所述組合物可以進(jìn)一步包含選自下述物質(zhì)的賦形劑軟膏、霜?jiǎng)⒛z以及洗液。本發(fā)明中預(yù)計(jì)的導(dǎo)致感染的作用物可以選自炭疽桿菌、天花病毒、致腸病性大腸桿菌(EPEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸集聚性大腸桿菌(EAEC)、艱難梭菌、輪狀病毒、綠膿桿菌、粘質(zhì)沙雷氏桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、陰溝腸桿菌(Enterobacteria cloacae)、白色念珠菌以及光滑假絲酵母(Candida globrata)等。
本發(fā)明另一方面涉及預(yù)防呼吸性傳染的方法，所述方法包括對(duì)動(dòng)物施用有效量的聚乙二醇(PEG)的步驟，其中所述PEG的平均分子量至少為5000道爾頓。本發(fā)明預(yù)防方法適用的呼吸性傳染可由傳染物通過本領(lǐng)域公知的任意途徑所引起，其包括呼吸器相關(guān)性肺炎、空氣傳播的傳染物、通過諸如噴嚏等散布在霧化液體中的傳染物等。在一些實(shí)施方案中，所述方法可預(yù)防由選自炭疽桿菌和天花病毒的作用物導(dǎo)致的呼吸性傳染。
本發(fā)明另一方面提供了一種對(duì)尿道的至少一部分進(jìn)行沖洗來預(yù)防慢性尿道感染的方法，所述方法包括將有效量的包含PEG的組合物輸送至尿道的步驟，其中所述PEG的平均分子量至少為5000道爾頓。在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述組合物施用于尿道中至少包括膀胱的一部分。
本發(fā)明又一方面提供了一種預(yù)防性傳播疾病的方法，所述方法包括在避孕套上施用聚乙二醇(PEG)的步驟，其中所述PEG的平均分子量至少為5000道爾頓。本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)方面涉及一種避孕套，所述避孕套至少包括局部的PEG涂層，所述PEG的平均分子量至少為5000道爾頓。本發(fā)明的另一相關(guān)方面涉及一種試劑盒，所述試劑盒包括避孕套和平均分子量至少為5000道爾頓的聚乙二醇(PEG)。
本發(fā)明還包括一種預(yù)防消化道紊亂的方法，所述方法包括對(duì)需要給藥的動(dòng)物施用有效量的組合物，所述組合物包含聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG的平均分子量至少為5000道爾頓。本發(fā)明的預(yù)防方法適用的消化道疾病的實(shí)例選自新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、抗生素誘導(dǎo)的腹瀉、假膜性結(jié)腸炎、炎性腸疾病、過敏性腸疾病、嗜中性小腸結(jié)腸炎、胰腺炎、菌群失調(diào)綜合癥以及微小結(jié)腸炎等。
本發(fā)明另一方面涉及對(duì)向需要給藥的動(dòng)物施用聚乙二醇(PEG)進(jìn)行監(jiān)測(cè)的方法，所述方法包括給需要給藥的動(dòng)物施用有效量的包含帶標(biāo)記的PEG的組合物，其中所述PEG的平均分子量至少為5000道爾頓，然后檢測(cè)所述帶標(biāo)記的PEG，由此，所述帶標(biāo)記的PEG的量和/或位置(例如，與微生物相連)為施用效能的評(píng)估提供了有用的信息。在該監(jiān)測(cè)方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述標(biāo)記為一熒光團(tuán)(例如，熒光素、羅丹明、Cy3、Cy5)。在該方法的另一實(shí)施方案中，檢測(cè)帶標(biāo)記的PEG包括內(nèi)窺鏡檢測(cè)。所述監(jiān)測(cè)方法還包括檢測(cè)大便樣品中的帶標(biāo)記的PEG(即，與諸如微生物等成分相連的帶標(biāo)記的PEG，其來源為大便樣品)。此外，所述監(jiān)測(cè)方法可以進(jìn)一步包括施用微生物特異性的第二標(biāo)記物，并對(duì)第二標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。本文所用的“特異性”指的是，該標(biāo)記物與至少一種微生物具有可檢測(cè)的相關(guān)性。
本發(fā)明另一方面涉及對(duì)向需要給藥的動(dòng)物施用聚乙二醇(PEG)進(jìn)行監(jiān)測(cè)的以下方法，所述方法包括從被施用了平均分子量至少為5000道爾頓的聚乙二醇的動(dòng)物中獲得樣品，使該樣品與上皮細(xì)胞相接觸，然后測(cè)定樣品中的微生物對(duì)上皮細(xì)胞的粘附，由此，PEG的量和/或位置為施用效能的評(píng)估提供了有用的信息。所述測(cè)定可通過顯微鏡檢查來完成。
本發(fā)明的另一監(jiān)測(cè)方法為對(duì)向需要給藥的動(dòng)物施用聚乙二醇(PEG)進(jìn)行監(jiān)測(cè)的以下方法，所述方法包括從被施用了平均分子量至少為5000道爾頓的聚乙二醇的動(dòng)物中獲得樣品，使該樣品與上皮細(xì)胞層相接觸，然后測(cè)定所述上皮層的跨上皮電阻，由此，通過跨上皮電阻相對(duì)對(duì)照值的降低程度來指示有效施用。所述對(duì)照值可為內(nèi)源性的(即，在施用PEG之前測(cè)量TEER)，或者為外源性的(即，其它研究中得到的可用于比較的可靠數(shù)值)。
本發(fā)明的另一監(jiān)測(cè)方法是對(duì)向需要給藥的動(dòng)物施用聚乙二醇(PEG)進(jìn)行監(jiān)測(cè)的方法，所述方法包括從被施用了平均分子量至少為5000道爾頓的聚乙二醇的動(dòng)物中獲得樣品，從該樣品中分離微生物，然后測(cè)量所述微生物的細(xì)胞表面的疏水性，由此，該樣品中任意微生物的疏水性為施用效能的評(píng)估提供了有用的信息。本文所述“分離”指的是與樣品的其它成分(例如，固態(tài)物質(zhì))相分離，從而足以進(jìn)行疏水性檢測(cè)，如本領(lǐng)域所公知的那樣。
本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)方面是提供一種試劑盒，該試劑盒用于對(duì)聚乙二醇的施用進(jìn)行監(jiān)測(cè)，所述試劑盒包括帶標(biāo)記的PEG以及一份方案，所述方案描述了帶標(biāo)記的PEG在監(jiān)測(cè)PEG施用時(shí)的用法。適宜的方案包括本文公開的或者本領(lǐng)域公知的涉及PEG的施用、遞藥或者涂布的任何方法。在本發(fā)明這一方面涉及的一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還進(jìn)一步包括游離的標(biāo)記物。
本發(fā)明的另一監(jiān)測(cè)方法是對(duì)向需要給藥的動(dòng)物施用聚乙二醇(PEG)進(jìn)行監(jiān)測(cè)的以下方法，所述方法包括從被施用了平均分子量至少為5000道爾頓的聚乙二醇的動(dòng)物中獲得樣品，檢測(cè)該樣品中的PA-I凝集素/粘附素的活性，由此，PA-I凝集素/粘附素的活性為施用效能的評(píng)估提供了有用的信息。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，通過將所述PA-I凝集素/粘附素與PA-I凝集素/粘附素的結(jié)合伴侶(binding partner)相結(jié)合而對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，所述結(jié)合伴侶是例如特異性對(duì)抗-PA-I凝集素/粘附素的抗體的任意已知形式或者與凝集素/粘附素特異性結(jié)合的碳水化合物等。本發(fā)明的相關(guān)方面是一種試劑盒，所述試劑盒用于對(duì)聚乙二醇(PEG)的施用進(jìn)行監(jiān)測(cè)，該試劑盒包括PA-I凝集素/粘附素的結(jié)合伴侶以及一份方案，所述方案描述了結(jié)合伴侶在檢測(cè)樣品中的PA-I凝集素/粘附素時(shí)的用法。適宜的方案包括本文所公開的或者本領(lǐng)域公知的與使用PEG相關(guān)的任意方法。
通過下述詳細(xì)描述并結(jié)合附圖以及實(shí)施例將更好地理解本發(fā)明的其它特點(diǎn)以及優(yōu)點(diǎn)。


圖1為將綠膿桿菌PA27853直接注射至經(jīng)歷假剖腹手術(shù)或30％外科肝切除手術(shù)后的小鼠的盲腸內(nèi)直至48小時(shí)的死亡率。在小鼠經(jīng)歷30％不流血左側(cè)肝切除手術(shù)后，立即直接盲腸注射1×107cfu/ml的PA27853。每組有7只小鼠。對(duì)照組小鼠接受假剖腹手術(shù)，然后向盲腸中注射等量的PA27853。對(duì)于PEG組的小鼠，在盲腸注射前，將1×107cfu/ml的PA27853懸浮于PEG 3.35(LMWPEG 3,350)或PEG 15-20(HMW PEG 15,000道爾頓～20,000道爾頓)中。在b圖中觀察到了PEG15-20的劑量反應(yīng)曲線。a.采用精確概率法檢驗(yàn)(Fisher ExactTest)確定了PEG15-20的保護(hù)作用的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.001)。b.確定了PEG15-20的最低保護(hù)濃度為5％(P＜0.05)。c.進(jìn)行30％外科肝切除手術(shù)并直接盲腸注射1×107cfu/ml的PA27853，24小時(shí)后盲腸內(nèi)含物(糞便)、洗滌后的盲腸粘膜、肝臟以及血液的定量細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果。單因素ANOVA檢測(cè)結(jié)果顯示，肝切除手術(shù)后小鼠的盲腸內(nèi)含物、盲腸粘膜、肝臟以及血液中的細(xì)菌數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性增加(P＜0.001)。對(duì)于PEG 3350，觀察到肝臟和血液中的細(xì)菌數(shù)有顯著性降低(P＜0.05)，而PEG15-20完全抑制了PA27853在小鼠肝臟和血液中的擴(kuò)散。
圖2顯示了PEG15-20對(duì)PA27853誘導(dǎo)的上皮屏障功能障礙的保護(hù)作用，該保護(hù)作用是通過跨上皮電阻(TEER)來評(píng)估的。a.圖中的數(shù)據(jù)表示，在三份平行培養(yǎng)物(n＝7)頂端(apical)與1×107cfu/ml的PA27853接觸8小時(shí)期間，觀察到的從其基線開始的TEER最大下降的平均值±SEM％。證實(shí)了與PA27853接觸的Caco-2細(xì)胞中的TEER下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(單因素ANOVA(P＜0.001))。證實(shí)PEG 15-20對(duì)PA27853誘導(dǎo)的TEER下降的保護(hù)作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.001)。b.在PEG 3.35存在下頂端與PA27853接觸的Caco-2細(xì)胞的圖像。該圖像采集自共培養(yǎng)4小時(shí)后，其顯示在細(xì)胞骨架上30微米～40微米處漂浮的細(xì)胞喪失了單層完整性，所述細(xì)胞支架顯示了PA27853對(duì)細(xì)胞膜的粘附。c.在PEG 15-20存在下頂端與PA27853接觸4小時(shí)后的Caco-2細(xì)胞，在任何檢查平面均無漂浮細(xì)胞的跡象。
圖3顯示了PEG對(duì)PA27853中PA-I的表達(dá)的抑制作用。a.蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)分析。將PA27853與1mM的群體感應(yīng)信號(hào)分子C4-HSL相接觸，結(jié)果PA-I蛋白的表達(dá)中產(chǎn)生了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性增加(單因素ANOVA，P＜0.001)，所述PA-I蛋白的表達(dá)在10％的PEG3.35存在下受到部分抑制，而且在10％的PEG15-20存在下受到強(qiáng)得多的抑制作用。a’.PEG15-20對(duì)C4-HSL誘導(dǎo)的PA-I表達(dá)的最小抑制濃度為5％(P＜0.01)。b.在有或無PEG存在下，與C4-HSL相接觸的單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的電鏡圖，該圖顯示C4-HSL引起了綠膿桿菌在外形以及菌毛表達(dá)上的形態(tài)學(xué)變化。在PEG 15-20存在下，完全消除了C4-HSL誘導(dǎo)的形態(tài)效應(yīng)，但是PEG 3.35無此效果。與PEG 15-20相接觸的PA27853的周圍可以看到光暈式效應(yīng)(halo-type effect)。c.Northern雜交。使PA27853與0.1mM的C4-HSL相接觸，結(jié)果PA-I mRNA表達(dá)產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性增加(單因素ANOVA，P＜0.001)，但是10％PEG 15-20顯著抑制了該增加。d.在PEG15-20存在下，與Caco-2細(xì)胞接觸4小時(shí)所誘導(dǎo)的PA-I mRNA的增加被抑制，但是PEG3.35并無此作用(單因素ANOVA，P＜0.001)。
圖4顯示了PEG溶液對(duì)干旱生長(zhǎng)模式的PA27853的細(xì)菌膜完整性的影響。a.利用含有SYTO 9和碘化丙錠的染色方法來評(píng)估兩種PEG溶液對(duì)細(xì)菌膜完整性的影響。兩種PEG溶液對(duì)細(xì)菌膜滲透性都沒有任何影響。b.兩種PEG溶液中所顯示的PA27853生長(zhǎng)模式與不含PEG的TSB培養(yǎng)基(對(duì)照組)完全相同。
圖5顯示了與PEG接觸的Caco-2細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞的原子力顯微鏡(AFM)圖像。a-c.在培養(yǎng)基單獨(dú)存在下(a)、培養(yǎng)基和PEG3.35存在下(b)、以及培養(yǎng)基和PEG15-20存在下Caco-2的AFM圖像。觀察到PEG3.35在Caco-2細(xì)胞上形成了平滑的毯狀物(b)，而PEG 15-20形成了形態(tài)更為清晰的覆蓋物(c)。d-f.在PEG 3.35和PEG 15-20存在下PA27853的AFM圖像。PEG 3.35在單個(gè)的細(xì)菌細(xì)胞周圍形成光滑的被膜(e)，而PEG15-20不僅緊密抱住單個(gè)細(xì)胞(f)，而且增加了聚合物/細(xì)菌的直徑(g，h)，從而隔開了單個(gè)細(xì)菌彼此之間的距離。
圖6顯示了PEG溶液對(duì)PA27853的分散/聚集模式的影響。利用Axiovert100TV熒光倒置顯微鏡，采用DIC和GFP作為熒光濾光片，所用物鏡放大率為63×，在此條件下可以直接觀察dTC3培養(yǎng)皿中細(xì)菌細(xì)胞的分散模式。利用Bioptechs恒溫控制系統(tǒng)來調(diào)節(jié)溫度。利用鎢燈(100V)來激發(fā)DIC和GFP。利用intelligent Imaging Innovations的3D成像軟件(Slidebook)使用GFP濾光片對(duì)在Z平面的細(xì)菌細(xì)胞分散模式進(jìn)行成像。在DIC圖像(6a1)和Z平面重新構(gòu)建(6a2)中觀察到綠膿桿菌細(xì)胞均勻分散浮游在沒有Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)基中。在Caco-2細(xì)胞存在的情況下，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)展成凝集的外觀(6b1)并觀察到其與Caco-2細(xì)胞相粘附(6b2)。10％PEG 3350降低了細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性，并誘導(dǎo)粘附于孔底(6c2)的蘑菇狀的細(xì)菌微菌落的即時(shí)生成(6c1)。在Caco-2細(xì)胞存在下，細(xì)菌微菌落位于上皮細(xì)胞平面上方約8微米處(6d1，2)。10％的PEG 15-20顯著降低了綠膿桿菌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性。但是，在含有PEG 15-20的培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育的最初0.5-1小時(shí)中，細(xì)菌細(xì)胞形成接近于孔底的蛛狀微菌落(6e1，2)。在幾小時(shí)內(nèi)，蛛腿狀的微菌落占據(jù)了培養(yǎng)基的全部空間/體積(未顯示)。在Caco-2細(xì)胞存在下，綠膿桿菌細(xì)胞喪失了蛛樣構(gòu)型，觀察到其升高至上皮平面上方(30-40微米)(6f1，2)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明為治療和/或預(yù)防多種微生物介導(dǎo)的上皮紊亂提供了簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的產(chǎn)品和方法，其中所述微生物介導(dǎo)的上皮紊亂為困擾包括人的許多哺乳動(dòng)物的異常狀態(tài)和疾病。通過給需要給藥(包括處在危險(xiǎn)中)的動(dòng)物施用諸如HMW聚乙二醇等高分子量極性聚合物，可利用最小花費(fèi)和最少的從業(yè)者培訓(xùn)對(duì)許多威脅健康或生命的異常狀態(tài)，即，包括腸源性敗血癥等的上皮紊亂和疾病進(jìn)行治療。不希望束縛于任何理論，本發(fā)明所提供的益處與下述原則相一致，即，可通過促進(jìn)一種有益于該類微生物存活的環(huán)境來成功預(yù)防、改善或治療這種微生物介導(dǎo)的上皮紊亂。首先明確本文中所用的下述術(shù)語的含義將有利于理解本發(fā)明下述的詳細(xì)描述。
“異常狀態(tài)”具有寬泛的定義，其包括哺乳動(dòng)物的以上皮表面處于可能發(fā)展為微生物介導(dǎo)的紊亂的危險(xiǎn)之中為特征的疾病、紊亂以及哺乳動(dòng)物健康的任何異常狀態(tài)。以上皮表面處于發(fā)展為微生物介導(dǎo)的紊亂的危險(xiǎn)之中為特征的異常狀態(tài)包括上皮表面已經(jīng)發(fā)展為微生物介導(dǎo)的紊亂時(shí)的狀態(tài)。所述狀態(tài)的實(shí)例包括需要醫(yī)療介入或者由于醫(yī)療介入導(dǎo)致的人類疾病以及人類的紊亂，諸如燒傷、新生兒小腸結(jié)腸炎、嚴(yán)重的嗜中性白血球減少癥、炎性腸疾病、腸病(例如，重病患者的腸病)、以及移植(例如，器官)排斥等。
“燒傷”指的是由于哺乳動(dòng)物的組織與諸如明火、蒸汽、熱流體以及熱表面等形式的熱源相接觸而對(duì)該組織造成的損傷。
“嚴(yán)重的”嗜中性白血球減少癥一詞取其常規(guī)慣用含義，即，循環(huán)嗜中性白細(xì)胞的數(shù)目顯著減少。
“移植排斥”指的是移植物(例如，器官)被視為與宿主生物體對(duì)該移植物的最終排斥相關(guān)的任何發(fā)展。
“施用”這一詞取其常規(guī)慣用含義，即，采用本領(lǐng)域公認(rèn)的任何適宜的手段進(jìn)行給藥。施用形式的實(shí)例包括口腔給藥、肛門給藥、直接穿刺或注射、局部施用、以及噴射(例如，霧化噴射)、還有針對(duì)眼、耳、鼻、口、肛門或尿道口的凝膠施用或液體施用等。
“有效量”指的是一種物質(zhì)能為接受該劑量的生物體提供有益效果的用量，該用量可根據(jù)施用所述劑量的目的、接受該劑量的生物體的大小和狀態(tài)、以及本領(lǐng)域公知的與確定有效劑量相關(guān)的其它變量而變化。確定有效劑量的方法包括本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)優(yōu)化步驟。
“動(dòng)物”這一詞取其常規(guī)含義，即，非植物、非原生生物的活生物體。優(yōu)選的動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，例如人。
在本發(fā)明公開的內(nèi)容中，“需要(給藥)的”指的是，生物體、器官、組織或細(xì)胞的一種狀態(tài)，該狀態(tài)可通過對(duì)具有這種狀態(tài)特征的生物體施用有效劑量而獲得益處。例如，可能發(fā)展為腸源性敗血癥的高危人群或具有腸源性敗血癥癥狀的人類，即是需要有效劑量的諸如本發(fā)明的藥物組合物等產(chǎn)品的生物體。
“平均分子量”這一詞取其常規(guī)慣用含義，即，組合物的成分(例如，分子)的分子量的算術(shù)平均值，無論該平均值的測(cè)定方法的精確度如何。例如，平均分子量為3.5千道爾頓的聚乙二醇或者說PEG可以含有多種分子量的PEG分子，只要以某種程度的精確度確定這些分子量的算術(shù)平均值為3.5千道爾頓即可，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，這可能反映的是算術(shù)平均值的估算。類似地，PEG15-20指的是分子量的算術(shù)平均值介于15千道爾頓～20千道爾頓之間的PEG，所述算術(shù)平均值遵從上述的特殊聲明。這些PEG分子包括但不限于簡(jiǎn)單的PEG聚合物。例如，多個(gè)相對(duì)較小的PEG分子(例如，7000道爾頓～10000道爾頓)可以任選與諸如苯酚等連接分子一起結(jié)合成具有更高平均分子量(例如，15000道爾頓～20000道爾頓)的單分子。
“細(xì)胞膜完整性”指的是，作為活細(xì)胞的功能性成分的細(xì)胞膜相比較而言在功能上沒有發(fā)生顯著改性，這一含義與本領(lǐng)域所理解的一致。
“可檢測(cè)的改變”這一術(shù)語取其常規(guī)慣用含義，即，采用所處環(huán)境下適宜的檢測(cè)手段可以感知的改變，這一含義與本領(lǐng)域所理解的一致。
“生長(zhǎng)模式”籠統(tǒng)地指單個(gè)細(xì)胞或者細(xì)胞組(例如，細(xì)胞群)的性質(zhì)的值，這些性質(zhì)是本領(lǐng)域公認(rèn)作為表征細(xì)胞生長(zhǎng)的性質(zhì)，例如細(xì)胞的傳代或者倍增時(shí)間、新生細(xì)胞組的形態(tài)的外觀以及本領(lǐng)域所公認(rèn)的有助于理解細(xì)胞或者細(xì)胞組的生長(zhǎng)模式的其它變量。
“抑制”這一術(shù)語取其常規(guī)慣用含義，即，利用降低或者阻止來進(jìn)行約束。例如，對(duì)形態(tài)變化的抑制指的是，使形態(tài)變化難于進(jìn)行或者完全阻止了形態(tài)變化。
“PA-I，或PA-I凝集素/粘附素表達(dá)”指的是PA-I凝集素/粘附素的活性特征的產(chǎn)生或者發(fā)生。通常，PA-I凝集素/粘附素表達(dá)涉及PA-I凝集素/粘附素編碼mRNA的翻譯以生成具有至少一個(gè)PA-I凝集素/粘附素活性特征的PA-I凝集素/粘附素多肽。作為選擇，PA-I凝集素/粘附素進(jìn)一步包括PA-I凝集素/粘附素編碼DNA用以產(chǎn)生前述mRNA的轉(zhuǎn)錄。
“上皮誘導(dǎo)活化”指的是通過上皮細(xì)胞的直接或間接影響而增加給定目標(biāo)物(例如，PA-I凝集素/粘附素)的活性。在本發(fā)明的說明書中，例如，PA-I凝集素/粘附素的由上皮誘導(dǎo)的活化指的是由于上皮的間接影響增加了所述多肽的活性，這種間接影響是通過一個(gè)或多個(gè)上皮細(xì)胞與腸道病原體的直接接觸而顯現(xiàn)的。
“形態(tài)改變”這一術(shù)語取其常規(guī)慣用含義，即，形態(tài)上的改變。
“腸道病原體”指的是能夠在諸如人等動(dòng)物中引起全身性的或局部的腸源性敗血癥的病原微生物。這一定義包括本領(lǐng)域公知的腸道病原體，包括諸如假單胞菌(例如，綠膿桿菌)等革蘭氏陰性細(xì)菌。
“改善”指的是降低程度或者嚴(yán)重性，與其常規(guī)慣用含義相一致。
“致病群體”指的是病原生物體(例如，綠膿桿菌)的聚集或者聯(lián)合且其數(shù)量足以引發(fā)或保持群體感應(yīng)信號(hào)，這一含義與本領(lǐng)域所公知的一致。
“相互作用”這一術(shù)語取其常規(guī)慣用含義，即指相互影響，例如在諸如分子、細(xì)胞等兩個(gè)或多個(gè)生物物質(zhì)之間的相互影響。
“跨上皮電阻”，或者“TEER”這一措詞取其在本領(lǐng)域中已獲得的含義，其指的是測(cè)定橫跨上皮組織的電阻，其非排他性地用于對(duì)上皮組織中的上皮細(xì)胞間的緊密接合的狀況進(jìn)行評(píng)定。
“粘附”這一術(shù)語取其常規(guī)慣用含義，即，指的是持續(xù)時(shí)間比瞬變周期的時(shí)間更長(zhǎng)的物理結(jié)合。
“形態(tài)不對(duì)稱性”指的是不對(duì)稱的三維物體(例如，細(xì)胞)表面的圖像、地圖或其它表示法。
“原子力顯微鏡”亦稱作掃描力顯微鏡，其是一種獲得物質(zhì)的高分辨率形態(tài)圖的技術(shù)，其在光柵掃描上具有橫跨樣品表面的懸臂探針，并使用高敏感性的用于檢測(cè)探針的偏轉(zhuǎn)的裝置，這一含義與本領(lǐng)域理解的一致。
“藥物組合物”是一種適于治療性地施用至諸如人類患者等活體動(dòng)物中的化合物制劑。本發(fā)明優(yōu)選的藥物組合物包括在粘度、電解特性以及重量克分子滲透壓濃度上取得平衡的溶液，其包含電解液、右旋糖苷包衣的L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的菊粉、乳果糖、D-半乳糖、N-乙酰-D-半乳糖胺以及5-20％PEG(15,000-20,000)。
“佐劑”、“載體”或者“稀釋劑”均為含義已由本領(lǐng)域公知的術(shù)語。佐劑是能夠延長(zhǎng)所共同施用的免疫原的免疫原性的一種或多種物質(zhì)。載體是通過諸如改變待負(fù)載物質(zhì)的位置以利于操作的一種或多種物質(zhì)。稀釋劑是通過使給定物質(zhì)與稀釋劑接觸來降低給定物質(zhì)的濃度或者對(duì)該給定物質(zhì)進(jìn)行稀釋的一種或多種物質(zhì)。
“HMW PEG”指的是平均分子量限定為大于3.5千道爾頓的分子量較高的PEG。優(yōu)選HMW PEG具有大于5千道爾頓的平均分子量，在特殊的實(shí)施方案中，HMW PEG的平均分子量至少為8千道爾頓、至少15千道爾頓、以及在15千道爾頓～20千道爾頓之間。
下面實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行闡述。實(shí)施例1描述了高分子量PEG對(duì)肝切除小鼠所患有的腸源性敗血癥的保護(hù)作用。實(shí)施例2公開了HMW PEG是如何阻止病原體粘附于腸道上皮細(xì)胞的。實(shí)施例3揭示了HMW PEG是如何一般性地抑制致病毒性的表達(dá)，特異性地抑制凝集素/粘附素的表達(dá)的。實(shí)施例4說明了PEG并不影響病原體的生長(zhǎng)，或者細(xì)胞膜的完整性。實(shí)施例5利用原子力顯微鏡闡述了HMW PEG包被的病原體獨(dú)特的形態(tài)構(gòu)象。實(shí)施例6描述了受HMW PEG影響的細(xì)胞—細(xì)胞間相互作用。實(shí)施例7闡述了采用本發(fā)明組合物的預(yù)防方法。實(shí)施例8公開了對(duì)諸如在本發(fā)明的治療方法中HMWPEG的施用進(jìn)行監(jiān)測(cè)的方法，以及相應(yīng)的試劑盒。
實(shí)施例1HMW PEG對(duì)30％肝切除之后的腸源性敗血癥的保護(hù)作用采用常規(guī)方案將雄性Balb/c小鼠麻醉，進(jìn)行肝切除。沿著松軟的左葉進(jìn)行不出血的30％肝臟切除。對(duì)照組小鼠經(jīng)受肝處理但不作肝切除。試驗(yàn)組和對(duì)照組各包括7只小鼠。對(duì)所有小鼠，將分別以生理鹽水、PEG 3.350或PEG 15-20稀釋的200μl 107cfu/ml綠膿桿菌PA27853通過直接針刺注射至盲腸的底部。相對(duì)較低分子量的PEG可通過商購獲得；平均分子量在15,000道爾頓～20,000道爾頓之間的PEG15-20為PEG7-8和PEG8-10通過苯酚環(huán)共價(jià)連接的結(jié)合物。PEG 7-8的平均分子量在7,000道爾頓～8,000道爾頓之間，PEG 8-10的平均分子量在8,000道爾頓～10,000道爾頓之間。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，HMWPEG包括具有各種PEG亞單位中的任何PEG亞單位的化合物，每一亞單位具有多種平均分子量中的任一平均分子量，它們彼此之間或者它們與一種或多種連接分子之間優(yōu)選共價(jià)連接，所述連接分子為具有適于PEG分子相連接的官能團(tuán)的較小分子。適宜的連接分子充分地保持了HMW PEG的生物活性(保持足以實(shí)現(xiàn)本文公開的有益的預(yù)防或治療效果的生物活性)。
為了在48小時(shí)試驗(yàn)期內(nèi)提供PEG的恒定來源，將針直接插入小腸(回腸)，將1ml生理鹽水、PEG 3.35或PEG 15-20逆行注射進(jìn)入近端腸內(nèi)。利用縫合絲線將刺穿位點(diǎn)結(jié)扎，然后用酒精擦拭盲腸。將小鼠放回籠中，在接下來的48小時(shí)內(nèi)僅飼喂水。
在圖1的b圖中觀察到了PEG 15-20的劑量反應(yīng)曲線。a.采用精確概率檢驗(yàn)確定了PEG15-20的保護(hù)作用的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.001)。b.確定了PEG15-20的最低保護(hù)濃度為5％(P＜0.05)。c.進(jìn)行30％外科肝切除手術(shù)并直接盲腸注射1×107cfu/ml的PA27853，24小時(shí)后盲腸內(nèi)含物(糞便)、洗滌后的盲腸粘膜、肝臟以及血液的定量細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果。單因素ANOVA檢測(cè)結(jié)果顯示肝切除手術(shù)后小鼠的盲腸內(nèi)含物、盲腸粘膜、肝臟以及血液中的細(xì)菌數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性增加(P＜0.001)。對(duì)于PEG 3350，觀察到肝臟和血液中的細(xì)菌數(shù)有顯著性降低(P＜0.05)，而PEG15-20完全抑制了PA27853在小鼠肝臟和血液中的擴(kuò)散。
綠膿桿菌菌株ATCC 27853(PA27853)是從血液培養(yǎng)物得到的非黏液樣臨床分離物。對(duì)小鼠進(jìn)行30％不出血的外科肝切除后直接盲腸注射PA27853菌株將導(dǎo)致臨床敗血癥狀態(tài)并且48小時(shí)后無生還動(dòng)物。對(duì)于不進(jìn)行肝切除但也注射了綠膿桿菌的假剖腹手術(shù)小鼠(對(duì)照)，所有動(dòng)物都存活，并且未觀察到敗血癥的任何臨床體征(圖1a)。為了確定PEG溶液在該模型中抑制或者降低死亡率的作用，將200μl濃度為1×107cfu/ml的PA27853分別懸浮于兩種10％(w/v)的聚乙二醇溶液中(PEG-3.35與PEG-15-20)。選擇PEG-3.35是由于其代表了在過去的25年中已在臨床上使用的PEG的分子量(Golytely)。與之相比較，本發(fā)明所用的PEG溶液具有15kDa～20kDa的分子量。將懸浮的菌株通過直接刺穿引入盲腸。PEG3.35對(duì)于肝切除后的小鼠的死亡率沒有影響，而PEG15-20卻具有完全的保護(hù)作用。實(shí)際上，如精確概率檢驗(yàn)法所確定，PEG15-20的保護(hù)作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.001)。劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了5％溶液是PEG15-20發(fā)揮完全保護(hù)作用的最小濃度(P＜0.05，參見圖1b)，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可的是，低于5％的HMW PEG溶液也可能起到一些保護(hù)作用，因此這也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)小鼠和對(duì)照小鼠中的細(xì)菌數(shù)目，采用單因素方差分析(ANOVA)證明，肝切除后小鼠的盲腸內(nèi)含物、盲腸粘膜、肝臟以及血液中的細(xì)菌數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性增加(P＜0.001)。對(duì)于PEG3350，觀察到肝臟和血液中的細(xì)菌數(shù)有顯著性降低(P＜0.05)，而PEG15-20完全抑制了PA27853在小鼠肝臟和血液中的傳播。PEG 15-20完全抑制了腸道中PA27853向肝臟和血流中的擴(kuò)散(圖1c)。這些數(shù)據(jù)表明PEG溶液的作用涉及非殺滅微生物機(jī)制。采用對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無毒的PEG濃度(即≤約10％)時(shí)，對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)模式?jīng)]有影響。
該實(shí)施例證實(shí)了HMW PEG降低了以部分肝切除的形式接受外科手術(shù)的小鼠中由腸源性敗血癥導(dǎo)致的死亡率。該小鼠模型說明HMW PEG治療可用于降低經(jīng)歷諸如侵害性手術(shù)(例如，部分肝切除)等生理應(yīng)激的動(dòng)物物種的死亡率(即，降低任何給定生物體中的死亡可能性)，所述動(dòng)物物種有例如人等哺乳動(dòng)物。在生理應(yīng)激后(例如，手術(shù)后護(hù)理)實(shí)施HMW PEG治療時(shí)，預(yù)計(jì)該治療可有效用于對(duì)與敗血癥相關(guān)的死亡或者嚴(yán)重疾病進(jìn)行預(yù)防的方法。另外，可在生理應(yīng)激前(例如，術(shù)前護(hù)理)、并且在所述應(yīng)激的引入為可預(yù)料的情況下使用HMW PEG治療，以降低發(fā)生嚴(yán)重疾病或者死亡的風(fēng)險(xiǎn)。HMWPEG治療還可用于改善與腸源性敗血癥相關(guān)的疾病或者異常狀態(tài)的癥狀。
實(shí)施例2HMW PEG阻止病原體粘附于腸道上皮細(xì)胞緊密連接是上皮細(xì)胞中細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)元件，這些動(dòng)態(tài)元件在哺乳動(dòng)物腸道的屏障功能中起到關(guān)鍵作用。如通過Caco-2細(xì)胞和T-84細(xì)胞的跨上皮電阻(TEER)進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果所示，綠膿桿菌對(duì)于緊密連接的滲透性產(chǎn)生了意義深遠(yuǎn)的改變。Caco-2細(xì)胞為特征明確的人類結(jié)腸上皮細(xì)胞，其在培養(yǎng)時(shí)保持穩(wěn)定的TEER，并且該細(xì)胞系為腸道病原體的體內(nèi)行為提供了一個(gè)公認(rèn)的體外模型。為了確定PEG對(duì)Caco-2單層培養(yǎng)細(xì)胞的由綠膿桿菌PA27853誘導(dǎo)的TEER降低的保護(hù)作用，在10％PEG 3.35或者10％PEG 15-20存在下向兩個(gè)Caco-2細(xì)胞單層上頂端接種1×107cfu/ml的PA27853。連續(xù)8小時(shí)測(cè)定TEER并記錄TEER的最大下降。
只有PEG 15-20對(duì)于綠膿桿菌誘導(dǎo)的TEER降低具有明顯的保護(hù)作用(圖2a)。圖2的數(shù)據(jù)顯示的是，在三份平行培養(yǎng)物(n＝7)頂端與1×107cfu/ml的PA27853接觸8小時(shí)期間，觀察到的從其基線開始的TEER最大下降的平均值±SEM％。如接觸PA27853的Caco-2細(xì)胞中所示，單因素ANOVA的數(shù)據(jù)顯示，其TEER的降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.001)。PEG 15-20對(duì)PA27853誘導(dǎo)的TEER下降的保護(hù)作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.001)。圖2b顯示了在PEG3.35存在下頂端與PA27853接觸的Caco-2細(xì)胞的圖像。在PEG 3.35存在下共培養(yǎng)4小時(shí)后，觀察到Caco-2細(xì)胞單層的破裂，這顯示有病灶性粘附的細(xì)菌，細(xì)胞在單層細(xì)胞骨架上30微米～40微米處漂浮(圖2b)。與之相對(duì)應(yīng)，圖2c顯示了在PEG 15-20存在下尖端與PA27853接觸4小時(shí)后的Caco-2細(xì)胞的圖像，在任何檢查平面均無漂浮細(xì)胞的跡象。PEG15-20對(duì)Caco-2細(xì)胞完整性的保護(hù)作用與細(xì)胞粘附性的降低相關(guān)，這是通過在細(xì)胞與1×107cfu/ml的PA27853接觸4小時(shí)后細(xì)胞上清液中細(xì)菌的回收率升高至15倍而體現(xiàn)出來的。
通過TEER的保持判斷出PEG培養(yǎng)的人腸道上皮細(xì)胞對(duì)于綠膿桿菌的屏障破壞作用具有抵抗性，這為面對(duì)來自侵襲性病原體的挑戰(zhàn)時(shí)提供了一種使緊密連接性屏障功能穩(wěn)定化的可行方法。上皮轉(zhuǎn)運(yùn)功能(Na+/H+交換、葡萄糖運(yùn)輸)未受該化合物影響為PEG 15-20治療價(jià)值提供了進(jìn)一步的證據(jù)。
因此，HMW PEG對(duì)于腸道上皮屏障是相對(duì)惰性的，并且具有使腸道上皮屏障穩(wěn)定化的作用。本發(fā)明包括對(duì)腸道屏障異常進(jìn)行治療的方法，所述腸道屏障異常與諸如綠膿桿菌等腸道病原體相關(guān)，所述方法包括給動(dòng)物施用HMWPEG，所述動(dòng)物有例如哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。腸道屏障異?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的任何的診斷技術(shù)或者其它手段來揭示。但是，不必在進(jìn)行HMW PEG治療前對(duì)腸道屏障異常進(jìn)行確定。與HMW PEG治療相關(guān)的低成本和高度安全性使得該方法不僅適于優(yōu)選針對(duì)高危生物體的預(yù)防性應(yīng)用，而且還可適用于對(duì)以下動(dòng)物實(shí)施的治療方法，所述動(dòng)物是表現(xiàn)出腸道屏障異常的至少一種癥狀特征的動(dòng)物。所述HMW PEG治療方法將改善與腸道屏障異常相關(guān)的癥狀；優(yōu)選該方法將從受治療生物體上降低或消除腸源性敗血癥的影響。
實(shí)施例3HMW PEG對(duì)病原體毒性表達(dá)的抑制肝切除后小鼠的盲腸中綠膿桿菌PA27853的PA-I凝集素/粘附素的表達(dá)增多，該表達(dá)在小鼠腸道中綠膿桿菌的致死效應(yīng)中起到了關(guān)鍵作用。PA-I在小鼠腸道中是一個(gè)重要的毒性確定要素，其通過促進(jìn)PA27853對(duì)上皮的粘附以及通過造成對(duì)細(xì)胞毒素、外毒素A和彈性蛋白酶等的重要的屏障缺陷而發(fā)揮作用。綠膿桿菌中PA-I的表達(dá)通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子RhIR及其同族活化子C4-HSL而得到調(diào)節(jié)。PA27853中PA-I的表達(dá)不僅因與C4-HSL接觸而增多，而且與Caco-2細(xì)胞、Caco-2細(xì)胞膜制備物以及來自Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液相接觸也會(huì)造成該表達(dá)增多。
采用Northern雜交在轉(zhuǎn)錄水平分析PA-I的表達(dá)。利用改良的三次洗滌法(three-detergent method)來分離綠膿桿菌的總RNA。采用PA-I引物F(ACCCTGGACATTATTGGGTG)(SEQ ID NO1)、R(CGATGTCATTACCATCG-TCG)(SEQ ID NO2)，以及16S引物F(GGACGGGTGAGTAATGCCTA)(SEQID NO3)、R(CGTAAGGGCCATGATGACTT)(SEQ ID NO4)，通過PCR來生成探針，并將其克隆至pCR2.1載體中(Invitrogen，Inc.)。插入物為與PA-I或者16S序列相匹配的序列。利用α32P-dCTP來對(duì)PA-I和16S的特異性cDNA探針進(jìn)行放射標(biāo)記。利用Storm 860磷屏成像儀(Molecular Dynamics，CA)來測(cè)量特異性放射活性，以PA-I和16S的強(qiáng)度比率為基礎(chǔ)，計(jì)算與對(duì)照相比的相對(duì)百分變化。
采用兔親和純化多克隆抗-PA-I抗體將蛋白質(zhì)印跡法用于PA-I蛋白分析。利用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)洗滌一毫升的綠膿桿菌細(xì)胞，并在溶菌緩沖液(4％SDS，50mM Tris-HCl，pH6.8)中于100℃進(jìn)行加熱。三(羥甲基)甲基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)分析后，通過蛋白的電轉(zhuǎn)移，進(jìn)行免疫印跡分析。利用ECL試劑(Amersham，NJ)來檢測(cè)PA-I凝集素。
將綠膿桿菌PA27853與1mM的群體感應(yīng)信號(hào)分子C4-HSL相接觸，該接觸導(dǎo)致PA-I的蛋白表達(dá)發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的增加(單因素ANOVA，P＜0.001)，在10％PEG 3.35存在下，該蛋白表達(dá)受到部分的抑制作用，相比之下，10％PEG 15-20對(duì)該蛋白表達(dá)具有大得多的抑制作用(圖3)。PEG 15-20對(duì)于C4-HSL誘導(dǎo)的PA-I表達(dá)的最小完全抑制濃度為5％(單因素ANOVA，P＜0.01)。對(duì)于在有或無PEG存在下與C4-HSL相接觸的個(gè)體細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行電鏡檢查，結(jié)果證實(shí)C4-HSL引起了綠膿桿菌在外形上的形態(tài)變化以及菌毛表達(dá)(圖3b)。在PEG 15-20存在下，完全消除了C4-HSL誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)效應(yīng)，但是在PEG 3.35存在下卻沒有完全消除該效應(yīng)。與PEG 15-20相接觸的PA27853的周圍可以看到光暈式效應(yīng)(圖3b)。利用Northern印跡法評(píng)估，使PA27853與0.1mM的C4-HSL相接觸，結(jié)果使PA-I mRNA表達(dá)發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的增加(單因素ANOVA，P＜0.001)。10％PEG 15-20顯著抑制了PA-I的表達(dá)。圖3d顯示了與Caco-2細(xì)胞接觸4小時(shí)所誘導(dǎo)的PA-I mRNA的增加受到PEG15-20的抑制，但是PEG3.35并無此作用(單因素ANOVA，P＜0.001)。
此處所示數(shù)據(jù)顯示了當(dāng)以10％PEG 15-20對(duì)細(xì)菌進(jìn)行預(yù)處理后，觀察到由100μM-1mM的C4-HSL誘導(dǎo)的PA27853中，PA-I的表達(dá)(蛋白質(zhì)和mRNA)顯著減弱(3-4倍的減弱)。但這一效果并未在PEG3.35中觀察到(圖3a)。對(duì)于10％PEG 3.35，同樣也觀察到了C4-HSL誘導(dǎo)的PA-I表達(dá)的減弱，盡管其減弱程度要明顯低于10％PEG 15-20的程度。PEG15-20對(duì)C4-HSL誘導(dǎo)的PA-I蛋白表達(dá)的最小抑制濃度為5％(圖3b)。與C4-HSL相接觸的個(gè)體細(xì)菌細(xì)胞的電鏡結(jié)果證實(shí)，C4-HSL引起了PA27853在外形上的形態(tài)變化以及菌毛表達(dá)(圖3b)。在PEG 15-20存在下，完全消除了C4-HSL誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)效應(yīng)，但是PEG3.35卻無該作用(圖3b)。在PEG 15-20存在下，抑制了因與CaCo-2細(xì)胞接觸4小時(shí)而被誘導(dǎo)的PA-I表達(dá)(mRNA)，但是PEG 3.35卻無該作用(圖3b)。在相互接觸過夜的試驗(yàn)中，PEG 15-20保持著對(duì)Caco-2細(xì)胞誘導(dǎo)的PA-I表達(dá)的保護(hù)作用。
響應(yīng)已知刺激時(shí)，HMW PEG也對(duì)綠膿桿菌的毒性表達(dá)有影響。由于群體感應(yīng)信號(hào)傳輸是PA27853這種病原體毒性表達(dá)的公知機(jī)制，因此減弱PA27853中C4-HSL誘導(dǎo)的PA-I表達(dá)這一作用可能是PEG 15-20的一個(gè)主要的保護(hù)作用。預(yù)計(jì)PEG15-20誘導(dǎo)的對(duì)由Caco-2細(xì)胞誘導(dǎo)的PA-I表達(dá)的干擾作用將成為PEG 15-20的保護(hù)作用的一個(gè)重要方面。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PEG 15-20對(duì)宿主動(dòng)物具有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用通過減弱綠膿桿菌(PA27853)中的PA-I表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，這種PA-I表達(dá)是作為對(duì)30％肝切除后小鼠的經(jīng)過濾的盲腸內(nèi)含物(糞便)的響應(yīng)而發(fā)生的。PEG 15-20具有屏蔽綠膿桿菌的能力，這種能力使綠膿桿菌不受增加其毒性表達(dá)的宿主因素的影響，預(yù)計(jì)這一能力是其對(duì)生物體進(jìn)行保護(hù)使之免患腸源性敗血癥的另一機(jī)制。
相應(yīng)地，本發(fā)明包括試劑盒形式的物質(zhì)，以及對(duì)動(dòng)物施用HMW PEG的相應(yīng)方法，所述方法可對(duì)具有以下特征的狀態(tài)進(jìn)行預(yù)防或治療，所述狀態(tài)的特征在于，諸如某種假單胞菌等腸道病原體進(jìn)行毒性因子或者決定子的表達(dá)。毒性決定子可直接或者間接地對(duì)毒性作出貢獻(xiàn)。間接貢獻(xiàn)的一個(gè)實(shí)例就是綠膿桿菌中的PA-I凝集素/粘附素對(duì)腸道病原體粘附于腸道上皮的作用和/或?qū)?xì)胞毒素、外毒素A和彈性蛋白酶產(chǎn)生屏障缺陷的作用。
實(shí)施例4PEG不影響病原體的細(xì)胞生長(zhǎng)或者細(xì)胞膜的完整性利用含有SYTO 9和碘化丙錠的染色方法來評(píng)估兩種PEG溶液(PEG 3.35和PEG 15-20)對(duì)細(xì)菌膜完整性的影響。兩種PEG溶液對(duì)細(xì)菌膜滲透性都沒有任何影響(圖4a)。利用活的/死的細(xì)菌存活力試劑盒L-3152(Molecular Probes)來確定膜的完整性。將在不同的孵育時(shí)間采集的樣品稀釋10倍，通過涂覆所述稀釋液來對(duì)細(xì)菌進(jìn)行定量，數(shù)目以cfu/ml(菌落形成單位/毫升)來表示。使綠膿桿菌在含有這兩種PEG溶液中任何一種的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，由該綠膿桿菌的生長(zhǎng)曲線可以看出，兩種PEG溶液對(duì)細(xì)菌數(shù)量都未表現(xiàn)出抑制作用(圖4b)。實(shí)際上，在每種含有PEG的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)模式都與不含PEG的TSB培養(yǎng)基的生長(zhǎng)模式完全相同。分別測(cè)定在指數(shù)生長(zhǎng)期和生長(zhǎng)靜止期的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的乳酸脫氫酶(LDH)的活性，該酶是與能量代謝有關(guān)的管家酶。利用CytoTox 96(Promega)的底物混合物通過偶聯(lián)硫辛酰胺脫氫酶檢測(cè)來測(cè)定LDH的活性。利用基于雙縮脲反應(yīng)的蛋白檢測(cè)(BCA Protein Assay)(Pierce)來確定蛋白濃度。在PEG存在下生長(zhǎng)的綠膿桿菌的無細(xì)胞上清液中，沒有觀察到LDH的活性變化。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明HMW PEG對(duì)于細(xì)菌生長(zhǎng)模式的作用是微不足道的。
本發(fā)明的方法及其相應(yīng)產(chǎn)品(例如，試劑盒)提供了預(yù)防或治療與腸源性敗血癥相關(guān)的疾病或者異常狀態(tài)的益處，并且所述預(yù)防或治療對(duì)腸道菌群組成沒有顯著影響。類似地，本發(fā)明的方法及產(chǎn)品可用于改善與上述疾病或異常狀態(tài)相關(guān)的癥狀而不顯著改變腸道的微生物組成。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，迄今為止，希望能有不顯著干擾腸道菌群組成的方法(及試劑盒)，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)引起由上述干擾所致的第二并發(fā)癥。
實(shí)施例5PEG包被的病原體的原子力顯微鏡分析取培養(yǎng)過夜的PA27853培養(yǎng)物百分之一等分，在有或無10％HMW PEG存在的情況下在37℃利用胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行次培養(yǎng)4小時(shí)。從各次培養(yǎng)物中取一滴，用PBS充分洗滌綠膿桿菌PA27853細(xì)胞，通過鼓入空氣10分鐘而使之在云母頂部干燥，然后立即成像。利用MultimodeNanoscope IIIA掃描探針顯微鏡(MMAFM，Digital Instruments)在空氣中采用輕敲式AFM(tapping-mode AFM)對(duì)干燥的細(xì)菌進(jìn)行成像。將次匯合的Caco-2細(xì)胞以10％HMW PEG處理4小時(shí)，然后用PBS充分洗滌。不使用O型墊圈(O-ring)在PBS中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行AFM成像。對(duì)于電鏡，在使用或不使用1mMC4-HSL和10％HMW PEG的情況下將PA27853接種至TSB中，并孵育過夜。將1滴1％的綠膿桿菌用醋酸雙氧鈾染色，用0.5M的NaCl洗滌，然后進(jìn)行電鏡檢查。
Caco-2的原子力顯微鏡結(jié)果顯示了典型的帶有刷狀邊界微絨毛的不均勻表面，而與PEG3.35相接觸的Caco-2細(xì)胞在上皮細(xì)胞的表面具有平滑的平面外觀(圖5a、c)。PEG 15-20通過沿著形態(tài)明確的平面填充不對(duì)稱處而鋪在Caco-2細(xì)胞上(圖5e)，從而形成為更加復(fù)雜的形態(tài)明確的覆蓋物。類似地，與PEG3.35相接觸的PA27853細(xì)胞展示了通過平坦擴(kuò)散的模式覆蓋在細(xì)菌細(xì)胞上的光滑的聚合物覆層圖案(圖6d)，而PEG15-20則以形態(tài)更加不對(duì)稱的方式從四周緊密圍抱著細(xì)菌。對(duì)原子力顯微鏡測(cè)量的PEG15-20中的細(xì)菌直徑的橫截面分析表明，在PEG溶液中的細(xì)菌/PEG包被物顯著增大(圖5e，f)。換言之，PEG3.35在單獨(dú)的細(xì)菌細(xì)胞周圍形成了光滑的包被(圖5e)，而PEG15-20緊密圍抱著單獨(dú)的細(xì)胞(圖5f)并且增加了聚合物/細(xì)菌的直徑(圖5g，5h)，從而隔開了個(gè)體細(xì)菌細(xì)胞彼此之間的距離。
不希望束縛于任何理論，HMW PEG可以通過純物理性地隔開綠膿桿菌與腸道上皮的距離而發(fā)揮其有益效果。作為選擇，HMW PEG也可通過阻止由致病細(xì)胞的細(xì)胞—細(xì)胞間相互作用而產(chǎn)生的致病性群體感應(yīng)活化信號(hào)的形成而提供有益效果。不希望束縛于任何理論，采用HMW PEG對(duì)生物學(xué)表面進(jìn)行包被將使得包被的PEG鏈喪失構(gòu)象自由度并排斥所接近的蛋白。HMW PEG和Caco-2之間的極性—極性相互作用能夠?qū)EG鏈的彈性產(chǎn)生影響，將某些HMW PEG的側(cè)鏈限制在排斥蛋白的分子結(jié)構(gòu)體中。本處提供的數(shù)據(jù)支持下述結(jié)論，即，HMW PEG包被的Caco-2細(xì)胞要比未包被的Caco-2細(xì)胞更加排斥綠膿桿菌，這也許是由于HMW PEG與Caco-2細(xì)胞的某種動(dòng)力學(xué)相互作用導(dǎo)致了“構(gòu)象熵”損失。
該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了HMW PEG處理可對(duì)所處理的細(xì)胞產(chǎn)生影響，特別是可以對(duì)該細(xì)胞表面形態(tài)產(chǎn)生影響。而且，HMW PEG接觸對(duì)這類細(xì)胞的影響不同于PEG3.35對(duì)這類細(xì)胞所施加的影響。盡管不希望束縛于任何理論，但是，此處公開的結(jié)果確實(shí)為HMW PEG與諸如PEG3.35等低分子量PEG對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的明顯不同的效果提供了一種物理學(xué)上的關(guān)聯(lián)。
實(shí)施例6HMW PEG對(duì)細(xì)胞—細(xì)胞間相互作用的影響為了直接觀察PEG溶液對(duì)綠膿桿菌空間定向的影響，利用攜帶有編碼綠色熒光蛋白的egfp基因的綠膿桿菌活菌株P(guān)A27853/EGFP來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在有或無Caco-2細(xì)胞存在下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了采用培養(yǎng)的上皮細(xì)胞將PEG對(duì)細(xì)菌及其相互作用的影響成像，使用了微分干涉對(duì)比(DIC)顯微鏡和GFP成像。
采用pB1-EGFP質(zhì)粒(Clontech)作為模板擴(kuò)增所述編碼綠色熒光蛋白的EGFP基因。利用引物TCTAGAACTAGTGGATCCCCGCGGATG(SEQ ID NO5)和GCAGACTAGGTCGACAAGCTTGATATC(SEQ ID NO6)引入Xbal和Pstl限制性位點(diǎn)。利用TA-克隆試劑盒(Invitrogen)將PCR產(chǎn)物直接克隆至pCR2.1載體中，然后將pCR2.1/EGFP結(jié)構(gòu)體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中。采用Xbal和Pstl進(jìn)行消化，以此從該結(jié)構(gòu)體上切離EGFP基因，然后將含有切離基因的片段克隆至大腸桿菌-綠膿桿菌穿梭載體pUCP24中，該載體是已采用同樣的限制性酶消化的載體。使所得的在穿梭載體上包含EGFP基因的結(jié)構(gòu)體(即，pUCP24/EGFP)在25μF和2500V的條件下通過電穿孔進(jìn)入至PA27583電穿孔法勝任(electrocompetent)細(xì)胞中。在含有100μg/ml慶大霉素(Gm)的LB-瓊脂培養(yǎng)板上選擇含有PA27853/EGFP的細(xì)胞。
使攜帶有PA27853/EGFP的細(xì)胞在含有100μg/ml Gm的LB中培養(yǎng)過夜，然后用1％的培養(yǎng)物接種至含有50μg/ml Gm的新鮮LB中。培養(yǎng)3小時(shí)后，加入異丙基-β-D—硫代半乳糖苷(IPTG)，使之最終濃度為0.5mM，然后將培養(yǎng)物再孵育2小時(shí)。取100μl細(xì)菌培養(yǎng)物與1ml的HDMEM培養(yǎng)基(Gibco BRL)相混合，其中所述培養(yǎng)基以HEPES緩沖并且含有10％的胎牛血清(HDMEMHF)和10％HMW PEG。取一毫升細(xì)菌懸液將其倒入0.15mm厚的dTC3培養(yǎng)皿(Bioptech)中。利用有或沒有HMW PEG的HDMEM HF將在0.15mm厚dTC3培養(yǎng)皿中的HDMEM HF中培養(yǎng)4天的Caco-2細(xì)胞(p10-p30)洗滌一次。將一毫升上述制備的細(xì)菌懸液加入裝有Caco-2細(xì)胞的dTC3培養(yǎng)皿中。通過采用DIC和GFP熒光濾光片的Axiovert 100TV熒光倒置顯微鏡直接觀察dTC3培養(yǎng)皿中細(xì)菌細(xì)胞的分散圖案，物鏡放大率為63×。利用Bioptechs恒溫控制系統(tǒng)來調(diào)節(jié)溫度。利用鎢燈(100V)來激發(fā)DIC和GFP。利用Intelligent ImagingInnovations的3D成像軟件(Slidebook)在使用GFP濾光片的Z平面對(duì)細(xì)菌細(xì)胞分散圖案進(jìn)行成像。在DIC圖像(圖6a1)和Z平面重新構(gòu)建圖像(圖6a2)中觀察到綠膿桿菌細(xì)胞均勻分散浮游在沒有Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)基中。在Caco-2細(xì)胞存在的情況下，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)展成凝集的外觀(6b1)并觀察到其與Caco-2細(xì)胞相粘附(6b2)。10％PEG 3350溶液降低了細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性，并誘導(dǎo)了粘附于孔底(圖6c2)的蘑菇狀的細(xì)菌微菌落的即可生成(圖6c1)。在Caco-2細(xì)胞存在下，細(xì)菌微菌落位于上皮細(xì)胞平面上方約8微米處(6d1，2)。10％的PEG 15-20溶液顯著降低了綠膿桿菌的運(yùn)動(dòng)性。盡管如此，在含有PEG 15-20的培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育的最初0.5-1小時(shí)中，細(xì)菌細(xì)胞形成接近于孔底的蛛腿狀微菌落(圖6e1，2)。在幾小時(shí)內(nèi)，蛛腿狀的微菌落占據(jù)了培養(yǎng)基的全部空間/體積。在Caco-2細(xì)胞存在下，綠膿桿菌細(xì)胞喪失了蛛樣構(gòu)型，觀察到其升高至上皮平面上方(30-40微米)(圖6f1，2)。
為了確定細(xì)菌-上皮細(xì)胞間相互作用在三維上的空間定位，進(jìn)行Z平面重新構(gòu)建。圖像顯示兩種PEG溶液對(duì)于綠膿桿菌的凝集具有不同的作用，并且取決于是否有Caco-2細(xì)胞存在，兩種PEG溶液對(duì)細(xì)菌的空間定位有不同的影響。在僅使用培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)中，觀察到綠膿桿菌顯示出均勻分散的圖案(圖6a)。但是，在Caco-2細(xì)胞存在下，受檢細(xì)菌細(xì)胞發(fā)展成凝集的外觀，并觀察到其在孔底處靠近上皮細(xì)胞平面(圖6b)。在僅有PEG3.35存在下，受檢細(xì)菌細(xì)胞形成大量凝集的聚集物，并停留在培養(yǎng)孔的底部(圖6c)，而受檢的細(xì)菌細(xì)胞與含有PEG3.35的培養(yǎng)基中的Caco-2細(xì)胞共存時(shí)，受檢細(xì)菌細(xì)胞停留而懸浮在上皮細(xì)胞平面的上方(約8微米)，并保持其凝集的外觀(圖6d)。在僅有PEG15-20存在下，受檢細(xì)菌細(xì)胞呈現(xiàn)出微小凝集的均勻圖案(圖6e)，而在含有PEG15-20的培養(yǎng)基中的Caco-2存在下，受檢細(xì)菌細(xì)胞以凝集的形式高高懸浮于上皮平面上方(約32微米)(圖6f)。在計(jì)時(shí)實(shí)驗(yàn)中，觀察到PEG3.35降低了細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性，PEG 15-20對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的降低程度更大。
通過與實(shí)施例5中所公開的試驗(yàn)類似的方法，本實(shí)施例為所觀測(cè)到的HMW PEG對(duì)細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用的影響提供了物理學(xué)上的關(guān)聯(lián)，這與本文公開的其有益的預(yù)防和治療活性相一致。預(yù)計(jì)采用HMW PEG將能降低或消除腸道中有害的細(xì)胞—細(xì)胞間相互作用(例如，腸道上皮細(xì)胞與諸如假單胞菌等腸道病原體之間的相互作用)，降低罹患與腸源性敗血癥相關(guān)的疾病和/或異常狀態(tài)的可能性。
實(shí)施例7預(yù)防疾病/異常狀態(tài)的方法本發(fā)明還提供了對(duì)人和其它動(dòng)物、尤其是其它哺乳動(dòng)物的多種疾病和/或異常狀態(tài)進(jìn)行預(yù)防的方法。在這些方法中，將有效量的HMW PEG施用至需要給藥的人類患者或動(dòng)物個(gè)體中?？刹捎帽绢I(lǐng)域公知的常規(guī)優(yōu)化程序來確定施用進(jìn)度表，以便使用該進(jìn)度表來施用PEG。優(yōu)選PEG的平均分子量為5,000道爾頓～20,000道爾頓，進(jìn)一步優(yōu)選在10,000道爾頓～20,000道爾頓之間。預(yù)期施用至少5％的HMW PEG?？刹捎眠m宜的形式來施用HMW PEG，所述適宜的形式為例如作為溶液、作為凝膠或霜?jiǎng)?、作為適于噴霧的溶液(例如，用于吸入)、含有HMW PEG的藥物組合物和適于注射至動(dòng)物體內(nèi)的無菌、等滲溶液等?？衫萌魏纬Ｒ?guī)途徑來完成施用；特別希望通過口服或者局部方式來施用HMW PEG。在一些實(shí)施方案中，待施用的HMW PEG組合物還進(jìn)一步包含選自以下的物質(zhì)右旋糖苷包衣的L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的菊粉、右旋糖苷包衣的丁酸、果糖-低聚糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、右旋糖苷包衣的甘露糖、半乳糖以及乳果糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所施用的HMW PEG組合物還進(jìn)一步包含右旋糖苷包衣的L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的菊粉、右旋糖苷包衣的丁酸、一種或多種果糖-低聚糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、右旋糖苷包衣的甘露糖、半乳糖以及乳果糖。
本發(fā)明提供了預(yù)防多種疾病和異常狀態(tài)的方法，所述疾病和異常狀態(tài)有例如游泳耳、急性或慢性中耳炎、呼吸器相關(guān)性肺炎、腸源性敗血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎、抗生素誘導(dǎo)的腹瀉、假膜性結(jié)腸炎、炎性腸疾病、過敏性腸疾病、嗜中性小腸結(jié)腸炎、胰腺炎、慢性疲勞綜合癥、菌群失調(diào)綜合癥、微小結(jié)腸炎、慢性尿道感染、性傳播疾病以及感染(例如，暴露于受生物恐怖試劑污染的環(huán)境中，所述生物恐怖試劑為例如炭疽桿菌、天花病毒、致腸病性大腸桿菌(EPEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸集聚性大腸桿菌(EAEC)、艱難梭菌、輪狀病毒、綠膿桿菌、粘質(zhì)沙雷氏桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、陰溝腸桿菌、白色念珠菌以及光滑假絲酵母等)。在預(yù)防或治療慢性尿道感染的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述HMW PEG以膀胱沖洗的方式施用。為預(yù)防性傳播疾病，優(yōu)選將本發(fā)明組合物用于潤(rùn)滑避孕套。在預(yù)防生物恐怖試劑感染的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物可為適于局部施用的凝膠劑或霜?jiǎng)┑男问?。預(yù)計(jì)這種局部施用將能用于預(yù)防與任一生物恐怖試劑相關(guān)的各種疾病/異常狀態(tài)，或能用于預(yù)防與對(duì)人類或動(dòng)物的生存、健康或舒適造成威脅的各種化學(xué)或者物理化學(xué)試劑相關(guān)的各種疾病/異常狀態(tài)。所述化學(xué)或物理化學(xué)試劑包括能夠燒傷或者損傷皮膚的試劑，這些試劑在本發(fā)明的組合物中失去活性或者幾乎不溶解。
在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，將雄性Balb/c小鼠麻醉，通過直接針刺向盲腸底部注射5％的PEG15-20水溶液。為了在48小時(shí)的試驗(yàn)期內(nèi)提供PEG的恒定來源，將針直接插入小腸(回腸)，將1ml PEG 15-20逆行注射進(jìn)入近端腸內(nèi)。利用縫合絲線將刺穿位點(diǎn)結(jié)扎，然后用酒精擦拭盲腸。將小鼠放回籠中，僅飼喂水。48小時(shí)后，對(duì)小鼠實(shí)施常規(guī)的肝切除程序，該程序包括沿著松軟的左葉進(jìn)行不出血的30％肝臟切除。對(duì)照組小鼠經(jīng)歷肝處理但不作肝切除。包括施用HMW PEG的預(yù)防性處理預(yù)計(jì)可降低或消除小鼠與外科手術(shù)相關(guān)的腸源性敗血癥的出現(xiàn)。
這些方法不僅適用于對(duì)如小鼠、豚鼠、狗以及貓等寵物進(jìn)行預(yù)防性護(hù)理，而且還適用于對(duì)如牛、馬、綿羊、山羊、豬、雞、火雞、鴨、鵝等有農(nóng)業(yè)價(jià)值的動(dòng)物以及其它任何豢養(yǎng)動(dòng)物的預(yù)防性護(hù)理。此外，預(yù)計(jì)該預(yù)防性方法還可用于人類，以改善許多患有下述疾病和/或異常狀態(tài)的患者或者可能發(fā)展成下述疾病和/或異常狀態(tài)的高危人群的健康和預(yù)期壽命游泳耳、急性或慢性中耳炎、呼吸器相關(guān)性肺炎、腸源性敗血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎、抗生素誘導(dǎo)的腹瀉、假膜性結(jié)腸炎、炎性腸疾病、過敏性腸疾病、嗜中性小腸結(jié)腸炎、胰腺炎、慢性疲勞綜合癥、菌群失調(diào)綜合癥、微小結(jié)腸炎、慢性尿道感染、性傳播疾病以及感染性試劑(例如，生物恐怖組合物)所致的疾病，所述感染性試劑所致疾病包括但不限于炭疽熱以及天花。如上所述，該預(yù)防方法包括采用任何公知或常規(guī)的施用途徑給人類或其它動(dòng)物施用含有至少5％HMW PEG(5kDa～20kDa)的組合物。該預(yù)防方法優(yōu)選用于可能發(fā)展為前述一種或多種疾病和/或狀態(tài)的高危個(gè)體中，但是本發(fā)明的組合物和方法預(yù)計(jì)可在對(duì)人類或其它動(dòng)物的整個(gè)種群或亞種群中的該類疾病或異常狀態(tài)進(jìn)行廣泛的預(yù)防或治療時(shí)起到預(yù)防性或治療性的作用。
實(shí)施例8對(duì)HMW PEG的施用進(jìn)行監(jiān)測(cè)的方法本發(fā)明還設(shè)計(jì)了對(duì)諸如治療方法中HMW PEG的施用進(jìn)行監(jiān)測(cè)的方法。在這種監(jiān)測(cè)方法中，將帶標(biāo)記的HMW PEG單獨(dú)施用或者與未標(biāo)記的HMWPEG一同施用，并且在以連續(xù)或間歇的時(shí)間表進(jìn)行治療期間，對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，該檢測(cè)包括簡(jiǎn)單終點(diǎn)確定。術(shù)語“帶標(biāo)記的”HMW PEG指的是，將標(biāo)記物或者可檢測(cè)化合物與HMW PEG直接或者間接相連，或者將HMW PEG與一報(bào)道化合物相連接，所述報(bào)道化合物能夠?qū)?biāo)記物與HMW PEG聯(lián)系起來(當(dāng)然，如下所述，本發(fā)明也考慮了未與HMW PEG相連的標(biāo)記物或者設(shè)計(jì)為與之相連的標(biāo)記物)。利用本領(lǐng)域公知的任何可檢測(cè)的標(biāo)記物對(duì)HMWPEG進(jìn)行標(biāo)記，并將該P(yáng)EG標(biāo)記至足以被檢測(cè)到的水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道，該水平將隨著標(biāo)記物以及檢測(cè)方法的不同而發(fā)生變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該能夠采用常規(guī)的優(yōu)化方法對(duì)標(biāo)記的程度進(jìn)行優(yōu)化。標(biāo)記物通過非共價(jià)鍵或者共價(jià)鍵與HMW PEG化學(xué)連接，所述非共價(jià)鍵或者共價(jià)鍵為使用時(shí)穩(wěn)定、優(yōu)選儲(chǔ)藏時(shí)穩(wěn)定的化學(xué)鍵。優(yōu)選標(biāo)記物與HMW PEG共價(jià)連接。調(diào)節(jié)標(biāo)記物連接的密度使得HMW PEG的生物活性能夠基本得到保持(保持足以實(shí)現(xiàn)如本文公開的預(yù)防或治療效果的生物活性)。如本領(lǐng)域公知，這通常通過調(diào)節(jié)HMW PEG標(biāo)記物的比率來完成。當(dāng)給定HMW PEG平均分子的相對(duì)尺寸時(shí)，則預(yù)計(jì)各種各樣的標(biāo)記物都能適于與HMW PEG相連接，并能基本保持HMW PEG的生物活性。
本發(fā)明考慮的標(biāo)記物為本領(lǐng)域公知的標(biāo)記物，其包括放射性標(biāo)記物、發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)以及報(bào)道物(包括能夠催化可檢測(cè)化合物的生成的酶以及諸如抗體等結(jié)合伴侶，該抗體使可檢測(cè)化合物定域在該報(bào)道物的附近)等。酶報(bào)道物的實(shí)例包括發(fā)光體系的酶成分和比色反應(yīng)催化劑。更具體地說，報(bào)道分子的實(shí)例包括生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白以及酶(例如，辣根過氧化物酶、熒光素酶以及堿性磷酸酶，包括分泌性堿性磷酸酶(SEAP)；β-半乳糖苷酶；β-葡萄糖苷酶；氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，該類報(bào)道物的使用是公知的，并且在例如美國專利No.3,817,837、美國專利No.3,850,752、美國專利No.3,996,345以及美國專利No.4,277,437中都有描述?？赏ㄟ^報(bào)道酶轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)化合物的酶底物的實(shí)例包括5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷或者Xgal和Bluo-gal等。在特定的實(shí)施方案中，作為可以轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)化合物的酶底物也可作為標(biāo)記物，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能理解這一點(diǎn)。教導(dǎo)過標(biāo)記物及其應(yīng)用的美國專利包括美國專利No.3,817,837；美國專利3,850,752；美國專利No.3,939,350；以及美國專利No.3,996,345。放射性標(biāo)記物的實(shí)例包括3H、14C、32P、33P、35S以及125I；熒光團(tuán)的實(shí)例包括熒光素(FITC)、羅丹明、Cy3、Cy5、發(fā)光蛋白質(zhì)以及綠色熒光蛋白。優(yōu)選的標(biāo)記物為諸如熒光素等熒光團(tuán)。
本發(fā)明的監(jiān)測(cè)方法還可以涉及一種以上的標(biāo)記物。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)標(biāo)記物用于識(shí)別治療后或者治療過程中HMW PEG的位置，同時(shí)第二標(biāo)記物對(duì)一種或多種微生物具有特異性，以至于該標(biāo)記物可以與至少一種微生物進(jìn)行可檢測(cè)的連接。例如，監(jiān)測(cè)方法可以包括以基本保持HMW PEG的生物活性的方式與HMW PEG相連的熒光素，以及用于檢測(cè)原核生物特異性β-半乳糖苷酶活性的游離(即，未連接的)Xgal或bluo-gal。熒光素使HMW PEG定域化，而有色(藍(lán)色)產(chǎn)物說明存在諸如假單胞菌等可代謝乳糖的原核微生物。本發(fā)明還包括以下的監(jiān)測(cè)方法，其中，單個(gè)標(biāo)記物提供該信息(即，HMW PEG的定位以及指示微生物的存在)。
本領(lǐng)域公知的任何檢測(cè)技術(shù)都可用于本發(fā)明的監(jiān)測(cè)方法。有一些因素會(huì)對(duì)所選擇的檢測(cè)技術(shù)產(chǎn)生影響，這些因素包括標(biāo)記物的類型、受到監(jiān)測(cè)的生物物質(zhì)(例如，皮膚、耳道或腸道的表皮細(xì)胞；糞便、粘膜或組織的樣品)、所需的識(shí)別水平以及是否需要定量等。適宜的檢測(cè)技術(shù)包括以肉眼進(jìn)行簡(jiǎn)單目視檢查、利用諸如選擇性地裝備有適宜的光源和/或用于記錄的相機(jī)的內(nèi)窺鏡等器械來進(jìn)行的目視檢查以及蓋革(Geiger)計(jì)數(shù)器、X-射線膜、閃爍計(jì)數(shù)器等的常規(guī)使用方法和本領(lǐng)域公知的任何其它檢測(cè)技術(shù)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以知道，本發(fā)明的監(jiān)測(cè)方法可用于對(duì)所述治療方法進(jìn)行優(yōu)化。例如，可采用監(jiān)測(cè)方法來對(duì)輸送至上皮細(xì)胞的HMW PEG的量和/或濃度進(jìn)行優(yōu)化(例如，為了使HMW PEG溶液或混合物達(dá)到所需的粘度)，所述上皮細(xì)胞是例如耳道上皮細(xì)胞，該輸送可用于預(yù)防或治療游泳耳。作為另外的實(shí)例，通過對(duì)與帶標(biāo)記的HMW PEG接觸的腸道進(jìn)行內(nèi)窺鏡檢查或者通過監(jiān)測(cè)大便樣品，可利于對(duì)腸或腸內(nèi)的治療進(jìn)行優(yōu)化。
本發(fā)明的監(jiān)測(cè)方法包括用于檢測(cè)能夠粘附于腸道上皮細(xì)胞的微生物的大便檢測(cè)，該方法包括使微生物和腸道上皮細(xì)胞相接觸，然后采用本領(lǐng)域公知的任意技術(shù)來檢測(cè)微生物對(duì)該上皮細(xì)胞的粘附。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將腸道上皮細(xì)胞固定于諸如微量滴定孔的底面和/或側(cè)面等適宜的表面上。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，在檢測(cè)步驟前或者檢測(cè)步驟中，加入直接標(biāo)記物或者諸如能夠生成可檢測(cè)產(chǎn)物的報(bào)道物等間接標(biāo)記物。所述監(jiān)測(cè)方法可以進(jìn)一步包括加入游離標(biāo)記物的步驟。例如，在懷疑含有可代謝乳糖的原核微生物的樣品中加入游離的Bluo-gal；如果存在，則微生物酶β-半乳糖苷酶將裂解Bluo-gal，產(chǎn)生可檢測(cè)的藍(lán)色產(chǎn)物。
在一個(gè)實(shí)施方案中將商購獲得的腸道上皮細(xì)胞(例如，Caco-2細(xì)胞，ATCCHTB 37和/或IEC-6細(xì)胞，ATCC CRL 1952)通過常規(guī)技術(shù)固定于微量滴定培養(yǎng)皿的孔中。收集大便樣品并與諸如磷酸鹽緩沖鹽水等液體相混合。獲得含有懸浮微生物的混合物的液相(例如，通過適宜的過濾(即，將粗固體與液態(tài)懸液中的細(xì)菌分離)或傾析等方法)，并用PBS以1∶100進(jìn)行稀釋。向活的微生物懸液中加入Bluo-gal。將懸液加至微量滴定孔中，于24℃保持1小時(shí)，然后用適宜的液體(例如，PBS)洗滌這些孔，以除去未結(jié)合的微生物。通過諸如偏振光顯微鏡計(jì)數(shù)等方法檢測(cè)未結(jié)合的微生物和/或與固定的上皮細(xì)胞結(jié)合的微生物。在另外的實(shí)施方案中，以適宜的免疫試劑將免疫測(cè)定用于檢測(cè)粘附，所述適宜的免疫試劑為微生物特異性的單克隆或者多克隆抗體，其選擇性地與諸如放射標(biāo)記物、熒光團(tuán)或者發(fā)色團(tuán)等標(biāo)記物相連接。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道，腸道上皮細(xì)胞或腸道微生物都無需固定，但所述固定會(huì)利于精確檢測(cè)粘附于上皮細(xì)胞的微生物。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，將固定的大便微生物與未固定的腸道上皮細(xì)胞相接觸。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道，可采用本領(lǐng)域公知的任意合適的液體來獲得微生物懸液，優(yōu)選所述液體為已知的任何等滲緩沖液。而且，如上所述，任何已知的標(biāo)記物都可用于檢測(cè)細(xì)胞粘附。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)微生物細(xì)胞的粘附的試劑盒，所述試劑盒包括上皮細(xì)胞以及一份用于檢測(cè)微生物細(xì)胞對(duì)該上皮細(xì)胞的粘附的實(shí)驗(yàn)方案。所述方案對(duì)檢測(cè)微生物的已知方法進(jìn)行了描述。優(yōu)選的試劑盒包括腸道上皮細(xì)胞。本發(fā)明的其它試劑盒進(jìn)一步包括諸如熒光團(tuán)或者報(bào)道物等標(biāo)記物。
本發(fā)明考慮的另一監(jiān)測(cè)方法為微生物疏水性的檢測(cè)。在該方法中，利用任何常規(guī)技術(shù)來確定微生物細(xì)胞的相對(duì)或絕對(duì)疏水性。所用技術(shù)的一個(gè)實(shí)例包括如本領(lǐng)域所公知的對(duì)任何微生物進(jìn)行疏水相互作用色譜。參見Ukuku等，J.Food Prot.651093-1099(2002)，將其全文引入作為參考。所用技術(shù)的另一實(shí)例為對(duì)任何微生物進(jìn)行非極性液體∶極性液體分配法(例如，1-辛醇∶水或者二甲苯∶水)。參見Majtan等，F(xiàn)olia Microbiol(Praha)47445-449(2002)，將其全文引入作為參考。
在采用疏水性檢測(cè)對(duì)PEG的施用進(jìn)行監(jiān)測(cè)的一個(gè)實(shí)施方案中，將大便樣品懸浮于50mM的磷酸鈉緩沖液(含有0.15M NaCl，pH7.4)中。通過離心收集懸液中的微生物，用相同的緩沖液進(jìn)行重懸，并重復(fù)離心-重懸的循環(huán)。如果可能，用相同的緩沖液將微生物重懸至660nm處的吸光率為0.4，此時(shí)可不使用帶標(biāo)記的PEG而通過分光光度法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。用二甲苯(Merck)處理微生物懸液(微生物懸液∶二甲苯的體積比為2.5∶1)，將懸液劇烈混合2分鐘，然后將懸液在室溫下沉降20分鐘。測(cè)定水相中微生物的存在，可通過例如分光光度法測(cè)定660nm處的吸光率來進(jìn)行測(cè)定。用含有磷酸鈉緩沖液的空白樣品來消除背景。
為從大便樣品中獲得微生物細(xì)胞以用于所述方法中，優(yōu)選HMW PEG在用于獲得微生物懸液的液體中以及在用于對(duì)微生物懸液進(jìn)行稀釋的任何液體中相對(duì)不溶解。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于包括對(duì)微生物疏水性進(jìn)行檢測(cè)的監(jiān)測(cè)方法的試劑盒，所述試劑盒包括腸道上皮細(xì)胞以及一份敘述微生物疏水性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方案。優(yōu)選的試劑盒包括腸道上皮細(xì)胞。相關(guān)的試劑盒進(jìn)一步包括諸如熒光團(tuán)或者報(bào)道物等標(biāo)記物。
本發(fā)明更進(jìn)一步提供了一種監(jiān)測(cè)方法，所述方法包括獲得腸道菌落樣品以及檢測(cè)PA-I凝集素/粘附素的活性?？刹捎帽绢I(lǐng)域公知的用來檢測(cè)PA-I凝集素/粘附素的活性的任何技術(shù)。例如，可利用特異性識(shí)別PA-I凝集素/粘附素的抗體(多克隆抗體、單克隆抗體、諸如Fab片段等抗體片段、單鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體以及本領(lǐng)域公知的任何其它形式的抗體)來對(duì)PA-I凝集素/粘附素進(jìn)行檢測(cè)。免疫檢測(cè)采用本領(lǐng)域公知的任何免疫檢測(cè)方法，例如，ELISA、蛋白印跡法和免疫沉淀反應(yīng)法等。作為選擇，可以檢測(cè)PA-I凝集素/粘附素與碳水化合物的結(jié)合能力或者PA-I凝集素/粘附素對(duì)腸道上皮屏障的破壞活性，所述檢測(cè)可通過例如在與樣品接觸前和/或與樣品接觸期間監(jiān)測(cè)上皮層的跨上皮電阻或者說TEER來進(jìn)行。在相關(guān)的試劑盒中，本發(fā)明提供了PA-I凝集素/粘附素結(jié)合伴侶以及用于檢測(cè)PA-I凝集素/粘附素的活性(例如，結(jié)合活性)的實(shí)驗(yàn)方案。本發(fā)明的其它試劑盒包括已知可與PA-I凝集素/粘附素結(jié)合的任意的碳水化合物以及用于檢測(cè)PA-I凝集素/粘附素的活性(例如，結(jié)合活性)的方案。
根據(jù)上述教導(dǎo)可對(duì)本發(fā)明作出多種修飾以及變化，這些修飾和變化也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本文引用的所有出版物都全文引用作為參考。
權(quán)利要求
1.降低處于異常狀態(tài)的動(dòng)物的死亡率的方法，所述異常狀態(tài)包括上皮表面處于可能發(fā)展為微生物介導(dǎo)的紊亂的危險(xiǎn)之中，所述方法包括向需要給藥的動(dòng)物施用有效量的聚乙二醇，所述聚乙二醇的平均分子量至少為5,000道爾頓。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述異常狀態(tài)選自腸源性敗血癥、燒傷、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、嚴(yán)重嗜中性白血球減少癥、毒性大腸炎、炎性腸疾病、腸病、移植排斥、慢性腸炎或豬腹病。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述動(dòng)物選自狗、貓、綿羊、山羊、牛、豬、雞、馬或人。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述動(dòng)物為人。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為15000道爾頓。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述聚乙二醇的平均分子量在5000道爾頓～20000道爾頓之間。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚乙二醇為含有10％～20％聚乙二醇的水溶液。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述水溶液含有10％聚乙二醇。
9.抑制腸道病原體中PA-I凝集素/粘附素表達(dá)的方法，所述方法包括向需要給藥的動(dòng)物施用有效量的聚乙二醇，所述聚乙二醇的平均分子量至少為5,000道爾頓。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為15000道爾頓。
11.抑制由腸道誘導(dǎo)的PA-I凝集素/粘附素活化的方法，所述方法包括向需要給藥的動(dòng)物施用有效量的聚乙二醇，所述聚乙二醇的平均分子量至少為5,000道爾頓。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為15000道爾頓。
13.抑制由C4-HSL誘導(dǎo)的腸道病原體的形態(tài)變化的方法，所述方法包括向需要給藥的動(dòng)物施用有效量的聚乙二醇，所述聚乙二醇的平均分子量至少為5,000道爾頓。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為15000道爾頓。
15.減少腸道病原體的毒性表達(dá)的方法，所述方法包括向需要給藥的動(dòng)物施用有效量的聚乙二醇，所述聚乙二醇的平均分子量至少為5,000道爾頓。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為15000道爾頓。
17.通過抑制致病性群體感應(yīng)活化的形成來改善腸道發(fā)病機(jī)理的方法，所述方法包括向需要給藥的動(dòng)物施用有效量的聚乙二醇，所述聚乙二醇的平均分子量至少為5,000道爾頓。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為15000道爾頓。
19.抑制細(xì)菌細(xì)胞粘附于哺乳動(dòng)物的腸道的方法，所述方法包括使腸道與聚乙二醇接觸，所述聚乙二醇的平均分子量至少為5,000道爾頓。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為假單胞菌。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述假單胞菌為綠膿桿菌。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為15000道爾頓。
23.減少細(xì)菌細(xì)胞中PA-I凝集素/粘附素表達(dá)的方法，所述方法包括使細(xì)菌細(xì)胞與聚乙二醇相接觸，所述聚乙二醇的平均分子量至少為5,000道爾頓。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為15000道爾頓。
25.降低動(dòng)物死亡率的方法，所述動(dòng)物罹患有微生物介導(dǎo)的上皮紊亂，所述方法包括施用有效量的聚乙二醇，所述有效量為有效抑制哺乳動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞與細(xì)菌細(xì)胞之間的相互作用的用量，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為5,000道爾頓。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述微生物介導(dǎo)的上皮紊亂選自腸源性敗血癥、燒傷、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、嚴(yán)重嗜中性白血球減少癥、毒性大腸炎、炎性腸疾病、腸病、移植排斥或慢性腸炎。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述聚乙二醇以形態(tài)不對(duì)稱方式粘附至腸道上皮細(xì)胞或者細(xì)菌細(xì)胞。
28.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為15000道爾頓。
29.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為腸道病原體，并且所述腸道病原體的生長(zhǎng)特性沒有發(fā)生可檢測(cè)的變化。
30.如權(quán)利要求25所述的方法，所述方法還包括向所述動(dòng)物的腸道引入有效量的選自右旋糖苷、右旋糖苷包衣的L-谷氨酸或右旋糖苷包衣的菊粉的化合物。
31.如權(quán)利要求25所述的方法，所述方法還包括向所述動(dòng)物的腸道引入有效量的L-谷氨酸。
32.藥物組合物，所述組合物包含平均分子量至少為15000道爾頓的聚乙二醇以及適宜的佐劑、載體或稀釋劑。
33.如權(quán)利要求32所述的藥物組合物，所述組合物還包含選自以下的物質(zhì)右旋糖苷、L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的菊粉、右旋糖苷包衣的丁酸、果糖-低聚糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、右旋糖苷包衣的甘露糖、半乳糖以及乳果糖。
34.用于治療或預(yù)防腸源性敗血癥的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求32所述的藥物組合物以及描述所述組合物在治療或者預(yù)防異常狀態(tài)時(shí)的用法的方案。
35.預(yù)防疾病或者異常狀態(tài)的方法，所述方法包括給動(dòng)物施用含有有效量的聚乙二醇的組合物，所述聚乙二醇的平均分子量至少為5,000道爾頓。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述疾病或異常狀態(tài)選自游泳耳、急性中耳炎、慢性中耳炎、呼吸器相關(guān)性肺炎、腸源性敗血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎、抗生素誘導(dǎo)的腹瀉、假膜性結(jié)腸炎、炎性腸病、過敏性腸病、嗜中性小腸結(jié)腸炎、胰腺炎、慢性疲勞綜合癥、菌群失調(diào)綜合癥、微小結(jié)腸炎、慢性尿道感染、性傳播疾病或感染。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述動(dòng)物選自狗、貓、綿羊、山羊、牛、豬、雞、馬或人。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述動(dòng)物為人。
39.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為15000道爾頓。
40.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述聚乙二醇的平均分子量在15000道爾頓～20000道爾頓之間。
41.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述聚乙二醇為含有10％～20％聚乙二醇的水溶液。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述水溶液含有10％聚乙二醇。
43.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述組合物還包含一種賦形劑，所述賦形劑選自液態(tài)溶液、局部用凝膠或適于噴霧的溶液。
44.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述組合物還包含選自以下的化合物右旋糖苷包衣的L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的菊粉、右旋糖苷包衣的丁酸、果糖-低聚糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、右旋糖苷包衣的甘露糖、半乳糖或乳果糖。
45.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述組合物還包含右旋糖苷包衣的L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的菊粉、右旋糖苷包衣的丁酸、果糖-低聚糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、右旋糖苷包衣的甘露糖、半乳糖以及乳果糖。
46.預(yù)防皮膚感染的方法，所述方法包括給動(dòng)物施用含有有效量的聚乙二醇的組合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為5,000道爾頓。
47.如權(quán)利要求46的方法，其中所述組合物還包含一種賦形劑，所述賦形劑選自軟膏、霜?jiǎng)?、凝膠或洗劑。
48.如權(quán)利要求46的方法，其中導(dǎo)致所述感染的作用物選自炭疽桿菌、天花病毒、致腸病性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、腸集聚性大腸桿菌、艱難梭菌、輪狀病毒、綠膿桿菌、粘質(zhì)沙雷氏桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、陰溝腸桿菌、白色念珠菌或光滑假絲酵母。
49.預(yù)防呼吸性傳染的方法，所述方法包括對(duì)動(dòng)物施用有效量的聚乙二醇的步驟，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為5000道爾頓。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述呼吸性傳染選自呼吸器相關(guān)性肺炎或感染。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中引起所述感染的所述作用物選自炭疽桿菌或天花病毒。
52.對(duì)尿道的至少一部分進(jìn)行沖洗來預(yù)防慢性尿道感染的方法，所述方法包括將有效量的包含聚乙二醇的組合物施用至尿道的步驟，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為5000道爾頓。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中尿道的所述部分至少包括膀胱。
54.預(yù)防性傳播疾病的方法，所述方法包括在避孕套上施用聚乙二醇的步驟，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為5000道爾頓。
55.避孕套，所述避孕套至少包括局部的聚乙二醇涂層，所述聚乙二醇的平均分子量至少為5000道爾頓。
56.對(duì)消化道紊亂進(jìn)行預(yù)防的方法，所述方法包括對(duì)需要給藥的動(dòng)物施用有效量的組合物，所述組合物包含聚乙二醇，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為5000道爾頓。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述消化道疾病選自新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、抗生素誘導(dǎo)的腹瀉、假膜性結(jié)腸炎、炎性腸病、過敏性腸病、嗜中性小腸結(jié)腸炎、胰腺炎、菌群失調(diào)性綜合癥或微小結(jié)腸炎。
58.向需要給藥的動(dòng)物施用聚乙二醇的監(jiān)測(cè)方法，所述方法包括(a)向需要給藥的動(dòng)物施用有效量的包含帶標(biāo)記的聚乙二醇的組合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為5000道爾頓；以及(b)檢測(cè)所述帶標(biāo)記的聚乙二醇。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述標(biāo)記為熒光團(tuán)。
60.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述的對(duì)帶標(biāo)記的聚乙二醇的檢測(cè)包括內(nèi)窺鏡檢查。
61.如權(quán)利要求58所述的方法，其中在大便樣品中檢測(cè)所述帶標(biāo)記的聚乙二醇。
62.如權(quán)利要求58所述的方法，所述方法還包括施用對(duì)微生物具有特異性的第二標(biāo)記以及檢測(cè)第二標(biāo)記。
63.向需要給藥的動(dòng)物施用聚乙二醇的監(jiān)測(cè)方法，所述方法包括(a)從被施用了平均分子量至少為5000道爾頓的聚乙二醇的動(dòng)物中獲得樣品；(b)使該樣品與上皮細(xì)胞相接觸；以及(c)測(cè)定該樣品中的微生物對(duì)上皮細(xì)胞的粘附。
64.向需要給藥的動(dòng)物施用聚乙二醇的監(jiān)測(cè)方法，所述方法包括(a)從被施用了平均分子量至少為5000道爾頓的聚乙二醇的動(dòng)物中獲得樣品；(b)從該樣品中分離微生物；以及(c)測(cè)量所述微生物的細(xì)胞表面的疏水性。
65.向需要給藥的動(dòng)物施用聚乙二醇的監(jiān)測(cè)方法，所述方法包括從被施用了平均分子量至少為5000道爾頓的聚乙二醇的動(dòng)物中獲得樣品；以及檢測(cè)該樣品中PA-I凝集素/粘附素的活性。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其中通過將所述PA-I凝集素/粘附素與PA-I凝集素/粘附素結(jié)合伴侶結(jié)合來檢測(cè)所述PA-I凝集素/粘附素。
67.試劑盒，該試劑盒用于權(quán)利要求66所述的對(duì)施用聚乙二醇的監(jiān)測(cè)，所述試劑盒包括PA-I凝集素/粘附素結(jié)合伴侶以及實(shí)驗(yàn)方案，所述方案描述了所述結(jié)合伴侶在檢測(cè)樣品中的PA-I凝集素/粘附素中的使用方法。
68.用于監(jiān)測(cè)聚乙二醇的施用的試劑盒，所述試劑盒包括帶標(biāo)記的聚乙二醇以及實(shí)驗(yàn)方案，所述方案描述了帶標(biāo)記的聚乙二醇在監(jiān)測(cè)聚乙二醇的施用中的使用方法。
69.預(yù)防動(dòng)物喪失產(chǎn)乳能力的方法，所述動(dòng)物的乳腺上皮表面處于可能發(fā)展為微生物介導(dǎo)的紊亂的危險(xiǎn)之中，而且所述微生物介導(dǎo)的紊亂為影響產(chǎn)奶量的紊亂，所述方法包括給所述乳腺上皮表面施用有效量的聚乙二醇，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為5,000道爾頓。
70.如權(quán)利要求69所述的方法，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為15000道爾頓。
71.預(yù)防微生物介導(dǎo)的上皮紊亂在喂乳期動(dòng)物中發(fā)展的方法，所述方法包括給該動(dòng)物施用有效量的聚乙二醇，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為5,000道爾頓。
72.如權(quán)利要求71所述的方法，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為15000道爾頓。
73.如權(quán)利要求71所述的方法，其中將所述聚乙二醇與嬰兒配方奶粉相混合。
74.包含嬰兒配方奶粉和聚乙二醇的組合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量至少為5,000道爾頓。
75.如權(quán)利要求74所述的組合物，其中所述PEG的平均分子量至少為15000道爾頓。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種藥物組合物，該藥物組合物的形式為諸如聚乙二醇等相對(duì)高分子量的生物相容性聚合物，任選添加諸如右旋糖苷等保護(hù)性聚合物和/或諸如L－谷氨酸等對(duì)病原體必要的營(yíng)養(yǎng)物。本發(fā)明還提供了一種對(duì)腸源性敗血癥進(jìn)行預(yù)防或治療的方法，所述腸源性敗血癥是由于諸如綠膿桿菌等腸道病原體所引發(fā)的，所述方法包括施用高分子量聚乙二醇；本發(fā)明還提供了對(duì)高分子量聚乙二醇的施用進(jìn)行監(jiān)測(cè)的方法，例如在對(duì)腸源性敗血癥等微生物介導(dǎo)的上皮紊亂進(jìn)行預(yù)防、改善或治療的方法中進(jìn)行所述監(jiān)測(cè)。腸源性敗血癥通常為手術(shù)恢復(fù)期的哺乳動(dòng)物的并發(fā)癥或者由一種疾病或紊亂所引起，為接受預(yù)防性治療的適宜動(dòng)物提供指征。最后，本發(fā)明提供了一種組合物，所述組合物包含嬰兒配方奶粉以及聚乙二醇，本發(fā)明還提供了該組合物的使用方法。
文檔編號(hào)A61K47/34GK1697644SQ02829960
公開日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2002年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月26日
發(fā)明者約翰·C·M·D·阿爾韋迪 申請(qǐng)人:芝加哥大學(xué)