專利名稱：一種溶解血栓的重組蛋白及其工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用基因工程方法改造尿激酶原，生產(chǎn)溶解血栓的重組蛋白及其工程菌。
背景技術(shù)：
血栓病已成為危害現(xiàn)代人類健康的重大疾病之一，僅我國每年就至少新增500萬患者。血栓類疾病不僅發(fā)病率高，而且死亡率與致殘率也很高，溶栓治療是血栓性疾病的安全而有效的手段，因此溶栓和溶栓輔助藥物的研制進(jìn)展迅速。
幾十年來，從溶栓劑開始作為藥物使用到現(xiàn)在，溶栓藥物已經(jīng)發(fā)展了三代第一代為尿激酶(u-PA)和鏈激酶(SK)，優(yōu)點(diǎn)是溶栓效果強(qiáng)烈，缺點(diǎn)在于無纖維蛋白特異性，纖溶亢進(jìn)。第二代為尿激酶原(pro-urokinase，pro-UK)、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、乙酰化纖溶酶原鏈激酶復(fù)合物(APSAC)等，具有纖維蛋白親和性，出血副作用少，再通率高。但是容易再栓塞，且t-PA治療顱內(nèi)出血發(fā)生率較高。第三代為導(dǎo)向溶栓劑(抗體導(dǎo)向、磁導(dǎo)向、小肽導(dǎo)向等)，該類溶栓劑血栓特異性高、半衰期長、可減少用藥量和副作用，正在開發(fā)和研制中。第二代尿激酶原的生物工程生產(chǎn)方法復(fù)雜，成本高。近年來，我國主要使用的溶栓藥物還是以尿激酶為主。而尿激酶的生產(chǎn)依然停留在由人尿中提取，生產(chǎn)工藝非常繁瑣，而且存在各種病原的潛在危險(xiǎn)性。因此，利用基因工程技術(shù)，大量生產(chǎn)穩(wěn)定高效具有導(dǎo)向性的溶栓藥物，對于提高療效和安全性、延長藥物半衰期，以及降低生產(chǎn)成本有重要意義。
技術(shù)內(nèi)容為了降低成本，獲得與天然尿激酶原活性相同，而生產(chǎn)工序簡化的溶解血栓藥物，本發(fā)明提供一種溶解血栓的重組蛋白，其特征在于T H C F I D Y P K K E D Y T V Y L G R S
R L N S N T Q G E M K F E V E N L I L HK D Y S A D T L A H H N D I A L L K I RS K E G R C A Q P S R T I Q T I C L P SM Y N D P Q F G T S C E I T G F G K E NS T D Y L Y P E Q L K M T V V K L I S HR E C Q Q P H Y Y G S E V T T K M L C AA D P Q W K T D S C Q G D S G G P L V CS L Q G R M T L T G I V S W G R G C A LK D K P G V Y T R V S H F L P W I R S HT K E E N G L A L上述溶解血栓的重組蛋白的基因編碼序列為ACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAGAAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCTGACACGCTTGCTCACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCTGCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACAAGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAGAATTCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAGCTGAAAATG ACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTACGGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTGTGTGCTGCTGACCCACAGTGGAAAACAGATTCCTGCCAGGGAGACTCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACTGGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGAGTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAAGAGAATGGCCTGGCCCTCTGATAG上述溶解血栓的重組蛋白可以采取以下方法獲得由人細(xì)胞提取總RNA，根據(jù)尿激酶原分子活性中心兩端的保守氨基酸序列，設(shè)計(jì)一對簡并引物，Uf15’CTGTCACCTACGTGTGTGGAGGCAG 3’、Uf25’GAGAATCGTGCGGCCGCCTATCAGAGGGCCAGGCCAT 3’其中GCGGCCGC為Not I酶切位點(diǎn)，通過RT-PCR擴(kuò)增獲取在尿激酶原分子中去掉了N端143個(gè)氨基酸，以及151-157、179-184位氨基酸編碼序列的sPA序列。選擇性地保留了尿激酶原分子活性部位的氨基酸序列，使之由原來的12對二硫鍵減少為6對，但同樣保持空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。改造后的分子缺失了尿激酶原基因的生長因子類似區(qū)(EGF-LIKE DOMAIN)、環(huán)柄區(qū)(KRINGLE)、連接區(qū)、PAI-1因子(可以結(jié)合尿激酶使之失活，引起全身纖溶激活)結(jié)合位點(diǎn)，但保留了尿激酶原的活性區(qū)(sPA)。
為了實(shí)現(xiàn)第三代導(dǎo)向溶栓劑，本發(fā)明可以這樣進(jìn)行在sPA序列5’端加上一段GZ1序列GGCCCCGTGGTGATTCTGGTTTGAAATTCCAGTGTGGTCAGGGTCCACGTCCATCTAAAATCATCGGT
GGTGAATTCACCACCATTGAAAACCAGCCATGGTTCGCTGCTATCTACCGTGTTACCTACGTTTGCGGTGGTTCTTTGATCTCTCCATGCTGGGTGATCAGCGCC。
該GZ1序列的功能為(1)可以識別、結(jié)合和活化血小板上最豐富的膜糖蛋白GP IIb/IIIa，所以它可以通過抑制纖維蛋白原與膜糖蛋白GP IIb/IIIa的結(jié)合從而抑制血小板的凝集，理論上在體內(nèi)表現(xiàn)為抗凝，起到防止灌注后再栓塞的作用。(2)對纖維蛋白有親和力，血栓中富含纖維蛋白，所以重組蛋白GZ1-sPA在體內(nèi)對血栓親和力較高。
上述溶解血栓的重組蛋白序列的基因編碼序列中的GZ1序列之氨基酸序列，其特征在于G P R G D S G L K F Q C G Q G P R P S K I I GG E F T T I E N Q P W F A A I Y R V T Y V C GG S L I S P C W V I S A通過基因工程方法獲得了重組蛋白GZ1-sPA，該重組蛋白具有對纖維蛋白的高親和力以及溶栓能力，因此有望成為新一代血栓導(dǎo)向溶栓藥物。并且該重組蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)能穩(wěn)定大量表達(dá)，其表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他表達(dá)系統(tǒng)中尿激酶原的表達(dá)量，因此通過基因工程能夠工業(yè)化大量生產(chǎn)重組蛋白。
本發(fā)明的重組蛋白GZ1-sPA的基因編碼序列為GGGCCCCGTGGTGATTCTGGTTTGAAATTCCAGTGTGGTCAGGGTCCACGTCCATCTAAAATCATCGGTGGTGAATTCACCACCATTGAAAACCAGCCATGGTTCGCTGCTATCTACCGTGTTACCTACGTTTGCGGTGGTTCTTTGATCTCTCCATGCTGGGTGATCAGCGCCACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAGAAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCTGACACGCTTGCTCACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCTGCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACAAGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAGAATTCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAGCTGAAAATGACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTACGGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTGTGTGCTGCTGACCCACAGTGGAAAACAGATTCCTGCCAGGGAGACTCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACTGGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGAGTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAAGAGAATGGCCTGGCCCTCTGATAG將重組蛋白的基因編碼序列接入質(zhì)粒pTRX中。首先通過兩次PCR反應(yīng)的方法人工合成GZ1序列。然后將GZ1序列用KpnI+BclI雙酶切，sPA用BclI+NotI雙酶切，以T4DNA連接酶在16℃下連接得到長度約為850bp的GZ1-sPA編碼序列片段，與表達(dá)載體pTRX相連，構(gòu)建重組質(zhì)粒pTRX-GZ1-sPA。
將重組質(zhì)粒pTRX-GZ1-sPA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，通過IPTG的誘導(dǎo)獲得包含體形式的分子量為43KD的融合蛋白TRX-GZ1-sPA。經(jīng)過變復(fù)性和純化等步驟，用3C蛋白酶切割后，除去TRX，得到分子量為32KD的重組蛋白GZ1-sPA。該重組蛋白不僅具有血栓高親和力，而且具有天然尿激酶原的纖溶活性，是一種新型的導(dǎo)向性溶血栓藥物。


圖1尿激酶原活性部位sPA氨基酸序列圖2前導(dǎo)肽序列GZ1基因及其氨基酸序列圖3重組質(zhì)粒pTRX-GZ1-sPA構(gòu)建的示意4重組質(zhì)粒pTRX-GZ1-sPA酶切的電泳結(jié)果圖5重組融合蛋白TRX-GZ1-sPA表達(dá)的電泳結(jié)果實(shí)施方案本發(fā)明通過以下實(shí)施例進(jìn)一步闡述。
實(shí)施例一 尿激酶原活性中心基因片段sPA的獲取用試劑盒Oligo(dT)提取人臍帶靜脈上皮細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)尿激酶原分子活性中心兩端的保守氨基酸序列，設(shè)計(jì)簡并引物Uf1、Uf2(由上海生工合成)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度約為650bp的尿激酶原活性中心基因片段sPA，其編碼的氨基酸序列見圖1。
引物Uf15’CTGTCACCTACGTGTGTGGAGGCAG 3’Uf25’GAGAATCGTGCGGCCGCCTATCAGAGGGGCCAGGCCAT 3’NotI實(shí)施例二 GZ1-sPA序列通過兩次PCR反應(yīng)合成前導(dǎo)序列GZ1，分別以P1、P2、P3、P4為引物，在5’端引入kpnl酶切位點(diǎn)和3C蛋白酶切割位點(diǎn)，在3’端引入BclI酶切位點(diǎn)，合成后的GZ1序列接在sPA片段的5’端。第一次PCR是利用P1和P2引物合成107bp的序列，第二次PCR則以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，利用P3和P4引物合成200bp的序列，并導(dǎo)入KpnI酶切位點(diǎn)。以下為四個(gè)引物的序列P1(正向)5’-AA TTC CAG TGT GGT CAG GGT CCA CGT CCA TCT AAA ATCATC GGT GGT GAA TTC ACC ACC-3’P2(反向)5’-AAC GTA GGT AAC ACG GTA GAT AGC AGC GAA CCA TGG CTGGTT TTC AAT GGT GGT GAA TT-3’P3(正向)5’-GGT ACC CTG GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCC CGT GGT GATTCT GGT TTG AAA TTC CAG TGT GGT-3’。其中GGTACC為KpnI酶切位點(diǎn)，CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC為3C蛋白酶切割位點(diǎn)。
P4(反向)5’-GGC GCT GAT CAC CCA GCA TGG AGA GAT CAA AGA ACC ACCGCA AAC GTA GGT AAC ACG GT-3’。其中TGATCA為BclI酶切位點(diǎn)。
實(shí)施例三 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將GZ1序列用KpnI+BclI雙酶切。sPA序列用BclI+NotI雙酶切，兩個(gè)片段用T4DNA連接酶連接后，插到中間載體pBluescript的NotI-KpnI雙酶切窗口。轉(zhuǎn)化宿主菌并篩選重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切電泳鑒定無誤后，進(jìn)行序列分析。
利用GZ1-sPA片段5’端的KpnI酶切位點(diǎn)，3’端的NotI酶切位點(diǎn)，將測序結(jié)果證明序列正確的GZ1-sPA片段從載體pBluescript-GZ1-sPA切下，插入pTRX表達(dá)載體的KpnI+NotI酶切窗口，構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒pTRX-GZ1-sPA(圖3)。將之轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)并篩選重組質(zhì)粒，挑出單克隆，進(jìn)行酶切鑒定，電泳結(jié)果表明其大小與目標(biāo)分子一致，長度約為850bp(見圖4，圖中“1”為DNA分子量參照，“2”為質(zhì)粒pTRX/KpnI+NotI，“3”為重組質(zhì)粒pTRX-GZ1-sPA/KpnI+NotI)。
實(shí)施例四 重組蛋白的表達(dá)與純化上述含有重組質(zhì)粒pTRX-GZ1-sPA的大腸桿菌已保存在“中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)”，保存號為CCTCC NOM203008將含有重組質(zhì)粒pTRX-GZ1-sPA的大腸桿菌接種到20ml普通LB培養(yǎng)液中，37℃震搖12～20小時(shí)，轉(zhuǎn)接到100ml加富LB培養(yǎng)基中，37℃震搖生長到OD600＝0.5～1.5時(shí)，在20～30C使用IPTG誘導(dǎo)7-15小時(shí)，獲得大量包含體形式的融合蛋白(見圖5中的“3、5”)，與預(yù)期約43KD的分子量大小一致。離心棄上清，超聲法破碎細(xì)胞后離心收集沉淀。洗滌雜蛋白后，12,000rpm離心10分鐘收集沉淀。變性劑溶解包含體蛋白后收集上清。2.5M尿素對上清進(jìn)行復(fù)性。為了純化重組尿激酶原，利用了融合蛋白上的6個(gè)組氨酸親和位點(diǎn)，采用了Ni2+的親和層析填料來進(jìn)行純化。經(jīng)10～500mmol/L咪唑洗脫可得到目的蛋白。純化后的融合蛋白純度達(dá)到90％以上。
重組蛋白GZ1-sPA的獲得經(jīng)上述純化后獲得的融合蛋白TRX-GZ1-sPA，在3C蛋白酶切割緩沖液中用3C蛋白酶進(jìn)行切割以除去TRX部分。然后以SephadexG-75純化，獲得分子量32KD的重組蛋白GZ1-sPA。
3C蛋白酶，又稱PreScission蛋白酶，是GST(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)和人鼻病毒3C蛋白酶的融合蛋白，切割位點(diǎn)在專一性的識別序列(N)LEVLFQ↓GP(C)中的QG之間，采用此蛋白酶進(jìn)行切割，酶切后的重組尿激酶原蛋白N端會多出GP兩個(gè)氨基酸殘基(設(shè)計(jì)時(shí)將之包含在GZ1序列中)。
權(quán)利要求
1.一種溶解血栓的重組蛋白的氨基酸序列，其特征在于T H C F I D Y P K K E D Y I V Y L G R SR L N S N T Q G E M K F E V E N L I L HK D Y S A D T L A H H N D I A L L K I RS K E G R C A Q P S R T I Q T I C L P SM Y N D P Q F G T S C E I T G F G K E NS T D Y L Y P E Q L K M T V V K L I S HR E C Q Q P H Y Y G S E V T T K M L C AA D P Q W K T D S C Q G D S G G P L V CS L Q G R M T L T G I V S W G R G C A LK D K P G V Y T R V S H F L P W I R S HT K E E N G L A L
2.一種權(quán)利要求1所述溶解血栓的重組蛋白的基因編碼序列ACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAGAAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCTGACACGCTTGCTCACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCTGCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACAAGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAGAATTCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAGCTGAAAATG ACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTACGGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTGTGTGCTGCTGACCCACAGTGGAAAACAGATTCCTGCCAGGGAGACTCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACTGGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGAGTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAAGAGAATGGCCTGGCCCTCTGATAG
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述溶解血栓的重組蛋白的基因編碼序列，其特征在于在序列5’端加上一段GZ1序列GGCCCCGTGGTGATTCTGGTTTGAAATTCCAGTGTGGTCAGGGTCCACGTCCATCTAAAATCATCGGTGGTGAATTCACCACCATTGAAAACCAGCCATGGTTCGCTGCTATCTACCGTGTTACCTACGTTTGCGGTGGTTCTTTGATCTCTCCATGCTGGGTGATCAGCGCC。
4.一種權(quán)利要求3所述溶解血栓的重組蛋白的基因編碼序列中的GZ1序列之氨基酸序列，其特征在于G P R G D S G L K F Q C G Q G P R P S K I I G GE F T T I E N Q P W F A A I Y R V T Y V C G G SL I S P C W V I S A
5.一種含有權(quán)利要求2或3所述的溶解血栓的重組蛋白基因編碼序列的重組質(zhì)粒，其特征在于將重組蛋白的基因編碼序列接入質(zhì)粒pTRX中。
6.一種含有權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒的大腸桿菌，其特征在于將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用基因工程方法改造尿激酶原，生產(chǎn)溶解血栓的重組蛋白及其工程菌。如右式該重組蛋白選擇性地保留了尿激酶原分子活性部位的氨基酸序列，使之由原來的12對二硫鍵減少為6對，但同樣保持空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和溶栓能力。
文檔編號A61P7/00GK1534094SQ03114009
公開日2004年10月6日 申請日期2003年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月28日
發(fā)明者吳文言, 楊曉儀, 林鍵 申請人:中山大學(xué)