專利名稱：當(dāng)歸多糖組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及當(dāng)歸多糖組合物及其制備方法。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是當(dāng)歸多糖組合物，由0.4～2％的當(dāng)歸多糖和98～99.6％纖維素組成，以上百分比為重量百分比。
本發(fā)明還提供了上述當(dāng)歸多糖組合物的制備方法將當(dāng)歸水提取，乙醇沉淀，離心，沉淀為多糖；濾液濃縮，加入2～4倍量體積乙醇再沉淀，得多糖；將多糖與纖維素混合制粒，得當(dāng)歸多糖組合物。
本發(fā)明提供的藥用組合物用于肝損傷的治療，具有療效確切，副作用少等優(yōu)點。
實施例2當(dāng)歸多糖組合物由1％的當(dāng)歸多糖和99％纖維素組成，以上百分比為重量百分比。
實施例3當(dāng)歸多糖組合物由2％的當(dāng)歸多糖和98％纖維素組成，以上百分比為重量百分比。
實施例4按實施例1～3中的任一配比，取當(dāng)歸多糖與纖維素混合制粒，得當(dāng)歸多糖組合物。
制備將當(dāng)歸水提取，乙醇沉淀，離心，沉淀為多糖。濾液濃縮，加入3倍量體積乙醇再沉淀，得多糖。將多糖與纖維素制粒，然后壓片或灌裝膠囊，每粒(片)含多糖5mg。
用法用量每日三次，每次3～6片；口服。
當(dāng)歸多糖組合物對免疫性肝損傷的保護(hù)作用動物試驗雄性昆明種小鼠，體重18-24g，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，用顆粒型普通鼠飼料喂養(yǎng)，飲用自來水，飼養(yǎng)2d后隨機分為5組空白對照組；Model(肝損傷組)一次ip(腹腔注射)給予BCG1.5mg.10g-1，7d后ip(腹腔注射)給予LPS2μg.10g-1；Model+ASP1(肝損傷+小劑量當(dāng)歸多糖組)、Model+ASP2(肝損傷+大劑量當(dāng)歸多糖組)給予BCG的同時，ig(經(jīng)口給予)ASP(當(dāng)歸多糖)30mg.kg-1、60mg.kg-1(每公斤小鼠所用當(dāng)歸多糖組合物的當(dāng)歸多糖含量)，qd*7d(一天一次，連續(xù)給藥7天)。于給予LPS 6h后，小鼠斷頭處死，分離血清，測定ALT、GST、GSH，數(shù)據(jù)以x±S表示，組間差異采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計處理。結(jié)果當(dāng)歸多糖組合物對免疫性肝損傷小鼠sALT，sGST and GSH含量的影響見下表，Group sALT sGST GSH(mmol·min-1·L-1) (μmol·min-1·L-1) (μmol·mg-1·pro.)Control 1.29±0.1421±3 23±7Model 4.02±0.27**30±6**9.3±2.9**Model+ASP1 3.0±0.4**▲▲17.7±2.6▲▲15±5**▲▲Model+ASP22.55±0.29*▲▲20±9▲13±5**▲結(jié)論本發(fā)明的當(dāng)歸多糖組合物對免疫性肝損傷具有保護(hù)作用。
當(dāng)歸多糖組合物對免疫性肝損傷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響動物試驗動物處理方法同前。原位雜交法觀察NFkappaBp65、STAT1 mRNA表達(dá)；免疫組化染色觀察結(jié)構(gòu)型、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(cNOS、iNOS)、誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶(COX-2)、蛋白激酶A(PKA)及凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、早期反應(yīng)基因c-fos、c-Jun、表皮生長因子受體EGFR、原癌基因ras的表達(dá)。Griess法測定NO含量；放射免疫法測定PGE2、cAMP含量。
結(jié)果表明1.對凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的影響見

圖1，當(dāng)歸多糖組合物可明顯上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)。
2.對免疫性肝損傷肝組織中MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響見圖2，當(dāng)歸多糖組合物能激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使EGFR、ras、Erk1的表達(dá)上調(diào)。
3.對免疫性肝損傷肝組織中NFkappaBp65、STAT1、c-fos、c-Jun表達(dá)的影響見圖3，當(dāng)歸多糖組合物僅能減少c-fos在肝組織中的表達(dá)。
4.對免疫性肝損傷肝組織中cNOS，iNOS，COX-2，PKA表達(dá)的影響見圖4，當(dāng)歸多糖組合物能顯著上調(diào)PKA的表達(dá)，同時可增加cNOS的表達(dá)。
5.對免疫性肝損傷肝組織中第二信使NO、PGE2、cAMP含量的影響見下表，GroupNO PGE2cAMP(pmol·mg-1·pro.-1) (pg·mg-1·pro-1) (pmol·mg-1·pro-1)Control 2.5±0.4 7.8±1.40.158±0.015Model3.9±0.4**13±3**0.126±0.020**Model+ASP1 3.13±0.13▲▲10.2±1.0▲0.151±0.022▲Model+ASP2 3.2±0.3▲▲10.9±2.50.20±0.04▲▲結(jié)論當(dāng)歸多糖組合物可顯著增加NO、cAMP含量，減少PGE2含量。
利用基因芯片技術(shù)篩選當(dāng)歸多糖護(hù)肝相關(guān)基因動物試驗動物處理方法同前，小鼠處死后，取肝臟，立即液氮凍存?zhèn)溆谩?br> 總RNA抽提及mRNA分離純化一步法提取肝組織總RNA。將液氮凍存組織放在陶瓷碾缽(RNase free)中徹底碾碎成粉末狀，加入溶液D(3mol/L NaAc，10％SDS，1mol/L Tris-HCl)和1％巰基乙醇，勻漿，離心后上清液經(jīng)1∶1酚∶氯仿兩次抽提后，經(jīng)NaAc和5∶1酸性酚-氯仿兩次抽提后，再經(jīng)等體積異丙醇沉淀，離心后，用Milli-Q水溶解沉淀，紫外分析顯示獲得了高純度總RNA。按Oligotex mRNA spin-column protocal(Qiagen)分離純化mRNA，紫外分析。
探針制備 在50μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入3μg mRNA，參照Schena的方法，逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記及純化mRNA，用Cy3-dUTP標(biāo)記正常組織mRNA，用Cy5-dUTP標(biāo)記損傷組織或經(jīng)藥物處理的組織mRNA，乙醇沉淀后將Cy3-dUTP、Cy5-dUTP標(biāo)記的探針混合溶解在20μl5×SSC+0.2％SDS雜交液中。
芯片雜交 將芯片和雜交探針分別置于95℃水浴變性5min，立即將探針加在基因芯片上，蓋玻片封片，置于密封艙內(nèi)60℃雜交15-17h。揭開蓋玻片，用SSC和SDS溶液洗滌10min，室溫晾干。
檢測與分析 用ScanArray5000掃描儀掃描芯片，得到Cy3/Cy5圖像文件，通過劃格，確定雜交點范圍，過濾背景噪聲，提取基因表達(dá)的熒光強度值。用預(yù)先選定的內(nèi)參照基因(42個管家基因)對Cy3和Cy5的原始提取信號進(jìn)行均衡和修正。用ImaGene 3.0軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號的強度和比值。用以下三個條件作為判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)(1)Cy3和Cy5信號比值的自然對數(shù)的絕對值＞0.69(基因的表達(dá)變化在2倍以上)；(2)Cy3和Cy5信號值之一＞600；(3)PCR結(jié)果良好。
結(jié)果當(dāng)歸多糖組合物對免疫性肝損傷差異表達(dá)基因的調(diào)控見下表

Ratio is Cy5/Cy3high expression(ratio＞2.0)，low expression(ratio＜0.5)結(jié)論與正常肝組織相比，經(jīng)當(dāng)歸多糖預(yù)處理的免疫性肝損傷小鼠肝組織內(nèi)顯示7個差異表達(dá)基因，其中6個下調(diào)表達(dá)，1個上調(diào)表達(dá)。
權(quán)利要求
1.當(dāng)歸多糖組合物，由0.4～2％的當(dāng)歸多糖和98～99.6％纖維素組成，以上百分比為重量百分比。
2.權(quán)利要求1所述當(dāng)歸多糖組合物的制備方法，其特征在于將當(dāng)歸水提取，乙醇沉淀，離心，沉淀為多糖；濾液濃縮，加入2-4倍量體積乙醇再沉淀，得多糖；將多糖與纖維素混合制粒，得當(dāng)歸多糖組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及當(dāng)歸多糖組合物，由0.4～2％的當(dāng)歸多糖和98～99.6％纖維素組成，以上百分比為重量百分比。本發(fā)明還提供了上述當(dāng)歸多糖組合物的制備方法將當(dāng)歸水提取，乙醇沉淀，離心，沉淀為多糖；濾液濃縮，加入2～4倍量體積乙醇再沉淀，得多糖；將多糖與纖維素混合制粒，得當(dāng)歸多糖組合物。本發(fā)明提供的藥用組合物用于肝損傷的治療，具有療效確切，副作用少等優(yōu)點。
文檔編號A61K31/715GK1430969SQ0311848
公開日2003年7月23日 申請日期2003年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月20日
發(fā)明者丁虹 申請人:武漢大學(xué)