專利名稱：抗乙型肝炎病毒治療性疫苗及其佐劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的治療性疫苗，具體涉及抗乙型肝炎病毒(HBV)治療性疫苗抗原與佐劑，以及抗原與佐劑的重量比。
乙型肝炎是由HBV傳染的發(fā)病率極高的疾病?？共《局委熓侵委熉訦BV感染的主要手段。
20世紀90年代至今，研制出許多核苷類似物抗病毒藥，其中拉咪呋叮(Lamivudine)已于1998年被美國FDA批準，用于治療慢性乙肝。
此外，一種新的特異性抗HBV療法(抗HBV治療性疫苗)也已研制出來，其中HBV前S與S片段蛋白與T細胞表位多肽治療性疫苗也已問世，并已用于臨床治療慢性HBV感染患者。2001年Merck研究所研究人員Hilleman在Vaccine雜志上簡要綜述了現(xiàn)今國際上治療慢性HBV感染的主要治療方法。文章中敘述了目前國際上治療慢性HBV感染的最主要抗病毒療法包括抗病毒化學(xué)療法、干擾素類抗病毒藥、生物學(xué)療法、特異性免疫學(xué)療法等。其中抗病毒化學(xué)療法使用核苷類似物抗病毒藥。干擾素類抗病毒藥有IFN-α1、2a和2b。生物學(xué)療法是影響HBV復(fù)制后轉(zhuǎn)錄過程，該療法使用細胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12)、胸腺激素(Thymosinα1)、反義核苷酸與反義核酸等物質(zhì)。特異性免疫學(xué)療法使用抗HBV特異性免疫球蛋白、抗HBV治療性疫苗。目前已有的抗HBV治療性疫苗主要有三種前S與S片段蛋白治療性疫苗、T細胞表位脂多肽治療性疫苗和DNA質(zhì)粒疫苗。前兩種抗HBV治療性疫苗已有臨床應(yīng)用報告，DNA質(zhì)粒疫苗則由于存在尚未解決的安全問題而仍處在體外與動物實驗的階段。
根據(jù)目前發(fā)現(xiàn)的HBV免疫學(xué)機理，慢性HBV感染患者的轉(zhuǎn)歸與抗病毒治療的效果有密切關(guān)系。極少數(shù)病例在抗病毒治療過程中，肝內(nèi)與循環(huán)血液內(nèi)HBV被清除，臨床上表現(xiàn)為HBsAg、HBeAg及HBV DNA消失，甚至最終產(chǎn)生抗HBs，取得根治性治療效果；而大部分病例則只是在用藥期間HBV復(fù)制被抑制，臨床上表現(xiàn)為HBeAg及HBV DNA在循環(huán)血內(nèi)達到檢測不出的水平。然而，停藥后一段時間內(nèi)復(fù)發(fā)，返回到治療前的狀況。抗病毒治療療效的這種現(xiàn)狀表明，慢性HBV感染的根除性治療問題還遠未解決。
在上述的三種已有抗HBV治療性疫苗中，第一種抗HBV治療性疫苗由兩種制劑構(gòu)成，其一是HBV特異性抗原。國際上通用HBV S片段或Pre S與S片段蛋白為HBV特異性抗原；其二是免疫佐劑。兩種成分都會影響抗HBV治療性疫苗的臨床療效。
慢性HBV感染病人免疫系統(tǒng)存在的重要問題是免疫耐受。由于免疫耐受使患者的抗HBV免疫反應(yīng)淋巴細胞對HBV及其抗原不產(chǎn)生免疫應(yīng)答，因此使HBV在體內(nèi)呈持續(xù)感染狀態(tài)?，F(xiàn)代免疫學(xué)的研究提示，解決這種狀態(tài)的唯一途徑是通過應(yīng)用抗HBV治療性疫苗進行治療，來打破免疫耐受。故此，用抗HBV治療性疫苗打破慢性HBV感染病人的免疫耐受，重建其正?？笻BV免疫應(yīng)答，不僅是當(dāng)前一種新治療途徑，而且也是當(dāng)前最新的治療思路。
在上述三種抗HBV治療性疫苗中，現(xiàn)今被認為安全而且有療效者是抗HBVPre S與S片段蛋白治療性疫苗。在這個領(lǐng)域內(nèi)，國際間競爭極為激烈。競爭的重點在于對這種治療性疫苗佐劑的研制上。可以說，誰搞出最好的佐劑，誰就在國際競爭中占上峰。
在佐劑的研究方面，絕大多數(shù)人常用脂多糖類物質(zhì)或舊結(jié)核菌素。由于我們在多年研究中發(fā)現(xiàn)，慢性HBV感染患者之所以對HBV呈免疫耐受狀態(tài)，很重要的原因之一是患者的抗原處理細胞(APCs)上缺乏免疫第二信號(稱為B7.1與B7.2或稱CD80與CD86多肽)。正由于這種免疫信號缺乏，使得啟動抗HBV免疫應(yīng)答的兩種細胞，即HBV抗原特異性細胞毒T淋巴細胞(簡稱特異性CTL)與輔助性T淋巴細胞(簡稱CD4+細胞或HTL)不能活化，進而使體內(nèi)的HBV不能被清除。
鑒于上述原因，本發(fā)明人研究的重點是研制出具有免疫第二信號功能的多肽物質(zhì)作為抗HBV治療性疫苗的佐劑。經(jīng)過多年研究之后，我們有了很大的發(fā)現(xiàn)，即基因重組白細胞介素-2(IL-2)、基因重組GM-CSF與破傷風(fēng)類素(TT)衍生多肽按特定比例組合在一起，加一定劑量的Pre S與S片段蛋白疫苗，能表現(xiàn)兩個作用①替代患者APCs缺乏的免疫第二信號；②重建患者失去的抗HBV免疫應(yīng)答。這種研制抗HBV治療性疫苗佐劑的新思路，以及在這種新思路基礎(chǔ)上研制出來的新佐劑，到目前為止，在國際上仍然是獨一無二的。
本發(fā)明的目的是提供新的佐劑，特別是提供適用于抗HBV治療性疫苗的佐劑。
本發(fā)明的目的是提供新的用于治療慢性HBV感染的抗乙型肝炎病毒(HBV)治療性疫苗。
本發(fā)明的一個實施方案是提供一種新的疫苗佐劑，其中所述佐劑由白細胞介素-2(IL-2)、人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、破傷風(fēng)類毒素衍生多肽(TT)組成。IL-2與GM-CSF可以是天然蛋白，也可以是重組蛋白。IL-2、GM-CSF以及TT均有市售，IL-2可以從北京四環(huán)生物工程制品廠以注射用重組人白細胞介素-2的產(chǎn)品名獲得；GM-CSF可以從Schering-Plough(Brinny)Co.以Leucomax的商品名獲得；TT可以從蘭州生物制品研究所以破傷風(fēng)類毒素的商品名獲得。另外，IL-2、GM-CSF以及TT的生產(chǎn)方法也是本領(lǐng)域已知的，例如參見Wong GG，witek JS，Temple PA，et al，Molecular cloning ofhuman and givvon GM-CSF cDNA’s and purification of the natural and recombinanthuman proteins.Cancer Cells 1985；3235-242。
本發(fā)明的另一實施方案是提供由白細胞介素-2(IL-2)、人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、破傷風(fēng)類毒素衍生多肽(TT)組成的新佐劑，其中所述IL-2、GM-CSF和TT的比例(重量比)為50-600∶10-200∶6-20，優(yōu)選IL-2、GM-CSF和TT的重量比例為56∶16∶6。所述三種組分的含量以所得的佐劑不會產(chǎn)生毒性為準。
本發(fā)明的佐劑可用于疫苗，特別是用于抗HBV治療性疫苗。
按上述比例取IL-2、GM-CSF和TT混合在一起，即可制成本發(fā)明所述的佐劑。按照本領(lǐng)域熟知的方法，可將上述組分按比例組合后制成水劑或者凍干制劑。
本發(fā)明的另一個實施方案是提供一種新的抗HBV治療性疫苗。這種抗HBV治療性疫苗由兩種主要成分構(gòu)成。即1.HBV特異性抗原蛋白，取用HBV基因結(jié)構(gòu)中的S片段主蛋白(含226個氨基酸)或S片段主蛋白加前S1(含108氨基酸)與前S2(55個氨基酸)基因表達的蛋白(見

圖1)。2.佐劑采用本發(fā)明人發(fā)明的細胞因子佐劑。該佐劑由白細胞介素-2、人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)與破傷風(fēng)類毒素(TT)按一定重量比組成(本發(fā)明人已申請的有關(guān)佐劑專利，專利號為02159913.0)。
本發(fā)明的另一實施方案是提供由HBV基因結(jié)構(gòu)中S片段主蛋白或S片段主蛋白加前S1或S片段主蛋白加前S1與前S2基因表達的蛋白為HBV特異性抗原加上上述細胞因子佐劑組成的新HBV治療性疫苗。其中所述的抗原與細胞因子佐劑的重量比為S片段蛋白或S片段加前S1與前S2蛋白(簡稱HBV特異性抗原蛋白)IL-2∶GM-CSF∶TT＝5-100∶50-600∶10-200∶4-10，優(yōu)選HBV特異性抗原、IL-2、GM-CSF和TT的重量比為60∶56∶16∶6。本發(fā)明所用的乙型肝炎病毒表面抗原可以從市場上購買，例如北京天壇生物制品公司、康泰公司。
按上述比例取HBV特異性抗原蛋白、IL-2、GM-CSF和TT混合在一起，即可制成本發(fā)明所述的抗HBV治療性疫苗。按照本領(lǐng)域熟知的方法，上述組分按比例組合后制成水劑或者凍干制劑。
權(quán)利要求
1.一種抗乙型肝炎病毒(HBV)治療性疫苗，由HBV表面抗原和佐劑組成。
2.權(quán)利要求1的HBV治療性疫苗，其中所述HBV表面抗原選自(1)HBVS片段；(2)HBVS片段+前S1片段；或(3)HBVS片段+前S1+前S2片段。
3.權(quán)利要求1或2的HBV治療性疫苗，其中所述佐劑由白細胞介素-2(IL-2)、人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、破傷風(fēng)類毒素衍生多肽(TT)組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的疫苗，其中所述佐劑中IL-2、GM-CSF和TT的重量比例為50-600∶10-200∶6-20。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的疫苗，其中所述佐劑中IL-2、GM-CSF和TT的重量比例為56∶16∶6。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4的任一疫苗，其中所述HBV表面抗原與IL-2、GM-CSF和TT的重量比例為5-100∶50-600∶10-200∶6-20。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的疫苗，其中所述HBV表面抗原與IL-2、GM-CSF和TT的重量比例為60∶56∶16∶6。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的治療性疫苗及其佐劑。本發(fā)明的佐劑特別適用于抗HBV治療性疫苗。所述疫苗佐劑由白細胞介素－2(IL－2)、人粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子(GM－CSF)、破傷風(fēng)類毒素衍生多肽(TT)組成。本發(fā)明的疫苗由上述佐劑和乙型肝炎病毒表面抗原組成。
文檔編號A61P1/00GK1454668SQ0310469
公開日2003年11月12日 申請日期2003年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月30日
發(fā)明者蘇盛 申請人:北京市希波醫(yī)學(xué)技術(shù)開發(fā)公司