專利名稱：朊病毒體外抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及朊病毒體外抑制劑。具體涉及用天然植物多酚制備的或含有植物多酚的朊病毒體外抑制劑，即用天然植物多酚制備的對(duì)導(dǎo)致人和動(dòng)物海綿狀腦病的朊病毒的體外抑制劑，如對(duì)導(dǎo)致瘋牛病、羊瘙癢病、克雅氏病和新變異型克雅氏病的朊病毒的體外抑制劑。
背景技術(shù)：
朊病毒，也稱毒蛋白，是特別定義一類引起神經(jīng)性疾病，具體是引起傳播(感染)性海綿狀腦病如克雅氏病、新變異型克雅氏病、瘋牛病、羊瘙癢病等疾病的蛋白質(zhì)。朊病毒通常存在于人、牲畜、動(dòng)物的大腦和其他組織中，這些組織尤其是腦組織中的蛋白質(zhì)(朊蛋白)，由于特殊原因的作用引起結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而致使人和動(dòng)物患神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為海綿狀腦病?；疾〉娜撕蛣?dòng)物的腦組織形成海綿狀空洞，導(dǎo)致腦萎縮、精神錯(cuò)亂、癡呆等癥狀，最終死亡。
朊病毒具有獨(dú)特的特性，主要有(1)朊病毒沒有核酸，卻可使正常的蛋白質(zhì)由良性轉(zhuǎn)為惡性，由不具感染性轉(zhuǎn)化為感染性；(2)朊病毒沒有病毒的形態(tài)，呈纖維狀；(3)朊病毒對(duì)傳統(tǒng)意義的所有殺滅病毒的物理化學(xué)因素均有抵抗力，現(xiàn)在的消毒方法對(duì)其無(wú)效，只有在136℃高溫和兩個(gè)小時(shí)的高壓下才能將其滅活；(4)朊病毒潛伏期長(zhǎng)，從感染到發(fā)病一般為幾個(gè)月，有的可達(dá)幾年甚至幾十年，而一旦出現(xiàn)癥狀半年到一年100％死亡；(5)診斷困難，機(jī)體感染后患者體內(nèi)不產(chǎn)生免疫反應(yīng)和抗體，不發(fā)熱，不出現(xiàn)炎癥癥狀，因此不易監(jiān)測(cè)。
朊病毒引起的疾病(也稱朊病毒疾病或毒蛋白疾病)為可傳播(或可傳染)的海綿狀腦病，簡(jiǎn)稱TSE(rtansmissible spongiformencephalopathy，)。動(dòng)物患有的海綿狀腦病主要包括牛的海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy，簡(jiǎn)稱BSE)，或稱瘋牛病(Mad CowDisease)；羊瘙癢病(sheep scrapie或scrapie)；貂傳染性腦病(TME)；糜鹿的慢性消耗性疾病。人患有的海綿狀腦病主要包括克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease，簡(jiǎn)稱CJD)；新變異型克雅氏病(new variantCreutzfeldt-Jakob disease簡(jiǎn)稱nvCJD或vCJD)；庫(kù)魯病(又稱震顫病)；格斯特曼氏病；致死性家族性失眠癥?，F(xiàn)已證明瘋牛病、羊瘙癢病和人的克雅氏病、新變異型克雅氏病、庫(kù)魯病等朊病毒疾病可通過食物、輸血、手術(shù)器具、注射器具等多種方式傳染。
朊病毒和所致海綿狀腦病，尤其是瘋牛病、克雅氏病和新變異型克雅氏病已引起全世界的恐慌，對(duì)全世界的經(jīng)濟(jì)造成了巨大的損失，由此引起相當(dāng)嚴(yán)重的社會(huì)問題。
由于朊病毒具有異常獨(dú)特的性質(zhì)，目前全世界可以抗朊病毒和抑制朊病毒的有效化合物很少，而且其生物適應(yīng)性也存在一些問題。由于人類的醫(yī)學(xué)用品和生物用品許多材料來(lái)源于動(dòng)物，這些用品的安全就成為關(guān)注的問題。因此，尋找和研究抗朊病毒和抑制朊病毒的方法顯得尤其重要。
植物多酚(Plant polyphenol)是天然多酚，是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚化合物，其結(jié)構(gòu)已有充分的鑒定和研究，一般將分子量大于500的稱為鞣質(zhì)或單寧。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，植物多酚(尤其特指植物鞣質(zhì))可分為水解類和縮合類兩大類型，前者是沒食子酸及其衍生物與葡萄糖或多元酚主要通過酯鍵形成的化合物，如五倍子鞣質(zhì)；后者是以黃烷-3-醇為基本結(jié)構(gòu)單元的縮合物，如落葉松樹皮中所含多酚(鞣質(zhì))。水解類多酚(鞣質(zhì))的特點(diǎn)是遇酸、堿或酶易水解，同時(shí)生成小分子量的產(chǎn)物；而縮合類多酚(鞣質(zhì))在酸、堿或酶作用下，易于發(fā)生分子間的縮合，產(chǎn)生大分子產(chǎn)物。
植物多酚(鞣質(zhì))由于其自身的多酚羥基結(jié)構(gòu)，決定了它具有較強(qiáng)的化學(xué)和生理活性，主要性質(zhì)有與蛋白質(zhì)、生物堿、多糖結(jié)合以及與金屬離子絡(luò)合。
植物多酚的種類很多，但是作為提取物形態(tài)的多酚種類則較少，用作藥用的多酚提取物更少。對(duì)于這些植物多酚和其提取物的藥用價(jià)值，主要可以概括為抗腫瘤、降血脂、降血糖、降血壓、降膽固醇、抗動(dòng)脈粥樣硬化、預(yù)防和治療心腦血管疾病，抗菌、抗炎癥、抗自由基。另外，一些多酚提取物(如茶多酚、葡萄多酚)也作為食品抗氧化劑使用。
本申請(qǐng)人曾就植物多酚用于制備治療和預(yù)防朊病毒所致海綿狀腦病，尤其是用于制備治療和預(yù)防瘋牛病、羊瘙癢病、克雅氏病和新變異型克雅氏病的藥物和保健品提出過發(fā)明專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)朠CT/CN02/00046、WO 02/92110A1)。該項(xiàng)申請(qǐng)雖然涉及了用植物多酚為活性成份制備藥物和保健品治療和預(yù)防朊病毒疾病，但是，其涉及范圍是(1)治療和預(yù)防朊病毒疾病的藥物和保健品，(2)此藥物和保健品用于人和動(dòng)物體內(nèi)抗朊病毒，準(zhǔn)確地講是經(jīng)口服、透皮、注射、直腸或非腸道給藥到人和動(dòng)物身體用以在人和動(dòng)物身體內(nèi)抗朊病毒，由此治療和預(yù)防朊病毒疾病。因此，該項(xiàng)發(fā)明申請(qǐng)沒有涉及含天然植物多酚的在體外使用的對(duì)朊病毒的消毒、滅活和抑制的抑制劑，或者說沒有涉及除人和動(dòng)物藥物、保健品形態(tài)之外的朊病毒抑制劑，如沒有涉及作為血液滅毒劑、手術(shù)器具消毒劑等，也就是說，沒有涉及朊病毒的體外抑制劑。
到目前為止，也未見其他的關(guān)于用天然植物多酚作為活性成份制備的體外朊病毒抑制劑的報(bào)道和記載。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用植物多酚或植物植物多酚提取物制備的用于體外抗朊病毒的朊病毒體外抑制劑。
本發(fā)明根據(jù)蛋白質(zhì)及朊病毒的特性進(jìn)行研究，從而設(shè)計(jì)朊病毒體外抑制劑。
朊病毒的本質(zhì)是蛋白質(zhì)的變異或變異(結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能變異的)的蛋白質(zhì)，這種變異的結(jié)果是惡性的，對(duì)人和牲畜是致命的。由于(1)朊病毒無(wú)核酸，只是蛋白質(zhì)在起作用，(2)變異的蛋白質(zhì)只是結(jié)構(gòu)的改變，而朊病毒仍作為蛋白質(zhì)這一本性尚未發(fā)現(xiàn)有改變，因此，作為抑制劑的活性成份起作用的方式應(yīng)直接對(duì)蛋白質(zhì)作用，這樣的作用至少應(yīng)體現(xiàn)在如下的一個(gè)或多個(gè)方面(1)恢復(fù)或還原變異蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能；(2)阻止或延緩變異蛋白質(zhì)傳染其他蛋白質(zhì)，或者阻止或延緩變異蛋白質(zhì)的增殖或復(fù)制；(3)鞏固正常蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，保護(hù)其不受變異蛋白質(zhì)的傳染或延緩其傳染速度。(4)與正常蛋白質(zhì)、多糖等大分子結(jié)合后，防止和減輕朊病毒的附著與粘連。
對(duì)蛋白質(zhì)最有影響的天然化合物是植物多酚(polyphenol)類物質(zhì)，這在理論上已經(jīng)得到普遍的認(rèn)可。在實(shí)際的應(yīng)用上也得到充分說明，典型事例是用植物多酚(植物鞣質(zhì)或植物單寧)將生皮鞣制成革，幾乎全世界都將植物多酚作為傳統(tǒng)鞣劑。而其他的植物成分不能象多酚那樣與蛋白質(zhì)發(fā)生如此強(qiáng)烈和如此具有影響的作用，這已在千百年來(lái)人類的實(shí)踐中得到充分證明，在理論上也得到了充分的研究。
需要特別說明的是，在植物多酚的醫(yī)學(xué)和食品應(yīng)用上，現(xiàn)有的研究者更多的是強(qiáng)調(diào)植物多酚(polyphenol)尤其是茶多酚、葡萄多酚和松樹多酚的抗氧化作用，并更多地將這類多酚作為抗氧化劑和自由基清除劑使用。由于多酚具有羥基，有明顯的供氫作用，確實(shí)是一種抗氧化劑。而多酚的最為重要的特性不是抗氧化作用，而是與蛋白質(zhì)結(jié)合從而產(chǎn)生的特殊作用。許多研究資料說明，多酚與蛋白質(zhì)相互結(jié)構(gòu)的作用，或與蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用或?qū)Φ鞍踪|(zhì)的鞣化作用是其顯著特征。有研究資料表明，多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性和物理穩(wěn)定性增加。植物多酚用作藥物，其絕大多數(shù)藥理作用的根據(jù)也在于與蛋白質(zhì)發(fā)生的作用。比如茶多酚、葡萄多酚、松樹多酚的抗炎癥、抗菌、抗病毒、抗癌、除臭等作用就是多酚與蛋白質(zhì)作用在藥理上的典型表現(xiàn)。多酚的抗菌作用在于多酚類物質(zhì)能沉淀菌體蛋白，使菌體蛋白變性而失活。有研究人員研究了五倍子體外實(shí)驗(yàn)對(duì)多種球菌(葡萄球菌、鏈球菌)及桿菌(傷寒、副傷寒、痢疾、炭疽、白喉、綠膿、大腸桿菌)的抑菌、殺滅作用，發(fā)現(xiàn)其抗菌作用是由于所含的鞣質(zhì)凝固蛋白所致。茶多酚的防齲作用也是多酚與致齲菌蛋白質(zhì)結(jié)合而殺滅菌體的結(jié)果。
因此，植物多酚類物質(zhì)表現(xiàn)出來(lái)的最重要的性質(zhì)主要是與蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生膠聯(lián)，也稱鞣化。
植物多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合的另一個(gè)重要效果是，多酚與蛋白質(zhì)形成交聯(lián)后，可以防止和減輕其他致病物的附著和粘連。有研究表明，植物多酚作用于粘膜和創(chuàng)面潰瘍，可使蛋白質(zhì)沉淀凝固，成為不溶解的化合物，并形成薄膜，將患部覆蔽，防止受到新的感染，也防止致病物的再度侵襲。日本的研究表明，茶葉中的兒茶素抑制流感病毒活性的機(jī)理是，流感主要是病毒附著在鼻子和嗓子中突起的粘膜細(xì)胞上不斷增殖而致病，兒茶素能夠覆蓋在突起的粘膜細(xì)胞上，防止流感病毒和粘膜結(jié)合，并殺死病毒。還有研究表明，茶多酚可以抑制細(xì)菌在牙齒表面的粘附。研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用含茶多酚的漱口劑時(shí)可以抑制牙周炎病菌粘附在口腔細(xì)胞上。
特別重要的一個(gè)效果是，優(yōu)選的作為藥用的植物多酚，主要是小分子量的多酚(如茶多酚、葡萄多酚和松樹多酚)，對(duì)人體甚至生物體似乎具有特殊的選擇性的積極性意義。表現(xiàn)在這類多酚對(duì)正常細(xì)胞和正常蛋白質(zhì)起著保護(hù)作用，而對(duì)異常細(xì)胞及其蛋白質(zhì)卻起著破壞作用。這在茶多酚、葡萄多酚和松樹多酚的理論研究和實(shí)際應(yīng)用中已得到較充分的說明。這類多酚有著廣范的治療作用，而對(duì)正常的物質(zhì)成分和人的生理尚未發(fā)現(xiàn)不良影響。以茶多酚為代表的植物多酚在中國(guó)，日本，意大利及其它眾多國(guó)家的研究和應(yīng)用說明了此問題，以葡萄多酚和松樹多酚為代表的植物多酚(理論上通常以原花青素表示，商業(yè)上常以“葡樂安”、“碧蘿芷”表示)在德國(guó)、法國(guó)、意大利、美國(guó)、日本、印度、匈牙利、韓國(guó)等不少國(guó)家的研究和應(yīng)用也說明了此問題。典型的是茶多酚、葡萄多酚和松樹多酚可以抑制細(xì)菌和有害微生物，而對(duì)于有益微生物則沒有影響。比如，茶多酚與正常細(xì)胞膜的結(jié)合，可以穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，而對(duì)于病變細(xì)胞如癌細(xì)胞膜，其鞣化結(jié)果則有破壞作用。茶多酚在強(qiáng)烈抑制致齲菌、明顯減少菌斑和牙周指數(shù)的同時(shí)，對(duì)口腔中其他有益微生物卻沒有影響。
優(yōu)選的植物多酚的優(yōu)良作用對(duì)離體細(xì)胞和器官也表現(xiàn)出同樣卓越的作用。日本對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞和器官的保存的研究表明，通過向細(xì)胞培養(yǎng)液或器官保存液中添加兒茶素類植物多酚，可以使細(xì)胞和器官保存時(shí)間比現(xiàn)有的保存劑提高數(shù)倍。其保存的細(xì)胞和器官及其廣范，其試驗(yàn)明確確認(rèn)多酚可使蛋白質(zhì)穩(wěn)定性提高。
本發(fā)明的朊病毒體外抑制劑，其中的有效成份植物多酚提取物可以是任何種類的植物多酚，植物多酚都可以選用，優(yōu)選的是茶葉提取物茶多酚(Tea polyphenols)和茶兒茶素(tea catechins)；葡萄籽和葡萄皮提取物葡萄多酚(Grape polyphenols)；松樹皮提取物松樹多酚(pine polyphenols)；兒茶提取物兒茶素(catechins)、蘋果提取物蘋果多酚(apple polyphenol)，姜黃提取物姜黃素(curcumin)。
茶多酚是茶葉中提取的多酚類物質(zhì)的混合物，含有多種多酚成分，包括兒茶素、黃酮甙類、花青甙類、酚酸類等三十多種多酚成分，屬于酚羥基天然酚類化合物。
茶兒茶素是茶多酚的主體成分，約為茶多酚的60-80％，其中的單體主要有(-)表兒茶素沒食子酸脂(L-ECG)C22H18O10、(-)表沒食子兒茶素3-沒食子酸脂(L-EGCG)C22H18O11、(+)兒茶素(D，L-C)C15H14O6、(-)表兒茶素(L-EC)C15H14O4、(+)沒食子兒茶素(D，L-GC)、(-)表沒食子兒茶素(L-EGC)，C15H14O7以及GCG、CG?，F(xiàn)已有從茶葉中或從茶多酚中提取的茶兒茶素的產(chǎn)品。
兒茶素是中藥兒茶的主要成分，其功效與茶兒茶素相似，并已有兒茶素提取物商品。
葡萄多酚也稱葡萄原花青素(Grape Procyanidins)，松樹多酚也稱松樹原花青素(Pine Procyanidins)，屬于酚羥基天然酚類化合物。原花青素(Procyanidins，簡(jiǎn)稱PC，其它英文名有proanthocyanidins，leucoanthocyanidins，pycnogenol)，是植物中廣泛存在的一大類多酚化合物的總稱。一般而言，多酚化合物在酸性介質(zhì)中加熱可產(chǎn)生花青素(cyanidins)，因此，通常將這類可產(chǎn)生花青素的多酚化合物命名為原花青素。原花青素是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成。最簡(jiǎn)單的原花青素是兒茶素或表兒茶素或兒茶素與表兒茶素形成的二聚體，此外還有三聚體、四聚體等直至十聚體。按聚合度的大小，通常將二～四聚體稱為低聚體(procyanidolic oligomers，簡(jiǎn)稱OPC)，將五聚體以上的稱為高聚體(procyanidolic polymers，簡(jiǎn)稱PPC)。
本發(fā)明用于制備朊病毒體外抑制劑的植物多酚提取物包括原花青素。
本發(fā)明用于制備朊病毒體外抑制劑的植物多酚，包括植物多酚提取物的各種單體，優(yōu)選的是茶多酚中的各種單體、茶兒茶素中的各種單體、葡萄多酚中的各種單體、松樹多酚中的各種單體、兒茶素中的各種單體、蘋果多酚中的各種單體、姜黃素單體。
本發(fā)明用于制備朊病毒體外抑制劑的植物多酚，也包括植物多酚提取物各單體的聚合物和/或衍生物，優(yōu)選的是茶多酚、茶兒茶素、葡萄多酚、松樹多酚、兒茶素、蘋果多酚、姜黃素各單體的聚合物和/或衍生物。這些聚合物和/或衍生物主要有茶色素(Tea pigment)、葡萄花青素(Grape cyanidins)、松樹花青素(Pain cyanidins)、兒茶色素(catechin pigment)、蘋果花青素(apple cyanidins)、去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin)、二去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin)。
本發(fā)明用于制備朊病毒體外抑制劑的植物多酚，還包括各種植物多酚提取物的混合物，具體指各種植物多酚提取物單體、各單體的聚合物和/或衍生物以及各種多酚的混合物。優(yōu)選的是茶多酚、茶兒茶素、葡萄多酚、松樹多酚、兒茶素、蘋果多酚、姜黃素各單體和各單體的聚合物和/或衍生物以及其中各種多酚的混合物。
植物多酚提取物的聚合物和衍生物是由植物多酚提取物通過物理、化學(xué)等方法所獲得的。茶色素通常是茶多酚或茶兒茶素經(jīng)氧化后獲得，包括茶黃素、茶紅素和茶褐素。茶多酚和兒茶素溶液漫熱時(shí)或在酶、酸、堿的作用下，自身可氧化縮合成不同程度的縮合產(chǎn)物；兒茶色素由兒茶素氧化后獲得；葡萄花青素、松樹花青素和蘋果花青素通常由葡萄多酚(或葡萄原花青素)、松樹多酚(或松樹原花青素)和蘋果多酚(或蘋果原花青素)在酸性介質(zhì)中加熱生成。
這些植物多酚的提取物及其聚合物、衍生物的制取方法有多種，并有多種報(bào)道，屬于已知技術(shù)和成熟工藝，并已有商品出售。
用這些方法和用其他方法得到的植物多酚提取物和其聚合物、衍生物都可用作朊病毒的體外抑制劑。
本發(fā)明的含有天然植物多酚的朊病毒體外抑制劑，可以在體外滅活或抑制包括所有引起海綿狀腦病的朊病毒，主要有導(dǎo)致瘋牛病的朊病毒、導(dǎo)致羊瘙癢病的朊病毒、導(dǎo)致貂傳染性腦病的朊病毒、導(dǎo)致糜鹿的慢性消耗性疾病的朊病毒、導(dǎo)致人類克雅氏病的朊病毒、導(dǎo)致人類新變異型克雅氏病的朊病毒、導(dǎo)致庫(kù)魯病的朊病毒、導(dǎo)致格斯特曼氏病的朊病毒、導(dǎo)致致死性家族性失眠癥的朊病毒。
本發(fā)明的植物多酚和多酚提取物及其聚合物和/或衍生物是朊病毒體外抑制劑的活性成分，在制備本發(fā)明提出的朊病毒體外抑制劑時(shí)，植物多酚和其聚合物、衍生物可以單用一種，也可以混合使用兩或多種，也可以與其他非植物多酚成份合用。
本發(fā)明的植物多酚提取物作為朊病毒體外抑制劑活性成份時(shí)，可以植物多酚單獨(dú)使用，也可以按照常規(guī)的制備工藝，以植物多酚為主活性組份，加入一種或多種常規(guī)的賦形劑、防腐劑、潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、粘合劑、溶劑、增稠劑、增溶劑等輔料，制成任何一種適合使用的劑型，如固體、液體(溶液、懸浮液、乳液劑)、霜?jiǎng)?、膏劑、糊劑、凝膠劑、軟膏劑型等。
本發(fā)明的植物多酚制成朊病毒體外抑制劑，抑制劑中天然植物多酚的含量為0.0001％至100％，在不同的劑型中可選擇不同含量，液體劑型或乳液劑型優(yōu)選為5％至50％；固體劑型優(yōu)選為20％至99％。植物多酚抑制朊病毒的濃度為0.00005％至50％，優(yōu)選為0.0005％至10％。
本發(fā)明的朊病毒體外抑制劑所稱的“體外”，指的是人、動(dòng)物、牲畜的“活體之外”?！盎铙w之外”的意思是僅僅排除人、動(dòng)物、牲畜活體本身或活體本體，并不排除植物活體，不排除動(dòng)物尸體，也不排除人、動(dòng)物、牲畜活體的離體器官、離體細(xì)胞以及其他具有活性的物質(zhì)。也就是說，本發(fā)明的朊病毒體外抑制劑的適用范圍是除了人、動(dòng)物、牲畜活體本身或活體本體之外的一切范圍。
本發(fā)明的朊病毒體外抑制劑的適用范圍包括人、動(dòng)物、牲畜自然死亡、偶然死亡、因病死亡、其他死亡和宰殺后的尸體；包括人、動(dòng)物、牲畜的離體器官和細(xì)胞；包括具有生物活性的離體蛋白及制品；包括離體的基因及制品；包括植物活體；包括除人、動(dòng)物、牲畜活體本身或活體本體之外的一切領(lǐng)域。
本發(fā)明的朊病毒體外抑制劑，可用于需要在體外抗朊病毒、對(duì)朊病毒進(jìn)行體外滅活、或體外抑制的各種化合物、物質(zhì)、原料、材料、半成品、制品、產(chǎn)品、商品以及各種物件、物品。
本發(fā)明的朊病毒體外抑制劑，可用于生物制劑、生物制品、血液及其制品、蛋白質(zhì)及其制品、激素、基因及其制品；可用于消毒劑、滅菌劑；可用于各種醫(yī)療器具，如手術(shù)器具、注射器具等的朊病毒滅活和抑制；可用于保存劑、保鮮劑；可用于各種化妝品(口紅、霜膏、護(hù)膚品、護(hù)發(fā)用品、毛發(fā)用品、香水、指甲涂抹劑)、洗浴用品、洗滌用品、洗漱用品；可用于植物的肥料、殺蟲劑、促生長(zhǎng)劑；可用于對(duì)食品、副食品、調(diào)味品、酒、飲料、糖果、飼料及其這些產(chǎn)品的原料和加工介質(zhì)在體外(即在食用前)進(jìn)行朊病毒的滅活和抑制；可用于烹飪食物的水、油和各種介質(zhì)中，在烹飪過程中滅活和抑制朊病毒；可用于水果、干果、蔬菜和其他農(nóng)副產(chǎn)品在食用前進(jìn)行朊病毒的滅活和抑制；可用于衣物、布料及各種生活用品和用具的朊病毒滅活和抑制；可用于各種產(chǎn)品和原料的包裝材料和包裝用品的朊病毒滅活和抑制；還可用于對(duì)包括水源、草場(chǎng)、牧場(chǎng)等在內(nèi)的環(huán)境進(jìn)行朊病毒的消毒、滅活和抑制。
除了上述從植物中得到的多酚提取物，本發(fā)明還可以直接使用包含多酚成分的原植物。使用時(shí)，可以使用原植物，也可以對(duì)原植物進(jìn)行加工使用；可以用原植物為成分制備抑制劑，還可以直接向需要滅活或抑制朊病毒的原料、半成品、制品、物品、物質(zhì)、產(chǎn)品、商品以及其他各種物品中或其清洗劑、洗滌劑、消毒劑、保存劑、處理劑、保鮮劑及其他清洗介質(zhì)中添加。
由于本發(fā)明首次公開了含植物多酚的朊病毒體外抑制劑，因此，將植物多酚單獨(dú)或與其它活性組份或輔料配合制作制劑，只要該制劑用于體外抑制或滅活朊病毒，則屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的植物多酚在制成任何一種劑型時(shí)，均具有體外抑制或滅活朊病毒的作用。任何劑型和產(chǎn)品，如果其組份中含有植物多酚或僅以植物多酚制備，在其包裝或說明書等標(biāo)識(shí)上，以及在其他任何宣傳品上，只要注明或提示具有體外抗朊病毒，或體外抑制或滅活朊病毒的作用，則落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明還提供一種體外抗朊病毒、滅活或抑制朊病毒的抑制劑的使用方法，即在需要滅活或抑制朊病毒的原料、半成品、制品、物品、物質(zhì)、產(chǎn)品、商品以及其他各種物品中或其清洗劑、洗滌劑、消毒劑、保存劑、處理劑、保鮮劑及其他清洗介質(zhì)中添加含有植物多酚的原植物和/或多酚提取物和/或多酚提取物的聚合物和衍生物。這些植物主要有茶葉、葡萄籽、葡萄皮、松樹皮、兒茶、蘋果、姜黃。這些提取物主要有茶多酚、茶兒茶素、葡萄多酚、松樹多酚、兒茶素、蘋果多酚、姜黃素。這些多酚提取物的聚合物和衍生物主要有茶色素、葡萄花青素、松樹花青素、兒茶色素、蘋果花青素、去甲氧基姜黃素、二去甲氧基姜黃素。
可以添加這些植物或植物提取物或聚合物或衍生物的一種，也可以添加兩種或多種。其作用是體外滅活或抑制朊病毒。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1配方茶多酚1000克以茶多酚為原料，包裝，每袋20克，制成抑制劑50袋。
實(shí)施例2配方葡萄多酚 600克茶多酚400克將上述組份攪拌均勻，包括，每袋20克，制得含葡萄多酚和茶多酚的抑制劑50袋。
實(shí)施例3配方松樹多酚 700克茶多酚300克將上述組份攪拌均勻，包裝，每袋20克，制成含松樹多酚和茶多酚的抑制劑50袋。
實(shí)施例4配方蘋果多酚 500克松樹多酚 400克去甲氧基姜黃素 100克將上述組份攪拌均勻，包裝，每袋20克，制成含蘋果多酚、松樹多酚和去甲氧基姜黃素的抑制劑50袋。
實(shí)施例5配方葡萄花青素 500克蘋果花青素 400克姜黃素 100克將上述組份攪拌均勻，包裝，每袋20克，制成含葡萄花青素、蘋果花青素和姜黃素的抑制劑50袋。
實(shí)施例6配方松樹花青素 500克茶色素 500克將上述組份攪拌均勻，包裝，每包20克，制得含松樹花青素和茶色素的抑制劑50包。
實(shí)施例7配方茶多酚 400克葡萄花青素 300克松樹花青素 300克將上述組份攪拌均勻，包裝，每包20克，制得茶多酚、葡萄花青素和松樹花青素的抑制劑50包。
實(shí)施例8配方葡萄多酚 400克松樹多酚 300克茶色素300克將上述組份攪拌均勻，包裝，每包20克，制得葡萄多酚、松樹多酚和茶色素的抑制劑50包。
實(shí)施例9松樹多酚 1000克蒸餾水3000毫升將松樹多酚溶于蒸餾水中攪拌混勻，裝瓶，每瓶裝100克，滅菌，制得含松樹多酚的液體抑制劑40瓶。
實(shí)施例10茶多酚1500克葡萄多酚 1000克蒸餾水5500毫升將茶多酚和葡萄多酚溶于蒸餾水中攪拌混勻，裝瓶，每瓶裝100克，滅菌制得含茶多酚和葡萄多酚的液體抑制劑。
本發(fā)明的植物多酚用作朊病毒體外抑制劑的生物適應(yīng)性茶多酚、葡萄多酚和松樹多酚已在許多國(guó)家有相當(dāng)充分的藥理研究和應(yīng)用，現(xiàn)有研究證明應(yīng)用這類多酚是相當(dāng)安全的。
優(yōu)選多酚的使用安全性不少國(guó)家對(duì)茶多酚、葡萄多酚、松樹多酚、蘋果多酚和姜黃素進(jìn)行了深入的毒理學(xué)研究。其結(jié)果證實(shí)這類多酚使用是安全的。如對(duì)茶多酚的急性和慢性毒理研究結(jié)果是大鼠和小鼠口服茶多酚的LD50為2499mg/Kg，動(dòng)物長(zhǎng)期服用茶多酚未出現(xiàn)體重、血常規(guī)、肝腎功能及臟器組織的毒性變化；不少國(guó)家對(duì)葡萄多酚和松樹多酚(以原花青素表示)的毒理研究結(jié)果是大鼠和小鼠口服原花青素的LD50均在4000mg/Kg以上，無(wú)任何副作用且耐受良好。無(wú)致畸、致突變作用。對(duì)蘋果多酚和姜黃素的研究是，這類植物多酚幾乎無(wú)毒。
本發(fā)明的植物多酚體外抑制朊病毒實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)由申請(qǐng)人與美國(guó)研究人員合作進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)在美國(guó)完成。
本實(shí)驗(yàn)用的植物多酚為茶多酚，其茶多酚由無(wú)錫世紀(jì)生物工程有限公司提供，茶多酚含量為99％，其中兒茶素含量87％，主要兒茶素單體含量為分類兒茶素名稱 簡(jiǎn)稱在茶多酚中的％分子式 分子量非酯型兒茶素(+)兒茶素 D，L-C 0.6％ C15H14O6290(-)表兒茶素L-EC6.6％ C15H14O4258(+)沒食子兒茶素D，L-GC 0.3％(-)表沒食子兒茶素 L-EGC 6％ C15H14O7306GCG 3.4％CG 0.6％酯型兒茶素(-)表兒茶素沒食子酸脂L-ECG 14.7％C22H18O10442(-)表沒食子兒茶素3-沒食子酸脂 L-EGCG 55％ C22H18O11458說明咖啡因＜0.4％平均分子量約為403-417。
其中顯示了茶多酚的總含量、兒茶素的總含量，以及兒茶素的主要單體的含量、分子量。以此衡量茶多酚的品質(zhì)和計(jì)量其平均分子量是較為準(zhǔn)確的。
實(shí)驗(yàn)的方式是，用羊瘙癢癥感染的(scrapie-infected)的細(xì)胞培養(yǎng)篩選化合物系統(tǒng)，測(cè)定茶多酚在體外對(duì)PrPsc的抑制效果。本系統(tǒng)使用的細(xì)胞是感染羊瘙癢癥的小鼠neuroblastoma細(xì)胞。
將茶多酚溶解、稀釋，制成供實(shí)驗(yàn)用的不同濃度的溶液。
將制成的茶多酚溶液直接加至細(xì)胞培養(yǎng)基以測(cè)試其對(duì)PrPSc的抑制活性，并用dot blot技術(shù)分析PrP。
在分析測(cè)定前，細(xì)胞孵化(培育)5天。
不同濃度的茶多酚溶液對(duì)PrPSc感染細(xì)胞測(cè)試效果如下濃度 對(duì)PrPres生成的抑制效果對(duì)細(xì)胞的毒性50微克/mL抑制效果很好 略有毒性5微克/mL 抑制效果很好 沒有毒性0.5微克/mL 抑制無(wú)效 沒有毒性由上可見，在濃度為5微克/mL時(shí)，茶多酚對(duì)PrPSc的抑制效果很好，且對(duì)細(xì)胞沒有毒性。
本實(shí)驗(yàn)的茶多酚的平均分子量為403-417，在對(duì)PrPres產(chǎn)生很好抑制效果的5微克/mL濃度時(shí)，其IC50約為5micromolar。
茶多酚作為朊病毒體外抑制劑與其他已知的抑制劑相比，抑制朊病毒的效果相當(dāng)好。已發(fā)現(xiàn)對(duì)朊病毒具有抑制效果的化合物僅有少數(shù)幾種，其中一些生物適應(yīng)性存在問題，公認(rèn)的具有潛在應(yīng)用價(jià)值的有剛果紅(化學(xué)染料)、氯丙嗪(治療精神病的藥物)和阿的平(治療虐疾的藥物)。但是這幾種化合物是化學(xué)合成物，毒性較高。而茶多酚是茶葉的提取物，安全度很高。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明擴(kuò)大了天然植物多酚的應(yīng)用范圍，提高了其開發(fā)價(jià)值。用本發(fā)明的天然植物多酚制備朊病毒體外抑制劑，方法簡(jiǎn)單、原料易得，具有工業(yè)實(shí)用性。
權(quán)利要求
1.朊病毒體外抑制劑，其特征是含有一種或一種以上的植物多酚。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制劑，其特征是所述的朊病毒，是導(dǎo)致一系列傳染性海綿狀腦病的蛋白，主要有導(dǎo)致瘋牛病的朊病毒、導(dǎo)致羊瘙癢病的朊病毒、導(dǎo)致貂傳染性腦病的朊病毒、導(dǎo)致糜鹿的慢性消耗性疾病的朊病毒、導(dǎo)致人類克雅氏病的朊病毒、導(dǎo)致人類新變異型克雅氏病的朊病毒、導(dǎo)致庫(kù)魯病的朊病毒、導(dǎo)致格斯特曼氏病的朊病毒、導(dǎo)致致死性家族性失眠癥的朊病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制劑，其特征是所述的植物多酚為茶葉提取物茶多酚、茶兒茶素和兒茶提取物兒茶素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制劑，其特征是所述的植物多酚為葡萄多酚、松樹多酚、蘋果多酚、姜黃素。
5.根據(jù)權(quán)利要求3至4任一所述的抑制劑，其特征是所述的植物多酚為植物多酚單體、聚合物和/或衍生物，包括茶多酚、茶兒茶素、葡萄多酚、松樹多酚、兒茶素、蘋果多酚、姜黃素的單體以及聚合物和/或衍生物，聚合物和/或衍生物優(yōu)選為茶色素、葡萄花青素、松樹花青素、兒茶色素、蘋果花青素、去甲氧基姜黃素、二去甲氧基姜黃素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制劑，其特征是抑制劑中植物多酚的含量為0.0001％至100％。在不同的劑型中可選擇不同含量，液體劑型或乳液劑型優(yōu)選為5％至50％；固體劑型優(yōu)選為20％至99％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制劑，其特征是植物多酚抑制朊病毒的濃度為0.00005％至50％，優(yōu)選為0.0005％至10％。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制劑，其特征是，可以植物多酚單獨(dú)使用，也可以以植物多酚為主活性組份，加入其他非多酚成分和/或一種或多種常規(guī)的賦形劑、防腐劑、潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、粘合劑、溶劑、增稠劑、增溶劑等輔料，制成任何一種適合使用的劑型，如固體、液體(溶液、懸浮液、乳液劑)、霜?jiǎng)?、膏劑、糊劑、凝膠劑、軟膏劑型等。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制劑，其特征是適用于生物制品、血液及血液制品、消毒滅菌劑、化妝品、保存劑、處理劑及一切需要進(jìn)行朊病毒體外滅活和抑制的物質(zhì)、物品和環(huán)境。
10.據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制劑，其特征是朊病毒體外抑制劑的使用方法，在需要滅活或抑制朊病毒的原料、半成品、制品、產(chǎn)品、商品和其他各種物質(zhì)、物品中以及其洗滌劑、消毒劑、保存劑、處理劑、保鮮劑及其他清洗介質(zhì)中添加含有植物多酚的原植物和/或多酚提取物和/或多酚提取物的聚合物和衍生物。這些植物主要有茶葉、葡萄籽、葡萄皮、松樹皮、兒茶、蘋果、姜黃。這些提取物主要有茶多酚、茶兒茶素、葡萄多酚、松樹多酚、兒茶素、蘋果多酚、姜黃素。這些多酚提取物的聚合物和衍生物主要有茶色素、葡萄花青素、松樹花青素、兒茶色素、蘋果花青素、去甲氧基姜黃素、二去甲氧基姜黃素?？梢蕴砑铀鲈参锘蛑参锾崛∥锘蚓酆衔锘蜓苌锏囊环N，也可以添加兩種或多種。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用植物多酚作為活性成分制備的朊病毒體外抑制劑。具體是用植物多酚制備的或含有植物多酚的朊病毒體外抑制劑，尤其是抑制海綿狀腦病的朊病毒的體外抑制劑。本發(fā)明還公開了朊病毒體外抑制劑的使用方法。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1520813SQ0311728
公開日2004年8月18日 申請(qǐng)日期2003年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月10日
發(fā)明者陳建操, 牛蓉 申請(qǐng)人:陳建操