專利名稱：重組幽門螺桿菌外膜蛋白25的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組幽門螺桿菌外膜蛋白25。
背景技術(shù)：
目前人們已經(jīng)知道，人體內(nèi)胃粘膜中存在的螺形菌是幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)，且慢性幽門螺桿菌感染是人類最常見的慢性細(xì)菌感染之一。這種感染不可避免地導(dǎo)致人類細(xì)菌性胃炎(B型胃炎)的誘發(fā)。幽門螺桿菌在胃潰瘍和十二指腸潰瘍以及某些形式的胃癌(腺癌)的發(fā)展中起誘因作用(Lee等，1993；Solnick和Tompkins，1993)。更少見被視為免疫系統(tǒng)B細(xì)胞瘤的先兆的胃MALT(粘膜相關(guān)淋巴組織)淋巴瘤大概也是幽門螺桿菌感染的結(jié)果。
長期受幽門螺桿菌感染的一個后果是萎縮性胃炎，粘性、產(chǎn)酸或產(chǎn)胃蛋白酶的胃上皮細(xì)胞變性，與胃腺癌、胃粘膜相關(guān)性淋巴樣組織(MALT)惡性淋巴瘤的發(fā)生亦密切相關(guān)，被視為癌前期損害。胃癌中約有60％大概是幽門螺桿菌感染的結(jié)果。
細(xì)菌從口攝入后，首先到達(dá)極酸的胃腔(pH1-2)中。在此，通過產(chǎn)生脲酶這種酶使細(xì)菌可能存活，所述脲酶造成已有脲的分解，從而引起胃中酸性pH值的局部中和。借助趨化定向和依賴于鞭毛的游動性，微生物再移動到胃竇區(qū)的碳酸氫鹽緩沖的粘膜層，由于酸性屏障作用，只有幾種競爭性細(xì)菌能進(jìn)入該生態(tài)環(huán)境。為到達(dá)上皮，微生物大概借助于腔(pH1-2)和上皮細(xì)胞表面(Ph6-7)之間的pH梯度進(jìn)行自身定向。
既然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胃十二指腸潰瘍是傳染病，治療目的之一就是用抗生素消除病原體。然而，用各種抗生素(阿莫西林、硝基呋喃、furazolidin紅霉素a.o)進(jìn)行單獨(dú)治療已被證實(shí)并不令人滿意，因?yàn)樯踔猎谶@種情況下僅有0-15％病例會根除細(xì)菌。目前，把酸阻斷劑(Ompeprazol)和抗生素(阿莫西林)結(jié)合使用達(dá)到最成功的治療效果，這種療法使清除率達(dá)80％(Malfertheiner，1994)。用抗生素治療消除幽門螺桿菌并不是有前途的長期治療方案，因?yàn)榧?xì)菌會迅速產(chǎn)生對抗生素的耐性。
受幽門螺桿菌感染會導(dǎo)致胃粘膜的慢性炎癥反應(yīng)(胃炎)。另外，誘發(fā)對幽門螺桿菌抗原的特異性全身免疫反應(yīng)；不過，分泌性抗體(sIgA)在胃中的形成尚未得到無可爭議的闡述。發(fā)炎的結(jié)果是在胃粘膜和亞粘膜中存在多種免疫細(xì)胞，例如多形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞(Blaser，1992)。此外，幽門螺桿菌在體外激活嗜中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(Mai等，1991)。用特異性抗體和補(bǔ)體進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，在體外嗜中性白細(xì)胞使幽門螺桿菌迅速失活。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種運(yùn)用PCR技術(shù)克隆幽門螺桿菌基因，構(gòu)建載體對其進(jìn)行序列分析和蛋白表達(dá)分析，進(jìn)一步通過粘膜治藥免疫防治幽門螺桿菌。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應(yīng)的核苷酸序列，或，(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列；和(a)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(b)細(xì)胞被載體所轉(zhuǎn)化；及(a)序列號1所示的核苷酸序列，或，(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的核苷酸序列。
除了序列號1所示核苷酸序列和在遺傳密碼簡并性范圍內(nèi)與該序列相應(yīng)的核苷酸序列之外，本發(fā)明還包括在嚴(yán)格條件下與這些序列之一雜交的DNA序列。本發(fā)明包括在些洗滌條件下與序列號1所示核苷酸序列之一雜交或與在遺傳密碼簡并性范圍內(nèi)的相應(yīng)核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明的DNA分子最好編碼能粘附到人細(xì)胞上、特別是人胃上皮細(xì)胞上的多肽。此外，本發(fā)明的DNA分子最好在核苷酸水平上與序列號1所示核苷酸序列有至少70％、特別優(yōu)選至少90％的同源性。而且，該DNA分子的長度最好至少為45個核苷酸，優(yōu)選至少50個核苷酸。
本發(fā)明的又一個目的是含本發(fā)明DNA分子的至少一個拷貝的載體。該載體可以是最好在表達(dá)信號(啟動子、操縱基因、增強(qiáng)子等)控制下本發(fā)明DNA分子位于其上的任何原核或真核載體。原核體的例子有象噬菌體(例如λ噬菌體)這樣的染色體載體以及象質(zhì)粒這樣的染色體外載體，而環(huán)狀質(zhì)粒載體是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明的載體也可以是真核載體例如酵母載體或者是適于高等細(xì)胞的載體(例如，質(zhì)粒載體、病毒載體、植物載體)。
本發(fā)明的又一目的是用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，該細(xì)胞是原核細(xì)胞、優(yōu)選革蘭氏陰性的原核細(xì)胞、特別優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞。不過，另一方面，本發(fā)明的細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞，例如真菌細(xì)胞(如酵母)、動物或植物細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及由本發(fā)明DNA分子編碼的多肽。該多肽包括(a)序列號1所示氨基酸序列，或(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的氨基酸序列。
本發(fā)明的多肽最好與序列號1所示核苷酸序列有至少90％的同源性。
本發(fā)明的多肽最好通過下述方法生產(chǎn)用本發(fā)明的DNA分子或載體轉(zhuǎn)化一種細(xì)胞，在多肽能得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從細(xì)胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離多肽。該方法中可獲得融合多肽以及非融合多肽形式的本發(fā)明多肽。
本發(fā)明的多肽也可用作免疫原來產(chǎn)生抗體。因此，本發(fā)明還涉及抗本發(fā)明多肽的抗體。
本發(fā)明另一方面涉及一種藥用組合物，它包含作為活性物質(zhì)的本發(fā)明的DNA分子、本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的抗體，選擇性地含有常見藥用輔助物質(zhì)、稀釋劑、添加劑和載體。
一方面，本發(fā)明的藥用組合物可用于診斷幽門螺桿菌感染。
另一方面，該藥用組合物也可用于防止或治療幽門螺桿菌感染。對治療應(yīng)用而言，將多肽或其片斷用于產(chǎn)生主動疫苗，或?qū)⒖贵w用于產(chǎn)生被動疫苗。
本發(fā)明具有運(yùn)用PCR技術(shù)克隆幽門螺桿菌外膜蛋白25粘膜基因，并構(gòu)建載體對其進(jìn)行序列分析和蛋白表達(dá)分析，提高抗血清可阻止幽門螺桿菌粘附于胃粘膜上皮細(xì)胞和提高免疫原性及活性高等優(yōu)點(diǎn)。
從Hp陽性及陰性病人外周血中分離淋巴細(xì)胞，與重組OMP25共孵育后發(fā)現(xiàn)，該蛋白僅能刺激陽性病人的外周血T細(xì)胞增殖，而不能刺激陰性病人T細(xì)胞增殖，說明是幽門螺桿菌特異蛋白。
但體外試驗(yàn)也證實(shí)該蛋白具有弱的誘導(dǎo)Th2細(xì)胞表型的作用。
應(yīng)用OMP25 50ng/鼠加免疫佐劑霍亂毒素10ng，隔日一次共三次口服免疫小鼠，三周后應(yīng)用幽門螺桿菌感染小鼠，繼之二周后處死動物觀察。發(fā)現(xiàn)可完全預(yù)防60％的小鼠感染幽門螺桿菌，而且與對照相比，可降低另外40％小鼠的細(xì)菌定植量，保護(hù)率可達(dá)100％。重組OMP25與免疫小鼠脾細(xì)胞共孵育后，發(fā)現(xiàn)可刺激后者增殖10倍以上，說明能產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫。
用同樣方法經(jīng)肛免疫小鼠也可取得100％的保護(hù)率，具有最高的保護(hù)率和完全保護(hù)率。


圖1是序列表。
具體實(shí)施例方式
下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的作進(jìn)一步的詳述如圖所示，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應(yīng)的核苷酸序列，或，(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列；在核酸水平上它與序列號1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性；它的長度至少為45個核苷酸；(a)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(b)細(xì)胞被載體所轉(zhuǎn)化；多肽，它由DNA分子所編碼，它包括(a)序列號1所示的核苷酸序列，或，(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的核苷酸序列。產(chǎn)生多肽的方法，載體轉(zhuǎn)化一種細(xì)胞，在多肽得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并從細(xì)胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離出多肽。多肽作為免疫原產(chǎn)生抗體的應(yīng)用和多肽的抗體。藥用組合物，(a)它包含作為活性物質(zhì)的DNA分子、多肽或者抗體，選擇性地包含常見藥用輔助物質(zhì)、稀釋劑、添加劑和載體，(b)藥用組合物用來診斷幽門螺桿菌感染的應(yīng)用，(c)藥用組合物用于生產(chǎn)防止或治療幽門螺桿菌感染用的藥劑的應(yīng)用。
利用基因克隆技術(shù)對外膜蛋白25的基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)并研究了其免疫防治作用。
1材料與方法1.1質(zhì)粒和菌株菌株BL21(DE3)、質(zhì)粒pET-22b(+)和幽門螺桿菌SS1為第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院消化研究所保存。
1.2工具酶及試劑限制性內(nèi)切酶NotI、NcoI及T4DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶購自NewEngland Biolabs公司，Taq DNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)λDNA/EcoR I+Hind III購自華美生物工程公司，瓊脂糖、dNTPs、DNA快速純化試劑盒購自Promega公司，測序質(zhì)粒純化試劑盒購自美國Qiagen公司，其它試劑為國產(chǎn)分析純。
1.3Hp染色體DNA的提取從固體培養(yǎng)基上刮取生長良好的Hp菌落，按基因組DNA小量制備法制備，詳見參考文獻(xiàn)[1]。
1.4質(zhì)粒的提取及純化質(zhì)粒的快速抽提及大量制備均采用堿變性法，詳見參考文獻(xiàn)[2]。
1.5目的基因的PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)引物，在其5′端加上合適的限制性酶切位點(diǎn)，由博亞公司合成。序列如下外膜蛋白2515′-TG GCC ATG GAT TTG CAA AAC TTT GTT TTT-3′NcoI外膜蛋白2525′-AG TGC GGC CGCTCA AAA GCC TAT G-3′NotI熱啟動法進(jìn)行PCR，95℃變性30s，55℃退火50s，72℃延伸90s，35個循環(huán)后再延伸10min。0.8％瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果。
1.6DNA片段的酶切、連接、轉(zhuǎn)化和陽性克隆的鑒定質(zhì)粒和目的基因DNA經(jīng)NotI和NcoI雙酶切，玻璃奶回收酶切片段，T4連接酶作用下16℃連接12h，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，雙酶切鑒定篩選出陽性克隆。
1.7序列測定及分析堿裂解法大量抽提經(jīng)雙酶切鑒定的重組克隆質(zhì)粒，用自動測序儀進(jìn)行序列分析。
1.8誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳外膜蛋白25陽性克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
1.9動物實(shí)驗(yàn)對已經(jīng)感染幽門螺桿菌的小鼠通過黏膜途徑給予外膜蛋白25，觀察治療作用。對未感染幽門螺桿菌的小鼠先通過黏膜途徑給予外膜蛋白25，然后再用幽門螺桿菌進(jìn)行攻擊，觀察保護(hù)作用。
2結(jié)果2.1外膜蛋白25基因的擴(kuò)增PCR結(jié)果電泳分析發(fā)現(xiàn)在2100bp左右有一條帶，大小與預(yù)計(jì)相符。
2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及酶切鑒定將PCR產(chǎn)物經(jīng)NotI和NcoI雙酶切后，定向插入經(jīng)同樣雙酶切的pET-22b(+)載體中，獲得重組質(zhì)粒命名為pET-22b(+)/外膜蛋白25。經(jīng)NotI和NcoI雙酶切后的重組質(zhì)粒電泳結(jié)果與預(yù)計(jì)相符。
2.3外膜蛋白25基因片段的序列分析直接以重組質(zhì)粒pET-22b(+)/外膜蛋白25為模板進(jìn)行測序，得到了克隆片段的DNA序列，自動測序儀序列分析結(jié)果見后。
2.4外膜蛋白25基因在大腸桿菌中的表達(dá)外膜蛋白25陽性克隆株在LB培養(yǎng)液(含100ug/ml氨芐青霉素)中37℃過夜培養(yǎng)，然后按1％轉(zhuǎn)接至含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)至D值為0.6～0.8，加IPTG至終濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)3h，離心收集菌體，取其周質(zhì)的滲透休克液、菌體超聲后的上清以及沉淀進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)相對分子量為76×103的蛋白，與預(yù)期分子量大小一致。
2.5動物實(shí)驗(yàn)外膜蛋白25的治療和保護(hù)有效率均為100％。
參考文獻(xiàn)[1]Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T.Molecular cloninga laboratory manua1.2nded.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989.35。
Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，et al.顏?zhàn)臃f，王海林譯。精編分子生物學(xué)指南。北京科學(xué)出版社，1998.39。
權(quán)利要求
1.DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應(yīng)的核苷酸序列，或(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1的DNA分子，其特征在于在核酸水平上它與序列號1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性。
3.權(quán)利要求1或2的DNA分子，其特征在于它的長度至少為45個核苷酸。
4.權(quán)利要求1～3之一的DNA分子，其特征在于(a)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(b)細(xì)胞被載體所轉(zhuǎn)化。
5.多肽，其特征在于它由權(quán)利要求1～4之一的DNA分子所編碼。
6.權(quán)利要求5的多肽，其特征在于它包括(a)序列號1所示的核苷酸序列，或(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的核苷酸序列。
7.產(chǎn)生權(quán)利要求5～6之一的多肽的方法，其特征在于用權(quán)利要求1～3之一的DNA分子或權(quán)利要求4的載體轉(zhuǎn)化一種細(xì)胞，在多肽得以表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并從細(xì)胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離出多肽。
8.權(quán)利要求5～6之一的多肽作為免疫原產(chǎn)生抗體的應(yīng)用和多肽的抗體。
9.藥用組合物，其特征在于(a)它包含作為活性物質(zhì)的權(quán)利要求1～3之一的DNA分子、權(quán)利要求5～6之一的多肽或者權(quán)利要求8或9的抗體，選擇性地包含常見藥用輔助物質(zhì)、稀釋劑、添加劑和載體，(b)藥用組合物用來診斷幽門螺桿菌感染的應(yīng)用，(c)藥用組合物用于生產(chǎn)防止或治療幽門螺桿菌感染用的藥劑的應(yīng)用。
全文摘要
重組幽門螺桿菌外膜蛋白25，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應(yīng)的核苷酸序列，或，(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明具有用PCR技術(shù)克隆幽門螺桿菌基因，構(gòu)建載體對其進(jìn)行序列分析和蛋白表達(dá)，進(jìn)一步通過粘膜治藥免疫防治幽門螺桿菌感染的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61P31/00GK1654472SQ03109889
公開日2005年8月17日 申請日期2003年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月17日
發(fā)明者王繼德, 白楊, 陳燁, 但漢雷, 周殿元, 張亞歷, 張振書 申請人:南方醫(yī)院