專(zhuān)利名稱(chēng)：一種裂解致病菌的肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種裂解致病菌，尤其是耐藥性結(jié)核分枝桿菌的肽。該肽可以作為藥物單獨(dú)或者與適合藥物的組分一起裂解致病菌，從而治療致病菌感染。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的傳染病，是我國(guó)重點(diǎn)控制的重大疾病之一，也是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。近年來(lái)全球結(jié)核病疫情的回升引起了國(guó)際社會(huì)的高度重視。1993年和1998年，世界衛(wèi)生組織兩個(gè)就結(jié)核病問(wèn)題發(fā)出全球預(yù)警。當(dāng)前我國(guó)的結(jié)核病防治工作還面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。我國(guó)仍然是全球結(jié)核病嚴(yán)重流行的國(guó)家，現(xiàn)有結(jié)核病人占全球的1/4，死亡人數(shù)多，疫情下降緩慢，危害嚴(yán)重。在結(jié)核病人中，有3/4是最具有生產(chǎn)能力的青壯年。重慶市為中國(guó)結(jié)核病的第二高發(fā)區(qū)。如果我們不及時(shí)采取有效措施，結(jié)核病蔓延將進(jìn)一步加劇，已取得的結(jié)核病控制成果將付之東流，給家庭和國(guó)家造成更加嚴(yán)重的損失。對(duì)此，我們要有高度的認(rèn)識(shí)，否則要付歷史的責(zé)任[1]。
結(jié)核病防治的難點(diǎn)主要在于其致病菌-結(jié)核分枝桿菌獨(dú)特的生物學(xué)性質(zhì)[2]以及對(duì)它的基礎(chǔ)研究還很欠缺。表現(xiàn)為耐藥性愈演愈烈，結(jié)核分枝桿菌幾乎對(duì)所有的一線(xiàn)藥物都產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，同時(shí)耐兩種以上一線(xiàn)藥物的耐多藥菌株的出現(xiàn)頻率也在上升。解決結(jié)核病問(wèn)題的迅速有效措施是開(kāi)發(fā)特異性的新藥。
噬菌體是細(xì)菌的病毒，能夠特異性裂解宿主細(xì)菌。其特異性裂解細(xì)菌的酶可能是藥物開(kāi)發(fā)的理想先導(dǎo)分子。噬菌體在敏感菌株中的裂解循環(huán)末期，所有雙鏈DNA噬菌體都產(chǎn)生一種降解細(xì)菌細(xì)胞壁的裂解系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括holin和至少一種肽聚糖水解酶(peptidoglycanhydrolase)，也稱(chēng)為裂解素(lysin)。裂解素可以是1.endo-beta-N-乙酰葡萄糖胺酶；2.N-乙酰胞壁酸酶N-acetylmuramidases(溶菌酶lysozymes)，作用在糖成分上；3.內(nèi)肽酶(endopeptidases)，剪切肽鍵；4.N-乙酰胞壁?；?L-丙氨酸酰胺酶(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase)，水解連接糖和肽的酰胺鍵。Holin在噬菌體感染晚期表達(dá)，在細(xì)胞膜上打孔，允許裂解素接近細(xì)胞壁肽聚糖，最終導(dǎo)致子代噬菌體釋放。只有裂解素，無(wú)需噬菌體也能夠裂解敏感宿主菌，該現(xiàn)象稱(chēng)為“無(wú)噬菌體裂解”(lysis fromwithout)。
人體嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生一種克隆裂解肽，對(duì)結(jié)核分枝桿菌具有裂解活性，但為非特異性，對(duì)其他細(xì)菌也具有裂解活性。Staphylococcus simulans產(chǎn)生的內(nèi)肽酶lysostaphin能夠切除金黃色葡萄球菌肽聚糖的五甘氨酸交聯(lián)(pentaglycine cross bridge)。Lysostaphin對(duì)耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌引起的實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈管心內(nèi)膜炎有效[2]。
結(jié)核分枝桿菌具有裂解性噬菌體DS6A，D29[3]。國(guó)外研究目前只從病毒學(xué)的角度進(jìn)行，開(kāi)發(fā)作為結(jié)核分枝桿菌分子遺傳研究的工具，沒(méi)有研究其藥物開(kāi)發(fā)價(jià)值。研究這些噬菌體的lysin，可能將找到治療耐藥結(jié)核病新的抗生素。
參考文獻(xiàn)1.謝建平 結(jié)核分枝桿菌的后基因組研究和新型疫苗 微生物學(xué)報(bào)，2001，4151-572.Nelson D，Loomis L，F(xiàn)ischetti VA.Prevention and elimination of upper respiratorycolonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme.PNAS，2001，984107-41123.Hatfull GH，Methods in molecular biology-Mycobacteria protocols(，Tanya Parish，NeilG.Stoker，Humana Press Inc，Totowa，NJ.145-174)技術(shù)方案與技術(shù)效果本發(fā)明的目的之一是分離結(jié)核分枝桿菌裂解性噬菌體的裂解活性成分，本發(fā)明的另一目的在于將分離到的裂解肽用于結(jié)核分枝桿菌等致病菌感染的治療。
本發(fā)明主要通過(guò)分離裂解包括結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的分枝桿菌的噬菌體。大規(guī)模培養(yǎng)分離到的噬菌體，提取其裂解活性成分并鑒定其結(jié)構(gòu)和相應(yīng)功能。
實(shí)施方式菌株和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)所用菌株Mycobacterium tuberculosis H37Ra(ATCC 25 177)由重慶市肺科醫(yī)院檢驗(yàn)科MTB檢驗(yàn)室提供?？焐头种U菌為發(fā)明人分離并保存。細(xì)菌在Middlebrook7H10(Difco)添加OADC(0.5％BSA，0.2％glucose，0.06％oleic acid，140mMNaCl)的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)。在7H10固體培養(yǎng)基上連續(xù)稀釋后觀察CFU，測(cè)定細(xì)菌存活力和噬菌斑。分離噬菌體 采用環(huán)境土樣，按照文methods in molecular biology-Mycobacteria protocols(，Tanya Parish，Neil G.Stoker，HumanaPress Inc，Totowa，NJ.145-174)分離裂解性噬菌體。采集環(huán)境土樣，溶解于噬菌體緩沖液中，4℃過(guò)夜，5000g離心10min去除不可溶的碎片，上清液先后經(jīng)0.45μm和0.2μm濾膜滅菌，確定噬菌體的滴度；將100ml上清液與2L生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)早期OD＝0.2的結(jié)核分枝桿菌混合，培養(yǎng)細(xì)菌到對(duì)數(shù)晚期OD＝0.6。大規(guī)模制備噬菌體蛋白培養(yǎng)細(xì)菌，稀釋的噬菌體點(diǎn)雙層平板，過(guò)夜培養(yǎng)，加入噬菌體緩沖液，吸取溶解噬菌體的緩沖液，離心去除碎片，1M氯化鈉沉淀噬菌體，3500g離心5min，氯化銫密度梯度離心收集蛋白質(zhì)組分。
分離裂解素分離離心的各組分，逐個(gè)檢測(cè)對(duì)分枝桿菌的裂解活性。純化具有裂解活性的組分，進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定。
裂解素作用特異性的檢測(cè)分別以大腸桿菌、啤酒酵母、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌為模式，檢測(cè)裂解素對(duì)其他細(xì)菌的裂解效果。
結(jié)果分離到序列為EVTXXXSGCASECTXXTDKCNRARGG，其中X為任意氨基酸的肽對(duì)結(jié)核分枝桿菌和快生型分枝桿菌具有裂解活性，其對(duì)結(jié)核分枝桿菌的MIC值為100ug/ml。
權(quán)利要求
1.一種分離自分枝桿菌噬菌體的裂解肽，包括下列氨基酸EVTXXXSGCASECTXXTDKCNRARGG，其中X為任意氨基酸。
2.權(quán)利要求1所述的肽，肽含有至少一個(gè)修飾過(guò)的氨基酸。
3.權(quán)利要求2所述的肽，其中修飾的氨基酸在羧基末端。
4.權(quán)利要求1所述的肽，該肽對(duì)包括革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和病毒具有裂解活性。
5.權(quán)利要求4所述的肽，該肽對(duì)結(jié)核分枝桿菌具有裂解活性。
6.權(quán)利要求4所述的肽，該肽對(duì)耐藥結(jié)核分枝桿菌具有裂解活性。
7.權(quán)利要求4所述的肽，該肽對(duì)S.aureus，E.coli，C.albicans，S.typhimurium和C.neoformans具有裂解活性。
8.一種裂解致病菌，減少致病菌數(shù)量的方法，該方法包括將有效劑量的權(quán)利要求1所述的肽作為組分之一處理致病菌或感染致病菌的宿主。
9.權(quán)利要求8所述的致病菌減少包括減少90％-99％。
全文摘要
本發(fā)明提供了來(lái)自結(jié)核分枝桿菌噬菌體的新抗菌肽。該肽命名為結(jié)核分枝桿菌裂解肽MBL－1。從分枝桿菌噬菌體純化了MBL－1。本發(fā)明提供了相關(guān)的氨基酸序列。純化的MBL－1能夠裂解分枝桿菌。
文檔編號(hào)A61K31/06GK1535981SQ0311765
公開(kāi)日2004年10月13日 申請(qǐng)日期2003年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月10日
發(fā)明者謝建平, 胡昌華, 談鋒 申請(qǐng)人:西南師范大學(xué)